DE60119517T2

DE60119517T2 - Cd154 varianten und deren verwendung

Info

Publication number: DE60119517T2
Application number: DE60119517T
Authority: DE
Inventors: Yen-Ming Lexington HSU; Ellen Cambridge GARBER
Original assignee: Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2001-06-08
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2021-06-09
Also published as: DK1294874T3; EP1294874B1; WO2001096397A3; CY1105153T1; AU2001268250A1; EP1294874A2; ES2264697T3; DE60119517D1; JP2004503237A; NZ523351A; WO2001096397A2; ATE325874T1; CA2411472A1; PT1294874E

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft in vitro-Verfahren zur Verwendung von CD154-Varianten, welchen mindestens einen Teil einer Domäne fehlt, die homolog zum Tumornekrosefaktor ist, um die Expression von Wildtyp-CD154 auf der Oberfläche von Zielzellen zu hemmen. Die Verbindungen der Erfindung sind in der Behandlung oder der Hemmung CD154-abhängiger Immunerkrankungen nützlich.
STAND DER TECHNIK
CD154 (d.h. CD40-Ligand oder CD40L) ist ein Typ II-Membranprotein, welches hauptsächlich auf aktivierten T-Zellen exprimiert wird. Die Interaktion von CD154 mit seinem Rezeptor CD40 ist entscheidend für die Funktionen von T-Helferzellen, Differenzierung, Proliferation und Immunglobulin-Isotop-Umschaltung in B-Zellen zu induzieren (für eine Zusammenfassung siehe Foy et al., Annu Rev Immunol 14:591–617 (1996); van Kooten et al., J Leukoc Biol 67:2–17 (2000)). Das CD154-Gen, welches auf dem chromosomalen Bereich Xg2.6–2.7 liegt, umspannt mehr als 12 Kilobasenpaare und enthält fünf Exons (Villa et al., Proc NatI Acad Sci USA 91:2110–4 (1994)).
Das erste Exon codiert den cytoplasmatischen Bereich, die Transmembrandomäne und sechs Aminosäuren der extrazellulären Domäne. Das zweite und dritte Exon codiert den extrazellulären Stiel-Bereich. Das vierte und fünfte Exon codieren die 147 C-terminalen Aminosäuren (Villa et al., vorstehend), einen Bereich, welcher beschränkte Homologie mit anderen Mitgliedern der Tumornekrosefaktor („TNF")-Familie teilt und welcher daher als die TNF-homologe („TNFH")-Domäne bezeichnet wird. Die Röntgenstruktur der CD154-TNFH-Domäne macht deutlich, dass sie eine Sandwich-ähnliche Faltung von zwei β-Faltblättern mit Jelly-roll- oder Greek Key-Topologie umfasst. Obwohl Mitglieder der TNF-Familie die Konfiguration des TypII-Membranproteins teilen, liegt die limitierte Homologie zwischen diesen Mitgliedern in der C-terminalen TNFH-Domäne von ungefähr 150 Aminosäurresten.
Wildtyp-CD154 liegt wie TNF und Lymphotoxin-α als Trimer vor (Karpusas et al., Structures 3:1031–9 (1995)). Die Bildung von CD154-Trimeren wird durch die TNFH-Domäne vermittelt. Es ist gezeigt worden, dass die TNFH-Domäne alleine im Stande ist, Trimere zu bilden (PCT-Patentanmeldung WO 97/00895; Karpusas et al., vorstehend; Mazzei et al., J Biol Chem 270:7025–8 (1995)). Deletionsmutanten, welchen ein Hauptteil dieser Domäne fehlt, scheinen nicht als Trimere vorzuliegen (Garber et al., J Biol Chem 247:33545–50 (1999)). Es scheint daher, dass die TNFH-Domäne für die Zusammenlagerung von trimeren CD154-Proteinen erforderlich und ausreichend ist.
Mutationen des CD154-Gens verhindern die Expression von funktionellem CD154-Protein und können zu einer Immundefizienz führen, die durch erhöhte IgM-Spiegel und niedrige IgG- und IgA-Spiegel im Serum gekennzeichnet ist. Nachdem das CD154-Gen in Menschen auf dem X-Chromosom liegt, wird diese Immundefizienz als X-gekoppeltes Hyper-IgM-Syndrom („XHIM") bezeichnet (Allen et al., Science 259:990–3 (1993)); Korthauer et al., Nature 361:539–41 (1993); Di Santo et al., Nature 361:541–3 (1993); Aruffo et al., Cell 72:291–300 (1993); Fuleihan et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2170–3 (1993)). Über 70 einmalige Mutationen sind im CD154-Gen in mehr als 100 XHIM-Patienten identifiziert worden (Notarangelo et al., Immunol Today 17:511–6 (1996)). Diese Mutationen sind sehr heterogen. Sie schließen Insertionen, Deletionen und Punktmutationen ein. Es ist daher vorstellbar, dass die den funktionellen Defekten von CD154 zugrunde liegenden Mechanismen in XHIM-Patienten unterschiedlich sind (Garber et al., vorstehend; Seyama et al., Blood 92:2421–34 (1998)).
Da das CD154-Gen X-gekoppelt ist, erzeugt jede Zelle von normalen Personen oder XHIM-Patienten eine einzige Spezies an CD154-codierendem Transkript. In manchen XHIM-Patienten jedoch führen Mutationen in den Donor-Spleißstellen (Seyama et al., vorstehend; und darin zitierte Referenzen) oder den Akzeptor- Spleißstellen (Ameratunga et al., Clin Diagn Lab Immunol 3:722–6 (1996)) zur Bildung von mehreren Spezies an mRNA-Transkripten in einer einzelnen Zelle. Diese Transkripte schließen die normal gespleißten Transkripte, welche Wildtyp-CD154 codieren, sowie die falsch gespleißten Transkripte ein, welche variante CD154-Proteine codieren, denen entweder ein Hauptteil der TNFH-Domäne oder die gesamte TNFH-Domäne fehlt (Seyama et al., vorstehend; Ameratunga et al., vorstehend).
Da die TNFH-Domäne alleine für den Zusammenbau des trimeren CD154-Proteins verantwortlich zu sein scheint, wurde von Varianten, welchen die TNFH-Domäne fehlt, vorausgesagt, dass sie die Trimerisierung des Wildtyp-Proteins nicht beeinflussen. Es ist daher unklar, warum Patienten mit Mutationen an den Spleißstellen ihrer CD154-Gene das XHIM-Syndrom aufweisen, welches wahrscheinlich aus einem Fehlen des funktionellen CD154-Proteins resultiert.
In J. Biol. Chem. Bd. 274, 1999, 11310–11320 wird offenbart, dass CD154, welchem die TNFH-Domäne fehlt, mit dem Wildtyp-CD154 interagieren kann. Der Zelloberflächennachweis von Heterodimeren des Wildtyp-CD154 und einer untersuchten Mutante von CD154 wurde beobachtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf unserer Entdeckung, dass CD154-Varianten, welchen mindestens ein Teil der TNFH-Domäne fehlt, über den Stiel-Bereich trotzdem mit einem Wildtyp-CD154-Protein interagieren können. Diese Interaktion behält das Wildtyp-CD154-Protein intrazellulär zurück und hindert dadurch das Wildtypprotein daran, auf der Zelloberfläche exprimiert zu werden und an irgendeiner funktionellen CD154-Aktivität teilzunehmen. Diese Entdeckung offenbart den Stiel-Bereich des CD154-Proteins als ein früher nicht erkanntes, strukturelles Element, welches an der CD154-Trimerzusammenlagerung beteiligt ist.
