JP2001511111A - ヒト血小板糖タンパクＩｂ／ＩＸのミモトープおよび抗−ミモトープ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒト血小板糖タンパクＩｂ／ＩＸ複合体内のエピトープを認識するモノクローン抗体に対する結合部位を機能的に模倣する単離されたペプチドに関する。このペプチドはミモトープと呼ばれる。本発明はこのペプチド、すなわち、ミモトープに結合することができる単離された分子をも提供する。この分子は抗体、第２のペプチド、炭水化物、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または他の天然のまたは化学的に合成された分子であることができる。この単離された分子は抗−ミモトープと呼ばれる。モノクローン抗体Ｃ−３４およびＳＺ−２に対する結合部位を模倣するミモトープ、並びにＣ−３４ミモトープに対する抗−ミモトープが具体的に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト血小板糖タンパクＩｂ／ＩＸの ミモトープおよび抗−ミモトープ 本出願は１９９５年、３月１７日に出願された米国特許出願第０８／４０６， ３３０号の一部継続出願であり、その内容は参照により本明細書にインコーポレ ートされる。 発明の分野 本発明はヒト血小板糖タンパクＩｂ／ＩＸ複合体内のエピトープを認識するモ ノクローン抗体（すなわち、ミモトープ(mimotope)）の結合部位を機能的に模倣 することができるペプチドに関する。そしてこのペプチド（すなわち、抗−ミモ トープ）に結合することができる単離された分子に関する。 本発明の背景 本明細書を通じ、様々な文献を多くは括弧書きで参照する。これらの文献の完 全な引用は詳細な説明の終わりに提供する。これらの文献の開示はそっくりその まま本明細書に参照によりインコーポレートされる。 フォン・ウイルブラント因子（ｖＷｆ）に対する血小板糖タンパクＩｂ／ＩＸ （ＧＰＩｂ／ＩＸ）受容体はＧＰＩｂ（１６０ｋＤａ ）とＧＰＩＸ（１７ｋＤａ）の間の非共有結合会合における１：１ヘテロダイマ ー複合体（デューら１９８７）より成ると信じられている。ＧＰＩｂは今度はジ スルフィド結合した１４０ｋＤａのα鎖（ＧＰＩｂ・α）と２２ｋＤａのβ鎖（ ＧＰＩｂ・β）とから成っている（フィッツジェラルドおよびフィリップス１９ ８９）。 ＧＰＩｂ／ＩＸ複合体は血液血小板上の主要な膜貫通受容体複合体の一つであ り（ロート１９９１、ロペス１９９４、クレメツォンおよびクレメツォン１９９ ５）、フォン・ウイルブラント因子（ｖＷｆ）−依存性の血小板接着を媒介する 。血小板型フォン・ウイルブラント病（ＰＴ−ｖＷＤ）と呼ばれるヒト常染色体 の優性出血病は高レベルに調節されたＧＰＩｂ／ＩＸ受容体の天然に生ずるモデ ルを表している（ミラーおよびカステラ１９８２、ミラーら１９８３）。この疾 患では、化学的調節物質であるリストセチンの異常に低い濃度でもｖＷｆとＧＰ Ｉｂ／ＩＸの相互作用を促進することができる。さらに、このような患者の血小 板は正常な血小板に要求されるよりも低い剪断力で凝集する（ムラタら１９９３ ）。ＰＴ−ｖＷＤ患者の血縁の一人がＧＰＩｂ・α鎖の残基２３３におけるグリ シンのバリンへの置換をもたらす１個の点突然変異を持つことが発見された（ミ ラーら１９９１）。非常に近い近所で第２の点突然変異（残基２３９におけるメ チオニンのバリンへの置換（ラッセルおよびロート１９９３、タカハシら１９９ ５））がＰＴ−ｖＷＤ表現型を表すさらに二人の血縁者について記述された（ワ イスら１９８２、タカハシ１９８０）。 １９８０年代に、ミラーらはｖＷｆに対するＧＰＩｂ／ＩＸ複合体受容体に対 する一連のモノクローン抗体（ｍａｂ）を開発した。 特に、モノクローン抗体Ｃ−３４は詳細に性質決定がなされ、ｍａｂＣ−３４が 血小板糖タンパクＩｂ／ＩＸ複合体内のエピトープを認識することが決定された （ミラーら１９９０）。この研究およびその後の研究でミラーらはモノクローン 抗体Ｃ−３４、ＡＳ−２およびＡＳ−７がフォン・ウイルブラント因子に依存す る正常血小板のリストセチンに誘発される凝集の強い阻害剤であることを示した 。ミラーらは３種のモノクローン抗体すべてに対するエピトープがＧＰＩｂ／Ｉ Ｘ複合体の内部にあることをも示した。ミラーらはＡＳ−２およびＡＳ−７に対 するモノクローン抗体結合部位をＧＰＩｂ・αのアミノ末端の４５ｋＤａに局在 化することができた。Ｃ−３４に対するエピトープは最近チャイニーズハムスタ ー卵巣細胞の表面上で発現したＧＰＩｂ・α鎖の細胞外部分に局在化された（チ ェムバーズら１９９５）。Ｃ−３４がウエスタン・ブロットで変性ＧＰＩｂ・α に結合できなかったこと（ワードおよびバーント１９９５、クレメツォンおよび ハグリー１９９５）、またはＣ−３４が様々な実験条件の下で血小板から取り出 したＧＰＩｂ・αの細胞外領域と免疫沈降することができなかったこと（ミラー ら１９９０）はＣ−３４により認識されるエピトープが高度にコンホーメーショ ン依存性であることを強く示唆する。しかしながら、最近、ワードとバーントは¹²⁵ Ｉ標識グリコカリチン（glycocalicin）の精製分子のトリプシンの消化後の １・Ｈｉｓ−Ａｒｇ・２９３のアミノ末端断片とＣ−３４との免疫沈降に今度は 成功したと報告した（ワードおよびバーント１９９５）。 様々なモノクローン抗体に対する結合部位を確定しようとする試みはエピトー プライブラリーの開発をもたらした。パームリおよび スミスは外来エピトープをその表面に表示することができるバクテリオファージ 発現ベクターを開発した（パームリおよびスミス１９８８）。このベクターを使 用すれば、事実上考えられるすべての短いペプチド（例えば、６−アミノ酸）を 含み得るバクテリオファージの大きなコレクションを構築することができよう。 彼らも特異的抗体を用い外来エピトープを表示するファージをアフィニティ精製 する方法であるバイオパンニング（biopanning）を開発した（パームリおよびス ミス１９８８、クゥイラら１９９０、スコットおよびスミス１９９０、クリスチ ャンら１９９２、スミスおよびスコット１９９３を参照）。 エピトープライブラリーの開発の後、スミスらは、次に、バクテリオファージ 発現ベクターおよびパームリおよびスミスのバイオパンニング法を使用すれば所 与の長さの考えられる全ての配列からエピトープを同定することが可能となるは ずだと示唆した。これはエピトープライブラリーをバイオパンニングすることに より抗体に対するペプチドリガンドを同定するというアイデアに導き、これは次 いでワクチン設計、エピトープマッピング、遺伝子の同定、そして他の多くの応 用に使用することができるであろう（パームリおよびスミス１９８８、スコット １９９２）。 エピトープライブラリーおよびバイオパンニングを用いて、エピトープ配列を 研究している研究者はその代わりにエピトープを模倣したペプチドは発見した、 すなわち、連続した線状の天然の配列とは同一でない配列または天然のタンパク 配列内には必然的にはほとんど生じない配列である。これらの模倣性のペプチド はミモトープ と呼ばれる。このようにして、タンパクに対し様々な結合部位のミモトープが発 見された。ラロッカら（１９９２）はヒト胸上皮ムチン・タンデム反復のミモト ープを大腸菌で発現した。バラスら（１９９３）はアセチルコリン受容体のコン ホーメーション依存性の結合部位を模倣するヘキサペプチドを同定した。