JP2006506327A - プロスタグランジンｅ２の受容体サブタイプｅｐ４のアンタゴニスト・ポリペプチド - Google Patents

プロスタグランジンｅ２の受容体サブタイプｅｐ４のアンタゴニスト・ポリペプチド Download PDF

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Abstract

【化１】
Figure 2006506327

プロスタグランジンE2の受容体サブタイプEP4のアンタゴニストペプチド、及び減尿腎症、骨吸収、腸内の異常クリプト(crypt)細胞の増殖又は動脈管開存症などと関係する医学的症状の治療又は防止にこれらの使用が、本明細書に提供される。本発明のアンタゴニストペプチドが、一般式(I)を有し、ここでXは、水素原子、1から3の一連のアミノ酸、及びカルバメート基及びアシル基などの保護基から成る群から選択され、そしてYは、水素原子、1から5のリシン残基、リン酸塩、硫酸塩、及び1から5のエチレングリコール残基から成る群から選択される。

Description

発明の分野
本発明は、プロスタグランジンEP2の受容体サブタイプEP4のアンタゴニスト・ポリペプチドに関する。より具体的に本発明は、プロスタグランジンE2の受容体サブタイプEP4のポリペプチド・アンタゴニストに関し、そして減尿性腎症、骨吸収、腸内クリプト(crypt)細胞の異常な増殖又は動脈管開存症と関連した疾患の医薬的症状の治療に、これらを使用することに関する。
プロスタグランジンは、プロスタグランジン(PG)シンターゼによるアラギドン酸の酸素付加から誘導される。プロスタグランジンは、血管の運動性、睡眠/覚醒のサイクル、腸内の分泌、脂肪の分解、糸球体での濾過、マスト細胞の顆粒減少、神経伝達、血小板凝集化、白血球の破壊、子宮筋収縮及び分娩(myometrial contraction and labor)、炎症及び関節炎、動脈管開存症、細胞の増殖及び分化などの種々の生理作用を介在する。プロスタノイドが、７回の膜貫通ヘリカル受容体のロドプシン様スーパファミリーに属する明らかに判別できる受容体への結合を介しこれらの活性を介在する。これらの受容体が、α、β及びγのサブユニットから構成される異種3量体のG-タンパク質に結合され、そのG-タンパク質が、活性に基づいて細胞中のカルシウムの変化、ホスホイノシチドの加水分解又は環状アデノシン1リン酸合成の促進又は阻害(Narumiya,S.ら、1999;Physiol.Rev.79:1193-1226を参照)の開始を惹起する。
薬理的に明らかな５種のプロスタノイド受容体、PGE2,PGI2,PGD2,PGF2α,及びTxA2のうち、PGE2受容体の4のサブタイプが記載されている(Ichikawaら、1996)。これらは、幾つかのスプライス・バリアントを有するEP1,EP2,EP3、とそしてEP4である。クローン化したヒトのEP4(又はプロスタグランジンE2の受容体サブタイプEP4として周知)が、488のアミノ酸の糖タンパク質であり、Gαsに結合され、そしてアデニル酸シクラーゼ及びcAMP合成の刺激に関与する(米国特許番号5,759,789及び5,605,814)。
EP4受容体が、腸内で高レベルに発現されるが、肺、腎臓、胸腺、子宮及び脳内で有意に低いレベルにて発現される(Bastien,Y.ら、1994;J.Biol.Chem.269(16):11873-77を参照)。EP4受容体が、腎臓内の流動物の濾過、単球/マクロファージ前駆体の破骨細胞への分化、腸内クリプト(crypt)細胞の増殖、及び哺乳動物胎児の動脈管開存症に関与している。
PGE2は、腎臓内で豊富に産生され、そして腎における微小循環、塩及び水の輸送、及びレニン(renin)の放出(Breyer,M.D.ら、1998;Kidney Int.54(Suppl.67):S88-94を参照)の調節に関与している。全てのEP受容体が、腎構造体の局部に分散され(Morath,Rら、1999;J.Am.Soc.Nephrol.10:1851-60を参照)、そして特定機能と関係付けられている。腎臓内のEP受容体の分布に関し行なわれたあらゆる研究で示されたことは、EP4受容体が、糸球体内で独特の発現をする(Breyer,M.D.ら、1996;Am.J.Physiol.270:F912-918.Morath,Rら、1999;J.Am.Soc.Nephrol.10:1851-60を参照)。しかしながら、集合管(collecting duct)(Breyer,M.Dら、1998;Kidney Int.54(Suppl.67):S88-94)、腎動脈及び直管(vasa recta)の媒体(Morath,R.ら、1999;J.Am.Soc.Nephrol.10:1851-60)などネフロンの他の構造体における受容体の存在が、別々に記載されている。さらにEP4の転写が、近接する糸球体の顆粒細胞に見出され、そしてこれらの細胞内でPGE2にて誘導されたcAMPの合成と一致する。従ってEP4が、レニン(renin)分泌の役割も果たすことができる。
糸球体のプロスタグランジンが、濾過(Schlondoff,D.ら、1987;Kidney Int.29:108-19)及びレニン放出に影響を与えると考えられる。PGE2が、単離された糸球体中でcAMPのレベルを増大させる(Freidlander,G.ら、1983;Mol.Cell.Endocrinol.30:201-214を参照)。それは、cAMP合成体に結合したEP4受容体が、糸球体による濾過を調節できる(Sugimoto,Y.ら、1994;Am.J.Physiol.266(5 Pt 2):F823-8)ことを示唆する。小分子アンタゴニスト(Kohno,Yら、WO 00/16760)、及びペプチド・アンタゴニスト(Peri,K.G.ら、WO 00/16760)を使用することで、腎臓による濾過及び尿排出を調節するEP4の直接的役割が実証された。
骨が連続的に再構築を受け、ここで骨形成が骨芽細胞によって行なわれ、骨吸収が破骨細胞によって行われる。これらの過程は、パラチオイド・ホルモン、エストラジオール、ビタミンD、サイトカイン、増殖因子及びプロスタグランジンなどの幾つかのホルモン因子により制御されている。インターロイキン-1(IL-1)による破骨への誘発が、アスピリン様薬剤によって阻害される(Tai,Hら1997)ことが示された。EP4受容体のアゴニスト活性を有するPGE2の類似体(この受容体に対し非特異的アゴニスト又はアンタゴニストがこれまでに存在する)が、マウスの骨芽細胞と骨髄細胞との共培養により、破骨細胞の形成を促進する。EP4ノックアウト・マウスからの細胞を用いた同様の実験では、破骨細胞の形成の減少が生じ、そのことがマウスの破骨形成におけるEP4受容体の役割を示唆している(Narumiyaら、1999)。
動脈管が、一般に大きくて抵抗性が低く、胎児におけるシャウント血管で、肺への血管バイパスを容易にする。胎児は、自分の肺を使用していない(酸素が母体の胎盤より提供される)ため、胎児の肺が折り畳まれた状態で血流に高い抵抗性を取っている。従って血液が、右心室から管を通り降下している大動脈へと流れている。プロスタグランジン、特にPGE2が高レベルに循環することで、脚の開口部(foot open)の管(ductus)が維持される。胎児が生まれと肺を膨張させ肺動脈の抵抗性を低下させ、PGE2のレベルが減少し、管(ductus)の閉鎖が始まり、続いて血液を肺動脈から肺へ流入させる。新生児において高レベルの酸素により、その管がしばしば閉鎖され、ほとんどの場合24時間以内にその管が閉鎖される。動脈管開存症(PDA)は、管が閉鎖しない症状である。PDAの場合の罹病率と死亡率が、動脈管を通る流量と直接的に関連している。重篤なPDAが、肺動脈による高血圧、浮腫、再発性感染を起こし、さらに長期間治療せず放置すると心臓機能障害を起こす。肺血管の閉塞疾患を発症する可能性がある。治療せずに放置すると死亡率が、20歳で20%、45歳で42%、そして60歳にて60%であると予測される。女性では恐らくPDAの発症が、男性より2乃至3倍多い。
PDAが、プロスタグランジン合成の停止剤であるインドメタシン(Indomethacin)などの薬剤か、外科的矯正かのいずれかで治療可能である。しかしながら、インドメタシン(Indomethacin)が、腎虚血及び腎臓の融合(hypofusion)疎性への副作用を有し、その結果早産による胎児において虚欠性腎疾患を起こすことになる。EP4が、胎児ブタ(Bhattacharya,Mら、1999;Circulation 100(16):1751-6)、胎児ヤギ(Bouayad,Aら、2001;Am.J.Physiol.Heart Cir.c Physiol.280(5);H2342-9)及び胎児ヒヒ(Smith G.C.ら、2001;J.Cardiovasc.Pharmacol.37(6):697-704)の動脈管にて発現される。逆に言うとEP4のノックアウト・マウスが、出生後不十分な動脈管閉鎖により死に至る(Nguyen,Mら、1997;Nature,390:78-81を参照)。
EP4受容体の選択的ペプチド・アンタゴニストが、胎児の動脈管の治療に使用された(Peri,K.G.ら、WO 00/01445 and Wright,D.H.ら、Am.J Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.2001;281(5):R1345-60を参照)。
