DE69636346T2

DE69636346T2 - MIMOTOPE UND ANTIMIMOTOPE DES MENSCHLICHEN PLÄTTCHEN-GLYKOPROTEINS Ib/IX

Info

Publication number: DE69636346T2
Application number: DE69636346T
Authority: DE
Inventors: L. Jonathan Syracuse MILLER; A. Vicki Syracuse LYLE
Original assignee: RCBT Series II Chicago LLC
Current assignee: RCBT Series II Chicago LLC
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-08
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2016-11-09
Also published as: EP0876396A1; CN1202175A; JP2001511111A; WO1997018236A1; EP0876396A4; US5877155A; DE69636346D1; ATE332914T1; CN1140536C; JP3979448B2; EP0876396B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid mit der Fähigkeit zur funktionalen Nachahmung der Bindungsstelle für einen monoklonalen Antikörper (d.h. ein Mimotop), wobei der monoklonale Antikörper (C-34) ein Epitop innerhalb des humanen Plättchen-Glykoprotein-Ib/IX-Komplexes erkennt, und isolierte Moleküle mit der Fähigkeit zur Bindung an das Peptid (d.h. ein Antimimotop).
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Durchgängig sind in dieser Anmeldung verschiedene Veröffentlichungen, viele in Klammern, als Verweise angegeben. Vollständige Zitate für diese Veröffentlichungen sind am Ende der detaillierten Beschreibung angegeben. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen in ihrer Gesamtheit sind hierdurch als Bezug in dieser Anmeldung aufgenommen.
Es wird angenommen, dass der Plättchen-Glykoprotein-Ib/IX (GPIb/IX)-Rezeptor für den von Willebrand-Faktor (vWf) aus einem 1:1 heterodimeren Komplex (Du et al., 1987) zwischen GPIb (160 kDa) und GPIX (17 kDa) in einer nicht-kovalenten Assoziierung besteht. GPIb wiederum besteht aus einer disulfidverknüpften alpha-Kette von 140 kDa (GPIb-alpha) und einer beta-Kette von 22 kDa (GPIb-beta) (Fitzgerald und Phillips, 1989).
Der GPIb/IX-Komplex umfasst einen der Haupttransmembranrezeptorkomplexe auf Blutplättchen (Roth 1991, Lopez 1994, Clemetson und Clemetson 1995), der die vom von-Willebrand-Faktor (vWf) abhängige Plättchenadhäsion vermittelt. Die humane autosomale dominante Blutgerinnungsstörung der Bezeichnung Willebrand-Jürgens-Syndrom des Plättchentyps (PT-vWD) stellt ein natürlich vorkommendes Modell eines hochregulierten GPIb/IX-Rezeptors dar (Miller und Castella 1982, Miller et al. 1983). Bei dieser Störung sind anomal niedrige Konzentrationen des chemischen Modulators Ristocetin zur Förderung der Interaktion von vWF mit GPIb/IX fähig. Zusätzlich sind die Plättchen derartiger Patienten mit einer geringeren Scherkraft als sie für normale Plättchen erforderlich ist, aggregiert (Murata et al. 1993). Es wurde ermittelt, dass eine Familie von PT-vWD-Patienten eine Einzelpunktmutation aufwies, die zu einer Substitution von Glycin durch Valin am Rest 233 der GPIb-alpha-Kette führte (Miller et al. 1991). Eine zweite Punktmutation in sehr enger Nähe (Substitution von Methionin durch Valin am Rest 239) (Russell und Roth 1993, Takahashi et al. 1995) wurde in zwei weiteren Familien, die den PT-vWD-Phänotyp zeigten, beschrieben (Weiss et al. 1982, Takahashi 1980).
Die WO 91/09614 beschreibt GPIbα-Fragmente und derartige Fragmente codierende DNA-Expressionsvektoren.
In den achtziger Jahren entwickelten Miller et al. eine Reihe monoklonaler Antikörper (mab), die gegen den GP-Ib/IX-Komplexrezeptor für vWf gerichtet sind. Insbesondere wurde der monoklonale Antikörper C-34 detailliert charakterisiert und es wurde bestimmt, dass mab C-34 ein Epitop in dem Plättchen-Glykoprotein-Ib/IX-Komplex erkannte (Miller et al. 1990). In dieser und anschließenden Arbeiten zeigten Miller et al., dass die monoklonalen Antikörper C-34, AS-2 und AS-7 wirksame Inhibitoren der Ristocetin-induzierten Aggregation normaler Plättchen, die vom von-Willebrand-Faktor abhängig war, waren. Miller et al. zeigten ferner, dass die Epitope für alle drei monoklonalen Antikörper innerhalb des GPIb/IX-Komplexes lagen. Miller et al. konnten monoklo nale Antikörperbindungsstellen für AS-2 und AS-7 an den aminoterminalen 45 kDa von GPIb-alpha lokalisieren. Das Epitop für C-34 wurde vor kurzem an dem extrazellulären Bereich der GPIb-alpha-Kette, die auf der Oberfläche von Chinese Hamster Ovary-Zellen exprimiert war, lokalisiert (Chambers et al. 1995). Das Ausbleiben einer Bindung von C-34 an denaturiertes GPIb-alpha in Western-Blots (Ward und Berndt 1995, Clemetson und Hugli 1995) oder einer Immunpräzipitation der extrazellulären Region von GPIb-alpha, die von Plättchen entfernt wurde, unter einer Vielzahl experimenteller Bedingungen (Miller et al. 1990) legt stark nahe, dass das durch C-34 erkannte Epitop stark konformationsabhängig ist. Vor kurzem berichteten nun jedoch Ward und Berndt die erfolgreiche Immunpräzipitation eines 1-His-Arg-203-aminoterminalen Fragments von ¹²⁵I-markiertem Glykocalicin durch C-34 nach Verdau des gereinigten Moleküls durch Trypsin (Ward und Berndt 1995).
Versuche zur Festlegung der Bindungsstellen für verschiedene monoklonale Antikörper führten zur Entwicklung von Epitopbibliotheken. Parmley und Smith entwickelten einen Bakteriophagenexpressionsvektor, der Fremdepitope auf dessen Oberfläche zeigen konnte (Parmley und Smith 1988). Dieser Vektor konnte zur Konstruktion großer Sammlungen eines Bakteriophagen, die tatsächlich alle möglichen Sequenzen eines kurzen Peptids (von beispielsweise sechs Aminosäuren) umfassen könnten, verwendet werden. Sie entwickelten auch Biopanning, das ein Verfahren zur Affinitätsreinigung eines Fremdepitope zeigenden Phagen unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers ist (siehe Parmley und Smith 1988, Cwirla et al. 1990, Scott und Smith 1990, Christian et al. 1992, Smith und Scott 1993).
Nach der Entwicklung von Epitopbibliotheken schlugen Smith et al. dann vor, dass es möglich sein sollte, den Bakterio phagenexpressionsvektor und die Biopanningtechnik von Parmley und Smith zur Identifizierung von Epitopen aus allen möglichen Sequenzen einer gegebenen Länge zu verwenden. Dies führte zur Idee der Identifizierung von Peptidliganden für Antikörper durch Biopannung von Epitopbibliotheken, die dann bei der Vakzingestaltung, Epitopmarkierung, der Identifizierung von Genen und vielen anderen Anwendungen verwendet werden könnten (Parmley und Smith 1988, Scott 1992).
Unter Verwendung von Epitopbibliotheken und Biopanning fanden Forscher, die nach Epitopsequenzen suchten, statt dessen Peptidsequenzen, die das Epitop nachahmten, d.h. Sequenzen, die keine kontinuierliche lineare native Sequenz identifizieren oder zwangsläufig überhaupt nicht in einer natürlichen Proteinsequenz vorkommen. Diese nachahmenden Peptide werden als Mimotope bezeichnet. Auf diese Weise wurden Mimotope verschiedener Bindungsstellen/Proteine ermittelt. LaRocca et al. (1992) exprimierten ein Mimotop des humanen Brustepithel-Mucin-Tandemrepeats in Escherichia coli. Balass et al. (1993) identifizierten ein Hexapeptid, das eine konformationsabhängige Bindungsstelle des Acetylcholinrezeptors nachahmt. Hobart et al. (1993) isolierten ein Mimotop, das das C6-Epitop (das Epitop für die sechste Komplementkomponente) nachahmt.