ホバー トら（１９９３）はＣ６エピトープ（補体の第６成分に対するエピトープ）を模 倣するミモトープを単離した。 これらのミモトープの配列は、定義により、連続した線状の天然の配列または いずれにしても天然に生ずる分子、すなわち、天然に生ずるタンパクの中で必然 的に起こる配列とは同一ではない。ミモトープの配列は天然に生ずるタンパクの 結合部位を機能的に模倣するペプチドを単に形成する。例えば、バラスら（１９ ９３）のミモトープはアセチルコリン受容体の結合部位を模倣する。 これらのミモトープの多くは、短いペプチドである。容易に大量合成できそし て天然に生ずる配列（すなわち、結合部位）を模倣することができる短いペプチ ドの入手可能性により、大きな潜在的応用の途が開ける。 従って、有用なミモトープを解明する必要が継続して存在する。 発明の概要 この必要性は本発明のミモトープにより満たされる。このように して本発明はヒト血小板糖タンパクＩｂ／ＩＸ複合体内のエピトープを認識する モノクローン抗体に対する結合部位を機能的に模倣する単離されたペプチドを提 供する。この単離されたペプチドはミモトープである。モノクローン抗体がペプ チドに結合することができるならば、そのペプチドはそのモノクローン抗体に対 する結合部位を機能的に模倣する。 本発明はさらに、このペプチドに結合することができる単離された分子を提供 する。この分子は、例えば、抗体、第２のペプチド、炭水化物、ＤＮＡ分子、Ｒ ＮＡ分子、または化学的に合成された分子であることができる。この単離された 分子は抗−ミモトープである。受容体に結合する抗−ミモトープはその受容体の 機能的活性を媒介するために使用することができる。 本発明は、このようにして、血小板の接着、集合(aggregation)、または凝集( agglutination)を調節する方法をも提供する。これらの現象はそれぞれ、糖タン パクＩｂ／ＩＸ複合体受容体を通じて血小板とフォン・ウイルブラント因子との 相互作用に依存している。この方法は、血小板の接着、集合、または凝集を調節 するために血小板を上記の分子（抗−ミモトープ）に接触させる。 本発明はさらにモノクローン抗体Ｃ−３４に結合することができる単離された ペプチドを提供し同時にこのようなペプチドに結合することができる単離された 分子をも提供する。また、血小板をこの分子（抗−ミモトープ）に接触させるこ とにより血小板の接着、集合、または凝集を調節する方法を提供する。 好ましい態様では、モノクローン抗体Ｃ−３４に結合することができる単離さ れたペプチドは配列番号：３８、ＷＮＷＲＹＲＥＹＶに対応するアミノ酸配列を 含んでいる。 本発明はさらに、モノクローン抗体ＳＺ−２に結合することができる単離され たペプチド並びにこのペプチドに結合することができる単離された分子を提供す る。また、この分子（抗−ミモトープ）に血小板を接触させることにより血小板 の接着、集合、または凝集を調節する方法を提供する。 図面の簡単な説明 本発明のこれらのそして他の特徴と長所は好ましい態様に関する下記の詳細な 説明を下記の図面と関連付けて読むことから明らかとなる。 図１はフォン・ウイルブラント因子の存在下においてリストセチンに誘導され た血小板の完全な集合を例示する。 図２はモノクローン抗体Ｃ−３４の２０μｇ／ｍｌによるリストセチン誘導血 小板集合の阻害を例示する。 図３は配列番号：１のＡＷＮＷＲＹＲＥＹＶを持つ合成ペプチド・ミモトープ の０．１４μＭの存在下においてもｍａｂＣ−３４の２０μｇ／ｍｌによる血小 板のリストセチン誘導集合の継続する阻害を例示する。 図４は配列番号：１のＡＷＮＷＲＹＲＥＹＶを持つ合成ペプチド・ミモトープ の０．２７μＭの存在下におけるｍａｂＣ−３４の２０μｇ／ｍｌによる血小板 のリストセチン誘導集合の阻害の部分的中和を例示する。 図５は配列番号：１のＡＷＮＷＲＹＲＥＹＶを持つ合成ペプチド・ミモトープ の０．５５μＭの存在下におけるｍａｂＣ−３４の２０μｇ／ｍｌによる血小板 のリストセチン誘導集合の阻害の部分的中和を例示する。 図６は配列番号：１のＡＷＮＷＲＹＲＥＹＶを持つ合成ペプチド・ミモトープ の１．１μＭの存在下におけるｍａｂＣ−３４の２０μｇ／ｍｌによる血小板の リストセチン誘導集合の阻害の部分的中和を例示する。 図７は配列番号：１のＡＷＮＷＲＹＲＥＹＶを持つ合成ペプチド・ミモトープ の２．３μＭの存在下におけるｍａｂＣ−３４の２０μｇ／ｍｌによる血小板の リストセチン誘導集合の阻害の完全中和を例示する。 図８は抗−ミモトープバクテリオファージの候補クローンの機能スクリーニン グを例示する。示されたバクテリオファージクローンの１５０μｌをクエン酸化 されたＰＲＰ２５０μｌと共に２２℃で１時間インキュベートした後、３７℃で 攪拌しながらリストセチン０．８ｍｇ／ｍｌの添加により集合を開始させた。 図９〜図１１はホルマリン固定血小板のリストセチン誘導集合に対する合成ペ プチドの効果を例示する。そして 図１２ａ〜図１２ｃは血小板糖タンパクＩｂ・αにおける構造的相関関係を探 るために使用したミモトープおよび抗−ミモトープの図式的スケッチである。 詳細な説明 本発明はヒト糖タンパクＩｂ／ＩＸ複合体内のエピトープを認識するモノクロ ーン抗体に対する結合部位を機能的に模倣する単離されたペプチドを提供する。 このペプチドはミモトープと呼ばれる。 一つの好ましい態様では、モノクローン抗体はＣ−３４と名付けられ、そして このペプチドには下記のものより成る群から選択されるアミノ酸配列が含まれる 。 これらのペプチドとしては、配列番号：３８のＷＮＷＲＹＲＥＹＶというコン センサス配列に対応するアミノ酸配列を含むことが最も好ましい。 これらのペプチドはそれぞれ配列番号：１〜２１、配列番号：２３〜３７、配 列番号：３９〜７５および配列番号：７７〜８１により表されるが、これらはｍ ａｂＣ−３４に対するＧＰＩｂ／ＩＸ内の結合部位を模倣する。このようにして ｍａｂＣ−３４はこれらのペプチドのそれぞれと結合する。しかしながら、これ らのペプチドそれぞれの配列はＧＰＩｂ／ＩＸ複合体のどの鎖（すなわち、ＧＰ Ｉｂ・α、ＧＰＩｂ・β、ＧＰＩＸ）の中の連続した線状天然配列とも同一でな く、これらの鎖に必然的に生じるものでは全くない。このように、これらのペプ チドはｍａｂＣ−３４の結合部位を模倣しているのであり、従って、ミモトープ である。本発明のペプチドにはＣ−３４などのモノクローン抗体に対する結合部 位を機能的に模倣する能力を保持している上に例示したペプチドの断片も含まれ る。配列番号：３８に対応するアミノ酸配列を持つペプチドはそのような断片の １例であり、それは配列番号：１に対応するアミノ酸配列を含むペプチドの断片 である。 別の態様では、モノクローン抗体はＳＺ−２と命名される。このペプチドには 下記のものより成る群から選択されるアミノ酸配列が含まれる。 これらのペプチドはそれぞれ、配列番号：８３〜９３、配列番号：７６、配列 番号：８２、および配列番号：１０９〜１５６により表され、ｍａｂＳＺ−２に 対するＧＰＩｂ／ＩＸ内の結合部位を模倣する。ｍａｂＳＺ−２はこのようにし てこれらのペプチドのそれぞれに結合する、従ってこれらのペプチドはミモトー プということができる。本発明のペプチドには、上に例示したペプチドの断片で あってモノクローン抗体ＳＺ−２に対する結合部位を機能的に模倣する能力を保 持するものは含まれる。 本発明によれば、モノクローン抗体（その結合部位が本発明のペプチドにより 模倣されている、すなわち、Ｃ−３４またはＳＺ−２）はヒト糖タンパクＩｂ／ ＩＸ複合体内のエピトープを認識する。 