KR20050049545A - 길항제 ｉｌ-15 - Google Patents

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KR20050049545A
KR20050049545A KR1020057006381A KR20057006381A KR20050049545A KR 20050049545 A KR20050049545 A KR 20050049545A KR 1020057006381 A KR1020057006381 A KR 1020057006381A KR 20057006381 A KR20057006381 A KR 20057006381A KR 20050049545 A KR20050049545 A KR 20050049545A
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인게보르그 드레어
토마스 몰
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 야생형 IL-15, 및 마우스 IgG2b 단편은 제외한 IgG Fc 단편으로 이루어진 융합 단백질, 이 단백질을 암호화하는 핵산, 벡터, 변형된 세포, 및 예를 들어 이식으로부터 발생되는 장애 및/또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료에 사용되는 약제를 제조하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

길항제 ＩＬ-15 {Antagonists IL-15}
시약
별도의 언급이 없는한, 세포 배양 배지, 효소 등과 같은 시약은 인비트로젠(Invitrogen)(이전 명칭: Gibco BRL/Life Technologies), Paisley, UK)에서 구입한 것이고 실험 화합물은 로쓰(Roth, Karlsruhe, Germany)에서 구입한 것이다.
실시예 1: 신호 서열의 대체
본 과정은 돌연변이 사람 IL-15 및 쥐 IgG2a Fc 잔기(hinge-C2-C3)[참조문헌: Kim et al. 1998, see above]로 구성된 융합 단백질에 대한 cDNA를 벡터 pSecTagA(Invitrogen, Paisley, UK) 속에 함유하는 플라스미드를 사용하여 시작하였다. BamHI 절단 부위에 의해 IL-15를 Fc 잔기에 융합시켜, 접합점에서 삽입될 부가적인 아미노산(아스파르테이트)을 만들었다.
단백질이 IL-15 수용체의 알파 아단위에는 결합하지만 베타 및 감마 아단위에 의한 신호 전달은 방지하도록, IL-15의 149번 및 156번(신호 서열 제거후 101번 및 108번에 상응) 위치의 두 개의 글루타민 잔기를 아스파르테이트로 돌연변이시켰다. 특별히 효율적이지 않은 고유한 신호 서열을 사람 IL-15로부터 제거하고, 상응하게 절두된(truncated) cDNA는 HindIII 및 XbaI 절단 부위에 의해 pSecTagA 벡터에 클로닝되어 플라스미스에 존재하는 Igκ 리더가 분비 신호로써 사용될 수 있게 하였다. 클로닝 결과로, 플라스미드에 존재하는 Igκ 리더와 IL-15 서열의 시작 지점 사이에 10가의 추가 아미노산이 위치하게 되었다. 이러한 아미노산을 제거하고 경우에 따라 단백질의 분비를 개선시키기 위해, Igκ 리더를 다양한 다른 단백질의 신호 서열로 대체하였다. 이와 관련하여, 추가한 아미노산만이 제거된 원래의 Igκ 리더 대신에 사람 IL-2, MCP-1, CD4 및 CD5로부터의 리더 서열을 클로닝할 수 있었다.
실시예 2: pSecTagA 플라스미드의 제조
신호 서열은 리더 서열의 ATG 개시 코돈으로부터 5' 방향에 위치한 특유한 NheI 절단 부위, 및 IL-15 서열의 5' 영역에 위치한 BglII 절단 부위에 의해 클로닝되기 때문에, 추가한 BglII 절단 부위는 가장 먼저 벡터 pSecTagA로부터 제거되었다. 이를 위해, 삽입체가 없는 벡터 pSecTagA를 BglII로 잘랐다(혼합물: 총 40㎕중 9㎍의 DNA, 4㎕의 10x 완충액 2, 26㎕의 물 및 4㎕의 BglII(40단위); 37℃에서 2시간 동안 항온처리).
DNA는 파마시아 S400 마이크로스핀 칼럼(Pharmacia S400 Microspin column; Amersham-Pharmacia, Freiburg)을 통해 효소 및 완충액으로부터 정제하였다. 5㎕의 10x PCR 완충액(Taq-Core kit, Qiagen, Hilden), 2㎕의 dNTP(각각 10mM, Taq-Core kit, Qiagen), 2㎕의 물 및 1㎕(4단위)의 DNA 폴리머라제 I(Klenow 단편)을 40㎕의 혼합물에 가하고, BglII 절단 부위를 채우기 위해 전체를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플라스미드를 1% 아가로스 겔에 충전한 다음, 콘서트-래피드-겔(Concert Rapid-Gel) 추출 시스템을 사용하여 겔로부터 밴드를 용출시켰다. 혼합물 전체를 100㎕의 물에 용해시켰다. 이 혼합물중 7.5㎕는, 7.5㎕의 물, 4㎕의 5x T4 리가아제 완충액 및 1㎕의 T4 리가아제(1U)와 함께 실온에서 1시간 동안 결합시켰다. 제조자(Stratagene, La Jolla, USA) 지시사항에 따라 결합 혼합물중 절반을 이.콜라이(E.coli) XL1 블루로 형질전환시켰다.
상기한 플라스미드로부터의 전체 삽입체, 즉 Igκ 리더 + 10개의 추가 아미노산-mutIL-15-mIgG2a를, NheI 및 XbaI 절단 부위에 의해 생성된 플라스미드에 다시 클로닝하였다. NheI/BglII 절단에 의해 원래의 Igκ 리더 + 10개의 아미노산+5'-IL-15 잔기를 제거한 다음, 올리고뉴클레오타이드 클로닝에 의해 상기한 신호 서열로 이를 대체하였다.
실시예 3: Igκ 리더의 클로닝
단편은 다음과 같다: IL-15의 5' 부분에 BglII 절단 부위가 있는 5'-NheI-리더-IL-15-3'. 단일 올리고뉴클레오타이드가 담당하기에는 이 단편이 너무 길기 때문에, 2개의 중복 올리고뉴클레오타이드 및 이의 상보적인 쇄(총 4개의 올리고뉴클레오타이드)를 MWG-바이오테크(Ebersberg)로부터 구입하였다(올리고뉴클레오타이드 서열은 하기한 바와 같다). 상응하는 제한 절단 부위(NheI 및 BglII)로 클로닝하기 위한 돌출 말단이 이미 존재하는 일본쇄 올리고뉴클레오타이드를 선택하였다. 올리고뉴클레오타이드는 먼저 인산화시켰다. 이를 위해, 2㎕의 10x 정방향 완충액 및 1㎕의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(10U)을 포함한 20㎕의 혼합물중 10㎍의 각각의 올리고뉴클레오타이드를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 각각의 경우에서, 동일몰량의 올리고뉴클레오타이드 쇄 및 상대 올리고뉴클레오타이드 쇄를, 95℃로 가열한 다음 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 어닐링시켰다. 벡터에 클로닝하기 전, 이본쇄 올리고뉴클레오타이드를 밤새 결합시켰다. 각 경우에서, 5㎕의 5' 및 3' 이본쇄 올리고뉴클레오타이드 + 4㎕의　5x T4 리가아제 완충액 + 5㎕의 물 + 1㎕의 T4 리가아제(1U)을 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 결합 혼합물을 2% 아가로스 겔상에서 분리시킨 다음, 콘서트 래피드 겔 추출 시스템을 사용하여 겔로부터 올리고이량체를 용출시키고 40㎕의 최종 용적에 용해시켰다. 그런 다음, 올리고이량체를 사용하여 클로닝시켰다: 결합은 12℃에서 밤새 실시하였다(10㎕의 올리고이량체, 4㎕의 5x T4 리가아제 완충액, 4㎕의 물, 1㎕의 NheI/BglII-절단 플라스미드 및 1㎕의 T4 리가아제(1U)). 20㎕의 결합 혼합물중 5㎕을 사용하여 이. 콜라이-XL10-골드(Stratagene, 제조자의 지시사항에 따름)를 형질전환시켰다.
Igκ 올리고뉴클레오타이드의 서열
5'-Igκ fwd:
상보적인 Igκ rev:
제2 정방향 올리고: 3'-IL-15 fwd1.1:
상보적인 IL-15 rev1.1:
어닐링 및 접합 후, 하기의 단편이 수득되었다:
하기 서열(이본쇄)을 갖는 5'-Nhel-Igκ-리더-IL-15-BglII-3';
상보적인 서열:
설명:
이탤릭체 및 밑줄: 각각 NhelII 및 BglII 절단 부위; 진한 글씨: Igκ 리더.
생성된 클론의 제한 패턴은 미니프렙(miniprep; QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden)으로 조사하였다. 이를 위해, NheI/BglII(삽입된 리더를 직접 절단하는 제한효소) 및 XbaI(Fc 잔기의 3' 절단)을 사용하여 3회 반복 절단을 실시하였다.
양성 DNA 클론은 제조자의 지시사항에 따라 퀴아젠 엔도프리 맥시(Qiagen Endofree Maxi) 키트를 사용하여 분리시키고 GATC로 서열분석하였다(불변). 이러한 방식으로 수득한 플라스미드(mutIL-15 101/108)-Igκ 리더가 제거된 mIgG2a)는 Igκ8이라 하였다.
다른 리더에 대한 과정은 상기한 Igκ 작제물에 대해 기술한 바와 정확히 일치하였다.
실시예 4: 작제물 WT-Fc 및 149-Fc의 제조
상기한 플라스미드 Igκ8로부터 시작하여, 5' 말단에 BglII 절단 부위가 있는 정방향 프라이머(IL-15 fw3.1: 5'-attgaagatcttattcaatctatgc-3') 및 상응하는 3' 역방향 프라이머(WT: 5'-ggatccgaagtgttgatgaacatttggacaatatgtacaaaactctgcaaaaattc-3')를 사용하여 PCR에 의해 개별적인 돌연변이체를 제조하였다(149: 5'-gggatccgaagtgttgatgaacatttgga-3').
각각의 경우에 PCR 반응 주형으로서, 25pmol의 프라이머, 0.5㎕의 dNTP(Taq-Core kit, Qiagen), 2.5㎕의 10x PCR 완충액 및 0.9U의 Taq 폴리머라제(Expand High-Fidelity system, Roche, Mannheim)을 포함한 혼합물 25㎕당 10ng의 mutIL-15(101,108)-쥐 Fc 플라스미드를 사용하였다. DNA는, 95℃에서 45초 동안 변성, 60℃에서 60초 동안 어닐링 및 72℃에서 45초 동안 합성하는 조건하에 30주기로 증폭시키고, 이후 증폭물을 아가로스 겔 상에서 정제하고, PCR 밴드를 겔로부터 용출시키고 50㎕의 TE 완충액에 용해시켰다. 25㎕의 혼합물을 3㎕의 10x 완충액 3으로 처리하고, 각각의 경우에 15U의 BamHI 및 BglII과 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. DNA는 파마시아 마이크로스핀(Pharmacia Microspin) S400 칼럼을 통해 정제하였다. 이중 돌연변이를 포함한 IL-15 잔기를 이중 BglII/BamHI 절단에 의해 유사하게 플라스미드 Igκ8로부터 잘라내고, 단일 돌연변이 또는 야생형 서열을 함유한 IL-15 잔기로 대체하였다. 이를 서열분석하여 플라스미드를 확인하였다.
