JP2004503237A - Cd154改変体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
標的細胞の表面における野生型CD154の発現を減少(例えば、阻害)するための方法およびCD154媒介疾患に罹患した患者またはCD154媒介疾患にかかりやすい患者を処置するための方法。これの方法において、腫瘍壊死因子相同ドメイン(「TFTH」)の少なくとも一部を欠く変異CD154の発現を指向する核酸は、標的細胞(例えば、Tヘルパー細胞または傷害性T細胞)に導入される。発現した変異CD154は、細胞内の野生型CD154に結合し、野生型タンパク質が、細胞表面に到達するのを不可能にする。
Description
【0001】
(発明の技術分野)
本発明は、標的細胞の表面における野生型CD154の発現を阻害するために腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも一部を欠くCD154改変体を使用する方法に関する。本発明の方法は、CD154依存免疫障害の処置または阻害において有用である。
【0002】
(発明の背景)
CD154(すなわち、CD40リガンドまたはCD40L)は、活性化T細胞において主に発現されるII型膜タンパク質である。CD154とそのレセプター(CD40)の相互作用は、B細胞において分化、増殖および免疫グロブリンイソ型の転換を誘導するTヘルパー細胞の機能に重要である(概説に関して、Foyら,Annu Rev Immunol 14:591−617(1996);van Kootenら,J Leukoc Biol 67:2−17(2000)を参照のこと)。CD154遺伝子(染色体領域Xq2.6−2.7に位置される)は、12キロベースを越えるペアに及び、そして5個のエキソンを含む(Villaら,Proc Natl Acad Sci USA 91:2110−4(1994))。
【0003】
第1のエキソンは、細胞質領域、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの6個のアミノ酸をコードする。第2および第3のエキソンは、細胞外ストーク領域をコードする。第4および第5のエキソンは、C末端147アミノ酸(Villaら,上述)(腫瘍壊死因子(「TNF」)ファミリーの他のメンバーと有限の相同性を共有する領域)をコードし、従って、TNF相同(「TNFH」)ドメインと称される。CD154TNFHドメインのX線構造は、ゼリーロール形態またはGreekキー形態を伴う2つのβシートのサンドイッチ様折り畳み形態を含むことが明らかである。TNFファミリーのメンバーは、II型膜タンパク質の配置を共有するが、これらのメンバー間の有限の相同性は、約150アミノ酸残基のC末端TNFHドメインに位置する。
【0004】
TNF様およびリンフォトキシン−α、野生型CD154は、トリマーとして存在する(Karpusasら,Structure 3:1031−9(1995))。CD154トリマーの形成は、TNFHドメインによって媒介される。TNFHドメインは、単独でトリマーを形成し得ることが示されている(PCT特許出願番号WO97/00895;Karpusasら,上述;Mazzeiら,J Biol Chem 270:7025−8(1995))。このドメインの主要な部分を欠いた欠失変異体は、トリマーとして存在しないようである(Garberら,J Biol Chem 274:33545−50(1999))。従って、TNFHドメインは、トリマーCD154タンパク質のアセンブリに必要かつ十分であることが明らかである。
【0005】
機能的CD154タンパク質の発現を防止するCD154遺伝子の変異は、血清中の増大したIgMレベルならびに低いIgGレベルおよびIgAレベルによって特徴付けられる免疫不全に導き得る。CD154遺伝子は、ヒトにおけるX染色体に位置するので、この免疫不全は、X結合高IgM症候群(X−linked hyper−IgM syndrome)(「XHIM」)と呼ばれる(Allenら,Science 259:990−3(1993);Korthauerら,Nature 361:539−41(1993);DiSantoら,Nature 361:541−3(1993);Aruffoら,Cell 72:291−300(1993);Fuleihanら,Proc Natl Acad Sci USA 90:2170−3(1993))。CD154遺伝子の70を超える固有の変異は、100を越えるXHIN患者において同定されている(Notarangeloら,Immunol Today 17:511−6(1996))。これらの変異は、非常に異質である。これらは、挿入、欠失および点変異を含む。従って、XHIN患者におけるCD154の機能的欠失の関する潜在的な機構は、異なることが考えられる(Garberら,上述;Seyamaら,Blood 92:2421−34(1998))。
【0006】
CD154遺伝子は、X結合型であるので、正常な個体またはXHIM患者由来の各細胞は、CD154コード転写物の単一種を作製する。しかし、いく人かのXHIN患者において、ドナースプライシング部位における変異(Seyamaら,上述;および本明細書中に引用される参考文献)またはアクセプタースプライシング部位における変異(Ameratungaら,Clin Diagn Lab Immunol 3:722−6(1996))は、単細胞においてmRNA転写物の複数の種の産生を導く。これら転写物は、野生型CD154をコードする正常スプライス転写物およびTNFHドメインの主要な部分または完全なTNFHドメインのいずれかを欠く改変体CD154タンパク質をコードするミススプライス転写物を含む(Seyamaら,上述;Ameratungaら,上述)。
【0007】
TNFHドメインは、単独でトリマーCD154タンパク質のアセンブリの原因であることが明らかであるので、TNFHドメインを欠く改変体は、野生型タンパク質のトリマー化に影響しないことが予測された。従って、CD154遺伝子のスプラシング部位における変異を有する患者が、なぜ、機能性CD154タンパク質の欠損の結果によっておそらく生じる、XHIN症候群を示すのかは明らかではない。
【0008】
(発明の要旨)
本発明は、TNFHドメインの少なくとも一部を欠くCD154改変体が、それにもかかわらず、ストーク領域を介して野生型CD154タンパク質に相互作用し得るという発明者らの発見に基づく。この相互作用は、野生型CD154タンパク質を細胞内に保持し、それによって、細胞表面に野生型タンパク質が発現されることを防止し、そして任意のCD154機能的活性に関与する。この発見は、CD154トリマーアセンブリに起因する以前に認識されていない構造的エレメントとしてCD154タンパク質のストーク領域を明らかにする。
【0009】
従って、本発明は、標的細胞の表面における野生型CD154タンパク質の発現を減少する(阻害することを含む)方法を提供する。この方法において、組換え核酸構築物は、CD154発現標的細胞に導入され、ここでこの構築物は、野生型タンパク質の機能的TNFHドメインを欠いたCD154改変体タンパク質の発現を指向し得る。その結果、改変体タンパク質は、トリマー化できず、そしてなお野生型タンパク質に結合し得、野生型タンパク質が、細胞表面に到達するのを不可能にする。例えば、改変体は、TNFHドメインの少なくとも一部を欠く。この例に関して、本発明に有用なCD154改変体は、TNFHドメインの少なくとも5個(例えば、少なくとも10個;少なくとも15個;または少なくとも20個)アミノ酸を欠き得る。1つの実施形態において、CD154改変体は、完全にTNFHドメインを欠き得る。別の実施形態において、CD154改変体は、挿入変異および/または点変異を有するTNFHドメインを含み得る。
【0010】
本明細書中で使用される場合、CD154のTNFHドメインは、以下の配列番号1のアミノ酸残基116〜261の範囲の領域に対応する。
【0011】
【表1】
配列番号1は、ヒトCD154の全長配列を示し、そして登録番号CAA48554下でGenGankにおいて利用可能である(Grafら,Eur,J. Immunol.22(12):3191−4(1992)に参照される)。配列番号1の対立遺伝子アイソフォームはまた、本発明において有用なCD154改変体についての同族の配列として使用され得る。
【0012】
本発明において有用であるCD154改変体の例としては、配列番号の1の以下:(1)アミノ酸残基116〜136、(2)アミノ酸残基137〜261、(3)アミノ酸残基115〜261、および(4)アミノ酸残基97〜261をそれぞれ欠失するものが挙げられる。CD154改変体を作製する方法は、当該分野で公知である。例えば、Garberら、J.Biol.Chem.274:33545〜550(1999)の図1および表1を参照のこと。
【0013】
本発明はさらに、被験体(すなわち、霊長類のような哺乳動物、好ましくはヒト)において、CD154依存性疾患(例えば、CD154:CD40相互作用によって媒介される免疫障害)を処置または阻害する方法を提供する。この方法は、この被験体の標的細胞(例えば、T細胞(例えば、CD4+T細胞およびCD8+T細胞)または巨核球)に、本発明のCD154改変体を投与し、それによって標的細胞の表面上の野生型CD154の発現を減少させる工程を包含する。1つの実施形態において、CD154改変体は、標的細胞の内部で産生され、これは、その改変体をコードする核酸配列を含む遺伝子発現構築物の細胞による取り込みに基づく。
【0014】
本発明の方法論はまた、他のTNFリガンドファミリータンパク質(例えば、FASリガンド)の改変体を産生するためにも使用され得、ここで、これらのタンパク質のTNFHドメインは、変異(例えば、欠失、挿入、および/または点変異)によってトリマー形成が不可能になり、その結果、生じた改変体が、対応する野生型タンパク質に結合し、そしてこのタンパク質を細胞内に保持し、野生型タンパク質の細胞表面の発現を妨害する。TNFレセプターファミリーの一般的な総説については、Fahrerら、Nature 409:836〜8(2001)およびLocksleyら、Cell 104:487〜501(2001)を参照のこと。
【0015】
本発明の方法において有用なCD154変異体の発現を指向する核酸構築物を含む薬学的組成物もまた、本発明の範囲内である。本発明はまた、標的細胞の表面上の野生型CD154の発現を減少させるため、および/またはCD154媒介疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい患者を処置するための、医薬を製造するためのこのような構築物の使用を提供する。
【0016】
本発明は、被験体の身体における治療的処置を必要とする部位で、局所送達および標的細胞による取り込みのために非常に適切である。例えば、本明細書中に記載される遺伝子発現構築物は、脾臓もしくは他のリンパ組織に、または炎症の部位(例えば、損傷部位もしくは病変)に、局所的に(例えば、注射によって)投与され得る。このような局所処置は、免疫調節剤の全身送達で遭遇し得る、いずれの合併症も回避する。
【0017】
さらに、この遺伝子発現構築物は、細胞外免疫調節剤(例えば、抗体)の潜在的な弱点を無効にする。細胞表面抗原に結合する場合、抗体は、例えば、抗体依存性細胞の細胞傷害性応答を介して、またはその細胞表面上にFcレセプターを示すマクロファージまたは他のエフェクター細胞によって、細胞破壊を誘引し得る。このような細胞破壊は、特定の治療的設定において望ましいものではあり得ない。
【0018】
本発明の他の特徴および利点は、以下の図および詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲からもまた、明らかである。
【0019】
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価なものもまた、本発明の実施において使用され得る。
本明細書中において言及される全ての刊行物および他の参考文献は、その全体において参考として援用される。矛盾する場合、本明細書(定義を含む)が、支配する。材料、方法、および実施例は、例示のみであり、限定を意図するものではない。
【0020】
(発明の詳細な説明)
過去10年間において、T細胞の活性化は、T細胞抗原レセプター(「TCR」)媒介シグナルと、同時に送達される同時刺激シグナルとの両方を必要とすることが確証されてきた。例えば、タンパク質抗原に対する応答における、B細胞による抗体産生は、B細胞とヘルパーT細胞との間の抗原特異的な相互作用、およびB細胞とT細胞との間の非抗原特異的な同時刺激レセプターリガンドの相互作用を必要とする。これらの非抗原特異的な相互作用としては、B細胞上のCD40の、T細胞上のCD154に対する結合が挙げられる。
【0021】
ヒトCD40は、成熟B細胞、マクロファージおよび活性化された内皮細胞上で発現する、50kDの細胞表面タンパク質である。CD40は、増殖およびアポトーシスに関連するレセプター(Fas/CD95、TNFレセプターおよびリンホトキシンレセプターを含む)のクラスに属する。ヒトCD154は、主に活性化されたT細胞上で一過的に発現する、32kDのII型膜糖タンパク質である。CD40:CD154の相互作用は、基本的に全てのT細胞依存性免疫応答(抗体応答を含む)のために必要とされる。特に、CD40:CD154の相互作用は、抗アポトーシス刺激性シグナルおよび/またはリンホカイン刺激性シグナルを提供する。
【0022】