本発明はこのペプチドに結合することができる単離された分子をも提供する。 この単離された分子は抗−ミモトープと呼ばれる。抗−ミモトープ分子は、例え ば、抗体、第２のペプチド、炭水化物、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または化学的 に合成された分子などの如何なる適当な分子であることもできる。ミモトープに 結合することができるこのようなペプチド、タンパク、または他の生物学的、合 成的、または半合成的分子は、ミモトープに対する抗体を産生させることにより 、バクテリオファージ・ライブラリー、化学的ライブラリー、ハイブリドーマ細 胞ライブラリー、またはミモトープ配列に対し高い親和性を持つと思われる１セ ットまたはサブセットの分子を創りだす他のタイプのライブラリー、細胞、また は化学的合成から選択することにより、またはミモトープ配列に対し高い親和性 を持つと思われる分子をコンピュータの助けまたは他の理論的取り組みを用いて 設計することにより同定することができる。適当な抗−ミモトープはペプチドミ モトープに結合することができる核酸のイン・ビトロの展開を用いて開発するこ ともできる（ジョイス１９９４を参照）。 一つの態様では、本発明の抗−ミモトープは、下記のものより成る群から選択 されるアミノ酸配列を含むペプチドを構成要素とする。 これらの特定の抗−ミモトープペプチドはモノクローン抗体Ｃ−３４に対する 結合部位を模倣するミモトープに対して創られた。 このような抗−ミモトープはアンチトロンビン薬として役立つことができよう 。例えば、ｍａｂＣ−３４のＧＰＩｂ／ＩＸに対する結合はリストセチン−誘導 血小板集合を阻害する。ミモトープペプチドはＧＰＩｂ／ＩＸの結合部位を模倣 し、そして抗−ミモトープ分子はミモトープペプチドに結合する。従って、ペプ チドであり得る抗−ミモトープはミモトープペプチドをそれ自体相補するはずで ある。そのようなものとして、抗−ミモトープは血小板糖タンパクＩｂ／ＩＸ複 合体内のｍａｂＣ−３４またはｍａｂＳＺ−２の元のエピトープに結合すること ができる筈であり、それによりｍａｂＣ−３４またはｍａｂＳＺ−２がするのと 同様な効果、すなわち、フォン・ウイルブラント因子に依存する血小板のリスト セチン−誘導集合の阻害を誘発する。 本発明はこのようにして、血小板の接着、集合、または凝集を調節する方法を 提供する。この方法は血小板を選択する工程、そしてその血小板を本発明の抗− ミモトープ分子に接触させる工程を含んで成るものである。そのような接触は糖 タンパクＩｂ／ＩＸ受容体を介するフォン・ウイルブラント因子と血小板の相互 作用に影響を与え、それにより血小板の接着、集合、または凝集を調節する。 本発明はモノクローン抗体Ｃ−３４に結合することができる単離されたペプチ ド、すなわち、下記のものより成る群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチ ドを提供する。 さらに、上記のペプチドのいずれかの断片であって、モノクローン抗体Ｃ−３ ４に結合する能力を保持している断片が提供される。そのような断片としては、 配列番号：１の断片である配列番号：３８が例示される。 本発明はまた、上記のペプチド、抗−ミモトープとしても知られているペプチ ドに結合することができる単離された分子を提供する。適当な分子としては、抗 体、別のペプチド、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、炭水化物、または化学的に合 成された分子が挙げられる。 上記のように、本発明はこうして血小板の接着、集合、または凝集を調節する 方法を提供する。この方法は血小板を選択する工程および血小板を抗−ミモトー プ分子に接触させる工程を含んで成る。このような接触は糖タンパクＩｂ／ＩＸ 受容体を介する血小板とフォン・ウイルブラント因子の相互作用に影響を与え、 それにより血小板の接着、集合、または凝集を調節する。 一つの好ましい態様では、本発明はモノクローン抗体Ｃ−３４に結合すること ができかつ配列番号：３８：ＷＮＷＲＹＲＥＹＶに対応するアミノ酸配列を含む 単離されたペプチドを提供する。 本発明はさらに、モノクローン抗体SZ−２に結合することができる単離された ペプチドであって、下記のものより成る群から選択されるアミノ酸配列を含むペ プチドを提供する。 さらに、上記のペプチドのいずれかの断片であって、モノクローン抗体ＳＺ− ２に結合する能力を保持する断片を提供する。本発明は上記のペプチドに結合す ることができる単離された分子（抗−ミモトープ）をも提供し、そして血小板を この抗−ミモトープ分子に接触させることにより血小板の接着、集合、または凝 集を調節する方法をも提供する。 本発明をさらに以下に詳細に説明する。Ｃ−３４エピトープ ミラーら（１９９０）により報告されたように、血小板糖タンパクＩｂのα鎖 における突然変異２３０・ＷＫＱ（Ｇ→Ｖ）₂₃₃Ｖ・２３４のための雑種形成に よる血小板型フォン・ウイルブラント病（ＰＴ−ｖＷＤ）を患う患者由来の血小 板をネズミモノクローン抗体の生産のための免疫原として使用した。一つのその ようなモノクローン抗体であるＣ−３４は患者の血小板または正常な血小板のリ ストセチン誘導集合を阻害したが、他の凝集剤により誘導される集合は阻害しな かった。交差免疫電気泳動により明らかにされたように、モノクローン抗体Ｃ− ３４はＧＰＩｂ／ＩＸ複合体内のエピトープを認識した。新鮮な血小板について の間接的免疫蛍光研究では、４種の異なる抗−ＧＰＩｂモノクローン抗体比は相 互に、正常人および患者の両者に対し共にほとんど１（０．８８〜１．１４）で あった。対照的に、モノクローン抗体Ｃ−３４のそのようなモノクローン抗体（ ＡＰ−１）に対する結合の比は正常な血小板に対し０．３１±０．０２（平均値 ±ＳＥ）でありそして患者の血小板に対しては０．５４±０．０１まで有意に増 加した（ｐ＜０．００１）。³Ｈ−標識された血小板のＮＰ−４０溶解液につい ての免疫沈降では、モノクローン抗体Ｃ−３４の飽和濃度がＡＳ−２または他の 抗−ＧＰＩｂモノクローン抗体が作るよりも遙かに微弱なバンドを形成した。他 の抗−ＧＰＩｂモノクローン抗体とは対照的に、Ｃ−３４はＧＰＩｂの¹²⁵Ｉ− 標識化グリコカリチン断片の精製標品にまたは交差−免疫電気泳動により同定さ れたグリコカリチン誘導体には結合しなかった。トリプシンまたはキモトリプシ ン消化に付し た³Ｈ−標識化血小板の免疫沈降研究では、Ｃ−３４は、モノクローン抗体ＡＳ −２またはモノクローン抗体ＡＳ−７により免疫沈降されたＧＰＩｂ・αのグリ コカリチン断片をも、アミノ−末端４５ｋＤａ断片をも同一視しなかった。 こうして、３種の独立の技術（完全な血小板の放射標識化およびこれらの糖タ ンパクのその後のタンパク分解酵素による消化に続く血小板糖タンパクの免疫沈 降、放射標識化精製グリコカリチンの免疫沈降、血小板糖タンパクの交差免疫電 気泳動）（ミラーら１９９０）を用いて、Ｃ−３４はＧＰＩｂ／ＩＸ複合体内の エピトープと認識するが、このエピトープはグリコカリチン内には存在するよう には見えないことが明らかにされた。 これらの研究はモノクローン抗体ＡＳ−２およびＡＳ−７をＧＰＩｂ・αの４ ５ｋＤａ領域にエピトープマッピングすることに成功した比較的単純な方法を報 告したが、本研究はモノクローン抗体Ｃ−３４がグリコカリチンのどの単一のト リプシンまたはキモトリプシンドメインにもマップされ得ないことを明らかにし た。