プロスタグランジンのうち特にPGE2が、腸内のクリプト(crypt)細胞の増殖に重要な役割を果している。実際に誘発性プロスタグランジン合成酵素であるCOX-2は、腸内のポリープ及び結腸の腫瘍中に存在することが示された(Shattuck-Brandt,R.L.ら、1999;Mol.Carinog.24(3):177-87を参照)。ニメスライド(Nimesulide)などのCOX-2への選択的停止剤(blockers)が、結腸ガン発症の化学的誘発の阻害に使用された(Jacoby,R.F.ら、2000;Cancer Res.60(18):5040-4を参照)。近年PGE2の活性は、EP4-/-マウスの結腸ポリープの発生率が低いことから推定してEP4受容体の介在が示され、その要因としては、アゾキシメタンにより、そしてアゾキシメタンにて処理されたミニ・マウス(min mice)において異常クリプト(crypt)病巣の減少にEP4への選択的アンタゴニスト、ONO-AE2-227(Mutoh,M.ら2002;Cancer Res.62(1):28-32)の効果に起因している。
従ってプロスタグランジンE2の受容体サブタイプEP4の選択的ポリペプチド・アンタゴニストを生成させる必要があり、そのことが、結腸ガンの発症を治療しそして阻害するに有益である。
さらに、新生児における動脈管開存(PDA)症の管閉鎖を阻害する症状に加え、末期の腎疾患、急性腎不全、及び骨粗鬆症における骨吸収を阻害する腎不良(insufficiency)による他の症状の治療方法が必要である。
さらに疾患過程の主要部分である骨粗鬆症、歯の疾患、及び他の疾患などの医薬的症状の治療方法が必要である。
本発明が求めることは、これらの要望及び他の要望を満すことである。
本記載が多くの文献に言及され、これらの内容は、本明細書にその全体を引用により組み入れられている。
発明の要約
プロスタグランジンE2の受容体サブタイプEP4の選択的ペプチド・アンタゴニストを記載する。これらのペプチド・アンタゴニストが、急性及び進行性腎臓疾患、骨粗鬆症、歯の疾患、及び動脈管開存症と診断された患者、又はこうした疾患を発症する危険性のある患者を治療する医薬組成物を生成するために使用することができる。
本発明は、受容体活性の少なくとも1の機能的結果を阻害できる、プロスタグランジンE2の受容体サブタイプEP4アンタゴニストの選択的なペプチド形状、又はペプチド擬体の形状に関する。
本発明は、プロスタグランジンE2の受容体サブタイプEP4の選択的なペプチド・アンタゴニストに関する。
さらに本発明は、結腸ガン発症の治療及び防止に有益な、プロスタグランジンE2の受容体サブタイプEP4の選択的ペプチド・アンタゴニストに関する。
さらに本発明は、末期の腎臓疾患、急性腎不全、及び骨粗鬆症の骨吸収を阻害する腎機能不良(insufficiency)の他の症状、並びに新生児の前記管(PDA)閉鎖を阻害する症状の治療において有効なプロスタグランジンE2の受容体サブタイプEP4における選択的ペプチドの、又はペプチド擬体のアンタゴニストを含んで成る医薬組成物に関する。
さらに本発明は、骨粗鬆症、歯の疾患、そして骨損傷が疾患過程の主要部分を構成する他の疾患などの医薬症状の治療に有効な選択的EP4アンタゴニストに関する。
さらにその範囲及び適合性が、以後に示される詳細な記載から明らかになろう。しかしながら本発明の好ましい例を示しているが、この詳細な記載が、図示だけの手段により提示され、その理由として、本発明の精神及び範囲内での種々の変化及び変更が当業者に明らかになるものとして理解すべきである。
本発明の他の目的、利点、及び特長が、添付図面を参照し好ましい例の非限定的記載に従って読み出すことにて有意に明らかになり、それが例示的で本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。
好ましい例の記載
本明細書に使用される用語を明確にそして矛盾無く理解できるよう下記の多くの用語の定義を提供する。
本明細書に使用される用語「アゴニスト」は、少なくとも1の観点におけるEP4の生物活性の効能を促進する物質(agent)として理解される。EP4の生物活性が、たとえば野生型活性を刺激し、そしてシグナル導入を刺激することにより、又は野生型EP4タンパク質とシグナル導入カスケードに関与する他のタンパク質とをより効果的な相互作用を可能にし、増大させることができる。
本明細書に使用される用語「アンタゴニスト」は、少なくとも1の観点におけるEP4生物活性を阻害する物質(agent)として理解される。EP4アンタゴニストは、EP4分子と他の分子との相互作用を阻害させるか又は減少させ、若しくはEP4ポリペプチドの合成及び発現を減少させ、又はEP4分子の生物活性を阻害させる化合物にて良い。アンタゴニストは、EP4のドミナント・ネガティブ形体などの核酸分子、EP4の抗センス分子、EP4のmRNAと特に相互作用の可能なリボゾーム、又はEP4ポリペプチドに結合する分子(たとえば、ペプチド、擬似ペプチド、抗体、小分子)にて可能である。
本明細書に使用される用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸のL型とD型の両異性体、並びにペプチド化学にて合成されるペプチド類似物の調製に使用される他の非タンパク質様アミノ酸を含むものとして理解される。天然に存在するアミノ酸の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、及びトレオニンを含むがそれに限定されない。非タンパク質様アミノ酸の例としては、ノルロイシン、ノルバリン、シクロヘキシル・アラニン、ビフェニール・アラニン、ホモフェニールアラニン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、及び置換されたフェニール・アラニン(アルコキシ、ハロゲン及びニトロ基を含むがそれに限定されない1又は複数の置換基により置換)が含まれるがそれに限定されない。さらにベータ及びガンマー・アミノ酸は、用語「アミノ酸」の範囲内である。こうした化合物が、ペプチド化学において当業者に周知である。
自明性の目的として、以下に一般的に受け入れられるアミノ酸の略語を示す。
Figure 2006506327
本明細書に使用される用語「極性アミノ酸」は、水に比較的良く溶ける非電荷側鎖を含むアミノ酸を指すものとして理解される。
本明細書に使用される用語「疎水性アミノ酸」は、水への溶解に乏しい非電荷側鎖を含む何れかのアミノ酸を指すものとして理解される。
本明細書に用いられる用語「関連アミノ酸」は、元の天然の又は合成的に側鎖の官能性を擬態(たとえば、芳香族、脂肪族、荷電された、極性のH-供与体、H-受容体など)できるα、β又はγ位に置換されたアミノ酸を指すものとして理解される。置換基の例は、化学表-1、化学表-2に提供されるものを含むがそれに限定されない。
本明細書にて相互に交換できる用語「生物学的活性」、「生物活性」又は「生物的機能」は、EP4ポリペプチド又はその任意の断片にて直接的に又は間接的に行なわれる機能を言及するものとして理解される。EP4の生物学的活性は、他の分子への結合、他のタンパク質との相互作用、Gαタンパク質によるグアニン・ヌクレオチド結合などのシグナル導入の変化、カルシウムのフラックス(fluxes)、cAMPの合成、イノシトールリン酸塩の合成、他の細胞内タンパク質又は細胞膜における被覆ピット(pits)に関連するEP4ポリペプチドの内在化、などを含むがそれに限定されない。EP4受容体の生物アッセイの記載は、下記に提供される。
本明細書において相互に交換できる用語「細胞」、「宿主細胞」又は「組み換え宿主細胞」は、特異的な細胞ばかりかその全ての子孫を指しているものとして理解される。さらにこれらの用語の範囲内として理解されるものは、哺乳動物、両性類、菌類、及び細菌由来の細胞である。
本明細書に使用される用語「調節」は、上限調節[すなわち活性化又は刺激(たとえば、作動作用(agonizing)又は促進作用(potentiating)]、及び下限調節[すなわち阻害化又は抑制化(たとえば拮抗作用(antagonizing)、減少作用又は阻害作用)]の両方を言及するものとして理解される。
本明細書に相互に交換できるものとして使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」は、遺伝子産生物を指すものとして理解される。
本明細書で使用される用語「ペプチド」は、少なくとも2つのアミノ酸、そして最大約50のアミノ酸を含む直鎖重合体を指すものと理解される。そのアミノ酸が、天然に存在する分子、又は合成にて誘導される分子にて良い。こうした分子の例は、L-アミノ酸、D-アミノ酸、及び合成による天然アミノ酸の類似物を含むがそれに限定されなく、これらが、非タンパク質様アミノ酸を含むがそれに限定されない。
本明細書に使用される用語「ペプチド擬体」は、ペプチドの構造的及び／又は機能的特長を真似ている分子を指すものと理解される。当業者が、種々の方法を使用して特定ペプチドのペプチド擬体を誘導する、すなわち、個々のアミノ酸と合成による化学物質との置換、非タンパク質様アミノ酸の類似体、欠失及び付加しているアミノ酸、ベータ・ターン擬体などのスカフォルド(scaffolds)と、又は周知の医薬担体(pharmacophores)とペプチドにおける1又は複数のアミノ酸との置き換えなどを含むがそれに限定されない。ペプチド擬体を得る目的は、効力、効能に顕著なペプチド分子の類似分子を得ること、そしてサイズが有意に小さく、親ペプチドよりも医薬的に、そして毒性学的に有意な形態(profile)を有することである。