本発明は、TNFHドメインの少なくとも一部を欠失するCD154の変異性改変体が、野生型CD154と細胞内で結合し得、そして野生型タンパク質が細胞表面に達することを阻害するという驚くべき発見に基づく。従って、被験体のT細胞におけるこのようなCD154改変体の発現は、野生型CD154の細胞表面発現を排除することによって、CD154依存性免疫応答を特異的に抑制し得る。
【0023】
(疾患の処置)
CD40:CD154相互作用は、タンパク質抗原に対するT細胞依存性免疫応答(抗体媒介体液性免疫応答およびT細胞媒介炎症性応答を含む)の誘導において中心的であることが知られている。好ましくない免疫応答もしくは病的な免疫応答を防ぐためまたは処置するために、この相互作用に介入する手段を開発する、多くの試みがいくつかの研究者のグループによってなされてきたが、治療的な設定において、CD40:CD154相互作用を妨害する手段を改善する必要性が残存する。
【0024】
本発明は、この改善された手段を提供する。本発明に従って、機能的TNFHドメインを欠失するCD154改変体(例えば、TNFH−マイナスCD154変異体)は、有意な炎症系または免疫系の関与によって特徴付けられ得るCD154依存性疾患を処置(例えば、緩和、遅延もしくは無効化)するためか、または阻害(例えば、発症もしくは進行の予防)するために、被験体中の標的T細胞中に導入され得る。このような疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:狼瘡、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ループス神経炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、気腫、多発性硬化症、ブドウ膜炎、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷、発作、アテローム性硬化症、冠動脈再狭窄、虚血性うっ血性心不全、肝硬変、C型肝炎、糖尿病性ネフロパシー、糸球体腎炎、自己免疫疾患、変形性関節症、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、全身性硬化症、放射線誘導性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性骨髄腫、眼球の炎症性疾患、対宿主性移植片病、移植拒絶(例えば、角膜および網膜の移植拒絶)、または悪液質。
【0025】
CD154変異性改変体はまた、疾患の症状をまだ示していない患者に、予防的に投与され得る。例えば、CD154改変体を使用して、移植を受ける患者を、可能性のある移植拒絶を予防または緩和するように処置し得る。
【0026】
1つの実施形態において、CD154改変体タンパク質は、改変体タンパク質を含むリポソームまたは他の適切なキャリア(例えば、ミクロスフェア)の局所注射によって、標的細胞に導入され得る。標的化を増大するために、リポソームまたは他の適切なキャリアは、組織特異的レセプターのリガンドとして機能する分子でコーティングされ得る。
【0027】
(遺伝子治療)
本発明に従って、TNFH−マイナスCD154変異体はまた、変異体CD154タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸構築物を細胞内で発現することによって、標的細胞に導入され得る。
【0028】
((1)ベクター)
本発明に従う核酸構築物は、複製していない直鎖状または環状DNAまたはRNAベクターから誘導され得るか、あるいは自己複製プラスミドもしくはウイルスベクターから誘導され得る。あるいは、この構築物は、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。T細胞をトランスフェクトまたは形質転換し得る任意のベクターが使用され得る。好ましいベクターは、ウイルスベクター(複製欠損レトロウイルス(例えば、WO 89/07136;Rosenbergら、N.Eng.J.Med.323(9):570〜578(1990)を参照のこと)、アデノウイルス(例えば、Morseyら、J.Cell.Biochem、補遺、17E(1993)を参照のこと)、アデノ随伴ウイルス(Kotinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87;2211〜2215(1990))、複製欠損単純ヘルペスウイルス(HSV;Luら、Abstract、66頁、Abstracts of the Meeting on Gene Therapy、9月、22〜26、1992、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York)、ワクシニアウイルス(Mukherjeeら、Cancer Gene Ther.7:663〜70(2000))由来のウイルスベクターを含む)、およびこれらのベクターの任意の改変バージョンである。発現ベクターを構築するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、第2版、Cold Spring Harbor、New York,1989を参照のこと。
【0029】
本発明のベクターは、T細胞を特異的に標的化し得る。遺伝子治療において有用なT細胞特異的ウイルスベクターは、当該分野で公知である。例えば、(1)Annenkovら、Gene Therapy 7:714〜22(2000);Cavazzana−Calvoら、Science 288:669〜72(2000);およびFarsonら、J.Gene Med.1:195〜209(1999)のレトロウイルスベクター;(2)Hillerら、Gene Therapy 7:664〜74(2000)のヘルペスウイルスsaimiriベクター;(3)Kungら、J.Virol.74:3668〜81(2000)のHIVベースのハイブリッドベクター;(4)Costelloら、Gene Therapy 7:596〜604(2000)のHIV誘導レンチウイルスベクター;または(5)上記で言及したベクターの任意の改変バージョンを使用し得る。
【0030】
((2)発現制御配列)
これらのベクターにおいて、発現制御配列は、本発明の変異体タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。T細胞における所望のレベルの転写を指向し得る任意の発現制御配列が、使用され得る。真核生物細胞について、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー(免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルスなどから誘導されるようなもの)、およびポリアデニル化配列を含み得る。本発明の核酸構築物はまた、内部リボソーム侵入部位(internal ribosome entry site)(「IRES」)、および望ましくはプロモーター/エンハンサー配列と変異体CD154コード配列との間に位置し得るイントロンを含み得る。これらおよび他の通常のベクターエレメントの選択は、慣習的である。例えば、Sambrookら、前述;Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York.(1989);およびそれらに引用される参考文献を参照のこと。
【0031】
本発明の1つの実施形態において、CD154についてのネイティブなプロモーターが使用される。このネイティブなプロモーターは、変異体CD154の発現がネイティブな発現を模倣すべきであることが要求される場合、好ましくあり得る。変異体CD154の発現が、時間的もしく発育的に、または組織特異的な様式で、または特定のネイティブの転写刺激に応答して調節されなければならない場合、このネイティブなプロモーターが使用され得る。さらなる実施形態において、他のネイティブな発現制御エレメント(例えば、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはKozakコンセンサス配列)はまた、ネイティブな発現を模倣するために使用され得る。
【0032】
本発明の別の実施形態において、T細胞特異的プロモーターが所望される。このようなプロモーターとしては、2つのクラスが挙げられる:細胞型特異的プロモーターおよび活性化特異的プロモーター。このようなプロモーターの例としては、CD2、CD4、CD3、T細胞レセプターα鎖およびT細胞レセプターβ鎖、ならびにIL−2の遺伝子から誘導されるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
長期の免疫抑制を防ぐために、変異体CD154の発現を調節する誘導性プロモーターを使用することが望ましくあり得る。このようなプロモーターは、当該分野で公知である。これらのプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:(1)テトラサイクリン誘導性プロモーター(Gossenら、Science 268:1766〜1769(1995);Harveyら、Curr.Opin.Chem.Biol.2:512〜518(1998));(2)テトラサイクリン抑制プロモーター(Alverez−Vallinaら、Cancer Gene Therapy 7:526〜9(2000);Gossenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547〜5551(1992));(3)ラパマイシン誘導性プロモーター系(Yeら、Science 283:88〜91(1999);Magariら、J.Clin.Invest.100:2865〜2872(1997);およびRiveraら、Nat.Medicine 2:1028〜1032(1996));(4)亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター;(5)デキサメタゾン(Dex)誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター;(6)T7ポリメラーゼプロモーター系(WO98/10088);(7)エクジソン昆虫プロモーター(Noら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:3346〜3351(1996));(8)RU486誘導性プロモーター系(Wangら、Nat.Biotech.15:239〜243(1997);Wangら、Gene Ther.4:432〜441(1997));ならびに(9)上記のプロモーター系の改変バージョン。本発明において有用な他の型の誘導性プロモーターは、特定の、生理学的状態(例えば、体温)急性期によってか、または複製細胞においてのみ調節されるプロモーターである。
【0034】
本発明のさらに別の実施形態において、高レベルの構造的な発現が所望される。この目的のための例示的なプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター/エンハンサー、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター/エンハンサー(例えば、Boshartら、Cell 41:521〜530(1985)を参照のこと)、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β−アクチンプロモーター、およびホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーター。
【0035】
本出願によって提供される手引きを使用して、当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく上記の発現制御配列およびそれらの改変バージョンの間での選択を行い得る。
【0036】
((3)核酸構築物の投与)
本発明の核酸構築物は、インビボおよびインビトロにおける、一過性の遺伝子転移および/または安定な遺伝子転移の任意の形態において使用するための薬学的組成物として、処方され得る。この組成物は、少なくとも、核酸構築物および生理食塩水のような薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアであると公知であり、そして当業者に周知である、他の滅菌した水性懸濁液および非水性懸濁液もまた、使用され得る。この構築物は、インビボおよびエキソビボの遺伝子治療、インビトロにおけるタンパク質産生および診断的アッセイのために使用され得る。
【0037】
核酸構築物は、裸のDNAとしてか、または、例えば、リポソーム融合(例えば、Nabelら、Science 249:1285〜8(1990);Ledley,J Pediatrics 110:1〜8および167〜74(1987);Nicolauら、Proc Natl Acad Sci USA 80:1068〜72(1983)を参照のこと)、赤血球ゴースト、またはミクロスフェア方法(微粒子;例えば、米国特許第4,789,734号、同第4,925,673号、および同第3,625,214号);Gregoriadis、Drug Carriers in Biology and Medicine、287〜341頁、Academic Press、1979を参照のこと)によって標的細胞中に導入され得る。あるいは、核酸構築物は、T細胞特異的レセプターのリガンドに結合され、それによってレセプター媒介エンドサイトーシスを介してT細胞に侵入し得る。
【0038】
