ES2224713T3 - Supresion de rechazo de xenotransplantes. - Google Patents
Supresion de rechazo de xenotransplantes.Info
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Abstract
Un tejido biológico que comprende células endoteliales que se pueden inducir para generar un compuesto que regula por disminución la expresión de una molécula de adhesión celular por las células, siendo el compuesto bien (a) un polinucleótido complementario en secuencia a parte del gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión celular, (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de ribozima que se dirige específicamente a un gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión celular, o (c) un péptido con afinidad de unión específica para la molécula de adhesión celular.
Description
Supresión de rechazo de xenotransplantes.
La presente invención se refiere a la supresión
de rechazo de injertos, particularmente a la supresión de rechazo de
xenotransplantes.
El éxito de transplante de órganos alogénicos se
ha llegado a establecer bien en las últimas décadas. Sin embargo, el
suministro limitado de órganos de donantes significa que muchos
pacientes tienen poca o ninguna oportunidad de recibir un órgano
transplantado y de esta manera mueren antes de que se encuentre un
órgano. Una solución potencial a este problema es el
"xenotransplante", o el uso de órganos de donantes de animales
no humanos ("xenogénicos").
Los órganos de donantes porcinos son candidatos
adecuados particularmente para transplante debido a que los cerdos
son anatómicamente y fisiológicamente similares a los seres humanos,
son de suministro abundante y están relativamente exentos de
patógenos que son capaces de producir infecciones a seres humanos.
Además, la tecnología transgénica produce la posibilidad de
modificar genéticamente el tejido del donante para invalidar la
respuesta de rechazo.
Un problema asociado al xenotransplante es que
los órganos xenogénicos se rechazan rápidamente tras la
revascularización mediante un proceso humoral llamado rechazo
hiperagudo (abreviadamente en inglés HAR). Esto se debe a la
presencia de anticuerpos de origen natural en el receptor del
transplante, que reconoce y reacciona con antígenos en las células
endoteliales (abreviadamente en inglés EC) del xenotransplante. Este
reconocimiento desencadena la cascada complementaria que a su vez
conduce al rechazo.
En los últimos años, se han propuesto varios
planteamientos terapéuticos novedosos para suprimir el HAR y
ensayado con éxito (Bach, 1998). Éstos actúan bien mediante
supresión de la activación complementaria o evitando los anticuerpos
naturales xenorreactivos. El HAR ya no se considera más como un
problema insalvable para el transplante de cerdo a ser humano. Sin
embargo, es evidente que solo la prevención de HAR en improbable que
sea suficiente para evitar el rechazo de órganos xenogénicos.
Incluso si se vence el HAR, el rechazo enérgico
del injerto se produce dentro de 2 - 3 días, mucho más rápido que la
mayoría de las formas de transplante alogénico, un proceso
denominado rechazo tardío al xenotransplante retardado
(abreviadamente en inglés DXR). La histología de este tipo de
rechazo es diferente del HAR con menos hemorragia aunque con
trombosis intravascular significativa. Además, existe deposición de
anticuerpos xenorreactivos sobre el endotelio junto con fibrina,
agregados de plaquetas e infiltración del tejido perivascular con
células inflamatorias (neutrófilos, macrófagos y células NK)
(Blakely y col., 1994).
Además de DXR existe el problema del rechazo
mediado por linfocitos T. Se ha mostrado (Dorling y col., 1994) que
la respuesta de las células T a los xenotransplantes porcinos es al
menos equivalente a la respuesta contra el transplante alogénico,
pero es probable que sea más agresivo y puede ser difícil controlar
con dosis habituales de fármacos inmunosupresores sistémicos.
Las células endoteliales (abreviadamente en
inglés EC) se cree que orquestan el reclutamiento de células
inflamatorias en el DXR y el posterior rechazo celular en numerosas
formas: (i) produciendo mediadores (tales como la interleucina - 8
(abreviadamente IL - 8) y el factor activador de plaquetas
(abreviadamente en inglés PAF) que activan la función de
leucocitos, incluyendo la adhesión; (ii) mediante la actuación de
células que presentan antígenos, que estimulan la respuesta inmune
contra el tejido extraño, y (iii) mediante la regulación de la
expresión espacial y temporal de las moléculas de adhesión celular
para facilitar la transmigración de leucocitos en el interior del
órgano transplantado (Bevilacqua), 1993). Las citocinas, liberadas
de los leucocitos reclutados, incrementan drásticamente la expresión
de las moléculas de adhesión sobre la superficie de las EC y
potencian el procedimiento de reclutamiento.
La primera estructura que pone en contacto los
leucocitos circulantes cuando la sangre reperfunde un injerto
vascularizado es el endotelio. Los leucocitos se deben adherir y
cruzar la barrera endotelial para infiltrar el injerto. Los
recientes avances en la comprensión de los mecanismos de las
interacciones leucocitos - EC han revelado una serie de casos de
adhesión y de activación (la cascada de adhesión) que tiene lugar
durante la emigración de leucocitos en los tejidos (Springer, 1994).
(Véase la figura 1).
La rodadura inicial sobre el endotelio vascular
está mediada por interacciones transitorias entre selectinas (por
ejemplo, la selectina L sobre los leucocitos, la selectina S sobre
las EC activadas y la selectina P sobre tanto las EC activadas como
las plaquetas activadas) y estructuras opuestas que llevan
carbohidratos sobre la célula opuesta (EC, leucocito o plaqueta)
(Tedder y col, 1995). Sin embargo debido a la alta relación
conexión/desconexión de estas interacciones selectinas -
carbohidratos, esta clase de receptores no pueden soportar la
adhesión firme de leucocitos. Mientras la rodadura, los leucocitos
se llegan a exponer a señales de activación que dan como resultado
un incremento de avidez de las integrinas de superficie de
leucocitos. Las quimiocinas se cree que son los candidatos probables
para este caso de desencadenamiento: la IL - 8 se ha mostrado que
existe anclada a la superficie de las EC mediante proteoglicanos de
superficie (Tanaka y col., 1993) que dan como resultado
concentraciones locales altas dentro del medio del leucocito
rodante. Esta adhesión secundaria mediada por integrinas da como
resultado una detección estable del leucocito y sigue la
transmigración en los tejidos (Springer, 1994).
Los miembros de la familia de supergenes de las
inmunoglobulinas (abreviadamente en inglés IgSF) expresados sobre el
endotelio son contra - receptores para las integrinas de los
leucocitos. Éstos incluyen la molécula de adhesión celular vascular
(abreviadamente en inglés VCAM - 1), moléculas de adhesión
intracelular (abreviadamente en inglés ICAM - 1, ICAM - 2), y
adresinas vasculares mucosales (MadCAM - 1). Los contra ligandos
para la VCAM - 1 son integrinas heterodiméricas \alpha4 con un
enlace no covalente bien a la cadena \beta o a \beta7. La
integrina \alpha4\beta1 (antígeno - 4 muy tardío [VLA - 4] se
expresa constitutivamente sobre la mayoría de los leucocitos
mononucleares que incluyen eosinófilos, linfocitos, monocitos,
basófilos pero está ausente sobre los neutrófilos. En contraste, la
integrina \alpha4\beta1 se encuentran principalmente en un
subconjunto de células T con un tropismo para el tracto intestinal y
su ligando primario es la adresina vascular mucosal (MadCAM - 1),
aunque también se une a VCAM - 1 (18). Los receptores de los
leucocitos para las ICAM son las integrinas \beta2' antígeno
asociado a la función de los linfocitos' (abreviadamente en inglés
LFA - 1) y la integrina \alphaM\beta1 (Mac - 1). Los neutrófilos
y las células hematopoyéticas (excepto los eritrocitos) expresan el
LFA - 1, mientras que la expresión de Mac - 1 está más restringida a
los monocitos, macrófagos y granulocitos.