실시예 5: 단백질의 제조
개별적인 돌연변이 단백질은 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포(ATCC, Manassas, USA)에 의해 제조하였다: 이를 위해, 60㎕의 리포펙타민2000을 2㎖의 옵티멘(Optimem) 1 배지에 희석시키고, 30㎍의 플라스미드 DNA(Igκ8, WT-Fc 및 149-Fc)도 플레이트 150㎠당 2㎖의 옵티멘 1 배지에 희석시켰다. 2개의 용액을 혼합하고 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 대략 80%의 컨플루언스에 이를때까지 150㎠의 HEK-293 플레이트상에서 세포 배양 배지(Dulbecco's MEM + Glutamax + 10%FCS + 1% Pen/Strep)에 DNA/리포좀 혼합물을 가하였다. 하루가 지난 후, 배지를 울트라컬쳐(Ultraculture) 배지(Biowhittaker, Verviers, Belgium)로 대체하고, 세포상에서 세포 배양 배지를 4일 동안 방치하였다. 세포 배양 상청액을 수집하고, 홈이 있는 필터(Schleicher and Schull, Dassel)를 통해 통과시켜 조악한 세포 구성물을 제거하였다. 그런 다음, 2㎛의 버틀-탑(bottle-top) 필터(Nalgene-Nunc, Wiesbaden)를 통해 여과시켜 멸균시키고, 단백질 A-세파로스(Sepharose)를 통해 정제하여 IL-15-Fc 융합 단백질을 분리시켰다. 이를 위해, 세척 완충액(20mM 트리스/HCl, pH 8.5, 130mM NaCl)(Amersham-Pharmacia, 세척 완충액중 50% v/v)중에서 팽윤시킨 단백질 A-세파로스를 세포 배양 상청액 리터당 0.4㎖로 가하고, 혼합물을 오버헤드 진탕기중 4℃에서 밤새 진탕시켰다. 단백질 A-세파로스를 비어있는 크로마토그래피 칼럼에 수집하고 적어도 150㎖의 세척 완충액으로 세척하였다. 단백질은 0.1M 글리신(pH 2.5)을 사용하여 1㎖의 분획으로 칼럼으로부터 용출시키고 바로 60㎕의 1M 트리스/HCl(pH 9.5)로 중화시켰다. 단백질은 PBS 완충액에 대해 투석하고 여과시켜 멸균시켰다. 단백질의 농도는 BCA 분석(Pierce, Rockford, USA)으로 측정하고, 이의 순도 및 본성은 실버 겔 및 웨스턴 블롯팅(western blotting)(제1 항체: 모노클로날 마우스 항-사람 IL-15, BD Biosciences Pharmingen, San Diego USA; 제2 항체: POD-염소 항-마우스, Dianova, Hamburg)을 사용하여 조사하였다. 그런 다음, 단백질의 기능성을 증식 분석으로 조사하였다.
실시예 6: 증식 분석
CTLL-2 세포(ATCC)는 쥐의 세포 독성 T 세포로, 이의 증식이 IL-15 또는 IL-2에 좌우되기 때문에 길항 단백질의 증식 억제 효과의 지표로서 사용할 수 있다. 세포를 RPMI1640 배지 + 10% 열 불활성화 송아지 태아 혈청(FCS) + 1% Pen/Strep + ConA가 있는 20% rat T-stim(Becton Dickinson Labware, Bedford, USA) 및 각종 성장인자의 혼합물로 이루어진 배지에서 배양하였다.
증식 분석물을 제조하기 위해, 세포 배양 배지(RPMI 1640 + 10%FCS + 1%Pen/Strep)로 2회 세척함으로써 세포 배양에 필요한 잔류 성장인자를 세포로 부터 제거하고 이 배지에 세포를 용해시켰다. 이를 위해, 세포를 349g에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 버린 후, 펠렛을 다시 세포 배양 배지에 용해시켰다. 원심분리 단계를 반복하였다.
분석은 평저 96웰 플레이트에서 실시하고, 3 x 104 세포/웰을 포함한 배지를 웰당 150㎕씩 사용하였다. 음성 대조를 위해, 추가되는 어떠한 인자도 없는 10% FCS를 포함한 배지에 세포를 넣었다. 양성 대조는, 세포의 최대 증식의 절반을 허용하는 농도(예: 12.5pg/웰)로 재조합 사람 IL-15(R&D Systems, Minneapolis, USA)을 추가로 포함하였다. 각 경우에서, 6개의 음성 및 양성 대조를 만들었다.
상기한 신규한 IL-15-Fc 변이체의 증식-억제 효과를 측정하기 위해, 세포를 양성 대조에서 기술한 바와 같이 재조합 IL-15로 처리하고, 정제된 단백질을 Igκ8로부터 유래된 101/108 이중 돌변연이체, 야생형 단백질(WT-Fc) 또는 단일 돌연변이(149-Fc)의 형태로 넣었다. 이와 관련하여, 웰당 사용되는 가장 고농도는 2㎍으로, 각각의 경우에 1:2로 희석하여 사용하였다(1㎍, 0,5㎍, 0,25㎍, 0.125㎍ 등). 대조로서, 하기의 관련 단백질을 동일 농도로 사용하였다: mIgG2a(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA)는 비특이적 항체로서 사용하고, 돌연변이되지 않은 사이토카인 잔기를 포함하여 결과적으로 세포의 증식을 자극하는 IL-2Fc뿐만 아니라, 구조적으로 관련된 융합 단백질이지만 어떠한 증식 효과도 갖지 않는 CTLA4-Fc도 사용하였다. 후자의 2가지 단백질은 키메리겐(Chimerigen; Allston, USA)으로부터 구입하였다. 모든 혼합물은 동일하게 3회 반복 실시하였다.
세포는 CO2 항온처리기에서 44±2시간 동안 37℃에서 항온처리한 다음, 제조자의 지시사항에 따라 XTT 세포 증식 키트(Roche)를 사용하여 증식을 측정하였다. 이를 위해, 키트의 2가지 성분을 1:50(즉, 75㎕의 XTT 표지 시약 + 1.5㎕의 전자 결합 시약)으로 혼합하였다. 웰당 75㎕의 혼합물을 가하고, CO2 항온처리기에서 4시간 동안 37℃에서 항온처리한 후, 690㎚에 반하여 490에서 ELISA 판독기로 플레이트를 측정하였다.
결과는 도 23에 나타내었다:
WT-Fc, 149-Fc, 및 이중 돌연변이체 101/108(플라스미드 Igκ8)로부터의 단백질은 CTLL-2 세포의 IL-15 매개된 증식에 대해 억제 효과를 나타내었다. 오히려 IL-2-Fc 및 IgG2a는 증식 촉진 효과를 나타내었다.
Neg: 세포는 재조합 사람 IL-15 없이 배양하였다.
Pos: 세포는 웰당 12.5pg의 재조합 사람 IL-15을 포함시켜 배양하였다.
다른 혼합물중의 세포 모두는 12.5pg의 재조합 사람 IL-15/웰 + 2㎍, 1㎍, 0.5㎍, 0.25㎍, 0.125㎍ 및 0.0625㎍의 소정의 단백질중에서 배양하였다. CTLA4-Fc는 어떠한 효과도 없었다. 모든 값은 양성 대조의 범위내에 있다(데이타는 표시하지 않음).
본 발명은 야생형 IL-15 및 IgG Fc 단편으로 구성된 융합 단백질, 이의 제조방법, 면역반응 억제를 위한 이의 용도, 및 이식 후유증 및/또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
효과적인 면역반응은, 항원 또는 유사분열물질에 의해 활성화가 유도되는 활성화된 면역계의 T 세포에 의해 개시된다. T 세포의 활성화는, 예를 들어 사이토카인 및 이의 수용체의 발현을 포함한 다수의 세포 변화를 필요로 한다. 이러한 사이토카인에는 특히 IL-15 및 IL-2가 포함된다.
IL-15 및 IL-2는, 사람 및 쥐의 T 세포, 대식세포, 천연 킬러(NK) 세포, 세포독성 T 세포(CTL) 및 림프구 활성화된 킬러(LAK) 세포의 증식 및 분화뿐만 아니라, 예를 들어 항면역글로불린(항-IgM) 또는 포볼 에스테르에 의해 활성화되는 B 세포의 공동 자극에서도 중요한 역할을 하는 것으로 공지된 성장 인자이다. 이러한 세포의 증식은 생물체의 면역반응을 증강시킨다.
IL-15는 IL-2-의존적인 쥐 세포독성 T 세포(CTLL-2)의 증식을 유도하는 분비 사이토카인으로써 처음 기술되었다. IL-15는, 48개 아미노산 리더 서열을 포함한 전구체 단백질의 아미노산이 162개이고 성숙한 단백질의 아미노산이 114개인 것이 특징이였다[참조문헌: Grabstein et al., (1994) Science 264(5161):965-8]
IL-15는 상피세포 및 섬유아세포주뿐만 아니라 말초혈 단핵구에서 형성된다. 이의 특이적인 mRNA는 태반, 골격근 및 신장에서도 발견되었다[참조문헌: 상기한 Grabstein et al.].
IL-15 및 IL-2는 공통적인 생물학적 특징 외에도 동종 구조를 갖는다. 두 분자 모두는 T 세포막상에 있는 적어도 3개의 개별적인 수용체 아단위에 결합하는데, 이때 신호전달을 일으키는 베타 및 감마 아단위 복합체는 IL-15 또는 IL-2 결합에 대해 동일한 반면, 알파 아단위는 IL-15 또는 IL-2 결합에 특이적이다. IL-2 수용체의 알파 아단위에 대한 항체는, IL-15가 이의 특이적인 알파 아단위에 결합하는데 어떠한 영향도 미치지 않지만[참조문헌: 상기한 Grabstein et al.], IL-2 수용체의 베타 아단위에 대한 항체는 IL-15의 활성을 차단하는 것으로 밝혀졌다[참조문헌: Giri et al., (1994) EMBO J., 13:2822]. 신호전달은 IL-15 베타 및 감마 아단위에 의해 일어난다.