核酸構築物がウイルスベースの場合、これはまた、ビリオンとしてパッケージされ得、次いでこれは細胞(例えば、患者から単離された自系T細胞)をエキソビボで形質導入するために使用され得る。次いでこの感染細胞は、患者の身体に戻される。あるいは、組換えウイルスは、遺伝子治療分野の当業者によって決定されるように、患者に直接的に投与され得る(例えば、静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、および/または皮内投与)。徐放性デバイス(例えば、移植可能なポンプ)は、組換えウイルスを細胞に送達することを促進するために使用され得る。ウイルスが被験体に投与される場合、感染されるべき特定の細胞は、送達方法を制御することによって標的化され得る。例えば、ウイルスの静脈内注射は、ウイルスを循環T細胞に標的化することを促進するために使用され得る。局所送達部位についての身体の標的領域としては、例えば、肺、皮膚、リンパ節、胸腺、脾臓および骨髄が挙げられる。このような送達は例えば、局所的送達、吸入、エアロゾルもしくは局所注射経路(例えば、門脈カテーテルが挙げられる)によす送達であり得る。本発明の処置は、必要に応じて、当業者によって決定されたように、繰り返され得る。
【0039】
遺伝子治療における本発明の核酸構築物の投与量は、処置される状態のような因子に主に依存する。この投与量はまた、患者の年齢、体重および健康によって変化し得る。例えば、変異体CD154コードウイルスの効果的なヒト投与量は、一般に、投与される用量あたり約1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、または1×1016ウイルス粒子の濃度でウイルスを含む生理食塩水溶液の、約0.5ml〜50mlの範囲である。この投与量は、任意の有害な副作用に対して補正する利点のバランスを取るように調整される。変異体CD154の発現レベルは、投与量の投与の型および頻度を決定するためにモニターされ得る。
【0040】
本発明の薬学的組成物は、単独で、あるいは1つ以上の物質(タンパク質もしくは組換えベクターの生物学的安定性を増大する他のタンパク質または組換えベクターを含む)との、または、T細胞を選択的に標的化する組成物の能力を増大する物質との混合物において、あるいはこれらの物質との化合中において使用され得る。
【0041】
(併用治療)
さらに、本発明の薬学的組成物は、別の免疫調節レジメンと組み合わせて使用され得、所望の免疫抑制(例えば、霊長類レシピエントへの、長期間、無拒絶の異種ドナー組織の組み込み)を達成し得る。例えば、CD154:CD40相互作用をブロックするか、またはCD28、CD80またはCD86を介する、同時刺激をブロックする、薬剤が使用され得る。
【0042】
例示的なCD154:CD4O相互作用インヒビターは、CD154に対する抗体(例えば、ATCC受託番号HB 10916を有する、ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体(「mAb」)5c8;これは米国特許第5,474,771号で開示される);ImxM90、ImxM91、ImxM92(米国特許第5,961,974号に開示される);およびAncellから市販される抗体(クローン24−31、カタログ番号353−020、Bayport,MN)、Genzyme(Cambridge,MA,カタログ番号80−3703−01)、およびPharMingen(San Diego、カタログ番号33580D))である。多くのさらなる抗CD154抗体が、作製され、そして特徴づけられる(例えば、Bristol−Myers SquibbのPCT特許出願WO 96/23071を参照のこと)。
【0043】
CD154:CD40相互作用をブロックする、他の公知のイムノレギュレーターとしては、例えば、以下の他の型の抗CD154分子が挙げられる:完全Fabフラグメント、F(ab’)2化合物、VH領域、FV領域、単鎖抗体(例えば、PCT特許出願WO 96/23071を参照のこと)、ポリペプチド、融合タンパク質(例えば、Hollenbaughら、J.Immunol.Meth.188:1−7(1995)中のCD40Igを参照のこと)、および低分子化合物(低分子半ペプチド性化合物または低分子非ペプチド性化合物)。これらの全てのイムノレギュレーターは、CD40:CD154相互作用をブロックまた中断することが可能である。低分子を設計し、スクリーニングし、そして最適化するための手順は、PCT特許公開WO 97/00895中に提供され、これの明細書は、本明細書中で参考として援用される。
【0044】
遺伝子治療の間、組換えウイルスに対する潜在的な免疫応答を回避するために、Ohirmuleら、J.Virol.74:3345−52(2000)に記載の処置レジメンに同一かまたは類似の処置レジメンを採用することが所望され得る。このレジメンにおいて、患者は先ず、(1)変異体CD154挿入物がない組換えウイルスと、(2)ヒト化抗CD154抗体または他の同時刺激インヒビターのようなイムノレギュレーターとで同時に処置される。次いで、この患者を、変異体CD154コードウイルスで処置する。このような2工程のレジメンは、遺伝子治療患者においてしばしば副作用を生じる、組換えウイルス特異的体液性応答の、有意でありかつ延長された阻害を生じることが実証された。
【0045】
また、米国特許第5,872,174号およびPCT特許出願WO 96/26285を参照のこと。
【0046】
(変異体CD154遺伝子治療レジメンを評価するための、前臨床モデル系) 変異体CD154遺伝子治療レジメンの効力を試験するための例示的なモデル系は、Kirkら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:8789−8794(1997)に開示される、霊長類腎臓同種移植片モデルである。これの教示は、本明細書中で参考として援用される。このアカゲザルモデルは、免疫操作の綿密な試験として役割を果たし得、すなわち、同種移植片機能における軽微な変化またはレシピエントの創傷治癒および免疫系機能における悪影響に対してもこの上なく見事に感受性であるモデルである。さらに、これは、ヒト腎臓移植に対する生物学的な類似性を有し、すなわち、特に、MHCタンパク質をコードする遺伝子は、アカゲザルとヒトとの間で十分に保存されており、そしてアカゲザルの血管新生された器官の拒絶は、臨床的にみられる拒絶と極めて類似する。
【0047】
このモデル系が、腎(腎臓)組織を含む移植片を評価するために適切であることが容易に理解される。他の技術的に認められた(art−recognized)前臨床モデル系(好ましくは、霊長類モデル系)は、他の移植片移植型(例えば、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵島、皮膚、末梢神経、中枢神経の拒絶を抑制する際の、変異体CD154遺伝子治療の効力を評価するのに適切である。さらに、本発明に従う、変異体CD154遺伝子治療の効力は、ループス腎炎の動物モデル(例えば、PCT特許出願WO 98/30240および同WO 98/30241に記載されるモデル)で評価され得る。このような効力はまた、動物角膜同種移植片モデル(例えば、マウス角膜同種移植片モデル)で評価され得る。
【0048】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の方法および材料を例示することを意味する。当業者にとって明白であり、通常、当該分野で出会う、記載された条件およびパラメーターの適切な改変および適合は、本発明の精神および範囲の内にある。
【0049】
(実施例1:手順)
((1)細胞株、抗体、およびIg融合タンパク質)
BJAB、ヒトB細胞株は、Harvard Medical SchoolのDr.George Mosialosから寄贈された。この細胞株は、ペニシリン、ストレプトマイシン、10%熱不活化ウシ胎仔血清、および4mMのグルタミンを補充した、RPMI培地で維持した。mAb 9E10が、産生され、そしてこれを9E10ハイブリドーマの培養物から精製した。このハイブリドーマは、American Type Culture Collectionから入手可能である。また、mAb 9E10およびEQKLISEEDL mycタグに関しては、G.I.Evenら、「Isolation of Moncolonal Antibodies Specific for Human c−myc Proto−Oncogene Product」、Mel Cell Biol 5:3610−3816(1985)を参照のこと。CD40−Fc融合タンパク質、ヒト化5c8、およびウサギのポリクローナル抗体Rb779およびポリクローナル抗体Rb784を操作、産生、および精製をするための手順を、Hsuら、J Biol Chem 272:911−915(1997)に記載されるように実施した。
【0050】
((2)野生型CD154タンパク質および変異体CD154タンパク質の一過性発現)
野生型CD154 cDNAを、活性化ヒト末梢血細胞由来のcDNAライブラリーから単離した。このcDNAのコード配列は、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。CD154の変異体を構築する手順を、Gerberら(前出)に記載のように実施した。この野生型cDNAおよび変異体cDNAを、確認された配列を有する制限フラグメントから、CMVであり、前初期プロモーター駆動の、発現ベクター(COS7細胞中のSV40複製起点を含む)の中の独特のNotI部位に、サブクローンニングまたは再構築した。COS7細胞を、超らせんプラスミドDNAで、製造者の指示書に従ってリポフェクチン(GibcoBRL,Grand Island, New York)を使用してトランスフェクトした。全ての実施例において、CD154コード配列を欠くプラスミドDNAをネガティブコントロールとして使用し、野生型CD154コード配列を含むベクターを、ポジティブコントロールとして使用した。CD154およびこれの改変体の発現を、トランスフェクションの72時間後に回収した、トランスフェクトされた細胞に基づいて分析した。細胞表面タンパク質の代謝標識化およびビオチン化、免疫沈降、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(「SDS−PAGE」)、およびウェスタンブロット分析を、Hsuら(前出)に記載の手順を使用して実施した。
【0051】
トランスフェクトしたCOS7細胞からの膜画分の調製およびリンフォトキシン−αアップレギュレーションの分析のための手順を、以前に記載(Garberら、前出)のように実施した。
【0052】
(実施例2:TNFH(−)変異体は、野生型CD154に関連する)
野生型CD154の発現におけるTNFH(−)変異体の効果を調べるために、代謝的に標識した、これらのタンパク質をコードするcDNAで同時トランスフェクションされたCOS7細胞の溶解物を、CD154特異的抗体を使用して免疫沈降によって分析した。変異体タンパク質を野生型ヘテロ3量体複合体のp18成分から識別するために(Hsuら、前出)、mycタグを、CD154第1の96アミノ酸のC末端で操作して、異常なスプライシングを受ける転写産物で予測される非CD154アミノ酸(11アミノ酸または21アミノ酸)を置換した(Seyamaら(前出)中の、患者19、患者20および患者21)。
【0053】
CD154変異体と野生型のタンパク質との関連性を決定するために、35Sで代謝標識した、全長野生型CD154もしくはmycタグ化変異体CD154(配列番号1において、アミノ酸残基1〜96)のいずれか、またはこれらの両方をコードするcDNAを用いてトランスフェクトしたCOS7細胞から調製した細胞溶解物を、抗myc mAb 9E10、抗ヒトCD154 mAb 5c8、または抗CD154−C末端ペプチド抗血清Rb784(また「784」)で免疫沈降した。免疫沈降物を、10〜20%勾配のSDS−PAGEゲルにおける電気泳動、その後のオートラジオグラフィーで分析した(図1)。
【0054】
図1は、野生型CD154が単独で発現される場合に、抗CD154N末端ペプチド抗血清Rb784の免疫沈降物(レーン3)および抗CD154 mAb 5c8の免疫沈降物(レーン4)は、主に全長p33タンパク質、いくつかのp31タンパク質、および少量のp18を含んだ(p33、p31、およびp18は、野型CD154の成分である)。これは、本発明者らの以前の観察と一貫性がある(Hsuら、前出)。このp33成分、p31成分、p18成分は、抗myc mAb 9E10(レーン1)またはコントロールのウサギ抗血清(レーン2)のいずれの免疫沈降物中にも観察されなかった。変異CD154タンパク質(配列番号1のアミノ酸残基1〜96を含み、そしてmycタグに連結される)(「TNFH(−)」)が単独で発現される場合、p17成分(変異体タンパク質自体に対応する)は、9E10およびRb784のいずれによっても免疫沈降したが、mAb 5c8またはコントロールのウサギ抗血清(レーン5〜8)により免疫沈降しなかった。変異体タンパク質および野生型タンパク質が同時に発現したとき、9E10の免疫沈降物は、p17 mycタグ化変異体タンパク質のみではなく、p33、p31、およびp18の野生型タンパク質(レーン9)も含んだ。同様のタンパク質パターンが、Rb784およびmAb 5c8の免疫沈降物中に見出されたが、コントロールの血清(レーン10〜12)の中には見出されない。著しいのは、mAb 5c8免疫沈降物は、より少量のこれらのタンパク質を提示し、これは、全ての発現した野生型タンパク質が、5c8によって認識されたわけではないことを示唆する。
【0055】