El endotelio vascular quiescente expresa una
disposición de moléculas que no debe ser suficiente para promover
unión significativa a los leucocitos y posterior transmigración. Sin
embargo está bien establecido que la isquemia de los órganos
peritransplantados da como resultado la activación endotelial con un
incremento de expresión de las moléculas de adhesión.
La interacción de la VACM - 1 sobre las EC con su
ligando, la integrina \alpha4\beta1 del VLA - 4, sobre el
leucocito se ha mostrado recientemente que es el mecanismo
predominante que desencadena la detención de monocitos rodantes y
linfocitos, y posterior difusión (Jones y col., 1994; Alon y col.,
1995). La transmigración a través de las conexiones estrechas
endoteliales implica a la molécula de adhesión de células
endoteliales (abreviadamente en inglés PECAM, CD31), proteína
asociada a las integrinas (abreviadamente en inglés IAP, CD47) e
integrina \alpha4\beta1 (Muller, 1995; Brown, 1996).
Parece que la interferencia con los
procedimientos de reconocimiento mediados mediante estas moléculas
de adhesión (en particular ICAM - 1, LFA - 1, VCAM - 1 y CD2) pueden
prolongar significativamente la supervivencia del injerto
alogrénico. Además en algunos modelos, no solamente bloquearon las
moléculas de adhesión induciendo los anticuerpos monoclonales la
supervivencia indefinida del injerto, pero también la tolerancia
específica del donante (Isobe y col, 1992).
Las EC porcinas tienen la capacidad de mediar
tanto la adhesión inicial como la migración y activación de los
leucocitos humanos de infiltración. Las interacciones funcionales
entre LFA - 1 humanos e ICAM de cerdo, y el VLA - 4 humano y la VCAM
de cerdo se han documentado. Además la interacción de los monocitos
humanos con endotelio porcino también da como resultado la
activación de las EC (Millan y col, 1997). Esto es probablemente
para promover la circulación de linfocitos y monocitos humanos en el
xenotransplante porcino y desencadenan el rechazo.
Se ha demostrado que los anticuerpos contra las
moléculas de adhesión porcinas pueden inhibir el proceso de
infiltración (Dorling y col., 1996; Mueller y col., 1995). Para
inhibir la interacción de la VCAM - 1 y el VLA - 4, se han
administrado los anticuerpos monoclonales contra cualquiera de estas
moléculas. Una proteína de fusión de la VCAM - Ig, los antagonistas
de péptidos cíclicos que imitan el bucle de unión a la integrina
\alpha4 en el dominio 1 de la VCAM - 1, y también se han usado
ciertos ciclopeptólidos (revisión en el documento de Foster,
1996).
Podría ser posible dirigir la VCAM - 1 porcina
específicamente con los anticuerpos monoclonales, pero se cree que
la administración repetida de estos anticuerpos daría como resultado
la sensibilización del receptor y un declive en la eficacia del
bloqueo. La administración sistémica de los agentes tales como la
proteína de fusión VCAM - Ig, los antagonistas de péptidos cíclicos
ciclopeptólidos fúngicos de origen natural mencionados anteriormente
darían como resultado un bloqueo no solamente de la interacción
pVCAM - VLA - 4 en el injerto sino también en otros tejidos del
receptor y puede perjudicar la capacidad del receptor para combatir
las infecciones.
Así pues existe una gran necesidad de un
procedimiento para combatir la fase celular del proceso de rechazo
que se produce a partir del xenotransplante, sin comprometer el
sistema inmune del receptor del tejido injertado.
Según la presente invención se proporciona un
tejido biológico que comprende células endoteliales que se pueden
inducir para generar un compuesto que regula por disminución la
expresión de una molécula de adhesión celular por las células.
El tejido biológico puede ser cualquier tejido
adecuado para transplante a un mamífero, e incluye colecciones de
células, y tejidos y órganos individuales. De acuerdo con lo
anterior, esta definición incluye, fibroblastos, tejido neural,
tejido fetal y corazón, hígado, pulmón, páncreas, islotes de
Langherans, piel, intestino delgado, córnea, cartílago, hueso,
músculo, o tejidos u órganos renales.
El tejido se puede derivar de cualquier animal no
humano que está suficientemente y estrechamente relacionado con el
ser humano y permite la conservación de la función que se ha
conservado. Tales animales incluyen ovejas, cerdos, ratites
(avestruz, emu), capibara y primates. El animal de elección es el
cerdo, debido a que sus órganos tienen fisiología y tamaño similar a
los órganos humanos. Además, los cerdos se pueden criar en grandes
cantidades y están relativamente exentos de patógenos capaces de
producir infecciones en seres humanos.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "expresión" se puede referir a la expresión de un
péptido o polipéptido a partir de un gen y/o la expresión de un
péptido o proteína sobre la superficie de una célula, según el
contexto lo requiera. Por "regulados por disminución" se
entiende que el compuesto actúa para disminuir el nivel de expresión
de la proteína de adhesión celular. La regulación por disminución
puede ser a nivel de transcripción, puede ser afectando la
traducción o puede actuar mediante algún otro mecanismo, por
ejemplo, efectuando cambios en la estabilidad del mRNA.
La molécula de adhesión celular que se va a
regular por disminución puede ser cualquier proteína que se expresa
sobre la superficie de una célula endotelial y que es capaz de la
interacción con un leucocito o plaqueta, tal como VCAM - 1, ICAM -
1, LFA - 1, CD2, PECAM, CD31, IAP, CD47, integrina
\alpha\nu\beta3, MadCAM, PECAM, selectinas (selectina P-, L-,
y E-), LFE - 3, CD80/CD86 o trombospondina. La VCAM - 1 es la
molécula de adhesión celular de elección debido a la interacción de
la VCAM - 1 sobre las EC con su ligando, y la integrina
\alpha4\beta1 del VLA - 4 sobre los leucocitos se ha mostrado
que es el mecanismo predominante que desencadena la detención de los
monocitos rodantes y linfocitos, y su posterior difusión.
Una característica de la presente invención es
que el compuesto que previene la expresión de la molécula de
adhesión celular se puede generar por inducción. Se ha encontrado
que la interrupción dirigida de la molécula de adhesión VCAM - 1 en
ratones es casi universalmente fatal para el desarrollo del embrión
debido a un fallo de placentación eficaz, que produce fusión
corioalantoica ausente o tardía y da como resultado la muerte del
embrión a entre 8 y 12 días en el útero (Gurtner y col., 1995).
