JP2003516417A - 糸球体濾過異常、動脈管開存、および骨粗鬆症治療に用いる組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規のプロスタグランジンE2受容体アンタゴニストを含む物質の組成物、ならびに腎臓における体液濾過の調節、骨粗鬆症および歯科疾患における骨塩減少の予防、さらには未熟児または動物胎児における動脈管（DA）閉鎖の治療におけるその使用に関する。また、組成物は、直鎖状ペプチド、ペプチド類似体、およびペプチド模倣体を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 （a）発明の分野 本発明は、急性腎不全、末期腎疾患、糸球体腎炎、および他の腎障害の場合に
腎臓における体液濾過の調節、骨粗鬆症および歯科疾患にみられるような再吸収
および骨塩減少の低下、さらには未熟児または動物胎児における動脈管閉鎖を中
心とする治療における、Gタンパク質共役型受容体に対する新しいペプチドアン
タゴニストおよびペプチド模倣体アンタゴニストの化合物およびその使用に関す
る。

【０００２】 （b）従来技術 プロスタグランジンは、プロスタグランジン（PG）合成酵素によりアラキドン
酸に酸素が付加されて合成される。プロスタグランジンは、血管運動性（vasome
tricity）、睡眠・覚醒サイクル、腸分泌、脂肪分解、糸球体濾過、肥満細胞の
脱顆粒、神経伝達、血小板凝集、リューテオリシス（leuteolysis）、子宮筋収
縮および分娩、炎症および関節炎、動脈管開存、細胞増殖および分化などのさま
ざまな生理学的作用に関与する。プロスタノイドは、上記作用をロドプシン様の
7回膜貫通らせん状受容体スーパーファミリーに属する特定の受容体に結合する
ことで発揮する。このような受容体は、活性化すると細胞内カルシウム量を変化
させ、ホスホイノシチドの加水分解、または環状アデノシン一リン酸合成の促進
もしくは抑制を開始させる、α、β、およびγサブユニットからなるヘテロ三量
体Gタンパク質と共役している。

【０００３】 PGE₂、PGI₂、PGD₂、PGF_2α、およびTxA₂に対する5種の薬理学的に異なるプロ
スタノイド受容体、ならびにPGE₂受容体の4種のサブタイプについては文献に記
載されている。（Ichikawaら、1996）。これらは、複数のスプライス異型のある
EP₁、EP₂、EP₃と、それとは別のEP₄である。クローン化されたヒトEP₄（プロス
タグランジンE2受容体サブタイプEP4としても知られる）は488アミノ酸残基から
なる糖タンパク質でG_αSに結合しており、アデニル酸シクラーゼおよびcAMP合成
の促進にかかわる（Abramovitz, M.ら、米国特許第5,759,789号および第5,605,8
14号）。EP₄受容体は、腸では高レベルで発現されるが、肺、腎臓、胸腺、子宮
、および脳ではかなり低いレベルで発現される（Bastion, Yら、1994、J. Biol.
Chem. 269（16）：11873〜77）。EP₄は動脈管で発現される（Bhattacharya, M.
ら、1999、Circulation. 100：1751〜56）。矛盾するようだが、EP₄ノックアウ
トマウスは、動脈管の閉鎖が十分ではないために出生後に死んでしまう（Nguyen
, M.ら、1997、Nature 390：78〜81；Segi, E.ら、1998）。したがって動脈管の
開存のメカニズムとEP₄が果たす役割は不明なままである。

【０００４】 PGE₂は腎臓で多量に作られ、腎臓の微小循環、塩および水の輸送、レニン放出
の調節に関与する（Breyer, M.D.ら、1998、Kidney Int. 54（Suppl. 67）：S88
〜94）。すべてのEP受容体は、腎臓に局所的に分布すること（Morath, R.ら、19
99、J. Am. Soc. Nephrol. 10：1851〜60）、および特定の機能と結びついてい
ることがわかっている。腎臓におけるEP受容体の分布に関するあらゆる研究では
、EP₄受容体が糸球体で特異的に発現されることが報告されている（Breyer, M.D
.ら、1996、Am. J. Physiol. 270：F912〜918；Morath, R.、1999）が、集合管
（Breyer, M.D.ら、1996）、腎動脈内の体液、および直細血管（Morath, R.ら、
1999）などのネフロンの他の構造における同受容体の存在が多く報告されている
。EP₄の転写産物は、傍糸球体の顆粒細胞にも認められ、この細胞でPGE₂によりc
AMP合成が誘導されていることと矛盾がない。つまりEP₄は、レニン分泌に役割を
果たす可能性がある。糸球体のプロスタグランジンは、濾過（Schlondoff, D.ら
、1987、Kidney Int. 29：108〜19）およびレニン放出に影響すると考えられて
いる。PGE₂は、単離された糸球体でcAMP量を上昇させる（Freidlander, G.ら、1
983、Mol. Cell. Endocrinol. 30：201〜214）。cAMP合成と共役したEP₄受容体
が、糸球体濾過を調節する可能性があることが示唆されている（Sugimoto, Y.ら
、1994）が、この役割が直接証明されているわけではない。最も重要なことは、
EP4受容体の促進または拮抗作用の結果、糸球体濾過の上昇を生じるかどうか、
または糸球体濾過の改善に、急性腎疾患、末期腎疾患、糸球体腎炎、および糖尿
病性腎症に治療上の有効性がどの程度あるのかに関する文献データが存在しない
点である。

【０００５】 骨は絶え間ないリモデリングを受けており、骨芽細胞により骨形成が行われ、
破骨細胞により骨吸収が行われる。この過程は、副甲状腺ホルモン、エストラジ
オール、ビタミンD、サイトカイン、成長因子、およびプロスタグランジンなど
の複数の液性因子で制御されている。インターロイキン1（IL-1）による破骨細
胞の誘導がアスピリン様の薬剤で抑制されることが知られている（Tai, H.、ら
、1997. Endocrinology、138：2372〜2379）。EP4受容体拮抗作用をもつPGE2類
似体は、マウスの骨芽細胞と骨髄細胞の共培養で破骨細胞の形成を促進し、また
EP4ノックアウトマウスに由来する細胞を用いた同様の実験では、破骨細胞の形
成が低下した。このことから、マウスの破骨細胞形成にEP4受容体が役割を果た
すことが示唆される（Narumiya, S.ら、1999、Physiol. Rev. 79：1193〜1226に
引用される）。したがってEP4アンタゴニストには、骨の喪失が疾患過程と不可
分である骨粗鬆症、歯科疾患、および他の疾患などの症状に治療上の有効性があ
るのではないかと予想される。EP4受容体に対する選択的アンタゴニストがない
ため、この領域の研究の進行ははかばかしくない。したがって本発明の目的の一
つは当技術分野における一つまたは複数の欠点を克服することである。

【０００６】 この受容体活性の少なくとも1種の機能を阻害可能なプロスタグランジンE2受
容体のサブタイプEP4受容体アンタゴニストを提供することが望ましいと思われ
る。

【０００７】 末期腎疾患、糸球体腎症、糖尿病性腎症、または急性腎不全の治療を受けてい
る患者の糸球体濾過および/または尿量を改善し、未熟児患者の動脈管（DA）を
閉鎖し、または骨減少が問題となる骨粗鬆症、歯科疾患、および他の症状におけ
るさらなる骨減少を予防する目的で、適切な剤形にこのようなアンタゴニストを
使用する方法を提供することが望ましいと思われる。