上記のデータは、3つの重要な知見を明らかにした。第1に、変異体CD154タンパク質は、安定して産生され、容易に検出され得る。第2に、TNFHドメインを欠く変異体CD154タンパク質は、野生型CD154と結合し得る。第3に、少なくともいくつかの野生型タンパク質は、変異体タンパク質と結合するが、その結合エピトープが、CD40ついてのCD154結合部位に対する立体配座であり、そしてCD40ついてのCD154結合部位に対して類似することを示すmAb 5c8と相互作用し得る。
【0056】
(実施例3:TNFH(−)変異体タンパク質との結合によって、用量依存的様式で、野生型タンパク質のレセプター結合活性は減少する)
図1に示されるデータは、TNFH(−)CD154の、野生型CD154との結合が、野生型タンパク質のレセプターと結合する野生型タンパク質の能力を危うくし得ることを示唆する。これをさらに調べるために、発明者らは、COS7細胞を、(1)全長CD154をコードするcDNAを含む定量のプラスミド、およびTNFH(−)CD154をコードするcDNAを含む可変量のプラスミドでトランスフェクトした。次いで、このトランスフェクト体を、35Sで代謝的に標識し、そして溶解した。この溶解産物の免疫沈降物は、10〜20%勾配のSDS−ポリアクリルアミドゲル、その後のオートラジオグラフィーで分析した(図2)。
【0057】
図2は、Rb784によって免疫沈降された野生型CD154の量が、トランスフェクションに使用したTNFH(−)DNAの量にかかわらず、同一であることを示す(図2、下端のパネル)。レーン1においては、細胞を、野生型CD154をコードするプラスミドのみを用いてトランスフェクションした。レーン2〜4においては、細胞を、同量の野生型CD154プラスミドおよび可変量のTNFH(−)プラスミドでトランスフェクションした;前者のプラスミド 対 後者のプラスミドの比が、それぞれ、3:1、1:1、および1:3であった。レーン6においては、細胞をコントロールプラスミドのみでトランスフェクションした。
【0058】
図2に示されるデータは、野生型タンパク質の発現が、TNFH(−)変異体の導入によって影響を受けなかったことを示す。しかし、CD40−Fc融合タンパク質によってか、またはmAb 5c8によって認識される、野生型タンパク質の量は、トランスフェクションに使用されたTNFH(−)プラスミドの量に対して反比例した(図2、それぞれ、上端のパネルおよび中央のパネル)。興味深いことに、発現された総TNFH(−)変異体の少しの部分のみ(図2、下端パネル)が、CD40−FcまたはmAb 5c8のいずれかによって免疫沈降された。これらの結果は、TNFH(−)変異体の発現が、用量依存的様式で、野生型CD154のレセプター相互作用活性に影響を与えたが、野生型CD154の発現レベルに影響は与えなかったことを示す。
【0059】
(実施例4:野生型CD154の機能に対する、TNFH(−)変異体タンパク質の効果)
変異体CD154の同時発現が野生型タンパク質の機能に影響を与えるか否かを試験するために、野生型CD154および/または変異体CD154をコードするcDNAでトランスフェクションした、COS7細胞由来のUV照射膜を、BJAB細胞とともに24時間インキュベートした。COS7トランスフェクションに使用される変異体cDNAに対する、野生型の比を、図3Bに示す。このBJAB細胞を、ビオチン標識抗リンフォトキシン−α、mAb、NC2で標識し、次いで、フィコエリトリン−標識ストレプトアビジンで染色し、そして最終的に、1%パラホルムアルデヒドで固定した。BJAB細胞のFACS分析を、細胞表面上のアップレギュレーションしたリンフォトキシンαのレベルを決定するために続いて使用した(図3A、この中で、バーは、平均の蛍光強度を表現する)。
【0060】
図3Aおよび図3Bは、野生型タンパク質と変異体CD154タンパク質との同時発現が、原形質膜上に存在する野生型タンパク質のリンフォトキシン−αのアップレギュレーション能力を減少したことを示す。この阻害効果は用量依存的であった。トランスフェクションのために使用される、野生型cDNAの量は、変異体cDNAの3分の1であり、CD154の機能活性はバックグラウンドレベルの下であった。
【0061】
(実施例5:TNFH(−)変異体は、細胞表面において発現しない)
変異体CD154が野生型CD154の機能を用量依存様式で阻害する、少なくとも2つの可能な機構が存在する。第1に、変異体CD154と結合する野生型CD154は、CD40と相互作用する際に、より低い活性であり得る。第2に、変異体CD154に結合する野生型CD154は、全く機能し得ないこともあり、そしてリンフォトキシン−αのアップレギュレーションにおいて観察される活性は、変異体タンパク質との結合がない野生型タンパク質に排他的に起因し得る。これらの2つの可能性を識別するために、次に、発明者らは、細胞表面に発現する、CD154タンパク質の生物化学的な特性を調べた。
【0062】
これを行うために、COS7細胞を、第1日目に野生型CD154をコードするcDNA、またはTNFH(−)変異体をコードするcDNA、あるいはこれらの両方を用いてトランスフェクションした。このトランスフェクト体を、第4日目に、PBSでリンスし、細胞の破片および付着していない細胞を除去し、次いで、インサイチュにて、ビオチンで標識した。標識化は、細胞上に残った水の中で0.5mg/mlであるビオチン−スルホ−NHSを、室温にて3分間使用して実施した。この反応をグリシンを使用して停止して、このトランスフェクト体細胞を、膨大なモル濃度のグリシンで、15分間残留させ、その後これらをPBSでリンスした。
【0063】
次いで、このトランスフェクト体細胞を溶解し、遠心分離して細胞破片を除去し、そしてCD40−Fc、Rb779、Rb784、または9E10で免疫沈降した。免疫沈降物を、10〜20%SDS−ポリアクリルアミドゲルで、電気泳動に供し、ニトロセルロースメンブレン上に移し、西洋ワサビぺルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンでプローブした(図4)。
【0064】
図4は、CD40−Fc融合タンパク質、Rb784、およびRb779はビオチン標識野生型タンパク質を、免疫沈降するが、9E10は免疫沈降させないことを示す。さらに、細胞表面で検出された野生型CD154の量は、同時トランスフェクションに使用された、野生型cDNAに対する変異体cDNAの割合に、反比例した。従って、TNFH(−)変異体タンパク質の発現は、用量依存的様式での、野生型タンパク質の表面おける発現を阻止する。重要なことに、発明者らは、CD40−Fc融合タンパク質、Rb784、およびRb779での免疫沈降物中にビオチン標識変異体タンパク質(p17)を検出しなかった。これは、このビオチン標識(すなわち、細胞表面で発現される)、野生型タンパク質が、TNFH(−)変異体タンパク質と結合しかったことを示唆する。TNFH(−)変異体の細胞外ドメイン中に総数8のリジン残基が存在するので、これらのリジン残基のうちどれもが、表面に存在する変異体タンパク質が検出されないように、実験条件下で、ビオチン化について接触可能ではないということはなさそうである。さらに、9E10が任意の野生型タンパク質を免疫沈降させないという事実は、この細胞表面野生型タンパク質のいずれもが、TNFH(−)変異体に結合しなかったことを示している。
【0065】
図1に示される結果と一緒に、これらのデータは、TNFH(−)変異体と結合していない野生型CD154タンパク質が、細胞表面で発現されたことを示している。しかし、TNFH(−)変異体と複合体化する野生型タンパク質は、細胞内に保持されていた。従って、TNFH(−)変異体との結合は、野生型CD154が細胞表面で発現することを阻止する。
【0066】
図5は、この阻害プロセスを示している。野生型タンパク質および変異体タンパク質が同時に発現した場合に、野生型タンパク質は、結合したTNFH(−)変異体を伴うか、または伴わずして、3量体を形成し得る。しかし、この変異体タンパク質によって結合された野生型タンパク質は、細胞表面上へ成熟し得ない。se毎のTNFH(−)自体との結合は、野生型タンパク質がそのレセプターである、CD40と相互作用する能力を損なわない。
【0067】
(実施例6:実験結果の考察)
CD154に対するTNFH(−)変異体の潜在的なドミナントネガティブ効果を研究するために、発明者らは、これらの2つのタンパク質をCOS細胞で同時発現し、そしてこれらの生化学的特性および機能的特性を調べた。発明者らの結果は、野生型タンパク質の複合体化によって、この変異体タンパク質が、野生型CD154の細胞表面発現を阻止していることを示している。この観察は、少なくとも2つの局面において、有意である。第1に、患者の細胞は、野生型タンパク質およびTNFH(−)変異体CD154タンパク質の両方を産生し得るが、これらは、細胞表面上で機能的なCD154を産生することができず、そしてこれは、超(hyper−)IgM表現型を生じることを意味する。第2に、発明者らの観察によって、TNFHドメインに加えて、CD154の他の部位がまた、CD154 3量体のアセンブリに関与していることが明らかになった。
【0068】
CD154は、活性化においてTリンパ細胞の細胞表面上で一過的に発現するので、このタンパク質の表面発現の部分的な減少でさえ、望まないT細胞媒介免疫応答の抑制において有益である。従って、標的T細胞に対する機能的TNFHドメインを欠くCD154改変体の誘導によって、機能的CD154の標的細胞表面における発現の効果的なブロッキングによる治療機会が提供される。
【0069】
(他の実施形態)
本発明が、本発明の詳細な説明と合わせて記載されるが、前述の記載は、本発明を例示することを意図し、本発明の範囲を限定することは意図しないことが理解される。本発明の発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【0070】
他の局面、利点、および改変は、上記の特許請求の範囲のうちに含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、TNFH(−)CD154の野生型CD154との関連を示したオートラジオグラフである。
【図2】
図2は、機能的CD154トリマーの産生に対するTNFH(−)CD154の用量依存性の抑制効果を示す、オートラジオグラフのパネルである。
【図3】
図3Aおよび図3Bは、それぞれ、CD154変異体が、野生型CD154の、リンフォトキシン−αの上方制御活性を減少することを示す、棒グラフおよび表である。
【図4】
図4は、TNFH(−)CD154が、野生型CD154の細胞表面発現を妨げることを示す、オートラジオグラフのパネルである。
【図5】
図5は、TNFH(−)CD154が、細胞内部で野生型CD154に結合し、そしてこれが細胞表面に達することを阻害することを例示した説明図である。
(発明の技術分野)
本発明は、標的細胞の表面における野生型CD154の発現を阻害するために腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも一部を欠くCD154改変体を使用する方法に関する。本発明の方法は、CD154依存免疫障害の処置または阻害において有用である。
【0002】
(発明の背景)
CD154(すなわち、CD40リガンドまたはCD40L)は、活性化T細胞において主に発現されるII型膜タンパク質である。CD154とそのレセプター(CD40)の相互作用は、B細胞において分化、増殖および免疫グロブリンイソ型の転換を誘導するTヘルパー細胞の機能に重要である(概説に関して、Foyら,Annu Rev Immunol 14:591−617(1996);van Kootenら,J Leukoc Biol 67:2−17(2000)を参照のこと)。CD154遺伝子(染色体領域Xq2.6−2.7に位置される)は、12キロベースを越えるペアに及び、そして5個のエキソンを含む(Villaら,Proc Natl Acad Sci USA 91:2110−4(1994))。
【0003】
第1のエキソンは、細胞質領域、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの6個のアミノ酸をコードする。第2および第3のエキソンは、細胞外ストーク領域をコードする。第4および第5のエキソンは、C末端147アミノ酸(Villaら,上述)(腫瘍壊死因子(「TNF」)ファミリーの他のメンバーと有限の相同性を共有する領域)をコードし、従って、TNF相同(「TNFH」)ドメインと称される。CD154TNFHドメインのX線構造は、ゼリーロール形態またはGreekキー形態を伴う2つのβシートのサンドイッチ様折り畳み形態を含むことが明らかである。TNFファミリーのメンバーは、II型膜タンパク質の配置を共有するが、これらのメンバー間の有限の相同性は、約150アミノ酸残基のC末端TNFHドメインに位置する。
【0004】
TNF様およびリンフォトキシン−α、野生型CD154は、トリマーとして存在する(Karpusasら,Structure 3:1031−9(1995))。CD154トリマーの形成は、TNFHドメインによって媒介される。TNFHドメインは、単独でトリマーを形成し得ることが示されている(PCT特許出願番号WO97/00895;Karpusasら,上述;Mazzeiら,J Biol Chem 270:7025−8(1995))。このドメインの主要な部分を欠いた欠失変異体は、トリマーとして存在しないようである(Garberら,J Biol Chem 274:33545−50(1999))。従って、TNFHドメインは、トリマーCD154タンパク質のアセンブリに必要かつ十分であることが明らかである。
【0005】