La estrategia ideal para la inducción es la
eliminación genética condicional de la molécula de adhesión celular,
que permite la expresión normal durante el desarrollo y en el adulto
joven, pero con la capacidad de inhibir la expresión de la molécula
de adhesión celular en el órgano donante inmediatamente antes, y/o
después del transplante. Los procedimientos adecuados de inducción
serán evidentes para los expertos en la técnica, tales como la
clonación del compuesto inhibidor por disminución de un elemento de
respuesta adecuado, elemento potenciador o elemento promotor. Por
ejemplo, varios sistemas conocidos permiten la transcripción de un
gen a controlar en las células de mamíferos que usan moléculas
pequeñas, incluyendo el sistema Tet - On ™ (Clontech, Reino Unido),
el sistema promotor de metaloproteínas (Palmiter y col., 1983), el
sistema de expresión de mamíferos inducible por ecdisona
(Invitrogen, BV), promotores inducibles por esteroides (Clackson y
col., 1997) y promotores inducibles por citocinas (Aranciba y col.,
1998; Bachiller y col., 1990). El sistema particular elegido se
determinará mediante el grado requerido de supresión.
El compuesto que regula por disminución la
expresión de la molécula de adhesión celular puede ser un
polinucleótido. Según un segundo aspecto de la invención se
proporciona un tejido biológico en el que las células endoteliales
del tejido se pueden inducir para generar un polinucleótido que
regula por disminución la expresión de una molécula de adhesión
celular por las células.
El polinucleótido puede ser complementario en
secuencia a parte del gen o mRNA que codifica la molécula de
adhesión celular, de manera que se hibrida al gen o al mRNA y así
previene su transcripción o traducción. De manera ideal, tal
polinucleótido debe ser de al menos 15 nucleótidos de longitud,
preferiblemente al menos 50 nucleótidos, más preferiblemente mayor
que 100 nucleótidos. Para asegurar que solamente el gen de adhesión
celular está dirigido, el polinucleótido debe ser complementario a
una porción del gen que es el más divergente de otras secuencias de
ácidos nucleicos. El polinucleótido se debe preferiblemente hibridar
al gen o al mRNA que codifica la molécula de adhesión celular en
condiciones de alta restricción, por ejemplo, 0,1 x SSC, 65ºC,
(donde SSC = NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2).
Según este aspecto de la invención, las
secuencias de polinucleótidos actuarán para revocar la transcripción
de un gen que codifica una molécula de adhesión celular o traducción
de un mRNA de adhesión celular mediante la hibridación con la
molécula, por lo tanto previniendo que tenga lugar la interacción
del ácido nucleico con los factores proteicos relevantes necesarios
para la transcripción o traducción.
Como alternativa, las secuencias de
polinucleótidos pueden comprender una secuencia de ribozimas que
dirige específicamente un gen o mRNA que codifica una molécula de
adhesión celular.
Según un tercer aspecto de la invención se
proporciona un tejido biológico en el que las células endoteliales
del tejido de pueden inducir para generar u péptido o polipéptido
que regula por disminución la expresión de una molécula de adhesión
celular por las células.
El péptido o polipéptido puede poseer alta
afinidad para la molécula de adhesión celular. Preferiblemente, la
afinidad del compuestos para la molécula de adhesión celular es
mayor que 10^{-8}M, más preferiblemente mayor que 10^{-9}M,
incluso más preferiblemente mayor que 10^{-10}M. El compuesto
también debe exhibir afinidad de unión específica para la molécula
de adhesión celular con el fin de asegurar que la actividad de unión
del compuesto no sea responsable de la destrucción inapropiada de
otras moléculas en la célula.
Preferiblemente, el compuesto es un anticuerpo o
fragmento de anticuerpos, que se puede preparar fácilmente con
especificidad y afinidad alta para una diana deseada. Los fragmentos
de anticuerpos tales como los fragmentos Fab o fragmentos de cadenas
individuales (sFvS) son particularmente adecuadas ya que son
moléculas pequeñas con un alta solubilidad y mayor que la capacidad
penetrante en un medio intracelular. Los anticuerpos sFv
intracelulares se han empleado con éxito in vitro para
neutralizar virus (VIH - 1 (Rondon y col., 1997) y flavivirus (Jiang
y col., 1995)), y para reducir la expresión de oncoproteínas
intracelulares (por ejemplo, erbB - 2 (Beerli y col.,)1994; Graus
Porta y col., 1995) y ras (Bioca y col., 1993)) y los receptores de
la superficie celular (por ejemplo, IL . 2R (Richardson y col.,
1997)). Estas especies de los sFv se generaron a partir de
hibridomas de anticuerpos monoclonales para la proteína diana.
El polipéptido puede ser una proteína de fusión
que comprende un dominio de unión que muestra afinidad para una
molécula de adhesión celular y un dominio efector que dirige una
molécula de adhesión celular o que dirige un gen o mRNA que codifica
la molécula de adhesión celular. Por ejemplo, el dominio efector se
puede distribuir (por medio del dominio de unión) al medio de la
molécula de adhesión celular, de manera que la molécula de adhesión
celular se dirige a la destrucción. Si es proteináceo, el dominio
efector puede comprender una proteasa, una quinasa, una fosfatasa o
cualquier otra enzima que sea capaz de inactivar una molécula de
adhesión celular. Como alternativa, el dominio efector puede
comprender un oligonucleótido o molécula de ribozima que actúa sobre
el gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión celular.
Según un cuarto aspecto de la invención se
proporciona un tejido biológico en el que las células endoteliales
del tejido se pueden inducir para generar una proteína de fusión
biespecífica que regula por disminución la expresión de una o más
moléculas de adhesión celular mediante las células. Tal proteína de
fusión puede comprender dominios o péptidos con afinidades para
epítopos diferentes de proteínas de adhesión celular. Por ejemplo,
una proteína de fusión se puede diseñar con afinidad de unión y
especificidad contra dos o más epítopos diferentes sobre una
molécula de adhesión celular tal como la VCAM. Esto mejoraría la
eficacia de eliminación genética de la molécula de adhesión celular.
Además, se pueden dirigir numerosos epítopos sobre diferentes
moléculas de adhesión celular, con el fin de derogar simultáneamente
su expresión.
Con el fin de que la molécula de adhesión celular
no se transporte a la superficie celular para la expresión, la
secuencia de aminoácidos del péptido o polipéptido debe incluir una
secuencia directora para dirigir la degradación de la molécula de
adhesión celular.
La secuencia directora puede comprender cualquier
señal que hace circular la proteína intracelular, con tal que la
señal esté implicada en la dirección del complejo de enlace a un
compartimiento celular para degradación. Los ejemplos de señales de
circulación de proteínas intracelulares adecuadas se describen en el
documento de Pudsley, 1989 y de Magee y Wileman, 1992.
Preferiblemente, la señal comprende una señal de
localización que dirige un péptido naciente al retículo endoplásmico
(abreviadamente en inglés ER). Una señal adecuada particularmente es
la inclusión de la secuencia de aminoácidos Lys - Asp - Glu - Leu
(KDEL) en el extremo C del péptido o polipéptido. Las proteínas que
residen en el lumen del retículo endoplásmico (ER), el primer
compartimiento para las proteínas unidas a membranas recientemente
preparadas o proteínas secretadas, se sabe que poseen esta corta
secuencia (Mururo y Pelham, 1987). Si esta secuencia se suprime o se
extiende mediante la adición de aminoácidos adicionales, la proteína
se secreta desde la célula en lugar de conservarse.