【０００８】 ハイスループットのスクリーニング法を用いてEP4受容体に対する低分子量の
アンタゴニストの探索をさらに進めるために、本発明のEP4受容体に対するアン
タゴニストを適切に標識してリガンドとして使用するバイオアッセイ法またはキ
ットを提供することが望ましい。

【０００９】発明の概要 本発明の一つの目的は、受容体活性化の機能の少なくとも1種を抑制可能なペ
プチドまたはペプチド模倣体のプロスタグランジンE2受容体サブタイプEP4のア
ンタゴニストを提供することである。

【００１０】 本発明の別の目的は、以下の一般式で表されるペプチドを含む化合物を提供す
ることである： Y1-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Z1 上式において、 Y1は、ペプチドのN末端に結合し、プロトン、1〜3残基のアミノ酸配列、または
カルバメート基、疎水性部分からなるシクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル
基のようなアシル基、1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および分枝状のアセチル基
およびベンゾイル基のようなアルキル基等の保護基からなる群より選択され； R1は、Val、Ala、Ile、Gln、Leu、またはArgからなる群より選択され； R2は、Ala、Ile、Phe、Arg、またはLeuからなる群より選択され； R3は、Pro、Thr、Ser、Tyr、Leu、またはValからなる群より選択され； R4は、Met、Ala、Gly、Ser、Val、またはIleからなる群より選択され； R5は、Thr、Pro、Tyr、Leu、Gly、またはGlnからなる群より選択され； R6は、Val、Cys、Ile、Gly、Glu、またはSerからなる群より選択され； R7は、Pro、Val、Cys、Leu、Glu、またはAsnからなる群より選択され； R8は、Ser、Leu、Thr、またはAlaからなる群より選択される。 Z1は、ペプチドのカルボキシ末端に結合し、プロトン、NH₂、1〜3残基のアミノ
酸、同様にベンジルアミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミンの
ようなアリールアルキルアミン、ならびに1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および
分枝状のアルキル基を有する脂肪族アミンからなる群より選択される。

【００１１】 本発明はまた、ペプチド化合物またはペプチド模倣体化合物を含み、このよう
な化合物がプロスタグランジンE2受容体のサブタイプEP4の活性の少なくとも1種
の機能結果を抑制する能力をもつ薬学的組成物の提供を目的とする。

【００１２】 さらに別の目的は、以下の構造式を有するペプチドからなる化合物を開示する
ことである： Y2-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Z2 上式において、 Y2は、ペプチドのN末端に結合し、プロトン、1〜3残基のアミノ酸配列、または
カルバメート基、疎水性部分を含むシクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル基
のようなアシル基、1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および分枝状のアセチル基お
よびベンゾイル基のようなアルキル基等の保護基からなる群より選択され； AA1は、残基なし、Ile、Leu、Phe、および疎水性側鎖、ベンジルアミンのような
アリールアルキルアミンを有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA2は、残基なし、Leu、Ile、Phe、および疎水性側鎖、ベンジルアミンのような
アリールアルキルアミンを有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA3は、残基なし、Ala、Ser、Thr、およびヒドロキシル基または水素結合形成基
を含む側鎖を有する他の関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA4は、Ser、Thr、およびヒドロキシル基または水素結合形成基を含む側鎖を有
する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA5は、Ala、Tyr、Phe、ならびにベンゾイル基およびフェノール基、同様にベン
ジルアミンのようなアリールアルキルアミンを含む側鎖を有する他の関連α-ア
ミノ酸からなる群より選択され； AA6は、Glu、Gln、Asp、Asn、および、荷電性基または水素結合受容基を含む側
鎖を有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA7は、残基なし、Ala、Cys、Ser、Thr、およびスルフヒドリル基、ヒドロキシ
ル基を含む側鎖を有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA8は、残基なし、Ile、Ala、Leu、Phe、ならびに疎水性側鎖、同様にベンジル
アミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミンのようなアリールアル
キルアミン、さらに炭素を1〜8個含む短い直鎖状および分枝状のアルキル基を有
する脂肪族アミンを有する他のα-アミノ酸からなる群より選択され； Z2は、ペプチドのカルボキシ末端に結合し、プロトン、NH₂、1〜3残基のアミノ
酸、同様にベンジルアミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミンの
ようなアリールアルキルアミン、ならびに1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および
分枝状のアルキル基を有する脂肪族アミンからなる群より選択される。

【００１３】 個々のアミノ酸、ペプチド模倣体の保存的置換を含む、合成ポリペプチドの場
合がある化合物の誘導体を提供することも本発明の目的である。

【００１４】 別の目的は、培養細胞、組織、および動物を用いたアッセイ法で、プロスタグ
ランジンE2受容体のサブタイプEP4の機能結果を調節することが可能な化合物を
提供することである。

【００１５】 薬学的に許容される担体と結合するプロスタグランジンE2受容体のサブタイプ
EP4のアンタゴニストを含む組成物を提供することも本発明の目的である。

【００１６】 本発明の別の目的は、患者の糸球体濾過および/または尿量を改善させ、末期
腎疾患または急性腎不全を治療し、未熟児患者の動脈管（DA）を閉鎖するために
、プロスタグランジンE2受容体のサブタイプEP4のアンタゴニストを含む薬学的
組成物の使用を提供することである。

【００１７】 本発明の別の目的は、骨粗鬆症を治療するためのプロスタグランジンE2受容体
のサブタイプEP4のアンタゴニストを含む薬学的組成物の使用を提供することで
ある。

【００１８】 本発明の別の目的は、化合物ライブラリーをスクリーニングするためにアンタ
ゴニストを使用するバイオアッセイ法およびキットにおいて、プロスタグランジ
ンE2受容体サブタイプEP4のアンタゴニストの使用を提供することである。

【００１９】本発明の詳細な説明 プロスタノイド受容体は、Gタンパク質共役型受容体であり、その天然リガン
ドはアラキドン酸（C20：4の不飽和脂肪酸）のシクロオキシゲナーゼ産物である
。これらの受容体に対する天然のリガンドがペプチドか否かは不明である。プロ
スタグランジンE2は、多くのGタンパク質共役型受容体サブタイプと結合する。
このうちサブタイプEP4はいくつかの病変において特に重要である。EP4受容体に
対する特定のアンタゴニストはなく、哺乳類生理におけるこの受容体の機能的役
割は確証されていない。

【００２０】 本発明の目的の一つは、当技術分野におけるこのような空白を埋めることであ
り、EP4受容体に対する選択的阻害剤を提供することである。

【００２１】 本発明の新しい局面は、プロスタグランジンE2受容体サブタイプEP4のアンタ
ゴニストが天然のペプチドであることである。また本明細書では、当技術分野で
周知の細胞、組織、および動物を対象としたアッセイ法における、このようなア
ンタゴニスト、およびアンタゴニストの機能および構造の特徴が類似の可能性が
ある誘導体の構造を提供する。