本明細書に使用される用語「小分子」は、約1kDより小さい分子量を、そして最も好ましくは約0.4kDより小さい分子量を有する組成物を指していると理解される。小分子の例としては、ヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ペプチド擬体、炭水化物、脂質又は他の有機(炭素含有)分子が含まれるがそれに限定されない。
本明細書に使用される用語「他の置換群」が、化学表2に明示される5つの群のうち1群の範囲内にて変換されることを指していると理解される。
本明細書に使用される用語「患者」は、ヒト及び任意の動物を含めヒトに対し特に言及していると理解される。
本発明は、以下の一般式を有するペプチド・アンタゴニストを含む組成物に関する。
Figure 2006506327
ここでXは、ペプチドのN末端に結合され、そして水素原子、1乃至3のアミノ酸配列、及びカルバメイト及びアシル基などの保護基から成る群から選択される。アシル基は、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、及び1乃至8の炭素原子を範囲とする短い直鎖及び分岐鎖アルキル基から成る群から選択される疎水性成分から構成される。アシル基の具体例は、アセチル及びベンジル基である。
Yは、ペプチドのカルボキシ末端に結合され、そして水素原子、1乃至5のL-リシン残基、リン酸、硫酸及びエチレングリコール(1乃至5残基)から成る群から選択され；
ｎは整数で９に等しく；
Rは、ペプチドのN-末端から開始しR1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8及びR9として指定され、ここで、
R1は、L-(4,4)ビフェニール及びD-(4,4)ビフェニールから成る群から選択され；
R2は、CH3,OH及びCH2OHから成る群から選択され；
R3は、CH3,OH及びCH2OHから成る群から選択され；
R4は、フェニール、チロシール、ベンゾイル、及び関係する芳香族基から成る群から選択され；
R5は、CH2COOH,CH2CH2COOH及び関連カルボン酸基から成る群から選択され；
R6は、CH3,CH2CH3,CH2CH2CH3,及び1乃至6の炭素原子を範囲とする比較的短鎖の脂肪族アルキル基から成る群から選択され；
R7は、CH3,CH2CH3,CH2CH2CH3から成る群から、そして1乃至6の炭素原子から成る比較的短鎖の脂肪族アルキル基の群から選択され；
R8は、リシンで；そして
R9は、リシンである。
本発明の好ましい例において、本発明のペプチド・アンタゴニストは、213.15(bip)tseyeal(配列番号1)；213.19(bip)tseyealk(配列番号2)；213.20(bip)tseyeglk(配列番号3)；213.21(bip)tseyealKK(配列番号4)；213.22(bip)tseyeglKK(配列番号5)；213.23(bip)tseyeslK(配列番号6)；213.24(bip)tseyeslKK(配列番号7)；213.25(bip)tseyeaK(配列番号8)；213.26(bip)tseyesK(配列番号9)；213.27(Bip)tseyealKK(配列番号10)；213.28(bip)tseyeaLKK(配列番号11)；213.29(Bip)tseyeaLKK(配列番号12)；213.30(bip)tseyealGKK(配列番号13)から成る群から選択され、
ここで、Bipは、L-(4,4)-ビフェニールアラニンで、bipは、D-(4,4)-ビフェニールアラニンで、そしてここでD-アミノ酸は小文字で示され、L-アミノ酸は大文字にて示される。アミノ酸を単一の文字コードにて示す。さらに本発明は、糸球体濾過及び尿排出を増大させるための医薬的に受け入れ可能な1又は複数の担体又は賦形剤と関連した標識化された配列番号1乃至13、及びそのペプチド擬体から成る群から選択される1又は複数のペプチド・アンタゴニストを含む医薬組成物に関する。さらに本発明は、1又は複数の医薬的に受け入れ可能な担体又は賦形剤と関連した標識化された配列番号1乃至13、及びそのペプチド擬体から成る群から選択される1又は複数のペプチド・アンタゴニストを含む医薬組成物に関する。
さらに本発明は、末期の腎臓疾患、及び急性腎不全と診断された患者の糸球体濾過、及び尿排出を改良するための標識化された配列番号1乃至13、及びそのペプチド擬体から成る群から選択される1又は複数のペプチド・アンタゴニストを含む医薬組成物の使用に関する。
さらに本発明は、骨粗鬆症、歯の疾患、及びガン関連の症状に罹っている患者が経験する骨の損傷を防止するように、標識化された配列番号1乃至13から成る群、及びそのペプチド擬体から選択される1又は複数のペプチド・アンタゴニストを含む医薬組成物の使用に関する。
さらに本発明は、血管開存症が発症する医薬症状における動脈管の閉鎖行なうための標識化された配列番号1乃至13から成る群、及びそのペプチド擬体から選択された1又は複数のペプチド・アンタゴニストを含む医薬組成物の使用に関する。
さらに、本発明は、結腸ガン又は腺腫瘍性ポリープと診断された患者を予防又は治療するために、標識化された配列番号1乃至13から成る群、及びそのペプチド擬体から選択される1又は複数のペプチド・アンタゴニストを含む医薬組成物の使用に関する。
さらに本発明は、プロスタグランジンE2の受容体EP2を天然又は組み換え的に発現する細胞又は組織を培養する工程、前記受容体における周知濃度のアゴニストの存在又は非存在下で、請求項1の所定量の化合物にて培養された細胞又は組織を処理する工程、そして受容体の生物活性の1又は複数の前記観点を測定する工程を含む観点において、ここで前記観点が、Gαタンパク質によるGTPの結合及び加水分解、環状アデノシン１リン酸の合成、細胞中のカルシウムの変化、細胞の増殖及び／又は分化、変更された遺伝子発現、及び平滑筋の収縮又は拡張から成る群から選択される、本発明のペプチド又はペプチド擬体を使用する方法に関する。
最後に本発明は、小分子擬体を同定するための生物分析法において、標識化された配列番号1乃至13から成る群から選択される1又は複数のペプチド・アンタゴニストの使用に関する。
もちろん、本発明のペプチド・アンタゴニストが、プロスタグランジンE2の受容体EP4のアンタゴニストにより証明される医薬症状又は疾患の防止に使用できることを理解すべきである。
EP4アンタゴニスト
本発明において、１組のペプチドが、213.15(配列番号1)の配列に基づいて合成された。溶解性が低いことにより治療剤としての本ペプチドの効能が制限される。ペプチド213.15の各種修飾を含むペプチドライブラリーが合成され、そして通常の動物及び急性腎臓不全のラットのモデルの血清の分解、溶解性、及び医薬効能及び効力の点で特徴付けられた。これらの分析法に基づいて幾つかのペプチド類、より具体的には配列番号2乃至13の一覧に記載されるペプチド類が同定された。
EP4アンタゴニスト213.15(配列番号1)の最適化
本発明のペプチド誘導化合物の治療効果を改良するペプチドの幾つか修飾が、1方のアミノ酸と関連するアミノ酸との置換により、又はペプチドのカルボキシ末端へのアミノ酸の付加により行われた。本発明のEP4ペプチド・アンタゴニストのアミノ酸の置換が、ポリペプチドにおける少なくとも1のアミノ酸残基が、構造体の官能基、又は側鎖の官能基(芳香族、脂肪族、そして正又は負に荷電された)のいずれかに関連付けられる異なったアミノ酸にて置換されたバリアントを含むがそれに限定されない。こうした置換体は、アミノ酸関係の以下の記載に従って行なわれることが好ましい。
化学表１：関係アミノ酸の例
Figure 2006506327
化学表2に示すように、本発明のペプチドEP4アンタゴニストの別の置換基は、少なくとも1のアミノ酸残基が取り出され、そして違った残基にて置換されて、そして所定の位置に挿入されることを包含する。
Figure 2006506327
化学表2のカッコ内に記載された3種のアミノ酸残基が、タンパク質の構成に特別な役割を果たしている。「Gly」だけが何れかの側鎖を欠いた残基により鎖に柔軟性が与えられる。しかしながらこれは、αヘリックス構造以外の2次構造の生成を促進する傾向がある。その形状から「Pro」は、鎖をしっかりと拘束する。それは通常βターン様構造を促進する傾向がある。「Cys」はジスルフィド結合形成に関与することができる。
潜在的に水素と結合可能な「Tyr」は、「Ser」及び「Thr」と有意な類似性を有する。
本発明のEP4ペプチドアンタゴニストのいずれかのアミノ酸成分が、それに対応する鏡像異性体(enantiomer)(同じアミノ酸であるがキラルテーが反対)により置換することができる。そのため、天然に存在するL-構造体のアミノ酸が、対応する鏡像異性体(enantiomer)にて置換される、すなわちアミノ酸がD-構造体を有することになる。L-構造体のアミノ酸は、D構造体のアミノ酸と同じ化学構造体であるが、反対のキラルテー(chirality)を有する。さらにL-及びD-体の配置は、R-又はS-型の配置として通常言及されている。追加的なバリエーションとしては、異なる空間構成の化学群を提供するβ-及びγ-アミノ酸があげられる。