다수의 질환에서, 치료 목적으로 환자의 면역계 반응을 억제해야할 필요가 있다. 이러한 질환에는, 예를 들어 자가면역 질환, 특히 제I형 당뇨병[참조문헌: Botazzo, G.F., et al., (1985) N Engl J Med 113:353], 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 만성 간 질환, 염증성 장 질환, 이식편대숙주 질환(GVHD) 및 이식 거부반응이 포함된다[참조문헌: Sakai et al., (1998) Gastroenterology, 114(6):1237-1243; Kivisakk et al., (1998) Clin Exp Immunol, 111(1):193197].
유전적으로 동일하지 않은 생물체로부터 면역적격 세포를 전달받는 경우, 이러한 세포는 수령자 생물체에 대해 반응하게 된다(GVHD)[참조문헌:Janeway C.A. and Travers P., Spektrum-Verlag, German edition, 1995, p. 467].
기관 또는 조직 이식은 생명을 위협하는 여러 질환에서 표준 방법이 되며, 다수의 경우에서는 생명을 구하는 유일한 치료법이 된다. 그러나, 이식물의 외래 세포의 표면 항원에 대한 면역 반응에 의해 발생하는 수령자 생물체에서의 거부반응과 관련하여 많은 어려움이 있다.
이식과 관련하여 이식이 거부되는 정도는 공여자와 수령자간의 조직발생학적 차이의 크기에 좌우된다(조직적합성). 공여자 및 수령자 생물체에 의해 발휘되는 항원 패턴의 차이는 수령자에게서 면역반응을 유도하여, 이식물에 대한 거부반응을 일으킨다. 이식은 체액성 및 세포성 반응 둘다의 결과로써 거부된다. 체액성 효과기는, 항체-의존적이고 세포-매개된 세포독성과 같이 특이성이 상이한 항체 및 공여자 HLA 시스템의 구조에 대해 유도된 항체이다. 세포성 효과기는 특히 대식세포와 함께 세포독성 T 세포이다[참조문헌: Immunologie [Immunology], Janeway C.A. and Travers P., Spektrum-Verlag, German edition 1995, pp. 522-8].
체액성 또는 세포성 면역반응을 억제하기 위한 한가지 치료법은 면역억제제, 특히 길항적 IL-15 또는 IL-2 항체, 또는 IL-15 또는 IL-2 길항제를 사용하는 방법이다.
IL-15 또는 IL-2 분자에 대해 유도된 항체를 사용하는 각종 치료법이 기술되어 있다. 따라서, 예를 들어 모노클로날 항체 항-IL-2.베타(Mik.beta-1)를 투여함으로써 동종이식된 영장류 심장의 생존 기간을 연장하는 것이 가능하다[참조문헌: Tinubu et al., (1994) J Immunol. 153:4330)]. 이식 거부반응을 차단하기 위해 T-세포 특이적인 항원 CD3에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 것도 기술되어 있다[참조문헌: Mackie et al., (1990) TransPlantation 49:1150].
또한 수용체에 결합하는 IL-15의 행태를 바꾸는 다수의 IL-15 길항제가 기술되어 있다. 이러한 길항제는 야생형 IL-15 서열에 돌연변이(들)을 도입하여 수득한다. 이에 따라, 예를 들어 IL-15 수용체의 알파 아단위에는 결합하도록 하지만 베타 아단위에 결합하는 것은 막는 아미노산 위치 56번(아스파르테이트)(리더 서열이 제거된 후에는 8번째 위치)에서의 돌연변이가 기술되어 있다[참조문헌: 제WO 96/26274호]. 다른 방법으로, 아미노산 위치 156번(글루타민)(리더 서열이 제거된 후에는 108번째 위치)의 돌연변이는 감마 아단위와의 상호작용을 억제한다[참조문헌: 제WO 96/26274호 및 제WO 97/41232호]. 또한, 페길화된(PEGylated) IL-15는 알파 아단위에는 결합하지만 공간적인 이유로 인해 베타 아단위에는 더 이상 결합할 수 없게 된다[참조문헌: Pettit et al., (1997) J Biol Chem, 272 4: 2312-2318].
상기한 IL-15 길항제는 그 자체 또는 융합 단백질로서 길항 효과를 수득한 돌연변이 IL-15(mut-IL-15) 서열이다. 이러한 융합 단백질은 N-말단 mut-IL-15 단편 및 C-말단 Fc 단편, 특히 쥐 IgG2a 또는 사람 IgG1으로 이루어진 폴리펩타이드이다[참조문헌: 제WO 97/41232호; Kim et al., 1998) J Immunol., 160:5742-5748].
Fc(결정성 단편: Fragment cristallizable) 단편은 어떠한 항원에도 결합하지 않는 항체의 단편을 의미하는 것으로 이해한다. 항체의 다른 2개의 동일한 Fab(Fragment antigen binding) 단편은 항원 결합 활성을 갖는다[참조문헌: Immunologie [Immunology], Janeway C.A. and Travers P., German edition (1995), p. 117 ff].
그러나, 이러한 돌연변이 IL-15 분자의 단점은, 야생형 IL-15와 비교하여 1차, 2차 및 3차 구조가 변화되어 상이한 분해점을 갖게 되고, 그 결과 세포에서는 천연적으로 생기지 않는 분해 산물이 생성되어 생물체에 독성 효과를 나타낼 수 있다는 점이다. 이러한 부작용 및 다른 부작용의 정도 및 특징은 상세히 예견할 수가 없다.
또다른 단점은, 이식받은 환자는 일반적으로 평생 동안 이식물을 보유해야 하는데 이는 평생 동안 면역억제제를 복용할 필요가 있음을 의미한다는 것이다. 특히 면역억제제의 장기간 복용의 부작용에 대한 이해가 불충분하다는 사실로 인해, 이러한 부작용을 배제하거나 적어도 이를 제한할 필요가 있음이 강조되고 있다.
사이클로스포린, FK506 및 라파마이신과 같은 면역억제 성분을 투여하는 경우, 이러한 제제가 모든 T 세포의 증식을 억제하는 것이 입증되었다[참조문헌: Penn, (1991) Transplant Proc, 23:1101; Beveridge et al., (1984) Lancet 1:788].
심각한 단점은, 일반적으로 면역억제제를 전신 투여하면 이러한 면역억제제가 생물체 전체에 분포되어 이식된 세포, 조직 또는 기관 부위에만 국소적으로 존재하도록 하지는 못한다는 점이다. 그러나, 생물체 전체에 걸쳐 T 세포의 증식이 억제되면 감염, 독성 분해 산물 또는 심지어는 암이 발생할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 면역반응을 억제해야할 생물체에서 어떠한 부작용도 나타내지 않거나 거의 부작용이 없는 면역억제제를 생산하는 것이다.
돌연변이된 IL-15 분자, 또는 mut-IL-15 및 Fc 단편을 포함한 융합 단백질이 수용체 결합 행태를 억제 또는 변화시켜 IL-15에 대해 길항 효과를 나타낸다는 것은 공지되어 있다.
그러나, 길항 효과가 그 자체는 예상되었을지라도, N-말단 야생형 IL-15 및 C-말단 Fc 단편, 특히 쥐 IgG2a를 포함한 융합 단백질이 길항 효과를 나타낸다는 것이 특히 놀라웠다. 일반적으로 면역자극성인 천연 IL-15 분자에 Fc 단편을 부착시킴에 의해서만 작용 기전을 역전시켜 면역반응을 억제할 수 있었다.
융합 단백질의 야생형 IL-15 단편이 자연적으로 폴딩되어, 부착된 Fc 단편이 단독으로 수용체 결합 행태를 바꾸도록 함으로써 전체 야생형 IL-15-Fc 분자가 야생형 IL-15와 관련된 길항 효과를 나타낸다는 가정에서는 이러한 발견이 불가능하기 때문에 이 발견은 정말 놀라운 것이다.
따라서, 본 발명의 내용의 일부는 한편으로는 야생형 IL-15, 및 다른 한편으로는 쥐 IgG2b Fc 단편을 제외한 IgG Fc 단편으로 이루어진 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 융합 유전자의 발현 산물인 것으로 이해할 수 있다. 융합 유전자는 둘 이상의 유전자 또는 유전자 단편을 연결시켜 새로운 조합을 형성시킨다.
본 발명에 따른 야생형 IL-15는, 예를 들어 문헌[Grabstein et al., (1994) Science 264(5161):965-8]에서 기술한 바와 같이 천연 IL-15 또는 이의 대립유전자 변이체를 의미하는 것으로 이해할 수 있다.
Fc (결정성 단편) 단편은 어떠한 항원에도 결합할 수 없는 항체의 단편, 예를 들어 가변 도메인이 결여되어 있거나 중쇄 및 경쇄의 첫번째 불변 도메인이 부분 또는 완전 결여된 항체 분자로 이해될 수 있다. Fc 단편은 천연 공급원으로부터 유래되거나 재조합으로 제조하고/하거나 합성할 수 있다. 당분야의 숙련가라면 적절한 방법을 알 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질의 Fc 단편은 면역글로불린 G(IgG), 보다 구체적으로는 사람 또는 쥐 IgG1, 사람 IgG2, 쥐 IgG2a, 사람 또는 쥐 IgG3 또는 사람 IgG4, 바람직하게는 사람 IgG1 또는 쥐 IgG2a, 특히 IgG1이다. 힌지(hinge) 부위 또는 그 아래쪽의 IgG를 사용하는 것이 바람직하다. Ig 분자의 유연한 부위가 힌지 부위이다.
본 발명에 따른 IgG는, 예를 들어 하기하는 IgG로 이해할 수 있다: 사람 IgG1[참조문헌: Paterson, T. et al., (1998), Immunotechnology 4(1):37-47], 쥐 IgG2a[참조문헌: Sikorav, J.L., (1980), Nucleic Acids Res. 8(14):3143-3155], 쥐 IgG1[참조문헌: French et al., (1991), J. Immunol. 146(6):2010-2016], 사람 IgG2[참조문헌: Krawinkel, U. and Rabbitts, T.H., (1982), EMBO J. 1(4):403-407; Wang et al., (1980), J. Immunol. 125(3):1048-1054], 쥐 IgG2b[참조문헌: Schlomchik, M.J., (1987), Nature 328, 805-811], 사람 IgG3[참조문헌: Huck, S. et al., (1986), Nucleic Acids Res. 14(4):1779-1789], 쥐 IgG3[참조문헌: Wels et al., (1984), EMBO J., 3(9):2041-2046] 및 사람 IgG4[참조문헌: Pink et al., (1970), Biochem. J., 117(1):33-47].
본 발명에 따른 융합 단백질은, 바람직하게는 예를 들어 야생형 IL-15 및 이종 IgG1 Fc 단편 또는 이종 IgG2a Fc 단편을 함유하는 키메라 융합 단백질이다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 아미노산 서열인 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5를 포함한다.