Las regiones de señales alternativas serán
evidentes para los expertos en la técnica e incluyen secuencias de
dirección liposomales. Las proteínas sede fusión también se pueden
construir, comprendiendo un péptido o polipéptido condensado a una
proteína viral tal como la nef del VIH - 1, o a señales
citoplásmicas para un rápido recambio tales como los que se
encuentran en CTLA - 4 (véase Magee y Wileman, (1992) Protein
targeting: a practical approach; Oxford University Press).
Según un quinto aspecto de la invención se
proporciona un polipéptido que comprende una región de unión capaz
de unirse a una molécula de adhesión celular y una región de
señalización para la dirección subcelular del polinucleótido.
Preferiblemente, el polipéptido comprende un anticuerpo o fragmento
de anticuerpos, más preferiblemente un fragmento de anticuerpos de
cadena individual (sFv). La región de señalización elegida es una
señal de localización para el retículo endoplásmico. Más
preferiblemente la región de señalización comprende la secuencia de
aminoácidos KDEL en el extremo C del polipéptido.
Según un sexto aspecto de la invención se
proporciona un polinucleótido que codifica un péptido o polipéptido
según el aspecto quinto de la invención. Preferiblemente, el
polinucleótido comprenderá secuencias adecuadas para la regulación
de la expresión del péptido o polipéptido. Preferiblemente esta
expresión puede controlarse, tal como mediante control específico
celular, control inducible, o control temporal. Preferiblemente, la
expresión debe ser específica para células musculares lisas
vasculares, fibroblastos, miocitos cardíacos, las EC o cualquier
combinación de estos tipos de células. Más preferiblemente, la
expresión debe ser específica para las EC; la expresión específica
de las EC se puede lograr usando promotores específicos de tejidos
tales como la selectina E, ICAM, y MadCAM.
Según un séptimo aspecto de la invención, se
proporciona un vector que comprende un polinucleótido según el
aspecto sexto la invención.
El término "vector" significa un resto que
es capaz de transferir un polinucleótido a una célula hospedadora.
Preferiblemente el vector es un vector de DNA y, más
preferiblemente, es capaz de expresar RNA que codifica una proteína
según la invención. Numerosos vectores adecuados se documentan en la
técnica; los ejemplos se pueden encontrar en Molecular cloning: a
Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook y col., 1989, Cold
Spring Harbor Laboratory Press o DNA cloning; a practical
approach, Volumen II: Expression systems, editado por D. M.
Glover (IRL Press, 1995).
Muchas técnicas y protocolos conocidos para la
manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de
construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación,
introducción de DNA en las células y expresión génica, y análisis de
proteínas, se describen en detalle en Short Protocols in
Molecular Biology, edición segunda, Ausubel y col., eds., (John
Wiley & Sons, 1992) o Protein Engineering: A practical
approach (editado por A. R. Rees y col., IRL Press 1993). Por
ejemplo, en las células eucarióticas, los vectores de elección
pueden ser a base de virus.
Para cierta realizaciones de la invención, se
puede usar un vector de expresión bicistrónico con el fin de
permitir la coexpresión estequiométrica de dos genes a partir de un
mRNA. En un sistema particular (Jackson y col., 1990), la expresión
se dirige desde un promotor de señal y la incorporación del sitio
interno de entrada al ribosomas (abreviadamente en inglés IRES) del
virus de encefalomiocarditis (abreviadamente en inglés ECMV) permite
la unión ribosomal independiente de CAP y la traducción de la
segunda fase abierta de lectura. Esto permite la transfección de una
construcción que contiene secuencias dirigidas contra dos epítopos
diferentes sobre una molécula de adhesión celular para mejorar la
eficacia de eliminación genética, o permite la dirección de dos o
más moléculas de adhesión celular diferentes usando solamente una
construcción.
A la introducción del ácido nucleico puede seguir
la producción o permisión de la expresión a partir del ácido
nucleico, por ejemplo cultivando las células hospedadoras en
condiciones que permiten la expresión del gen.
En una realización, el ácido nucleico de la
invención se integra en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la
célula hospedadora. La integración se puede promover mediante la
inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el
genoma, de acuerdo con técnicas habituales.
Preferiblemente el vector es adecuado para la
producción de un animal transgénico. Los vectores adecuados para la
generación de cerdos transgénicos, por ejemplo, como se describe en
el documento de Heckl - Östreicher (1995), MaCurry (1996), White
(1995), Yannoutsos (1995), y Langford (1996). Los vectores de
minigenes adecuados para la generación de ratones transgénicos se
describen en el documento de Diamond (1995).
Según un octavo aspecto de la invención, se
proporciona un sistema de distribución que comprende una molécula de
los aspectos quinto, sexto o séptimo y significa que distribuye
dicha molécula a la célula diana.
El sistema de distribución puede viral o no
viral. Los sistemas no virales, tales como liposomas, evitan algunas
de las dificultades asociadas a los sistemas a base de virus, tales
como el gasto de producción escalada, persistencia pobre de
expresión, y concierne a la seguridad. Preferiblemente el sistema de
distribución es adecuado para uso en terapia génica. Se conocen en
la técnica numerosos sistemas de distribución apropiados tales como,
por ejemplo, DNA condensado policatiónico unido o no unido a adeno
virus destruídos solos (véase Curiel, 1992) y DNA unido a ligandos
(véase WU, 1989). También se puede emplear DNA desnudo,
opcionalmente usando perlas de látex biodegradable para incrementar
la captación. Los liposomas pueden también actuar como vehículos de
distribución génica encapsulando ácidos nucleicos que comprenden un
gen clonado bajo el control de una diversidad de promotores
específicos de tejidos o activos de manera ubicua. También se pueden
usar sistemas de distribución mecánica tales como el planteamiento
descrito en el documento de Woffendin y col., (1994).
La distribución directa de composiciones de
terapia génica generalmente se llevará a cabo, en bien un régimen de
dosis múltiples o de dosis individual, mediante la inyección, bien
subcutáneamente, por vía intraperitoneal, intravenosa o
intramuscular o distribuido al espacio intersticial de un tejido.
Otras formas de administración incluyen administración oral y
pulmonar, usando supositorios, y aplicaciones transdérmicas, agujas
y pistolas génicas o hipopulverizaciones.
Preferiblemente, el sistema de distribución se
dirigirá de manera que las moléculas según la presente invención son
recogidas por las células adecuadas para transplante, o las células
que se han transplantado. Más preferiblemente el sistema de
distribución será específico para estas células. Por ejemplo, el
sistema de distribución se puede dirigir a un órgano específico, tal
como el corazón o el riñón, o a un tipo de células específico, tal
como las células endoteliales.
