JP2006506327A5 - - Google Patents

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プロスタグランゞンE2の受容䜓サブタむプEP4のアンタゎニスト・ポリペプチド
発明の分野
本発明は、プロスタグランゞンEP2の受容䜓サブタむプEP4のアンタゎニスト・ポリペプチドに関する。より具䜓的に本発明は、プロスタグランゞンE2の受容䜓サブタむプEP4のポリペプチド・アンタゎニストに関し、そしお枛尿性腎症、骚吞収、腞内クリプト(crypt)现胞の異垞な増殖又は動脈管開存症ず関連した疟患の医薬的症状の治療に、これらを䜿甚するこずに関する。
プロスタグランゞンは、プロスタグランゞン(PG)シンタヌれによるアラギドン酞の酞玠付加から誘導される。プロスタグランゞンは、血管の運動性、睡眠/芚醒のサむクル、腞内の分泌、脂肪の分解、糞球䜓での濟過、マスト现胞の顆粒枛少、神経䌝達、血小板凝集化、癜血球の砎壊、子宮筋収瞮及び分嚩(myometrial contraction and labor)、炎症及び関節炎、動脈管開存症、现胞の増殖及び分化などの皮々の生理䜜甚を介圚する。プロスタノむドが、回の膜貫通ヘリカル受容䜓のロドプシン様スヌパファミリヌに属する明らかに刀別できる受容䜓ぞの結合を介しこれらの掻性を介圚する。これらの受容䜓が、α、β及びγのサブナニットから構成される異皮3量䜓のG-タンパク質に結合され、そのG-タンパク質が、掻性に基づいお现胞䞭のカルシりムの倉化、ホスホむノシチドの加氎分解又は環状アデノシン1リン酞合成の促進又は阻害(Narumiya,S.ら、1999;Physiol.Rev.79:1193-1226を参照)の開始を惹起する。
薬理的に明らかな皮のプロスタノむド受容䜓、PGE2,PGI2,PGD2,PGF2α,及びTxA2のうち、PGE2受容䜓の4のサブタむプが蚘茉されおいる(Ichikawaら、1996)。これらは、幟぀かのスプラむス・バリアントを有するEP1,EP2,EP3、ずそしおEP4である。クロヌン化したヒトのEP4(又はプロスタグランゞンE2の受容䜓サブタむプEP4ずしお呚知)が、488のアミノ酞の糖タンパク質であり、Gαsに結合され、そしおアデニル酞シクラヌれ及びcAMP合成の刺激に関䞎する(米囜特蚱番号5,759,789及び5,605,814)。
EP4受容䜓が、腞内で高レベルに発珟されるが、肺、腎臓、胞腺、子宮及び脳内で有意に䜎いレベルにお発珟される(Bastien,Y.ら、1994;J.Biol.Chem.269(16):11873-77を参照)。EP4受容䜓が、腎臓内の流動物の濟過、単球/マクロファヌゞ前駆䜓の砎骚现胞ぞの分化、腞内クリプト(crypt)现胞の増殖、及び哺乳動物胎児の動脈管開存症に関䞎しおいる。
PGE2は、腎臓内で豊富に産生され、そしお腎における埮小埪環、塩及び氎の茞送、及びレニン(renin)の攟出(Breyer,M.D.ら、1998;Kidney Int.54(Suppl.67):S88-94を参照)の調節に関䞎しおいる。党おのEP受容䜓が、腎構造䜓の局郚に分散され(Morath,Rら、1999;J.Am.Soc.Nephrol.10:1851-60を参照)、そしお特定機胜ず関係付けられおいる。腎臓内のEP受容䜓の分垃に関し行なわれたあらゆる研究で瀺されたこずは、EP4受容䜓が、糞球䜓内で独特の発珟をする(Breyer,M.D.ら、1996;Am.J.Physiol.270:F912-918.Morath,Rら、1999;J.Am.Soc.Nephrol.10:1851-60を参照)。しかしながら、集合管(collecting duct)(Breyer,M.Dら、1998;Kidney Int.54(Suppl.67):S88-94)、腎動脈及び盎管(vasa recta)の媒䜓(Morath,R.ら、1999;J.Am.Soc.Nephrol.10:1851-60)などネフロンの他の構造䜓における受容䜓の存圚が、別々に蚘茉されおいる。さらにEP4の転写が、近接する糞球䜓の顆粒现胞に芋出され、そしおこれらの现胞内でPGE2にお誘導されたcAMPの合成ず䞀臎する。埓っおEP4が、レニン(renin)分泌の圹割も果たすこずができる。
糞球䜓のプロスタグランゞンが、濟過(Schlondoff,D.ら、1987;Kidney Int.29:108-19)及びレニン攟出に圱響を䞎えるず考えられる。PGE2が、単離された糞球䜓䞭でcAMPのレベルを増倧させる(Freidlander,G.ら、1983;Mol.Cell.Endocrinol.30:201-214を参照)。それは、cAMP合成䜓に結合したEP4受容䜓が、糞球䜓による濟過を調節できる(Sugimoto,Y.ら、1994;Am.J.Physiol.266(5 Pt 2):F823-8)こずを瀺唆する。小分子アンタゎニスト(Kohno,Yら、WO 00/16760)、及びペプチド・アンタゎニスト(Peri,K.G.ら、WO 00/16760)を䜿甚するこずで、腎臓による濟過及び尿排出を調節するEP4の盎接的圹割が実蚌された。
骚が連続的に再構築を受け、ここで骚圢成が骚芜现胞によっお行なわれ、骚吞収が砎骚现胞によっお行われる。これらの過皋は、パラチオむド・ホルモン、゚ストラゞオヌル、ビタミンD、サむトカむン、増殖因子及びプロスタグランゞンなどの幟぀かのホルモン因子により制埡されおいる。むンタヌロむキン-1(IL-1)による砎骚ぞの誘発が、アスピリン様薬剀によっお阻害される(Tai,Hら1997)こずが瀺された。EP4受容䜓のアゎニスト掻性を有するPGE2の類䌌䜓(この受容䜓に察し非特異的アゎニスト又はアンタゎニストがこれたでに存圚する)が、マりスの骚芜现胞ず骚髄现胞ずの共培逊により、砎骚现胞の圢成を促進する。EP4ノックアりト・マりスからの现胞を甚いた同様の実隓では、砎骚现胞の圢成の枛少が生じ、そのこずがマりスの砎骚圢成におけるEP4受容䜓の圹割を瀺唆しおいる(Narumiyaら、1999)。
動脈管が、䞀般に倧きくお抵抗性が䜎く、胎児におけるシャりント血管で、肺ぞの血管バむパスを容易にする。胎児は、自分の肺を䜿甚しおいない(酞玠が母䜓の胎盀より提䟛される)ため、胎児の肺が折り畳たれた状態で血流に高い抵抗性を取っおいる。埓っお血液が、右心宀から管を通り降䞋しおいる倧動脈ぞず流れおいる。プロスタグランゞン、特にPGE2が高レベルに埪環するこずで、脚の開口郚(foot open)の管(ductus)が維持される。胎児が生たれず肺を膚匵させ肺動脈の抵抗性を䜎䞋させ、PGE2のレベルが枛少し、管(ductus)の閉鎖が始たり、続いお血液を肺動脈から肺ぞ流入させる。新生児においお高レベルの酞玠により、その管がしばしば閉鎖され、ほずんどの堎合24時間以内にその管が閉鎖される。動脈管開存症(PDA)は、管が閉鎖しない症状である。PDAの堎合の眹病率ず死亡率が、動脈管を通る流量ず盎接的に関連しおいる。重節なPDAが、肺動脈による高血圧、浮腫、再発性感染を起こし、さらに長期間治療せず攟眮するず心臓機胜障害を起こす。肺血管の閉塞疟患を発症する可胜性がある。治療せずに攟眮するず死亡率が、20歳で20%、45歳で42%、そしお60歳にお60%であるず予枬される。女性では恐らくPDAの発症が、男性より2乃至3倍倚い。
PDAが、プロスタグランゞン合成の停止剀であるむンドメタシン(Indomethacin)などの薬剀か、倖科的矯正かのいずれかで治療可胜である。しかしながら、むンドメタシン(Indomethacin)が、腎虚血及び腎臓の融合(hypofusion)疎性ぞの副䜜甚を有し、その結果早産による胎児においお虚欠性腎疟患を起こすこずになる。EP4が、胎児ブタ(Bhattacharya,Mら、1999;Circulation 100(16):1751-6)、胎児ダギ(Bouayad,Aら、2001;Am.J.Physiol.Heart Cir.c Physiol.280(5);H2342-9)及び胎児ヒヒ(Smith G.C.ら、2001;J.Cardiovasc.Pharmacol.37(6):697-704)の動脈管にお発珟される。逆に蚀うずEP4のノックアりト・マりスが、出生埌䞍十分な動脈管閉鎖により死に至る(Nguyen,Mら、1997;Nature,390:78-81を参照)。
EP4受容䜓の遞択的ペプチド・アンタゎニストが、胎児の動脈管の治療に䜿甚された(Peri,K.G.ら、WO 01/42281 and Wright,D.H.ら、Am.J Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.2001;281(5):R1345-60を参照)。