【００２２】 したがって、以下の一般式で表される少なくともアミノ酸8残基のペプチドか
らなる化合物を提供する： Y1-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Z1 上式において、 Y1は、ペプチドのN末端に結合し、プロトン、1〜3残基のアミノ酸配列、または
カルバメート基、シクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル基のような疎水性部
分からなるアシル基、1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および分枝状のアセチル基
およびベンゾイル基のようなアルキル基等の保護基からなる群より選択され； R1は、Val、Ala、Ile、Gln、Leu、またはArgからなる群より選択され； R2は、Ala、Ile、Phe、Arg、またはLeuからなる群より選択され； R3は、Pro、Thr、Ser、Tyr、Leu、またはValからなる群より選択され； R4は、Met、Ala、Gly、Ser、Val、またはIleからなる群より選択され； R5は、Thr、Pro、Tyr、Leu、Gly、またはGlnからなる群より選択され； R6は、Val、Cys、Ile、Gly、Glu、またはSerからなる群より選択され； R7は、Pro、Val、Cys、Leu、Glu、またはAsnからなる群より選択され； R8は、Ser、Leu、Thr、またはAlaからなる群より選択され； Z1は、ペプチドのカルボキシ末端に結合し、プロトン、NH₂、1〜3残基のアミノ
酸、同様にベンジルアミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミンの
ようなアリールアルキルアミン、ならびに1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および
分枝状のアルキル基を有する脂肪族アミンからなる群より選択される。

【００２３】 また、以下の構造を有するペプチドを含む組成物を開示する： Y2-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Z2 上式において、 Y2は、ペプチドのN末端に結合し、プロトン、1〜3残基のアミノ酸配列、または
カルバメート基、疎水性部分を含むシクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル基
のようなアシル基、1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および分枝状のアセチル基お
よびベンゾイル基のようなアルキル基等の保護基からなる群より選択され； AA1は、残基なし、Ile、Leu、Phe、および疎水性側鎖、ベンジルアミンのような
アリールアルキルアミンを有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA2は、残基なし、Leu、Ile、Phe、および疎水性側鎖、ベンジルアミンのような
アリールアルキルアミンを有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA3は、残基なし、Ala、Ser、Thr、およびヒドロキシル基または水素結合形成基
を含む側鎖を有する他の関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA4は、Ser、Thr、およびヒドロキシル基または水素結合形成基を含む側鎖を有
する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA5は、Ala、Tyr、Phe、ならびにベンゾイル基およびフェノール基、同様にベン
ジルアミンのようなアリールアルキルアミンを含む側鎖を有する他の関連α-ア
ミノ酸からなる群より選択され； AA6は、Glu、Gln、Asp、Asn、および荷電性基または水素結合受容基を含む側鎖
を有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA7は、残基なし、Ala、Cys、Ser、Thr、およびスルフヒドリル基、ヒドロキシ
ル基を含む側鎖を有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA8は、残基なし、Ile、Ala、Leu、Phe、ならびに疎水性側鎖、同様にベンジル
アミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミンのようなアリールアル
キルアミン、さらに炭素を1〜8個含む短い直鎖状および分枝状のアルキル基を有
する脂肪族アミンを有する他のα-アミノ酸からなる群より選択され； Z2は、ペプチドのカルボキシ末端に結合し、プロトン、NH₂、1〜3残基のアミノ
酸、同様にベンジルアミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミンの
ようなアリールアルキルアミン、ならびに1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および
分枝状のアルキル基を有する脂肪族アミンからなる群より選択される。

【００２４】 本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸、ならびにペ
プチドの合成類似体を調製するためにペプチド化学分野で使用される他の非タン
パク質性アミノ酸のL体とD体の両異性体を含む。天然のアミノ酸の例には、グリ
シン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニンなどが
あり、非天然のアミノ酸にはノルロイシン、ノルバリン、シクロヘキシルアラニ
ン、ビフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ナフチルアラニン、ピリジル
アラニン、オルト位、パラ位、およびメタ位においてアルコキシ基、ハロゲン基
、またはニトロ基などと置換されるフェニルアラニンがある。これらの化合物は
、ペプチド化学分野で当業者に周知である。

【００２５】 「極性アミノ酸」という用語は、無電荷の残基をもつアミノ酸を意味するが、
これは水に比較的溶解する。

【００２６】 「疎水性アミノ酸」という用語は、水に不溶性の、無電荷の側鎖を含むアミノ
酸を意味する。

【００２７】 「患者」という用語は、任意の動物、特にヒトを意味する。

【００２８】 理解しやすくする目的から、一般的に受け入れられているアミノ酸の表記法を
以下に示す：

【００２９】ペプチド模倣体： ペプチドのコンホメーションを模倣して、例えば柔軟性、プロテアーゼ感受性
、成分の酸化能、関門（barrier）不透過性、および大きさ等のペプチドの望ま
しくない性質を避けつつ機能的活性を再現する置換化合物を同定することは、薬
剤設計の分野ではよく知られている。ペプチドを模倣するこのような化合物は、
「ペプチド模倣体（peptidomimetic）」と呼ばれる。ペプチド模倣体を設計して
合成する方法は当業者によく知られている。

【００３０】 ペプチド模倣体を設計する際に当業者は、保存的置換および非保存的置換、ア
ミノ酸の各位置に欠失を導入して任意のペプチドの構造を分析し、そのような変
化を物理的または生物学的活性の変化と関連づける。例えば保存的なアミノ酸の
変化は、ペプチドの実際の配列に対して作ると、ペプチドの一次配列は変更する
が、通常はその機能は変化しない。保存的なアミノ酸置換は典型的には、以下の
群の置換を含む： グリシン、アラニン； バリン、イソロイシン、ロイシン； アスパラギン酸、グルタミン酸； アスパラギン、グルタミン； セリン、スレオニン； リシン、アルギニン； フェニルアラニン、チロシン。

【００３１】 （通常は一次配列を変化させない）変更には、インビボまたはインビトロにお
ける、例えばアセチル化またはカルボキシル化等のポリペプチドの化学誘導体化
が含まれる。別の変更には、生物利用能を高めるさまざまな分子量のポリエチレ
ングリコール分子を結合すること（PEGylation）、関門透過性を高める脂肪酸の
修飾、および組織を標的とする抗体またはポリペプチド、小分子による修飾も本
明細書に含まれる。

【００３２】 タンパク質分解性の分解に対する耐性を改善するために、または可溶性の特性
を最適化するために、または治療薬としての適正を高めるために、ペプチド化学
の知見を利用して修飾されたポリペプチドも含まれる。このようなポリペプチド
の類似体には、ペプチド模倣体化学分野の当業者に周知の、例えばD-アミノ酸ま
たは非天然の合成アミノ酸等の天然のL-アミノ酸以外の残基が含まれる。

【００３３】 特に記載がなければ、本発明で使用されるすべてのペプチドおよびペプチド模
倣体はD-アミノ酸を含む。

【００３４】 さらに、βターンを模倣する場合に行われるように、またはβ-アミノ酸を天
然のアミノ酸に代えて用いる場合に行われるように、アミノ酸のブロックを合成
用足場と置き換えることは、ペプチド化学分野で行われる傾向がある。

【００３５】ペプチド合成： 本発明で記載されているペプチド化合物およびペプチド模倣体化合物は、固相
を用いた全合成法または混合型の方法で合成することができる。混合型の方法の
場合、すべてまたは大部分のペプチドが固相で合成され、その後の付加は溶液内
で行われる。