Die Sequenzen dieser Mimotope identifizieren per Definition keine kontinuierliche lineare native Sequenz und sie treten nicht zwangsläufig in irgendeiner Weise in einem natürlich vorkommenden Molekül, d.h. einem natürlich vorkommenden Protein, auf. Die Sequenzen der Mimotope bilden nur ein Peptid, das funktional eine Bindungsstelle an einem natürlich vorkommenden Protein nachahmt. Beispielsweise ahmt das Mimotop von Balass et al. (1993) die Bindungsstelle des Acetylcholinrezeptors nach.
Viele dieser Mimotope sind kurze Peptide. Die Verfügbarkeit kurzer Peptide, die ohne weiteres in großen Mengen synthetisiert werden können und die natürlich vorkommende Sequenzen (d.h. Bindungsstellen) nachahmen können, bietet große potentielle Anwendungsmöglichkeiten.
Daher besteht weiterhin Bedarf an der Aufklärung verwendbarer Mimotope.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dieser Bedarf wird durch die Mimotope der vorliegenden Erfindung erfüllt. Die Erfindung stellt daher isolierte Peptide bereit, die funktional eine Bindungsstelle für einen monoklonalen Antikörper (C-34) nachahmen, wobei der monoklonale Antikörper ein Epitop innerhalb des humanen Plättchen-Glykoprotein-Ib/IX-Komplexes erkennt. Diese isolierten Peptide sind Mimotope. Ein Peptid ahmt funktional eine Bindungsstelle für einen monoklonalen Antikörper nach, wenn der monoklonale Antikörper an das Peptid binden kann.
Die Erfindung stellt ferner ein isoliertes Molekül mit der Fähigkeit zur Bindung an das Peptid bereit, wobei das Molekül ein zweites Peptid, ein Kohlehydrat, ein DNA-Molekül, ein RNA-Molekül oder ein beliebiges chemisch synthetisiertes Molekül beispielsweise sein kann. Dieses isolierte Molekül ist ein Antimimotop. Antimimotope, die an einen Rezeptor binden, können zur Vermittlung der funktionalen Aktivität dieses Rezeptors verwendet werden.
Die Erfindung stellt daher ferner ein Verfahren zur Modulation der Adhäsion, Aggregation oder Agglutination von Plättchen, die jeweils von der Interaktion des von-Willebrand-Faktors mit Plättchen über den Glykoprotein-Ib/IX- Komplexrezeptor abhängig sind, bereit. Die Verfahren stellen ein Einwirken des Moleküls (Antimimotops) auf Plättchen zur Modulation von Adhäsion, Aggregation oder Agglutination der Plättchen bereit.
Die Erfindung stellt ferner isolierte Peptide mit der Fähigkeit zur Bindung an den monoklonalen Antikörper C-34 sowie ein isoliertes Molekül mit der Fähigkeit zur Bindung an ein derartiges Peptid bereit. Ferner wird ein Verfahren zur Modulation der Adhäsion, Aggregation oder Agglutination von Plättchen durch Einwirken des Moleküls (Antimimotops) auf die Plättchen bereitgestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Peptid mit der Fähigkeit zur Bindung an den monoklonalen Antikörper C-34 eine Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID NO: 38: WNWRYREYV.
Wir stellen ferner ein isoliertes Peptid mit der Fähigkeit zur Bindung an den monoklonalen Antikörper SZ-2 sowie ein isoliertes Molekül mit der Fähigkeit zur Bindung an ein derartiges Peptid bereit. Ferner wird ein Verfahren zur Modulation der Adhäsion, Aggregation oder Agglutination von Plättchen durch Einwirken des Moleküls (Antimimotops) auf die Plättchen bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Diese und andere Merkmale und Vorteile dieser Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen, wenn diese im Zusammensetzung mit den beigefügten Zeichnungen gelesen werden, offensichtlich, wobei:
1 die Ristocetin-induzierte vollständige Aggregation von Plättchen in Gegenwart des von-Willebrand-Faktors erläutert;
2 die Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation von Plättchen durch 20 μg/ml monoklonalen Antikörper C-34 erläutert;
3 die fortgesetzte Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation von Plättchen durch 20 μg/ml des mab C-34 in Gegenwart von 0,14 μM des synthetischen Peptidmimotops der SEQ ID NO: 1: AWNWRYREYV erläutert;
4 die partielle Neutralisation der Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation von Plättchen durch 20 μg/ml des mab C-34 in Gegenwart von 0,27 μM des synthetischen Peptidmimotops der SEQ ID NO: 1: AWNWRYREYV erläutert;
5 die partielle Neutralisation der Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation von Plättchen durch 20 μg/ml des mab C-34 in Gegenwart von 0,55 μM des synthetischen Peptidmimotops der SEQ ID NO: 1: AWNWRYREYV erläutert;
6 die partielle Neutralisation der Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation von Plättchen durch 20 μg/ml des mab C-34 in Gegenwart von 1,1 μM des synthetischen Peptidmimotops der SEQ ID NO: 1: AWNWRYREYV erläutert;
7 die vollständige Neutralisation der Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation von Plättchen durch 20 μg/ml des mab C-34 in Gegenwart von 2,3 μM des synthetischen Peptidmimotops der SEQ ID NO: 1: AWNWRYREYV erläutert;
8 das funktionale Screening von Kandidaten von Antimimotop-Bakteriophagenklonen erläutert. Nach der Inkubation von 150 μl der angegebenen Bakteriophagenklone mit 250 μl citratisiertem PRP während 1 h bei 22 °C wurde eine Aggregation durch die Zugabe von 0,8 mg/ml Ristocetin unter Rührbedingungen bei 37 °C initiiert;
9-11 die Wirkung synthetischer Peptide auf eine Ristocetin-induzierte Aggregation von Formalin-fixierten Plättchen erläutert; und
12a-12c eine diagrammartige Skizze von Mimotopen und Antimimotopen, die zur Sondierung der Strukturbeziehungen in Plättchen-Glykoprotein-Ib-alpha verwendet wurden, sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Peptid bereit, das funktional eine Bindungsstelle für einen monoklonalen Antikörper (C-34) nachahmt, wobei der monoklonale Antikörper ein Epitop innerhalb des humanen Glykoprotein-Ib/IX-Komplexes erkennt. Dieses Peptid wird als Mimotop bezeichnet.
Das Peptid umfasst eine Aminosäuresequenz, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
Vorzugsweise umfasst das Peptid eine Aminosäuresequenz, die der Konsensussequenz SEQ ID NO: 38: WNWRYREYV entspricht.
Jedes dieser Peptide, das durch SEQ ID NO: 1 bis 21, 23-37, 39-75 und 77-81 dargestellt wird, ahmt die Bindungsstelle innerhalb von GPIb/IX für mab C-34 nach. Mab C-34 bindet daher an jedes dieser Peptide. Jedoch identifizieren die Sequenzen von jedem dieser Peptide keine kontinuierliche lineare native Sequenz und sie treten keineswegs zwangsläufig innerhalb der Sequenz einer Kette (d.h. GPIb-alpha, GPIb-beta, GPIX) des GPIb/IX-Komplexes auf, weshalb die Peptide die mab-C-34-Bindungsstelle nachahmen und daher Mimotope sind. Das Peptid der vorliegenden Erfindung umfasst ferner Fragmente der oben als Beispiele angegebenen Peptide, die die Fähigkeit zur funktionalen Nachahmung der Bindungsstelle für einen monoklonalen Antikörper, wie C-34, beibehalten. Das Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO: 38 entspricht, ist ein Beispiel für ein derartiges Fragment, wobei es ein Fragment des Peptids ist, das die Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO: 1 entspricht, umfasst.
