JPH09503906A - 組換えｃ１４０受容体ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｃ１４０細胞表面受容体をコードするＤＮＡをクローン化し配列決定した。このＤＮＡの有用性は、細胞または卵母細胞表面で産生しうるＣ１４０受容体の組換え生産に用いることができる点であり、またアゴニストおよびアンタゴニストを含むその活性に影響する物質を検出するためのアッセイ系に使用できる。さらに、Ｃ１４０受容体の構造の解明はこれらのアッセイに使用できるアゴニストおよびアンタゴニスト化合物の設計を可能にする。Ｃ１４０受容体の有用性はまた、受容体自体またはその特異的領域と特異的に免疫反応する抗体の生産を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＣ１４０受容体ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニスト技術分野 本発明は新たに発見された受容体であってＧ−タンパク質結合受容体スーパー ファミリーに属する受容体に関する。該受容体は血管内の内皮細胞中で発現され る。該受容体に対する回避作用は、このファミリーの他の受容体を刺激するため に投与される薬剤の副作用を制限するのに必須の要素である。背景技術 多くの治療薬および予防薬に対する動物の応答は細胞表面上に存在する受容体 を介する。そのような受容体の１群はＧタンパク質結合受容体からなり、その生 理学的作用は３つのサブユニットタンパク質複合体であるＧ−タンパク質を介す るが、Ｇ−タンパク質は、サブユニットをその後に解放することによりこの種の 受容体に結合し、移動を伴う付加的な細胞内の事象に係わる。このサブクラスの 受容体は、とりわけ、アドレナリン受容体、神経ペプチド受容体、トロンビン受 容体および本発明の対象であるＣ１４０受容体を含む。このクラスの受容体は、 細胞表面内で受容体をつなぎ止める７つの膜貫通領域の存在により特徴付けられ る。 治療用物質のデザイナーの忘れやすい到達点は、副作用なしに目的物中に所望 の応答を生ぜしめることである。したがって、特定の受容体、例えばトロンビン 受容体を標的とするようにデザインされた薬剤はトロンビン受容体に特異的に反 応し且つ関連受容体に作用をもたないべきである。本発明のＣ１４０受容体は血 圧制御に関与し、そして該受容体の間違いによる刺激またはブロッキングは予想 し得ず、したがって不所望の作用をもたらす。したがって、例えばトロンビン受 容体を標的とするようにデザインされた治療剤がＣ１４０受容体との反応に関す る不所望の副作用を有すか否かを前もって確定する必要がある。便利なアッセイ 系としてＣ１４０受容体の生成のための組換え物質を提供し、並びに該アッセイ に用いるためのアゴニストおよびアンタゴニスト試薬を提供することにより、本 発明は、候補の薬剤のＣ１４０受容体との反応性に関する副作用の在否を前もっ て決定することができる。この副作用は、Ｃ１４０受容体が酵素、例えば外傷お よび免疫障害に連動するセリンプロテアーゼに応答すると信じられているため、 通常は不所望である。発明の開示 本発明は、候補の薬剤が不所望な副作用を及ぼす傾向を決定するためのアッセ イ系において有用な方法および物質を提供する。Ｃ１４０受容体の単離、組換え 生産および性状決定により、該アッセイにおいて該受容体を基質として用い、且 つ該受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを対照試薬として用いるアッセイ 系のデザインが可能になる。 即ち、一つの側面として、本発明はＣ１４０受容体の生成に関連した組換え物 質に向けられる。例えば、これらは培養されてその表面上にＣ１４０受容体を露 呈しうるトランスフェクト細胞を含み、そして即ち、天然Ｃ１４０受容体と物質 との相互作用のためのアッセイ系を提供する。通常、これらのアッセイ系におい て有用な宿主細胞の制限は、細胞が適切な機構を有することにより、それらの表 面上に受容体を有し且つ細胞内応答の媒介物質であるＧ−タンパク質を含むこと である。（しかしながら、単に結合のみを評価するアッセイはＧ−タンパク質を 必要としない。）ほとんどの動物細胞はこの要求を満たす。 他の側面において、本発明は活性化形態のＣ１４０受容体タンパク質細胞外部 分に類似させたＣ１４０受容体アゴニストに向けられる。これらのアゴニストは 、上記アッセイ中で対照試薬として用いることにより、アッセイ系の実用性を確 認するのに有用である。さらに、Ｃ１４０受容体のアゴニストはインビボにおい て低血圧作用を示す。したがって、アゴニスト自体も抗高血圧に有用である。 さらに他の側面において、本発明はＣ１４０受容体アンタゴニストに向けられ る。これらのアンタゴニストは修飾形態のＣ１４０受容体アゴニストペプチドか らなり、受容体の活性化に要求される必須特性を欠く。これらのアンタゴニスト は受容体に結合せず、受容体を活性化せず、そしてアゴニストおよび天然受容体 結合リガンドによる受容体活性化を阻害する。 