上記の置換に加え、さらに機能的に類似する側鎖を提供する合成アミノ酸を、ペプチド中に導入することができる。たとえば、芳香族アミノ酸が、D-又はL-ナフチルアラニン、D-又はL-フェニルグリシン、D-又はL-2-チエニルアラニン、D-又はL-1-,2-,3-,又は4-ピレニルアラニン、D-又はL-3-チエニルアラニン、D-又はL-(2-ピリジニル)-アラニン、D-又はL-(3-ピリジニル)-アラニン、D-又はL-(2-ピラジニル)-アラニン、D-又はL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン、D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン、D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン、D-p-フルオロフェニルアラニン、D-又はL-p-ビフェニルアラニン D-又はL-p-メトキシビフェニルアラニン、D-又はL-2-インドール(アルキル)アラニン、及びD-又はL-アルキルアラニンなどにて置換することができ、ここでアルキル基が、置換又は非置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ-ブチル、及びイソ-ペンチルから成る群から選択される。
非カルボキシレート・アミノ酸が、リン酸化、又は硫酸化(たとえば、-SO3H)したアミノ酸が提供されるように、負の荷電を有するよう生成されそれが非限定例として考えられる。
他の置換基は、天然のアミノ酸とアルキル基を結合して生成された非天然のアルキル化アミノ酸を含む。リシン及びアルギニンなどの天然の塩基性アミノ酸が、アミン(NH2)の官能基でアルキル基と置換することができる。さらに他の置換基としては、アスパラギン又はグルタミンのニトリル誘導体(たとえば、CONH2の官能基に代えCN-成分を含有させる）、メチオニンのスルホキシド誘導体があげられる。さらにペプチドに結合するいずれかのアミドを、ケトメチレン、ヒドロキシエチル、エチル/還元アミド、チオアミド、又は逆方向に配置された(reversed)アミド成分(たとえば、((-C=O)-NH-)に対し(-C=O)-CH2-),(-CHOH)-CH2-),(CH2-CH2-),(-C=S)-NH-)、又は-NH-(-C=O))にて置き換えることができる。
従って共有結合にて修飾したペプチドは、本発明の範囲内に含まれる。こうした修飾が、ポリペプチドの選択された側鎖又は末端残基と反応可能な有機誘導物質と、標的とされるポリペプチドのアミノ酸残基とを反応させることにより、EP4ペプチドアンタゴニストに導入することができる。化学誘導物質の以下の例は図示だけの方法にて提供されるが、本発明の範囲を限定する意図はない。システイン残基が、2-クロロ酢酸又はクロロアセトアミドなどのα-ハロゲン化酢酸(及び相当するアミン)と反応し、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体が得られる。ヒスチジン残基を、ジエチルピロカルボン酸(たとえば、pH5.5乃至7.0で)などの化合物と反応させることにより誘導可能であり、その理由は本試薬が、ヒスチジン側鎖に比較的特異的なためである。さらにp-ブロモフェナシル・ブロミドを使用することができる(たとえば、反応をpH6.0で0.1Mのカコジレート・ナトリウム(sodium cacodylate)にて行うことが好ましい)。リシン及びアミノ末端残基を、無水コハク酸、又は他のカルボン酸無水物などの化合物と反応させることができる。α-アミノ酸含有残基を誘導する他の適切な試薬としては、イミドエステル(たとえば、メチルピコリンイミデイト)などの化合物；ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソウレア、2,4ペンタンジオン及びトランスアミナーゼによるグリオキシレートとの触媒反応物があげられる。
アルギニン残基を、周知方法の工程により、フェニールグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンなど1又は幾つかの従来試薬との反応により修飾させることができる。アルギニン残基の誘導化が、グアジニン官能基のpKaが高いことから、アルカリ条件下にてその反応を行なう必要がある。さらに、これらの試薬は、リシンのアミノ基、及びアルギニンのεアミノ基とも反応可能である。
チロシン残基それ自体の特異的修飾は良く知られている。特異的でそして非制限の例としては、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロ・メタンとの反応によるチロシニル残基上のスペクトロ標識の導入があげられる。N-アセチルイミダゾル及びテトラニトロメタンを使用し、O-アセチル・チロシニル種及び3-ニトロ誘導体のそれぞれを生成することができる。
カルボキシル側鎖基(アスパチル又はグルタミル)が、1-シクロヘキシル-3-(2-モルフォリニル-(4-エチル)カルボジイミド又は1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルフェニル)カルボジイミドなどのカルボジイミド(R'-N=C=N-R')と反応することにより選択的に修飾することができる。さらにアスパルチル及びグルタミル残基を、アンモニウムイオンと反応させてアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換できる。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、相当するグルタミル及びアスパルチル残基へ脱アミド化される。
本発明のペプチドの他の修飾には、技術的に周知な方法によるプロリン及びリシンの水酸化、セリール又はセリオニール残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジンのαアミノ基のメチル化、N-末端アミンのアセチル化、主要鎖アミド残基(又はN-メチルアミノ酸にて置換)のメチル化、及び幾つかの例におけるC-末端カルボキシル基のアミド化があげられる。
脂肪酸(C6-C18)を本発明のペプチドに共有結合させると、付加的な生物特性が与えられ、たとえば、プロテアーゼ耐性、血漿タンパク質の結合、血漿半減期の増大、及び細胞内への貫通などがあげられる。
修飾の可能性のあるリード(lead)ペプチドの上の記載が、その方法の範囲を限定するものとして考慮する必要がないと同時に、鋳型としての213.15などのリード(lead)ペプチドを使用して、遺伝子操作できる可能な修飾の制限をも意図すべきでない。ペプチド複合体の折り畳み性質によるペプチド・アンタゴニストの受容体結合の構成(conformation)も、EP4生物活性に及ぼす修飾ペプチドの影響も、絶対的な確実性をもって予測することができない。従って修飾ベプチド、その生物活性を確認するための本発明に記載された生物アッセイにおいて又は当業者に技術的に周知なものにおいて、生物活性の確認するため試験すべきことは、当業者が容易に理解できよう。アッセイの非制限例としては、相当するGPCRに結合する受容体、又は結合するリガンドの調節があげられる。GPCRs に関係し、そしてより詳細いはin vitro,ex vivo 及びin vivoアッセイのためのEP4受容体に関係する特定の例が、当業者に周知で、そしてその選択された例を図に明示し、さらに以下に記載する。
EP4受容体生物アッセイ
EP4が、異種性細菌、酵母、又は哺乳動物の発現系で、組み換え的に発現される組織又は細胞から、EP4の精製によるか、粗製のいずれかによる調製物のEP4を(細胞-フリーアッセイ；以下を参照)を用いて生物活性を評価する多くの公開された方法がある。
細胞-フリーアッセイは、EP4タンパク質と相互作用し、それによりEP4タンパク質の活性を修飾できる化合物の同定に使用可能である。たとえばこうした化合物は、EP4タンパク質を構造的に修飾しそれにより活性に影響を及ぼすことができる。さらに細胞-フリー・アッセイが、EP4タンパク質とEP4結合パートナーとの相互作用を調節する化合物を同定するために使用される。EP4結合のパートナーはPGE2である。特に好ましい例においてこうした化合物の同定に使用される細胞・フリーアッセイは、特に緩衝溶液、EP4タンパク質、EP4結合パートナー、及び試験化合物を含む混合物から成る。試験化合物は、たとえばペプチド、ペプチド擬体、小分子、及び核酸にて可能である。検出のため結合パートナーは、放射性核種などの特定マーカ、蛍光性化合物又は酵素にて標識化できる。次ぎにEP4タンパク質と試験化合物との相互作用は、インキュベーション工程、そして洗浄工程の後に標識レベルの決定にて検出することができる。試験化合物の存在下でのEP4とEP4結合タンパク質との相互作用に対し試験化合物の非存在下での相互作用との有意な統計的変化(増強又は阻害)が、試験化合物に対するEP4生物活性の促進的アゴニスト効果(擬体、又は増強剤)又はアンタゴニスト効果(阻害)を示す。放射性標識化試料を、シンチレーション分光光度計にて計数することで定量可能である。結合リガンドを、アセチルコリン・エステラーゼなどの酵素と結合でき、そして結合されたEP4結合パートナーを、酵素アッセイにて定量することができる。