본 발명의 내용의 또다른 부분은 한편으로는 야생형 IL-15을 포함하고 다른 한편으로는 쥐 IgG2b Fc 단편을 제외한 IgG Fc 단편을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는 야생형 IL-15와 사람 또는 쥐 IgG1, 사람 IgG2, 쥐 IgG2a, 사람 또는 쥐 IgG3 또는 사람 IgG4, 특히 바람직하게는 사람 IgG1 또는 쥐 IgG2a, 특히 바람직하게는 IgG1을 암호화한다.
본 발명에 따른 핵산은, 바람직하게는 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5 중 하나인 융합 단백질을 암호화한다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 핵산은 DNA 서열인 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10을 포함한다.
본 발명에서 핵산은 RNA 또는 DNA, 특히 게놈 DNA, cDNA, 또는 예를 들어 포스포르아미드화 수준에서 합성되는 합성 DNA로 이해할 수 있다. 이러한 핵산의 뉴클레오타이드의 조합 및/또는 변형도 포함된다. 또한, 이 용어는 일본쇄 또는 이본쇄 핵산을 포함한다.
또한, 이는 기능적으로 연결된 성분, 예를 들어 본 발명에 따른 하나 이상의 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 융합된 유전자 또는 이의 활성 부위를 포함하고, 또한 정량적 및/또는 시간에 의존하는 방식으로 유전자의 발현에 영향을 미치는 조절 요소 및/또는 조절 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 포함된다.
조절 요소의 예에는 구성적(constitutive) 프로모터, 또는 세포 특이적 또는 조직 특이적 발현용 프로모터가 있다.
조절 뉴클레오타이드 서열에는, 예를 들어 리더 서열, 폴리아데닐화 서열(예: SV40 폴리아데닐화 신호), 인핸서 서열, IRES 서열 및 인트론이 포함된다.
하기에 열거된 리더 서열은 본 발명의 바람직한 리더 서열의 예이다:
Igκ 리더:
CD5 리더:
CD4 리더:
IL-2 리더:
MCP 리더:
고유한 짧은 IL-15 리더:
고유한 긴 IL-15 리더:
존재하는 유전자 서열이 전사 조절의 영향하에 전사되도록 성분들이 연결되어 있는 경우에 성분들은 기능적으로 연결되어 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 벡터는 플라스미드, 셔틀 벡터(shuttle vector), 파아지미드(phagemid), 코스미드(cosmid), 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 발현 벡터, 및 유전자 치료에 효과적인 벡터일 수 있다.
본 발명에서 발현 벡터는 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 해독 개시 신호, 해독 종결 신호 및/또는 진핵세포에서 발현하기 위한 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
시판되는 발현 벡터, 특히 포유동물 세포 발현용 벡터, 예를 들어 pIRES(공급원: Clontech, Palo Alto, USA), pCI-neo 벡터(공급원: Promega, Madison, USA), pCMV-Script(공급원: Stratagene, La Jolla, USA) 및 pCDNA 벡터(공급원: Invitrogen, Paisley, UK)가 본 발명에 따른 핵산을 도입시키기에 적합하다.
유전자 치료에 효과적인 본 발명에 따른 벡터에는, 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 RNA 바이러스 레플리콘(replicon)을 기본으로 하는 벡터가 있다[참조문헌: Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Khromykh, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther.; 2: 555-69].
유전자 치료에 효과적인 벡터는 또한 본 발명에 따른 핵산과 리포좀을 복합시켜 수득할 수 있다. 리포펙션(lipofection)에서, 양이온 지질로 구성된 작은 단층판 소포는 리포좀 현탁액을 초음파처리하여 제조한다. 구체적으로는 순 전하가 양전하로 유지되고 플라스미드 DNA의 100%가 리포좀과 복합되는 비율로 리포좀의 표면에 DNA를 이온 결합시킨다. DOTMA(1,2-디올레일옥시프로필-3-트리메틸암모늄 브로마이드) 및 DPOE(디올레옥시포스파티딜에탄올아민) 지질 혼합물 외에, 다수의 신규한 지질 제형이 새로 합성되고 다양한 세포주에서 이의 형질감염(transfection) 효율에 대해 시험되었다[참조문헌: Behr et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982-6986; Gao and Huang, 1991, Biochem. Biophys. Acta 1189, 195-203; Felgner et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550-2561]. 신규한 지질 제형의 예에는 DOTAP N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄에틸 설페이트 또는 DOGS(TRANSFECTAM; 디옥타데실아미도글리실스페르민)가 있다. 세포로의 핵산 전달을 증가시키는 보조 물질은, 예를 들어 핵산을 세포 핵으로 전달시킬 수 있는 합성 펩타이드-DNA 분자 또는 DNA에 결합된 단백질 또는 펩타이드일 수 있다[참조문헌: Schwartz et al., 1999, Gene Therapy 6: 282; Branden et al. 1999, Nature Biotechs. 17: 784]. 보조 물질에는 또한 핵산을 세포질로 방출시킬 수 있는 분자[참조문헌: Planck et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al., 1997, Bioconj. Chem. 8, 213], 또는 예를 들어 리포좀[참조문헌: Uhlmann and Peimann, 1990, Chem. Rev. 90, 544]이 포함된다.
본 발명의 내용의 일부는 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 및/또는 본 발명에 따른 하나 이상의 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
이러한 세포는 바람직하게는 전구세포, 불멸세포 또는 줄기세포, 특히 복수분화(pluripotent) 또는 다중분화(multipotent) 배아 줄기세포, 태아 줄기세포, 신생아 줄기세포 또는 성체 줄기세포이다. 이러한 복수분화 배아 줄기세포 또는 세포주는 배반포(blastocyte)의 내부 세포군으로부터 분리시킬 수 있다[참조문헌: Robertson, Embryo-derived stem cell lines, in Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, Robertson, editor, IRL Press, Washington DC, 1987]. 성체 조직 유래의 특히 바람직한 줄기세포에는, 예를 들어 신경 줄기세포, 골수 유래의 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 상피 줄기세포, 소화관 유래의 줄기세포 및 관 줄기세포가 포함된다.
본 발명에 따른 세포의 예에는 상피세포, 혈관세포, 간세포, 심장세포, 피부세포, 근육세포, 신경세포, 골수세포, CHO 세포(난소세포), 및 췌장샘, 신장, 안구 및 폐로 부터 유래된 세포가 있다.
특히, 본 발명에 따른 세포는 사람 세포를 포함한 포유동물 세포이다. 이러한 세포는, 예를 들어 사람, 마우스, 랫트, 기니피그, 토끼, 소, 염소, 양, 말, 돼지, 개, 고양이 또는 원숭이로부터 유래된 것일 수 있는데, 사람으로부터 유래된 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 세포는 이종 유전자를 발현시키는데도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 세포는 세포주의 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 세포주는 당분야의 숙련가에게 친숙한 방법, 예를 들어 형질감염, 형질전환, 전기천공, 미세주입 또는 감염을 사용하여, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터로 세포주를 형질감염, 형질전환 또는 감염시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 내용의 다른 부분은, 본 발명에 따른 하나 이상의 융합 단백질, 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산, 본 발명 따르는 하나 이상의 벡터 및/또는 본 발명에 따르는 하나 이상의 세포, 및 경우에 따라 적합한 보조 물질 및/또는 첨가제를 포함하는 약제에 관한 것이다.
예를 들어 약제 또는 진단 시약을 안정화시키거나 보존하는데 사용되는 적합한 보조 물질 및/또는 첨가제는 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 이러한 보조 물질 및/또는 첨가제는 생리학적 염화나트륨 용액, 링거(Ringer) 글루코스, 글루코스, 링거 락테이트, 탈염수, 안정화제, 항산화제, 착화제, 항균 화합물, 프로테이나제 억제제 및/또는 불활성 기체이다.
본 발명에 따른 약제는, 예를 들어 질환을 예방, 치료 또는 진단하는데 사용할 수 있다. 이러한 질환에는 예를 들어 아래의 질환이 포함된다:
- 류마티스 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 피부근육염, 다발근육염, 라이터 증후군 또는 베세트병;
- 제I형 또는 제II형 당뇨병;
- 갑상선의 자가면역 질환, 예를 들어 바세도우병, 하시모도 갑상선염;
- 중추신경계의 자가면역 질환, 예를 들어 다발성 경화증;
- 피부 질환, 예를 들어 건선, 신경피부염;
- 염증성 장질환, 예를 들어 크론병;
- 면역결핍 질환, 예를 들어 AIDS;
- 혈관 질환;
- 이식 후유증, 예를 들어 이식 거부반응, 및
- 종양 질환.
본 발명에 따른 약제는 당분야의 숙련가에게 친숙한 방법으로 투여하는데, 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 두개내, 안와내, 캡슐 경로, 척추내, 근육경유, 국소 또는 경구로 투여한다. 다른 투여 방법으로는, 예를 들어 전신 또는 국소 주사, 관류 또는 카테터-이용 투여가 있다.
본 발명에 따른 약제는, 예를 들어 정제 또는 캡슐과 같은 경구 투여형으로 투여하거나 점막(예: 비강 또는 구강)을 통해 투여하거나 스프레이 형태로 폐에 투여하거나 피부 속에 이식된 저장소의 형태로 투여할 수 있다. 경피 치료 시스템(TTS)는, 예를 들어 제EP 0　944　398-A1호, 제EP 0　916　336-A1호, 제EP 0　889　723-A1호 또는 제EP 0　852　493-A1호에 기술되어 있다.
약제는, 세포를 환자로부터 제거하고 예를 들어 DNA 형질감염에 의해 이를 유전적으로 변형시킨 후 환자에게 다시 도입하는 생체외 방법을 사용하거나, 또는 유전자 치료에 효과적인 본 발명에 따른 벡터를 본 발명에 따른 바이러스 또는 비바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 세포를 이용하거나 나상 DNA로서 환자 신체에 도입하는 생체내 방법을 사용하여 생물체에 도입할 수 있다.
약제의 용량이 환자의 체중, 일반적인 건강 상태, 체표면적, 연령 및 다른 약물과의 상호작용과 같은 몇몇 인자에 좌우된다는 것은 당분야에 공지되어 있다. 또한 용량은 투여 형태에도 좌우된다. 따라서, 용량은 개인을 기준으로 하여 각 환자에 따라 당분야의 숙련가가 결정해야 한다. 약제는 1일 1회 또는 수회 투여할 수 있으며 며칠에 걸쳐서 투여할 수 있는데, 이 또한 당분야의 숙련가가 결정할 수 있다.