さらに、モノクローン抗体Ｃ−３４は、ＧＰＩＸを認識するモノクローン抗 体のものに類似の免疫沈降パターンを生じない。バクテリオファージ表示ライブラリーでのモノクローン抗体Ｃ−３４のバイオパ ニング スコットとスミス（１９９０）は、無差別に合成されたペプチド挿入物をバク テリオファージに使用することによるペプチドリガンドを明らかにする方法を提 出した。関連する方法がクゥイラら（１ ９９０）およびデブリンら（１９９０）により出版された。この時以来、元のヘ キサペプチド挿入物およびそれ以上の大きな挿入物の両方がモノクローン抗体に より認識されるエピトープを同定する際に使用された文献が現れた。この技術は ＧＰＩｂ／ＩＸとして知られる血小板ｖＷＦ受容体内の重要なエピトープの検出 のためには大きな可能性を秘めている。本明細書に開示された研究はモノクロー ン抗体Ｃ−３４に焦点を絞っているが、本明細書においてモノクローン抗体Ｃ− ３４に対し開示された方法によりＧＰＩｂ／ＩＸ内の結合部位（エピトープ）を 有する他のモノクローン抗体にも適用することができる。 アルベルタ、カナダのブルース マルコム博士からの十分にバランスのとれた デカペプチド（１０−マー）ライブラリー（クリスチャンら１９９２により記載 されたもの）およびクロンテック・ラボラトリーズ（パロ アルト、ＣＡ）から のドデカペプチド（１２−マー）ライブラリーを使用した。ドデカペプチドライ ブラリーでは、各コドンの最初の二つの位置にアデノシンが現れる頻度が減少し ているため、１文字略号により示すと次のアミノ酸の出現が低いという特徴を生 じている。すなわち、Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、およびＥである。 これらのライブラリーは両方とも、バクテリオファージの小成分ウイルス・コー トタンパクｐIIIに融合した無差別デカペプチド（または修飾された−無差別ド デカペプチド）と共に、合成オリゴヌクレオチドの混合物の挿入により、融合物 ５ベクター(Fuse 5 vector)（スコットおよびスミス１９９０）の中に構築され た。ライブラリーはそれぞれ約３×１０⁸の独立のクローンの複雑さを持ちそし て１０¹²〜１０¹⁴／ｍｌの力価を有して いた。マルコム・ライブラリーは部分的デカペプチド・ライブラリーを構成する にすぎないが、それはヘキサペプチドとしては完全である。 これらのライブラリーを使用するための戦略は、ほとんどスコット（１９９２ ）によって最近著された総説に従っており、そしてスミスとスコット（１９９３ ）により最近記述されたこの系の使用のための詳細な方法論を修正して採用する 。本明細書で用いられた戦略は以下に記すようなものである。 具体的には、バイオパニングの第１ラウンドで、６０ｍｍのストレプトアビジ ン被覆ペトリ皿をブロック溶液（０．５％ＢＳＡ、０．１ＭのＮａＨＣＯ₃、０ ．１μｇ／ｍｌストレプトアビジン、０．２％ＮａＮ₃）で２時間満たし、次い でＴＢＳ−０．５％トゥイーンで３回洗浄する。次に、ビオチン化モノクローン 抗体の１μｇと共に４℃で一晩インキュベートされたライブラリー（約１×１０¹¹ ファージ）の１μｌをＴＢＳ−トゥイーンの１ｍｌで希釈し、そしてこの混合 物をついでペトリ皿に加えて室温で１５分間揺り動かす。このペトリ皿をＴＢＳ −トゥイーンで１０回洗浄し、そして結合したファージを０．１ＮのＨＣｌ（グ リシンでｐＨ２．２に調整）−１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡの８００μｌをピペッティ ングすることによりこの皿中に溶出させる。この溶出液をついでそのｐＨを約８ まで上げるため２Ｍトリスの４８μｌを含むミクロフュージ箇中にピペットする 。 この溶出液を濃縮しそしてアミコン・セントリコン−３０フィル ター（アミコン・インク、ビバリー、ＭＡ）を用いてＴＢＳ中で２回洗浄する。 この最終産物について、濃縮された溶出液の少量からＴＢＳ−０．１％ゼラチン 中に希釈し、そして作られた各希釈液の１μｌを１９μｌのＴＢＳ−ゼラチンに 加え、次いで飢餓させたＫ９１大腸菌細胞の２０μｌを加えそして室温で１０分 間インキュベートすることにより力価検定を行う。０．２μｇ／ｍｌのテトラサ イクリン（Ｔｃ）を含むＮＺＹ培地２００μｌを添加しそして３７℃で１時間イ ンキュベートした後、この混合物を４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＮ ＺＹ寒天プレート上に蒔き、そして３７℃で一晩成長させる。 力価検定をした後、バイオパニングの第１ラウンドから得た濃縮溶出液全体（ 約５０μｌ）を新鮮な飢餓Ｋ９１細胞の等量に添加し、そしてスミスおよびスコ ット（１９９３）により記述されたように増幅を行う。最初のＰＥＧ／ＮａＣｌ 沈澱に続き、得られるペレットを１ｍｌのＴＢＳに溶解する。ついで、ファージ をＰＥＧ／ＮａＣｌで２回沈澱させ、少なくとも１時間４℃に放置し、続いて４ ℃で遠心分離して沈殿物を集める。その上清をすべて慎重に除去した後、ペレッ トを１００μｌのＴＢＳに溶解する。この増幅された産物について次に力価を検 定する。 バイオパニングの第１ラウンドの結果は５×１０^-7％の収率を生ずる。第２回 目のバイオパニングもビオチン化Ｃ−３４の１μｇと１×１０¹¹ファージを用い て４×１０^-3％の収率を得る。バイオパニングの第２ラウンドは第１ラウンドの 場合と同様に濃縮しそして増幅する。第３ラウンドでは、０．０１μｇのビオチ ン化Ｃ−３４ を２．５×１０¹¹ファージに対してバイオパニングし、結果として３×１０^-4％ の収率を得た。第３ラウンドはペトリ皿から結合ファージを溶出した後中止する 。この溶出液を濃縮せず増幅もしない。力価検定を各ラウンドの前と後に行い、 そして収率％を最初のバクテリオファージ数に対する溶出画分で得られたバクテ リオファージの数の比として計算する（クリスチャンら１９９２）。収率は一般 にバックグラウンドを越え１０^-5よりも大きくなるはずであり、典型的には１０^-4 から１０^-1の値が観察される。バイオパニングの次のラウンドの収率％が増加 することは、特に、親和性の増加したクローンが選択されていることを示唆する 。 ミモトープペプチド（配列番号：１：ＡＷＮＷＲＹＲＥＹＶ）に結合するペプ チドの発見に向けられた研究のために、元のデカペプチド・ライブラリーに対す る２ラウンドのバイオパニングが行われた。第１ラウンドではビオチン化ミモト ープペプチドの１μｇを用いそして第２ラウンドでは０．０１μｇを用いた。得 られた収率はそれぞれ３×１０^-6％および２×１０^-3％であった。 実験の一部では、約５００穴−分離コロニーを含むＮＺＹ＋Ｔｃ寒天プレート を用いて、クリスチャンら（１９９２）により記述されたように免疫学的スクリ ーニング試験を行うことができる。このコロニーをニトロセルロース膜フィルタ ー（バイオラド・ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、ＣＡ）に移し、そしてフィ ルターを直ちにＴＮＴ緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａ Ｃｌ、０．０５％トゥイーン２０）で２回洗浄し、ＴＮＴ緩衝液中の２０％正常 ヤギ血清中で穏和に攪拌しながら室温で３０分間ブロ ックし、次いでブロック用緩衝液中に１：１０００倍希釈した第１モノクローン 抗体中で室温で２時間インキュベートする。このフィルターを逐次的に洗浄する 。