In Bezug auf den monoklonalen Antikörper der Bezeichnung SZ-2 umfasst das Peptid eine Aminosäuresequenz, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
Jedes dieser Peptide, das durch SEQ ID NO: 83-93, 76, 82 und 109-156 dargestellt wird, ahmt die Bindungsstelle innerhalb von GPIb/IX für mab SZ-2 nach. Mab SZ-2 bindet daher an jedes dieser Peptide, die als Mimotope bezeichnet werden. Das Peptid umfasst ferner Fragmente der oben als Beispiele angegebenen Peptide, die die Fähigkeit zur funktionalen Nachahmung der Bindungsstelle für den monoklonalen Antikörper SZ-2 beibehalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erkennt der monoklonale Antikörper (dessen Bindungsstelle durch das Peptid der Erfindung nachgeahmt wird, d.h. C-34) ein Epitop innerhalb des humanen Glykoprotein-GPIb/IX-Komplexes.
Die Erfindung stellt ferner ein isoliertes Molekül mit der Fähigkeit zur Bindung an das Peptid bereit. Dieses isolierte Molekül wird als Antimimotop bezeichnet. Das Antimimotop kann ein zweites Peptid, ein Kohlehydrat, ein DNA-Molekül, ein RNA-Molekül oder ein chemisch synthetisiertes Molekül sein. Derartige Peptide, Proteine oder anderen biologischen, synthetischen oder halbsynthetischen Moleküle, die zur Bindung an das Mimotop fähig sind, können durch Bildung von Antikörpern gegen das Mimotop, Auswahl aus Bakteriophagen-, chemischen, Hybridomzellen- oder anderen Arten von Bibliotheken, Zellen oder chemische Synthesen, die einen Satz oder Teilsatz von Molekülen mit hoher Affinität für die Mimotopsequenz produzieren können, oder die Gestaltung von Molekülen, die hohe Affinität für die Mimotopsequenzen aufweisen sollen, unter Verwendung computergestützter oder anderer theoretischer Ansätze identifiziert werden. Geeignete Antimimotope können auch unter Verwendung einer In-vitro-Entwicklung von Nukleinsäuren mit der Fähigkeit zur Bindung an das Peptidmimotop entwickelt werden (siehe Joyce 1994).
In einer Ausführungsform stellt das Antimimotop der vorliegenden Erfindung ein Peptid dar, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der im folgenden angegebenen Gruppe ausgewählt ist:
Diese speziellen Antimimotoppeptide wurden für das Mimotop, das die Bindungsstelle für den monoklonalen Antikörper C-34 nachahmt, erzeugt.
Derartige Antimimotope könnten als antithrombotische Arzneistoffe dienen. beispielsweise hemmt die Bindung von mab C-34 an GPIb/IX Ristocetin-induzierte Aggregation von Plättchen. Das Mimotoppeptid ahmt die Bindungsstelle in GPIb/IX nach und die Antimimotopmoleküle binden an das Mimotoppeptid. Daher sollten die Antimimotope, die Peptide sein können, selbst das Mimotoppeptid komplementieren. Als solches sollten die Antimimotope zur Bindung an das ursprüngliche Epitop für mab C-34 oder mab SZ-2 innerhalb des Plättchen-Glykoprotein-GPIb/IX-Komplexes fähig sein, wodurch ähnliche Effekte wie dies mab C-34 oder mab SZ-2 tun, d.h. die Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation von Plättchen, die vom von-Willebrand-Faktor abhängig ist, induziert werden.
Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Modulation der Adhäsion, Aggregation oder Agglutination von Plättchen bereit, wobei das Verfahren die Selektion von Plättchen und das Einwirken des Antimimotopmoleküls der vorliegenden Erfindung auf die Plättchen umfasst. Ein derartiges Einwirken beeinflusst die Interaktion des von-Willebrand-Faktors mit Plättchen über den Glykoprotein-GPIb/IX-Rezeptor, wodurch die Adhäsion, Aggregation oder Agglutionation der Plättchen moduliert wird.
Die Erfindung stellt ferner ein isoliertes Peptid mit der Fähigkeit zur Bindung an den monoklonalen Antikörper C-34 bereit, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
Ferner wird ein Fragment von einem der obigen Peptide bereitgestellt, wobei das Fragment die Fähigkeit zur Bindung an den monoklonalen Antikörper C-34 beibehält. Ein Beispiel für ein derartiges Fragment ist SEQ ID NO: 38, das ein Fragment von SEQ ID NO: 1 ist.
Die Erfindung stellt ferner ein isoliertes Molekül mit der Fähigkeit zur Bindung an die obigen Peptide bereit, das auch als Antimimotop bekannt ist. Geeignete Moleküle umfassen ein anderes Peptid, ein DNA- oder RNA-Molekül, ein Kohlehydrat oder ein chemisch synthetisiertes Molekül.
Wie oben stellt die Erfindung daher ein Verfahren zur Modulation der Adhäsion, Aggregation oder Agglutination von Plättchen bereit, wobei das Verfahren die Selektion von Plättchen und das Einwirken des Antimimotopmoleküls auf die Plättchen umfasst. Ein derartiges Einwirken beeinflusst die Interaktion des von-Willebrand-Faktors mit Plättchen über den Glykoprotein-GPIb/IX-Rezeptor, wodurch die Adhäsion, Aggregation oder Agglutination von Plättchen moduliert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Peptid mit der Fähigkeit zur Bindung an den monoklonalen Antikörper C-34, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die der SEQ ID NO: 38: WNWRYREYV entspricht, bereit.
Wir stellen ferner ein isoliertes Peptid mit der Fähigkeit zur Bindung an den monoklonalen Antikörper SZ-2 bereit, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der im folgenden angegebenen Gruppe ausgewählt ist:
Ferner wird ein Fragment von einem der obigen Peptide bereitgestellt, wobei das Fragment die Fähigkeit zur Bindung an den monoklonalen Antikörper SZ-2 beibehält. Wir stellen ferner ein isoliertes Molekül mit der Fähigkeit zur Bindung an die obigen Peptide (ein Antimimotop) und ein Verfahren zur Modulation der Adhäsion, Aggregation oder Agglutination von Plättchen durch Einwirken des Antimimotopmoleküls auf die Plättchen bereit.
Die Erfindung wird im folgenden detaillierter beschrieben.
Das C-34-Epitop
Wie von Miller et al. (1990) berichtet wurde, wurden Plättchen von Patienten mit Willebrand-Jürgens-Syndrom des Plättchentyps (PT-vWD), die heterozygot für die Mutation 230-WKQ(G→V)₂₃₃V-234 in der alpha-Kette von Plättchen-Glykoprotein Ib waren, als Immunogene für die Produktion muriner mabs verwendet. Ein derartiger mab, C-34, hemmte die Ristocetin-induzierte Aggregation von Patienten oder normalen Plättchen, jedoch nicht eine durch andere Aggregationsmittel induzierte Aggregation. Wie durch Kreuzimmunelektrophorese demonstriert wurde, erkannte mab C-34 ein Epitop innerhalb des GPIb/IX-Komplexes. In indirekten Immunfluoreszenzuntersuchungen an frischen Plättchen betrug das Verhältnis von jedem von vier verschiedenen Anti-GPIbmabs zum anderen nahezu eins (0,88-1,14) sowohl für normale Personen als auch für Patienten. Im Gegensatz dazu betrug das Verhältnis der Bindung des mab C-34 an einen derartigen mab (AP-1) 0,31 ± 0,02 (Mittelwert ± Standardabweichung) für normale Plättchen und es nahm signifikant auf 0,54 ± 0,01 für Patientenplättchen zu (p < 0,001). Bei Immunpräzipitationen an NP-40-Lysaten von ³H-markierten Plättchen ergaben Sättigungskonzentrationen von mab C-34 viel schwächere Banden als dies AS-2 oder andere Anti-GPIb-mabs taten. Im Gegensatz zu den anderen Anti-GPIb-mabs band C-34 nicht an das gereinigte, ¹²⁵I-markierte Glykocalicinfragment von GPIb oder das Glykocalicinderivat, das durch Kreuzimmunelektrophorese identifiziert wurde. Bei Immunpräzipitationsuntersuchungen von ³H-markierten Plättchen, die einer Verdauung mit Trypsin oder mit Chymotrypsin unterzogen wurden, identifizierte C-34 weder das Glykocalicin noch das aminoterminale 45-kDa-Fragment von GPIb-alpha, die durch mab AS-2 oder mab AS-7 immungefällt wurden.