さらに細胞フリー・アッセイは、EP4タンパク質と相互作用しそしてEP4タンパク質の活性を調節する化合物を同定するために使用される。従って一例において、EP4タンパク質と試験化合物とを接触させ、そしてEP4タンパク質の生物活性をモニターする。細胞フリーアッセイにおけるEP4タンパク質の生物活性は、GTPの結合、GTPの加水分解、Gαタンパク質の解離、アデニール・シクラーゼの活性化、ホスホリパーゼ(A2,β、γ、及びD型異性体)の活性化、リン脂質加水分解、及びcAMP合成などあげられるがそれに限定されない。こうしたGPCRタンパク質の生物活性の変化を測定する方法は、当業者に十分に知られている。
EP4生物活性の細胞を基盤とするアッセイ
さらにEP4の生物活性は、細菌、酵母、両生類若しくは哺乳類の全体にわたる細胞(下記の細胞を基礎とするアッセイ(cell-based assays))にて、EP4タンパク質が、天然タンパク質又は融合タンパク質として組み換え発現される(たとえば、抗体エピトープ・タグ、緑色蛍光タンパク質、Gα又はβ-アレスチンに接合したEP4)前記細胞を用いて測定することができる。融合タンパク質は、天然のタンパク質より特定の利点がある、即ち融合タンパク質が、細胞、組織、及び生体内のEP4ポリペプチド又はEP4の生物活性を直接検出できる。エピトープ(FLAG,HA,polyHIS,c-myc等)にて標識化(tagged)されたEP4は、免疫化学染色法による細胞及び組織内タンパク質のトラッキングに有効であり、そして免疫親和性クロマトグラフィーを介し純粋か又は実質的に純粋なEP4タンパク質の単離の支援となり得る。EP4タンパク質に融合される緑色蛍光タンパク質(GFP)は、たとえば生きた細胞又は固定細胞において他の細胞タンパク質との凝集又は会合、エンドサイトシース小胞内での内在化、移動(trafficking)、分解などのEP4タンパク質の位置付け、そしてその移動の追跡に使用することができる。GFP及び葉酸の融合EP4を、ダイマー及びオイゴマーの形成、及び他のシグナル分子との会合を研究し、そしてモニターするために使用することができる。EP4-Gαタンパク質の融合体が、アゴニスト又はアンタゴニストに応答するGタンパク質によりGTPの結合及び加水分解を測定するために使用され、そして当業者に知られたこれらの方法を使用し、アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性に関する小分子化合物ライブラリーのスクリーニング、及び試験に使用される。これらの例は、基礎及び応用科学研究において有効な融合パートナー及びそれらの使用を明示しているがそれに限定する意図はない。
EP4タンパク質の生物活性を調節し、そしてEP4タンパク質の生物活性の増大又は減少に応答して、誘発されるか又は阻害されるEP4遺伝子又はこれらの遺伝子群の発現を調節する化合物の同定に細胞を基礎とするアッセイ(cell-based assays)が用いられる。従って一例において、EP4の生成可能な細胞を、天然又は合成のEP4アゴニスト/アンタゴニストの存在又は非存在下で試験化合物と共にインキュベートし、そしてそのEP4の生物活性を測定する。その結果により形成されたEP4の生物活性の変化を、試験化合物と接触されていないコントロールEP4産生細胞と比較する。EP4生物活性を調節する方に試験化合物の効能、親和性及び作用を評価するためにこれらの測定法が用いられる。
治療方法
本発明は、尿排出の減少及び急性又は慢性の腎障害と診断された治療患者の予防方法と治療方法との両方を提供する。医療的な症状及びその発病が、阻害されるかあるいはそれぞれその進行が遅延されるようにEP4の異常を特徴付ける症状が明示される前に、予防薬の投与を行なうことができる。一般的に、予防方法又は治療方法は、EP4アンタゴニストの有効量を必要な対象物に治療として投与することを含む。本発明に記載されているように、適切なEP4アンタゴニスト及びその誘導体の例は、ペプチド、ペプチド擬体及び小分子擬体を含むがそれに限定されない。
尿排出の減少、血中の尿窒素(BUN)及びクレアチニンレベルの増大により特徴付けられるヒトの腎機能不良による疾患の治療として、本発明のEP4アンタゴニスト及びその誘導体の療法的な使用をうら付けるデータが、腎症の動物モデルから得られた。腎不良による急性腎疾患が、虚血による二次的な腎灌流の欠乏によるか又は放射性対照剤、抗腫瘍性薬、抗生物質、免疫阻害剤、及び重金属により介在される腎毒素の発作により起こる可能性がある。腎不良が、両側の腎臓動脈の閉塞(虚血性腎症)又はシスプラチンの注入(急性尿細管の壊死)により作成された2匹のラットのモデルが、ヒトの患者が罹病する腎障害を十分にに特徴付け、そしてその腎障害と近似していることを明示していた(by Lieberthal,W.,Nigam,S.K.(2000);Am.J.Physiol.Renal.Physio.278(1):F1-F12を参照)。両方のラットのモデルを用いることにより、腎障害及び腎臓機能の改良に本発明のEP4アンタゴニスト及びその誘導体の有用性が明示された。幾つかの例が提供され、そのうち本発明のEP4アンタゴニスト及びその誘導体を使用することにより、ラット、ドック、ブタの糸球体の濾過、腎臓の血流、及び尿排出の改良が明示された。それは、違った種(ラット、ドック、及びブタ)に示されているように、本発明のEP4アンタゴニストの薬理的効能が、受容体の配列及びそれらの組織への分散における類似性に基づいて、ヒトの対象物へさらに拡張できることが予測される。
EP4アンタゴニストの薬理的な調製
LD50(集団の50%までの致死投与量)及びED50(集団の50%の治療有効投与量)などの本発明のEP4アンタゴニストの毒性及び治療の有効性は、実験動物において標準的な医薬方法により決定することができる。毒性と治療効果との投与量比は、治療指数として知られ、そしてそれが、LD50/ED50比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。こうした化合物の投与量(dosage)は、ED50を含むが毒性をほとんど含まないか、全く含まない循環濃度の範囲内であることが好ましい。この投与量(dosage)は、用いられる投与量(dosage)の形式、及び投与経路に基づいてこの範囲内にて変化してよい。in vitro及びex vivo分析法、及び動物の研究において決定されるようなIC50(その症状の50%阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を得るための動物のモデルにおいて、その投与量(dose)を処方することができる。次ぎにこうした情報を用いて、ヒトに有効な投与量を正確に決定することができる。EP4アンタゴニストの血漿レベルを、たとえば、質量分光分析と連結した高速液体クロマトグラフィー(HPLC-MS)により測定することができる。EP4アンタゴニストの有効投与量は、0.01μg乃至100mg/kgにて可能で、そして投与経路、医薬物の調製、及び導入モデルにより決定される。
本発明は、以下の非限定試料によりさらに詳細に明示される。
ペプチドの化学合成
213.15(配列番号1)の構造に基づく幾つかのペプチドを、F-moc化学及び固相メリフィルド(Merrifield)ペプチド法を用いて合成した。これらペプチドの構造は、化学表3(配列番号2乃至13)に1覧として記載されている。これらペプチド類のトリフルオロ酢酸塩の純度を、HPLCと質量分析にて分析した。一般的合成法は、以下の文献(「固相ペプチド合成」Stewart & Young,W.H.Freeman Co.San Francisco,1969;「タンパク質」,Erikson and Merrifield,Vol.2.(ed.Neurath & Hill))に言及することにより十分に理解されるであろう。さらに水へのペプチド溶解度を、一覧として化学表3に記載する。
虚血性腎症のラットのモデルの糸球体濾過及び尿排出に及ぼす213.15の誘導体の効果
両側の腎臓動脈を30乃至60分間固定することにより腎臓の再潅流となり、そして糸球体の濾過率の劇的な減少、尿の排出、及び管細胞の死などの関連した余後疾患が生ずる。このモデルは、ヒトの欠乏尿腎不全という特定の重大な結果を再現する。腎損傷の復帰における種々の213.15誘導体の効能が測定された。
虚血性腎症のモデル
スプレイグ・ダウレイ・ラット(Sprague-Dawley rats(250-300g))に麻酔をかけ、そして頚静脈にカニューレを挿入し、ペプチド又は生理食塩水を注入する。それに加え頚動脈にカニューレを挿入し、圧変換器(Gould)にて動脈の血圧測定し、そして血液試料を採集した。膀胱にカニューレを挿入し尿を採取した。導尿管の挿入の後、[3H]インスリン(8μCi/hr),[14C]アミノ馬尿酸(0.8μCi/hr)及び麻酔薬(ケタミンとキラジン(Ketamine and xylazine),9:1 w:w;0.095ml/ml)混合液の注入(1.6ml/hr)を開始した。さらにその動物を40分間にて安定化させた。2個の尿試料を、10分間にわたって採取(40から50分、と50から60分)し、基本GFRの安定性を評価した。45分と55分にて血液試料のそれぞれを採取した。次ぎに左右の腎動脈の鉗子止め(clamped)を60分間行い、急性虚血性腎症状を誘発させた。虚結症状の期間後その動物を、ペプチド,213.19-213.30,(ボウラス(bolus)の1mg/kgの静注)、又は頚静脈を介した生理食塩水にて処理した。次ぎに血液及び尿試料を、さらに2時間の間に20分毎に採取した。糸球体濾過速度(GFR)及び尿流量率度([3H]ドックリン法にて測定)、及び腎血漿流量([14C]アミノ馬尿酸法にて測定)を、異なる時間にて、そして60分間を平均して(薬剤投与して20-30分後)決定した。