機能的CD154タンパク質の発現を防止するCD154遺伝子の変異は、血清中の増大したIgMレベルならびに低いIgGレベルおよびIgAレベルによって特徴付けられる免疫不全に導き得る。CD154遺伝子は、ヒトにおけるX染色体に位置するので、この免疫不全は、X結合高IgM症候群(X−linked hyper−IgM syndrome)(「XHIM」)と呼ばれる(Allenら,Science 259:990−3(1993);Korthauerら,Nature 361:539−41(1993);DiSantoら,Nature 361:541−3(1993);Aruffoら,Cell 72:291−300(1993);Fuleihanら,Proc Natl Acad Sci USA 90:2170−3(1993))。CD154遺伝子の70を超える固有の変異は、100を越えるXHIN患者において同定されている(Notarangeloら,Immunol Today 17:511−6(1996))。これらの変異は、非常に異質である。これらは、挿入、欠失および点変異を含む。従って、XHIN患者におけるCD154の機能的欠失の関する潜在的な機構は、異なることが考えられる(Garberら,上述;Seyamaら,Blood 92:2421−34(1998))。
【0006】
CD154遺伝子は、X結合型であるので、正常な個体またはXHIM患者由来の各細胞は、CD154コード転写物の単一種を作製する。しかし、いく人かのXHIN患者において、ドナースプライシング部位における変異(Seyamaら,上述;および本明細書中に引用される参考文献)またはアクセプタースプライシング部位における変異(Ameratungaら,Clin Diagn Lab Immunol 3:722−6(1996))は、単細胞においてmRNA転写物の複数の種の産生を導く。これら転写物は、野生型CD154をコードする正常スプライス転写物およびTNFHドメインの主要な部分または完全なTNFHドメインのいずれかを欠く改変体CD154タンパク質をコードするミススプライス転写物を含む(Seyamaら,上述;Ameratungaら,上述)。
【0007】
TNFHドメインは、単独でトリマーCD154タンパク質のアセンブリの原因であることが明らかであるので、TNFHドメインを欠く改変体は、野生型タンパク質のトリマー化に影響しないことが予測された。従って、CD154遺伝子のスプラシング部位における変異を有する患者が、なぜ、機能性CD154タンパク質の欠損の結果によっておそらく生じる、XHIN症候群を示すのかは明らかではない。
【0008】
(発明の要旨)
本発明は、TNFHドメインの少なくとも一部を欠くCD154改変体が、それにもかかわらず、ストーク領域を介して野生型CD154タンパク質に相互作用し得るという発明者らの発見に基づく。この相互作用は、野生型CD154タンパク質を細胞内に保持し、それによって、細胞表面に野生型タンパク質が発現されることを防止し、そして任意のCD154機能的活性に関与する。この発見は、CD154トリマーアセンブリに起因する以前に認識されていない構造的エレメントとしてCD154タンパク質のストーク領域を明らかにする。
【0009】
従って、本発明は、標的細胞の表面における野生型CD154タンパク質の発現を減少する(阻害することを含む)方法を提供する。この方法において、組換え核酸構築物は、CD154発現標的細胞に導入され、ここでこの構築物は、野生型タンパク質の機能的TNFHドメインを欠いたCD154改変体タンパク質の発現を指向し得る。その結果、改変体タンパク質は、トリマー化できず、そしてなお野生型タンパク質に結合し得、野生型タンパク質が、細胞表面に到達するのを不可能にする。例えば、改変体は、TNFHドメインの少なくとも一部を欠く。この例に関して、本発明に有用なCD154改変体は、TNFHドメインの少なくとも5個(例えば、少なくとも10個;少なくとも15個;または少なくとも20個)アミノ酸を欠き得る。1つの実施形態において、CD154改変体は、完全にTNFHドメインを欠き得る。別の実施形態において、CD154改変体は、挿入変異および/または点変異を有するTNFHドメインを含み得る。
【0010】
本明細書中で使用される場合、CD154のTNFHドメインは、以下の配列番号1のアミノ酸残基116〜261の範囲の領域に対応する。
【0011】
【表1】
配列番号1は、ヒトCD154の全長配列を示し、そして登録番号CAA48554下でGenGankにおいて利用可能である(Grafら,Eur,J. Immunol.22(12):3191−4(1992)に参照される)。配列番号1の対立遺伝子アイソフォームはまた、本発明において有用なCD154改変体についての同族の配列として使用され得る。
【0012】
本発明において有用であるCD154改変体の例としては、配列番号の1の以下:(1)アミノ酸残基116〜136、(2)アミノ酸残基137〜261、(3)アミノ酸残基115〜261、および(4)アミノ酸残基97〜261をそれぞれ欠失するものが挙げられる。CD154改変体を作製する方法は、当該分野で公知である。例えば、Garberら、J.Biol.Chem.274:33545〜550(1999)の図1および表1を参照のこと。
【0013】
本発明はさらに、被験体(すなわち、霊長類のような哺乳動物、好ましくはヒト)において、CD154依存性疾患(例えば、CD154:CD40相互作用によって媒介される免疫障害)を処置または阻害する方法を提供する。この方法は、この被験体の標的細胞(例えば、T細胞(例えば、CD4+T細胞およびCD8+T細胞)または巨核球)に、本発明のCD154改変体を投与し、それによって標的細胞の表面上の野生型CD154の発現を減少させる工程を包含する。1つの実施形態において、CD154改変体は、標的細胞の内部で産生され、これは、その改変体をコードする核酸配列を含む遺伝子発現構築物の細胞による取り込みに基づく。
【0014】
本発明の方法論はまた、他のTNFリガンドファミリータンパク質(例えば、FASリガンド)の改変体を産生するためにも使用され得、ここで、これらのタンパク質のTNFHドメインは、変異(例えば、欠失、挿入、および/または点変異)によってトリマー形成が不可能になり、その結果、生じた改変体が、対応する野生型タンパク質に結合し、そしてこのタンパク質を細胞内に保持し、野生型タンパク質の細胞表面の発現を妨害する。TNFレセプターファミリーの一般的な総説については、Fahrerら、Nature 409:836〜8(2001)およびLocksleyら、Cell 104:487〜501(2001)を参照のこと。
【0015】
本発明の方法において有用なCD154変異体の発現を指向する核酸構築物を含む薬学的組成物もまた、本発明の範囲内である。本発明はまた、標的細胞の表面上の野生型CD154の発現を減少させるため、および/またはCD154媒介疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい患者を処置するための、医薬を製造するためのこのような構築物の使用を提供する。
【0016】
本発明は、被験体の身体における治療的処置を必要とする部位で、局所送達および標的細胞による取り込みのために非常に適切である。例えば、本明細書中に記載される遺伝子発現構築物は、脾臓もしくは他のリンパ組織に、または炎症の部位(例えば、損傷部位もしくは病変)に、局所的に(例えば、注射によって)投与され得る。このような局所処置は、免疫調節剤の全身送達で遭遇し得る、いずれの合併症も回避する。
【0017】
さらに、この遺伝子発現構築物は、細胞外免疫調節剤(例えば、抗体)の潜在的な弱点を無効にする。細胞表面抗原に結合する場合、抗体は、例えば、抗体依存性細胞の細胞傷害性応答を介して、またはその細胞表面上にFcレセプターを示すマクロファージまたは他のエフェクター細胞によって、細胞破壊を誘引し得る。このような細胞破壊は、特定の治療的設定において望ましいものではあり得ない。
【0018】
本発明の他の特徴および利点は、以下の図および詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲からもまた、明らかである。
【0019】
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価なものもまた、本発明の実施において使用され得る。
本明細書中において言及される全ての刊行物および他の参考文献は、その全体において参考として援用される。矛盾する場合、本明細書(定義を含む)が、支配する。材料、方法、および実施例は、例示のみであり、限定を意図するものではない。
【0020】
(発明の詳細な説明)
過去10年間において、T細胞の活性化は、T細胞抗原レセプター(「TCR」)媒介シグナルと、同時に送達される同時刺激シグナルとの両方を必要とすることが確証されてきた。例えば、タンパク質抗原に対する応答における、B細胞による抗体産生は、B細胞とヘルパーT細胞との間の抗原特異的な相互作用、およびB細胞とT細胞との間の非抗原特異的な同時刺激レセプターリガンドの相互作用を必要とする。これらの非抗原特異的な相互作用としては、B細胞上のCD40の、T細胞上のCD154に対する結合が挙げられる。
【0021】
ヒトCD40は、成熟B細胞、マクロファージおよび活性化された内皮細胞上で発現する、50kDの細胞表面タンパク質である。CD40は、増殖およびアポトーシスに関連するレセプター(Fas/CD95、TNFレセプターおよびリンホトキシンレセプターを含む)のクラスに属する。ヒトCD154は、主に活性化されたT細胞上で一過的に発現する、32kDのII型膜糖タンパク質である。CD40:CD154の相互作用は、基本的に全てのT細胞依存性免疫応答(抗体応答を含む)のために必要とされる。特に、CD40:CD154の相互作用は、抗アポトーシス刺激性シグナルおよび/またはリンホカイン刺激性シグナルを提供する。
【0022】
本発明は、TNFHドメインの少なくとも一部を欠失するCD154の変異性改変体が、野生型CD154と細胞内で結合し得、そして野生型タンパク質が細胞表面に達することを阻害するという驚くべき発見に基づく。従って、被験体のT細胞におけるこのようなCD154改変体の発現は、野生型CD154の細胞表面発現を排除することによって、CD154依存性免疫応答を特異的に抑制し得る。
【0023】
(疾患の処置)
CD40:CD154相互作用は、タンパク質抗原に対するT細胞依存性免疫応答(抗体媒介体液性免疫応答およびT細胞媒介炎症性応答を含む)の誘導において中心的であることが知られている。好ましくない免疫応答もしくは病的な免疫応答を防ぐためまたは処置するために、この相互作用に介入する手段を開発する、多くの試みがいくつかの研究者のグループによってなされてきたが、治療的な設定において、CD40:CD154相互作用を妨害する手段を改善する必要性が残存する。
【0024】
本発明は、この改善された手段を提供する。本発明に従って、機能的TNFHドメインを欠失するCD154改変体(例えば、TNFH−マイナスCD154変異体)は、有意な炎症系または免疫系の関与によって特徴付けられ得るCD154依存性疾患を処置(例えば、緩和、遅延もしくは無効化)するためか、または阻害(例えば、発症もしくは進行の予防)するために、被験体中の標的T細胞中に導入され得る。このような疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:狼瘡、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ループス神経炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、気腫、多発性硬化症、ブドウ膜炎、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷、発作、アテローム性硬化症、冠動脈再狭窄、虚血性うっ血性心不全、肝硬変、C型肝炎、糖尿病性ネフロパシー、糸球体腎炎、自己免疫疾患、変形性関節症、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、全身性硬化症、放射線誘導性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性骨髄腫、眼球の炎症性疾患、対宿主性移植片病、移植拒絶(例えば、角膜および網膜の移植拒絶)、または悪液質。
【0025】
CD154変異性改変体はまた、疾患の症状をまだ示していない患者に、予防的に投与され得る。例えば、CD154改変体を使用して、移植を受ける患者を、可能性のある移植拒絶を予防または緩和するように処置し得る。
【0026】
1つの実施形態において、CD154改変体タンパク質は、改変体タンパク質を含むリポソームまたは他の適切なキャリア(例えば、ミクロスフェア)の局所注射によって、標的細胞に導入され得る。標的化を増大するために、リポソームまたは他の適切なキャリアは、組織特異的レセプターのリガンドとして機能する分子でコーティングされ得る。
【0027】
(遺伝子治療)
本発明に従って、TNFH−マイナスCD154変異体はまた、変異体CD154タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸構築物を細胞内で発現することによって、標的細胞に導入され得る。
【0028】
((1)ベクター)