各洗浄はそれぞれ室温で１０分間で、緩衝液Ａ（ＴＮＴ緩衝液＋０．１％ＢＳ Ａ）での洗浄、緩衝液Ｂ（ＴＮＴ緩衝液＋０．１％ＢＳＡ＋０．１％ＮＰ−４０ ）での洗浄、そして次いで再び緩衝液Ａでの洗浄であり、ついで第２のペルオキ シダーゼ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧの中で１〜１／２時間室温でインキュベー トする。このフィルターを前のように洗浄し、次いでＴＮ（１０ｍＭのトリス、 ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で最終の洗浄を行う。発色はフィルターを ＡＢＴＳ基質中に置いた後に観察する。 次いで、個々のコロニーの小さな培養を、ａ）免疫学的スクリーニングで陽性 であったコロニーを選択すること、またはｂ）スクリーニング工程を飛ばし無差 別にコロニーを選択（約１００個）することのいずれかにより、一晩成長させる 。各コロニーを２０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＮＺＹ培地２ｍｌ中に接 種し、そしてこれらの小さな培養を激しく攪拌しながら３７℃で一晩成長させる 。次の日培養物を遠心分離し細胞をペレットにし、上清を除去する。次いで、こ の上清１ｍｌに１５０μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌを添加しそしてファージを４℃で 一晩沈澱させる。次の遠心分離そして上清を除去した後、ペレットを１ｍｌのＴ ＢＳに溶解する。 ＤＮＡ配列決定のために、溶解したペレット４００μｌをフェノールで１回抽 出し、そして得られる水相（約３００μｌ）を５００μｌのＴＥおよび８０μｌ の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に添加する 。次いで、エタノール１ｍｌを添加し、一本鎖ＤＮＡを４℃で一晩沈澱させる。 ついで各試料を４℃で３０分間ミクロフュージ(microfuge)し、このＤＮＡペレ ットを７０％エタノールで１回洗浄し、乾燥し、そして７μｌの水に再懸濁する 。この鋳型は使用するまで−２０℃で貯蔵することができる。 挿入領域の両側にある極めてＧＣリッチなＳｆｉＩクローン部位により（クリ スチャンら１９９２）、配列決定反応はシークエナーゼ７−デアザｄＧＴＰ・Ｄ ＮＡシークエンシング・キット（アマシャム−ＵＳ・バイオケミカルズ、アーリ ントン・ハイツ、ＩＬ）を用い、³²Ｐ−ｄＡＴＰおよび挿入部位のほぼ４０ヌク レオチド３’側に位置するアンチセンスプライマー（プライマーは配列番号：１ ００：５’−ＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’を持つ）を使用して 行う。ＩＢＩ・ＳＴＳ４５シークエンシング装置（イーストマン・コダック社、 ロチェスター、ＮＹ）を使用して、試料を標準の６％シークエンシングゲル上に 流す。 ＧＣＧソフトウエア（ジェネティクス・コンピュータ・グループ・インク、マ ジソン、ＷＩ）はコンセンサス配列を探すために多種のクローンから得られる配 列を整列させるのに助けになる。結合部位を探している新規なモノクローン抗体 の場合には、そしてモノクローン抗体Ｃ−３４の場合でさえも、ＧＰＩｂ・αの 中だけでなく、ＧＰＩｂ・β、ＧＰＩＸの中、そして実際、入手可能なデータベ ース（スイス・プロット、ゲン・バンク、ＥＭＢＬ、その他）に寄託されている 他の血小板タンパクの中の配列を調査することは興味があることは確かである。 実際、この分析は特定のモノクローン抗 体のエピトープがＧＰＩｂ／ＩＸ複合体の多重成分から構成されており、従って 空間的に近接しているに違いないということを示唆する重要な新規の情報を与え てくれることもある。 この点で、ＥＬＩＳＡ試験は、クローンの数が多いときは、個々のクローンを 評価するために使用することができる。簡単に述べると、２回のＰＥＧ沈澱を受 け、続いて力価検定のために調整されたファージをビオチン化モノクローン抗体 と共に一晩インキュベートし、続いてモノクローン抗体−ファージ混合物を予め ホルマリン固定血小板（またはモノクローン抗体により認識される他の適当な固 定化標的）で被覆されたミクロタイタープレートの穴に加えることができる。一 連の洗浄工程の後、アビジン−ペルオキシダーゼを添加し、穴を再度洗浄し、発 色原基質を添加し、そして最後に穴をＥＬＩＳＡプレート・リーダー上で読みと る。この試験でシグナル強度の相対的減少はさらに研究するための最も有望なク ローンに関する指標を与える。このようにして同定されたコンセンサスペプチド は化学的に合成し元の抗体に結合する能力について決定される。ついで、この抗 体に対する高い結合親和性を示すペプチドをマウスおよび／またはウサギの免疫 原として使用することができる。モノクローン抗体Ｃ−３４のエピトープマッピング研究 上に論じた二つのファージ表示ライブラリーをモノクローン抗体Ｃ−３４を用 いるマッピング研究で採用した。バランスのとれた１０−マーペプチドライブラ リーで得られた結果はバイオパニングの２ラウンドまたは３ラウンドの後に選択 されたクローンの中の強いコンセンサスの形成に関して極めて決定的であった。 ９−マー配列 、配列番号：３８：ＷＮＷＲＹＲＥＹＶに対する明らかなコンセンサスがあるば かりでなく、アミノ末端のアラニンを持つこの配列（配列番号：１）を含む１０ −マーペプチドはバイオパニングにおいて最大の選択用の長所を持つように見え た。それはこの配列を持つクローンが最も高頻度で発見されたからである。 一連のクローニングされた配列は以下の形に整列して記述する。 二重の下線はコンセンサスアミノ酸を表し、そして一本の下線を付したアミノ酸 はこのコンセンサスに顕著なホモロジーを示すものである。 そのアミノ酸レパートリにおいて部分的に制限されている第２のペプチド表示 ライブラリーで得られた結果は、ミモトープ・コンセンサス配列、配列番号：３ ８の外観を全く持たないでＣ−３４に結合する一連のクローンを明らかにした。 第２のライブラリーから得られたこの一連のクローニングされた配列には下記に 配列した形が含まれている。配列番号：２２はＧＰＩｂ・αのアミノ酸４８４か ら４９９までの天然の配列であり、そして第２のライブラリーから単離されたク ローンにより明らかにされたおそらく天然のエピトープ配列を表している。’は キモトリプシン切断の可能性のある部位を表す。上記のように、二重下線はこの 第２のライブラリーの中の天然のものと思われる配列（配列番号：２２）を表し 、そして一本下線を付したアミノ酸は天然のものと思われる配列に顕著なホモロ ジーを示している。 下記のクローニングされた配列も第２のペプチド表示ライブラリーから得られ たものであった。 コンセンサス配列と天然の配列との比較 上記のペプチド（配列番号：３８）のコンセンサス配列とスイス・プロテイン またはＮＣＢＩデータバンク中のＧＰＩｂ・αまたは他の既知のタンパクの中の 天然の配列とを関連付けようとする試みに相当の努力が払われた。そのような関 係は発見されなかった。この配列は、従って、「ミモトープ」、すなわち、一次 的アミノ酸配列レベルでは見掛けのホモロジーが欠如するにもかかわらず、天然 のエピトープ（モノクローン抗体に対する結合部位）を模倣するペプチドを表し ている（ミモトープについては、モッティら１９９４、ラロッカら１９９２、レ ンストラら１９９２、バラスら１９９３、ホバートら１９９３、およびルッツァ ゴら１９９３を参照）。