Demgemäß stellt diese Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Verminderung (einschließlich Hemmung) der Expression des CD154-Wildtypproteins auf der Oberfläche von Zielzellen bereit. In diesem in vitro-Verfahren wird ein rekombinantes Nucleinsäurekonstrukt in eine CD154-exprimierende Zielzelle eingeführt, wo das Konstrukt im Stande ist, die Expression von einem CD154-Variantenprotein, welchem die funktionelle TNFH-Domäne des Wildtypproteins fehlt, zu steuern, so dass das Variantenprotein nicht im Stande ist, ein Trimer zu bilden, aber dennoch an das Wildtypprotein binden kann, wodurch das Wildtypprotein unfähig ist, die Zelloberfläche zu erreichen. Zum Beispiel fehlt der Variante mindestens ein Teil der TNFH-Domäne. Als Beispiel können einer in der Erfindung verwendeten CD154-Variante mindestens 5 (z.B. mindestens 10; mindestens 15; oder mindestens 20) Aminosäuren der TNFH-Domäne fehlen. In einer Ausführungsform kann einer CD154-Variante die gesamte TNFH-Domäne fehlen. In einer weiteren Ausführungsform kann eine CD154-Variante eine TNFH-Domäne mit Insertionsmutationen und/oder Punktmutationen umfassen.
Die TNFH-Domäne von CD154, wie hierin verwendet, entspricht einem Bereich, welcher die Aminosäurereste 116 bis 261 der SEQ ID NO: 1 umfasst.
SEQ ID NO: 1 stellt eine Gesamtlängensequenz von menschlichem CD154 dar und ist in GenBank unter der Zugangsnummer CAA48554 (verweisend auf Graf et al., Eur. J. Immunol. 22(12):3191–4 (1992)) erhältlich. Allelische Isoformen von SEQ ID NO: 1 können auch als die verwandte Sequenz für die in dieser Erfindung nützlichen CD154-Varianten verwendet werden.
Beispiele von in dieser Erfindung nützlichen CD154-Varianten schließen jene ein, welchen (1) die Aminosäurereste 116–136, (2) die Aminosäurereste 137–261, (3) die Aminosäurereste 115–261 bzw. (4) die Aminosäurereste 97–261 von SEQ ID NO: 1 fehlen. Verfahren zur Herstellung von CD154-Varianten sind im Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. 1 und Tabelle 1 von Garber et al., J. Biol. Chem. 274:33545–550 (1990).
Diese Erfindung stellt ferner Verbindungen zur Verwendung in einem Verfahren der Behandlung oder Hemmung einer CD154-abhängigen Erkrankung (z.B.: einer Erkrankung des Immunsystems vermittelt durch Interaktion von CD154:CD40) in einem Individuum (d.h. einem Säuger wie zum Beispiel einem Primaten, vorzugsweise einem Menschen) bereit. Das Verfahren schließt die Verabreichung einer CD154-Variante der vorliegenden Erfindung an Zielzellen des Individuums ein, wie zum Beispiel T-Zellen (z. B. CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen) oder Megakarocyten, dadurch wird die Expression des Wildtyp-CD154 auf der Oberfläche der Zielzellen vermindert. In einer Ausführungsform wird die CD154-Variante in der Zielzelle erzeugt, basierend auf der Aufnahme eines Genexpressionsprodukts durch die Zelle, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die diese Variante codiert.
Im Bereich der vorliegenden Erfindung sind auch Arzneimittel, umfassend ein Nucleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer CD154-Mutante steuert, die in einem Verfahren der Erfindung nützlich ist. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines solchen Konstrukts für die Herstellung eines Medikaments zur Verminderung der Expression des CD154-Wildtyps auf der Oberfläche einer Zielzelle und/oder zur Behandlung eines Patienten bereit, der an einer CD154-vermittelten Erkrankung leidet oder für sie prädisponiert ist.
Die vorliegende Erfindung ist gut für die lokale Verabreichung und Aufnahme durch Zielzellen an einem Ort im Körper des Individuums geeignet, der eine therapeutische Behandlung braucht. Zum Beispiel kann das hierin beschriebene Genexpressionskonstrukt lokal (z.B. durch Injektion) in die Milz oder andere lymphoide Gewebe oder in einen Entzündungsort verabreicht werden, wie zum Beispiel eine verletzte Stelle oder eine pathologische Läsion. Eine solche lokale Behandlung verhindert jegliche Komplikationen, auf die man mit systemischer Verabreichung von immunmodulierenden Stoffen stoßen kann.
Außerdem vermeidet das vorliegende Genexpressions-Konstrukt mögliche Nachteile von extrazellulären immunmodulierenden Stoffen wie zum Beispiel Antikörpern. Wenn Antikörper an ein Zelloberflächenantigen gebunden sind, können sie die Zerstörung der Zelle auslösen, zum Beispiel über eine Antikörper-abhängige Zellcytotoxizitätsantwort oder durch Makrophagen oder andere Effektorzellen, welche Fc-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche zeigen. Eine solche Zellzerstörung mag in bestimmten therapeutischen Situationen nicht wünschenswert sein.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den nachfolgenden Zeichnungen und der genauen Beschreibung offensichtlich sein und auch von den beigefügten Ansprüchen.
Wenn nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung wie allgemein durch einen Fachmann, den diese Erfindung betrifft, angenommen. Beispielhafte Verfahren und Materialien werden nachstehend beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Autoradiogramm, welches den Zusammenhang von TNFH(–)-CD154 mit Wildtyp-CD154 verdeutlicht.
2 ist eine Reihe an Autoradiogrammen, welche den dosisabhängigen hemmenden Effekt von TNFH(–)-CD154 auf die Produktion von funktionellen CD154-Trimeren zeigt.
3A und 3B sind ein Säulendiagramm bzw. eine Tabelle, die zeigen, dass eine CD154-Mutante die Lymphotoxin-α-Hochregulationsaktivität des Wildtyp-CD154 vermindert.
4 ist eine Reihe an Autoradiogrammen, welche zeigt, dass TNFH(–)-CD154 die Zelloberflächen-Expression von Wildtyp-CD154 verhindert.
5 ist ein schematisches Diagramm, welches zeigt, dass TNFH(–)-CD154 intrazellulär an Wildtyp-CD154 bindet und dieses daran hindert, die Zelloberfläche zu erreichen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wurde in den letzten Jahrzehnten festgestellt, dass die T-Zell-Aktivierung sowohl T-Zell-Antigenrezeptor („TCR")-vermittelte Signale als auch gleichzeitig abgegebene co-stimulatorische Signale benötigt. Zum Beispiel benötigt die Antikörperproduktion durch B-Zellen in Antwort auf Proteinantigene eine antigenspezifische Interaktion zwischen B-Zellen und Helfer-T-Zellen sowie auch nicht-antigenspezifische co-stimulatorische Rezeptor-Liganden-Interaktionen zwischen den B und T-Zellen. Diese nicht-antigenspezifischen Interaktionen schließen die Bindung von CD40 auf B-Zellen an CD154 auf T-Zellen ein.