본 발명의 내용의 다른 부분은, 하나 이상의 융합 단백질, 상기한 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산, 상기한 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터, 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 벡터를 포함하는 하나 이상의 세포를 함유하며, 이때 융합 단백질이 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물의 기관에 관한 것이다.
본 발명에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 본 발명에 따른 사람 또는 포유동물 기관의 융합 단백질은, 바람직하게는 한편으로는 야생형 IL-15을 포함하고 다른 한편으로는 사람 또는 쥐 IgG1, 사람 IgG2, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 사람 또는 쥐 IgG3 또는 사람 IgG4, 바람직하게는 사람 IgG1 또는 쥐 IgG2a, 특히 IgG1을 포함하지만, 쥐 IgG2b를 포함하지 않는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 사람 또는 동물의 기관특이적 조직은, 예를 들어 췌장샘으로부터의 조직(예: 랑게르한스섬 세포), 및 심장, 심근, 신장, 간, 폐, 비장, 연골, 인대, 망막, 각막, 골수, 피부, 신경 및/또는 근육 조직일 수 있다.
본 발명의 사람 또는 포유동물 기관은, 예를 들어 췌장샘, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 눈 및/또는 피부일 수 있다.
본 발명의 내용의 또다른 부분은, 하나 이상의 융합 단백질, 상기한 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산, 상기한 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터, 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 벡터를 포함하는 하나 이상의 세포를 함유하며, 이때 융합 단백질이 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 유전자전이된(transgenic), 사람을 제외한 포유동물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 동물의 융합 단백질은, 바람직하게는 한편으로는 야생형 IL-15을 함유하고 다른 한편으로는 사람 또는 쥐 IgG1, 사람 IgG2, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 사람 또는 쥐 IgG3 또는 사람 IgG4, 바람직하게는 사람 IgG1 또는 쥐 IgG2a, 특히 IgG1을 함유하지만, 쥐 IgG2b를 함유하지 않는 것이 특히 바람직하다.
일반적으로 유전자전이된 동물은 조직 특이적으로 핵산 발현이 증가되므로, 예를 들어 면역반응을 분석하는데 매우 적합하다. 유전자전이된 마우스를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물의 예에는 마우스, 랫트, 기니피그, 토끼, 소, 염소, 양, 말, 돼지, 개, 고양이 또는 원숭이가 있다.
본 발명의 내용의 다른 부분은,
●IL-15 매개된 세포 현상을 억제하거나;
●IL-15와 이의 수용체간의 상호작용을 억제하고/하거나;
●이식 후유증, 특히 이식 거부반응 및/또는 자가면역 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한, 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는 융합 단백질, 상기한 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는 벡터, 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는 벡터를 함유하는 세포의 용도, 또는 본 발명에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 동물의 기관의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 내용의 다른 부분은, IL-15 수용체를 발현하는 세포를 용해시키기 위한, 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는 융합 단백질, 상기한 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는 벡터, 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 벡터를 함유하는 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질은, 바람직하게는 한편으로는 야생형 IL-15을 포함하고 다른 한편으로는 사람 또는 쥐 IgG1, 사람 IgG2, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 사람 또는 쥐 IgG3 또는 사람 IgG4, 바람직하게는 사람 IgG1 또는 쥐 IgG2a, 특히 IgG1을 함유하지만, 쥐 IgG2b를 함유하지 않는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 용도는 바람직하게는 사람 또는 포유동물에서 실시되거나 이와 연관되어 실시된다. 본 발명에서, 포유동물 사람은 사람인 것으로 이해하고, 포유동물은, 예를 들어 마우스, 랫트, 기니피그, 토끼, 소, 염소, 양, 말, 돼지, 개, 고양이 또는 원숭이 등으로 이해한다.
본 발명의 내용의 또다른 부분은 사람 또는 포유동물에 이식하기 위한, 본 발명에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 본 발명에 따른 사람 또는 포유동물 기관의 용도에 관한 것이다. 이식은 바람직하게는 자가이식, 동종이식 또는 이종이식이다.
이식은 당분야의 숙련가에게 익히 공지된 방법을 사용하여 살아있는 물질, 예를 들어 신체 일부로부터 떼낸 세포, 조직 또는 기관을 신체의 다른 곳으로 이전(자가이식)하거나, 한 개체로부터의 세포, 조직 또는 기관을 다른 개체로 이전(동종이식, 동계이식 및 이종이식)하는 것이다[참조문헌: Klein, J.　S, (1991) Immunologie [Immunology], 1st edition, VHC Verlagsgesellschaft, Weinheim, p. 483]. 다른 생물체로의 이식과 관련하여 동계이식, 동종이식 및 이종이식간에는 다음과 같은 차이가 있다:
- 동계이식: 공여자 및 수령자가 동종에 속하며 유전적으로 완전히 또는 상당히 동일한 경우;
- 동종이식: 공여자 및 수령자가 동종에 속하지만 면역유전학적으로 상이한 경우;
- 이종이식: 공여자 및 수령자가 동종에 속하지 않아 결과적으로는 면역유전학적으로 완전히 상이한 경우.
또한 본 발명의 양태는,
a) 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 및/또는 본 발명에 따른 하나 이상의 벡터를 세포내로 도입하는 단계 및
b) 적합한 조건하에 핵산을 발현시키는 단계를 포함하여, 본 발명에 따른 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
핵산, 벡터 및 유전자(예: 분화 마커 유전자 또는 형질감염 마커 유전자)를 세포로 도입하는 방법은 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있으며, 당분야에서 통상적인 방법, 예를 들어 전기천공, 주입, 형질감염 및/또는 형질전환이 포함된다. 이러한 방법은 물질이 나상 핵산, 특히 DNA를 포함하는 경우에 특별히 바람직하다.
핵산을 발현하는 적합한 조건은 발현 벡터에 의해 만들 수 있는데, 예를 들어 상기한 발현 벡터 및 조절 요소(예: 프로모터 또는 조절 핵산 서열)에 의해 만들 수 있다. 일반적으로 발현 벡터는 전사되는 각 유전자 또는 소정의 세포에 대해 적합한 프로모터를 또한 포함한다.
진핵세포에서 구성적 발현을 가능하게 하는 조절 요소의 예에는, RNA 폴리머라제 II에 의해 인지되는 프로모터가 있다. 모든 세포 및 조직 형태에서 구성적 발현을 위한 이러한 프로모터의 예에는 CD11c 프로모터, pGk(포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터, TK(티미딘 키나아제) 프로모터, EF1α(연장인자 1 알파) 프로모터, SV40 (원숭이 바이러스) 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터 및 pUB(유비퀴틴) 프로모터가 있다.
진핵세포에서 세포 특이적 또는 조직 특이적 발현을 가능하게하는 조절 요소의 예에는, 특정 세포 유형에서만 발현되는 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터 또는 인핸서로 이루어진 활성인자 서열 또는 프로모터가 있다. 이러한 프로모터의 예에는 췌장 베타세포에 대한 인슐린 프로모터, 신경세포에 대한 Sox-2 프로모터, 간세포에 대한 알부민 프로모터, 근육세포 대한 미오신 중쇄 프로모터, 내피세포에 대한 VE-캐더린 프로모터 및 상피세포에 대한 케라틴 프로모터가 있다.
진핵세포에서 조절가능한 발현을 가능하게하는 조절 요소의 다른 예에는 상응하는 억제인자와 상호작용하는 테트라사이클린 오퍼레이터 및 RU486-유도성 프로모터가 있다[참조문헌: Gossen M. et al., (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20].
또한 발현은 정량적 및/또는 시간에 의존적인 방식으로 발현에 영향을 미치는 조절 뉴클레오타이드 서열에 의해 제어될 수 있다. 이러한 서열에는, 예를 들어 인핸서 서열, 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, IRES 서열 및 인트론이 포함된다.
본 발명의 내용의 다른 부분은,
a) 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 하나 이상의 줄기세포, 전구세포 및/또는 불멸세포에, 먼저 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 포함한 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산을 포함한 하나 이상의 벡터를 도입하고, 두번째로 하나 이상의 적합한 분화 마커 유전자를 도입하는 단계;
b) 단계 a)로부터의 세포를 분화시키는 단계;
c) 단계 b)로부터의 분화된 세포를 선별하는 단계, 및
d) 단계 c)로부터의 선별한 세포를 하나 이상의 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 하나 이상의 사람 또는 포유동물 기관에 도입하는 단계를 포함하여, 본 발명에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 본 발명에 따른 사람 또는 포유동물 기관을 제조하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
바람직한 양태에서, 하나 이상의 적합한 형질감염 마커 유전자는, 본 발명에 따른 상기한 방법에서 단계 a) 이후, 단계 a) 이전 또는 단계 a)와 동시에 도입하며, 단계 a)로부터의 형질감염된 세포는 단계 a) 이후에 선별하는 것이 바람직하다.
세포를 분화시키는 적합한 조건은, 예를 들어 바람직한 세포 분화를 개시하는 성장인자를 가함으로써 만들 수 있다.
세포를 선별하는 다수의 방법들이 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
다른 세포로부터 분화된 세포를 선별하기 위해서 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 양성 선별 계획을 포함한다. 이와 관련하여, 마커 유전자, 예를 들어 항생제 내성을 전달하는 유전자를 분화 단계전, 분화 단계후 또는 분화 단계 동안에 세포에 도입하고, 적합한 조건하에 발현시킨다. 이러한 조건은, 예를 들어 목적하는 세포에서만 활성인 프로모터의 제어하에 마커 유전자를 발현시키는 것으로 이루어져 있다.
마커 유전자의 발현은 성공적으로 분화된 세포에 항생제 내성을 전달한다. 따라서, 예를 들어 상응하는 항생제와 세포를 접촉시킴으로써 분화 후에 세포를 용이하게 선별할 수 있다. 상응하는 항생제 내성을 포함하지 않는 세포는 죽고 분화된 세포만이 생존하게 된다. 본 발명에서 접촉은, 예를 들어 활성 물질을 세포 배양 영양 배지에 부가하여 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 항생제는, 본 발명에 따른 선별 카세트로서 사용되는 항생제 내성 유전자가 내성을 생성하는 항생제를 의미한다. 항생제를 배양된 줄기세포에 부가하면, 본질적으로 리포터 유전자 발현 벡터를 보유한 줄기세포만이 생존하고 분화하게 된다.
바람직하게는 두번째 마커 유전자를 세포에 도입하면, 단계 a)에 따라 핵산 및/또는 벡터가 성공적으로 도입된 세포를 선별할 수 있다. 이러한 이중 선별에 의해, 대략 90%, 바람직하게는 대략 95 내지 100%가 순수한 목적하는 세포군을 수득할 수 있다.