上記の配列番号：１〜２１および配列番号：６６を精査 すれば気が付くように、選択されたクローンの全てがこのコンセンサスグループ の一部であるようには見えない、そして天然エピトープに関するさらなる配列の 手掛かりについて前進することが可能である。 そのアミノ酸レパートリが一部制限されている第２のペプチド表示ライブラリ ーを使用することにより、ミモトープ・コンセンサス・ペプチドの外観なしにＣ −３４に結合する別の一連のクローン（ 「Ｃ−３４ｂ」シリーズ）が得られた。これらのクローンの配列決定の後、この グループのクローンについてＦＡＳＴＡ分析（ピアソンおよびリップマン１９８ ８、ピアソン１９９０）を行った。この分析はＧＰＩｂ・αの配列に沿って７− アミノ酸ウインドウを動かし、一時に１個のアミノ酸を進め、そしてＧＰＩｂ・ α分子中の位置の関数としてグループスコアを決定することにより行う。 その結果は、一般に、クローン内のコンセンサス形成という意味での強い調和 を与えるものではない。しかしながら、この分析により明らかにされた天然のＧ ＰＩｂ’・α配列と思われる配列は配列番号：２２により表される。 集合研究 クエン酸添加のヒト血小板リッチな血漿（ＰＲＰ）は標準的方法で調製した（ ミラーら１９８３）。ミモトープペプチドによるＣ−３４中和の研究のために、 １５０，０００血小板／μｌを含むＰＲＰ３５０μｌをリン酸緩衝化生理食塩水 （ＰＢＳ）、Ｃ−３４モノクローン抗体２０μｇ／ｍｌ、または種々の濃度のペ プチドと予め２２℃で３０分間インキュベートしておいたＣ−３４の２０μｇ／ ｍｌと共に２２℃で１０分間インキュベートした。ついでこのＰＲＰを３７℃に 加温しそしてクロノ−ログ・ルミ−アグレゴメーター（クロノ−ログ・コーポレ ーション、ハバータウン、ＰＡ）中で１２００ｒｐｍで攪拌した。集合は１ｍｇ ／ｍｌのリストセチン（ヘレナ・ラボラトリーズ、ボーモント、ＴＸ）の添加に より開始した。潜在的抗−ミモトープペプチドを表示するバクテリオファージク ローンのスクリーニングのために、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈澱させた ファージ１５０μｌをクエン酸添加ＰＲＰ２５０μｌと共に２２℃で１時間イン キュベートし、アグレゴメーターに移し、その後にリストセチンを最終濃度が０ ．８ｍｇ／ｍｌになるように添加した。ｖＷＦ−依存性血小板集合に対する合成 ペプチドの阻害能力の研究は、ｐＨ６．０のＰＢＳに溶解した種々の希釈度のペ プチド１５０μｌをホルマリン固定（マクファーランら１９７５）血小板（１． ５×１０⁵／ｍｌ）と共に２２℃で２〜４時間プリインキュベートし、その後こ の混合物をアグレゴメーター中で３７℃まで加温し、精製したｖＷＦ（ミラーら １９８３）（１Ｕ／ｍｌ）を添加し、そして０．９ｍｇ／ｍｌリストセチンの添 加により集合を開始させることにより行った。 合成されたペプチド コンセンサス配列（配列番号：３８）を含むペプチドを化学的に合成した（ゲ ノシス・バイオテクノロジーズ、ウッドランド、テキサス）。この合成されたペ プチドは配列番号：１：ＡＷＮＷＲＹＲＥＹＶに対応するアミノ酸配列を持って いた。このペプチドのアミノ末端のアラニンにビオチンを結合させた修飾化合物 （Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・ヘキサン酸長鎖スペーサーアーム・ビオチン 化）も合成した。化学的に合成されたビオチン化ペプチド１ｍｇを２０μｌのＤ ＭＳＯを含む水１ｍｌ中に溶解した。最終濃度２０μｇ／ｍｌでＣ−３４はクエ ン酸添加血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）中でのリストセチン誘導集合の強力な阻害 剤であり、この合成ペプチドの強さはこの条件の下でペプチドがＣ−３４の阻害 活性を中和することができるか否かを試験することにより評価された。従って、 種々の濃度の供試ペプチドまたは対照ペプチドと共にＣ−３４の約 １０μｇを２２℃で３０分間インキュベートし、その後に混合物をＰＲＰに最終 容量が約０．５ｍｌになるように添加し、２２℃でさらに１０分間インキュベー トした。その結果得られる集合曲線（図１〜７）から見られるように、この合成 ペプチドはＣ−３４を完全に中和し、約１．０μｇ／ｍｌでＣ−３４の１／２最 大中和を生じ、これはビオチン化ペプチドの場合約０．５５μＭである。Ｃ−３ ４抗体中和の同様のパターンが、ペプチドの非ビオチン化型（配列番号：３８を 持つもの）を使用したときに観察され、１／２最大中和が約３．０μＭであった 。このペプチド（元のものまたはビオチン化されたもの）それ自体は血小板集合 を誘導せず、またＡＤＰ−誘導集合に影響を与えない限り、非特異的効果を持つ ようには見えなかった。 より具体的には、図１はフォン・ウイルブラント因子の存在下における血小板 のリストセチン誘導完全集合を示す。図２はモノクローン抗体Ｃ−３４の２０μ ｇ／ｍｌによる血小板のリストセチン誘導集合の阻害を示す。図３〜７は血小板 のリストセチン誘導集合のモノクローン抗体Ｃ−３４の２０μｇ／ｍｌによる阻 害の、配列番号：１を持つ合成ビオチン化ペプチドミモトープの０．１４、０． ２７、０．５５、１．１、および２．３μＭの存在下におけるそれぞれの中和の 種々の程度を示す。図３では、このペプチドの０．１４μＭはＣ−３４の阻害を 中和しない。図７では、このペプチドの２．３μＭはＣ−３４阻害を完全に中和 し、そして図４〜６はＣ−３４阻害の種々の程度の中和を示す。 合成ペプチドの別の使用 化学的に合成されたペプチドはウシ血清アルブミンに結合させることができ、 そしてウサギでポリクローン抗体を高めるために使用することができる。標準的 手順を用いてウサギを免疫化し、以下に述べるように血清を集めることができる 。ポリクローン抗体は正常な血小板に並びに組換えＧＰＩｂ・αの野生型および バリン２３３突然変異型に結合するその能力についてテストすることができる。 血小板に結合する高い親和性を示すポリクローン抗体に対しては、次いで機能の 研究をすることができる。これらの研究には、接着、集合、凝集、およびｖＷＦ 結合が含まれる。立体障害がこの抗体のより具体的な調節効果の正確な評価を妨 げているように見えるときは、ポリクローン抗体のＦ（ａｂ）’₂およびＦａｂ 断片を作成することができる（ベッカーおよびミラー１９８９、クピンスキーお よびミラー１９８６、およびミラーら１９８６）。ｖＷＦに結合する親和性の増 強または低下に関連するコンホーメーションを認識したりまたは安定化する、合 成ペプチドに対するポリクローン抗体を９５％以上の純度で得ることができ、そ してウシ血清アルブミンまたは別の担体タンパクに結合させてネズミのモノクロ ーン抗体の生産に使用することができる。 合成ペプチドに対する抗体の生産 マウス： モノクローン抗体生産はＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて行うことがで きる。Ｂ−細胞ドナーマウスの免疫化はそれらを以下のようにタイターマックス^TM アジュバントと混合した抗原で免疫化することを含むことができる。すなわち 、１日目に、後横腹のそれぞれに５０μｇ抗原／２０μｌエマルジョン×２注射 を筋肉内注射により投与する。２８日目および５６日目に血液試料を尾部採血に より抜き出し、ＥＬＩＳＡ試験により力価をチェックする。