Menschliches CD40 ist ein 50-kD-Zelloberflächenprotein, welches auf reifen B-Zellen, Makrophagen und aktivierten Endothelzellen exprimiert wird. CD40 gehört zu einer Klasse von Rezeptoren, welche an der Proliferation und Apoptose beteiligt sind und Fas/CD95, TNF-Rezeptoren und Lymphotoxin-Rezeptoren einschließen. Menschliches CD154 ist ein 32-kD-Typ-II-Membranglycoprotein, welches hauptsächlich auf aktivierten T-Zellen transient exprimiert wird. Eine CD40:CD154-Interaktion wird im Wesentlichen für alle T-Zell-abhängigen Immunantworten, einschließlich Antikörperantworten, benötigt. Im Besonderen stellt die CD40:CD154-Interaktion anti-apoptotische und/oder Lymphokin-stimulatorische Signale bereit.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, dass CD154-Mutationsvarianten, welchen zumindest ein Teil der TNFH-Domäne fehlt, intrazellulär an Wildtyp-CD154 binden können und das Wildtypprotein daran hindern, die Zelloberfläche zu erreichen. Die Expression einer solchen CD154-Variante in den T-Zellen eines Individuums kann daher die CD154-abhängigen Immunantworten durch Eliminierung der Zelloberflächenexpression von Wildtyp-CD154 spezifisch unterdrücken.
Behandlung von Krankheiten
Von der CD40:CD154-Interaktion ist bekannt, dass sie für die Induktion von T-Zell-abhängigen Immunantworten entscheidend ist, einschließlich Antikörpervermittelten humoralen Immunantworten und T-Zell-vermittelten, entzündlichen Reaktionen auf Proteinantigene. Obwohl von mehreren Forschergruppen beträchtlicher Aufwand in die Entwicklung von Mitteln zum Eingreifen in diese Interaktion investiert wurde, um ungewollte oder pathologische Immunantworten zu verhindern oder zu behandeln, verbleibt ein Bedarf für verbesserte Mittel zur Unterbrechung der CD40:CD154-Interaktion in therapeutischen Situationen.
Die vorliegende Erfindung stellt die verbesserten Mittel bereit. Gemäß dieser Erfindung kann eine CD154-Variante, welcher eine funktionelle TNFH-Domäne fehlt (z.B. eine TNFH-minus-CD154-Mutante), in Ziel-T-Zellen in ein zu behandelndes Individuum zur Behandlung (z.B. Linderung, Verzögerung oder Umkehr) oder zur Hemmung (z.B. Verhinderung des Ausbruchs oder des Fortschreitens) von CD154-abhängigen Erkrankungen eingeführt werden, welche durch ein bedeutendes entzündliches System oder eine Beteiligung des Immunsystems gekennzeichnet sind. Solche Erkrankungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Lupus, systemischer Lupus erythematodes, Lupus nephritis, Lupus neuritis, Asthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung, Bronchitis, Emphysem, multiple Sklerose, Uveitis, Alzheimer-Krankheit, traumatische Hirnverletzung, traumatische Rückenmarksverletzung, Schlaganfall, Atherosklerose, Coronarrestenose, ischämische kongestive Herzinsuffizienz, Zirrhose, Hepatitis C, diabetische Nephropathie, Glomerulonephritis, Autoimmunerkrankung, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, atopische Dermatitis, systemische Sklerose, Strahlen-induzierte Fibrose, Morbus Crohn, eiternde Colitis, multiples Myelom, entzündliche Augenerkrankung, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatabstoßung (z.B.: Cornea- und Retina-Transplantatabstoßung) oder Kachexie.
Die CD154-Mutationsvarianten können auch prophylaktisch an einen Patienten verabreicht werden, der noch keine Symptome der Krankheit gezeigt hat. Zum Beispiel kann die CD154-Variante verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die eine Transplantation durchmachen werden, um eine mögliche Transplantatabstoßung zu verhindern oder zu lindern.
In einer Ausführungsform kann das CD154-Variantenprotein durch lokale Injektion von Liposomen oder anderen geeigneten Trägerstoffen (z.B.:Mikrosphären), welche das Variantenprotein enthalten, in eine Zielzelle eingeführt werden. Zum verbesserten Ansteuern des Ziels können die Liposomen oder andere geeignete Trägerstoffe mit Molekülen beschichtet werden, die als Liganden von gewebespezifischen Rezeptoren fungieren.
Gentherapie
Gemäß dieser Erfindung kann auch eine TNFH-minus-CD154-Mutante durch Expression eines Nucleinsäurekonstrukts innerhalb der Zelle in eine Zielzelle eingeführt werden, wobei das Konstrukt eine Promotorsequenz umfasst, welche funktionsfähig mit einer Sequenz verbunden ist, die das Mutanten-CD154-Protein codiert.
(1) VEKTOREN
Ein Nucleinsäurekonstrukt gemäß dieser Erfindung kann von einem nicht replizierenden, linearen oder zirkulären DNA- oder RNA-Vektor oder von einem autonom replizierenden Plasmid oder viralen Vektor abgeleitet sein. Alternativ kann das Konstrukt in das Wirtsgenom integriert sein. Jeder Vektor, der eine T-Zelle transfizieren oder transduzieren kann, kann verwendet werden. Bevorzugte Vektoren sind virale Vektoren, welche jene einschließen, die von replikationsdefizienten Retroviren (siehe z.B.: WO 89/07136; Rosenberg et al., N. Eng. J. Med. 323(9):570–578 (1990)), Adenovirus (siehe z.B.: Morsey et al., J. Cell. Biochem., Ergänzung 17E (1993)), Adeno-assoziiertem Virus (Kotin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2211–2215 (1990)), replikationsdefizienten Herpes simplex-Viren (HSV; Lu et al., Zusammenfassung, Seite 66, Abstracts of the Meeting on Gene Therapy, Sept. 22–26, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), Vaccinia-Virus (Mukherjee et al., Cancer Gene Ther. 7:663–70 (2000)) abstammen, und beliebige veränderte Versionen dieser Vektoren. Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren sind im Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Die Vektoren dieser Erfindung können spezifisch auf T-Zellen abzielen. T-Zellspezifische virale Vektoren, die in der Gentherapie nützlich sind, sind im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel kann man verwenden (1) die retroviralen Vektoren von Annenkov et al., Gene Therapy 7:74–22 (2000); Cavazzana-Calvo et al., Science 288:669–72 (2000); und Farson et al., J. Gene Med. 1:195–209 (1999); (2) den Herpesvirussaimiri-Vektor von Hiller et al., Gene Therapy 7:664–74 (2000); (3) die auf HIV basierenden Hybridvektoren von Kung et al., J. Virol. 74:3668–81 (2000); (4) die von HIV abgeleiteten lentiviralen Vektoren von Costello et al., Gene Therapy 7:596–604 (2000); oder (5) beliebige veränderte Versionen der vorstehend erwähnten Vektoren.