【００３６】 従来のペプチド合成法では、アミノ酸を一つずつ結合させて行くことで完全な
ペプチドを得る。アミノ酸を例えばBOCやFmoc等のさまざまな保護基に結合させ
ていくことから、BOC化学またはFmoc化学と呼ばれることもある。ペプチド合成
に関する背景情報は、「固相ペプチド合成（Solid phase peptide synthesis）
」、スチュワート（Stewart）およびヤング（Young）、W h Freeman Co. サンフ
ランシスコ、1969、およびエリクソン（Erikson）およびメリフィールド（Merri
field）、「タンパク質（The proteins）第2巻、（Neurath & Hill編）、Academ
ic press、ニューヨーク、1976）」を参照して得ることができる。

【００３７】 本発明によれば、薬理学的または生理学的または薬学的に許容される担体と結
合する、プロスタグランジンE₂のサブタイプEP₄のGタンパク質共役型受容体アン
タゴニストを含む組成物が提供される。担体の選択は、使用するアンタゴニスト
の特定の適用によって指定される。

【００３８】 数多くの薬学的に許容される担体が当技術分野で知られており、本発明の組成
物を用い、当技術分野で周知の方法によって製剤化することができる。

【００３９】 本発明の組成物をインビトロで使用するときは、例えば生理食塩水、または調
査対象の特定の細胞または組織にふさわしい他の任意の緩衝液等の任意の許容さ
れる担体に懸濁させてもよい。したがってインビトロにおける製剤化は、膜また
は細胞全体を用いたリガンド結合アッセイ法、組織を用いた生理学的実験を行う
当業者に容易に明らかとなる。

【００４０】 本発明の化合物の活性は、さまざまなアッセイ系で検討することが可能であり
、このような系については文献に記載されており当業者に周知である。例えばNI
H3T3細胞、または組換え発現ベクターを用いて外来のcDNAを導入して発現させる
細胞のような、EP4受容体を天然の状態で発現している細胞を用いることで、本
明細書に記載された化合物の拮抗作用の有効性と効力とを測定することができる
。あるいは、例えば伏在静脈や腸の平滑筋組織などのEP4受容体を発現すること
がわかっている組織を器官槽アッセイ法に用いることで伸縮を測定することが可
能であり、または組織断片または組織に由来する膜を、放射性リガンドとインキ
ュベートすることでリガンド置換、GTPの結合および加水分解、二次メッセンジ
ャー（例えばcAMPやイノシトールリン酸）の合成を測定することができる。これ
らすべてのアッセイ法では、対象となる受容体からの情報伝達の1種または複数
の生化学的および生理学的な結果が測定される。この場合、得られる結果は、G
_αタンパク質によるGTPの結合および加水分解、環状アデノシン一リン酸の合成
、細胞内カルシウムの変化、平滑筋の伸縮、細胞の増殖および/または分化、遺
伝子発現の変化、および平滑筋の伸縮からなる群より選択される。

【００４１】 本明細書に記載された化合物の活性を検討する生理学的な面のより強い方法は
、体重1 kgあたり1 μg〜1000 mgの用量範囲および適切な投与経路を用いて、動
物に適切な担体と結合した化合物を導入することである（後述）。動物の操作、
投与経路、および投与方法は当業者に周知である。例えば本発明は、ラット、ブ
タ、およびヒツジで検討される特定の化合物の作用に関する記述、ならびに実施
例に記載されている方法を含む。

【００４２】 本発明のアンタゴニストを、治療を必要とする患者に投与するときは、特定の
治療対象の症状、年齢、疾患または障害の進行度などを含む多くの因子をふまえ
た、任意の適切な剤形に製剤化してもよい。本発明の阻害剤は、従来の投与様式
（例えば経口投与、非経口投与、経皮投与、もしくは経筋肉投与）で、生分解性
の生体適合性ポリマーを用いた徐放性製剤で、もしくはミセル、ゲルおよびリポ
ソームを用いるオンサイト輸送法（on-site delivery）で、または（例えば坐薬
または浣腸剤として）直腸経由で、さらには（例えば点鼻薬により）経鼻的に患
者に投与することができる。薬学的に許容される適切な担体は当業者には明らか
であると思われ、投与経路に大きく依存すると思われる。製剤化には、他の任意
の経路で投与したときに血液脳関門を通過可能とする阻害剤も含めることができ
る。また本発明の阻害剤を製剤化して、特定の細胞を標的とすることができる。
例えば今日では、カプセルへの封入、またそれ以外では、化合物が細胞表面の特
定の受容体を指向するような化合物の製剤化が当技術分野で知られている。この
ような製剤化には、抗体を用いたタギングによる製剤化や受容体とリガンドとの
結合による製剤化などが含まれる。

【００４３】 本発明の阻害剤は患者に末梢経路で投与することができるほか、全身投与する
こともできる。本明細書で使用する「末梢投与」とは、脳に直接投与すること以
外の任意の経路で化合物を投与することを意味する。したがって末梢投与には、
本発明の任意の化合物の経口投与、鼻咽頭投与、腹腔内投与、筋肉内投与、およ
び静脈内投与が含まれるがこれらに限定されない。

【００４４】 企図される投与法には、単回投与、または1時間、1日、1週間、または1か月、
さらには1年毎に投与する方法が含まれる。投与量は患者の体重1 kgあたり1 μg
〜1000 mgを変動する場合があり、化合物の送達に適した剤形が採用される。投
与経路も治療対象の疾患に応じて変わる。

【００４５】 上記の記述によれば、EP4アンタゴニストを含む薬学的組成物を、治療を必要と
する患者へ同組成物が投与される状況で使用することは、結果的に糸球体濾過お
よび尿量を上昇させる。急性腎不全もしくは末期腎疾患、またはさまざまな糸球
体腎炎もしくは腎障害と診断された患者に製剤を与えることも想定されている。

【００４６】 また、EP4受容体アンタゴニストを含む薬学的組成物が、骨粗鬆症もしくは歯
科疾患または多くの免疫学的疾患および癌関連疾患の症状でみられるように、骨
塩減少と診断された患者または動物に投与される場合があることも言及しておく
。

【００４７】 EP4アンタゴニストを含む薬学的調製物の使用も、未熟児を対象に動脈管開存
を閉鎖させて肺性高血圧を避ける必要性がある場合に本発明に含まれる。

【００４８】 EP4アンタゴニストの用量は、患者または動物の体重1 Kgあたり1 μg〜1 gを
変動する場合があり、末梢経路で投与される場合がある。

【００４９】 本発明の別の態様は、本発明に記載されたペプチドアンタゴニストが、プロス
タグランジンE2受容体のサブタイプEP4の、組織または動物全体における新しい
役割を検証するツールとして使用されることである。例えば、EP₄受容体は糸球
体（Breyer, M.D.、1996；Morath, R.、1999）および動脈管（Bhattacharya, M.
ら、1999）に存在することが知られているが、このような器官および動物の生理
における同受容体の詳しい機能は不明である。本発明に記載されているように、
特定のアンタゴニストを用いることで、EP₄受容体の阻害はラットの糸球体濾過
および尿量を上昇させ、ヒツジ胎児の動脈管を閉鎖し、およびヒト脾臓細胞を骨
芽細胞と共培養したときに破骨細胞形成を低下させることが報告されている。受
容体に対するこのような特定のアンタゴニストを、天然のリガンドに関する知見
の有無にかかわらず提供することにより当業者は、プロスタグランジンE2受容体
サブタイプEP4または他のGタンパク質共役型受容体の組織ならびに動物全体にお
ける新しい役割を調べることができる。