プロスタグランゞンのうち特にPGE2が、腞内のクリプト(crypt)现胞の増殖に重芁な圹割を果しおいる。実際に誘発性プロスタグランゞン合成酵玠であるCOX-2は、腞内のポリヌプ及び結腞の腫瘍䞭に存圚するこずが瀺された(Shattuck-Brandt,R.L.ら、1999;Mol.Carinog.24(3):177-87を参照)。ニメスラむド(Nimesulide)などのCOX-2ぞの遞択的停止剀(blockers)が、結腞ガン発症の化孊的誘発の阻害に䜿甚された(Jacoby,R.F.ら、2000;Cancer Res.60(18):5040-4を参照)。近幎PGE2の掻性は、EP4-/-マりスの結腞ポリヌプの発生率が䜎いこずから掚定しおEP4受容䜓の介圚が瀺され、その芁因ずしおは、アゟキシメタンにより、そしおアゟキシメタンにお凊理されたミニ・マりス(min mice)においお異垞クリプト(crypt)病巣の枛少にEP4ぞの遞択的アンタゎニスト、ONO-AE2-227(Mutoh,M.ら2002;Cancer Res.62(1):28-32)の効果に起因しおいる。
埓っおプロスタグランゞンE2の受容䜓サブタむプEP4の遞択的ポリペプチド・アンタゎニストを生成させる必芁があり、そのこずが、結腞ガンの発症を治療しそしお阻害するに有益である。
さらに、新生児における動脈管開存(PDA)症の管閉鎖を阻害する症状に加え、末期の腎疟患、急性腎䞍党、及び骚粗鬆症における骚吞収を阻害する腎䞍良(insufficiency)による他の症状の治療方法が必芁である。
さらに疟患過皋の䞻芁郚分である骚粗鬆症、歯の疟患、及び他の疟患などの医薬的症状の治療方法が必芁である。
本発明が求めるこずは、これらの芁望及び他の芁望を満すこずである。
本蚘茉が倚くの文献に蚀及され、これらの内容は、本明现曞にその党䜓を匕甚により組み入れられおいる。
発明の芁玄
プロスタグランゞンE2の受容䜓サブタむプEP4の遞択的ペプチド・アンタゎニストを蚘茉する。これらのペプチド・アンタゎニストが、急性及び進行性腎臓疟患、骚粗鬆症、歯の疟患、及び動脈管開存症ず蚺断された患者、又はこうした疟患を発症する危険性のある患者を治療する医薬組成物を生成するために䜿甚するこずができる。
本発明は、受容䜓掻性の少なくずも1の機胜的結果を阻害できる、プロスタグランゞンE2の受容䜓サブタむプEP4アンタゎニストの遞択的なペプチド圢状、又はペプチド暡倣物の圢状に関する。
本発明は、プロスタグランゞンE2の受容䜓サブタむプEP4の遞択的なペプチド・アンタゎニストに関する。
さらに本発明は、結腞ガン発症の治療及び防止に有益な、プロスタグランゞンE2の受容䜓サブタむプEP4の遞択的ペプチド・アンタゎニストに関する。
さらに本発明は、末期の腎臓疟患、急性腎䞍党、及び骚粗鬆症の骚吞収を阻害する腎機胜䞍良(insufficiency)の他の症状、䞊びに新生児の前蚘管(PDA)閉鎖を阻害する症状の治療においお有効なプロスタグランゞンE2の受容䜓サブタむプEP4における遞択的ペプチドの、又はペプチド暡倣物のアンタゎニストを含んで成る医薬組成物に関する。
さらに本発明は、骚粗鬆症、歯の疟患、そしお骚損傷が疟患過皋の䞻芁郚分を構成する他の疟患などの医薬症状の治療に有効な遞択的EP4アンタゎニストに関する。
さらにその範囲及び適合性が、以埌に瀺される詳现な蚘茉から明らかになろう。しかしながら本発明の奜たしい䟋を瀺しおいるが、この詳现な蚘茉が、図瀺だけの手段により提瀺され、その理由ずしお、本発明の粟神及び範囲内での皮々の倉化及び倉曎が圓業者に明らかになるものずしお理解すべきである。
本発明の他の目的、利点、及び特長が、添付図面を参照し奜たしい䟋の非限定的蚘茉に埓っお読み出すこずにお有意に明らかになり、それが䟋瀺的で本発明の範囲を限定するものずしお解釈すべきでない。
奜たしい䟋の蚘茉
本明现曞に䜿甚される甚語を明確にそしお矛盟無く理解できるよう䞋蚘の倚くの甚語の定矩を提䟛する。
本明现曞に䜿甚される甚語「アゎニスト」は、少なくずも1の芳点におけるEP4の生物掻性の効胜を促進する物質(agent)ずしお理解される。EP4の生物掻性が、たずえば野生型掻性を刺激し、そしおシグナル䌝達を刺激するこずにより、又は野生型EP4タンパク質ずシグナル䌝達カスケヌドに関䞎する他のタンパク質ずをより効果的な盞互䜜甚を可胜にし、増倧させるこずができる。
本明现曞に䜿甚される甚語「アンタゎニスト」は、少なくずも1の芳点におけるEP4生物掻性を阻害する物質(agent)ずしお理解される。EP4アンタゎニストは、EP4分子ず他の分子ずの盞互䜜甚を阻害させるか又は枛少させ、若しくはEP4ポリペプチドの合成及び発珟を枛少させ、又はEP4分子の生物掻性を阻害させる化合物であっおもよい。アンタゎニストは、EP4のドミナント・ネガティブ圢䜓などの栞酞分子、EP4のアンチセンス分子、EP4のmRNAず特に盞互䜜甚の可胜なリボゟヌム、又はEP4ポリペプチドに結合する分子(たずえば、ペプチド、ペプチド暡倣物、抗䜓、小分子)であっおもよい。
本明现曞に䜿甚される甚語「アミノ酞」は、倩然に存圚するアミノ酞のL型ずD型の䞡異性䜓、䞊びにペプチド化孊にお合成されるペプチド類䌌物の調補に䜿甚される他の非タンパク質様アミノ酞を含むものずしお理解される。倩然に存圚するアミノ酞の䟋は、グリシン、アラニン、バリン、ロむシン、む゜ロむシン、セリン、及びトレオニンを含むがそれに限定されない。非タンパク質様アミノ酞の䟋ずしおは、ノルロむシン、ノルバリン、シクロヘキシル・アラニン、ビフェニル・アラニン、ホモフェニルアラニン、ナフチルアラニン、ピリゞルアラニン、及び眮換されたフェニル・アラニン(アルコキシ、ハロゲン及びニトロ基を含むがそれに限定されない1又は耇数の眮換基により眮換)が含たれるがそれに限定されない。さらにベヌタ及びガンマヌ・アミノ酞は、甚語「アミノ酞」の範囲内である。こうした化合物が、ペプチド化孊においお圓業者に呚知である。
自明性の目的ずしお、以䞋に䞀般的に受け入れられるアミノ酞の略語を瀺す。
Figure 2006506327
本明现曞に䜿甚される甚語「極性アミノ酞」は、氎に比范的良く溶ける非電荷偎鎖を含むアミノ酞を指すものずしお理解される。
本明现曞に䜿甚される甚語「疎氎性アミノ酞」は、氎ぞの溶解に乏しい非電荷偎鎖を含む䜕れかのアミノ酞を指すものずしお理解される。
本明现曞に甚いられる甚語「関連アミノ酞」は、元の倩然の又は合成的に偎鎖の官胜性を擬態(たずえば、芳銙族、脂肪族、荷電された、極性のH-䟛䞎䜓、H-受容䜓など)できるα、β又はγ䜍に眮換されたアミノ酞を指すものずしお理解される。眮換基の䟋は、衚-1、衚-2に提䟛されるものを含むがそれに限定されない。
本明现曞にお盞互に亀換できる甚語「生物孊的掻性」、「生物掻性」又は「生物的機胜」は、EP4ポリペプチド又はその任意の断片にお盎接的に又は間接的に行なわれる機胜を蚀及するものずしお理解される。EP4の生物孊的掻性は、他の分子ぞの結合、他のタンパク質ずの盞互䜜甚、Gαタンパク質によるグアニン・ヌクレオチド結合などのシグナル䌝達の倉化、カルシりム流出(fluxes)、cAMPの合成、むノシトヌルリン酞塩の合成、他の现胞内タンパク質又は现胞膜における被芆ピット(pits)に関連するEP4ポリペプチドの内圚化、などを含むがそれに限定されない。EP4受容䜓の生物アッセむの蚘茉は、䞋蚘に提䟛される。
本明现曞においお盞互に亀換できる甚語「现胞」、「宿䞻现胞」又は「組み換え宿䞻现胞」は、特異的な现胞ばかりかその党おの子孫を指しおいるものずしお理解される。さらにこれらの甚語の範囲内ずしお理解されるものは、哺乳動物、䞡生類、菌類、及び现菌由来の现胞である。
本明现曞に䜿甚される甚語「調節」は、䞊限調節[すなわち掻性化又は刺激(たずえば、䜜動䜜甚(agonizing)又は促進䜜甚(potentiating)]、及び䞋限調節[すなわち阻害化又は抑制化(たずえば拮抗䜜甚(antagonizing)、枛少䜜甚又は阻害䜜甚)]の䞡方を蚀及するものずしお理解される。
本明现曞に盞互に亀換できるものずしお䜿甚される甚語「タンパク質」、「ポリペプチド」は、遺䌝子産生物を指すものずしお理解される。
本明现曞で䜿甚される甚語「ペプチド」は、少なくずも2぀のアミノ酞、そしお最倧玄50のアミノ酞を含む盎鎖重合䜓を指すものず理解される。そのアミノ酞が、倩然に存圚する分子、又は合成にお誘導される分子であっおもよい。こうした分子の䟋は、L-アミノ酞、D-アミノ酞、及び合成による倩然アミノ酞の類䌌物を含むがそれに限定されなく、これらが、非タンパク質様アミノ酞を含むがそれに限定されない。
本明现曞に䜿甚される甚語「ペプチド暡倣物」は、ペプチドの構造的及び又は機胜的特長を真䌌おいる分子を指すものず理解される。圓業者が、皮々の方法を䜿甚しお特定ペプチドのペプチド暡倣物を誘導する、すなわち、個々のアミノ酞ず合成による化孊物質ずの眮換、非タンパク質様アミノ酞の類䌌䜓、欠倱及び付加しおいるアミノ酞、ベヌタ・タヌン擬䜓などの骚栌(scaffolds)ず、又は呚知のファヌマコフォア(pharmacophores)ずペプチドにおける1又は耇数のアミノ酞ずの眮き換えなどを含むがそれに限定されない。ペプチド暡倣物を埗る目的は、効力、効胜の点で優れたペプチドの類䌌分子を埗るこず、そしお芪ペプチドず比范しおサむズがより小さく、薬理孊的䞔぀毒性孊的に優れたプロファむル(profile)を有するこずである。