(2) EXPRESSIONS-KONTROLLSEQUENZEN
In diesen Vektoren werden Expressions-Kontrollsequenzen funktionsfähig mit Nucleinsäuresequenzen verbunden, welche das mutierte Protein der Erfindung codieren. Es können beliebige Expressions-Kontrollsequenzen, die eine gewünschte Transkriptionsmenge in T-Zellen steuern können, verwendet werden. Für eukaryontische Zellen können die Expressions-Kontrollsequenzen einen Promotor, einen Enhancer wie zum Beispiel einen, der von einem Immunglobulingen, SV40, Cytomegalievirus usw. abgeleitet ist, und eine Polyadenylierungs-Sequenz einschließen. Ein Nucleinsäurekonstrukt dieser Erfindung kann auch eine interne Ribosomen-eintrittsstelle („IRES") und ein Intron enthalten, welches vorzugsweise zwischen der Promotor/Enhancer-Sequenz und der mutierten CD154-Codierungssequenz gelagert ist. Die Auswahl von diesen und anderen gebräuchlichen Vektorelementen ist üblich. Siehe z.B.: Sambrook et al., vorstehend; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (1989); und darin zitierte Literaturhinweise.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der native Promotor für CD154 benützt. Der native Promotor kann bevorzugt sein, wenn es wünschenswert ist, dass die Expression von mutiertem CD154 die native Expression nachahmen soll. Der native Promotor kann verwendet werden, wenn die Expression der CD154-Mutante zeitlich oder entwicklungsgemäß oder in einer gewebespezifischen Weise oder als Antwort auf spezifische native transkriptionelle Stimuli reguliert werden muss. In einer weiteren Ausführungsform können auch andere native Expressions-Kontrollelemente wie zum Beispiel Enhancer-Elemente, Polyadenylierungsstellen oder Kozak-Konsensussequenzen verwendet werden, um die native Expression zu imitieren.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind T-Zellspezifische Promotoren erwünscht. Solche Promotoren schließen zwei Klassen ein: Zelltyp-spezifische Promotoren und aktivierungsspezifische Promotoren. Beispiele solcher Promotoren schließen ohne Einschränkung Promotoren ein, die von den Genen von CD2, CD4, CD3, T-Zell-Rezeptor-α-und-β-Ketten und IL-2 abstammen.
Um eine anhaltende Immunsuppression zu verhindern, kann es wünschenswert sein, induzierbare Promotoren zu verwenden, um die Expression des mutierten CD154 zu regulieren. Solche Promotoren sind im Fachgebiet bekannt. Sie schließen ohne Einschränkung ein (1) Tetracyclin-induzierbare Promotoren (Gossen et al., Science 268:1766–1769 (1995); Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512–518 (1998); (2) Tetracyclin-supprimierbare Promotoren (Alvarez-Vallina et al., Cancer Gene Therapy 7:526–9 (2000); Gossen et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 89:5547–5551 (1992); (3) die Rapamycin-induzierbaren Promotorsysteme von Ye et al., Science 283:88–91 (1999); Magari et al., J. Clin. Invest. 100:2865–2872 (1997); und Rivera et al., Nat. Medicine 2:1028–1032 (1996); (4) den Zink-induzierbaren Methallothionein-Promotor; (5) den Dexamethason (Dex)-induzierbaren Maus-Brusttumorvirus (MMTV)-Promotor; (6) das T7 Polymerase-Promotorsystem (WO 98/10088); (7) den Ecdyson-Insektenpromotor (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3346–3351 (1996)); (8) die RU486-induzierbaren Promotorsysteme (Wang et al., Nat. Biotech. 15:239–243 (1997); Wang et al., Gene Ther. 4:432–441 (1997)); und (9) die veränderten Versionen der vorstehend erwähnten Promotorsysteme. Andere Arten an induzierbaren Promotoren, die in dieser Erfindung nützlich sind, sind jene, die durch einen spezifischen physiologischen Zustand, z.B. Temperatur, akute Phase oder nur in replizierenden Zellen, reguliert werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine hohe konstitutive Expression gewünscht. Beispielhafte Promotoren für diesen Zweck schließen ohne Einschränkung den retroviralen LTR-Promotor/Enhancer des Rous-Sarcomvirus (RSV), den sehr frühen Promotor/Enhancer des Cytomegalievirus (CMV) (siehe z.B. Boshart et al., Cell 41:521–530 (1985)); den SV40-Promotor, den Dihydrofolatreduktase-Promotor, den cytoplasmatischen β-Actin-Promotor und den Phosphoglycerokinase (PGK)-Promotor ein.
Unter Verwendung der in dieser Anmeldung bereitgestellten Anleitung kann ein Fachmann eine Auswahl unter den vorstehend genannten Expressions-Kontrollsequenzen und den veränderten Versionen davon treffen, ohne den Bereich dieser Erfindung zu verlassen.
(3) VERABREICHUNG VON NUCLEINSÄUREKONSTRUKTEN
Die Nucleinsäurekonstrukte dieser Erfindung können als ein Arzneimittel zur Verwendung in jeder Form des transienten und/oder stabilen Gentransfers in vivo und in vitro formuliert werden. Die Zusammensetzung umfasst mindestens das Nucleinsäurekonstrukt und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff wie zum Beispiel Kochsalzlösung. Andere wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die bekannte pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe sind und die Fachleuten gut bekannt sind, können auch eingesetzt werden. Das Konstrukt kann für in vivo- und ex vivo- Gentherapie, in vitro-Proteinproduktion und diagnostische Tests verwendet werden.
Das Nucleinsäurekonstrukt kann in Zielzellen als nackte DNA oder z.B. durch Liposomenfusion (siehe z.B.: Nabel et al., Science 249:1285–8 (1990); Ledley, J Pediatrics 110:1–8 und 167–74 (1987); Nicolau et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:1068–72 (1983)), Erythrocyten-Ghosts oder Mikrosphären-Verfahren (Mikropartikel; siehe z.B. US-Patente 4.789.734, 4.925.673 und 3.625.214; Gregoriadis, Drug Carriers in Biology and Medicine, Seiten 287–341; Academic Press, 1979) eingeführt werden. Alternativ kann das Nucleinsäurekonstrukt an Liganden von T-Zell-spezifischen Rezeptoren gekoppelt werden und dadurch in die T-Zellen über Rezeptor-vermittelte Endocytose eindringen.
Wenn das Nucleinsäurekonstrukt auf einem Virus basiert, kann es auch als ein Virion verpackt werden, welches dann verwendet wird, um eine Zelle ex vivo zu transduzieren (z.B. eine autologe T-Zelle, die von einem Patienten isoliert wurde). Die infizierte Zelle wird dann dem Körper des Patienten wieder zugeführt. Alternativ kann das rekombinante Virus einem Patienten direkt, wie von einem Fachmann im Gebiet der Gentherapie bestimmt, verabreicht werden, z.B. intravenös, intraperitoneal, intranasal, intramuskulär, subkutan und/oder intradermal. Eine Vorrichtung für die langsame Abgabe wie zum Beispiel eine implantierbare Pumpe kann verwendet werden, um die Abgabe des rekombinanten Virus in die Zelle zu erleichtern. Wo das Virus an ein Individuum verabreicht wird, kann durch Kontrollieren des Verabreichungsverfahrens auf die zu infizierenden, spezifischen Zellen abgezielt werden. Zum Beispiel kann eine intravenöse Injektion des Virus verwendet werden, um die Ansteuerung einer zirkulierenden T-Zelle durch das Virus zu erleichtern. Zielgebiete des Körpers für lokale Verabreichungsstellen beinhalten zum Beispiel die Lungen, Haut, Lymphknoten, den Thymus, die Milz und das Knochenmark. Eine solche Verabreichung kann zum Beispiel topisch, durch Inhalation, Aerosole oder lokale Injektionswege einschließlich zum Beispiel durch einen Pfortaderkatheter stattfinden. Die Behandlungen der Erfindung können, wie durch einen Fachmann bestimmt, wie benötigt wiederholt werden.