Daher wurde unter Verwendung dreier unabhängiger Techniken (Immunpräzipitation von Plättchenglykoproteinen und anschließende radioaktive Markierung intakter Plättchen und anschließender proteolytischer Verdau dieser Glykoproteine; Immunpräzipitation von radioaktiv markiertem gereinigtem Glykocalicin; Kreuzimmunelektrophorese von Plättchenglykoproteinen) (Miller et al. 1990) gezeigt, dass C-34 zwar ein Epitop innerhalb des GPIb/IX-Komplexes erkennt, dieses Epitop jedoch nicht innerhalb von Glykocalicin zu sitzen scheint.
Während diese Untersuchungen ein relativ einfaches Verfahren berichteten, das erfolgreich eine Epitopkartierung der mabs AS-2 und AS-7 in der 45-kDa-Region von GPIb-alpha durchführte, zeigte diese Arbeit, dass mab C-34 nicht in einer beliebigen einzelnen Trypsin- oder Chymotrypsindomäne von Glykocalicin kartiert werden kann. Ferner produziert mab C-34 keine Immunpräzipitationsmuster, die ähnlich denen eines GPIX erkennenden mab sind.
Biopanning des mab C-34 mit Bakteriophangendisplaybibliotheken
Scott und Smith (1990) präsentierten ein Verfahren zur Definition von Peptidliganden durch die Verwendung willkürlich synthetisierter Peptidinserts in Bakteriophagen. Verwandte Verfahren wurden von Cwirla et al. (1990) und von Devlin et al. (1990) veröffentlicht. Seit dieser Zeit gibt es Literatur, wobei sowohl die ursprünglichen Hexapeptidinserts als auch größere Inserts zur Identifizierung von Epitopen, die durch monoklonale Antikörper erkannt werden, verwendet wurden. Diese Technik besitzt großes Potential zur Detektion kritischer Epitope innerhalb des Plättchen-vWF-Rezeptors, der als GPIb/IX bekannt ist. Die hierin offenbarten Untersuchungen konzentrieren sich auf den monoklonalen Antikörper C-34, sie können jedoch auf andere monoklonale Antikörper mit Bindungsstellen (Epitopen) innerhalb von GPIb/IX durch die hierin offenbarten Verfahren für mab C-34 angewandt werden.
Eine ausbalancierte Dekapeptid (10-mer)-Bibliothek von Dr. Bruce Malcom von Alberta, Kanada (beschrieben von Christian et al. 992) und eine Dodekapeptid (12-mer)-Bibliothek von Clontech Laboratories (Palo Alto, CA) wurden verwendet. In der Dodekapeptidbibliothek verursacht eine verringerte Häufigkeit von Adenosinen an den ersten zwei Positionen jedes Codons eine charakteristische Unterrepräsentation der folgenden Aminosäuren, die durch ihre Ein-Buchstaben-Codes angegeben sind: I, M, T, N, K, Y, H, Q, D und E. Die Bibliotheken wurden beide zu einem Fuse-5-Vektor (Scott und Smith 1990) durch Insertion eines Gemischs synthetischer Oligonucleotide konstruiert, wobei die willkürlichen Dekapeptide (oder modifiziert-willkürlichen Dodekapeptide) mit dem kleineren Virushüllprotein pIII des Bakteriophagen fusioniert wurden. Die Bibliotheken weisen jeweils eine Komplexität von etwa 3 × 10⁸ unabhängigen Klonen und einen Titer von 10¹² bis 10¹⁴ pro ml auf. Während die Malcom-Bibliothek nur eine partielle Dekapeptidbibliothek bildet, ist sie als Hexapeptidbibliothek vollständig.
Die Strategie zur Verwendung dieser Bibliotheken folgt in großem Umfang dem Übersichtsartikel, der vor kurzem von Scott (1997) präsentiert wurde, und sie verwendet mit Modifikationen die detaillierte Methodik zur Verwendung dieses Systems, die vor kurzem von Smith und Scott (1993) beschrieben wurde. Die hierin verwendete Strategie ist die folgende.
Insbesondere wird in der ersten Runde des Biopanning eine streptavidinbeschichtete 60-mm-Petrischale mit Blockierungslüsung (0,5% BSA, 0, 1 M NaHCO₃, 0,1 μg/ml Streptavidin, 0,2% NaN₃) 2h gefüllt, dann dreimal mit TBS-0,5 Tween gewaschen. Als nächstes wird 1 μl der Bibliothek (etwa 1 × 10¹¹ Phagen), die über Nacht bei 4 °C mit 1 μg biotinyliertem mab inkubiert wurde, mit 1 ml TBS-Tween verdünnt und dieses Gemisch wird dann zu der Petrischale gegeben und 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Petrischale wird 10-mal mit TBS-Tween gewaschen und gebundener Phagen wird durch Pipettieren von 800 μl 0,1 N HCl (pH-Wert mit Glycin auf 2,2 eingestellt) – 1 mg/ml BSA in die Schale eluiert. Das Eluat wird dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 48 μl 2 M Tris enthält, um den pH-Wert auf etwa 8 zu bringen, pipettiert.
Das Eluat wird in TBS unter Verwendung eines Amicon Centricon-30-Filters (Amicon, Inc., Beverly, MA) zweimal kozentriert und gewaschen. Dieses Endprodukt wird durch Herstellen von Verdünnungen von einer kleinen Menge von konzentriertem Eluat in TBS-0,1% Gelatine und die Zugabe von 1 μl jeder hergestellten Verdünnung zu 19 μl TBS-Gelatine, dann Zugabe von 20 μl ausgehungerten K91-E. coli-Zellen und Inkubation während 1.0 min bei Raumtemperatur austitriert. Nach Zugabe von 200 μl NZY-Medium, das 0,2 μg/ml Tetracyclin (Tc) enthält, und Inkubation bei 37 °C während. 1 h wird das Gemisch auf NZY-Agaragar-Platten, die 40 μg/ml Tetracyclin enthalten, ausplattiert und über Nacht bei 37 °C wachsen gelassen.
Nach dem Titrieren wird das gesamte konzentrierte Eluat aus der ersten Biopanningrunde (etwa 50 μl) zu einem gleichen Volumen frischer ausgehungerter K91-Zellen gegeben und eine Amplifikation gemäß der Beschreibung bei Smith und Scott (1993) durchgeführt. Nach der ersten PEG/NaCl-Fällung wird das gebildete Pellet in 1 ml TBS gelöst. Phagen wird dann ein zweites Mal mit PEG/NaCl gefällt, mindestens 1 h bei 4 °C stehengelassen und das Präzipitat nach Zentrifugation bei 4 °C gewonnen. Nach sorgfältigem Entfernen des gesamten Überstands wird das Pellet in 100 μl TBS gelöst. Dieses amplifizierte Produkt kann dann titriert werden.
Die erste Biopanningrunde führt zu einer Ausbeute von 5 × 10^–7%. Das zweite Biopanning verwendete ebenfalls 1 μg von biotinyliertem C-34 mit 1 × 10¹¹ Phagen, was zu einer Ausbeute von 4 × 10^–3% führte. Die zweite Biopanningrunde wird wie in der ersten Runde konzentriert und amplifiziert. In der dritten Runde wurden 0,01 μg von biotinyliertem C-34 Biopanning gegenüber 2,5 × 10¹¹ Phagen unterzogen, wobei eine Ausbeute von 3 × 10^–4% erhalten wurde. Die dritte Runde wird nach Elution des gebundenen Phagen aus der Petrischale gestoppt. Dieses Eluat wird nicht konzentriert oder amplifiziert. Titerfeststellungen erfolgen vor und nach jeder Runde und die prozentuale Ausbeute wird als die Zahl der Bakteriophagen, die in einer Elutionsfraktion, bezogen auf die Anfangszahl der Bakteriophagen erhalten wurde, berechnet (Christian et al. 1992). Die Ausbeute sollte allgemein größer als 10^–5 sein, um den Hintergrund zu übertreffen, wobei Werte von 10^–4 bis 10^–1 typischerweise beobachtet werden. Zunehmende prozentuale Ausbeuten in anschließenden Biopanningrunden legen insbesondere nahe, dass Klone zunehmender Affinität selektiert werden.