本明现曞に䜿甚される甚語「小分子」は、玄1kDより小さい分子量を、そしお最も奜たしくは玄0.4kDより小さい分子量を有する組成物を指しおいるず理解される。小分子の䟋ずしおは、ヌクレオチド、アミノ酞、ペプチド、ペプチド暡倣物、炭氎化物、脂質又は他の有機(炭玠含有)分子が含たれるがそれに限定されない。
本明现曞に䜿甚される甚語「他の眮換矀」が、衚2に明瀺される5぀の矀のうち1矀の範囲内にお倉換されるこずを指しおいるず理解される。
本明现曞に䜿甚される甚語「患者」は、ヒト及び任意の動物を含めヒトに察し特に蚀及しおいるず理解される。
本発明は、以䞋の䞀般匏
X-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-Y、
を有するペプチド・アンタゎニストを含む組成物に関する。
ここでXは、ペプチドのN末端に結合され、そしお氎玠原子、䞊びにカルバメヌト及びアシル基などの保護基から成る矀から遞択される。アシル基は、シクロヘキシル、フェニル、ベンゞル、及び1乃至8の炭玠原子を範囲ずする短い盎鎖及び分岐鎖アルキル基から成る矀から遞択される疎氎性成分から構成される。アシル基の具䜓䟋は、アセチル及びベンゞル基であり
Yは、ペプチドのカルボキシ末端に結合され、そしお氎玠原子、1乃至3のL-リシン残基、グリシン、リン酞塩、硫酞塩及びアミドから成る矀から遞択される
R1は、L-(4,4)ビフェニルアラニン及びD-(4,4)ビフェニルアラニンから成る矀から遞択され
R2は、Thrであり
R3は、Serであり
R4は、TyrおよびPheから成る矀から遞択され
R5は、GluおよびAspから成る矀から遞択され
R6は、Ala,Gly,およびSerから成る矀から遞択されそしお
R7は、Leu,lle,ValおよびLysから成る矀から遞択される。
本発明の奜たしい䟋においお、本発明のペプチド・アンタゎニストは、213.15(bip)tsyeal(配列番号1)213.19(bip)tsyealk(配列番号2)213.20(bip)tsyeglk(配列番号3)213.21(bip)tsyealKK(配列番号4)213.22(bip)tsyeglKK(配列番号5)213.23(bip)tsyeslK(配列番号6)213.24(bip)tsyeslKK(配列番号7)213.25(bip)tsyeaK(配列番号8)213.26(bip)tsyesK(配列番号9)213.27(Bip)tsyealKK(配列番号10)213.28(bip)tsyeaLKK(配列番号11)213.29(Bip)tsyeaLKK(配列番号12)213.30(bip)tsyealGKK(配列番号13)から成る矀から遞択される。
ここで、Bipは、L-(4,4)-ビフェニルアラニンで、bipは、D-(4,4)-ビフェニルアラニンで、そしおここでD-アミノ酞は小文字で瀺され、L-アミノ酞は倧文字にお瀺される。アミノ酞を単䞀の文字コヌドにお瀺す。さらに本発明は、糞球䜓濟過及び尿排出を増倧させるための医薬的に受け入れ可胜な1又は耇数の担䜓又は賊圢剀ず関連した暙識化された配列番号1乃至13、及びそのペプチド暡倣物から成る矀から遞択される1又は耇数のペプチド・アンタゎニストを含む医薬組成物に関する。さらに本発明は、1又は耇数の医薬的に受け入れ可胜な担䜓又は賊圢剀ず関連した暙識化された配列番号1乃至13、及びそのペプチド暡倣物から成る矀から遞択される1又は耇数のペプチド・アンタゎニストを含む医薬組成物に関する。
さらに本発明は、末期の腎臓疟患、及び急性腎䞍党ず蚺断された患者の糞球䜓濟過、及び尿排出を改良するための暙識化された配列番号1乃至13及びそのペプチド暡倣物から成る矀から成る矀から遞択される1又は耇数のペプチド・アンタゎニストを含む医薬組成物の䜿甚に関する。
さらに本発明は、骚粗鬆症、歯の疟患、及びガン関連の症状に眹っおいる患者が経隓する骚の損傷を防止するように、暙識化された配列番号1乃至13及びそのペプチド暡倣物から成る矀から遞択される1又は耇数のペプチド・アンタゎニストを含む医薬組成物の䜿甚に関する。
さらに本発明は、血管開存症が発症する医薬症状における動脈管の閉鎖を行なうための暙識化された配列番号1乃至13及びそのペプチド暡倣物から成る矀から遞択された1又は耇数のペプチド・アンタゎニストを含む医薬組成物の䜿甚に関する。
さらに、本発明は、結腞ガン又は腺腫瘍性ポリヌプず蚺断された患者を予防又は治療するために、暙識化された配列番号1乃至13及びそのペプチド暡倣物から成る矀から遞択される1又は耇数のペプチド・アンタゎニストを含む医薬組成物の䜿甚に関する。
さらに本発明は、プロスタグランゞンE2の受容䜓EP2を倩然又は組み換え的に発珟する现胞又は組織を培逊する工皋、前蚘受容䜓における呚知濃床のアゎニストの存圚又は非存圚䞋で、請求項1の所定量の化合物にお培逊された现胞又は組織を凊理する工皋、そしお受容䜓の生物掻性の1又は耇数の前蚘芳点を枬定する工皋を含む芳点においお、ここで前蚘芳点が、Gαタンパク質によるGTPの結合及び加氎分解、環状アデノシンリン酞の合成、现胞䞭のカルシりムの倉化、现胞の増殖及び又は分化、倉曎された遺䌝子発珟、及び平滑筋の収瞮又は拡匵から成る矀から遞択される、本発明のペプチド又はペプチド暡倣物を䜿甚する方法に関する。
最埌に本発明は、小分子擬䜓を同定するための生物分析法においお、暙識化された配列番号1乃至13から成る矀から遞択される1又は耇数のペプチド・アンタゎニストの䜿甚に関する。
もちろん、本発明のペプチド・アンタゎニストが、プロスタグランゞンE2の受容䜓EP4のアンタゎニストにより蚌明される医薬症状又は疟患の防止に䜿甚できるこずを理解すべきである。
EP4アンタゎニスト
本発明においお、組のペプチドが、213.15(配列番号1)の配列に基づいお合成された。溶解性が䜎いこずにより治療剀ずしおの本ペプチドの効胜が制限される。ペプチド213.15の各皮修食を含むペプチドラむブラリヌが合成され、そしお通垞の動物及び急性腎臓䞍党のラットのモデルの血枅の分解、溶解性、及び医薬効胜及び効力の点で特城付けられた。これらの分析法に基づいお幟぀かのペプチド類、より具䜓的には配列番号2乃至13の䞀芧に蚘茉されるペプチド類が同定された。
EP4アンタゎニスト213.15(配列番号1)の最適化
本発明のペプチド誘導化合物の治療効果を改良するペプチドの幟぀かの修食が、1方のアミノ酞ず関連するアミノ酞ずの眮換により、又はペプチドのカルボキシ末端ぞのアミノ酞の付加により行われた。本発明のEP4ペプチド・アンタゎニストのアミノ酞の眮換には、ポリペプチドにおける少なくずも1のアミノ酞残基が、構造、又は偎鎖の官胜基(芳銙族、脂肪族、そしお正又は負に荷電された)のいずれかで関連する、異なったアミノ酞にお眮換されたバリアントが含たれるがそれに限定されない。こうした眮換䜓は、アミノ酞関係の以䞋の蚘茉に埓っお行なわれるこずが奜たしい。
衚関連アミノ酞の䟋
Figure 2006506327
è¡š2に瀺すように、本発明のペプチドEP4アンタゎニストの別の眮換基は、少なくずも1のアミノ酞残基が陀去され、そしお違った残基にお眮換されお、そしお所定の䜍眮に挿入されるこずを包含する。
Figure 2006506327
è¡š2のカッコ内に蚘茉された3皮のアミノ酞残基が、タンパク質の構成に特別な圹割を果たしおいる。「Gly」は偎鎖を欠く唯䞀の残基であり、その結果鎖に柔軟性をもたらす。しかしながらこれは、αヘリックス構造以倖の2次構造の生成を促進する傟向がある。その圢状から「Pro」は、鎖をしっかりず拘束する。それは通垞βタヌン様構造を促進する傟向がある。「Cys」はゞスルフィド結合圢成に関䞎するこずができる。
朜圚的に氎玠ず結合可胜な「Tyr」は、「Ser」及び「Thr」ず有意な類䌌性を有する。
本発明のEP4ペプチドアンタゎニストのいずれかのアミノ酞成分が、それに察応する鏡像異性䜓(enantiomer)(同じアミノ酞であるがキラリティヌが反察)により眮換するこずができる。そのため、倩然に存圚するL-構造䜓のアミノ酞が、察応する鏡像異性䜓(enantiomer)にお眮換される、すなわちアミノ酞がD-構造䜓を有するこずになる。L-構造䜓のアミノ酞は、D構造䜓のアミノ酞ず同じ化孊構造䜓であるが、反察のキラリティヌ(chirality)を有する。さらにL-及びD-䜓の配眮は、R-又はS-型の配眮ずしお通垞蚀及されおいる。远加的なバリ゚ヌションずしおは、異なる空間構成の化孊矀を提䟛するβ-及びγ-アミノ酞があげられる。
䞊蚘の眮換に加え、さらに機胜的に類䌌する偎鎖を提䟛する合成アミノ酞を、ペプチド䞭に導入するこずができる。たずえば、芳銙族アミノ酞が、D-又はL-ナフチルアラニン、D-又はL-フェニルグリシン、D-又はL-2-チ゚ニルアラニン、D-又はL-1-,2-,3-,又は4-ピレニルアラニン、D-又はL-3-チ゚ニルアラニン、D-又はL-(2-ピリゞニル)-アラニン、D-又はL-(3-ピリゞニル)-アラニン、D-又はL-(2-ピラゞニル)-アラニン、D-又はL-(4-む゜プロピル)-フェニルグリシン、D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン、D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン、D-p-フルオロフェニルアラニン、D-又はL-p-ビフェニルアラニン D-又はL-p-メトキシビフェニルアラニン、D-又はL-2-むンドヌル(アルキル)アラニン、及びD-又はL-アルキルアラニンなどにお眮換するこずができ、ここでアルキル基が、眮換又は非眮換のメチル、゚チル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、む゜プロピル、む゜-ブチル、及びむ゜-ペンチルから成る矀から遞択される。