Die Dosierungen des Nucleinsäurekonstrukts dieser Erfindung in der Gentherapie wird hauptsächlich von Faktoren wie dem Zustand, der behandelt wird, abhängen. Die Dosierung kann auch abhängig von Alter, Gewicht und Gesundheit des Patienten variieren. Zum Beispiel ist eine wirkungsvolle menschliche Dosis eines Virus, welches mutiertes CD154 codiert, im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 ml bis 50 ml Kochsalzlösung, welche das Virus bei Konzentrationen von etwa 1 × 10⁷, 1 × 10⁸, 1 × 10⁹, 1 × 10¹⁰, 1 × 10¹¹, 1 × 10¹², 1 × 10¹³, 1 × 10¹⁴, 1 × 10¹⁵, 1 × 10¹⁶ viralen Partikeln pro verabreichter Dosis enthält. Die Dosierung wird angepasst werden, um die verbessernden Vorteile gegen beliebige nachteilige Nebeneffekte auszugleichen. Die Expressionsmengen des mutierten CD154 können überwacht werden, um die Art und Frequenz der Dosisverabreichung zu bestimmen.
Die Arzneimittel der Erfindung können alleine oder in einem Gemisch oder in chemischer Verbindung mit einem oder mehreren Materialien, einschließlich anderen Proteinen oder rekombinanter Vektoren, welche die biologische Stabilität der Proteine oder der rekombinanten Vektoren erhöhen, oder mit Materialien verwendet werden, welche die Fähigkeit der Zusammensetzung erhöhen, selektiv auf T-Zellen abzuzielen.
Kombinationstherapie
Zusätzlich kann das Arzneimittel der Erfindung in Kombination mit einem anderen immunmodulierenden Behandlungsplan verwendet werden, um die gewünschte Immunsuppression zu erreichen, z.B. langfristige, abstoßungsfreie Integration von heterologem Spendergewebe in einen Primaten-Empfänger. Zum Beispiel kann ein Agens verwendet werden, welches die CD154:CD40-Interaktion blockiert oder die Co-Stimulation über CD28, CD80 oder CD86 blockiert.
Beispielhafte CD154:CD40-Interaktionsinhibitoren sind Antikörper gegen CD154 wie zum Beispiel der monoclonale Antikörper („mAk") 5c8 (hergestellt durch das Hybridom, welches die ATCC-Zugangsnummer HB 10916 aufweist; offenbart im US-Patent 5.474.771); ImxM90, ImxM91 und ImxM92 (beschrieben im US-Patent 5.961.974); sowie jene, die von Ancell (Clon 24–31, Katalog # 353-020; Bayport, MN), Genzyme (Cambridge, MA, Katalog # 80-3703-01) und PharMingen (San Diego, Katalog # 33580D) im Handel erhältlich sind. Zahlreiche zusätzliche anti-CD154-Antikörper sind produziert und charakterisiert worden (siehe z.B. PCT-Patentanmeldung WO 96/23071 von Bristol-Myers Squibb).
Andere bekannte Immunmodulatoren, welche CD154:CD40-Interaktionen blockieren, schließen anti-CD154-Moleküle anderer Arten ein, wie zum Beispiel gesamte Fab-Fragmente, F(ab')₂-Verbindungen, V_H-Bereiche, F_V-Bereiche, einkettige Antikörper (siehe z.B. PCT-Patentanmeldung WO 96/23071), Polypeptide, Fusionsproteine (wie zum Beispiel CD40lg, wie in Hollenbaugh et al., J. Immunol. Meth. 188:1–7 (1995)) und kleine Molekülverbindungen wie zum Beispiel kleine semipeptidische Verbindungen oder nicht-peptidische Verbindungen. Alle diese Immunmodulatoren sind im Stande, die CD40:CD154-Interaktion zu blockieren oder zu stören. Verfahren zum Entwerfen, Durchmustern und Optimieren kleiner Moleküle werden in der PCT-Patentveröffentlichung WO 97/00895 bereitgestellt, deren Beschreibung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Um während der Gentherapie mögliche Immunantworten auf das rekombinante Virus zu vermeiden, kann es auch erwünscht sein, den Behandlungsplan zu übernehmen, welches identisch oder ähnlich jenem ist, das in Chirmule et al., J. Virol. 74:3345–52 (2000) beschrieben ist. In diesem Plan wird ein Patient zuerst mit (1) dem rekombinanten Virus ohne der mutierten CD154-Insertion und (2) einem Immunmodulator wie zum Beispiel einem humanisierten anti-CD154-Antikörper oder einem anderen Co-Stimulationsinhibitor gleichzeitig behandelt. Dann wird der Patient mit dem mutierten CD154-codierenden Virus behandelt. Es wurde gezeigt, dass solch ein Zwei-Schritt-Behandlungsplan in erheblicher und verlängerter Hemmung der rekombinanten Virus-spezifischen humoralen Antwort resultiert, welche in Gentherapiepatienten oft Nebeneffekte hervorruft.
Siehe auch US-Patent 5.872.174 und PCT-Patentanmeldung WO 96/26285.
Vorklinische Modellsysteme zur Beurteilung des Gentherapie-Behandlungsplans von mutiertem CD154
Ein beispielhaftes Modellsystem zur Überprüfung der Wirksamkeit des Gentherapie-Behandlungsplans von mutiertem CD154 ist das in Kirk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8789–94 (1997), offenbarte Primaten-Nierenallotransplantat-Modell, dessen Lehren durch Bezugnahme hierin einbezogen sind. Dieses Rhesusaffen-Modell kann als ein strikter Test von Immunmanipulation dienen: eines, das sogar für geringe Veränderungen in der Allotransplantatfunktion oder für nachteilige Effekte auf die Wundheilung des Empfängers und die Immunsystem-Funktion höchst sensitiv ist. Außerdem hat es biologische Ähnlichkeit zu menschlichen Nierentransplantation: genau gesagt sind Gene, welche MHC-Proteine codieren, zwischen Rhesusaffen und Menschen gut konserviert und die Abstoßung von vaskularisierten Organen bei Rhesusaffen läuft ziemlich genau so wie jene, die klinisch beobachtet wird.
Es wird leicht erkannt werden, dass dieses Modellsystem zur Beurteilung von Transplantaten, die renales (Nieren)-Gewebe umfassen, geeignet ist. Andere im Fachgebiet anerkannte vorklinische Modellsysteme, vorzugsweise Primaten-Modellsysteme, sind zur Bewertung der Wirksamkeit von Gentherapie mit mutiertem CD154 in der Unterdrückung der Abstoßung von anderen Transplantat-Gewebearten wie zum Beispiel Leber, Herz, Lunge, Pankreas, Pankreasinseln, Haut, peripheren und zentralen Nerven geeignet. Außerdem kann die Wirksamkeit der Gentherapie mit mutiertem CD154 gemäß der vorliegenden Erfindung in Tiermodellen von Lupus nephritis bewertet werden, wie zum Beispiel jenen, die in den PCT-Patentanmeldungen WO 98/30240 und WO 98/30241 beschrieben sind. Eine solche Wirksamkeit kann auch in Tiermodellen für Hornhaut-Transplantation wie zum Beispiel dem Korneatransplantionsmodell der Maus bewertet werden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Verfahren und Materialien der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1: Verfahren
(1) Zelllinien, Antikörper und Ig-Fusionsprotein
BJAB, eine menschliche B-Zelllinie, war ein Geschenk von Dr. George Mosialos an der Harvard Medical School. Die Zelllinie wurde in einem RPMI-Medium gehalten, welches mit Penicillin, Streptomycin, 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum und 4 mM Glutamin ergänzt war. Der mAk 9E10 wurde von der Kultur des 9E10-Hybridoms produziert und gereinigt, welches von der American Type Culture Collection erhältlich ist. Hinsichtlich des mAk 9E10 und des EQKLISEEDL-myc-Marhers, siehe auch G.I. Evan et al., „Isolation of Monoclonal Antibodies Specific for Human c-myc Proto-Oncogene Product", Mol Cell Biol 5:3610–3616 (1985). Verfahren zum Konstruieren, Produzieren und Reinigen des CD40-Fc-Fusionsproteins, humanisiertem 5c8 und der polyclonalen Kaninchen-Antikörper Rb779 und Rb784 wurden, wie in Hsu et al., J Biol Chem 272:911–5 (1997) beschrieben, durchgeführt.