【００５０】 本発明の別の態様は、生化学アッセイ法でEP4受容体アンタゴニストを用いて
、未知リガンドの機能を検証し、オートラジオグラフィー、放射性リガンド結合
、ラジオシンチグラフィー、ポジトロン放出断層撮影などの手法を用いて、受容
体を細胞および組織内で物理的に同定して局在を明らかにすることである。そし
て、特定の手法は実験対象によって変わり、当業者に周知である。したがって蛍
光色素、放射性核種、イムノアフィニティハプテン、抗体および他のアフィニテ
ィタグなどのさまざまな標識を結合させたEP4受容体アンタゴニストを含むキッ
トも本発明に含まれる。

【００５１】 阻害剤および材料の調製ペプチドおよびペプチド模倣体の化学合成： 発明者らは、F-moc化学および固相メリフィールド（Merrifield）法を用いて
複数のペプチドおよびペプチド模倣体を合成した。このペプチドの純度の評価は
HPLCおよび質量分析で行った。一般的な方法は以下の文献を参照することで理解
される：「固相ペプチド合成（Solid phase peptide synthesis）」、スチュワ
ートおよびヤング（Stewart & Young）、W h Freeman Co. サンフランシスコ、1
969、ならびにエリクソン（Erikson）およびメリフィールド（Merrifield）、「
タンパク質（The proteins）」第2巻（Neurath & Hill編）、Academic press、
ニューヨーク、1976）。

【００５２】 特に記載がなければ、すべてのペプチドおよびペプチド模倣体はD-アミノ酸を
含む。インビトロ実験ではペプチドを秤量してジメチルスルホキシドに10 mMで
溶解し、インビボ実験では滅菌水に記載濃度になるように溶解した。これらの溶
液は必要時に調製し、使用後は廃棄した。

【００５３】EP₄ cDNAのHEK293細胞における発現： ヒトのEP₄のコード領域をジャーカット（Jurkat）細胞からRT-PCR法で増幅し
た。簡潔に説明すると、全RNAをジャーカット細胞（〜10⁷個の細胞）から、Triz
ol（商標）試薬（Life technologies、Burlington、ON）を用いて抽出した。RNA
の純度の評価と定量は260 nmおよび280 nmにおける吸収を決定して行った。RNA
のアリコートをスーパースクリプト（Superscript）II逆転写酵素（Life techno
logies、Burlington、ON）（200 U）および100 μMのオリゴ（dT）_12-18を用い
て反応緩衝液（50 mM Tris-HCl pH 8.3、75 mM KCl、3 mM MgCl₂、10 mM DTT）
中で1時間42℃の条件で逆転写した。cDNAの一部（1 μgのRNAに相当）を、10 μ
Mの各プライマー、EP4.1 およびEP4.2 ならびにThermopol（商標）（New England Biolabs、Mississaugua、ON）に溶解
した2 UのVent（商標）ポリメラーゼ（New England Biolabs、Mississaugua、ON
）、反応緩衝液（20 mM Tris-HCl pH 8.8、10 mM KCl、10 mM （NH₄）₂SO₄、2 m
M MgSO₄、0.1% Triton X-100、0.2 mM dNTPsおよび5% DMSO）を用いて30サイク
ル（94℃、1分；55℃、1分；72℃、1.5分）のPCR法で増幅した。DNA断片の精製
はアガロースゲル電気泳動法で行い、T4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し
、pGEM-3（Promega、Madison、WI）のHincII部位へのクローニングを標準的な分
子生物学的手法（Maniatis, Tら、1989、「分子クローニング：実験マニュアル
（Molecular cloning：a laboratory manual）」、Cold Spring Harbor Press、
ニューヨーク）により平滑末端連結法で行った。EP₄ cDNAの配列は塩基配列決定
法で決定した。EP₄のコード領域（HindIII-XbaI断片）を真核細胞の発現ベクタ
ー、pRC-CMV（Invitrogen、San Diego、CA）にクローニングしてEP₄/RC-CMVプラ
スミドを得た。

【００５４】 HEK293細胞（6穴プレートの1ウェルあたり2×10⁵個の細胞）へのEP₄/RC-CMVの
導入は、lipofectamine（商標）（Life technologies、Burlington、ON）を用い
て業者から提供された指示書にしたがって行った。簡潔に説明すると、2 μgの
プラスミドを4 μlの脂質とOPTI-MEM溶媒中で30分間かけて混合し、DNA脂質複合
体を細胞に添加して、6時間37℃で維持した。次に溶媒を10% FBSを含むDMEMと交
換した。2日後に細胞をDMEM培地に分け、1 mg/ml G418（Life technologies、Bu
rlington、ON）で抗生物質耐性細胞を選択した。選択を10〜12日かけて行った後
にG418耐性コロニーをプールして増殖させた。プールした細胞集団におけるEP₄
受容体の発現の確認は、放射リガンド結合と、PGE₂への応答によるcAMP合成で確
認した。

【００５５】 本発明の範囲を制限するのではなく説明するために提供される以下の実施例を
参照することで、本発明はより容易に理解されると思われる。

【００５６】実施例I PHG213に対する反応における環状アデノシン一リン酸の基礎レベルおよびPGE₂に
よる刺激時のレベル EP₄/293細胞におけるcAMPの基礎レベルは、ホスホジエステラーゼ阻害剤であ
るイソブチルメチルキサンチン（IBMX）の存在下では、親株であるHEK293細胞よ
り上昇した。これは主に、EP₄受容体の過剰発現によるアデニル酸シクラーゼの
基礎活性が上昇したことに起因する。ペプチド阻害剤の有効性の検討は、上記細
胞におけるcAMPの基礎レベルを元に行った。

【００５７】 方法： EP₄/293細胞を、1ウェルあたり5×10⁵個の割合で6ウェルプレートに播種し、
翌日PHG213（100 μM）の存在下または非存在下で、100 μMのIBMXで1時間処理
した。培地を除き、0.3 mlのエタノールを添加してタンパク質を沈殿させ、cAMP
を抽出した。遠心後に得られたタンパク質を含まない上清を、凍結乾燥した。残
査を結合緩衝液に再懸濁し、cAMPレベルの決定を市販のキットを用いて行った。

【００５８】 結果を表1に示す。100 μMのIBMXの存在下で、細胞をPHG213（配列番号：1）
（100 μM）で1時間処理した。フォルスコリンおよびPGE₂を15分間だけ添加した
。データは4回の実験の平均値を示す。表1により、PHG213に反応した環状アデノ
シン一リン酸の基礎レベルおよびPGE₂によって刺激されたレベルの変化が示され
る。

【００５９】

【表１】 PHG213がEP₄/293細胞中のcAMP基礎レベルに及ぼす作用

【００６０】 IBMXの存在下、cAMPの基礎レベルはEP₄/293細胞中で経時的に上昇した。PHG21
3はcAMPの蓄積を大きく減少させた。アデニル酸シクラーゼ活性化薬剤であるPGE
2（1 μM）またはフォルスコリン（100 μM）を添加したところcAMPレベルが上
昇したことから、アデニル酸シクラーゼを含むEP₄情報伝達経路が、これらの細
胞中で十分活性であることが示唆された。したがってPHG213は、これらの細胞に
おけるEP₄受容体の基礎活性の強力な阻害剤であると考えられる。