非カルボン酞系アミノ酞が、リン酞化、又は硫酞化(たずえば、-SO3H)したアミノ酞が提䟛されるように、負の荷電を有するよう生成されそれが非限定䟋ずしお考えられる。
他の眮換基は、倩然のアミノ酞ずアルキル基を結合しお生成された非倩然のアルキル化アミノ酞を含む。リシン及びアルギニンなどの倩然の塩基性アミノ酞が、アミン(NH2)の官胜基でアルキル基ず眮換するこずができる。さらに他の眮換基ずしおは、アスパラギン又はグルタミンのニトリル誘導䜓(たずえば、CONH2の官胜基に代えCN-成分を含有させる、メチオニンのスルホキシド誘導䜓があげられる。さらにペプチドに結合するいずれかのアミドを、ケトメチレン、ヒドロキシ゚チル、゚チル/還元アミド、チオアミド、又は逆方向に配眮された(reversed)アミド成分(たずえば、((-C=O)-NH-)に察し(-C=O)-CH2-),(-CHOH)-CH2-),(CH2-CH2-),(-C=S)-NH-)、又は-NH-(-C=O))にお眮き換えるこずができる。
埓っお共有結合にお修食したペプチドは、本発明の範囲内に含たれる。こうした修食が、ポリペプチドの遞択された偎鎖又は末端残基ず反応可胜な有機誘導物質ず、暙的ずされるポリペプチドのアミノ酞残基ずを反応させるこずにより、EP4ペプチドアンタゎニストに導入するこずができる。化孊誘導物質の以䞋の䟋は図瀺だけの方法にお提䟛されるが、本発明の範囲を限定する意図はない。システむン残基が、2-クロロ酢酞又はクロロアセトアミドなどのα-ハロゲン化酢酞(及び盞圓するアミン)ず反応し、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導䜓が埗られる。ヒスチゞン残基を、ゞ゚チルピロカルボン酞(たずえば、pH5.5乃至7.0で)などの化合物ず反応させるこずにより誘導可胜であり、その理由は本詊薬が、ヒスチゞン偎鎖に比范的特異的なためである。さらにp-ブロモフェナシル・ブロミドを䜿甚するこずができる(たずえば、反応をpH6.0で0.1Mのカコゞル酞ナトリりム(sodium cacodylate)にお行うこずが奜たしい)。リシン及びアミノ末端残基を、無氎コハク酞、又は他のカルボン酞無氎物などの化合物ず反応させるこずができる。α-アミノ酞含有残基を誘導する他の適切な詊薬ずしおは、むミド゚ステル(たずえば、メチルピコリンむミデむト)などの化合物ピリドキサヌルリン酞、ピリドキサヌル、クロロボロハむドラむド、トリニトロベンれンスルホン酞、O-メチルむ゜りレア、2,4ペンタンゞオン及びトランスアミナヌれによるグリオキシレヌトずの觊媒反応物があげられる。
アルギニン残基を、呚知方法の工皋により、フェニルグリオキサヌル、2,3-ブタンゞオン、1,2-シクロヘキサンゞオン、及びニンヒドリンなど1又は幟぀かの垞甚の詊薬ずの反応により修食させるこずができる。アルギニン残基の誘導化が、グアゞニン官胜基のpKaが高いこずから、アルカリ条件䞋におその反応を行なう必芁がある。さらに、これらの詊薬は、リシンのアミノ基、及びアルギニンのεアミノ基ずも反応可胜である。
チロシン残基それ自䜓の特異的修食は良く知られおいる。特異的でそしお非制限の䟋ずしおは、芳銙族ゞアゟニりム化合物又はテトラニトロ・メタンずの反応によるチロシニル残基䞊のスペクトロ暙識の導入があげられる。N-アセチルむミダゟル及びテトラニトロメタンを䜿甚し、O-アセチル・チロシニル皮及び3-ニトロ誘導䜓のそれぞれを生成するこずができる。
カルボキシル偎鎖基(アスパルチル又はグルタミル)が、1-シクロヘキシル-3-(2-モルフォリニル-(4-゚チル)カルボゞむミド又は1-゚チル-3-(4-アゟニア-4,4-ゞメチルフェニル)カルボゞむミドなどのカルボゞむミド(R'-N=C=N-R')ず反応するこずにより遞択的に修食するこずができる。さらにアスパルチル及びグルタミル残基を、アンモニりムむオンず反応させおアスパラギニル及びグルタミニル残基に倉換できる。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、盞圓するグルタミル及びアスパルチル残基ぞ脱アミド化される。
本発明のペプチドの他の修食には、技術的に呚知な方法によるプロリン及びリシンの氎酞化、セリル又はスレオニル残基の氎酞基のリン酞化、リシン、アルギニン及びヒスチゞンのαアミノ基のメチル化、N-末端アミンのアセチル化、䞻芁鎖アミド残基(又はN-メチルアミノ酞にお眮換)のメチル化、及び幟぀かの䟋におけるC-末端カルボキシル基のアミド化があげられる。
脂肪酞(C6-C18)を本発明のペプチドに共有結合させるず、付加的な生物特性が䞎えられ、たずえば、プロテアヌれ耐性、血挿タンパク質の結合、血挿半枛期の増倧、及び现胞内ぞの貫通などがあげられる。
修食の可胜性のあるリヌド(lead)ペプチドの䞊蚘説明は、その方法の範囲を限定するものずみなされるべきではなく、たた、鋳型ずしおの213.15などのリヌド(lead)ペプチドを䜿甚しお操䜜できる可胜のある修食を限定するものずみなされるべきでない。ペプチドの折り畳みの耇雑な性質によるペプチド・アンタゎニストの受容䜓結合の構成(conformation)も、EP4生物掻性に及がす修食ペプチドの圱響も、絶察的な確実性をもっお予枬するこずができない。埓っお修食ベプチド、その生物掻性を確認するための本発明に蚘茉された生物アッセむにおいお又は圓業者に技術的に呚知なものにおいお、生物掻性の確認するため詊隓すべきこずは、圓業者が容易に理解できよう。アッセむの非制限䟋ずしおは、盞圓するGPCRに結合する受容䜓、又は結合するリガンドの調節があげられる。GPCRs に関係し、そしおより具䜓的にはin vitro,ex vivo 及びin vivoアッセむのためのEP4受容䜓に関係する具䜓䟋が、圓業者に呚知で、そしおその遞択された䟋を図に明瀺し、さらに以䞋に蚘茉する。
EP4受容䜓生物アッセむ
EP4が、異皮性现菌、酵母、又は哺乳動物の発珟系で、組み換え的に発珟される組織又は现胞から、EP4の粟補によるか、粗補のいずれかによる調補物のEP4を(無现胞アッセむ以䞋を参照)を甚いお生物掻性を評䟡する倚くの公開された方法がある。
無现胞アッセむは、EP4タンパク質ず盞互䜜甚し、それによりEP4タンパク質の掻性を修食できる化合物の同定に䜿甚可胜である。たずえばこうした化合物は、EP4タンパク質を構造的に修食しそれにより掻性に圱響を及がすこずができる。さらに無现胞アッセむが、EP4タンパク質ずEP4結合パヌトナヌずの盞互䜜甚を調節する化合物を同定するために䜿甚される。EP4結合のパヌトナヌはPGE2である。特に奜たしい䟋においおこうした化合物の同定に䜿甚される無现胞アッセむは、特に緩衝溶液、EP4タンパク質、EP4結合パヌトナヌ、及び詊隓化合物を含む混合物から成る。詊隓化合物は、たずえばペプチド、ペプチド暡倣物、小分子、及び栞酞であっおもよい。怜出のため結合パヌトナヌは、攟射性栞皮などの特異的マヌカ、蛍光性化合物又は酵玠にお暙識化できる。次ぎにEP4タンパク質ず詊隓化合物ずの盞互䜜甚は、むンキュベヌション工皋、そしお掗浄工皋の埌に暙識レベルの決定にお怜出するこずができる。詊隓化合物の存圚䞋でのEP4ずEP4結合タンパク質ずの盞互䜜甚に察し詊隓化合物の非存圚䞋での盞互䜜甚ずの統蚈的に有意な倉化(増匷又は阻害)が、詊隓化合物に察するEP4生物掻性の促進的アゎニスト効果(擬䜓、又は増匷剀)又はアンタゎニスト効果(阻害)を瀺す。攟射性暙識化詊料を、シンチレヌション分光光床蚈にお蚈数するこずで定量可胜である。結合リガンドを、アセチルコリン・゚ステラヌれなどの酵玠ず結合させるこずができ、そしお結合されたEP4結合パヌトナヌを、酵玠アッセむにお定量するこずができる。
さらに無现胞アッセむは、EP4タンパク質ず盞互䜜甚しそしおEP4タンパク質の掻性を調節する化合物を同定するために䜿甚される。埓っお䞀䟋においお、EP4タンパク質ず詊隓化合物ずを接觊させ、そしおEP4タンパク質の生物掻性をモニタヌする。無现胞アッセむにおけるEP4タンパク質の生物掻性は、GTPの結合、GTPの加氎分解、Gαタンパク質の解離、アデニル・シクラヌれの掻性化、ホスホリパヌれ(A2,β、γ、及びD型異性䜓)の掻性化、リン脂質加氎分解、及びcAMP合成などあげられるがそれに限定されない。こうしたGPCRタンパク質の生物掻性の倉化を枬定する方法は、圓業者に十分に知られおいる。
EP4生物掻性の现胞を基盀ずするアッセむ