(2) Transiente Expression von Wildtyp und mutierten CD154-Proteinen
Eine Wildtyp-CD 154-cDNA wurde von einer cDNA-Bank isoliert, die aus aktivierten menschlichen peripheren Blutzellen hergestellt wurde. Die codierende Sequenz dieser cDNA codiert ein Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1 aufweist. Verfahren zur Konstruktion von Mutanten von CD154 wurden, wie beschrieben in Gerber et al., vorstehend, durchgeführt. Die Wildtyp- und mutierten cDNAs wurden in eine einmalige NotI-Stelle in einem CMV-Expressionsvektor, der unter der Kontrolle eines sehr frühen Promotors stand und einen SV40-Ursprung für die Amplifikation in COS7-Zellen enthielt, subcloniert oder von Restriktionsfragmenten mit bestätigter Sequenz rekonstruiert. COS7-Zellen wurden mit superspiralisierter Plasmid-DNA unter Verwendung von Lipofectamin (GibcoBRL, Grand Island, New York) unter Befolgung der Anleitungen des Herstellers transfiziert. Plasmid-DNA, der die CD154-Codierungssequenz fehlt, wurde als eine negative Kontrolle verwendet und ein Vektor, welcher die codierende Wildtyp-CD154-Sequenz enthielt, wurde in allen Beispielen als eine positive Kontrolle verwendet. Die Expression von CD154 und seinen Varianten wurde auf transfizierten Zellen analysiert, die 72 Stunden nach der Transfektion geerntet wurden. Metabolische Markierung und Biotinylierung von Zelloberflächenproteinen, Immunpräzipitation, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese („SDS-PAGE") und Western-Blot-Analyse wurden unter Verwendung der in Hsu et al., vorstehend, beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Herstellung von Membranfraktionen von transfizierten COS7-Zellen und die Verfahren zur Analyse der Lymphotoxin-α-Hochregunglation wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt (Garber et al., vorstehend).
Beispiel 2: Die TNFH(–)-Mutante ist mit Wildtyp-CD154 assoziiert.
Um den Effekt der TNFH(–)-Mutante auf die Expression von Wildtyp-CD154 zu untersuchen, wurden Lysate von metabolisch markierten COS7-Zellen, die mit cDNAs co-transfiziert waren, welche diese Proteine codierten, durch Immunpräzipitation unter Verwendung von CD154-spezifischen Antikörpern analysiert. Um das mutierte Protein von der p18-Komponente der heterotrimeren Wildtyp-Komplexe (Hsu et al., vorstehend) zu unterscheiden, wurde ein myc-Marker am C-Terminus der ersten 96 Aminosäuren von CD154 eingebaut, um die nicht-CD154-Aminosäuren (11 oder 21 Aminosäuren) zu ersetzen, die in den abnormal gespleißten Transkripten (Patienten 19, 20 und 21 in Seyama et al., vorstehend) vorausgesagt wurden.
Um die Vereinigung von CD154-Mutanten mit dem Wildtypprotein zu bestimmen, wurden Zellysate, die von mit ³⁵S-metabolisch markierten COS7-Zellen erzeugt wurden, die mit cDNA transfiziert waren, welche entweder den Volllängen-Wildtyp oder die CD154-Mutante mit dem myc-Marker (Aminosäurereste 1–96 von SEQ ID NR: 1) oder beide codierte, mit anti-myc-mAk 9E10, anti-menschlichem CD154-mAk 5c8 oder anti-CD154-C-terminales-Peptidantiserum Rb784 (oder "784") immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden durch Elektrophorese auf einem 10–20% Gradienten-SDS-PAGE-Gel, gefolgt von Autoradiographie (1), analysiert.
1 zeigt, dass, wenn Wildtyp-CD154 alleine exprimiert wurde, die Immunpräzipitate des Antiserums Rb784 gegen N-terminales CD154-Peptid (Spur 3) und von anti-CD154-mAk 5c8 (Spur 4) hauptsächlich das Volllängen-p33-Protein, etwas p31-Protein und eine kleine Menge an p18 enthielten (p33, p31 und p18 sind Komponenten des Wildtyp-CD154). Das steht im Einklang mit früheren Beobachtungen (Hsu et al., vorstehend). Die p33-, p31- und p18-Komponenten wurden weder in den Immunpräzipitaten des anti-myc-mAk 9E10 (Spur 1) beobachtet, noch in dem Kaninchen-Kontrollantiserum (Spur 2) beobachtet. Wenn ein mutiertes CD154- Protein (enthaltend Aminosäurereste 1–96 von SEQ ID NO: 1 und gekoppelt an einen myc-Marker) („TNFH(–)") alleine exprimiert wurde, wurde eine p17-Komponente, welche mit dem mutierten Protein selbst übereinstimmt, sowohl durch 9E10 als auch Rb784 immunpräzipitiert, aber nicht durch den mAk 5c8 oder das Kaninchen-Kontrollantiserum (Spuren 5 bis 8). Wenn mutierte und Wildtypproteine co-exprimiert wurden, enthielten die Immunpräzipitate von 9E10 nicht nur das mutierte p17-Protein mit dem myc-Marker, sondern auch die p33-, p31- und p18-Wildtypproteine (Spur 9). Ähnliche Proteinmuster wurden in Immunpräzipitaten von Rb784 und mAk 5c8, aber nicht im Kontrollserum (Spuren 10 bis 12) gefunden. Man beachte, dass mAk 5c8-Immunpräzipitate eine geringere Menge dieser Proteine zeigen, was darauf hindeutet, dass nicht alle exprimierten Wildtypproteine durch 5c8 erkannt wurden.
Die vorstehenden Daten offenbaren drei wichtige Ergebnisse. Erstens, dass mutierte CD154-Proteine stabil produziert werden und leicht nachgewiesen werden können. Zweitens, dass mutierte CD154-Proteine, welchen die TNFH-Domäne fehlt, mit dem Wildtyp-CD154 assoziieren können. Drittens, dass zumindest manche Wildtypproteine, während sie mit mutierten Proteinen assoziiert sind, mit mAk 5c8 interagieren können, von dessen Bindungsepitop gezeigt wurde, dass es konformativ und ähnlich der CD154-Bindungsstelle für CD40 ist.
Beispiel 3: Die Verbindung der TNFH(–)-Proteinmutante vermindert die Rezeptorbindungsaktivität des Wildtypproteins in einer dosisabhängigen Art und Weise
Die in 1 gezeigten Daten deuten darauf hin, dass die Verbindung von TNFH(–)-CD154 mit Wildtyp-CD154 die Fähigkeit des Wildtypproteins, mit seinem Rezeptor zu interagieren, beeinträchtigen kann. Um das weiter zu untersuchen, haben wir COS7-Zellen mit (1) einer konstanten Menge eines Plasmids, welche cDNA enthielt, die Volllängen CD154 codierte, und einer unterschiedlichen Menge eines Plasmids transfiziert, welches cDNA enthielt, die TNFH(–)-CD154 codierte. Die Transfektanten wurden dann metabolisch mit ³⁵S markiert und lysiert. Immunpräzipitate der Lysate wurden durch ein 10–20% Gradienten-SDS-Polyacrylamidgel, gefolgt von Autoradiographie, (2) analysiert.