【００６１】実施例II 器官槽（organ bath）アッセイ法におけるPHG213およびそのペプチド模倣体変異
体がPGE2誘導型の伏在静脈条辺の拡張に及ぼす作用 強力なアンタゴニストを作成するために、F-moc化学を用いて213の配列（配列
番号：1）にさまざまな変異を設計して合成した。ペプチドおよびペプチド模倣
体をHPLCで精製した。これには以下の配列が含まれる：213.2：（配列番号：2）
；213.4：（配列番号：3）；213.6：（配列番号：4）；213.7：（配列番号：5）
；213.9：（配列番号：6）；213.15：（配列番号：7）；213.16：（配列番号：8
）；213.17：（配列番号：9）。

【００６２】 動物 Ste-Justine病院付属研究センターの動物管理委員会（Animal Care Committee
of the Research Centre）で承認されたプロトコルにしたがって、ヨークシャ
ー種の子ブタ（2日齢〜4日齢）を本研究において用いた。概略すると、ブタを1.
5%ハロタンで麻酔し、下方外側の伏在静脈を除去して、以下の組成の冷クレブス
（Krebs）緩衝液（pH 7.4）中に静置した：NaCl 120 mM、KCl 4.5 mM、CaCl₂ 2.
5 mM、MgSO₄ 1.0 mM、NaHCO₃ 27 mM、KH₂PO₄ 1.0 mM、グルコース 10 mMこれに1
.5 U/ml ヘパリンを添加した）。

【００６３】 器官槽アッセイ法 伏在静脈から外側の組織を除いて4 mmの輪（ring）にし、クレブス緩衝液を満
たした個々のジャケット付き器官槽（15 ml；RadnotiGlass、Monrovia、CA）中
で37℃で維持した。溶液を、95% O₂-5% CO₂の混合ガスで泡立たせた。各実験に
おいて、8個の輪（それぞれの伏在静脈から4個ずつ）を用い、2.0 grの静止張力
を加えながら60分間、頻繁に洗浄しかつ張力を調節しながら平衡化した。張力は
、力-変位（force-displacement）トランスデューサで測定し、コンピュータを
用いたデータ収集システムへの記録には、ワークベンチ（Work Bench）ソフトウ
ェア（いずれもKent Scientific、Litchfield、CT）を用いた。

【００６４】 実験プロトコル 第1回目の実験において、拡張性FP受容体サブタイプの相対分布を、EP受容体
のアゴニストとアンタゴニストの組み合わせを用いて確認した。PGE₂に対する下
方外側の伏在静脈の血管拡張性反応は、30% EP₂および70% EP₄による刺激に起因
すると考えられた。組織にまず2×10^-7 U46619を添加したところ、1.5 gr〜2.0
grの張力上昇が誘導された。反応しなかった輪を廃棄した。U46619に対する反応
が定常状態に至った時点で薬剤を添加した。薬剤に対する反応が認められなかっ
た場合は、10分間おいて、組織内での薬剤の適切な分布を確実にした。次にPGE₂ （10^-10M〜10^-6 M）に対する用量反応曲線を、各試験薬剤の存在下または非存在
下で得た。

【００６５】 実験の結果を表2に示す。結果は2回〜8回の実験の平均である。結果は、1 μM
のペプチド存在下で1 μMのPGE2により誘導された収縮の逆転率（%）として表に
されている。ここで示されたペプチドは、親ペプチドPHG213（配列番号：1）に
おける生産的かつ有効な置換を含む。

【００６６】

【表２】 PHG213のペプチド模倣体誘導体が、子ブタの伏在静脈におけるPGE2誘
導型の血管緊張低下に及ぼす作用

【００６７】実施例III PHG213がブタの眼モデルの眼潅流率（ocularperfusion rate）に及ぼす作用 PHG213（配列番号：1）がEP₄受容体機能にもたらす有効性を検討するために、
ブタ脈絡膜の血管運動性を調べるエクスビボのアッセイ法を用いた。このような
血管床におけるPGE₂に対する拡張性反応がEP₄受容体に媒介されることは過去に
報告されている（Abran, D.ら、1997、Am. J. Physiol. 272：R995〜1001）。

【００６８】 方法： アブラン（Abran）ら（1997）により詳細に記載されている方法に正確に従っ
た。新生ブタの眼由来の渦静脈に、27ゲージ針を用いてカテーテルを留置し、灌
流圧が安定になるまでクレブス溶液を灌流した。この血管系をまずトロンボキサ
ン模倣体U46619（1 μM）で収縮させ、その後1 μMのPGE₂を注入した。収縮の逆
転がプラトーに達したら、次にPHG213を100 μMの濃度で注入し、灌流圧を記録
した。

【００６９】 結果を図1に示す。正の灌流圧は血管系の収縮を示し、負の灌流圧は血管系の
拡張を示す。PGE₂は、U46619に起因する収縮を逆転させた。PHG213を灌流すると
PGE₂によるこの拡張作用が完全に妨害された。PGE₂による拡張作用には新生ブタ
の脈絡膜のEP₄受容体が主に関与することが知られているので、PHG213はEP4受容
体による作用に拮抗作用を示し、この受容体に起因する拡張を妨害した。

【００７０】実施例IV PHG213が正常ラットの糸球体濾過率および尿量に及ぼす作用 EP₄受容体は糸球体に局在しており、かつおそらく集合管に局在しているので
、本発明者らはEP₄アンタゴニストが糸球体濾過率を上昇させうると仮定した。
このために、本発明者らはラットのインビボモデルにおいてPHG213（配列番号：
1）を開発して検討した。

【００７１】 方法： スプラーグ・ドーリー（Sprague-Dawley）種の成体ラット（〜250 g）を50 mg
/kgのペントバルビタール（pentobarbitone）で麻酔した。左頚静脈（注入用）
および左頚動脈（血圧測定用）にカテーテルを留置し、かつ尿を採取するため膀
胱の先端に別のカテーテルを留置した。生理食塩水に溶解した［³H］-イヌリン
（2 μCi/Kg/h）の注入を開始し、2時間続けて系を安定化させた。尿の採取を正
確に20分間行い、かつ10分間毎にヘパリン処理した管に0.1 mlの血液を採取した
。血液を遠心分離し、血漿の放射性活性をカウントした。10分後および30分後（
前回の尿採取を開始してから30分および60分）にこの過程を繰り返した。アンタ
ゴニストであるPHG213を生理食塩水に溶解して、6 μmol/Kg/hで1時間静脈内に
注入した後に最初の尿採取を行った。尿量（UV）を計算して、ラットの体重で補
正した尿量（μl）/hとして表す。GFRを、血漿中イヌリン濃度に対する尿中イヌ
リン濃度の比をラットの尿量と体重で補正して算出した。

【００７２】 結果を図2に示す。平均血圧は、ペプチドによって有意に変化しなかった。尿
の流速（UV）は2.3倍と劇的に上昇し、かつ糸球体濾過率（GFR）は157%上昇した
。このような尿量の変化は、EP₄受容体アンタゴニストが糸球体に作用し、糸球
体では濾過率を上昇させ、集合管では再吸収を抑制することで尿量の増大が生じ
ていることを意味している。