Für Untersuchungen, die auf die Entdeckung eines Peptids, das das Mimotoppeptid (SEQ ID NO: 1: AWNWRYREYV) bindet, gerichtet waren, wurden zwei Biopanningrunden gegen die ursprüngliche Dekapeptidbibliothek unter Verwendung von 1 μg biotinyliertem Mimotoppeptid in der erste Runde und 0,01 μg in der zweiten Runde durchgeführt. Die erhaltenen Ausbeuten betrugen 3 × 10^–6% bzw. 2 × 10^–3%.
In einigen Experimenten kann ein immunologischer Screeningassay gemäß der Beschreibung bei Christian et al. (1992) unter Verwendung von NZY + Tc-Agaragarplatten, die etwa 500 gut getrennte Kolonien enthalten, durchgeführt werden. Die Kolonien werden auf Nitrocellulosemembranfilter (Biorad Laboratories, Hercules, CA) übertragen und die Filter werden unmittelbar zweimal mit TNT-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) gewaschen, 30 min bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in 20%-igem normalem Ziegenserum in TNT-Puffer blockiert, dann 2 h bei Raumtemperatur in einem ersten mab, der 1:1000 in Blockierungspuffer verdünnt wurde, inkubiert. Die Filter werden aufeinanderfolgend unter jeweils 10 min Waschen bei Raumtemperatur in Waschpuffer A (TNT-Puffer + 0,1% BSA), Waschpuffer B (TNT-Puffer + 0,1% BSA + 0,1% NP-40) und dann erneut Waschpuffer A gewaschen und in einem zweiten Peroxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-IgG 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Filter werden wie zuvor gewaschen, dann in eine letzte Waschflüssigkeit von TN (10 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl) gegeben. Eine Farbentwicklung wird nach dem Einsetzen der Filter in ABTS-Substrat beobachtet.
Kleine Kulturen individueller Kolonien werden dann über Nacht durch entweder a) Selektion der Kolonien, die aufgrund des immunologischen Screenings positiv waren, oder b) Überspringen der Screeningstufe und willkürliche Auswahl von Kolonien (etwa 100) gezüchtet. Jede Kolonie wird in 2 ml NZY-Medium, das 20 μg/ml Tetracyclin enthält, überimpft und diese kleinen Kulturen werden über Nacht bei 37 °C unter kräftigem Schütteln gezüchtet. Am nächsten Tag werden die Kulturen zum Pelletisieren der Zellen zentrifugiert und der Überstand wird entfernt. Zu 1 ml des Überstands werden dann 150 μl PEG/NaCl gegeben und die Phagen werden über Nacht bei 4 °C gefällt. Nach anschließender Zentrifugation und Entfernung des Überstands wird das Pellet in 1 m 1 TBS gelöst.
Zur DNA-Sequenzierung werden 400 μl des gelösten Pellets einmal mit Phenol extrahiert und die gebildete wässrige Phase (etwa 300 μl) wird zu 500 μl TE und 80 μl 3 M Natriumacetatpuffer gegeben. Dann wird 1 ml Ethanol zugegeben und die SS-DNA wird über Nacht bei 4 °C ausfallen gelassen. Die Probe wird dann 30 min bei 4 °C mikrozentrifugiert, das DNA-Pellet wird einmal in 70% EtOH gewaschen, getrocknet und in 7 μl H₂O resuspendiert. Dieses Templat kann bei –20 °C aufbewahrt werden, bis es zur Verwendung bereit ist.
Aufgrund der ganz GC-reichen Sfi-1-Klonierungsstelle, die die Insertionsregion flankiert (Christian et al. 1992), werden Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung des Sequenase 7-deaza dGTP DNA Sequencing Kit (Amersham-US Biochemicals, Arlington Heights, IL) mit ³²P-dATP und einem Antisense-Primer, der etwa 40 Nucleotide 3' zur Insertstelle lokalisiert ist, (Primer der SEQ ID NO: 100: 5'-CTCATAGTTAGCGTAACG-3') durchgeführt. Proben werden auf einem Standard-6%-Sequenzierungsgel unter Verwendung einer IBI STS 45-Sequenziervorrichtung (Eastman Kodak Company, Rockester, NY) laufengelassen.
Die GCG-Software (Genetics Computer Group, Inc., Madison WI) ist zum Aligning von Sequenzen, die von mehreren Klonen erhalten wurden, hilfreich, um Konsensussequenzen zu ermitteln. Sicherlich im Falle neuer mabs, für die Bindungsstel len gesucht werden, jedoch auch im Falle des mab C-34 besteht Interesse an der Suche nach Sequenzen nicht nur in GPIb-alpha, sondern auch in GPIb-beta, GPIX und tatsächlich anderen Plättchenproteinen, die in den verfügbaren Datenbanken (Swiss Prot, Gen Bank, EMBL und dgl.) hinterlegt wurden. Tatsächlich kann diese Analyse wichtige neue Informationen ergeben, die nahelegen, dass ein spezielles Epitop eines monoklonalen Antikörpers aus mehreren Komponenten des GPIb/IX-Komplexes bestehen kann, die demgemäß in enger räumlicher Nähe sein müssen.
An diesem Punkt kann ein ELISA-Assay zur Beurteilung individueller Klone verwendet werden, wenn die Zahl der Klone hoch ist. Kurz gesagt, können Phagen, die zwei PEG-Präzipitationen unterzogen wurden und anschließend bezüglich des Titers eingestellt wurden, über Nacht mit biotinyliertem mab inkubiert werden, wonach das mab-Phagen-Gemisch in Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben werden kann, die zuvor mit formalinfixierten Plättchen (oder einem anderen geeignet immobilisierten Target, das von dem mab erkannt wird) beschichtet wurden. Nach einer Reihe von Waschstufen werden Avidin-Peroxidase zugegeben, die Vertiefungen erneut gewaschen, mit chromogenem Substrat versetzt und die Vertiefungen schließlich auf einem ELISA-Plattenleser ausgelesen. Die relative Abnahme der Intensität eines Signals in diesem Assay ergibt eine Richtlinie für die vielversprechendsten Klone zur weiteren Untersuchung. Auf diese Weise identifizierte Konsensuspeptide können chemisch synthetisiert und im Hinblick auf die Fähigkeit zur Bindung des ursprünglichen Antikörpers charakterisiert werden. Peptide, die hohe Bindungsaffinität für den Antikörper zeigen, können dann als Immunogene bei Mäusen und/oder Kaninchen verwendet werden.
Epitopmarkierungsuntersuchungen von mab C-34
Die oben diskutierten zwei Phagendisplaybibliotheken wurden in Kartierungsuntersuchungen mit mab C-34 verwendet. Die Ergebnisse mit der ausbalancierten 10-mer-Peptidbibliothek waren im Hinblick auf eine starke Konsensusentwicklung unter Klonen, die nach zwei oder drei Biopanningrunden selektiert wurden, ganz definitiv. Es besteht nicht nur offensichtlicher Konsensus in Bezug auf die 9-mer-Sequenz SEQ ID NO: 38: WNWRYREYV, sondern das diese Sequenz umfassende 10-mer-Peptid (SEQ ID NO: 1) mit einem aminoterminalen Alanin schien den größten selektiven Vorteil im Hinblick auf das Biopanning aufzuweisen, da diese Sequenz tragende Klone am häufigsten gefunden wurden.
Die Reihe klonierter Sequenzen ist im folgenden in Alignmentform angegeben. Doppelt unterstrichene Aminosäuren stellen Konsensus-Aminosäuren dar und einfach unterstrichene Aminosäuren stellen signifikante Homologie zur Konsensussequenz dar.