さらにEP4の生物掻性は、现菌、酵母、䞡生類若しくは哺乳類の党䜓にわたる现胞(䞋蚘の现胞ベヌスアッセむ(cell-based assays)を参照のこず)にお、EP4タンパク質が、倩然タンパク質又は融合タンパク質ずしお組み換え発珟される(たずえば、抗䜓゚ピトヌプ・タグ、緑色蛍光タンパク質、Gα又はβ-アレスチンに接合したEP4)前蚘现胞を甚いお枬定するこずができる。融合タンパク質は、倩然のタンパク質より幟぀かの利点がある、即ち融合タンパク質が、现胞、組織、及び生䜓内のEP4ポリペプチド又はEP4の生物掻性を盎接怜出できる。゚ピトヌプ(FLAG,HA,polyHIS,c-myc等)タグ付き(tagged)EP4は、免疫化孊染色法による现胞及び組織内タンパク質のトラッキングに有効であり、そしお免疫芪和性クロマトグラフィヌを介し玔粋か又は実質的に玔粋なEP4タンパク質の単離の支揎ずなり埗る。EP4タンパク質に融合される緑色蛍光タンパク質(GFP)は、たずえば生きた现胞又は固定现胞においお他の现胞タンパク質ずの凝集又は䌚合、゚ンドサむトシヌス小胞内での内圚化、移動(trafficking)、分解などのEP4タンパク質の䜍眮付け、そしおその移動の远跡に䜿甚するこずができる。GFP及び葉酞の融合EP4を、ダむマヌ及びオリゎマヌの圢成、及び他のシグナル分子ずの䌚合を研究し、そしおモニタヌするために䜿甚するこずができる。EP4-Gαタンパク質の融合䜓が、アゎニスト又はアンタゎニストに応答するGタンパク質によりGTPの結合及び加氎分解を枬定するために䜿甚され、そしお圓業者に知られたこれらの方法を䜿甚し、アゎニスト掻性又はアンタゎニスト掻性に関する小分子化合物ラむブラリヌのスクリヌニング、及び詊隓に䜿甚される。これらの䟋は、基瀎及び応甚科孊研究においお有効な融合パヌトナヌ及びそれらの䜿甚を明瀺しおいるがそれに限定する意図はない。
EP4タンパク質の生物掻性を調節し、そしおEP4タンパク質の生物掻性の増倧又は枛少に応答しお、誘発されるか又は阻害されるEP4遺䌝子又はこれらの遺䌝子矀の発珟を調節する化合物の同定に现胞ベヌスアッセむ(cell-based assays)が甚いられる。埓っお䞀䟋においお、EP4の生成可胜な现胞を、倩然又は合成のEP4アゎニスト/アンタゎニストの存圚又は非存圚䞋で詊隓化合物ず共にむンキュベヌトし、そしおそのEP4の生物掻性を枬定する。その結果により圢成されたEP4の生物掻性の倉化を、詊隓化合物ず接觊されおいないコントロヌルEP4産生现胞ず比范する。EP4生物掻性を調節する方に詊隓化合物の効胜、芪和性及び䜜甚を評䟡するためにこれらの枬定法が甚いられる。
治療方法
本発明は、尿排出の枛少及び急性又は慢性の腎障害ず蚺断された治療患者の予防方法ず治療方法ずの䞡方を提䟛する。医療的な症状及びその発病が、阻害されるかあるいはそれぞれその進行が遅延されるようにEP4の異垞を特城付ける症状が明瀺される前に、予防薬の投䞎を行なうこずができる。䞀般的に、予防方法又は治療方法は、EP4アンタゎニストの有効量を必芁な察象物に治療ずしお投䞎するこずを含む。本発明に蚘茉されおいるように、適切なEP4アンタゎニスト及びその誘導䜓の䟋は、ペプチド、ペプチド暡倣物及び小分子擬䜓を含むがそれに限定されない。
尿排出の枛少、血䞭の尿窒玠(BUN)及びクレアチニンレベルの増倧により特城付けられるヒトの腎機胜䞍良による疟患の治療ずしお、本発明のEP4アンタゎニスト及びその誘導䜓の療法的な䜿甚をうら付けるデヌタが、腎症の動物モデルから埗られた。腎䞍良による急性腎疟患が、虚血による二次的な腎灌流の欠乏によるか又は攟射性線造圱剀、抗腫瘍性薬、抗生物質、免疫阻害剀、及び重金属により介圚される腎毒玠の発䜜により起こる可胜性がある。腎䞍良が、䞡偎の腎臓動脈の閉塞(虚血性腎症)又はシスプラチンの泚入(急性尿现管の壊死)により䜜成された2匹のラットのモデルが、ヒトの患者が眹病する腎障害を十分にに特城付け、そしおその腎障害ず近䌌しおいるこずを明瀺しおいた(by Lieberthal,W.,Nigam,S.K.(2000);Am.J.Physiol.Renal.Physio.278(1):F1-F12を参照)。䞡方のラットのモデルを甚いるこずにより、腎障害及び腎臓機胜の改良に本発明のEP4アンタゎニスト及びその誘導䜓の有甚性が明瀺された。幟぀かの䟋が提䟛され、そのうち本発明のEP4アンタゎニスト及びその誘導䜓を䜿甚するこずにより、ラット、ドック、ブタの糞球䜓の濟過、腎臓の血流、及び尿排出の改良が明瀺された。それは、違った皮(ラット、ドック、及びブタ)に瀺されおいるように、本発明のEP4アンタゎニストの薬理的効胜が、受容䜓の配列及びそれらの組織ぞの分散における類䌌性に基づいお、ヒトの察象物ぞさらに拡匵できるこずが予枬される。
EP4アンタゎニストの薬理的な調補
LD50(集団の50%たでの臎死投䞎量)及びED50(集団の50%の治療有効投䞎量)などの本発明のEP4アンタゎニストの毒性及び治療の有効性は、実隓動物においお暙準的な医薬方法により決定するこずができる。毒性ず治療効果ずの投䞎量比は、治療指数ずしお知られ、そしおそれが、LD50/ED50比ずしお衚すこずができる。倧きな治療指数を瀺す化合物が奜たしい。こうした化合物の投䞎量(dosage)は、ED50を含むが毒性をほずんど含たないか、党く含たない埪環濃床の範囲内であるこずが奜たしい。この投䞎量(dosage)は、甚いられる投䞎量(dosage)の圢匏、及び投䞎経路に基づいおこの範囲内にお倉化しおよい。in vitro及びex vivo分析法、及び動物の研究においお決定されるようなIC50(その症状の50%阻害を達成する詊隓化合物の濃床)を含む埪環血挿濃床範囲を埗るための動物のモデルにおいお、その投䞎量(dose)を凊方するこずができる。次ぎにこうした情報を甚いお、ヒトに有効な投䞎量を正確に決定するこずができる。EP4アンタゎニストの血挿レベルを、たずえば、質量分光分析ず連結した高速液䜓クロマトグラフィヌ(HPLC-MS)により枬定するこずができる。EP4アンタゎニストの有効投䞎量は、0.01ÎŒg乃至100mg/kgにお可胜で、そしお投䞎経路、医薬物の調補、及び導入モデルにより決定される。
本発明は、以䞋の非限定詊料によりさらに詳现に明瀺される。
ペプチドの化孊合成
213.15(配列番号1)の構造に基づく幟぀かのペプチドを、F-moc化孊及び固盞メリフィルド(Merrifield)ペプチド法を甚いお合成した。これらペプチドの構造は、衚3(配列番号2乃至13)に1芧ずしお蚘茉されおいる。これらペプチド類のトリフルオロ酢酞塩の玔床を、HPLCず質量分析にお分析した。䞀般的合成法は、以䞋の文献(「固盞ペプチド合成」Stewart & Young,W.H.Freeman Co.San Francisco,1969;「タンパク質」,Erikson and Merrifield,Vol.2.(ed.Neurath & Hill))に蚀及するこずにより十分に理解されるであろう。さらに氎ぞのペプチド溶解床を、䞀芧ずしお衚3に蚘茉する。
虚血性腎症のラットのモデルの糞球䜓濟過及び尿排出に及がす213.15の誘導䜓の効果
䞡偎の腎臓動脈を30乃至60分間固定するこずにより腎臓の再朅流ずなり、そしお糞球䜓の濟過率の劇的な枛少、尿の排出、及び管现胞の死などの関連した䜙埌疟患が生ずる。このモデルは、ヒトの欠乏尿腎䞍党ずいう特定の重倧な結果を再珟する。腎損傷の埩垰における皮々の213.15誘導䜓の効胜が枬定された。
虚血性腎症のモデル
スプレむグ・ダりレむ・ラット(Sprague-Dawley rats(250-300g))に麻酔をかけ、そしお頚静脈にカニュヌレを挿入し、ペプチド又は生理食塩氎を泚入する。それに加え頚動脈にカニュヌレを挿入し、圧倉換噚(Gould)にお動脈の血圧枬定し、そしお血液詊料を採集した。膀胱にカニュヌレを挿入し尿を採取した。導尿管の挿入の埌、[3H]むンスリン(8ÎŒCi/hr),[14C]アミノ銬尿酞(0.8ÎŒCi/hr)及び麻酔薬(ケタミンずキラゞン(Ketamine and xylazine),9:1 w:w;0.095ml/ml)混合液の泚入(1.6ml/hr)を開始した。さらにその動物を40分間にお安定化させた。2個の尿詊料を、10分間にわたっお採取(40から50分、ず50から60分)し、基本GFRの安定性を評䟡した。45分ず55分にお血液詊料のそれぞれを採取した。次ぎに巊右の腎動脈の鉗子止め(clamped)を60分間行い、急性虚血性腎症状を誘発させた。虚結症状の期間埌その動物を、ペプチド,213.19-213.30,(ボりラス(bolus)の1mg/kgの静泚)、又は頚静脈を介した生理食塩氎にお凊理した。次ぎに血液及び尿詊料を、さらに2時間の間に20分毎に採取した。糞球䜓濟過速床(GFR)及び尿流量率床([3H]ドックリン法にお枬定)、及び腎血挿流量([14C]アミノ銬尿酞法にお枬定)を、異なる時間にお、そしお60分間を平均しお(薬剀投䞎しお20-30分埌)決定した。
衚213.15の構造に基づく合成されたペプチドラむブラリヌ
Figure 2006506327
Ο倧文字はL-アミノ酞を瀺し、小文字は、D-アミノ酞を瀺すbip:D-(4,4)ビフェニルアラニンBipL-(4,4)ビフェニルアラニン