예를 들어, 상기한 선별에 분화 마커 유전자 및 형질감염 마커 유전자를 사용할 수 있다. 이러한 특징의 유전자로는 소정의 독성 물질, 예를 들어 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자가 주로 사용된다. 이와 관련하여 가장 빈번하게 사용되는 항생제에는 네오마이신, 하이그로마이신(hph), 제오신(Sh ble) 및 푸로마이신(pacA)이 있다.
선별, 특히 줄기세포 선별에 적합한 다른 유전자로는, 예를 들어 표면 분자 또는 형광 마커(예: GFP)의 발현을 조절하고 선별될 세포를 세포 분류에 의해 정제하는데 사용될 수 있는 유전자가 있다. 다른 예로는 독성 물질의 전구체, 즉 "프로드럭(prodrug)"을 독성 물질로 전환시키는 효소 활성을 암호화하는 유전자가 있다. 이 경우, 선별은 음성일 수 있는데, 즉 유전자의 상류에 위치한 프로모터를 발현시키지 않는 세포만이 생존하게 된다.
본 발명의 내용의 또다른 부분은,
a) 사람을 제외한 포유동물의 하나 이상의 난모세포, 줄기세포, 전구세포 및/또는 불멸세포에, 한편으로는 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터를 도입하고, 다른 한편으로는 하나 이상의 적합한 형질감염 마커 유전자를 도입하는 단계;
b) 단계 a)로부터의 형질감염된 세포를 선별하는 단계;
c) 단계 b)에 따라 선별된 세포를 사람을 제외한 포유동물의 하나 이상의 배반포에 도입하는 단계;
d) 단계 c)로부터의 배반포를 사람을 제외한 포유동물, 바람직하게는 가임신 포유동물 양모에게 도입하는 단계 및
e) 상기한 배반포로부터 발생된 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물을 확인하는 단계를 포함하여, 본 발명에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
배반포에 도입하는 방법은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 배반포는, 예를 들어 주입에 의해 도입할 수 있다[참조문헌: Hogan, B., Beddington, R., Constantini, F. and Lacy, E., A laboratory Manual (1994), Cold Spring Harbor Laboratory Press].
사람을 제외한 유전자전이된 포유동물은 유전자전이된 포유동물, 예를 들어 마우스의 꼬리로부터 게놈 DNA를 추출하여 확인할 수 있다. 후속되는 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에서는, 본 발명에 따른 핵산에 대한 전이유전자(transgene)를 특이적으로 확인하는 프라이머를 사용한다. 이러한 방식으로 전이유전자의 통합을 검출할 수 있다.
서던 블롯팅(Southern blotting)에 의해서도 이를 확인할 수 있다. 이 방법에서는, 게놈 DNA를 막으로 이전시키고, DNA 프로브, 예를 들어 찾고자하는 전이유전자에 대해 특이적인 방사능 표지된 DNA 프로브를 사용하여 검출할 수 있다.
사람의 것이 아닌 줄기세포, 난모세포, 전구세포 또는 불멸세포를 재생함으로써 본 발명에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물을 만드는 방법, 특히 유전자전이된 마우스를 만든 방법은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있으며[참조문헌: 제DE 196　25　049호, 및 제US 4,736,866호, 제US 5,625,122호, 제US 5,698,765호, 제US 5,583,278호 및 제US 5,750,825호], 예를 들어 본 발명에 따른 발현 벡터를 배아 또는 정모세포에 직접 주입하거나 발현 벡터를 배아 줄기세포에 형질감염시킴으로써 만들 수 있는 유전자전이된 동물도 포함한다[참조문헌: Polites and Pinkert: DNA Mikroinjection and Transgenic Animal Production, pages 15-68 in Pinkert, 1994: Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, San Diego, USA; Houdebine 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stem Cells, pages 115-146 in Pinkert, 1994, see above; Wood: Retrovirus-Mediated Gene Transfer, pages 147-176 in Pinkert, 1994, see above; Monastersky: Gene Transfer Technology: Alternative Techniques and Applications, pages 177-220 in Pinkert, 1994, see above].
본 발명에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물은 본 발명에 따른 핵산을 사람을 제외한 포유동물의 전핵에 직접 주입하여 제조할 수도 있다.
또한, 유전자전이된 동물, 특히 유전자전이된 마우스를 만드는 다수의 방법은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있으며[참조문헌: 제WO 98/36052호, 제WO 01/32855호, 제DE 196　25　049호, 제US 4,736,866호, 제US 5,625,122호, 제US 5,698,765호, 제US 5,583,278호 및 제US 5,750,825호], 예를 들어 본 발명에 따른 벡터를 배아 또는 정모세포에 직접 주입하거나 벡터 또는 핵산을 배아 줄기세포에 형질감염시켜 만들 수 있는 유전자전이된 동물도 포함한다[참조문헌: Polites and Pinkert, in Pinkert, (1994) Transgenic animal technology, A Laboratory Handbook, Academic Press, London, UK, pages 15 to 68; Doetschmann, in Pinkert, 1994, see above, pages 115 to 146].
본 발명의 내용의 또다른 부분은, 본 발명에 따른 상기한 방법으로 만든 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물 및 이의 자손에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 본 발명에 따른 사람 또는 포유동물 기관을 제조하기 위한 본 발명에 따른 시험관내 방법, 및 본 발명에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물을 만드는 방법에서 사용되는 줄기세포는 복수분화 또는 다중분화 배아 줄기세포, 태아 줄기세포, 신생아 줄기세포 또는 성체 줄기세포이다.
본 발명의 내용의 일부는 동종이식 및/또는 이종이식용 세포, 기관특이적 조직 및/또는 포유동물 기관을 수득하기 위한, 본 발명에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 동물의 용도에 관한 것이다.
세포를 이식하는 경우, 예를 들어 이식(implantation) 방법을 사용하거나, 또는 혈관벽을 통해 카테터에 의한 주입 방법을 사용하여 이식할 수 있다.
본 발명에서, "수득"은 본 발명에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물의 신체로부터 상기한 세포, 조직 및/또는 기관을 제거하는 것으로 이해한다. 이러한 제거를 실시하는 적절한 방법은 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다.
본 발명의 내용의 일부는 또한 약리학적 활성 화합물을 발견하고/하거나 독성 물질을 확인하기 위한, 본 발명에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 본 발명에 따른 사람 또는 포유동물 기관의, 본 발명에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물의 용도에 관한 것이다.
이러한 방법은, 예를 들어 본 발명의 세포를 96웰 미세역가 플레이트에 넣고, 조사하고 후속 분석할 독성 물질 또는 약리학적 활성 물질을 가한 다음, 상기 물질이 세포 사멸율을 증가시키는지를 알아보기 위해 세포수를 측정하는 것으로 이루어진다.
본 발명에서, 용어 약리학적 활성 화합물 및 독성 물질은, 적합한 조건하에 개별적인 세포, 개별적인 조직, 개별적인 기관 또는 포유동물 또는 사람의 전신에 영향을 미치는 모든 분자, 화합물 및/또는 조성물 및 물질들의 혼합물로 이해한다. 가능한 약리학적 활성 화합물 및 독성 물질은 단순 화학(유기 또는 무기) 분자 또는 화합물, 핵산 또는 핵산 유사체, 핵산 안티센스 서열, 펩타이드, 단백질 또는 복합체 및 항생제일 수 있다. 이의 예로는, 물질 라이브러리로부터 유래되고 이의 약리학적 또는 독성 활성에 대해 분석된 유기 분자가 있다.
약리학적 활성 화합물의 예에는
- 세포의 분열 및/또는 생존 능력;
- 단백질 분비, 예를 들어 췌장 베타세포에 의한 인슐린 분비 또는 신경세포에 의한 도파민 분비;
- 근육세포의 수축, 및/또는
- 세포의 이동 행태에 영향을 미치는 활성 화합물이 있다.
사람 또는 포유동물의 전신에 사용되는 경우, 약리학적 활성 화합물은, 예를 들어 심혈관계, 신경계 및 또한 대사 활성에 영향을 미치는 것으로도 이해한다.
독성 물질의 예에는
- 스트레스와 같은 소정의 신호가 전달된 후 세포가 아폽토시스(apoptosis)를 겪도록 자극하고,
- 심혈관계에 영향을 미치고/미치거나,
- 신경계에 영향을 미치고/미치거나,
- 대사 활성에 영향을 미치는 활성 화합물이 있다.
확인된 약리학적 활성 화합물 및 독성 물질은, 예를 들어 상기 예시한 바와 같이 이식 후유증 및/또는 자가면역질환의 진단, 예방 및/또는 치료하기 위한 진단 시약 또는 약제를 제조하기 위해, 경우에 따라 적합한 첨가제 및/또는 보조 물질과 함께 또는 이와 혼합하여 사용될 수 있다.
하기 도면 및 예는 본 발명을 제한하지 않으면서 이를 명확하게 할 의도로 기술된 것이다.
도 1a는 아미노산 서열 WT-IL-15-hIgG1을 도시한 것이고,
도 1b는 아미노산 서열 WT-IL-15-mIgG2a를 도시한 것이고,
도 2a는 아미노산 서열 WT-IL-15를 도시한 것이고,
도 2b는 아미노산 서열 hIgG1을 도시한 것이고,
도 2c는 아미노산 서열 mIgG2a를 도시한 것이고,
도 3a는 아미노산 서열 Igκ8을 도시한 것이고,
도 3b는 아미노산 서열 149-Fc를 도시한 것이고,
도 4는 핵산 서열 WT-IL-15-hIgG1을 도시한 것이고,
도 5는 핵산 서열 WT-IL-15-mIgG2a를 도시한 것이고,
도 6a는 핵산 서열 WT-IL-15를 도시한 것이고,
도 6b는 핵산 서열 hIgG1을 도시한 것이고,
도 7은 핵산 서열 mIgG2a를 도시한 것이고,
도 8a는 쥐 Igκ 리더의 핵산 서열을 도시한 것이고,
도 8b 사람 CD5 리더의 핵산 서열을 도시한 것이고,
도 8c는 사람 CD4 리더의 핵산 서열을 도시한 것이고,
도 8d는 사람 IL-2 리더의 핵산 서열을 도시한 것이고,
도 9a는 사람 MCP 리더의 핵산 서열을 도시한 것이고,
도 9b는 고유한 짧은 사람 IL-15 리더의 핵산 서열을 도시한 것이고,
도 9c는 고유한 긴 사람 IL-15 리더의 핵산 서열을 도시한 것이고,
도 10은 핵산 서열 Igκ8을 도시한 것이고,
도 11은 핵산 서열 149-Fc을 도시한 것이며,
도 12는 CTLL-2 세포의 IL-15 매개된 증식에 대한 상이한 단백질 작제물의 억제 또는 증식 촉진 효과를 도시한 것이다.