化学表３：213.15の構造に基づく合成されたペプチドライブラリー
Figure 2006506327
 ξ：大文字はL-アミノ酸を示し、小文字は、D-アミノ酸を示す；bip:D-(4,4)ビフェニール・アラニン
*：溶解性が水中にて決定される。
尿の流量率度(図1A)及びGFR(図1B)に関する結果は、薬剤の投与から20分後から開始し、60分にわたる尿の平均流量率度及び平均GFRとして表される。尿排出の効能順位が、213.15>213.19≧213.21であり、他のペプチドも213.15と同様の効能があった。さらに、同じように213.19及び213.21は、GFRの増大を示した。GFRの改良が、他のペプチドに対して観察されなかった。GFR、尿の流量率度及び腎血漿の流量率の改良には、ペプチド213.19及び213.21が、一貫して他のペプチドより優れていた。
213.21の構造に基づいて、より類似した4種の213.27乃至213.30が、腎臓動脈の閉塞のラットのモデルにおいて合成されそして試験された。GFRの結果(60分間の平均と薬剤の注入から20分後の開始)を、図１Cに示す。比較のため213.15及び213.21をその図に記載する。もちろん213.28と213.29が共に、40分間に腎臓動脈の鉗子止めを外した後40分間にわたり、対照とした213・15と比較し４倍と５倍のGFRが増大した。さらに試験化合物のうち有意に溶解可能な(化学表３）213.28と213.29は、親化合物の213.15より有意に有効であることが見出された。
正常なラット、ドック及び仔ブタの腎臓機能に及ぼす213.29の投与(dose)応答
213.29(1,2,3,4,5,10mg/kg ボルス静注(bolus iv)の投与応答が、麻酔にかけられ雌のビーグル・ドックにて試験された。少なくとも1週間の馴化と1昼夜の絶食の後、それぞれの動物を、チオペンタール(5mg/kg)による静脈注射にて麻酔にかけ、その麻酔をイソフルラン下にて持続した。その動物を保温し、そしてその体内温度を15分毎にモニターした。血圧をモニターする頚動脈カテーテル、及び尿を採取する導尿管を取り付けた。5時間の導入として十分な全投与量0.05mCiの[3H]のドックリン及び0.005mCiの[14C]パラアミノ馬尿酸(PAH)を含む、生理食塩水(10mL/kg/h)の静注による一定量の注入を開始した。試料としての尿を10分毎に採取した。各10分間の中間点にて血液試料を採取した。放射性標識による60分間の平衡化の後、逐次増加(incremental)による213.29の投与量(doses)が、頭部静脈を経由して静脈内に注入された。
血液試料及び尿試料(n=30/dog)中の放射能を、シンチレーション分光器にて決定した。研究の結果を図２Aに示した。GFR及び尿の流動速度では、劇的にさらに最大の増大が、正常なドックの4mg/kgの213.29にて観察された。さらに図2Bは、ラット及び仔ブタにて行なわれた同様の研究結果を示している。GFR、尿の流量率及び腎血漿の流量率における最大応答が観察された投与量を、図２Bの挿入図に示す(n=動物の数)。その結果により示されたことは、213.29は、種に独立した方法にて腎臓への潅流の増大、GFRの増大、及び尿排出の増大を引き起こすことである。これらの結果は、示唆によれば、213.29が、ヒトにおける腎灌流、GFR及び尿の流量の増大に有効であることを示唆している。
PGE2にて誘発されたブタの低部伏在静脈リングの拡張に及ぼす213.29の効果
動物
Animal Care Committee of the Research Center of the St.-Justine Hospitalにて受け入れられ方法により、ヨークシャ種(Yorkshhire)の仔ブタ(2乃至4日経過)が、この研究に用いられた。簡単にいうと、動物をハロセーン((holothane)(1.5%))にて麻酔にかけ、そして底部の外部伏在の静脈を取り出し、以下の組成物を有し、すなわちNaCl 120,KCl 4.5,CaCl 2.5,MgSO4 1.0,NaHCO3 27,KH2PO4 1.0,グルコース 10を含み、そこに1.5U/mlのヘパリンを添加した組成物(mM)を有する冷却したクレブス・緩衝液(Krebs buffer)(pH7.4)内の所定の位置に置いた。
器官(organ)バス・アッセイ
伏在静脈を、外生組織から清浄にし、4mmのリングに切断し、それをKrebs緩衝液を含む個々に被覆された(jackted)器官バス(15ml;Radnoti Glass,Monrovia,CA)に置いて、さらに37℃に維持した。その溶液を、O2/CO2の混合ガス(95/5)にて泡立たせた。各実験に8個のリングを使用し(各伏在静脈から４つ)、そして頻繁な洗浄に伴う2.0grの受動張力(passive tension)、及びその張力の調整下にて60分間平衡状態にした。その張力を、張力変位転換装置により測定し、Work Benchソフトウエア(Kent Scientific,Litchfield,CTから共に)を用いて、計算データ獲得システムにて記録した。
実験方法
PGE2に対する低部外性伏在静脈の血管拡張応答が、EP2(30%)とEP4(70%)の刺激からの結果と見受けられる。この組織が、1.5乃至2.0grの張力の増大を誘発したU46619(2x10-7M)(トロンボキサンA2擬体)により、最初にチャレンジされた。応答のないリングを廃棄した。U46619への応答が定常状態に達する時に薬剤を添加した。薬剤に対する応答が観察されない時、30分間にて、組織内に薬剤の適切な分散を確実なものとした。次ぎにPGE2(10-10-10-6M)への投与量応答曲線が、各試験薬剤の存在又は非存在下にて得られた。
2乃至8の実験の平均した結果を図3に示す。その結果は、仔ブタに、1μMのペプチドの存在下で1μMのU46619(トロンボキサンA2擬体)と予め接触させた仔ブタの低部伏在静脈リングにおいて、1μMのPGE2により生成される拡張の逆比率(percent reversal)として表される。213.29は、この組織内のPGE2における拡張効果の約50%の逆比率(percent reversal)を示した。
ヒト血清における213.29の安定性、及び代謝としての生物活性
213.29ペプチドが、血清プロテアーゼを活性にすると考えられるL-アミノ酸を含む。213.29の変性生成物を特徴付けるための等分量(aliquots)(100μg)を、ヒトの血清中にて時間を変えて、37℃にてインキュベートした。その反応物をトリフルオロ酢酸(0.24ml;1M)にて急冷し、10分間氷上にてインキュベートし、さらにその後TFA(0.25ml;0.05%)を添加し、そして遠心分離にかけて羊毛塊状物を沈殿させた。上清物をSepPak C18カートリッジ上で固相抽出により精製した。0.05%のTFA中でそのペプチドを、80%のアセトニトリルにて希釈し、溶離物を凍結乾燥した。次ぎにそのペプチドを酢酸(0.1Nにて400μl)で再溶解し、逆相HPLCのC18カラム上にて分離した。画分を含むピーク物質を採集し、ペプチド断片の質量をMALDI-TOFにて決定した。
図4Aは、経過時間に対する213.29の変性、及び1のカルボキシ末端のリシン(213.291)(図4B)欠損における1の代謝生成物の外観を示す。切断が迅速で2分より短い半減期を伴う。第二の代謝産物としての213,292(図4B)が、本実験に観察されなく、そして分解反応において現れるのが遅い。
さらに代謝産物が、生物活性を有するかどうか試験するためのペプチド213.29、213.292、及び213.292を、100nMのPGE2の存在下にてヒトEP4リセプターを組み換え発現するHEK293細胞と共にインキュベートした。cAMPのレベルを放射性免疫法にて決定し、そしてその結果を図4Bに示す。これら自身のペプチドは、受容体の刺激を惹起しないが、PGE2にて刺激されたcAMPの合成を20-30%だけ阻害した。
213.29が、他のプロスタノイド受容体の生物的応答に影響しないことを実証するため、プロスタノイド受容体の選択的リガンド(ブタプロスト-EP2;17-フェニールPGE2-EP1;PGF2a-FP;U46619-TP;M&B28767-EP3)を、予め記載されそして検証されたブタの網膜(Li,D.Y.,Abran,D.,Peri,K.G.,Varma,D.R.,Chemtob,S.(1996);J.Pharmacol.Exp.Ther.278(1):370-7)のex vivoにおける血管狭窄分析法に使用した。分娩期前後の高循環レベルのプロスタグランジンを下限調節することによって、新生血管系のプロスタノイド受容体の密度が、最小となることから、新生ブタを、プロスタグランジン合成酵素の遮断剤のイブプロフェン((ibuprofen)(30mg/kg(体重の)/8時間乃至24時間))にて処理し、受容体の密度及び血管運動効果を増大させた。
方法
眼杯を調製するために、鋸状縁(ora serrata)より3乃至4mm後部に円形状の切開が行なわれ、網膜への手動操作を最少限にし内部節及び硝子体を取り出した。留まっている眼杯を、20mlのKreb'sの緩衝液(pH 7.35乃至7.45)を含む20mlの組織浴槽中でワックス・ベースに合わせピンにて固定し、そして21%の酸素と5%の2酸化炭素にて、37℃で平衡しにした。その調製物を30分間にて安定化した。