力価のピーク時に（ 通常５６日）、マウスをＣＯ₂吸入で麻酔をかけることができ、その後に脾摘出 を行うことができ、そして脾臓細胞を収穫し標準的方法でハイブリドーマの調製 を行う。 ウサギ： ニュージーランド白ウサギ中でポリクローン抗体を生産させること ができる。耳の動脈を介してケタミン／ロムプン（２０ｍｇ／ｋｇＩＭでケタミ ン塩酸塩および４ｍｇ／ｋｇＩＭでキシラジン塩酸塩）で鎮静化したウサギから 予め免疫化した血清を集めることができる。全血容積の１０〜１５％を各採血時 に集めることができる。耳の上の毛は＃４０クリッパーブレードで剃り、７０％ アルコールで拭き、そして滅菌２２ゲージ・バターフライを用いて血液を集める ことができる。この抗原をＲＩＢＩアジュバントまたはタイターマックス^TMアジ ュバントと混合し、製造業者の指示に従って使用することができる。次いで、背 中を剃り、７０％アルコールで拭き、そして抗原／アジュバント混合物の入った 滅菌２５ゲージ針を用いて製造業者の推奨するように皮下および筋肉内に投与す ることができる。免疫血清試料を予め免疫された試料について記述されたように 集めることができる。十分な力価に達したとき、動物の後部耳血管を介して深い 麻酔がかかるまでペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔 を掛けることができる。心臓穿刺を介してプラスチック遠心分離管中に血液を直 ちに集めそして凝固させることができる。その後、この血液を遠心分離し、血清 を吸引して−７０℃で凍結させることができる。安楽死のために、６０ｍｇ／ｋ ｇの投与量でペントバルビタールナトリウム麻酔下にウサギを心臓穿刺を介して 瀉血することができる。Ｃ−３４抗−ミモトープペプチドの開発 次いで、ミモトープデカペプチドそれ自体をプローブとして用いて「抗−ミモ トープ」ペプチドの探索を行った。具体的には、幾つかのペプチドが溶液中で接 触したミモトープペプチドのある部分と相互作用するかも知れないけれども、「 抗−ミモトープ」ペプチドはバイオパニングの数ラウンドで選択されるものであ るばかりでなく、天然のエピトープとの機能的相互作用のある尺度をも提供し、 それにより元のモノクローン抗体に似るものとして定義されるであろう。図８に 示すように、精製され続いてテストされた４６のバクテリオファージクローンの 中の１個のクローンが機能的血小板試験でバックグラウンドレベルを越える阻害 活性を示した。この「抗−ミモトープ」クローンは配列番号：９４：ＲＨＶＡＷ ＷＲＱＧＶを持つ配列を示した。この配列はそのカルボキシ末端半分はＧＰＩｂ ・αの残基２３０〜２３４と同一であり、残基２３１に保存性（Ｌｙｓ→Ａｒｇ ）置換だけを有していた。（ＧＰＩｂ・α配列の２２５〜２３７（配列番号：１ ０１）およびＧＰＩｂ・α配列の２２５〜２３４（配列番号：１７３：ＥＮＶＹ ＶＷＫＱＧＶ）を参照）。最終的に決定された５７のユニーク配列の中で、さら に５個の配列が以下に示すように種々の程度の構造的ホモロジーを示した。以下 のものには付加的な抗−ミモトープ配列も含まれている。 配列番号：９４：ＲＨＶＡＷＷＲＱＧＶを有する化学的に合成されたペプチド についてさらに研究が行われた。このデカペプチドはリストセチン−誘導集合を 完全に阻害することができた。そのＩＣ₅₀は２００〜４００μｇ／ｍｌの間に生 じた（図９）。９位における一つの置換（Ｇｌｙ→Ｖａｌ）（配列番号：１０４ ）、これはＰＴ−ｖＷＤで観察された突然変異に対応するものであるが、これが ほとんど完全な阻害は再び７１５μｇ／ｍｌで見られたが、このＩＣ₅₀を僅かに 下げた。天然の構造にもっと近く接近させるために、７位に一つの置換（Ａｒｇ −Ｌｙｓ）を持つペプチドを次に研究した。図１０に示すように、Ｌｙｓ含有ペ プチドのＧｌｙ型とＶａｌ型の間により劇的な相違が観察された。ペプチドＲＨ ＶＡＷＷＫＱＶＶ（配列番号：１０５）は強い阻害活性を保持していたが、ペプ チドＲＨＶＡＷＷＫＱＧＶ（配列番号：１０６）はテストされた最高濃度を除き 僅かな阻害しか示すことができなかった。最後に、残基２３３にＧｌｙを含む野 生型ＧＰＩｂ・αの２２８〜２３７ペプチド（配列番号：１０８）およびこの位 置のＧｌｙをＶａｌに置換しているＰＴ−ｖＷＤ変異型（配列番号：１０７）の 両方を合成した。図１１に示すように、この野生型ペプチドは実際に阻害活性を 持たなかった。対照的に、ＰＴ−ｖＷＤ変異体に相当するペプチドは約４００μ ｇ／ｍｌのＩＣ₅₀でリストセチン誘導集合を完全に阻害することができた。アグ レゴメトリー（凝集度測定）の前に、凍結乾燥したペプチドをｐＨ６．０のＰＢ Ｓ中で再構成し、そして種々の希釈度の１５０μｌを２５０μｌのホルマリン− 固定血小板（１．５×１０⁵／ｍｌ）と共に２２℃で２〜４時間インキュベート した。アグレゴメトリーは１Ｕ／ｍｌの精製ｖＷＦを添加しその後に０．９ｍｇ ／ｍｌのリストセチンを添加して行った。ミモトープ／抗−ミモトープの三次元的記述 図１２ａ〜１２ｃはミモトープおよび抗−ミモトープの提案された三次元的記 述を示す。図１２ａでは、モノクローン抗体Ｃ−３４を認識することができる元 のエピトープ１０を含む血小板糖タンパクＩｂ・αの細胞外ドメイン内の領域を 示す。図１２ｂはミモトープペプチド１２の構造を示す。これは元のエピトープ のアミノ酸一次配列を共有せず、元のエピトープ（図１２ａに示す１０）を三次 元空間で模倣している。このミモトープペプチド１２はモノクローン抗体Ｃ−３ ４を認識し、またはそれに結合する。 図１２ｃは抗−ミモトープペプチド１４の構造との関連でミモトープペプチド １２の構造を例示する。抗−ミモトープペプチド配列は、モノクローン抗体Ｃ− ３４が元のエピトープに対してそうであったように、三次元空間でミモトープペ プチドの表面に相補的である（図１２ａを参照）。 モノクローン抗体ＳＺ−２のエピトープマッピング研究 エピトープマッピング研究はモノクローン抗体ＳＺ−２を用いても行った。モ ノクローン抗体ＳＺ−２（ルアンら１９８７）を選択したのは、そのエピトープ がＧＰＩｂ・αの４５ｋＤａ内にあることが知られており（フォックスら１９８ ８、モリノら１９９３）、ＳＺ−２がニトロセルロースに移す前にＳＤＳで変性 させたＧＰＩｂ・α、グリコカリチンまたはＧＰＩｂ・α４５ｋＤａ断片に強く ブロットするのでこのエピトープが比較的コンホーメーションに依存しないよう であり（モリノら１９９３）、そしてこのモノクロー ン抗体が市販されておりそして広範かつ多様な基礎的研究および臨床的研究にお いて世界中で使用されているように見えるからこのモノクローン抗体のエピトー プの位置決定には広範囲の関心があるからである。 良くバランスのとれた、１０−マーの無差別ペプチド表示ライブラリーをＳＺ −２について使用した。２または３ラウンドのバイオパニングの後、その第３ラ ウンドでは免疫スクリーニングを行ったが、バクテリオファージクローンの配列 決定を行い、そしてその結果予言されたペプチド配列を、成熟ＧＰＩｂ・α分子 の最初の約３００アミノ酸の中に含まれると希望する明確なパターンに収斂させ るため分析した。得られた表示配列を血小板表面に存在することが知られている 入手可能な一連の糖タンパク配列、例えば、ＧＰＩａ、ＧＰＩｂ・α、ＧＰＩｂ ・β、ＧＰIIｂ、ＧＰIIIａ，ＧＰIV、ＧＰIX、および血小板ＦＣγ₂受容体など と比較した。 多重ファージ配列と天然の血小板配列との最も確かな対応は、ＧＰＩｂ・αの 残基とよりも血小板ＦＣγ₂受容体の残基とであり得る。これは以下の観察に基 づく。