Ergebnisse mit der zweiten Peptiddisplaybibliothek, die im Hinblick auf deren Aminosäurerepertoire partiell beschränkt ist, ergab eine Reihe von Klonen, die an C-34 ohne irgendein Auftreten der Mimotopkonsensussequenz SEQ ID NO: 38 binden. Die Reihe klonierter Sequenzen aus der zweiten Bibliothek ist in Alignmentform im folgenden angegeben. SEQ ID NO: 22 ist die native Sequenz von GPIb-alpha von Aminosäure 484 bis 499 und sie stellt eine mögliche natürliche Epitopsequenz dar, die durch die aus der zweiten Bibliothek isolierten Klone gezeigt wurde. Das Zeichen ' stellt potentielle Chymotrypsinspaltungsstellen dar. Wie oben stellen doppelt unterstrichene Aminosäuren die mögliche native Sequenz (SEQ ID NO: 22) innerhalb dieser zweiten Bibliothek dar und einfach unterstrichene Aminosäuren signifikante Homologie zur möglichen nativen Sequenz dar.
C34b-Reihe gegen GPIb 484-499
Die folgenden klonierten Sequenzen wurden ebenfalls von der zweiten Peptiddisplaybibliothek erhalten:
Vergleich der Konsensussequenz mit nativen Sequenzen
Beträchtliche Bemühungen wurden aufgewendet, um zu versuchen, die Konsensussequenz des obigen Peptids (SEQ ID NO: 38) mit nativen Sequenzen innerhalb von GPIb-alpha oder anderen bekannten Proteinen in der Swiss Protein- oder NCBI-Datenbank in Beziehung zu setzen. Keine derartige Beziehung wurde ermittelt. Diese Sequenz stellt daher ein "Mimotop" dar – d.h. ein Peptid, das ein natives Epitop (eine Bindungsstelle für einen monoklonalen Antikörper) nachahmt, trotz des Mangels einer offensichtlichen Homologie auf der Ebene der primären Aminosäuresequenz (für Mimotope siehe Motti et al. 1994, Larocca et al. 1992, Lenstra et al. 1992, Balass et al. 1993, Hobart et al. 1993 und Luzzago et al. 1993). Wie nach der Betrachtung der obigen SEQ ID NO: 1-21 und 26 in der Übersicht festgestellt wurde, scheinen nicht alle selektierten Klone Teil dieser Konsenusgruppe zu sein, und es ist möglich, dass mit einer weiteren Sequenzierung Schlüssel im Hinblick auf das native Epitop abgeleitet werden können.
Durch Verwendung der zweiten Peptiddisplaybibliothek, die im Hinblick auf deren Aminosäurerepertoire partiell beschränkt ist, wurde eine weitere Reihe von Klonen ("C34b"-Reihe), die an C-34 ohne Auftreten der Mimotopkonsensuspeptide banden, erhalten. Nach der Sequenzierung dieser Klone wurde eine FASTA-Analyse (Pearson und Lipman 1988, Pearson 1990) an dieser Gruppe von Klonen durch Bewegen eines 7-Aminosäuren-Fensters längs der Sequenz von GPIbalpha durchgeführt, wobei jedesmal eine Aminosäure weitergegangen wurde und die Gruppenpunktezahl als Funktion der Position in dem GPIb-alpha-Molekül bestimmt wurde.
Die Ergebnisse bieten allgemein keine zwingenden Übereinstimmungen im Sinne einer Konsensusentwicklung zwischen den Klonen. Jedoch ist die mögliche native GPIb-alpha-Sequenz, die durch diese Analyse angezeigt wurde, durch SEQ ID NO: 22 dargestellt.
Aggregationsuntersuchungen
Humanes plättchenreiches Citrat-Plasma (PRP) wurde durch Standardverfahren hergestellt (Miller et al. 1983). Zur Untersuchung der C-34-Neutralisation durch ein Mimotoppeptid wurden 350 μl PRP, das 150 000 Plättchen/μl enthielt, 10 min bei 22 °C mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 20 μg/ml C-34-mab oder 20 μg/ml C-34, das zuvor 30 min bei 22 °C mit variierenden Peptidkonzentrationen inkubiert worden war, inkubiert. Das PRP wurde dann auf 37 °C gebracht und mit 1200 Umin^–1 in einem Chrono-Log Lumi-Aggregometer (Chrono-Log Corporation, Havertown, PA) gerührt. Die Aggregation wurde durch Zugabe von 1 mg/ml Ristocetin (Helena Laboratories, Beaumont, TX) initiiert. Zum Screening von Bakteriophagenklonen, die potentielle Antimimotoppeptide zeigten, wurden 150 μl PEG/NaCl-gefällter Phage mit 250 μl Citrat-PRP 1 h bei 22 °C inkubiert, in das Aggregometer überführt, wonach Ristocetin mit einer Endkonzentration von 0,8 mg/ml zugesetzt wurde. Die Untersuchung des Hemmvermögens synthetischer Peptide auf vWF-abhängige Plättchenaggregation wurde durch Präinkubation von 150 μl variierender Verdünnungen eines Peptids, das in PBS, pH 6,0, gelöst war, während 2-4 h bei 22 °C mit 250 μl formalinfixierter (Macfarlane et al. 1975) Plättchen (1,5 × 10⁵/ml), anschließendes Erwärmen des Gemischs auf 37 °C in dem Aggregometer, Zugabe von gereinigtem vWF (Miller et al. 1983) (1 U/ml) und Initiieren der Aggregation durch die Zugabe von 0,9 mg/ml Ristocetin durchgeführt.
Synthetisiertes Peptid
Ein Peptid, das die Konsensussequenz (SEQ ID NO: 38) umfasste, wurde chemisch synthetisiert (Genosys Biotechnologies, The Woodlands, Texas). Das synthetisierte Peptid wies eine Aminosäuresequenz auf, die SEQ ID NO: 1: AWNWRYREYV entsprach. Eine Modifikation dieses Peptids mit einem Biotin, das am aminoterminalen Alanin befestigt war, (N-Hydroxysuccinimidhexansäure-langkettiger-Abstandshalterarm-Biotinylierung) wurde ebenfalls synthetisiert. 1 mg des chemisch synthetisierten biotinylierten Peptids wurde in 1 ml Wasser, das 20 μl DMSO enthielt, gelöst. Da C-34 mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml ein wirksamer Inhibitor einer Ristocetin-induzierten Aggregation in plättchenreichem Citrat-Plasma (PRP) ist, wurde die Wirksamkeit des synthetischen Peptids durch Untersuchen, ob das Peptid die Hemmaktivität von C-34 in dieser Einstellung neutralisieren konnte, festgestellt. Demgemäß wurden etwa 10 μg C-34 bei 22 °C 30 min mit variierenden Konzentrationen eines Test- oder Kontrollpeptids inkubiert, worauf das Gemisch zu PRP in einem Endvolumen von etwa 0,5 ml weitere 10 min bei 22 °C gegeben wurde. Wie aus den erhaltenen Aggregationskurven ersichtlich ist (1-7), neutralisierte das synthetisierte Peptid das C-34 vollständig, wobei eine halbmaximale Neutralisation des C-34 bei etwa 1,0 μg/ml, was etwa 0,55 μM für das biotinylierte Peptid ist, erhalten wurde. Ein ähnliches Muster der C-34-Antikörperneutralisation wurde beobachtet, wenn die nicht-biotinylierte Form des Peptids (der SEQ ID NO: 38) verwendet wurde, mit einer halbmaxima len Neutralisation bei etwa 3,0 μM. Das (native oder biotinylierte) Peptid selbst induzierte keine Plättchenaggregation noch schien es nichtspezifische Wirkungen insofern aufzuweisen, als es keinen Einfluss auf eine ADP-induzierte Aggregation hatte.
Genauer gesagt, zeigt 1 die Ristocetin-induzierte vollständige Aggregation von Plättchen in Gegenwart von von-Willebrand-Faktor. 2 zeigt die Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation von Plättchen durch 20 μg/ml mab C-34. Die 3-7 zeigen variierende Grade einer Neutralisation der Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation von Plättchen durch 20 μg/ml von mab C-34 in Gegenwart von 0,14, 0,27, 0,55, 1,1 und 2,3 μM des synthetischen biotinylierten Peptidmimotops der SEQ ID NO: 1. In 3 neutralisieren 0,14 μM des Peptids die C-34-Hemmung nicht; in 7 neutralisieren 2,3 μM des Peptids die C-34-Hemmung vollständig und die 4-6 zeigen variierende Neutralisationsgrade der C-34-Hemmung.