本発明に従う核酸構築物は、複製していない直鎖状または環状DNAまたはRNAベクターから誘導され得るか、あるいは自己複製プラスミドもしくはウイルスベクターから誘導され得る。あるいは、この構築物は、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。T細胞をトランスフェクトまたは形質転換し得る任意のベクターが使用され得る。好ましいベクターは、ウイルスベクター(複製欠損レトロウイルス(例えば、WO 89/07136;Rosenbergら、N.Eng.J.Med.323(9):570〜578(1990)を参照のこと)、アデノウイルス(例えば、Morseyら、J.Cell.Biochem、補遺、17E(1993)を参照のこと)、アデノ随伴ウイルス(Kotinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87;2211〜2215(1990))、複製欠損単純ヘルペスウイルス(HSV;Luら、Abstract、66頁、Abstracts of the Meeting on Gene Therapy、9月、22〜26、1992、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York)、ワクシニアウイルス(Mukherjeeら、Cancer Gene Ther.7:663〜70(2000))由来のウイルスベクターを含む)、およびこれらのベクターの任意の改変バージョンである。発現ベクターを構築するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、第2版、Cold Spring Harbor、New York,1989を参照のこと。
【0029】
本発明のベクターは、T細胞を特異的に標的化し得る。遺伝子治療において有用なT細胞特異的ウイルスベクターは、当該分野で公知である。例えば、(1)Annenkovら、Gene Therapy 7:714〜22(2000);Cavazzana−Calvoら、Science 288:669〜72(2000);およびFarsonら、J.Gene Med.1:195〜209(1999)のレトロウイルスベクター;(2)Hillerら、Gene Therapy 7:664〜74(2000)のヘルペスウイルスsaimiriベクター;(3)Kungら、J.Virol.74:3668〜81(2000)のHIVベースのハイブリッドベクター;(4)Costelloら、Gene Therapy 7:596〜604(2000)のHIV誘導レンチウイルスベクター;または(5)上記で言及したベクターの任意の改変バージョンを使用し得る。
【0030】
((2)発現制御配列)
これらのベクターにおいて、発現制御配列は、本発明の変異体タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。T細胞における所望のレベルの転写を指向し得る任意の発現制御配列が、使用され得る。真核生物細胞について、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー(免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルスなどから誘導されるようなもの)、およびポリアデニル化配列を含み得る。本発明の核酸構築物はまた、内部リボソーム侵入部位(internal ribosome entry site)(「IRES」)、および望ましくはプロモーター/エンハンサー配列と変異体CD154コード配列との間に位置し得るイントロンを含み得る。これらおよび他の通常のベクターエレメントの選択は、慣習的である。例えば、Sambrookら、前述;Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York.(1989);およびそれらに引用される参考文献を参照のこと。
【0031】
本発明の1つの実施形態において、CD154についてのネイティブなプロモーターが使用される。このネイティブなプロモーターは、変異体CD154の発現がネイティブな発現を模倣すべきであることが要求される場合、好ましくあり得る。変異体CD154の発現が、時間的もしく発育的に、または組織特異的な様式で、または特定のネイティブの転写刺激に応答して調節されなければならない場合、このネイティブなプロモーターが使用され得る。さらなる実施形態において、他のネイティブな発現制御エレメント(例えば、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはKozakコンセンサス配列)はまた、ネイティブな発現を模倣するために使用され得る。
【0032】
本発明の別の実施形態において、T細胞特異的プロモーターが所望される。このようなプロモーターとしては、2つのクラスが挙げられる:細胞型特異的プロモーターおよび活性化特異的プロモーター。このようなプロモーターの例としては、CD2、CD4、CD3、T細胞レセプターα鎖およびT細胞レセプターβ鎖、ならびにIL−2の遺伝子から誘導されるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
長期の免疫抑制を防ぐために、変異体CD154の発現を調節する誘導性プロモーターを使用することが望ましくあり得る。このようなプロモーターは、当該分野で公知である。これらのプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:(1)テトラサイクリン誘導性プロモーター(Gossenら、Science 268:1766〜1769(1995);Harveyら、Curr.Opin.Chem.Biol.2:512〜518(1998));(2)テトラサイクリン抑制プロモーター(Alverez−Vallinaら、Cancer Gene Therapy 7:526〜9(2000);Gossenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547〜5551(1992));(3)ラパマイシン誘導性プロモーター系(Yeら、Science 283:88〜91(1999);Magariら、J.Clin.Invest.100:2865〜2872(1997);およびRiveraら、Nat.Medicine 2:1028〜1032(1996));(4)亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター;(5)デキサメタゾン(Dex)誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター;(6)T7ポリメラーゼプロモーター系(WO98/10088);(7)エクジソン昆虫プロモーター(Noら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:3346〜3351(1996));(8)RU486誘導性プロモーター系(Wangら、Nat.Biotech.15:239〜243(1997);Wangら、Gene Ther.4:432〜441(1997));ならびに(9)上記のプロモーター系の改変バージョン。本発明において有用な他の型の誘導性プロモーターは、特定の、生理学的状態(例えば、体温)急性期によってか、または複製細胞においてのみ調節されるプロモーターである。
【0034】
本発明のさらに別の実施形態において、高レベルの構造的な発現が所望される。この目的のための例示的なプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター/エンハンサー、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター/エンハンサー(例えば、Boshartら、Cell 41:521〜530(1985)を参照のこと)、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β−アクチンプロモーター、およびホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーター。
【0035】
本出願によって提供される手引きを使用して、当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく上記の発現制御配列およびそれらの改変バージョンの間での選択を行い得る。
【0036】
((3)核酸構築物の投与)
本発明の核酸構築物は、インビボおよびインビトロにおける、一過性の遺伝子転移および/または安定な遺伝子転移の任意の形態において使用するための薬学的組成物として、処方され得る。この組成物は、少なくとも、核酸構築物および生理食塩水のような薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアであると公知であり、そして当業者に周知である、他の滅菌した水性懸濁液および非水性懸濁液もまた、使用され得る。この構築物は、インビボおよびエキソビボの遺伝子治療、インビトロにおけるタンパク質産生および診断的アッセイのために使用され得る。
【0037】
核酸構築物は、裸のDNAとしてか、または、例えば、リポソーム融合(例えば、Nabelら、Science 249:1285〜8(1990);Ledley,J Pediatrics 110:1〜8および167〜74(1987);Nicolauら、Proc Natl Acad Sci USA 80:1068〜72(1983)を参照のこと)、赤血球ゴースト、またはミクロスフェア方法(微粒子;例えば、米国特許第4,789,734号、同第4,925,673号、および同第3,625,214号);Gregoriadis、Drug Carriers in Biology and Medicine、287〜341頁、Academic Press、1979を参照のこと)によって標的細胞中に導入され得る。あるいは、核酸構築物は、T細胞特異的レセプターのリガンドに結合され、それによってレセプター媒介エンドサイトーシスを介してT細胞に侵入し得る。
【0038】
核酸構築物がウイルスベースの場合、これはまた、ビリオンとしてパッケージされ得、次いでこれは細胞(例えば、患者から単離された自系T細胞)をエキソビボで形質導入するために使用され得る。次いでこの感染細胞は、患者の身体に戻される。あるいは、組換えウイルスは、遺伝子治療分野の当業者によって決定されるように、患者に直接的に投与され得る(例えば、静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、および/または皮内投与)。徐放性デバイス(例えば、移植可能なポンプ)は、組換えウイルスを細胞に送達することを促進するために使用され得る。ウイルスが被験体に投与される場合、感染されるべき特定の細胞は、送達方法を制御することによって標的化され得る。例えば、ウイルスの静脈内注射は、ウイルスを循環T細胞に標的化することを促進するために使用され得る。局所送達部位についての身体の標的領域としては、例えば、肺、皮膚、リンパ節、胸腺、脾臓および骨髄が挙げられる。このような送達は例えば、局所的送達、吸入、エアロゾルもしくは局所注射経路(例えば、門脈カテーテルが挙げられる)によす送達であり得る。本発明の処置は、必要に応じて、当業者によって決定されたように、繰り返され得る。
【0039】
遺伝子治療における本発明の核酸構築物の投与量は、処置される状態のような因子に主に依存する。この投与量はまた、患者の年齢、体重および健康によって変化し得る。例えば、変異体CD154コードウイルスの効果的なヒト投与量は、一般に、投与される用量あたり約1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、または1×1016ウイルス粒子の濃度でウイルスを含む生理食塩水溶液の、約0.5ml〜50mlの範囲である。この投与量は、任意の有害な副作用に対して補正する利点のバランスを取るように調整される。変異体CD154の発現レベルは、投与量の投与の型および頻度を決定するためにモニターされ得る。
【0040】
本発明の薬学的組成物は、単独で、あるいは1つ以上の物質(タンパク質もしくは組換えベクターの生物学的安定性を増大する他のタンパク質または組換えベクターを含む)との、または、T細胞を選択的に標的化する組成物の能力を増大する物質との混合物において、あるいはこれらの物質との化合中において使用され得る。
【0041】
(併用治療)
さらに、本発明の薬学的組成物は、別の免疫調節レジメンと組み合わせて使用され得、所望の免疫抑制(例えば、霊長類レシピエントへの、長期間、無拒絶の異種ドナー組織の組み込み)を達成し得る。例えば、CD154:CD40相互作用をブロックするか、またはCD28、CD80またはCD86を介する、同時刺激をブロックする、薬剤が使用され得る。
【0042】
例示的なCD154:CD4O相互作用インヒビターは、CD154に対する抗体(例えば、ATCC受託番号HB 10916を有する、ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体(「mAb」)5c8;これは米国特許第5,474,771号で開示される);ImxM90、ImxM91、ImxM92(米国特許第5,961,974号に開示される);およびAncellから市販される抗体(クローン24−31、カタログ番号353−020、Bayport,MN)、Genzyme(Cambridge,MA,カタログ番号80−3703−01)、およびPharMingen(San Diego、カタログ番号33580D))である。多くのさらなる抗CD154抗体が、作製され、そして特徴づけられる(例えば、Bristol−Myers SquibbのPCT特許出願WO 96/23071を参照のこと)。
【0043】