*溶解性が氎䞭にお決定される。
尿の流量率床(図1A)及びGFR(図1B)に関する結果は、薬剀の投䞎から20分埌から開始し、60分にわたる尿の平均流量率床及び平均GFRずしお衚される。尿排出の効胜順䜍が、213.15<213.19≧213.21であり、他のペプチドも213.15ず同様の効胜があった。さらに、同じように213.19及び213.21は、GFRの増倧を瀺した。GFRの改良が、他のペプチドに察しお芳察されなかった。GFR、尿の流量率床及び腎血挿の流量率の改良には、ペプチド213.19及び213.21が、䞀貫しお他のペプチドより優れおいた。
213.21の構造に基づいお、より類䌌した4皮の213.27乃至213.30が、腎臓動脈の閉塞のラットのモデルにおいお合成されそしお詊隓された。GFRの結果(60分間の平均ず薬剀の泚入から20分埌の開始)を、図Cに瀺す。比范のため213.15及び213.21をその図に蚘茉する。もちろん213.28ず213.29が共に、40分間に腎臓動脈の鉗子止めを倖した埌40分間にわたり、察照ずした213・15ず比范し倍ず倍のGFRが増倧した。さらに詊隓化合物のうち有意に溶解可胜な(衚213.28ず213.29は、芪化合物の213.15より有意に有効であるこずが芋出された。
正垞なラット、ドック及び仔ブタの腎臓機胜に及がす213.29の投䞎(dose)応答
213.29(1,2,3,4,5,10mg/kg ボヌラス静泚(bolus iv))の投䞎応答が、麻酔にかけられ雌のビヌグル・ドックにお詊隓された。少なくずも1週間の銎化ず1昌倜の絶食の埌、それぞれの動物を、チオペンタヌル(5mg/kg)による静脈泚射にお麻酔にかけ、その麻酔をむ゜フルラン䞋にお持続した。その動物を保枩し、そしおその䜓内枩床を15分毎にモニタヌした。血圧をモニタヌする頚動脈カテヌテル、及び尿を採取する導尿管を取り付けた。5時間の導入ずしお十分な党投䞎量0.05mCiの[3H]のドックリン及び0.005mCiの[14C]パラアミノ銬尿酞(PAH)を含む、生理食塩氎(10mL/kg/h)の静泚による䞀定量の泚入を開始した。詊料ずしおの尿を10分毎に採取した。各10分間の䞭間点にお血液詊料を採取した。攟射性暙識による60分間の平衡化の埌、逐次増加(incremental)による213.29の投䞎量(doses)が、頭郚静脈を経由しお静脈内に泚入された。
血液詊料及び尿詊料(n=30/dog)䞭の攟射胜を、シンチレヌション分光噚にお決定した。研究の結果を図Aに瀺した。GFR及び尿の流動速床では、劇的にさらに最倧の増倧が、正垞なドックの4mg/kgの213.29にお芳察された。さらに図2Bは、ラット及び仔ブタにお行なわれた同様の研究結果を瀺しおいる。GFR、尿の流量率及び腎血挿の流量率における最倧応答が芳察された投䞎量を、図Bの挿入図に瀺す(n=動物の数)。その結果により瀺されたこずは、213.29は、皮ずは無関係な様匏で腎臓ぞの朅流の増倧、GFRの増倧、及び尿排出の増倧を匕き起こすこずである。これらの結果は、瀺唆によれば、213.29が、ヒトにおける腎灌流、GFR及び尿の流量の増倧に有効であるこずを瀺唆しおいる。
PGE2にお誘発されたブタの䜎郚䌏圚静脈リングの拡匵に及がす213.29の効果
動物
Animal Care Committee of the Research Center of the St.-Justine Hospitalにお受け入れられ方法により、ペヌクシャ皮(Yorkshhire)の仔ブタ(2乃至4日経過)が、この研究に甚いられた。簡単にいうず、動物をハロタン(1.5%))にお麻酔にかけ、そしお底郚の倖郚䌏圚の静脈を取り出し、以䞋の組成物を有し、すなわちNaCl 120,KCl 4.5,CaCl 2.5,MgSO4 1.0,NaHCO3 27,KH2PO4 1.0,グルコヌス 10を含み、そこに1.5U/mlのヘパリンを添加した組成物(mM)を有する冷华したクレブス・緩衝液(Krebs buffer)(pH7.4)内の所定の䜍眮に眮いた。
噚官槜アッセむ
䌏圚静脈を、倖生組織から枅浄にし、4mmのリングに切断し、それをKrebs緩衝液を含む個々に被芆された(jackted)噚官槜(15ml;Radnoti Glass,Monrovia,CA)に眮いお、さらに37℃に維持した。その溶液を、O2/CO2の混合ガス(95/5)にお泡立たせた。各実隓に8個のリングを䜿甚し(各䌏圚静脈から぀)、そしお頻繁な掗浄に䌎う2.0grの受動匵力(passive tension)、及びその匵力の調敎䞋にお60分間平衡状態にした。その匵力を、匵力倉䜍転換装眮により枬定し、Work Bench゜フトり゚ア(Kent Scientific,Litchfield,CTから共に)を甚いお、蚈算デヌタ獲埗システムにお蚘録した。
実隓方法
PGE2に察する䜎郚倖性䌏圚静脈の血管拡匵応答が、EP2(30%)ずEP4(70%)の刺激からの結果ず芋受けられる。この組織が、1.5乃至2.0grの匵力の増倧を誘発したU46619(2x10-7M)(トロンボキサンA2擬䜓)により、最初にチャレンゞされた。応答のないリングを廃棄した。U46619ぞの応答が定垞状態に達する時に薬剀を添加した。薬剀に察する応答が芳察されない時、30分間にお、組織内に薬剀の適切な分散を確実なものずした。次ぎにPGE2(10-10-10-6M)ぞの投䞎量応答曲線が、各詊隓薬剀の存圚又は非存圚䞋にお埗られた。
2乃至8の実隓の平均した結果を図3に瀺す。その結果は、仔ブタに、1ÎŒMのペプチドの存圚䞋で1ÎŒMのU46619(トロンボキサンA2擬䜓)ず予め接觊させた仔ブタの䜎郚䌏圚静脈リングにおいお、1ÎŒMのPGE2により生成される拡匵の逆転の比率(percent reversal)ずしお衚される。213.29は、この組織内のPGE2における拡匵効果の玄50%逆転させた。
ヒト血枅における213.29の安定性、及び代謝ずしおの生物掻性
213.29ペプチドが、血枅プロテアヌれを掻性にするず考えられるL-アミノ酞を含む。213.29の倉性生成物を特城付けるための等分量(aliquots)(100ÎŒg)を、ヒトの血枅䞭にお時間を倉えお、37℃におむンキュベヌトした。その反応物をトリフルオロ酢酞(0.24ml;1M)にお急冷し、10分間氷䞊におむンキュベヌトし、さらにその埌TFA(0.25ml;0.05%)を添加し、そしお遠心分離にかけお矊毛塊状物を沈殿させた。䞊枅物をSepPak C18カヌトリッゞ䞊で固盞抜出により粟補した。0.05%のTFA䞭でそのペプチドを、80%のアセトニトリルにお垌釈し、溶離物を凍結也燥した。次ぎにそのペプチドを酢酞(0.1Nにお400ÎŒl)で再溶解し、逆盞HPLCのC18カラム䞊にお分離した。画分を含むピヌク物質を採集し、ペプチド断片の質量をMALDI-TOFにお決定した。
図4Aは、経過時間に察する213.29の倉性、及び1のカルボキシ末端のリシン(213.291)(図4B)欠損における1の代謝生成物の出珟を瀺す。切断が迅速で2分より短い半枛期を䌎う。第二の代謝産物ずしおの213,292(図4B)が、本実隓に芳察されなく、そしお分解反応においお珟れるのが遅い。
さらに代謝産物が、生物掻性を有するかどうか詊隓するためのペプチド213.29、213.292、及び213.292を、100nMのPGE2の存圚䞋におヒトEP4リセプタヌを組み換え発珟するHEK293现胞ず共にむンキュベヌトした。cAMPのレベルを攟射性免疫法にお決定し、そしおその結果を図4Bに瀺す。これら自身のペプチドは、受容䜓の刺激を惹起しないが、PGE2にお刺激されたcAMPの合成を20-30%だけ阻害した。
213.29が、他のプロスタノむド受容䜓の生物的応答に圱響しないこずを実蚌するため、プロスタノむド受容䜓の遞択的リガンド(ブタプロスト-EP2;17-フェニルPGE2-EP1;PGF2a-FP;U46619-TP;M&B28767-EP3)を、予め蚘茉されそしお怜蚌されたブタの網膜(Li,D.Y.,Abran,D.,Peri,K.G.,Varma,D.R.,Chemtob,S.(1996);J.Pharmacol.Exp.Ther.278(1):370-7)のex vivoにおける血管狭窄分析法に䜿甚した。分嚩期前埌の高埪環レベルのプロスタグランゞンを䞋限調節するこずによっお、新生血管系のプロスタノむド受容䜓の密床が、最小ずなるこずから、新生ブタを、プロスタグランゞン合成酵玠の遮断剀のむブプロフェン((ibuprofen)(30mg/kg(䜓重の)/8時間乃至24時間))にお凊理し、受容䜓の密床及び血管運動効果を増倧させた。
方法
県杯を調補するために、鋞状瞁(ora serrata)より3乃至4mm埌郚に円圢状の切開が行なわれ、網膜の取り扱いを最少限にし内郚節及び硝子䜓を取り出した。留たっおいる県杯を、20mlのKreb'sの緩衝液(pH 7.35乃至7.45)を含む20mlの組織济槜䞭でワックス・ベヌスに合わせピンにお固定し、そしお21%の酞玠ず5%の二酞化炭玠にお、37℃で平衡化した。その調補物を30分間にお安定化した。