すなわち、第一に、ＧＰＩｂ・αの残基１〜３００と比較したときのファ ージ配列のＧＣＧ ＦＡＳＴＡ分析およびワードサーチ（ＷＯＲＤＳＥＡＲＣＨ ）分析は幾つかの好ましい領域での類似性を確かに示すが、明確な適合として確 信できるような形で現れる天然の分子中のアミノ酸の１個の短い鎖が存在しない 。第二に、高度に精製したＰＥＧ沈澱物を調製し力価を検定した最初の５０クロ ーンを用いてＥＬＩＳＡ試験を行ったが、その結果、ビオチン化ＳＺ−２へのフ ァージの結合はそれに続く ＳＺ−２の固定化グリコカリチンへの結合を阻害することである。５０クローン の中の僅か１個が配列番号：８３：ＷＨＷＲＳＳＷＫＳＧを持つ配列を示し、Ｓ Ｚ−２を完全に中和することができることが明らかになったが、その時使用可能 であった他のクローンは中和能力において近付くものさえなかった。しかしなが ら、このクローンは一連のクローンの明らかな収斂パターンを代表するようには 見えず、また、その時使用可能であった他のクローンよりもＧＰＩｂ・α内の配 列に、より広い適合を提供するものでもなかった。しかしながら、他の血小板表 面タンパクのコンピュータ支援分析では、この配列は以下に示す血小板ＦＣγ₂ 受容体の領域に対する最高のＦＡＳＴＡスコアを持っていた。以下のリストでは それは提案されたコンセンサス配列リストで第２のペプチドとして示してある。 さらに幾つかのクローンの配列を決定し、このシリーズの最初に示したペプチド −配列番号：８４：ＨＲＰＬＳＷＫＧＲＡが得られた。このペプチドもＳＷＫ配 列を持つがＳＷＫのアミノ側に余分にＲと３残基を持つことに注意すべきである 。 血小板ＦＣγ₂受容体にマップされた収斂配列の下に、提案されたコンセンサ スセットに最も近く適合するＧＰＩｂ・α内の配列が示してある。 本明細書においては、好ましい態様が図示されそして詳細に記述されたが、関 連分野における熟練者には、本発明の精神から逸脱することなく多様な修飾、付 加、置換および同様なことがなし得ること、従ってこれらは以下の請求の範囲に 記載したように本発明の範囲内にあるものと解すべきであることは明らかであろ う。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． モノクローン抗体に対する結合部位を機能的に模倣する単離されたペプチ ドであって、該モノクローン抗体がヒト血小板糖タンパクＩｂ／ＩＸ複合体内の エピトープを認識するものであるペプチド。 ２． 該モノクローン抗体がＣ−３４と命名されているものである請求項１記載 の単離されたペプチド。 ３． 該ペプチドが下記のものより成る群から選択されるアミノ酸配列を含むも のである請求項２記載の単離されたペプチド。 ４． 該ペプチドが配列番号：３８：ＷＮＷＲＹＲＥＹＶに一致するアミノ酸配 列を含むものである請求項２記載の単離されたペプチド。 ５． 断片がモノクローン抗体Ｃ−３４に対する結合部位を機能的に模倣するも のである、請求項３記載の単離されたペプチドの断片。 ６． 該断片が配列番号：３８：ＷＮＷＲＹＲＥＹＶに一致するアミノ酸配列を 有するものである請求項５記載の断片。 ７． モノクローン抗体がＳＺ−２と命名されるものである請求項１記載の単離 されたペプチド。 ８． 該ペプチドが下記のものより成る群から選択されるアミノ酸配列を含むも のである請求項７記載の単離されたペプチド。 ９． 請求項１記載のペプチドに結合することができる単離された分子。 １０． 該分子が化学的に合成されたものである請求項９記載の単離された分子 。 １１． この分子が抗体を含むものである請求項９記載の単離された分子。 １２． この分子が第２のペプチドを含むものである請求項９記載の単離された 分子。 １３． 該第２のペプチドが下記のものより成る群から選択されるアミノ酸配列 を含むものである請求項１２記載の単離された分子。 １４． この分子がＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子より成る群から選択されるもの である請求項９記載の単離された分子。 １５． 血小板の接着、集合、または凝集を調節する方法であって、血小板を選 択する工程および該血小板を請求項９記載の分子に接触させ、それによりフォン ・ウイルブラント因子と血小板との相互作用に糖タンパクＩｂ／ＩＸ受容体を介 して影響を与える工程、および該血小板の接着、集合、または凝集を調節する工 程を含んで成る方法。 １６． モノクローン抗体Ｃ−３４に結合することができる単離されたペプチド であって、下記のものより成る群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。 １７． 断片がモノクローン抗体Ｃ−３４に結合することができるものである請 求項１６記載の単離されたペプチドの断片。 １８． 該断片が配列番号：３８：ＷＮＷＲＹＲＥＹＶに一致するアミノ酸配列 を有するものである請求項１７記載の断片。 １９． 請求項１６記載のペプチドに結合することができる単離された分子。 ２０． 該分子が化学的に合成されるものである請求項１９記載の単離された分 子。 ２１． この分子が抗体を含むものである請求項１９記載の単離された分子。 ２２． この分子が第２のペプチドを含むものである請求項１９記載の単離され た分子。 ２３． 該第２のペプチドが下記のものより成る群から選択されるアミノ酸配列 を含むものである請求項２２記載の単離された分子。２４． この分子がＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子より成る群から選択されるもの である請求項１９記載の単離された分子。 ２５． 血小板の接着、集合、または凝集を調節する方法であって、血小板を選 択する工程および該血小板を請求項１９記載の分子に接触させ、それにより糖タ ンパクＩｂ／ＩＸ受容体を介して血小板とフォン・ウイルブラント因子との相互 作用に影響を与える工程および該血小板の接着、集合、または凝集を調節する工 程を含んで成る方法。 ２６． モノクローン抗体Ｃ−３４に結合することができる単離されたペプチド であって、配列番号：３８：ＷＮＷＲＹＲＥＹＶに一致するアミノ酸配列を含む ペプチド。 ２７． モノクローン抗体ＳＺ−２に結合することができる単離されたペプチド であって、下記のものより成る群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。 ２８． この断片がモノクローン抗体ＳＺ−２に結合することができるものであ る請求項２７記載の単離されたペプチドの断片。 ２９． 請求項２７記載のペプチドに結合することができる単離された分子。 ３０． 該分子が化学的に合成されるものである請求項２９記載の単離された分 子。 ３１． この分子が抗体を含むものである請求項２９記載の単離された分子。 ３２． この分子が第２のペプチドを含むものである請求項２９記載の単離され た分子。 ３３． この分子がＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子より成る群から選択されるもの である請求項２９記載の単離された分子。 ３４． 血小板の接着、集合、または凝集を調節する方法であって、血小板を選 択する工程および該血小板を請求項２９記載の分子に 接触させ、それにより糖タンパクＩｂ／ＩＸ受容体を介して血小板とフォン・ウ イルブラント因子の相互作用に影響を与える工程および該血小板の接着、集合、 または凝集を調節する工程を含んで成る方法。