2 zeigt, dass die Menge an Wildtyp-CD154, welche durch Rb784 immunpräzipitiert wurde, die gleiche war, unabhängig von der für die Transfektion verwendeten Menge an TNFH(–)-DNA (2, unteres Feld). In Spur 1 wurden die Zellen nur mit dem Plasmid transfiziert, welches Wildtyp-CD154 codierte. In den Spuren 2–4 wurden die Zellen mit der gleichen Menge an Wildtyp-CD154-Plasmid und einer unterschiedlichen Menge an TNFH(–)-Plasmid transfiziert; und die Verhältnisse des ersteren Plasmids und des letzteren Plasmids waren 3:1, 1:1 bzw. 1:3. In Spur 6 wurden die Zellen nur mit einem Kontrollplasmid transfiziert.
Die in 2 gezeigten Daten deuten darauf hin, dass die Expression des Wildtypproteins durch die Einführung der TNFH(–)-Mutante nicht beeinträchtigt war. Die Menge an Wildtypprotein jedoch, die durch ein CD40-Fc-Fusionsprotein oder durch den mAk 5c8 erkannt wurde, war umgekehrt proportional zu der Menge des für die Transfektion verwendeten TNFH(–)-Plasmids (2, oberes bzw. mittleres Feld). Interessanterweise wurde nur ein kleiner Anteil der gesamten exprimierten TNFH(–)-Mutante (2, unteres Feld) entweder durch CD40-Fc oder mAk 5c8 immunpräzipitiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression der TNFH(–)-Mutante die Rezeptorinteraktionsaktivität, aber nicht die Expressionsmenge, von Wildtyp-CD154 in einer dosisabhängigen Art und Weise beeinflusst hat.
Beispiel 4: Effekt der TNFH(–)-Proteinmutante auf die Funktion von Wildtyp-CD154.
Um zu prüfen, ob die Co-Expression der CD154-Mutante die Funktion des Wildtypproteins beeinflusst, wurden UV-bestrahlte Membranen von transfizierten COS7-Zellen, die mit Wildtyp und/oder CD154-Mutante codierenden cDNA(s) transfiziert waren, für 24 Stunden mit BJAB-Zellen inkubiert. Die für die COS7-Transfektionen verwendeten Verhältnisse von Wildtyp- zu mutierten cDNAs werden in 3B angezeigt. Die BJAB-Zellen wurden mit den Biotin-markierten anti-Lymphotoxin-α-mAk, NC2, gefärbt und dann mit Phycoerythrin-markiertem Streptavidin und zum Abschluss mit 1% Paraformaldehyd fixiert. Danach wurde die FACS-Analyse der BJAB-Zellen verwendet, um die Menge des hochregulierten Lyphotoxins-α auf der Oberfläche der Zellen zu bestimmen (3A, in welcher die Säulen die mittleren Fluoreszenzintensitäten darstellen).
3A und 3B zeigen, dass die Co-Expression des mutierten CD154-Proteins mit dem Wildtypprotein die Lymphotoxin-α-Hochregulierungs-Aktivität des auf den Plasmamembranen vorhandenen Wildtypproteins vermindert. Dieser hemmende Effekt war dosisabhängig. Wenn die Menge der für die Transfektion verwendeten Wildtyp-cDNA ein Drittel der mutierten cDNA war, war die funktionelle Aktivität von CD154 unten auf dem Hintergrundniveau.
Beispiel 5: Die TNFH(–)-Mutante wird nicht auf der Zelloberfläche exprimiert.
Es gibt mindestens zwei mögliche Mechanismen, durch welche die CD154-Mutante die Wildtyp-CD154-Funktionen in einer dosisabhängigen Weise hemmt. Erstens kann ein Wildtyp-CD154, das mit einer CD154-Mutante verbunden ist, in der Interaktion mit CD40 weniger aktiv sein. Zweitens kann ein Wildtyp-CD154, das mit einer CD154-Mutante verbunden ist, überhaupt nicht funktionsfähig sein und die in der Hochregulierung von Lymphotoxin-α beobachtete Aktivität kann ausschließlich auf den Wildtypproteinen beruhen, die frei von der Vereinigung mit mutierten Proteinen sind. Um diese beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, haben wir als Nächstes die biochemischen Eigenschaften der auf der Zelloberfläche exprimierten CD154-Proteine untersucht.
Um das zu tun, wurden COS7-Zellen an Tag 1 mit cDNA, die CD154-Wildtyp codierte, oder mit cDNA, welche die TNFH(–)-Mutante codierte, oder mit beiden transfiziert. Die Transfektanten wurden am 4. Tag mit PBS gespült, um Zelltrümmer und nicht angehaftete Zellen zu entfernen, und dann in situ mit Biotin markiert. Die Markierung wurde unter Verwendung von Biotin-Sulfo-NHS bei 0,5 mg/ml in Wasser durchgeführt, das für 3 Minuten bei Raumtemperatur auf den Zellen belassen wurde. Die Reaktion wurde unter Verwendung von Glycin beendet, wobei die transfizierten Zellen für 15 Minuten in einem enormen molaren Überschuss von Glycin verblieben, danach wurden sie mit PBS gespült.
Die transfizierten Zellen wurden dann lysiert, zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen, und mit CD40-Fc, Rb779, Rb784 oder 9E10 immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden einer Elektrophorese in einem 10–20% SDS-Polyacrylamidgel unterzogen, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit Streptavidin, welches mit Meerrettich-Peroxydase konjugiert war, durchmustert (4).
4 zeigt, dass das CD40-Fc-Fusionsprotein, Rb784 und Rb779, aber nicht 9E10 das mit Biotin markierte Wildtypprotein immunpräzipitierten. Außerdem war die auf der Zelloberfläche nachgewiesene Menge an Wildtyp-CD154 umgekehrt proportional zum Verhältnis der für die Co-Transfektion verwendeten mutierten cDNA zu Wildtyp-cDNA. Die Expression der TNFH(–)-Proteinmutante verhinderte daher die Oberflächenexpression des Wildtypproteins in einer dosisabhängigen Art und Weise. Es ist wichtig, dass wir keine Biotin-markierte Proteinmutante (p17) in den Immunpräzipitaten mit CD40-Fc-Fusionsprotein, Rb784 und Rb779 nachgewiesen haben, was darauf hindeutet, dass die mit Biotin markierten, d.h. auf der Zelloberfläche exprimierten, Wildtypproteine nicht mit der TNFH(–)-Proteinmutante verbunden waren. Da es insgesamt acht Lysinreste in der extrazellulären Domäne der TNFH(–)-Mutante gibt, war es unwahrscheinlich, dass keiner dieser Lysinreste unter den experimentellen Bedingungen für die Biotinylierung zugänglich war, so dass die auf der Oberfläche vorhandenen mutierten Proteine unentdeckt blieben. Die Tatsache, dass 9E10 keine Wildtypproteine immunpräzipitierte, deutet außerdem darauf hin, dass kein Wildtypprotein der Zelloberfläche mit der TNFH(–)-Mutante verbunden war.