0.1ÎŒMのリガンドが、济槜液䞭に添加される前に213.29(10ÎŒM)を、5分間にわたり添加した。脈管の倖埄(outer vessel diameter)を、実䜓顕埮鏡(dissecting microscope(Zeiss M 400)䞊に取り付けられたビデオ・カメラに蚘録し、そしおその応答をデゞタル画像解析装眮(Sigma Scan Software,Jandel Scientific,Corte Madera,CA)にお定量化した。アゎニストを局所適応する前及び適応した5分埌に、その血管の盎埄を蚘録した。枬定がそれぞれ3回繰り返され、そしお1%より䜎い倉動が瀺された。図5に瀺すように、213.29は、プロスタノむド受容䜓の受容䜓遞択アゎニストの収瞮応答又は拡匵応答に圱響を䞎えなかった。埓っお213.29は、プロスタノむド受容䜓EP4に高い遞択性があるず考えられる。
虚血性腎症のラットのモデルの腎機胜の改良におけるフェノルドパム(0)ず213.29ずの比范
フェノルドパム(Fenoldopam)は、ドパヌミン受容䜓のサブタむプの1アゎニストであり、そしお限定されるが臚床的に及び動物実隓においお尿排出の増倧を瀺した(Singer,I.and Epstein,M.1998;Am.J.Kidney Dis.31(5):743-55)。虚血性腎症のラットのモデルの腎機胜の改良におけるフェノルドパム(Fenoldopam)ず213.29ずの効胜(実斜䟋2に蚘茉)を比范した。213.29を静泚ボヌラスで1mg/kg䞎え、䞀方フェノルドパム(Fenoldopam)を静泚ボヌラスで0.6ÎŒg/kg、続いお0.6ÎŒg/kg/h実隓期間䞭に䞎えた。図6Aに瀺すように、フェノルドパム(Fenoldopam)ず213.29が共に同皋床の尿排出を増倧させるばかりか、213.29は、腎機胜ずしおの朅流、及びGFRを有意に改良するこずができる。血液尿玠窒玠(BUN)及び血枅のクレアチニン・レベルを、72時間埌に枬定し、そしお図6Bに瀺すようにフェノルドパム(Fenoldopam)ず213.29が共に、BUN及びクレアチニン・レベルの枛少における効果が同じであった。
腎䞍党(虚血性腎症のラットのモデルにおいお)に眹っおいるラットに213.29を投䞎する保護効果
腎動脈ぞの鉗子止めを解きそしお薬剀を投䞎しお24時間又は72時間埌に、実斜䟋にお䜿甚した動物から腎臓を採取した。切断した組織により実隓を行なった。
図に瀺すように、糞球䜓呚蟺の膚匵を瀺す糞球䜓の数は213.29による治療結果ずしお有意に枛少した。同様に现胞の屑を含む採取管の数が213.29によっお有意に枛少した。これらの結果では、腎機胜の改良䞊びに超埮现構造䜓の損傷ずその埌の虚血性障害からの保護に、213.29の䜿甚を指摘しおいる。
䞡偎の腎動脈鉗子止め(clamping)により腎䞍党に眹ったラットに、213.29を1日1回投䞎する効果に察する1日2回投䞎する効果
213.29の投䞎頻床の増倧が、ラットRAO-モデルの腎機胜に良奜な効果を及がすかどうかの決定するために、1mg/kgの213.29を1日1回ず1日2回静泚し、そしお日目ず5日目ずを比范した。埗られた結果を図8に瀺す。日たでの糞球䜓濟過速床(GFR)、腎血挿流床(RPF)及び尿の流量率(UV)が、1日1回(qd)ず1日2回(bid)の投䞎の堎合同じ皋床に改良された。しかしながら、これらの腎機胜パラメヌタは、薬剀が1日1回よりむしろ1日2回投䞎された堎合に1日目に劇的な改良を瀺した。埓っお、薬剀の薬物動態孊ず結び぀けお213.29の投䞎頻床が、腎機胜の機胜䞍良な堎合における腎機胜を改良するこずができる。
シスプラチンによる急性尿现管の壊死、及び腎䞍党ずなっおいるラットにおける213.29の投䞎効果
急性尿现管の壊死、及び腎䞍党が、攟射線造圱剀(radiocontrast agent)、原ガン性化合物、及び抗䜓を䜿甚する盎接的結果である。ラットのシスプラチンに誘発される急性尿现管の壊死モデルが、ヒトの腎䞍党の倚くの特性を再生するために瀺された(Lieberthal,W.,Nigam,S.K.(2000);Am.J Physiol.Renal.Physiol.278(1):F1-F12)。
シスプラチンにお誘発される急性尿现管壊死のラットのモデル
急性尿现管の壊死が、1日目Sprague-Dawley オスのラットに17.5mg/kgのシスプラチンを泚入するこずで誘発された。5日目たで、腎臓機胜のパラメヌタすなわちGFR,RPF及びUVが、無芖される量たで劇的に枛少した(図9AにおけるSal[生理的食塩氎」カラム)。これは、シスプラチンで治療したラットにおいお以埌50%の死亡率であった。血液尿玠窒玠(BUN)及びクレアチニンのレベルが、5日目たで劇的に増倧した(デヌタを明瀺しおいない)。
さらに213.29がこれらの症状に有益であるかどうかを刀定するために、1mg/kgラットに静泚埌5日目にお、腎臓機胜詊隓を行なった。図9Aに瀺すように、GFR,RPF及びUVが、生理食塩氎にお凊理したラットず比范しお劇的に改良した。化合物を、5mg/kgにお1日に3回(tid)䞎えるこずを、2日目より開始しそしお5日たで継続した(図9A)。血液尿玠窒玠ずクレアチニンずのレベルが共に予期したように枛少した。
腎䞍党の2匹のラットのモデルにより埗られた結果(虚血性又は腎毒性によりヒトの急性腎䞍党の重芁な特性を再生するモデルずしお文献[Lieberthal,W.,Nigam,S.K.(2000);Am.J.Physiol.Renal.Physiol.278(1):F1-F12]においお十分に実蚌され受け入れられた)により瀺されたこずは、213.29及びその誘導䜓が腎機胜を改良し、そしお腎障害の悪化に察する保護を提䟛する。したがっお、これらの化合物が、急性腎䞍党及び慢性腎䞍良ずなるヒトの堎合の治療剀ずしお䜿甚するこずができる。
本発明は、その奜たしい実斜䟋の方法により本明现曞に蚘茉されおいるが、添付されたクレヌムに明蚘されおいるように、本発明の粟神及び特性から逞脱するこずなく、これを倉曎するこずができる。
本発明を䞀般的に説明するこずで、本発明の奜たしい態様を䟋瀺するための添付図面に぀いお以䞋説明する
図は、虚血性腎症のラットのモデルにおいお尿の流量率尿のΌl/h/kg(䜓重)ずしお衚珟されるに及がす213.15及び盞圓する誘導䜓(è¡š3を参照)の効果を瀺しおいる。 図は、虚血性腎症のラットモデルにおける、60分間にわたる(薬剀泚入から20分から80分埌で䞔぀鉗子止めをはずした盎埌)平均の糞球䜓濟過率(GFR)に及がす213.15及び盞圓する誘導䜓(è¡š3を参照)の効果を瀺しおいる。 図は、虚血性腎症のラットモデルにおける、60分間にわたる(薬剀泚入から20分から80分埌で䞔぀鉗子止めをはずした盎埌)平均の糞球䜓濟過率(GFR)に及がす213.15及び盞圓する誘導䜓(è¡š3を参照)の効果を瀺しおいる。 図は、正垞なビヌグル・ドックのGFRにおける213.29の甚量の応答を瀺しおいる。 図は、ラット、ドック、及び仔ブタにおける腎機胜パラメヌタに及がす213.29の最倧効果を瀺しおいる。 図は、U46619(トロンボキサンA2擬䌌)にお前収瞮された仔ブタの䜎郚䌏圚静脈リングにおいおPEG2にお圢成される拡匵に及がす213.29の効果を瀺しおいる。 図4は、ヒト血枅における213.29の枛成(degradation)プロファむルを瀺しおいる。このペプチドは血枅プロテアヌれに感受性のあるカルボキシ末端で2個のリシンを含む。その枛成(degradation)により、1個のカルボキシルリシン[213.291]、又は2個のカルボキシルリシン[213.292]のいずれかを欠損したペプチドにおいお生ずる。カルボキシルロむシン残基は、実隓条件䞋でヒトの血枅による枛成(degradation)にお完党に耐性があるず芋られる。 図4Bは、现胞ベヌスアッセむ(cell based assay)にお213.29及びその代謝物の生物掻性を瀺しおいる。ヒトEP4を発珟するHEK293现胞を、213.29及びその代謝産物213.291及び213.292の存圚又は非存圚䞋で、100MのPGE2にお刺激した。攟射性免疫アッセむにより決定されるcAMPのレベルはpmol/105现胞で衚した。 図は、腎毛现血管収瞮アッセむでの仔ブタにおける他のプロスタノむド受容䜓(ブタプロスト-EP2;17-フェニルPGE2-EP1;PGF2-EP1;PGF2a-FP;U46619-TP;M&B28767-EP3)の遞択的アゎニストに刺激された収瞮応答に及がす213.29の効果を瀺す。 図は、ラットの腎臓動脈閉鎖(RAO)モデルにおいお、213.29の静泚ボヌラス((bolus)(1mg/kg))に応答した糞球䜓の濟過率(GFR)、腎血挿流量(RPF)及び尿の排出によっお評䟡されるような腎機胜の改良を瀺す。コントロヌルずしおフェノルドパム(fenoldpam)(0.6ÎŒg/kgのボヌラス((bolus)、続いお実隓䞭0.6ÎŒg/kg/h)を䜿甚した。 図は、ラットのRAOモデルにおける213.29及びフェノルドパム(fenoldpam)に応答する血液尿窒玠(å°¿)及びクレアチニンのレベル(腎機胜パラメヌタを図に瀺す(Shamはコントロヌルずしお擬䌌手術されたラットの意味である)を瀺す。 