Para lograr esto el sistema de distribución
puede, por ejemplo, ser un sistema de distribución mediado por
receptores, que se dirige a receptores encontrados en las células
diana. Por ejemplo, el sistema de distribución se debe dirigir a los
receptores encontrados en las células cardiacas, preferiblemente a
receptores encontrados exclusivamente en las células cardiacas, o se
puede dirigir a receptores encontrados en las células endoteliales,
preferiblemente a receptores encontrados exclusivamente en las
células endoteliales tales como la selectina E o la selectina P.
El sistema de distribución es preferiblemente
adecuado para la generación de animales transgénicos. Por ejemplo,
el sistema de distribución se puede dirigir a un gameto, un cigoto,
o una célula tronco embrionaria.
Según un noveno aspecto de la invención, se
proporciona un procedimiento de transfección de una célula con un
vector según la invención. La célula para la transfección debe ser
un progenitor de la especie que va a ser el donante de órganos,
preferiblemente una célula endotelial. La transfección estable de
células endoteliales porcinas se describe en el documento de Heckl -
Östreicher (1995).
Preferiblemente, la célula es adecuada para la
generación de un animal transgénico. Más preferiblemente, la célula
es un gameto, un cigoto, o una célula tronco embrionaria. Por
ejemplo, la transfección de óvulos de murinos mediante
microinyección para generar ratones transgénicos, se describe en el
documento de Diamond (1995), y por ejemplo, la microinyección de
cigotos porcinos, para generar cerdos transgénicos se describe en el
documento de Yannoutsos (1995), Langford (1996), Y White (1995).
Según un décimo aspecto de la invención, se
proporciona una célula transfectada según el noveno aspecto.
Según un undécimo aspecto de la invención, se
proporciona un tejido biológico que comprende una célula según el
décimo aspecto de la invención. El término "tejido biológico"
como se usa en esta memoria descriptiva incluye colecciones de
células, tejidos y órganos. De acuerdo con lo anterior la definición
incluye, por ejemplo, fibroblastos, tejido nervioso, corazón,
hígado, o tejidos u órganos de riñón.
Según un duodécimo aspecto de la invención, se
proporciona un animal que comprende un tejido celular y/o biológico
según la invención. Preferiblemente el animal es adecuado para la
producción de órganos para transplante en seres humanos.
Preferiblemente el animal es un mamífero, y más preferiblemente es
un cerdo transgénico u oveja transgénica.
El animal se debe ser tratar mientras vive de
manera que comprenda tejido biológico transgénico (es decir, tratado
mediante terapia génica). Preferiblemente, un animal vivo se
transfecta con un vector que se distribuye específicamente a las
células endoteliales para producir órganos transgénicos adecuados
para xenotransplante.
Como alternativa, el animal debe nacer como un
animal transgénico. Se conocen en la técnica diversos planteamientos
adecuados para generar tales animales transgénicos (por ejemplo,
Bradley y Liu, 1996; Clarke. 1996; Wheeler, 1994). Por ejemplo, se
conoce bien la manipulación directa del cigoto o embrión temprano,
por ejemplo mediante microinyección de DNA, como es la manipulación
in vitro de células pluripotentes tales como células madre
embrionarias. La infección retroviral de embriones tempranos ha
probado ser exitosa en una serie de especies, y se ha descrito la
infección adenoviral de los huevos libres de zonas. También se ha
descrito la transgénesis y clonación de ovejas mediante
transferencia nuclear (por ejemplo, el documento WO 97/07668).
Según un decimotercero aspecto de la invención,
se proporciona un procedimiento de obtención de un tejido biológico
adecuado para transplante, que comprende la expresión de uno o más
compuestos según la presente invención en el tejido biológico,
preferiblemente y exclusivamente en sus células endoteliales. El
tejido biológico también se puede obtener bien in vivo o
ex vivo. Por ejemplo, un órgano animal se puede estar
transfectar in vivo con un vector según la invención, o un
órgano se puede transfectar ex vivo antes del transplante o
in vivo después del transplante.
Según un decimocuarto aspecto de la invención, se
proporciona un procedimiento de transplante que comprende el
transplante de tejido biológico según la invención a partir de un
donante animal en un animal receptor. Preferiblemente el
procedimiento es para xenotransplante y el tejido donante biológico
es xenogénico con respecto al animal receptor.
Ahora la invención se describirá en detalle con
referencia específica a fragmentos de anticuerpos de cadena única
frente a la molécula de la VCAM - 1. Se apreciará que se puede
realizar la modificación de detalles sin salirse el alcance de la
invención.
Figura 1: cascada de adhesión de leucocitos -
células endoteliales
Figura 2: citometría de flujo con anticuerpos de
fagos que demuestran especificidad para VCAM
Figura 3: toma de impresiones digitales de las
enzimas de restricción de los clones de sFv
Figura 4: vector de expresión para sFv
Figura 5: cotransfección de sFv/ER con
pEF/GFP/ER
Figura 6a: expresión de VCAM sobre trasfectantes
de EC estables con el clon F5 de sFv
Figura 6b: expresión de VCAM sobre trasfectantes
de EC estables con el clon E6.2 de sFv
Figura 7a: expresión de VCAM sobre trasfectantes
de EC estables con el clon F5 de sFv
Figura 7b: expresión de VCAM sobre trasfectantes
de EC estables con el clon E6.2 de sFv
Figura 8: tinción de VCAM sobre células
endoteliales no transfectadas y transfectadas
Figura 9: unión de células Jurkat a densidades
variables de células endoteliales
Se usó una genoteca de anticuerpos de exposición
de fagos para generar un sFv específico para la VCAM - 1.
La genoteca usada contiene > 10^{8} clones
generados usando un banco de 50 segmentos de genes VH humanos
clonados con una secuencia de nucleótidos aleatorios que codifica
longitudes de CDR3 de 4 - 12 residuos (Richardson y col., 1993).
Esta genoteca ya se ha usado para aislar anticuerpos de cadena única
específicos para una diversidad de antígenos que incluye haptenos,
antígenos extraños y propios. Sin embargo la selección ha dependido
de la disponibilidad de antígeno purificado o recombinante. Los
autores desarrollaron una estrategia de selección novedosa pata
superar la carencia de VCAM porcina recombinante.
cDNA para VCAM porcino se utilizó para generar
líneas celulares estables que muestran altos niveles de expresión de
VCAM porcina de superficie como se determinó mediante citometría de
flujo. Las células VCAM positivas se incubaron con CMFDA verde
CellTracker™ 3 \muM (diacetato de 5- clorometilfluoresceína,
(Molecular Probes, Oregón) durante 1 hora a 37ºC. Una vez que esta
sonda permeable a la membrana entra en la célula la hidrólisis con
esterasa convierte el CMFDA no fluorescente en
5-clorometilfluoresceína fluorescente que reacciona
con tioles o proteínas para formar conjugados fijables de aldehídos.
Las células marcadas con esto son viables y fluorescentes durante
varias divisiones celulares.
Una suspensión de células negativas de VCAM se
incubó con la genoteca de fagos en Marvel al 4%/PBS a 4ºC con
agitación suave. Después de 30 minutos, después las células VCAM
positivas se añadieron en una relación 1:10 (VCAM positiva:negativa)
y se incubaron durante 90 minutos adicionales. La células se
sedimentaron mediante centrifugación y se lavaron con PBS tres
veces. Las células VCAM positivas fluorescentes (y el fago que se
unió a la superficie celular) se separaron después mediante FACS.