【００７３】実施例V PHG213が糖尿病ラットの糸球体濾過率および尿量に及ぼす作用 糸球体機能の低下は末期腎疾患（ESRD）の特徴の一つであり、GFRを改善する
薬剤は、疾患の進行を遅らせることから治療上大きな価値があると思われる。EP ₄ アンタゴニストが糸球体機能を上昇させるかどうかを見出すために、ストレプ
トゾトシンで誘導した糖尿病ラットをモデルとして使用した。

【００７４】 方法： スプラーグ・ドーリー（Sprague-Dawley）種の成体ラット（〜250 g）に、ス
トレプトゾトシン（45〜50 mg/Kg）を静脈注入し、2日後に糖およびタンパク質
に関して尿を試験した。2週間後に、両マーカーに関して陽性を示したラットを
選び、上述の方法を用いて、PHG213（配列番号：1）がGFRおよびUVに及ぼす作用
を試験した。

【００７５】 結果を図3に示す。EP4.3を全身注入したときは、EP₄受容体を介したPGE₂の作
用の推定された阻害に合致して、GFRおよびUVの両方が上昇した。動物において
、平均血圧は有意に変化しなかったことから、EP₄受容体は血圧の恒常性に最小
限寄与することが示唆され、これは薬剤の望ましい特性である。これらの結果は
、糖尿病の動物においては、正常な動物と同等に、EP₄受容体が発現されて糸球
体濾過が調節されることを示唆している。

【００７６】実施例VI PHG213がヒツジ胎児の動脈管に及ぼす作用 妊娠した雌ヒツジ（妊娠129日〜140日）をケタミン（30 mg/Kg、静脈注射）で
麻酔して、帝王切開を行って胎児を体外に出した。胎児の呼吸条件を再現するた
めに、生理食塩水を満たしたグローブ中に胎児の頭部を浸した。大腿静脈および
頚静脈に全身血圧測定用および薬剤注入用のカテーテルをそれぞれ留置した。動
脈管（DA）の直径を、文献に記載されているドップラー心エコー検査法（Dopple
r echocardiography）（Teyssier, G.ら、1989、J. Cardiovascular Technol、8
：259〜266）で測定した。心エコーの測定（echocardiographic measurement）
を、レンジゲーテッド（range-gated）ドップラーで二重化された（duplexed）7
.5 MHzまたは5 MHzのトランスデューサを用いたアキュソン（Acuson）128 XP/10
C リアルタイム超音波イメージングシステムにより行った。ドップラーシグナル
を、100 MHzの高域フィルタで処理した。DAを、左第2肋間傍胸骨からアプローチ
して可視化した。薬剤を注入後、続く20分間〜25分間にDAの直径の測定を5分間
隔で3回繰り返して行った。

【００７７】 結果を図4に示す。安定化時間の40分間、DAは変化しなかった。PHG213（配列
番号：1）（2 mgのボーラスの後、15分かけて1 mg/Kgを注入）を注入してから数
分間のうちに、DAは収縮を始め、それは15分間続き、逆転しなかった。EP₄受容
体のペプチドアンタゴニストであるPHG213は、胎児の脈管開存の維持を担う受容
体の拡張作用をブロックした。

【００７８】実施例VII ヒト膵臓細胞およびSaOS-2不死化（immoetalized）固定化ヒト骨芽細胞の共培養
物において、PHG213が破骨細胞形成に及ぼす作用 破骨細胞は骨に付着して、再吸収または骨の喪失を引き起こす。骨の喪失を防
ぐために、骨粗鬆症における破骨細胞数の増加（破骨細胞の分化）を阻害するこ
とは治療上の利点となる。PHG213（配列番号：1）が破骨細胞の分化にもたらす
有効性を検討するために、ヒト胎児の膵臓細胞およびヒト骨芽細胞の共培養系を
用いた。

【００７９】 方法： SaOs-2細胞（ヒト骨芽細胞の不死化細胞系）を、10% ウシ胎児血清およびビタ
ミンD3（10^-7）を含むα-MEM培地を満たした24ウェルのプレートで4日間成育し
た。コンフルエントなSaOs-2細胞を、1% パラホルムアルデヒドMおよびデキサメ
タゾン（リン酸緩衝食塩液（PBS）に10^-8 Mとなるように溶解）中で8分間かけて
固定化した。細胞をPBSで4回洗浄し、10% ウシ胎児血清およびビタミンD3（10^-7 M）を含むα-MEMを添加した。

【００８０】 2日前に、ヒト流産児の脾臓を小片に切断して、数回摩砕して細胞を放出させ
た。脾臓細胞を10% ウシ胎児血清を含むα-MEM中で2日間培養した。脾臓細胞を
トリプシン処理し、PBS中で1回洗浄し、コールターカウンターで数を測定した。
脾臓細胞のアリコート（10⁵ 細胞/ウェル）を、固定化したSaOs-2細胞の単層上
に2時間おいた後に、PHG213（100 μM）を添加した。3日後に、4% パラホルムア
ルデヒドを含むPBSで細胞を固定化し、水で洗浄して、D-酒石酸塩（tartarat）
耐性アルカリホスファターゼ（TRAP）を市販のキット（Sigma、St.Mouis、MO）
で染色した。TRAP陽性細胞を顕微鏡下で観察して細胞数を数えた。

【００８１】 実験の結果を図5に示す。データは複数回の実験の平均である（n=10）。PHG21
3の添加により、ヒト細胞供培養系においてTRAP陽性細胞（破骨細胞）の数は半
減した。これは、ヒトEP4受容体の特定の阻害剤PHG213が、脾臓における前駆細
胞が破骨細胞になることを妨げた最初の報告である。したがってEP4受容体の阻
害は、破骨細胞媒介される過剰な骨の喪失を特徴とする骨粗鬆症の治療に関して
潜在的利用価値を有すると言える。

【００８２】 本発明は特定の態様に関して記載されているが、さらなる改変が可能であり、
この応用は、発明の任意の変法、用途、または適用を含むことが意図されており
、一般的には発明の原理に従い、発明が適用される技術分野の既知または通例の
実施の範囲内にあり、上述のかつ本質的な特性に適合しうり、かつ添付の特許請
求の範囲内に従う限り、本開示からの逸脱を含むことが理解されるべきである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 PHG213がPGE₂に反応した眼潅流圧の変化に及ぼす作用を示す。

【図２】 PHG213が正常ラットにおける糸球体濾過率および尿量に及ぼす作
用を示す。

【図３】 PHG213が糖尿病ラットにおける糸球体濾過率および尿量に及ぼす
作用を示す。

【図４】 ドップラー心エコー検査法により測定された、PHG213がヒツジ胎
児の動脈管の直径に及ぼす作用を示す。

【図５】 PHG213が固定化されたSaOS-2細胞との共培養においてヒト胎児の
脾臓細胞とともに破骨細胞形成（TRAP+細胞）に及ぼす作用を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１０月４日（２００２．１０．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ13 QR33 QR48 QR59 QR77 QR80 QS05 QS36 QX02 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA17 BA23 CA18 DC50 MA01 MA65 NA14 ZA362 ZA672 ZA812 ZA972 4H045 AA10 AA30 BA14 BA15 BA16 EA20 FA34