図は、䞡偎の腎臓動脈に玄1時間の鉗子止め(clamping)を受け、そしお1 mg/kgの213.29の静泚ボヌラス(Bolus)にお毎日(日に1回)投䞎されたラットの腎臓組織の代衚的䟋を(糞球䜓呚蟺の空間に赀血球の浞出、及び管閉塞の存圚)図匏的に瀺す。その結果は、213.29の凊理により、糞球䜓呚蟺の赀血球の浞出、及び管の閉塞を有意に枛少させ、そしお虚血性急性腎䞍党のラットのモデルにおける腎機胜の回埩が、有意に導かれたこずを瀺しおいる。 図は、䞡偎の腎臓動脈に1時間の鉗子止め(clamping)を受けた動物にペプチド番号を毎日(qd)(日に1回)、及び日に2回(bid)(日に2回)投䞎しお埗られたRPF,GFR,及びUVの尿流量率によっお評䟡されるような腎臓機胜における改良を瀺す。 図は、急性尿现管の壊死(日に1回シスプラチンを17.5mg/kg腹腔内泚入されたラット)のラットのモデルにおける5日埌の腎臓機胜パラメヌタを瀺しおいる。生理食塩氎(saline(Sal))にお凊理されたラットの糞球䜓の濟過率(GFR)、腎血挿流量、及び尿の排出が、5日たでに極めお䜎いレベルに䜎䞋した、すなわち213.29(1mg/kg)の投䞎が5日目で、生理食塩氎にお凊理されたラットの尿のパラメヌタが改良された。しかしながら、213.29(5mg/kgを日に3回)におラットを凊理し、日目に開始し、5日たでに腎臓機胜のほが党おのパラメヌタが正垞化された、すなわち血液の尿窒玠(BUN)及びクレアチニンのレベルの枛少ず関連した腎臓機胜が改良された。 図9Bは、シスプラチンにお凊理されたラットの腎組織を図匏的に瀺す。213.29の治療(5 mg/kg日に3回)により、肥倧症糞球䜓及び閉塞を含む集合管の数が枛少した。

Claims (27)

  1. 以䞋の䞀般匏
    −−−−−−−−−
    ここで、
    は氎玠原子及びカルバメヌト基又はアシル基である保護基、から成る矀から遞択され
    は぀及び぀の−リゞン残基から成る矀から遞択され
    は、−−ビフェニルアラニン及び−ビフェニルアラニンから成る矀から遞択され
    はであり
    はであり
    は及びから成る矀から遞択され
    は及びから成る矀から遞択され
    は、、及びから成る矀から遞択され
    は及び䞍圚から成る矀から遞択され
    は及び䞍圚から成る矀から遞択されるを有する、プロスタグランゞン受容䜓のペプチドアンタゎニスト。
  2. が぀の−リゞン残基である、請求項に蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  3. がである、請求項又はに蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  4. がである、請求項〜のいずれか項に蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  5. が及び䞍圚から成る矀から遞択される、請求項〜のいずれか項に蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  6. が氎玠である、請求項〜のいずれか項に蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  7. が−ビフェニルアラニンである、請求項〜のいずれか項に蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  8. アシル基が、シクロヘキシル、フェニル、ベンゞル、䞊びに〜個に及ぶ炭玠原子の短い盎鎖アルキル及び分枝鎖アルキルから成る矀から遞択される疎氎性郚分である、請求項〜のいずれか項に蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  9. アシル基がアセチル基である、請求項に蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  10. アシル基がベンゟむル基である、請求項に蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  11. 213.19(bip)tsyealk(配列番号2)213.20(bip)tsyeglk(配列番号3)213.21(bip)tsyealKK(配列番号4)213.22(bip)tsyeglKK(配列番号5)213.23(bip)tsyeslK(配列番号6)213.24(bip)tsyeslKK(配列番号7)213.25(bip)tsyeaK(配列番号8)213.26(bip)tsyesK(配列番号9)213.27(Bip)tsyealKK(配列番号10)213.28(bip)tsyeaLKK(配列番号11)213.29(Bip)tsyeaLKK(配列番号12)及び213.30(bip)tsyealGKK(配列番号13)から成る矀から遞択され、
    ここで、Bipが−ビフェニルアラニンであり、そしおbipが−ビフェニルアラニンであり、そしお−アミノ酞は小文字で識別され、そしお−アミノ酞は倧文字で識別される、請求項に蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  12. プロスタグランゞン受容䜓の生物掻性を阻害するこずができる、請求項〜のいずれか項に蚘茉のペプチドアンタゎニスト。
  13. プロスタグランゞン受容䜓の生物掻性を阻害するこずができる、請求項に蚘茉のペプチドアンタゎニストのペプチド暡倣物。
  14. 請求項に蚘茉のペプチドアンタゎニストを玄〜玄含んで成る医薬組成物。
  15. 請求項に蚘茉のペプチド暡倣物を玄〜玄含んで成る医薬組成物。
  16. 末期の腎疟患を凊眮する方法であっお、治療的に有効量の請求項に蚘茉の医薬組成物を必芁ずされる患者に察し投䞎するこずを含んで成る方法。
  17. 急性腎䞍党を凊眮する方法であっお、治療的に有効量の請求項に蚘茉の医薬組成物を必芁ずされる患者に察し投䞎するこずを含んで成る方法。
  18. 腎機胜障害を凊眮する方法であっお、治療的に有効量の請求項に蚘茉の医薬組成物を必芁ずされる患者に察し投䞎するこずを含んで成る方法。
  19. 糞球䜓濟過を向䞊させるための方法であっお、治療的に有効量の請求項に蚘茉の医薬組成物を必芁ずされる患者に察し投䞎するこずを含んで成る方法。
  20. 尿排出量を向䞊させる、請求項に蚘茉の方法。
  21. 動脈管開存症を凊眮するための方法であっお、治療的に有効量の請求項に蚘茉の医薬組成物を必芁ずされる患者に察し投䞎するこずを含んで成る方法。
  22. 動脈管を閉じる、請求項に蚘茉の方法。
  23. アッセむにおいお請求項に蚘茉のペプチドアンタゎニストを䜿甚する方法であっお
    倩然に又は組換え的にプロスタグランゞン受容䜓を発珟しおいる现胞又は組織を培逊するステップ
    前蚘培逊现胞又は組織を、䞀定量の請求項に蚘茉のペプチドアンタゎニストを甚いお、既知の濃床の前蚘受容䜓のアゎニストの存圚䞋又は䞍圚䞋で凊眮するステップ
    αタンパク質による結合及び加氎分解、環状アデノシン䞀リン酞の合成、现胞カルシりムの倉化、现胞増殖䞊びにあるいは分化、遺䌝子発珟の倉化及び平滑筋収瞮又は拡匵から成る矀から遞択される、前蚘受容䜓の生物掻性の又は耇数の芳点を枬定するステップ、
    を含んで成る方法。
  24. アッセむにおいお請求項に蚘茉のペプチド暡倣物を䜿甚する方法であっお
    倩然に又は組換え的にプロスタグランゞン受容䜓を発珟しおいる现胞又は組織を培逊するステップ
    前蚘培逊现胞又は組織を、䞀定量の請求項に蚘茉のペプチド暡倣物を甚いお、既知の濃床の前蚘受容䜓のアゎニストの存圚䞋又は䞍圚䞋で凊眮するステップ
    αタンパク質による結合及び加氎分解、環状アデノシン䞀リン酞の合成、现胞カルシりムの倉化、现胞増殖䞊びにあるいは分化、遺䌝子発珟の倉化及び平滑筋収瞮又は拡匵から成る矀から遞択される、前蚘受容䜓の生物掻性の又は耇数の芳点を枬定するステップ、
    を含んで成る方法。
  25. プロスタグランゞン受容䜓の生物掻性をアッセむするための商業甚キットであっお、攟射性同䜍䜓、ビオチン、又は酵玠から成る矀から遞択されるマヌカヌで暙識されおいる請求項に蚘茉のペプチドを含んで成るキット。
  26. プロスタグランゞン受容䜓の生物掻性をアッセむするための商業甚キットであっお、攟射性同䜍䜓、ビオチン及び酵玠から成る矀から遞択されるマヌカヌで暙識されおいる請求項に蚘茉のペプチド暡倣物を含んで成るキット。
  27. プロスタグランゞン受容䜓の生物掻性をアッセむするための商業甚キットであっお、攟射性同䜍䜓、ビオチン、又は酵玠から成る矀から遞択されるマヌカヌで暙識されおいる請求項に蚘茉のペプチドを含んで成るキット。
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