Los fagos se "rescataron" de la manera habitual (Griffiths y
col, 1994), se amplificaron y la genoteca se sometió a tres rondas
adicionales de selección. ELISA de fagos "policlonales"
confirmó que la genoteca se enriqueció para el fago específico de
VCAM. Después los clones individuales se ensayaron mediante
citometría de flujo para unión a la línea celular VCAM positiva y
los resultados de los clones representativos se muestran en la
figura 2.
La secuencia para los clones específicos de VCAM
se amplificó a partir de minipreparaciones del vector fagémido
mediante PCR y se digirieron durante 18 horas con bien BstN1
o BsaJi según el protocolo del fabricante. El mapeo del
polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (abreviadamente
en inglés RFLP) de los 15 primeros clones específicos de VCAM mostró
que había al menos 5 distintos patrones de digestión sugiriendo al
menos 5 secuencias de anticuerpos diferentes. (Figura 3). Dos de
éstos se usaron para análisis posterior.
La estrategia de los autores fue modificar
genéticamente el cFv específico de VCAM a conservar dentro del ER,
de manera que prevea que la interacción sFv - VACM sea de suficiente
afinidad, ambas moléculas se conservarían dentro del ER y se
degradarían, por lo tanto se reducirían los niveles de VCAM de la
superficie celular. Inicialmente, el sFv se ha expresado usando un
promotor constitutivamente activo, el promotor de la subunidad
1\alpha (EF - 1\alpha) del factor de elongación humano.
El sFv se amplificó a partir del vector fagemido
mediante PCR (30 ciclos, fijación por calor a temperatura de 55ºC,
Mg^{24} 1,5 \muM) usando los cebadores:
(5')CAGTCTATGCGGCCCCATTCA(3'); Y
(5')TCCACAGGCGCGCACTCCCAGCCGGGCATGGCCCAGGT(3').
El fragmento resultante se subclonó en los sitios
BssHII/Not1 en pEF/myc/ER (Invitrogen, BV). El
sFv se dirigió al ER mediante la incorporación de la secuencia de un
péptido señal a partir de una cadena VH de ratón en el extremo 5'
del gen sFv; este péptido se escinde tras la translocación en el ER.
El sFv se conserva debido a que la secuencia peptídica de KDEL en el
extremo c. La construcción se muestra en forma de diagrama en la
figura 4.
El análisis funcional de las construcciones se
llevó a cabo mediante la transfección en una línea célula A9
endotelial porcina inmortalizada. Éstas se generaron mediante
microinyección de DNA de pZipSVU19 en células endoteliales aórticas
primarias (Dorling y col, 1996). Las células inmortalizadas coservan
las características de las células endoteliales pero diferentes a
las EC, demostraron expresión constitutiva de VCAM. El tratamiento
con citocinas de las células incrementó la expresión de VCAM
marginalmente (incremento de RMFI desde 38,2 a 66,3 en 72
horas).
La trasfección de DNA se llevó a cabo con la
formulación de liposomas LipofectMAINE (Life Technologies) usando
una modificación del protocolo de los fabricantes. El reactivo de
LipofectAMINE es una formulación 3:1 del lípido policatiónico
trifluoroacetato de
2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxilamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio
(abreviadamente en inglés DOSPA) y el lípido neutro
dioleoilfosfatidiletanolamina (abreviadamente en inglés DOPE) en
agua.
1 x 10^{5} células se sembraron en cada uno de
los pocillos de una placa de 6 pocillos en medio completo (DMEM) y
se dejó unir durante una noche a 37ºC, en un incubador con CO_{2}
al 5% durante una noche. El día siguiente las células se lavaron dos
veces en Opti - MEM® I exento de suero precalentado (Gibco BRL). Se
añadieron 2 ml de Opti
- MEM® I exento de suero a cada uno de los pocillos y las células se devolvieron al incubador de CO_{2} a 37ºC durante 2 - 3 horas.
- MEM® I exento de suero a cada uno de los pocillos y las células se devolvieron al incubador de CO_{2} a 37ºC durante 2 - 3 horas.
El DNA a transfectar (1 - 2 \mug por
transfección) se diluyó hasta un volumen final de 100 \mul por
transfección en Opti - MEM® I, exento de suero. A un tubo separado,
para cada transfección, se añadieron 5 \mul de LipofectAMINE y 15
\mug de transferrina bobina (Sigma; solución madre preparada hasta
1 \mug/ml en Opti - MEM® I exento de suero) a un volumen final de
100 \mul en Opti - MEM® I exento de suero. El DNA y la mezcla de
LipofectAMINE - transferrina se combinaron y se dejaron en reposo a
temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir la formación
del complejo DNA - liposomas.
Para cada transfección, se añadieron 0,8 ml de
Opti - MEM® I exento de suero precalentado al tubo que contenía los
complejos. El medio se aspiró de las paredes y se añadió 1 ml de la
solución diluida de los complejos a las células. Las células se
incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 5 - 6 horas. Después la
mezcla de transfección se retiró y se añadieron 2 ml de medio
completo (DMEM) que contenía FCS al 10% a cada pocillo.
En los ensayos de transfección transitoria, las
células se ensayaron 24 - 72 horas después del comienzo de la
transfección. Las células transfectadas se recogieron y se tiñeron
con en anticuerpo monoclonal 10.2C7 específico para VCAM porcino
(Celltech, Reino Unido) y un segundo reactivo de fase marcado con
rojo Texas. Con el fin de identificar las células que habían
recogido el DNA de plásmidos, las construcciones de sFv se
cotransfectaron con el vector pEF/GFP/ER que contiene un fragmento
de 761 pares de bases de paGFP (Crameri y col, 1996) condensado a la
señal KDEL de retención de ER en la misma estructura principal del
vector como las construcciones sFv.
La figura 5 muestra un histograma típico cuando
se determina la población para la expresión de VCAM (fluorescencia
roja) y la expresión de GFP (fluorescencia verde). Las células que
expresan GFP mostraron una reducción de 77% en la expresión de VCAM
(control RMFI 10,9, células GFP positivas 2,4). Esta reducción no se
observó en las células transfectadas con el plásmido pEF/GFP/ER solo
sugiriendo que la reducción se debía a la expresión del sFv
específico de VCAM.
Para obtener transfectantes estables, IPEC se
cotransfectaron con un plásmido que codificaba la resistencia a la
higromicina (Kioussis y col., 1987). Después de 48 - 72 horas las
células se subcultivaron y se diluyeron 1:10 en medio completo que
contenía 150 \mug/ml de higromicina. La expresión de VCAM se
analizó mediante citometría de flujo de las células resistentes a la
higromicina en los 10 - 14 días.
Las figuras 6 A y B muestran los histogramas
típicos de las líneas celulares generadas mediante transfección de
las construcciones de dos clones diferentes de sFv, E6.2 y F5. Ambas
construcciones de sFv reducen la expresión de VCAM sobre la
superficie de las células endoteliales. Los valores de la
fluorescencia media correspondientes al nivel de la expresión de
VCAM mostrados en estas figuras son:
Población no transfectada de RMFI = 38,2, clon
sFv/ER 6.2 = 4,82 y F5 = 10,1.