0.1μMのリガンドが、浴槽液中に添加される前に213.29(10μM)を、5分間にわたり添加した。脈管の外径(outer vessel diameter)を、実体顕微鏡(dissecting microscope(Zeiss M 400)上に取り付けられたビデオ・カメラに記録し、そしてその応答をデジタル画像解析装置(Sigma Scan Software,Jandel Scientific,Corte Madera,CA)にて定量化した。アゴニストを局所適応する前及び適応した5分後に、その血管の直径を記録した。測定がそれぞれ3回繰り返され、そして1%より低い変動が示された。図5に示すように、213.29は、プロスタノイド受容体の受容体選択アゴニッストの収縮応答又は拡張応答に影響を与えなかった。従って213.29は、プロスタノイド受容体EP4に高い選択性があると考えられる。
虚血性腎症のラットのモデルの腎機能の改良におけるフェノルドパム(Fenoldopam)と213.29との比較
フェノルドパム(Fenoldopam)は、ドパーミン受容体のサブタイプの1アゴニストであり、そして限定されるが臨床的に及び動物実験において尿排出の増大を示した(Singer,I.and Epstein,M.1998;Am.J.Kidney Dis.31(5):743-55)。虚血性腎症のラットのモデルの腎機能の改良におけるフェノルドパム(Fenoldopam)と213.29との効能(実施例2に記載)を比較した。213.29が、静注する1mg/kgのボルス(iv bolus)として与えられ、一方フェノルドパム(Fenoldopam)が、静注する0.6μg/kgのボルス(iv bolus)として、続いて実験期間中0.6μg/kg/hとして与えられた。図6Aに示すように、フェノルドパム(Fenoldopam)と213.29が共に同程度の尿排出を増大させるばかりか、213.29は、腎機能としての潅流、及びGFRを有意に改良することができる。血液尿素窒素(BUN)及び血清のクレアチニン・レベルを、72時間後に測定し、そして図6Bに示すようにフェノルドパム(Fenoldopam)と213.29が共に、BUN及びクレアチニン・レベルの減少における効果が同じであった。
腎不全(虚血性腎症のラットのモデルにおいて)に罹っているラットに213.29を投与する保護効果
腎動脈への鉗子止めを解きそして薬剤を投与して24時間又は72時間後に、実施例７にて使用した動物から腎臓を採取した。切断した組織により実験を行なった。
図７に示すように、糸球体周辺の膨張を示す糸球体の数を、213.29による治療結果として有意に減少させた。同様に細胞の屑を含む採取管の数を、213.29によって有意に減少させた。これらの結果では、腎機能の改良並びに超微細構造体の損傷とその後の虚血性障害からの保護に、213.29の使用を指摘している。
両側の腎動脈鉗子止め(clamping)により腎不全に罹ったラットに、213.29を1日1回投与する効果に対する1日2回投与する効果
213.29の投与頻度の増大が、ラットRAO-モデルの腎機能に良好な効果を及ぼすかどうかの決定するために、1mg/kgの213.29の静注を1日1回と1日2回注入し、そして１日目と5日目とを比較した。得られた結果を図8に示す。日４までの糸球体濾過速度(GFR)、腎血漿流度(RPF)及び尿の流量率(UV)が、1日1回(qd)と1日2回(bid)の投与の場合同じ程度に改良された。しかしながら、これらの腎機能パラメータは、薬剤が1日1回よりむしろ1日2回投与された場合に1日目に劇的な改良を示した。従って、薬剤の薬物動態学と結びつけて213.29の投与頻度が、腎機能の機能不良な場合における腎機能を改良することができる。
シスプラチンによる急性尿細管の壊死、及び腎不全となっているラットにおける213.29の投与効果
急性尿細管の壊死、及び腎不全が、放射性対比剤(radiocontrast agent)、原ガン性化合物、及び抗体を使用する直接的結果である。ラットのシスプラチンに誘発される急性尿細管の壊死モデルが、ヒトの腎不全の多くの特性を再生するために示された(Lieberthal,W.,Nigam,S.K.(2000);Am.J Physiol.Renal.Physiol.278(1):F1-F12)。
シスプラチンにて誘発される急性尿細管壊死のラットのモデル
急性尿細管の壊死が、1日目Sprague-Dawley オスのラットに17.5mg/kgのシスプラチンを注入することで誘発された。5日目まで、腎臓機能のパラメータすなわちGFR,RPF及びUVが、無視される量まで劇的に減少した(図9AにおけるSal[サリン」カラム)。これは、シスプラチンで治療したラットにおいて以後50%の死亡率であった。血液尿素窒素(BUN)及びクレアチニンのレベルが、5日目まで劇的に増大した(データを明示していない)。
さらに213.29がこれらの症状に有益であるかどうかを判定するために、1mg/kg静注のラットに注入後5日目にて、腎臓機能試験を行なった。図9Aに示すように、GFR,RPF及びUVが、生理食塩水にて処理したラットと比較して劇的に改良した。化合物を、5mg/kgにて1日に3回(tid)与えることを、2日目より開始しそして5日まで継続した(図9A)。血液尿素窒素とクレアチニンとのレベルが共に予期したように減少した。
腎不全の2匹のラットのモデルにより得られた結果(虚血性又は腎毒性によりヒトの急性腎不全の重要な特性を再生するモデルとして文献[Lieberthal,W.,Nigam,S.K.(2000);Am.J.Physiol.Renal.Physiol.278(1):F1-F12]において十分に実証され受け入れられた)により示されたことは、213.29及びその誘導体が腎機能を改良し、そして腎障害の悪化に対する保護を提供する。したがって、これらの化合物が、急性腎不全及び慢性腎不良となるヒトの場合の治療剤として使用することができる。
本発明は、その好ましい実施例の方法により本明細書に記載されているが、添付されたクレームに明記されているように、本発明の精神及び特性から逸脱することなく、これを変更することができる。
本発明を一般的に記載している引用は、現段階で添付図面にて行われ、その好ましい例の図表を介して示している、そして図において：
図１Ａは、虚血性腎症のラットのモデルにおいて尿の流量率（尿のμl/h/kg(体重)として表現される）に及ぼす213.15及び相当する誘導体(化学表3を参照)の効果を示している。 図１Bは、ラットのモデルの虚血性腎症において、60分間にわたる(薬剤注入から20分から80分後にて、それは鉗子止めをはずした直後)平均の糸球体濾過率(GFR)に及ぼす213.15及び相当する誘導体(化学表3を参照)の効果を示している。 図１Cは、ラットのモデルの虚血性腎症において、60分間にわたる(薬剤注入から20分から80分後にて、それは鉗子止めをはずした直後)平均の糸球体濾過率(GFR)に及ぼす213.15及び相当する誘導体(化学表3を参照)の効果を示している。
図２Ａは、正常なビーグル・ドックのGFRにおける213.29の用量の応答を示している。 図２Ｂは、ラット、ドック、及び仔ブタにおける腎機能パラメータに及ぼす213.29の最大効果を示している。
図３は、U46619(トロンボキサンA2擬似)にて前収縮された仔ブタの低部伏在静脈リングにおいてPEG2にて形成される拡張に及ぼす213.29の効果を示している。
図4Ａは、ヒト血清における213.29の減成(degradation)プロファイルを示している。そのペプチドが、血清プロテアーゼに感受性のあるカルボキシ末端で2個のリシンを含む。その減成(degradation)により、1個のカルボキシルリシン[213.291]、又は2個のカルボキシルリシン[213.292]のいずれかを欠損したペプチドにおいて生ずる。カルボキシルロイシン残基は、実験条件下でヒトの血清による減成(degradation)にて完全に耐性があると見られる。 図4Bは、細胞を基盤とする分析(cell based assay)にて213.29及びその代謝物の生物活性を示している。ヒトEP4を発現するHEK293細胞を、213.29及びその代謝産物213.291及び213.292の存在又は非存在下で、100ｎMのPGE2にて刺激した。放射性免疫アッセイにより決定されるcAMPのレベルが、pmol/105細胞において発現された。
図５は、腎毛細血管収縮アッセイでの仔ブタにおける他のプロスタノイド受容体(ブタプロスト-EP2;17-フェニールPGE2-EP1;PGF2-EP1;PGF2a-FP;U46619-TP;M&B28767-EP3)の選択的アゴニストに刺激された収縮応答に及ぼす213.29の効果を示す。
図６Ａは、ラットの腎臓動脈閉鎖(RAO)モデルにおいて、213.29の静注ボーラス((bolus)(1mg/kg))に応答した糸球体の濾過率(GFR)、腎血漿流量(RPF)及び尿の排出によって評価されるような腎機能の改良を示す。コントロールとしてフェノルドパム(fenoldpam)(0.6μg/kgのボーラス((bolus)、続いて実験中0.6μg/kg/h)を使用した。 図６Ｂは、ラットのRAOモデルにおける213.29及びフェノルドパム(fenoldpam)に応答する血液尿窒素(尿)及びクレアチニンのレベル(腎機能パラメータを図６Ａに示す）(Shamはコントロールとしてshamにより操作されたラットの意味である)を示す。