설명: hIgG1는 사람 IgG1을 의미하고 mIgG2a는 쥐 IgG2a를 의미한다.
본 발명의 내용의 다른 부분은,
(i) 야생형 IL-15, 및 쥐 IgG2b Fc 단편을 제외한 IgG Fc 단편으로 이루어진 융합 단백질;
(ii) IgG Fc 단편이 사람 또는 쥐 IgG1, 사람 IgG2, 쥐 IgG2a, 사람 또는 쥐 IgG3 또는 사람 IgG4임을 특징으로 하는, (i)에 따른 융합 단백질;
(iii) 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 함유하는, (i) 또는 (ii)에 따른 융합 단백질;
(iv) 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 함유하는, (i) 또는 (ii)에 따른 융합 단백질;
(v) 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 함유하는, (i) 또는 (ii)에 따른 융합 단백질;
(vi) 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 함유하는, (i) 또는 (ii)에 따른 융합 단백질;
(vii) 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 함유하는, (i) 또는 (ii)에 따른 융합 단백질;
(viii) (i) 내지 (vii)중 하나 이상에 따른 융합 단백질을 암호화하는 핵산;
(ix) 서열 번호 6의 DNA 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 함유하는, (viii)에 따른 핵산;
(x) 서열 번호 7의 DNA 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 함유하는, (viii)에 따른 핵산;
(xi) 서열 번호 8의 DNA 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 함유하는, (viii)에 따른 핵산;
(xii) 서열 번호 9의 DNA 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 함유하는, (viii)에 따른 핵산;
(xiii) 서열 번호 10의 DNA 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 함유하는, (viii)에 따른 핵산;
(xiv) (ix) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 핵산에 의해 암호화되는 융합 단백질;
(xv) (viii) 내지 (xiv)중 하나 이상에 따른 핵산을 하나 이상 함유하는 벡터;
(xvi) (viii) 내지 (xiv)중 하나 이상에 따른 하나 이상의 핵산 및/또는 (xv)에 따른 하나 이상의 벡터를 함유하는 세포;
(xvii) 세포가 줄기세포, 전구세포 및/또는 불멸세포임을 특징으로 하는, (xvi)에 따른 세포;
(xviii) 세포가 복수분화 또는 다중분화 배아 줄기세포, 태아 줄기세포, 신생아 줄기세포 또는 성체 줄기세포임을 특징으로 하는, (xvii)에 따른 세포;
(xix) (xvi) 내지 (xviii)중 하나 이상에 따르는, 세포주 형태의 세포;
(xx) (i) 내지 (vii)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 융합 단백질, (viii) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 핵산, (xv)에 따른 하나 이상의 벡터 및/또는 (xvi) 내지 (xviii)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 세포와 적합한 보조 물질 및/또는 첨가제를 포함하는 약제;
(xxi) 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 (i) 내지 (vii) 및 (xiv)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 융합 단백질; 상기한 융합 단백질을 암호화하는, 특히 (viii) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 핵산; 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는, 특히 (xv)에 따른 하나 이상의 벡터; 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 벡터를 함유하는, 특히 (xvi) 내지 (xviii)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는, 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관;
(xxii) 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 포함하는, 특히 (i) 내지 (vii) 및 (xiv)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 융합 단백질; 상기한 융합 단백질을 암호화하는, 특히 (viii) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 핵산; 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는, 특히 (xv)에 따른 하나 이상의 벡터; 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 벡터를 함유하는, 특히 (xvi) 내지 (xviii)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는, 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물;
(xxiii) IL-15 매개된 세포 현상을 억제하는 약제를 제조하기 위한, 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 (i) 내지 (vii) 및 (xiv)중 어느 하나에 따른 융합 단백질; 특히 (viii) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 핵산; 특히 (xv)에 따른 하나 이상의 벡터; 및/또는 특히 (xvi) 내지 (xviii)중 어느 하나에 따른 세포; 또는 (xxi)에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 용도;
(xxiv) IL-15와 이의 수용체의 상호작용을 억제하는 약제를 제조하기 위한, 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 (i) 내지 (vii) 및 (xiv)중 어느 하나에 따른 융합 단백질; 특히 (viii) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 핵산; 특히 (xv)에 따른 하나 이상의 벡터; 및/또는 특히 (xvi) 내지 (xviii)중 어느 하나에 따른 세포; 또는 (xxi)에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 용도;
(xxv) IL-15 수용체를 발현하는 세포를 용해시키는 약제를 제조하기 위한, 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 (i) 내지 (vii) 및 (xiv)중 어느 하나에 따른 융합 단백질; 특히 (viii) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 핵산; 특히 (xv)에 따른 벡터; 및/또는 특히 (xvi) 내지 (xviii)중 어느 하나에 따른 세포의 용도;
(xxvi) 이식 후유증 및/또는 자가면역 질환을 예방하고/하거나 치료하는 약제를 제조하기 위한, 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 (i) 내지 (vii) 및 (xiv)중 어느 하나에 따른 융합 단백질; 특히 (viii) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 핵산; 특히 (xv)에 따른 벡터; 및/또는 특히 (xvi) 내지 (xviii)중 어느 하나에 따른 세포; 또는 (xxi)에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 용도;
(xxvii) 사람 또는 포유동물에게 이식하기 위한, (xxi)에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 용도;
(xxviii) 이식이 자가이식, 동종이식 또는 이종이식임을 특징으로 하는, (xxvii)에 따른 용도;
(xxix)
a) (viii) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 핵산 및/또는 (xv)에 따른 하나 이상의 벡터를 세포내로 도입하는 단계 및
b) 적합한 조건하에 핵산을 발현시키는 단계를 포함하여, (i) 내지 (vii) 및 (xiv)중 하나 이상에 따른 융합 단백질을 제조하는 방법;
(xxx)
a) 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 하나 이상의 줄기세포, 전구세포 및/또는 불멸세포에, 먼저 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는 융합 단백질을 암호화하는, 특히 (viii) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는 하나 이상의 벡터를 도입하고, 두번째로 하나 이상의 적합한 분화 마커 유전자를 도입하는 단계,
b) 단계 a)로부터의 세포를 분화시키는 단계,
c) 단계 b)로부터의 분화된 세포를 선별하는 단계 및
d) 단계 c)로부터의 선별한 세포를 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관에 도입하는 단계를 포함하여, (xxi)에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관을 제조하기 위한 시험관내 방법;
(xxxi) 하나 이상의 적합한 형질감염 마커 유전자가 단계 a) 이후, 단계 a) 이전 또는 단계 a)와 동시에 도입되며 단계 a)로부터의 형질감염된 세포가 바람직하게는 단계 a) 이후에 선별됨을 특징으로 하는, (xxx)에 따른 방법;
(xxxii) 세포가 복수분화 또는 다중분화 배아 줄기세포, 태아 줄기세포, 신생아 줄기세포 또는 성체 줄기세포임을 특징으로 하는, (xxx) 또는 (xxxi)중 어느 하나에 따른 방법;
(xxxiii)
a) 사람을 제외한 포유동물의 하나 이상의 난모세포, 줄기세포, 전구세포 및/또는 불멸세포에, 한편으로는 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는 융합 단백질을 암호화하는, 특히 (vii) 내지 (xiii)중 어느 하나에 따른 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는, 특히 (xv)에 따른 하나 이상의 벡터를 도입하고, 다른 한편으로는 하나 이상의 적합한 형질감염 마커 유전자를 도입하는 단계,
b) 단계 a)로부터의 형질감염 세포를 선별하는 단계,
c) 단계 b)에 따라 선별된 세포를 사람을 제외한 포유동물의 하나 이상의 배반포에 도입하는 단계,
d) 단계 c)로부터의 배반포를 사람을 제외한 포유동물 양모에게 도입하는 단계, 및
e) 상기한 배반포로부터 발생된 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물을 확인하는 단계를 포함하여, (xxii)에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물을 제조하는 방법;
(xxxiv) 세포가 복수분화 또는 다중분화 배아 줄기세포, 태아 줄기세포, 신생아 줄기세포 또는 성체 줄기세포임을 특징으로 하는, (xxxiii)에 따른 방법;
(xxxv) (xxxiii) 또는 (xxxiv)에 따른 방법을 사용하여 제조됨을 특징으로 하는, 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물;
(xxxvi) (xxxv)에 따른 포유동물의 자손임을 특징으로 하는, 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물;
(xxxvii) 동종이식 및/또는 이종이식용 세포, 기관특이적 조직 및/또는 포유동물 기관을 수득하기 위한, (xxii), (xxxv) 및 (xxxvi)중 하나 이상에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 동물의 용도; 및
(xxxviii) 약리학적 활성 화합물을 발견하고/하거나 독성 물질을 확인하기 위한, (xxii), (xxxv) 및 (xxxvi)중 어느 하나에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물, (xxi)에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 용도에 관한 것이다.