Weitere Verwendung des synthetisierten Peptids
Das chemisch synthetisierte Peptid kann an Rinderserumalbumin konjugiert und zur Bildung von polyklonalen Antikörpern in Kaninchen verwendet werden. Standardverfahren können zur Immunisierung der Kaninchen und zur Gewinnung von Serum, wie im folgenden beschrieben, verwendet werden. Polyklonaler Antikörper kann auf dessen Fähigkeit zur Bindung an normale Plättchen sowie an die Wildtyp- und Valin-233-Mutantenformen von rekombinantem GPIb-alpha getestet werden. Für einen polyklonalen Antikörper, der eine Bindung hoher Affinität an Plättchen zeigt, können dann funktionale Untersuchungen unternommen werden. Diese Untersuchungen umfassen Adhäsion, Aggregation, Agglutination und vWF-Bindung. F(ab)'₂- und Fab-Fragmente des poly klonalen Antikörpers können hergestellt werden, wenn eine sterische Hinderung eine genaue Beurteilung speziellerer modulierender Wirkungen des Antikörpers zu verhindern scheint (Becker und Miller 1989, Kupinski und Miller 1986 und Miller et al. 1986). Ein polyklonaler Antikörper für das synthetische Peptid, der eine mit einer erhöhten oder verringerten Affinität zur Bindung von vWF verbundene Konformation erkennt oder stabilisiert, kann mit ≥ 95 Reinheit erhalten und an Rinderserumalbumin oder ein anderes Trägerprotein zur Produktion muriner monoklonaler Antikörper konjugiert werden.
Produktion von Antikörpern gegenüber synthetisierten Peptiden
Mäuse: Die Produktion monoklonaler Antikörper kann unter Verwendung von BALB/c-Mäusen durchgeführt werden. Die Immunisierung der B-Zellenspendermäuse kann die Immunisierung derselben mit Antigenen, die mit TiterMax^TM-Adjuvans gemischt sind, wie im folgenden umfassen: 50 μg Antigen/20 μl Emulsion × 2 Injektionen, die durch intramuskuläre Injektion in jede Hinterflanke am Tag 1 gegeben werden. Blutproben können durch Schwanzblutentnahmen an den Tagen 28 und 56 zur Überprüfung der Titer durch ELISA-Assay genommen werden. Beim Spitzentiter (üblicherweise am Tag 56) können die Mäuse Euthanasie durch CO₂-Inhalation unterzogen werden, wonach Splenektomien durchgeführt werden können und Milzzellen zur Herstellung von Hybridomen durch Standardverfahren geerntet werden können.
Kaninchen: Polyklonale Antikörper können in New Zealand White Rabbits gebildet werden. Präimmunserum kann von Kaninchen, die mit Ketamin/Rompun (Ketamin-HCl mit 20 mg/kg IM und Xylazin-HCl mit 4 mg/kg IM) sediert wurden, über die Ohrarterie gewonnen werden. Zehn bis fünfzehn Prozent des Gesamtblutvolumens können bei jeder Blutentnahme gewonnen werden. Das Haar über dem Ohr kann mit einer 40er Klinge abrasiert, mit 70%-igem Alkohol abgewischt werden und ein steriles Butterfly Nr. 22 kann zur Blutsammlung verwendet werden. Das Antigen kann mit entweder RIBI-Adjuvans oder TITER-MAX^TM-Adjuvans gemischt und nach den Vorschriften des Herstellers verwendet werden. Der Rücken kann dann rasiert, mit 70%-igem Alkohol abgewischt werden und eine sterile Nadel Nr. 25 mit dem Antigen/Adjuvans-Gemisch in dieser kann zur subkutanen und intramuskulären Verabreichung gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet werden. Immunserumproben können gemäß der Beschreibung für Präimmunproben gewonnen werden. Wenn ausreichende Titer erreicht sind, kann das Tier mit Natriumpentobarbital (60 mg/kg BW) über die laterale Ohrvene anästhesiert werden, bis eine tiefe Anästhesie erreicht ist. Blut kann unmittelbar über kardiale Punktur in Kunststoffzentrifugenröhrchen gewonnen und gerinnen lassen werden; danach kann das Blut zentrifugiert und das Serum abgesaugt und bei –70 °C eingefroren werden. Zur Euthanasie kann das Kaninchen, während es unter Natriumpentobarbital-Anästhesie mit einer Dosierung von 60 mg/kg steht, über kardiale Punktur ausgeblutet werden.
Entwicklung von C-34-Antimimotoeptiden
Das Mimotopdekapeptid selbst wurde dann als Sonde zur Suche nach "Antimimotop"-Peptiden verwendet. Insbesondere kann, obwohl eine Zahl von Peptiden mit einem Teil des in Lösung freigelegten Mimotoppeptids interagieren kann, ein "Antimimotop"-Peptid als eines definiert werden, das nicht nur in mehreren Biopanningrunden selektiert wurde, sondern das auch ein gewisses Maß funktionaler Interaktion mit dem nativen Epitop ergab, wodurch es dem ursprünglichen monoklonalen Antikörper ähnelt. Wie in 8 gezeigt ist, zeigte ein einziger Klon von 46 Bakteriophagenklonen, die gereinigt und anschließend getestet wurden, Hemmaktivität über dem Hintergrundniveau in einem funktionalen Plättchenassay. Dieser "Antimimotop"-Klon zeigte die Sequenz der SEQ ID NO: 94: RHVAWWRQGV – deren carboxylterminale Hälfte zu den Resten 230-234 von GPIb-alpha mit nur einer konservativen (Lys → Arg) Substitution am Rest 231 identisch ist. (Siehe die GPIb-alpha-Sequenz von 225-237 [SEQ ID NO: 101] und die GPIb-alpha-Sequenz von 225-234 [SEQ ID NO: 173: ENVYVWQKGV]). Von den 57 einzelnen Sequenzen, die schließlich bestimmt wurden, zeigten 5 weitere Sequenzen variierende Grade einer Strukturhomologie, die im folgenden gezeigt sind. Weitere Antimimotopsequenzen umfassten auch die folgenden:
Weitere Untersuchungen wurden mit dem chemisch synthetisierten Peptid der SEQ ID NO: 94: RHVAWWRQGV unternommen. Dieses Dekapeptid war zur vollständigen Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation mit einem IC₅₀-Wert, der zwischen 200 und 400 μg/ml lag, fähig (9). Eine (Gly Val)-Substitution an Position 9 (SEQ ID NO: 104), die der in PT-vWD beobachteten Mutation entsprach, verringerte den IC₅₀-Wert leicht, obwohl eine nahezu vollständige Hemmung erneut bei 715 μg/ml beobachtet wurde. Um der nativen Struktur dichter nahezukommen, wurden dann Peptide mit einer (Arg → Lys)-Substitution an Position 7 untersucht. Wie in 10 gezeigt ist, wurde ein drastischerer Unterschied zwischen den Gly- und Val-Formen der Lys-haltigen Peptide beobachtet. Während das RHVAWWKQVV (SEQ ID NO: 105)-Peptid wirksame Hemmaktivität beibehielt, war das RHVAWWKQGV (SEQ ID NO: 106)-Peptid unfähig, mehr als eine leichte Hemmung auszuüben, mit Ausnahme bei den höchsten getesteten Konzentrationen. Schließlich wurden sowohl das Wildtyp-GPIbalpha-228-237-Peptid (SEQ ID NO: 108), das Gly am Rest 233 enthielt, als auch die PT-vWD-Variante mit Gly an dieser Position ersetzendem Val (SEQ ID NO: 107) synthetisiert. Wie in 11 gezeigt ist, war das Peptid des Wildtyps tatsächlich ohne Hemmaktivität. Im Gegensatz dazu war das Peptid, das der PT-vWD-Mutante entsprach, zur vollständigen Hemmung von Ristocetin-induzierter Aggregation mit einem IC₅₀-Wert von etwa 400 μg/ml fähig. Lyophilisierte Peptide wurden in PBS, pH-Wert 6,0, und 150 μl variierenden Verdünnungen, die 2-4 h bei 22 °C mit 250 μl formalinfixierten Plättchen (1,5 × 10⁵/ml) inkubiert wurden, rekonstituiert, bevor eine Aggrometrie durchgeführt wurde, wobei auf die Zugabe von 1 U/ml gereinigtem vWF die Zugabe von 0,9 mg/ml Ristocetin folgte.