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の式で表されるペプチド： Y1-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Z1 上式において、 Y1は、ペプチドのN末端に結合し、プロトン、1〜3残基のアミノ酸配列、または
   カルバメート基、疎水性部分からなるシクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル
   基のようなアシル基、1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および分枝状のアルキル基
   等の保護基からなる群より選択され； R1は、Val、Ala、Ile、Gln、Leu、またはArgからなる群より選択され； R2は、Ala、Ile、Phe、Arg、またはLeuからなる群より選択され； R3は、Pro、Thr、Ser、Tyr、Leu、またはValからなる群より選択され； R4は、Met、Ala、Gly、Ser、Val、またはIleからなる群より選択され； R5は、Thr、Pro、Tyr、Leu、Gly、またはGlnからなる群より選択され； R6は、Val、Cys、Ile、Gly、Glu、またはSerからなる群より選択され； R7は、Pro、Val、Cys、Leu、Glu、またはAsnからなる群より選択され； R8は、Ser、Leu、Thr、またはAlaからなる群より選択され； Z1は、ペプチドのカルボキシ末端に結合し、プロトン、NH₂、1〜3残基のアミノ
   酸、同様にアリールアルキルアミン、ならびに1〜8個の炭素を含む短い直鎖状お
   よび分枝状のアルキル基を有する脂肪族アミンからなる群より選択される。
2. 【請求項２】 プロスタグランジンE2受容体サブタイプEP4の少なくとも一
   つの機能結果を抑制する能力をもつ、請求項1記載のペプチド。
3. 【請求項３】 以下の構造で表される化合物であって、 Y2-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Z2 上式において： Y2は、ペプチドのN末端に結合し、プロトン、1〜3残基のアミノ酸配列、または
   カルバメート基、疎水性部分を含むシクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル基
   のようなアシル基、1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および分枝状のアセチル基お
   よびベンゾイル基のようなアルキル基等の保護基からなる群より選択され； AA1は、残基なし、Ile、Leu、Phe、および疎水性側鎖、アリールアルキルアミン
   を有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA2は、残基なし、Leu、Ile、Phe、および疎水性側鎖、アリールアルキルアミン
   を有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA3は、残基なし、Ala、Ser、Thr、およびヒドロキシル基または水素結合形成基
   を含む側鎖を有する他の関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA4は、Ser、Thr、およびヒドロキシル基または水素結合形成基を含む側鎖を有
   する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA5は、Ala、Tyr、Phe、ならびにベンゾイル基、フェノール基およびアリールア
   ルキルアミンを含む側鎖を有する他の関連α-アミノ酸からなる群より選択され
   ； AA6は、Glu、Gln、Asp、Asn、および、荷電性基または水素結合受容基を含む側
   鎖を有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA7は、残基なし、Ala、Cys、Ser、Thr、およびスルフヒドリル基、ヒドロキシ
   ル基を含む側鎖を有する関連α-アミノ酸からなる群より選択され； AA8は、残基なし、Ile、Ala、Leu、Phe、ならびに疎水性側鎖、アリールアルキ
   ルアミン（ベンジルアミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミン）
   、および炭素を1〜8個含む短い直鎖状および分枝状のアルキル基を有する脂肪族
   アミンを有する他のα-アミノ酸からなる群より選択され； Z2は、ペプチドのカルボキシ末端に結合し、プロトン、NH₂、1〜3残基のアミノ
   酸、アリールアルキルアミン、ならびに1〜8個の炭素を含む短い直鎖状および分
   枝状のアルキル基を有する脂肪族アミンからなる群より選択される。
4. 【請求項４】 プロスタグランジンE2受容体サブタイプEP4の少なくとも一
   つの機能を抑制する能力をもつ、請求項3記載の化合物。
5. 【請求項５】 化合物が、 からなる群より選択される、請求項4の化合物。
6. 【請求項６】 適切な薬学的担体と結合する、請求項3〜5のいずれか一項記
   載の化合物を含む組成物。
7. 【請求項７】 治療を必要とする患者の糸球体濾過および/または尿量を改
   善する、請求項3〜5のいずれか一項記載の化合物の使用。
8. 【請求項８】 治療を必要とする患者に、請求項3〜5のいずれか一項記載の
   治療的有効量の化合物を投与する段階を含む、患者の糸球体濾過および/または
   尿量を改善する方法。
9. 【請求項９】 末期腎疾患または急性腎不全と診断された患者に、約1 μg
   〜約1000 mgの用量範囲で末梢経路で投与される、請求項3〜5のいずれか一項記
   載の化合物を含む薬学的組成物。
10. 【請求項１０】 末期腎疾患または急性腎不全の患者の治療に用いる方法で
    あって、請求項3〜5のいずれか一項記載の治療的有効量の化合物を該患者に投与
    する段階を含む方法。
11. 【請求項１１】 未熟児患者の動脈管（DA）を閉鎖するための、請求項3〜5
    のいずれか一項記載の化合物の使用。
12. 【請求項１２】 動脈管開存と診断された患者に、1 μg〜1000 mgの用量範
    囲で末梢経路で投与される、請求項3〜5のいずれか一項記載の化合物を含む薬学
    的組成物。
13. 【請求項１３】 治療を必要とする未熟児患者に、請求項3〜5のいずれか一
    項記載の治療有効量のアンタゴニストを投与する段階を含む、動脈管（DA）を閉
    鎖する方法。
14. 【請求項１４】 以下の段階を含むアッセイ法における、請求項3〜5のいず
    れか一項記載の化合物の使用： a）天然の受容体または組換え型の受容体を発現する細胞または組織を培養する
    段階； b）培養細胞または組織を、該受容体の既知濃度のアゴニストの存在下または非
    存在下、請求項3〜5のいずれか一項記載の任意の化合物量で処理する段階； c）該受容体からの情報伝達の一つまたは複数の生化学的および生理学的な結果
    を測定する段階であって、該結果が、G_αタンパク質によるGTP結合および加水分
    解、環状アデノシン一リン酸の合成、細胞内カルシウムの変化、平滑筋の伸縮、
    細胞の増殖および/または分化、遺伝子発現の変化、または平滑筋の伸縮からな
    る群より選択される段階。
15. 【請求項１５】 請求項3〜5のいずれか一項記載の化合物を含むアッセイキ
    ット。
16. 【請求項１６】 患者の骨塩減少を予防するための治療を必要とする患者に
    治療有効量の化合物を投与する段階を含む、請求項3〜5のいずれか一項記載の化
    合物の使用。
17. 【請求項１７】 骨粗鬆症または歯科疾患の症状があると診断された患者に
    約1 μg〜約1000 mgの用量範囲で末梢経路で投与される、請求項3〜5のいずれか
    一項記載の化合物を含む薬学的組成物。
18. 【請求項１８】 請求項3〜5のいずれか一項記載の治療的有効量の化合物を
    、治療を必要とする患者に投与する段階を含む、患者の骨塩減少を治療する方法
    。
19. 【請求項１９】 請求項3〜5のいずれか一項記載の治療的有効量の化合物を
    患者に投与する段階を含む、患者の末期腎疾患または急性腎不全を治療する方法
    。