Las figuras 7 A y B presentan los resultados de
un segundo experimento en las células transfectadas permanentemente
para determinar la reducción de la expresión de VCAM sobre la
superficie de estas células.
Estos datos demuestran que es posible reducir la
expresión de VCAM sobre las células endoteliales mediante la
expresión en las células de un scFv específico de VCAM dirigida para
la retención en las ER.
Las técnicas de la tinción con
inmunofluorescencia y microscopía confocal se usaron después para
demostrar la colocalización de VCAM y scFv dentro de los
transfectante de scFv tanto E6.2 como F5.
Las células endoteliales A9 no transfectadas
muestran una tinción de membranas difusa para VCAM (véase la figura
8A). Ambos clones transfectados de scFv demostraron un patrón de
tinción perinuclear, acentuado cuando se tiñe para la expresión de
VCAM, consistente con la retención de VCAM en el interior del
retículo endoplásmico (un ejemplo de una célula transfectada se
muestra en la figura 8 B). La tinción de la células transfectadas
con un anticuerpo anti - myc sin la detección del epítopo
c-myc sobre las construcciones de scFv produjeron un
patrón de tinción perinuclear fuerte consistente con la retención de
ER del scFv (figura 8C). La exposición dual con filtros apropiados
confirmó que la VACM y scFv se colocalizaron en ER (panel D):
Con el fin de demostrar que la reducción en la
expresión de VCAM lograda mediante el scFv intracelular era
significativa funcionalmente, se examinó la unión de la línea de
leucemia de las células T, Jufkat, tanto para los transfectantes
como para la línea precursora endotelial A9.
La línea Jurkat A9 se eligió debido a la alta
expresión de VLA - 4 de superficie y se documentó la dependencia de
esta integrina para la unión a las células endoteliales (van Kooyk,
Y y col,, 1993)
Los gráficos mostrados en la figuras 9A y B
demuestran la unión de las células Jurkat a densidades variables de
las células endoteliales sembradas en pocillos individuales de una
placa de 96 pocillos. Para ambos transfectantes de scFv, hubo un
desplazamiento a la derecha en la curva de unión demostrando una
afinidad reducida de las células Jurkat para los trasnfectantes, así
como una reducción significativa en la máxima unión de los
leucocitos a la monocapa de células endoteliales.
Alon, R., P. D. Kassner, M. W.
Carr, E. B. Finger, M. E. Hemler, and T. A.
Springer. 1995. The integrin VLA-4
supports tethering and rolling in flow on VCAM-1.
J-Cell-Biol
128:1243-53 issn: 0021-9525.
Aranciba-Carcamo et
al., (1998) 65(1):
62-7.
Bach, F. H. 1998.
Xenotransplantation: problems and prospects. Annu Rev Med
49:301-10.
Bachiler et al, (1990)
Arch Geschwulstforsch, 60(5):
357-60.
Beerli, R. R., W. Wels, and N. E.
Hynes. 1994. Intracellular expression of single chain
antibodies reverts ErbB-2 transformation.
J-Biol-Chem 269:
23931-6.
Bevilacqua, M. P. 1993.
Endothelial-leukocyte adhesion molecules. Annu
Rev Immunol 11:767-804.
Biocca, S., P. Pierandrei Amaldi,
and A. Cattaneo. 1993. Intracellular expression of
anti-p2lras single chain Fv fragments inhibits
meiotic maturation of xenopus oocytes.
Biochem-Biophys-Res-Commun
197:422-7.
Blakely, M. L., W. J. Van der Werf,
M. C. Berndt, A. P. Dalmasso, F. H. Bach, and
W. W. Hancock. 1994. Activation of intragraft
endothelial and mononuclear cells during discordant xenograft
rejection. Transplantation 58: 1059-66 issn:
0041-1337.
Bradley A, Liu P. Target practice
in transgenics. Nature Genet. 1996; 14:
121-123.
Brown, E. J., and F. P. Lindberg.
1996. Leucocyte adhesion molecules in host defence against
infection. Ann-Med 28:201-8
issn: 0785-3890.
Clackson, T. 1997. Controlling
mammalian gene expression with small molecules. Curr. Opin. Chem.
Biol. 1:210-8.
Clarke AR. The adenovirus and the egg: a
new approach to transgenesis. Nature Biotech. 1996;
14: 942.
Crameri, A., E. A. Whitehom, E.
Tate, and W. P. Stemmer. 1996. Improved green
fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling.
Nat-Biotechnol 14:315-9.
Curiel (1992) Hum Gene Ther
3:147-154
Diamond LE, McCurry KR,
Oldham ER, Tone M, Waldmann H, Platt JL,
Logan JS. Human CD59 expressed in transgenic mouse hearts
inhibits the activation of complement. Transplant Immunol.
1995; 3: 305-312.
Dorling, A., and R. I. Lechler.
1994. Prospects for xenografting.
Curr-Opin-Immunol
6:765-9 issn: 0952-7915.
Dorling, A., C. Stocker, T.
Tsao, D. O. Haskard, and R. 1. Lechler.
1996. In vitro accommodation of immortalized porcine
endothelial cells: resistance to complement mediated lysis and
down-regulation of VCAM expression induced by low
concentrations of polyclonal human IgG antipig antibodies.
Transplantation 62:1127-36 issn:
0041-1337.
Foster, C. A. 1996.
VCAM-1/alpha 4-integrin adhesion
pathway: therapeutic target for allergic inflammatory disorders.
J-Allergy-Clin-Immunol
98:S270-7 issn: 0091-6749.
Graus Porta, D., R. R. Beerli, and
N. E. Hynes. 1995. Single-chain
antibody-mediated intracellular retention of
ErbB-2 impairs Neu differentiation factor and
epidermal growth factor signaling.
Mol-Cell-Biol
15:1182-91.
Griffiths, A. D., S. C. Williams,
O. Hartley, 1. M. Tomlinson, P. Waterhouse, W.
L. Crosby, R. E. Kontermann, P. T. Jones, N. M.
Low, T. J.Allison, and et al. 1994.
Isolation of high affinity human antibodies directly from large
synthetic repertoires. EMBO-J
13:3245-60.
Gurtner, G. C., V. Davis, H.
Li, M. J. McCoy, A. Sharpe, and M. 1.
Cybulsky. 1995. Targeted disruption of the murine
VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in
chorioallantoic fusion and placentation.
Genes-Dev 9:1-14 issn:
0890-9369.
Heckl-Ostreicher B,
Binder R, Kirschfink M. Functional activity of the
membrane-associated complement inhibitor CD59 in a
pig-to-human in vitro model
for hyperacture xenograft rejection. Clin. Exp. lmmunol.
1995;102:589-595.
Isobe, M., H. Yagita, K.
Okumura, and A. Ihara. 1992. Specific
acceptance of cardiac allograft after treatment with antibodies to
ICAM-1 and LFA-1. Science
255:1125-7 issn: 0036-8075.
Jiang, W., K. Venugopal, and E. A.
Gould. 1995. Intracellular interference of
tick-bome flavivirus infection by using a
single-chain antibody fragment delivered by
recombinant Sindbis virus. J-Virol
69:1044-9.