Dreidimensionale Beschreibung von Mimotop/Antimimotop
Die 12a-12c zeigen die vorgeschlagene dreidimensionale Beschreibung von Mimotopen und Antimimotopen. In 12a ist die Region innerhalb der extrazellulären Domäne von Plättchen-Glykoprotein-1b-alpha, die das ursprüngliche Epitop 10 enthält, das zur Erkennung des monoalen Antikörpers C-34 fähig ist, angegeben. 12b zeigt die Struktur des Mimotoppeptids 12, das das ursprüngliche Epitop (10, das in 12a gezeigt ist) im dreidimensionalen Raum nachahmt, ohne die primäre Aminosäuresequenz des ursprünglichen Epitops zu teilen. Das Mimotoppeptid 12 erkennt ebenfalls oder bindet an den monoalen Antikörper C-34.
12c erläutert die Struktur des Mimotoppeptids 12 in Bezug auf die Struktur des Antimimotoppeptids 14. Die Antimimotoppeptidsequenz ist komplementär zur Vorderseite des Mimotoppeptids im dreidimensionalen Raum, wie dies der monoale Antikörper C-34 zum ursprünglichen Epitop war (siehe 12a).
Epitopkartierungsuntersuchungen von mab SZ-2
Epitopkartierungsuntersuchungen wurden ebenfalls unter Ver wendung des monoalen Antikörpers SZ-2 durchgeführt. Die Wahl des mab SZ-2 (Ruan et al. 1987) erfolgte, da bekannt ist, dass dessen Epitop innerhalb der 45-kDa-Region von GPIb-alpha liegt (Fox et al. 1988, Molino et al. 1993); wobei das Epitop wahrscheinlich relativ konformationsunabhängig ist, da SZ-2 stark an GPIb-alpha, Glykocalicin oder das GPIb-alpha-45-kDa-Fragment, das in SDS vor der Übertragung auf Nitrocellulose denaturiert wurde, blottet (Molino et al. 1993); und es kann ein weit verbreitetes Interesse an der Epitoplokalisierung dieses mab bestehen, da er im Handel erhältlich ist und in einer breiten Vielzahl von Forschungsstudien und klinischen Studien weltweit verwendet zu werden scheint.
Die ausbalancierte 10-mer-Zufallspeptiddisplaybibliothek wurde mit SZ-2 verwendet. Nach entweder zwei oder drei Biopanningrunden mit Immunscreening in der dritten Runde wurden Bakteriophagene sequenziert und die gebildeten vorhergesagten Peptidsequenzen auf Konvergenz mit einem klar geschnittenen Muster, das erhofftermaßen innerhalb der ersten 300 Aminosäuren des reifen GPIb-alpha-Moleküls enthalten ist, analysiert. Die erhaltenen gezeigten Sequenzen wurden mit dem verfügbaren Satz von Glykoproteinsequenzen, von denen bekannt ist, dass sie auf der Plättchenoberfläche existieren, die GPIa, GPIb-alpha, GPIbβ, GPIIb, GPIIIa, GPIV, GPIX umfassen, und dem Plättchen-FCgamma₂-Rezeptor verglichen.
Die überzeugendste Entsprechung mehrerer Phagensequenzen zu einer natürlichen Plättchensequenz kann eher zu Resten des Plättchen-FCgamma₂-Rezeptors statt GPIb-alpha auf der Basis der folgenden Beobachtungen bestehen: Erstens zeigen zwar GCG FASTA- und WORDSEARCH-Analysen von Phagensequenzen, die mit den Resten 1-300 von GPIb-alpha verglichen wurden, mehrere begünstigte Ähnlichkeitsregionen, doch gibt es immer noch keine einzige kurze Strecke von Aminosäuren in dem nativen Molekül, die in überzeugender Weise als offensichtliche Übereinstimmung hervortritt. Zweitens wurden unter Verwendung der ersten 50 e, für die hoch gereinigte PEG-Präzipitate hergestellt und titriert wurden, ELISA-Assays durchgeführt, wobei die Bindung von Phagen an biotinyliertes SZ-2 die anschließende Bindung des SZ-2 an immobilisiertes Glykocalicin hemmt. Nur einer der 50 e, die die Sequenz der SEQ ID NO: 83: WHWRSSWKSG zeigen, erwies sich zur vollständigen Neutralisation von SZ-2 fähig und kein anderer dann verfügbarer Klon kam im Hinblick auf das Neutralisationsvermögen auch nur nahe. Dieser Klon schien jedoch kein offensichtliches konvergentes Muster der Reihe von en darzustellen, noch ergab er eine stärkere Übereinstimmung mit Sequenzen innerhalb von GPIb-alpha als andere dann verfügbare Klone. In einer computergestützten Analyse der anderen Plättchenoberflächenproteine trat diese Sequenz jedoch insofern hervor, als sie die höchste FASTA-Punktbewertung für die im folgenden angegebene Region des Plättchen-FCgamma₂-Rezeptors aufwies, wo sie als das zweite Peptid in einer vorgeschlagenen Konsensussequenzliste angegeben ist. Mehrere weitere e wurden sequenziert, die das als erstes in der Reihe gezeigte Peptid – SEQ ID NO: 84: HRPLSWKGRA – ergaben. Es ist anzumerken, dass dieses Peptid auch die SWK-Sequenz aufweist, jedoch zusätzlich ein R drei Reste der Aminoseite entfernt zu dem SWK aufweist.
Im folgenden ist die an dem Plättchen-FCgamma₂-rezeptorkartierte Konvergenzsequenz in der Sequenz innerhalb von GPIb-alpha angegeben, die mit dem vorgeschlagenen Konsensussatz am engsten übereinstimmt.
Obwohl bevorzugte Ausführungsformen hierin detailliert angegeben und beschrieben werden, ist dem Fachmann auf dem relevanten Gebiet offensichtlich, dass verschiedene Modifikationen, Additionen, Substitutionen und dgl. ohne Abweichen vom Umfang der Erfindung, die in den folgenden Ansprüchen definiert ist, durchgeführt werden können.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Peptid mit der Fähigkeit zur Bindung an oder funktionalen Nachahmung einer Bindungsstelle für einen monoklonalen Antikörper, wobei der monoale Antikörper ein Epitop innerhalb des humanen Plättchen-Glycoprotein-Ib/IX-Komplexes erkennt, wobei der monoklonale Antikörper die Bezeichnung C-34 hat, und wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
Fragment des isolierten Peptids nach Anspruch 1, wobei das Fragment die Bindungsstelle für den monoalen Antikörper C-34 funktional nachahmt oder zur Bindung an den monoalen Antikörper C-34 fähig ist.
Fragment nach Anspruch 2, wobei das Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, die SEQ ID NO. 38: WNWRYREYV entspricht.
Isoliertes Molekül mit der Fähigkeit zur Bindung an das Peptid nach Anspruch 1, wobei das Molekül ein zweites Peptid umfasst, wobei das zweite Peptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
In-vitro-Verfahren zur Modulation der Adhäsion, Aggregation oder Agglutination von Plättchen, wobei das Verfahren die Selektion von Plättchen und das Einwirken des Moleküls nach Anspruch 4 auf die Plättchen umfasst, wodurch die Interaktion des von-Willebrand-Faktors mit Plättchen über den Glycoprotein-Ib/IX-Rezeptor beeinflusst wird und die Adhäsion, Aggregation oder Agglutination der Plättchen moduliert wird.
Verwendung des Moleküls nach Anspruch 4 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Modulation der Adhäsion, Aggregation oder Agglutination von Plättchen, wobei Plättchen ausgewählt werden und das Medika ment auf diese einwirken gelassen wird, wodurch die Interaktion des von-Willebrand-Faktors mit Plättchen über den Glycoprotein-Ib/IX-Rezeptor beeinflusst wird und die Adhäsion, Aggregation oder Agglutination der Plättchen moduliert wird.
Molekül nach Anspruch 4 zur Verwendung in der Medizin.