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antagonists IL-15 <130> Case21909 <150> EP 02022869.8 <151> 2002-10-14 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> human <400> 1 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 2 <211> 231 <212> PRT <213> human <400> 2 Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro 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ctctgacctg catggtcaca gacttcatgc ctgaagacat ttacgtggag 840 tggaccaaca acgggaaaac agagctaaac tacaagaaca ctgaaccagt cctggactct 900 gatggttctt acttcatgta cagcaagctg agagtggaaa agaagaactg ggtggaaaga 960 aatagctact cctgttcagt ggtccacgag ggtctgcaca atcaccacac gactaagagc 1020 ttctcccgga ctccgggtaa atgag 1045 <210> 11 <211> 63 <212> DNA <213> human <400> 11 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gac 63 <210> 12 <211> 72 <212> DNA <213> human <400> 12 atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct 60 tcctgcctcg ga 72 <210> 13 <211> 75 <212> DNA <213> human <400> 13 atgaaccggg gagtcccttt taggcacttg cttctggtgc tgcaactggc gctcctccca 60 gcagccactc aggga 75 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> human <400> 14 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 <210> 15 <211> 68 <212> DNA <213> human <400> 15 tgaaagtctc tgccgccctt ctgtgcctgc tgctcatagc agccaccttc attccccaag 60 ggctcgct 68 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> human <400> 16 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tggagacaga cacactcctg ctatgggtac tgctgctctg ggttccaggt 60 tccactggtg acaactgggt gaatgtaata agtgatttga aaaaaattga a 111 <210> 23 <211> 111 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 23 ggtggtacct ctgtctgtgt gaggagcata cccatgacga cgagacccaa ggtccaaggt 60 gaccactgaa gacccactta cattattcac taaacttttt ttaacttcta g 111 <210> 24 <211> 347 <212> PRT <213> human <400> 24 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Asp Ser Phe Val His Ile Val Asp Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser Asp Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys 115 120 125 Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr 145 150 155 160 Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser 165 170 175 Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His 180 185 190 Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile 195 200 205 Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 210 215 220 Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys 225 230 235 240 Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu 245 250 255 Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe 260 265 270 Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu 275 280 285 Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 290 295 300 Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg 305 310 315 320 Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His 325 330 335 Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 340 345 <210> 25 <211> 347 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated Fc <400> 25 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Asp Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser Asp Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys 115 120 125 Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr 145 150 155 160 Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser 165 170 175 Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His 180 185 190 Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile 195 200 205 Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 210 215 220 Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys 225 230 235 240 Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu 245 250 255 Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe 260 265 270 Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu 275 280 285 Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 290 295 300 Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg 305 310 315 320 Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His 325 330 335 Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 340 345 <210> 26 <211> 1108 <212> DNA <213> human <400> 26 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg 120 catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca 180 atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt 240 catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 300 gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 360 ttggacagtt ttgtacatat tgtcgacatg ttcatcaaca cttcggatcc cagagggccc 420 acaatcaagc cctgtcctcc atgcaaatgc ccagcaccta acctcttggg tggaccatcc 480 gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga tctccctgag ccccatagtc 540 acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagatg tccagatcag ctggtttgtg 600 aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca caaacccata gagaggatta caacagtact 660 ctccgggtgg tcagtgccct ccccatccag caccaggact ggatgagtgg caaggagttc 720 aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca gcgcccatcg agagaaccat ctcaaaaccc 780 aaagggtcag taagagctcc acaggtatat gtcttgcctc caccagaaga agagatgact 840 aagaaacagg tcactctgac ctgcatggtc acagacttca tgcctgaaga catttacgtg 900 gagtggacca acaacgggaa aacagagcta aactacaaga acactgaacc agtcctggac 960 tctgatggtt cttacttcat gtacagcaag ctgagagtgg aaaagaagaa ctgggtggaa 1020 agaaatagct actcctgttc agtggtccac gagggtctgc acaatcacca cacgactaag 1080 agcttctccc ggactccggg taaatgag 1108 <210> 27 <211> 1108 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid for mutated Fc <400> 27 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg 120 catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca 180 atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt 240 catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 300 gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 360 ttggacagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttcggatcc cagagggccc 420 acaatcaagc cctgtcctcc atgcaaatgc ccagcaccta acctcttggg tggaccatcc 480 gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga tctccctgag ccccatagtc 540 acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagatg tccagatcag ctggtttgtg 600 aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca caaacccata gagaggatta caacagtact 660 ctccgggtgg tcagtgccct ccccatccag caccaggact ggatgagtgg caaggagttc 720 aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca gcgcccatcg agagaaccat ctcaaaaccc 780 aaagggtcag taagagctcc acaggtatat gtcttgcctc caccagaaga agagatgact 840 aagaaacagg tcactctgac ctgcatggtc acagacttca tgcctgaaga catttacgtg 900 gagtggacca acaacgggaa aacagagcta aactacaaga acactgaacc agtcctggac 960 tctgatggtt cttacttcat gtacagcaag ctgagagtgg aaaagaagaa ctgggtggaa 1020 agaaatagct actcctgttc agtggtccac gagggtctgc acaatcacca cacgactaag 1080 agcttctccc ggactccggg taaatgag 1108 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer <400> 28 attgaagatc ttattcaatc tatgc 25 <210> 29 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer <400> 29 ggatccgaag tgttgatgaa catttggaca atatgtacaa aactctgcaa aaattc 56 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer <400> 30 gggatccgaa gtgttgatga acatttgga 29

Claims (38)

  1. 야생형 IL-15, 및 쥐 IgG2b Fc 단편을 제외한 IgG Fc 단편으로 이루어진 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, IgG Fc 단편이 사람 또는 쥐 IgG1, 사람 IgG2, 쥐 IgG2a, 사람 또는 쥐 IgG3 또는 사람 IgG4임을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 서열 번호 6의 DNA 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 포함하는 핵산.
  10. 제8항에 있어서, 서열 번호 7의 DNA 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 포함하는 핵산.
  11. 제8항에 있어서, 서열 번호 8의 DNA 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 포함하는 핵산.
  12. 제8항에 있어서, 서열 번호 9의 DNA 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 포함하는 핵산.
  13. 제8항에 있어서, 서열 번호 10의 DNA 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 포함하는 핵산.
  14. 제9항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 핵산에 의해 암호화되는 융합 단백질.
  15. 제8항 내지 제14항중 어느 한 항에 따른 핵산을 하나 이상 포함하는 벡터.
  16. 제8항 내지 제14항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산 및/또는 제15항에 따른 하나 이상의 벡터를 포함하는 세포.
  17. 제16항에 있어서, 세포가 줄기세포, 전구세포 및/또는 불멸세포임을 특징으로 하는 세포.
  18. 제17항에 있어서, 세포가 복수분화(pluripotent) 또는 다중분화(multipotent) 배아 줄기세포, 태아 줄기세포, 신생아 줄기세포 또는 성체 줄기세포임을 특징으로 하는 세포.
  19. 제16항 내지 제18항중 어느 한 항에 있어서, 세포주 형태의 세포.
  20. 제1항 내지 제7항 및 제14항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 융합 단백질, 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산, 제15항에 따른 하나 이상의 벡터 및/또는 제16항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포와 적합한 보조 물질 및/또는 첨가제를 포함하는 약제.
  21. 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 제1항 내지 제7항 및 제14항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 융합 단백질; 상기한 융합 단백질을 암호화하는, 특히 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산; 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는, 특히 제15항에 따른 하나 이상의 벡터; 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 벡터를 함유하는, 특히 제16항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는, 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관.
  22. 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 제1항 내지 제7항 및 제14항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 융합 단백질; 상기한 융합 단백질을 암호화하는, 특히 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산; 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는, 특히 제15항에 따른 하나 이상의 벡터; 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 벡터를 함유하는, 특히 제16항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는, 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물.
  23. IL-15 매개된 세포 현상을 억제하는 약제를 제조하기 위한, 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 제1항 내지 제7항 및 제14항중 어느 한 항에 따른 융합 단백질; 특히 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 핵산; 특히 제15항에 따른 벡터; 및/또는 특히 제16항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 세포; 또는 제21항에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 용도.
  24. IL-15와 이의 수용체의 상호작용을 억제하는 약제를 제조하기 위한, 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 제1항 내지 제7항 및 제14항중 어느 한 항에 따른 융합 단백질; 특히 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 핵산; 특히 제15항에 따른 벡터; 및/또는 특히 제16항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 세포; 또는 제21항에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 용도.
  25. IL-15 수용체를 발현하는 세포를 용해시키는 약제를 제조하기 위한, 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 제1항 내지 제7항 및 제14항중 어느 한 항에 따른 융합 단백질; 특히 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 핵산; 특히 제15항에 따른 벡터; 및/또는 특히 제16항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 세포의 용도.
  26. 이식 후유증 및/또는 자가면역 질환을 예방하고/하거나 치료하는 약제를 제조하기 위한, 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는, 특히 제1항 내지 제7항 및 제14항중 어느 한 항에 따른 융합 단백질; 특히 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 핵산; 특히 제15항에 따른 벡터; 및/또는 특히 제16항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 세포; 또는 제21항에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 용도.
  27. 사람 또는 포유동물에게 이식하기 위한, 제21항에 따른 사람 또는 포유동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 용도.
  28. 제27항에 있어서, 이식이 자가이식, 동종이식 또는 이종이식임을 특징으로 하는 용도.
  29. a) 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산 및/또는 제15항에 따른 하나 이상의 벡터를 세포내로 도입하는 단계, 및
    b) 적합한 조건하에 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제7항 및 제14항중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 제조방법.
  30. a) 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 하나 이상의 줄기세포, 전구세포 및/또는 불멸세포에, 먼저 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는 융합 단백질을 암호화하는, 특히 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는 하나 이상의 벡터를 도입하고, 두번째로 하나 이상의 적합한 분화 마커 유전자를 도입하는 단계,
    b) 단계 a)로부터의 세포를 분화시키는 단계,
    c) 단계 b)로부터의 분화된 세포를 선별하는 단계, 및
    d) 단계 c)로부터의 선별한 세포를 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관에 도입하는 단계를 포함하여, 제21항에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관을 제조하기 위한 시험관내 방법.
  31. 제30항에 있어서, 하나 이상의 적합한 형질감염 마커 유전자가 단계 a) 이후, 단계 a) 이전 또는 단계 a)와 동시에 도입되며, 단계 a)로부터의 형질감염된 세포가 바람직하게는 단계 a) 이후에 선별됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 세포가 복수분화 또는 다중분화 배아 줄기세포, 태아 줄기세포, 신생아 줄기세포 또는 성체 줄기세포임을 특징으로 하는 방법.
  33. a) 사람을 제외한 포유동물의 하나 이상의 난모세포, 줄기세포, 전구세포 및/또는 불멸세포에, 한편으로는 야생형 IL-15 및 Fc 단편을 함유하는 융합 단백질을 암호화하는, 특히 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산 및/또는 상기한 하나 이상의 핵산을 함유하는, 특히 제15항에 따른 하나 이상의 벡터를 도입하고, 다른 한편으로는 하나 이상의 적합한 형질감염 마커 유전자를 도입하는 단계,
    b) 단계 a)로부터의 형질감염 세포를 선별하는 단계,
    c) 단계 b)에 따라 선별된 세포를 사람을 제외한 포유동물의 하나 이상의 배반포에 도입하는 단계,
    d) 단계 c)로부터의 배반포를 사람을 제외한 포유동물 양모에게 도입하는 단계, 및
    e) 상기한 배반포로부터 발생된 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물을 확인하는 단계를 포함하여, 제22항에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물을 생산하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 세포가 복수분화 또는 다중분화 배아 줄기세포, 태아 줄기세포, 신생아 줄기세포 또는 성체 줄기세포임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 따른 방법을 사용하여 생산됨을 특징으로 하는, 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물.
  36. 제35항에 있어서, 포유동물의 자손임을 특징으로 하는, 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물.
  37. 동종이식 및/또는 이종이식용 세포, 기관특이적 조직 및/또는 포유동물 기관을 수득하기 위한, 제22항, 제35항 및 제36항중 어느 한 항에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유 동물의 용도.
  38. 약리학적 활성 화합물을 발견하고/하거나 독성 물질을 확인하기 위한, 제22항, 제35항 및 제36항중 어느 한 항에 따른 사람을 제외한 유전자전이된 포유동물, 또는 제21항에 따른 사람 또는 동물의 기관특이적 조직 및/또는 사람 또는 포유동물 기관의 용도.
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