CD154:CD40相互作用をブロックする、他の公知のイムノレギュレーターとしては、例えば、以下の他の型の抗CD154分子が挙げられる:完全Fabフラグメント、F(ab’)2化合物、VH領域、FV領域、単鎖抗体(例えば、PCT特許出願WO 96/23071を参照のこと)、ポリペプチド、融合タンパク質(例えば、Hollenbaughら、J.Immunol.Meth.188:1−7(1995)中のCD40Igを参照のこと)、および低分子化合物(低分子半ペプチド性化合物または低分子非ペプチド性化合物)。これらの全てのイムノレギュレーターは、CD40:CD154相互作用をブロックまた中断することが可能である。低分子を設計し、スクリーニングし、そして最適化するための手順は、PCT特許公開WO 97/00895中に提供され、これの明細書は、本明細書中で参考として援用される。
【0044】
遺伝子治療の間、組換えウイルスに対する潜在的な免疫応答を回避するために、Ohirmuleら、J.Virol.74:3345−52(2000)に記載の処置レジメンに同一かまたは類似の処置レジメンを採用することが所望され得る。このレジメンにおいて、患者は先ず、(1)変異体CD154挿入物がない組換えウイルスと、(2)ヒト化抗CD154抗体または他の同時刺激インヒビターのようなイムノレギュレーターとで同時に処置される。次いで、この患者を、変異体CD154コードウイルスで処置する。このような2工程のレジメンは、遺伝子治療患者においてしばしば副作用を生じる、組換えウイルス特異的体液性応答の、有意でありかつ延長された阻害を生じることが実証された。
【0045】
また、米国特許第5,872,174号およびPCT特許出願WO 96/26285を参照のこと。
【0046】
(変異体CD154遺伝子治療レジメンを評価するための、前臨床モデル系) 変異体CD154遺伝子治療レジメンの効力を試験するための例示的なモデル系は、Kirkら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:8789−8794(1997)に開示される、霊長類腎臓同種移植片モデルである。これの教示は、本明細書中で参考として援用される。このアカゲザルモデルは、免疫操作の綿密な試験として役割を果たし得、すなわち、同種移植片機能における軽微な変化またはレシピエントの創傷治癒および免疫系機能における悪影響に対してもこの上なく見事に感受性であるモデルである。さらに、これは、ヒト腎臓移植に対する生物学的な類似性を有し、すなわち、特に、MHCタンパク質をコードする遺伝子は、アカゲザルとヒトとの間で十分に保存されており、そしてアカゲザルの血管新生された器官の拒絶は、臨床的にみられる拒絶と極めて類似する。
【0047】
このモデル系が、腎(腎臓)組織を含む移植片を評価するために適切であることが容易に理解される。他の技術的に認められた(art−recognized)前臨床モデル系(好ましくは、霊長類モデル系)は、他の移植片移植型(例えば、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵島、皮膚、末梢神経、中枢神経の拒絶を抑制する際の、変異体CD154遺伝子治療の効力を評価するのに適切である。さらに、本発明に従う、変異体CD154遺伝子治療の効力は、ループス腎炎の動物モデル(例えば、PCT特許出願WO 98/30240および同WO 98/30241に記載されるモデル)で評価され得る。このような効力はまた、動物角膜同種移植片モデル(例えば、マウス角膜同種移植片モデル)で評価され得る。
【0048】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の方法および材料を例示することを意味する。当業者にとって明白であり、通常、当該分野で出会う、記載された条件およびパラメーターの適切な改変および適合は、本発明の精神および範囲の内にある。
【0049】
(実施例1:手順)
((1)細胞株、抗体、およびIg融合タンパク質)
BJAB、ヒトB細胞株は、Harvard Medical SchoolのDr.George Mosialosから寄贈された。この細胞株は、ペニシリン、ストレプトマイシン、10%熱不活化ウシ胎仔血清、および4mMのグルタミンを補充した、RPMI培地で維持した。mAb 9E10が、産生され、そしてこれを9E10ハイブリドーマの培養物から精製した。このハイブリドーマは、American Type Culture Collectionから入手可能である。また、mAb 9E10およびEQKLISEEDL mycタグに関しては、G.I.Evenら、「Isolation of Moncolonal Antibodies Specific for Human c−myc Proto−Oncogene Product」、Mel Cell Biol 5:3610−3816(1985)を参照のこと。CD40−Fc融合タンパク質、ヒト化5c8、およびウサギのポリクローナル抗体Rb779およびポリクローナル抗体Rb784を操作、産生、および精製をするための手順を、Hsuら、J Biol Chem 272:911−915(1997)に記載されるように実施した。
【0050】
((2)野生型CD154タンパク質および変異体CD154タンパク質の一過性発現)
野生型CD154 cDNAを、活性化ヒト末梢血細胞由来のcDNAライブラリーから単離した。このcDNAのコード配列は、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。CD154の変異体を構築する手順を、Gerberら(前出)に記載のように実施した。この野生型cDNAおよび変異体cDNAを、確認された配列を有する制限フラグメントから、CMVであり、前初期プロモーター駆動の、発現ベクター(COS7細胞中のSV40複製起点を含む)の中の独特のNotI部位に、サブクローンニングまたは再構築した。COS7細胞を、超らせんプラスミドDNAで、製造者の指示書に従ってリポフェクチン(GibcoBRL,Grand Island, New York)を使用してトランスフェクトした。全ての実施例において、CD154コード配列を欠くプラスミドDNAをネガティブコントロールとして使用し、野生型CD154コード配列を含むベクターを、ポジティブコントロールとして使用した。CD154およびこれの改変体の発現を、トランスフェクションの72時間後に回収した、トランスフェクトされた細胞に基づいて分析した。細胞表面タンパク質の代謝標識化およびビオチン化、免疫沈降、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(「SDS−PAGE」)、およびウェスタンブロット分析を、Hsuら(前出)に記載の手順を使用して実施した。
【0051】
トランスフェクトしたCOS7細胞からの膜画分の調製およびリンフォトキシン−αアップレギュレーションの分析のための手順を、以前に記載(Garberら、前出)のように実施した。
【0052】
(実施例2:TNFH(−)変異体は、野生型CD154に関連する)
野生型CD154の発現におけるTNFH(−)変異体の効果を調べるために、代謝的に標識した、これらのタンパク質をコードするcDNAで同時トランスフェクションされたCOS7細胞の溶解物を、CD154特異的抗体を使用して免疫沈降によって分析した。変異体タンパク質を野生型ヘテロ3量体複合体のp18成分から識別するために(Hsuら、前出)、mycタグを、CD154第1の96アミノ酸のC末端で操作して、異常なスプライシングを受ける転写産物で予測される非CD154アミノ酸(11アミノ酸または21アミノ酸)を置換した(Seyamaら(前出)中の、患者19、患者20および患者21)。
【0053】
CD154変異体と野生型のタンパク質との関連性を決定するために、35Sで代謝標識した、全長野生型CD154もしくはmycタグ化変異体CD154(配列番号1において、アミノ酸残基1〜96)のいずれか、またはこれらの両方をコードするcDNAを用いてトランスフェクトしたCOS7細胞から調製した細胞溶解物を、抗myc mAb 9E10、抗ヒトCD154 mAb 5c8、または抗CD154−C末端ペプチド抗血清Rb784(また「784」)で免疫沈降した。免疫沈降物を、10〜20%勾配のSDS−PAGEゲルにおける電気泳動、その後のオートラジオグラフィーで分析した(図1)。
【0054】
図1は、野生型CD154が単独で発現される場合に、抗CD154N末端ペプチド抗血清Rb784の免疫沈降物(レーン3)および抗CD154 mAb 5c8の免疫沈降物(レーン4)は、主に全長p33タンパク質、いくつかのp31タンパク質、および少量のp18を含んだ(p33、p31、およびp18は、野型CD154の成分である)。これは、本発明者らの以前の観察と一貫性がある(Hsuら、前出)。このp33成分、p31成分、p18成分は、抗myc mAb 9E10(レーン1)またはコントロールのウサギ抗血清(レーン2)のいずれの免疫沈降物中にも観察されなかった。変異CD154タンパク質(配列番号1のアミノ酸残基1〜96を含み、そしてmycタグに連結される)(「TNFH(−)」)が単独で発現される場合、p17成分(変異体タンパク質自体に対応する)は、9E10およびRb784のいずれによっても免疫沈降したが、mAb 5c8またはコントロールのウサギ抗血清(レーン5〜8)により免疫沈降しなかった。変異体タンパク質および野生型タンパク質が同時に発現したとき、9E10の免疫沈降物は、p17 mycタグ化変異体タンパク質のみではなく、p33、p31、およびp18の野生型タンパク質(レーン9)も含んだ。同様のタンパク質パターンが、Rb784およびmAb 5c8の免疫沈降物中に見出されたが、コントロールの血清(レーン10〜12)の中には見出されない。著しいのは、mAb 5c8免疫沈降物は、より少量のこれらのタンパク質を提示し、これは、全ての発現した野生型タンパク質が、5c8によって認識されたわけではないことを示唆する。
【0055】
上記のデータは、3つの重要な知見を明らかにした。第1に、変異体CD154タンパク質は、安定して産生され、容易に検出され得る。第2に、TNFHドメインを欠く変異体CD154タンパク質は、野生型CD154と結合し得る。第3に、少なくともいくつかの野生型タンパク質は、変異体タンパク質と結合するが、その結合エピトープが、CD40ついてのCD154結合部位に対する立体配座であり、そしてCD40ついてのCD154結合部位に対して類似することを示すmAb 5c8と相互作用し得る。
【0056】
(実施例3:TNFH(−)変異体タンパク質との結合によって、用量依存的様式で、野生型タンパク質のレセプター結合活性は減少する)
図1に示されるデータは、TNFH(−)CD154の、野生型CD154との結合が、野生型タンパク質のレセプターと結合する野生型タンパク質の能力を危うくし得ることを示唆する。これをさらに調べるために、発明者らは、COS7細胞を、(1)全長CD154をコードするcDNAを含む定量のプラスミド、およびTNFH(−)CD154をコードするcDNAを含む可変量のプラスミドでトランスフェクトした。次いで、このトランスフェクト体を、35Sで代謝的に標識し、そして溶解した。この溶解産物の免疫沈降物は、10〜20%勾配のSDS−ポリアクリルアミドゲル、その後のオートラジオグラフィーで分析した(図2)。
【0057】
図2は、Rb784によって免疫沈降された野生型CD154の量が、トランスフェクションに使用したTNFH(−)DNAの量にかかわらず、同一であることを示す(図2、下端のパネル)。レーン1においては、細胞を、野生型CD154をコードするプラスミドのみを用いてトランスフェクションした。レーン2〜4においては、細胞を、同量の野生型CD154プラスミドおよび可変量のTNFH(−)プラスミドでトランスフェクションした;前者のプラスミド 対 後者のプラスミドの比が、それぞれ、3:1、1:1、および1:3であった。レーン6においては、細胞をコントロールプラスミドのみでトランスフェクションした。
【0058】
図2に示されるデータは、野生型タンパク質の発現が、TNFH(−)変異体の導入によって影響を受けなかったことを示す。しかし、CD40−Fc融合タンパク質によってか、またはmAb 5c8によって認識される、野生型タンパク質の量は、トランスフェクションに使用されたTNFH(−)プラスミドの量に対して反比例した(図2、それぞれ、上端のパネルおよび中央のパネル)。興味深いことに、発現された総TNFH(−)変異体の少しの部分のみ(図2、下端パネル)が、CD40−FcまたはmAb 5c8のいずれかによって免疫沈降された。これらの結果は、TNFH(−)変異体の発現が、用量依存的様式で、野生型CD154のレセプター相互作用活性に影響を与えたが、野生型CD154の発現レベルに影響は与えなかったことを示す。
【0059】
(実施例4:野生型CD154の機能に対する、TNFH(−)変異体タンパク質の効果)
変異体CD154の同時発現が野生型タンパク質の機能に影響を与えるか否かを試験するために、野生型CD154および/または変異体CD154をコードするcDNAでトランスフェクションした、COS7細胞由来のUV照射膜を、BJAB細胞とともに24時間インキュベートした。COS7トランスフェクションに使用される変異体cDNAに対する、野生型の比を、図3Bに示す。このBJAB細胞を、ビオチン標識抗リンフォトキシン−α、mAb、NC2で標識し、次いで、フィコエリトリン−標識ストレプトアビジンで染色し、そして最終的に、1%パラホルムアルデヒドで固定した。BJAB細胞のFACS分析を、細胞表面上のアップレギュレーションしたリンフォトキシンαのレベルを決定するために続いて使用した(図3A、この中で、バーは、平均の蛍光強度を表現する)。
【0060】