図７は、両側の腎臓動脈に約1時間の鉗子止め(clamping)を受け、そして1 mg/kgの213.29の静注ボーラス(Bolus)にて毎日(日に1回)投与されたラットの腎臓組織の代表的例を(糸球体周辺の空間に赤血球の浸出、及び管閉塞の存在)図式的に示す。その結果は、213.29の処理により、糸球体周辺の赤血球の浸出、及び管の閉塞を有意に減少させ、そして虚血性急性腎不全のラットのモデルにおける腎機能の回復が、有意に導かれたことを示している。
図８は、両側の腎臓動脈に1時間の鉗子止め(clamping)を受けた動物にペプチド番号２１３．２９を毎日(qd)(日に1回)、及び日に2回(bid)(日に2回)投与して得られたRPF,GFR,及びUVの尿流量率によって評価されるような腎臓機能における改良を示す。
図９Ａは、急性尿細管の壊死(日に1回シスプラチン ip 17.5mg/kgにて注入されたラット)のラットのモデルにおける5日後の腎臓機能パラメータを示している。生理食塩水(saline(Sal))にて処理されたラットの糸球体の濾過率(GFR)、腎血漿流量、及び尿の排出が、5日までに極めて低いレベルに低下した、すなわち213.29(1mg/kg)の投与が5日目で、生理食塩水にて処理されたラットの尿のパラメータが改良された。しかしながら、213.29(5mg/kgを日に3回)にてラットを処理し、２日目に開始し、5日までに腎臓機能のほぼ全てのパラメータが正常化された、すなわち血液の尿窒素(BUN)及びクレアチニンのレベルの減少と関連した腎臓機能が改良された。 図9Bは、シスプラチンにて処理されたラットの腎組織を図式的に示す。213.29の治療(5 mg/kg日に3回)により、肥大症糸球体及び閉塞を含む集合管の数が減少した。

Claims (35)

  1. 下記の一般式：
    X-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-Y
    [式中Xは、水素原子及びカルバメイト基及びアシル基などの保護基からなる群から選択され；
    Yは、水素原子、1乃至3のL-リシン残基、グリシン、リン酸塩、硫酸塩、及びアミドから成る群から選択され；
    R1は、L-(4,4)ビフェニール・アラニン及びD-(4,4)ビフェニール・アラニンからなる群から選択され；
    R2は、Thrで；
    R3は、Serで;
    R4は、Tyr及びPheから成る群から選択され；
    R5は、Glu及びAspから成る群から選択され；
    R6は、Ala,Gly及びSerから成る群から選択され；
    R7は、Leu,lle,Val及びLysから成る群から選択される]
    を有するプロスタグランジンE2の受容体EP4のペプチド・アンタゴニスト。
  2. アシル基は、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル及び短い直鎖及び分岐鎖にて1乃至8の炭素原子を単位とするアルキル基から成る群から選択される疎水性成分から構成される請求項１記載のペプチド・アンタゴニスト。
  3. アシル基がアセチル基である請求項２記載のペプチド・アンタゴニスト。
  4. アシル基がベンゾイル基である請求項２記載のペプチド・アンタゴニスト。
  5. プロスタグランジンE2の受容体EP4の生物活性を阻害できる請求項1乃至4のいずれか1項記載のペプチド・アンタゴニスト。
  6. プロスタグランジンE2の受容体EP4の生物活性を阻害できる請求項5記載のペプチド・アンタゴニストのペプチド擬体。
  7. 請求項5記載の約0.1乃至約100mgのペプチド・アンタゴニストを含む医薬組成物。
  8. 請求項6記載の約0.1乃至約100mgのペプチド擬体を含む医薬組成物。
  9. 末期の腎疾患と診断された患者を治療するための請求項７及び８のいずれか1項記載の医薬組成物の使用。
  10. 急性腎不全と診断された患者を治療するための請求項７及び８のいずれか1項記載の医薬組成物の使用。
  11. 腎不良(insufficiency)と診断された患者を治療するための請求項７及び８のいずれか1項記載の医薬組成物の使用。
  12. 糸球体の濾過を改良するための請求項9乃至11のいずれか1項記載の医薬組成物の使用。
  13. 尿排出を改良するための請求項12記載の医薬組成物の使用。
  14. 動脈管開存症と診断された患者を治療するための請求項７及び8のいずれか1項記載の医薬組成物の使用。
  15. 動脈管を閉鎖するための請求項14記載の医薬組成物の使用。
  16. Bipが、L-(4,4)ビフェニルアラニンであり、そしてbipが、D-(4,4)ビフェニルアラニンであり、ここでD-アミノ酸を小文字にて定義し、そしてL-アミノ酸を大文字にて定義した、213.15(bip)tsyeal(配列番号1)、213.19(bip)tsyealk(配列番号2)、213.20(bip)tsyeglK(配列番号3)、213.21(bip)tsyealKK(配列番号4)、213.22(bip)tsyeglKK(配列番号5)、213.23(bip)tsyeslK(配列番号6)、213.24(bip)tsyeslKK(配列番号7)、213.25(bip)tsyeaK(配列番号8)、213.26(bip)tsyesK(配列番号9)、213.27(Bip)tsyealKK(配列番号10)、213.28(bip)tsyeaLKK(配列番号11)、213.29(Bip)tsyeaLKK(配列番号12)及び213.30(bip)tsyealGKK(配列番号13)から成る群から選択される請求項２記載のペプチド・アンタゴニスト。
  17. プロスタグランジンE2の受容体EP4の生物活性を阻害できる請求項１６記載のペプチド・アンタゴニスト。
  18. プロスタグランジンE2の受容体EP4の生物活性を阻害できる請求項１６記載のペプチド擬体。
  19. 請求項１７記載の約0.1乃至約100mgのペプチド・アンタゴニストを含む医薬組成物。
  20. 請求項１８記載の約0.1乃至約100mgのペプチド擬体を含む医薬組成物。
  21. 末期の腎疾患と診断された患者を治療するための請求項１９及び２０の何れか１項記載の医薬組成物の使用。
  22. 急性腎不全と診断された患者を治療するための請求項１９及び２０の何れか１項記載の医薬組成物の使用。
  23. 腎不良と診断された患者を治療するための請求項１９及び２０の何れか１項記載の医薬組成物の使用。
  24. 糸球体濾過を改良するための請求項21乃至23の何れか1項記載の医薬組成物の使用。
  25. 尿排出を改良するための請求項24記載の医薬組成物の使用。
  26. 動脈管開存症と診断された患者を治療するための請求項19及び20のいずれか1項記載の医薬組成物の使用。
  27. 動脈管の閉鎖のための請求項２６に記載された医薬組成物の使用。
  28. a) プロスタグランジンE2の受容体EP4を天然に又は組み換え的に発現させる細胞又は組織を培養する工程；
    b) 前記受容体における周知濃度のアゴニストの存在又は非存在下で、請求項１記載の所定量の化合物にて前記培養した細胞又は組織を処理する工程；
    c) Gαタンパク質によるGTPの結合及び加水分解、環状アデノシン1リン酸の合成、細胞中のカルシウムの変化、細胞の増殖そして／又は分化、変更された遺伝子発現、及び平滑筋の収縮又は弛緩から成る群から選択される、前記受容体の生物活性の1又は複数の観点を測定する工程、
    を含むアッセイにおける請求項５記載のペプチドを使用する方法。
  29. a) プロスタグランジンE2の受容体EP4を天然に又は組み換え的に発現させる細胞又は組織を培養する工程；
    b) 周知の濃度の前記受容体のアゴニストの存在又は非存在下で、請求項６記載の所定量の化合物にて前記培養された細胞又は組織を処理する工程；
    c) Gαタンパク質によるGTPの結合及び加水分解、環状アデノシン1リン酸の合成、細胞中のカルシウムの変化、細胞の増殖そして／又は分化、変更された遺伝子発現、及び平滑筋の収縮又は弛緩から成る群から選択される前記受容体の生物活性の1又は複数の観点を測定する工程、
    を含むアッセイにおける請求項６記載のペプチド擬体を使用する方法。
  30. ペプチドが、放射性同位体、ビオチン又は酵素から成る群から選択されたマーカーにより標識とされた請求項２又は１６のいずれか１項記載のペプチドを含むプロスタグランジンE2の受容体EP4の生物活性を評価するためのキット。
  31. ペプチドが、放射性同位体、ビオチン又は酵素から成る群から選択されるマーカーにより標識される請求項６及び１７のいずれか１項記載のペプチド擬体を含むプロスタグランジンE2の受容体EP4の生物活性を評価するためのキット。
  32. 医薬剤が、請求項１記載の前記ペプチドの治療としての効果量を含んで成る、末期段階の腎疾患の治療用前記医薬剤を製造するための請求項１記載のペプチド・アンタゴニストの使用。
  33. 医薬剤が、請求項１記載の前記ペプチドの治療としての効果量を含んで成る、急性腎臓不全の治療用前記医薬剤を製造するための請求項１記載のペプチド・アンタゴニストの使用。
  34. 医薬剤が、請求項１記載の前記ペプチドの治療としての効果量を含んで成る腎臓不良(insufficiency)の治療用前記医薬剤を製造するための請求項１記載のペプチド・アンタゴニストの使用。
  35. 医薬剤が、請求項１記載の前記ペプチドの治療としての効果量を含んで成る、腎動脈開存症の治療用前記医薬剤を製造するための請求項１記載のペプチド・アンタゴニストの使用。
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