Jones, D. A., L. V. McIntire, C. W.
Smith, and L. J. Picker. 1994. A
two-step adhesion cascade for T
cell/endothelial cell interactions under flow conditions. J-Clin-lnvest 94:2443-50 issn: 0021-9738.
cell/endothelial cell interactions under flow conditions. J-Clin-lnvest 94:2443-50 issn: 0021-9738.
Kioussis, D., F. Wilson, C.
Daniels, C. Leveton, J. Taverne, and J. H.
Playfair. 1987. Expression and rescuing of a cloned
human tumour necrosis factor gene using an EBV-based
shuttle cosmid vector. EMBO-J
6:355-61.
Langford GA, Cozzi E,
Yannoutsos N, Lancaster R, Elsome K,
Chen P, White DGJ. Production of pigs transgenic for
human regulators of complement activation using YAC technology.
Transplant Proc. 1996; 28:
862-863.
Magee, A., and T. Wileman,
1992. Protein Targeting: A Practical Approach. In
Practical Approach Series. Oxford University Press,
Oxford.
McCurry KR, Diamond LE,
Kooyman DL, Byme GW, Martin MJ, Logan
JS, Platt JL. Human complement regulatory proteins expressed
in transgenic swine protect swine xenografts from humoral injury.
Transplant Proc. 1996; 28: 758.
Millan, M. T., C. Geczy, K. M.
Stuhlmeier, D. J. Goodman, C. Ferran, and F. H.
Bach. 1997. Human monocytes activate porcine
endothelial cells, resulting in increased
E-selectin, interleukin-8, monocyte
chemotactic protein-1, and plasminogen activator
inhibitor-type-1 expression.
Transplantation 63:421-9 issn:
0041-1337 .
Mueller, J. P., M. J. Evans, R.
Cofiell, R. P. Rother, L. A. Matis, and E. A.
Elliott. 1995. Porcine vascular cell adhesion molecule
(VCAM) mediates endothelial cell adhesion to human T cells.
Development of blocking antibodies specific for porcine VCAM.
Transplantation 60:1299-306 issn:
0041-1337.
Muller, W. A. 1995. The role of
PECAM-1 (CD31) in leukocyte emigration: studies
in vitro and in vivo.
J-Leukoc-Biol
57:523-8 issn: 0741-5400.
Munro, S., and H. R. Pelham.
1987. A C-terminal signal prevents secretion
of luminal ER proteins. Cell 48:899-907 *LHM:
This title is held by RPMS library *LHC: Vol. 19 (1980)-.
Palmiter et al., 1983 Science, 222: (4625): 809-814.
Pudsley, A. 1989. Protein
Targeting. Academic Press, San Diego, CA.
Richardson, J. H., T. A. Waldmann,
J. G. Sodroski, and W. A. Marasco. 1997.
Inducible knockout of the interleukin-2 receptor
alpha chain: expression of the high-affinity
IL-2 receptor is not required for the in
vitro growth of
HTLV-I-transformed cell Zines.
Virology 237:209-16.
Rondon, 1. J., and W. A. Marasco.
1997. Intracellular antibodies (intrabodies) for gene therapy
of infectious diseases. Annu Rev Microbiol
51:257-83.
Springer, T. A. 1994. Traffic
signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the
multistep paradigm. Cell 76:301-14 issn:
0092-8674.
Tanaka, Y., D. H. Adams, and S.
Shaw. 1993. Proteoglycans on endothelial cells present
adhesion-inducing cytokines to leukocytes.
Immunol-Today 14:111-5 issn:
0167-4919.
Tedder, T. F., D. A. Steeber, A.
Chen, and P. Engel. 1995. The selectins:
vascular adhesion molecules. FASEB-J 9:
866-73 issn: 0892-6638.
van Kooyk,Y et al; 1993"Lymphocyte function-associated antigen 1
dominates very late antigen 4 in binding of activated T cells to
endothelium". J Exp Med 177: 185-90.
Wheeler MB. Development and validation of
swine embryonic stem cells: a review. Reprod Perfil. Dec.
1994; 6:563-568.
White D, Cozzi E, Langford
G, Oglesby T, Wang M, Wright L, Wallwork
J. The control of hyperacute rejection by genetic engineering of the
donor species. Eye 1995;
9:185-189.
Woffendin et al (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91(24):11581-11585
Wu (1989) J. Biol. Chem.
264:16985-16987
Yannoutsos N, Langford GA,
Cozzi E, Lancaster R, Elsome K, Chen P,
White DJG. Production of pigs transgenic for human regulators
of complement activation. Transplant Proc. 1995; 27:
324-325.
Claims (18)
1. Un tejido biológico que comprende células
endoteliales que se pueden inducir para generar un compuesto que
regula por disminución la expresión de una molécula de adhesión
celular por las células, siendo el compuesto bien (a) un
polinucleótido complementario en secuencia a parte del gen o mRNA
que codifica la molécula de adhesión celular, (b) un polinucleótido
que comprende una secuencia de ribozima que se dirige
específicamente a un gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión
celular, o (c) un péptido con afinidad de unión específica para la
molécula de adhesión celular.
2. Un tejido según la reivindicación 1, en el que
dicho polipéptido (c) es una proteína de fusión biespecífica.
3. Un polipéptido que comprende una región de
unión capaz de unirse a una molécula de adhesión celular y una
región de señalización para la dirección subcelular del polipéptido
de manera que no se transporte a la superficie de la célula.
4. Un polipéptido según la reivindicación 3, que
comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
5. Un polipéptido según la reivindicación 4, que
comprende un fragmento Fv de una cadena simple.
6. Un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la región de señalización para la
dirección subcelular del polipéptido comprende una señal de
localización para el retículo endoplásmico.
7. Un polipéptido según la reivindicación 6, en
el que la región de señalización comprende la secuencia de
aminoácidos KDEL en el extremo C del polipéptido.
8. Un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 7, en el que la región de unión tiene afinidad
por una cualquiera de las moléculas de adhesión VCAM - 1, ICAM - 1,
LFA - 1, CD2, PECAM, CD31, IAP, CD47 o integrina
\alpha\nu\beta3.
9. Un polipéptido que codifica un polipéptido
según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.
10. Un vector que comprende un polinucleótido
según la reivindicación 9.
11. Una célula que comprende un polinucleótido
según la reivindicación 9 o un vector según la reivindicación
10.
12. Tejido biológico que comprende una célula
según la reivindicación 11.
13. Un animal no humano que comprende tejido
biológico según la reivindicación 12 y/o una célula según la
reivindicación 11.
14. Un animal según la reivindicación 13, en el
que dicho animal es un cerdo u oveja transgénica.
15. Un procedimiento de obtención de un tejido u
órgano adecuado para transplante, que comprende la expresión de un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 en
las células endoteliales en dicho tejido u órgano, por lo tanto
regulando por disminución la expresión de una molécula de adhesión
celular.
16. Tejido biológico según la reivindicación 12,
para uso en transplante.
17. El uso de tejido biológico según la
reivindicación 12 en la fabricación de un medicamento para
transplantar en un animal receptor.
18. El uso de la reivindicación 17, en el que
dicho receptor animal es un ser humano.
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