Zusammen mit den in 1 gezeigten Ergebnissen, deuten diese Daten darauf hin, dass Wildtyp-CD154-Proteine, die frei von der Vereinigung mit der TNFH(–)-Mutante sind, auf der Zelloberfläche exprimiert wurden. Wildtypproteine, die im Komplex mit der TNFH(–)-Mutante vorlagen, wurden jedoch innerhalb der Zelle zurückbehalten. Die Vereinigung mit der TNFH(–)-Mutante verhindert daher die Expression des CD154-Wildtyps auf der Zelloberfläche.
5 veranschaulicht diesen hemmenden Vorgang. Wenn die Wildtyp- und mutierten Proteine co-exprimiert werden, können die Wildtypproteine, mit oder ohne der verbundenen TNFH(–)-Mutante, Trimere bilden. Jene, die von dem mutierten Protein gebunden werden, können jedoch nicht auf die Zelloberfläche ausreifen. Die Vereinigung mit TNFH(–) an sich beeinträchtigt die Fähigkeit des Wildtypproteins, mit dem CD40-Rezeptor zu interagieren, nicht.
Beispiel 6: Erörterung der experimentellen Ergebnisse
Um den möglichen dominant-negativen Effekt der TNFH(–)-Variante auf Wildtyp-CD154 zu untersuchen, haben wir diese beiden Proteine in COS-Zellen coexprimiert und ihre biochemischen und funktionellen Eigenschaften untersucht. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass das mutierte Protein die Zelloberflächenexpression von Wildtyp-CD154 durch Komplexbildung mit dem Wildtypprotein verhindert. Diese Beobachtung ist in mindestens zwei Aspekten wesentlich. Erstens impliziert sie, dass, während die Zellen eines Patienten im Stande sind, sowohl Wildtyp- als auch TNFH(–)-CD154-Proteinmutanten herzustellen, scheitern sie, ein funktionsfähiges CD154 auf der Zelloberfläche zu produzieren und führen zu einem Hyper-IgM-Phänotyp. Zweitens offenbart unsere Beobachtung, dass zusätzlich zu der TNFH-Domäne auch andere Teile von CD154 am Zusammenbau der CD154-Trimere beteiligt sind.
Da CD154 auf der Zelloberfläche von T-Lymphocyten nach Aktivierung transient exprimiert wird, wird sogar eine teilweise Verminderung der Oberflächenexpression dieses Proteins bei der Unterdrückung von unenrwünschten T-Zell-vermittelten Immunantworten vorteilhaft sein. Die Einführung einer CD154-Variante, welcher eine funktionsfähige TNFH-Domäne fehlt, in Ziel-T-Zellen wird daher durch wirkungsvolle Blockierung der Expression von funktionsfähigem CD154 auf der Oberfläche der Zielzellen, ein therapeutische Chance bereitstellen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In vitro-Verfahren zur Verminderung der Expression von CD154-Wildtyp auf der Oberfläche einer Zelle, wobei das Verfahren den Schritt des Einführens eines Nucleinsäurekonstruktes in die Zelle umfasst, das die Expression einer CD154-Mutante lenkt, der eine funktionsfähige zum Tumornekrosefaktor homologe Domäne des CD154-Wildtyps fehlt, wobei die CD154-Mutante in der Lage ist, den CD154-Wildtyp im Innern einer Zelle zu binden, in der die CD154-Mutante und der CD154-Wildtyp beide exprimiert werden, und wobei die CD154-Mutante dabei den CD154-Wildtyp unfähig machen kann, an die Zelloberfläche zu gelangen.
Verwendung eines Nucleinsäurekonstruktes, das die Expression einer CD154-Mutante lenkt, der eine funktionsfähige zum Tumornekrosefaktor homologe Domäne des CD154-Wildtyps fehlt, wobei die CD154-Mutante in der Lage ist, den CD154-Wildtyp im Innern einer Zelle zu binden, in der die CD154-Mutante und der CD154-Wildtyp beide exprimiert werden, und wobei die CD154-Mutante dabei den CD154-Wildtyp unfähig machen kann, an die Zelloberfläche zu gelangen, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der an einer CD154-vermittelten Krankheit leidet oder für eine CD154-vermittelte Krankheit prädisponiert ist, wobei die CD154-vermittelte Krankheit Transplantatabstoßung, eine Autoimmunkrankheit oder eine Entzündungskrankheit ist.
Verwendung eines Nucleinsäurekonstruktes, das die Expression einer CD154-Mutante lenkt, der eine funktionsfähige zum Tumornekrosefaktor homologe Domäne des CD154-Wildtyps fehlt, wobei die CD154-Mutante in der Lage ist, den CD154-Wildtyp im Innern einer Zelle zu binden, in der die CD154-Mutante und der CD154-Wildtyp beide exprimiert werden, und wobei die CD154-Mutante dabei den CD154-Wildtyp unfähig machen kann, an die Zelloberfläche zu gelangen, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der an einer CD154-vermittelten Krankheit leidet oder für eine CD154-vermittelte Krankheit prädisponiert ist, wobei die CD154-vermittelte Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lupus, systemischem Lupus erythematodes, Lupusnephritis, Lupusneuritis, Asthma, chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung, Bronchitis, Emphysem, Multipler Sklerose, Uveitis, Alzheimer-Krankheit, traumatischer Gehirnverletzung, traumatischer Rückenmarksverletzung, Schlaganfall, Atherosklerose, Coronarrestenose, ischämischer kongestiver Herzinsuffizienz, Cirrhose, Hepatitis C, diabetischer Nephropathie, Glomerulonephritis, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, atopischer Dermatitis, systemischer Sklerose, strahleninduzierter Fibrose, Morbus Crohn, eiternder Colitis, multiplem Myelom, Augenentzündung und Kachexie.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der CD154-Mutante mindestens ein Teil der zum Tumornekrosefaktor homologen Domäne des CD154-Wildtyps fehlt.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 4, wobei die CD154-Mutante aus den Aminosäureresten 1 bis 96 von SEQ ID NO:1 besteht.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Nucleinsäurekonstrukt einen Virus-abgeleiteten Vektor umfasst.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Virus-abgeleitete Vektor ein retroviraler Vektor, lentiviraler Vektor, adenoviraler Vektor oder adeno-assoziierter viraler Vektor ist.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Nucleinsäurekonstrukt oder das Arzneimittel in die Zelle oder den Patienten über virale Transduktion eingeführt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Arzneimittel so gestaltet ist, um in vivo oder ex vivo in die Zelle oder in den Patienten eingeführt zu werden.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zelle eine T-Zelle oder ein Megakaryocyt, eine Säugerzelle, eine menschliche Zelle oder eine menschliche T-Zelle ist.
Arzneimittel, umfassend ein Nucleinsäurekonstrukt, das die Expression einer CD154-Mutante lenkt, der eine funktionsfähige zum Tumornekrosefaktor homologe Domäne des CD154-Wildtyps fehlt, wobei die CD154-Mutante in der Lage ist, den CD154-Wildtyp im Innern einer Zelle zu binden, in der die CD154-Mutante und der CD154-Wildtyp beide exprimiert werden, und wobei die CD154-Mutante dabei den CD154-Wildtyp unfähig machen kann, an die Zelloberfläche zu gelangen.
Arzneimittel nach Anspruch 11, wobei der CD154-Mutante mindestens ein Teil der zum Tumornekrosefaktor homologen Domäne des CD154-Wildtyps fehlt.
Arzneimittel nach Anspruch 12, wobei die CD154-Mutante aus den Aminosäureresten 1 bis 96 von SEQ ID NO:1 besteht.