図3Aおよび図3Bは、野生型タンパク質と変異体CD154タンパク質との同時発現が、原形質膜上に存在する野生型タンパク質のリンフォトキシン−αのアップレギュレーション能力を減少したことを示す。この阻害効果は用量依存的であった。トランスフェクションのために使用される、野生型cDNAの量は、変異体cDNAの3分の1であり、CD154の機能活性はバックグラウンドレベルの下であった。
【0061】
(実施例5:TNFH(−)変異体は、細胞表面において発現しない)
変異体CD154が野生型CD154の機能を用量依存様式で阻害する、少なくとも2つの可能な機構が存在する。第1に、変異体CD154と結合する野生型CD154は、CD40と相互作用する際に、より低い活性であり得る。第2に、変異体CD154に結合する野生型CD154は、全く機能し得ないこともあり、そしてリンフォトキシン−αのアップレギュレーションにおいて観察される活性は、変異体タンパク質との結合がない野生型タンパク質に排他的に起因し得る。これらの2つの可能性を識別するために、次に、発明者らは、細胞表面に発現する、CD154タンパク質の生物化学的な特性を調べた。
【0062】
これを行うために、COS7細胞を、第1日目に野生型CD154をコードするcDNA、またはTNFH(−)変異体をコードするcDNA、あるいはこれらの両方を用いてトランスフェクションした。このトランスフェクト体を、第4日目に、PBSでリンスし、細胞の破片および付着していない細胞を除去し、次いで、インサイチュにて、ビオチンで標識した。標識化は、細胞上に残った水の中で0.5mg/mlであるビオチン−スルホ−NHSを、室温にて3分間使用して実施した。この反応をグリシンを使用して停止して、このトランスフェクト体細胞を、膨大なモル濃度のグリシンで、15分間残留させ、その後これらをPBSでリンスした。
【0063】
次いで、このトランスフェクト体細胞を溶解し、遠心分離して細胞破片を除去し、そしてCD40−Fc、Rb779、Rb784、または9E10で免疫沈降した。免疫沈降物を、10〜20%SDS−ポリアクリルアミドゲルで、電気泳動に供し、ニトロセルロースメンブレン上に移し、西洋ワサビぺルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンでプローブした(図4)。
【0064】
図4は、CD40−Fc融合タンパク質、Rb784、およびRb779はビオチン標識野生型タンパク質を、免疫沈降するが、9E10は免疫沈降させないことを示す。さらに、細胞表面で検出された野生型CD154の量は、同時トランスフェクションに使用された、野生型cDNAに対する変異体cDNAの割合に、反比例した。従って、TNFH(−)変異体タンパク質の発現は、用量依存的様式での、野生型タンパク質の表面おける発現を阻止する。重要なことに、発明者らは、CD40−Fc融合タンパク質、Rb784、およびRb779での免疫沈降物中にビオチン標識変異体タンパク質(p17)を検出しなかった。これは、このビオチン標識(すなわち、細胞表面で発現される)、野生型タンパク質が、TNFH(−)変異体タンパク質と結合しかったことを示唆する。TNFH(−)変異体の細胞外ドメイン中に総数8のリジン残基が存在するので、これらのリジン残基のうちどれもが、表面に存在する変異体タンパク質が検出されないように、実験条件下で、ビオチン化について接触可能ではないということはなさそうである。さらに、9E10が任意の野生型タンパク質を免疫沈降させないという事実は、この細胞表面野生型タンパク質のいずれもが、TNFH(−)変異体に結合しなかったことを示している。
【0065】
図1に示される結果と一緒に、これらのデータは、TNFH(−)変異体と結合していない野生型CD154タンパク質が、細胞表面で発現されたことを示している。しかし、TNFH(−)変異体と複合体化する野生型タンパク質は、細胞内に保持されていた。従って、TNFH(−)変異体との結合は、野生型CD154が細胞表面で発現することを阻止する。
【0066】
図5は、この阻害プロセスを示している。野生型タンパク質および変異体タンパク質が同時に発現した場合に、野生型タンパク質は、結合したTNFH(−)変異体を伴うか、または伴わずして、3量体を形成し得る。しかし、この変異体タンパク質によって結合された野生型タンパク質は、細胞表面上へ成熟し得ない。se毎のTNFH(−)自体との結合は、野生型タンパク質がそのレセプターである、CD40と相互作用する能力を損なわない。
【0067】
(実施例6:実験結果の考察)
CD154に対するTNFH(−)変異体の潜在的なドミナントネガティブ効果を研究するために、発明者らは、これらの2つのタンパク質をCOS細胞で同時発現し、そしてこれらの生化学的特性および機能的特性を調べた。発明者らの結果は、野生型タンパク質の複合体化によって、この変異体タンパク質が、野生型CD154の細胞表面発現を阻止していることを示している。この観察は、少なくとも2つの局面において、有意である。第1に、患者の細胞は、野生型タンパク質およびTNFH(−)変異体CD154タンパク質の両方を産生し得るが、これらは、細胞表面上で機能的なCD154を産生することができず、そしてこれは、超(hyper−)IgM表現型を生じることを意味する。第2に、発明者らの観察によって、TNFHドメインに加えて、CD154の他の部位がまた、CD154 3量体のアセンブリに関与していることが明らかになった。
【0068】
CD154は、活性化においてTリンパ細胞の細胞表面上で一過的に発現するので、このタンパク質の表面発現の部分的な減少でさえ、望まないT細胞媒介免疫応答の抑制において有益である。従って、標的T細胞に対する機能的TNFHドメインを欠くCD154改変体の誘導によって、機能的CD154の標的細胞表面における発現の効果的なブロッキングによる治療機会が提供される。
【0069】
(他の実施形態)
本発明が、本発明の詳細な説明と合わせて記載されるが、前述の記載は、本発明を例示することを意図し、本発明の範囲を限定することは意図しないことが理解される。本発明の発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【0070】
他の局面、利点、および改変は、上記の特許請求の範囲のうちに含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、TNFH(−)CD154の野生型CD154との関連を示したオートラジオグラフである。
【図2】
図2は、機能的CD154トリマーの産生に対するTNFH(−)CD154の用量依存性の抑制効果を示す、オートラジオグラフのパネルである。
【図3】
図3Aおよび図3Bは、それぞれ、CD154変異体が、野生型CD154の、リンフォトキシン−αの上方制御活性を減少することを示す、棒グラフおよび表である。
【図4】
図4は、TNFH(−)CD154が、野生型CD154の細胞表面発現を妨げることを示す、オートラジオグラフのパネルである。
【図5】
図5は、TNFH(−)CD154が、細胞内部で野生型CD154に結合し、そしてこれが細胞表面に達することを阻害することを例示した説明図である。
Claims (25)
- 細胞の表面における野生型CD154の発現を減少させる方法であって、該方法は、核酸構築物を該細胞に導入する工程を包含し、該核酸構築物は、野生型CD154の腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも5個のアミノ酸残基を欠いた変異CD154の発現を指向し、それによって、発現した変異CD154が、該細胞内で該野生型CD154に結合し、該野生型CD154が、該細胞表面に到達することを不可能にする、方法。
- CD154媒介疾患に罹患した患者またはCD154媒介疾患にかかりやすい患者を処置するための方法であって、該方法は、核酸構築物を該患者に送達する工程を包含する、該核酸構築物は、該患者の細胞において野生型CD154の腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも5個のアミノ酸残基を欠いた変異CD154の発現を指向し、それによって、発現した変異CD154が、該細胞内で該野生型CD154に結合し、該野生型CD154が、該細胞表面に到達することを不可能にする、方法。
- 前記核酸構築物が、ウイルス由来のベクターを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ウイルス由来のベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項3に記載の方法。
- 前記ウイルス由来のベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項3に記載の方法。
- 前記ウイルス由来のベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項3に記載の方法。
- 前記ウイルス由来のベクターが、アデノ関連ウイルスベクターである、請求項3に記載の方法。
- 前記核酸構築物が、ウイルスの形質導入を介して前記細胞に導入される、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が、T細胞または巨核球である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項1または2の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒトT細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記核酸構築物が、インビボで前記細胞に導入される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記核酸構築物が、エキソビボで前記細胞に導入される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記CD154媒介疾患が、移植拒絶である。請求項2に記載の方法。
- 前記CD154媒介疾患が、自己免疫疾患である、請求項2に記載の方法。
- 前記CD154媒介疾患が、炎症性疾患である、請求項2に記載の方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記CD154媒介疾患が、狼瘡、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ループス神経炎、ぜん息、慢性閉塞性肺疾患、細気管支炎、気腫、多発性硬化症、ブドウ膜炎、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷、発作、アテローム硬化症、冠状再狭窄、虚血性うっ血性心不全、肝硬変、C型肝炎ウイルス、糖尿病ニューロパシー、糸球体腎炎、自己免疫疾患、変形性関節症、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、全身性硬化症、放射誘導線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発骨髄腫、眼球炎症性疾患、対宿主性移植片病、移植拒絶および悪液質からなる群から選択される、方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、前記変異CD154が、野生型CD154の一部を欠き、該部分が、配列番号1の(1)アミノ酸残基116〜136、(2)アミノ酸残基137〜261、(3)アミノ酸残基115〜261または(4)アミノ酸97〜261に対応する、方法。
- 請求項19に記載の方法であって、前記変異CD154が、野生型CD154の一部を欠き、該部分が、配列番号1のアミノ酸残基116〜261に対応する、方法。
- 核酸構築物を含む薬学的組成物であって、該核酸構築物は、野生型CD154の腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも5個のアミノ酸残基を欠いた変異CD154の発現を指向し、それによって、発現した変異CD154が、細胞内で野生型CD154に結合し、該野生型CD154が、該細胞表面に到達することを不可能にする、薬学的組成物。
- 請求項21に記載の薬学的組成物であって、前記変異CD154が、野生型CD154の一部を欠き、該部分が、配列番号1の(1)アミノ酸残基116〜136、(2)アミノ酸残基137〜261、(3)アミノ酸残基115〜261または(4)アミノ酸97〜261に対応する、薬学的組成物。
- 該核酸は、細胞表面における野生型CD154の発現を減少するための医薬品を製造するための核酸の使用であって、該野生型CD154の腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも5個のアミノ酸残基を欠いた変異CD154の発現を指向する、使用。
- 核酸の使用であって、該核酸は、CD154媒介疾患を処置するための医薬品を製造するために野生型CD154の腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも5個のアミノ酸残基を欠いた変異CD154の発現を指向する、使用。
- 請求項23または24に記載の使用であって、前記変異CD154が、野生型CD154を欠き、該一部が、配列番号1の(1)アミノ酸残基116〜136、(2)アミノ酸残基137〜261、(3)アミノ酸残基115〜261または(4)アミノ酸97〜261に対応する、使用。
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