第２群のアンタゴニストは受容体タンパク質の特定部分に結合するようにデザ インされた抗体を含む。通常、これらは、Ｃ１４０受容体のあらゆる所望な領域 に極めて特異的なモノクローナル抗体調製物である。本発明の抗体は、受容体タ ンパク質の免疫アッセイ、例えば組換え系において遺伝子の首尾よい発現を評価 するのにも有用である。 他の側面において、本発明は、組換えＣ１４０受容体を利用して候補の薬剤の アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性をスクリーンするアッセイ系に関する 。このアッセイは、治療剤がＣ１４０受容体の活性化または阻害により引き起こ される不所望な副作用を有さないことを確認するために特に有用である。ある場 合には、この受容体系のアゴニスト活性は治療における有用性を有する。これら アッセイ系の幾つかは、陽性対照としてアゴニストペプチドの使用を含む。アッ セイはアゴニスト作用を阻害するアンタゴニストのスクリーンにも用いることが できる。 本発明の他の側面は、Ｃ１４０受容体が活性化された際にＣ１４０受容体から 分断されたペプチドの、液体中、例えば血液中または尿中での検出による、Ｃ１ ４０受容体の活性化により特徴付けられる体調の診断に関する。本発明に含まれ る他の診断法は、活性化受容体に特異的な抗体を用いてインサイチュにより造影 剤を活性化受容体に局在化させることによる、活性化形態の受容体の可視化であ る。 本発明の他の側面は、本発明のアゴニストおよびアンタゴニストを含む薬剤組 成物に向けられる。本発明のアゴニストは抗高血圧であり、ひるがえせば、所望 により該アンタゴニストで血圧を上昇させることができる。図面の簡単な説明 図１は、マウスＣ１４０受容体のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を示す。 図２は、ヒトＣ１４０受容体のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を示す。 図３は、ヒトＣ１４０受容体とマウスＣ１４０受容体のアミノ酸配列の比較を 示す。 図４は、推定されたアミノ酸配列に基づいたＣ１４０受容体の活性化の提案モ デルを示す。 図５は、マウスＣ１４０受容体とヒトトロンビン受容体のアミノ酸配列の比較 を示す。 図６は、ノーザンブロットを用いてさまざまなマウス組織中のＣ１４０受容体 コードｍＲＮＡの存在を検出した結果を示す。 図７は、Ｃ１４０アゴニストペプチドのインビボにおける低血圧作用を証明す る血圧のトレースを示す。 図８は、Ｃ１４０受容体アゴニストペプチドにより誘導されたラット大腿静脈 の血管拡張を示す。図８ａは固定化静脈におけるこれらの結果を示し、図８ｂは 内皮細胞を除去した固定化静脈におけるこれらの結果を示す。 図９は、カエル卵巣中で発現されたＣ１４０受容体のプラスミン、カリクレイ ンまたはトリプシンによる活性化のアッセイ結果を示す。図９ａはプラスミンの 結果を示し、図９ｂはカリクレインの結果を示し、そして図９ｃはトリプシンの 結果を示す。 図１０は、マウスＣ１４０受容体をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオチ ド配列および推定アミノ酸配列を示す。 図１１は、ヒトＣ１４０受容体をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオチド 配列および推定アミノ酸配列を示す。 図１２は、マウスＣ１４０受容体を用いた切片化新生マウスのインサイチュハ イブリダイゼーションの結果を示す。 図１３は、ヒトＣ１４０受容体プローブにハイブリダイズするヒト細胞ライン からの全ＲＮＡのノーザンブロットを示す。発明を実施する態様 本発明により明らかにされたＣ１４０受容体の特徴は、本明細書中において図 １−４に要約される。図１は、マウス受容体をコードする全ＤＮＡ配列およびそ の推定アミノ酸配列を示す。本明細書中において、「Ｃ１４０受容体」は、実施 例１において記載されたクローンＣ１４０に含まれるマウス受容体に対応するあ らゆる動物種の受容体を意味する。この受容体のマウス型をコードする天然ＤＮ Ａを用いることにより、ヒトを含む他の種の対応受容体は本明細書に記載される とおりに得られる。図２は、ヒト受容体の対応ＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を 示す。 マウス受容体の全アミノ酸配列は３９５アミノ酸からなり、２７アミノ酸のシ グナルペプチドが分断されることにより３６８アミノ酸の成熟受容体タンパク質 となる。同様に、図２に示されるとおり、ヒト受容体は推定される２９アミノ酸 のシグナルペプチド配列を含む３９８アミノ酸に相当する解読枠によりコードさ れ、３６９アミノ酸の成熟受容体タンパク質となる。 図３は、ヒトとマウスのアミノ酸配列の比較を示すが、これらの配列は高度の 相同性を示す。 図１および２に示された配列の疎水性／親水性プロットは、成熟Ｃ１４０受容 体が、Ｇ−タンパク質を介して細胞に作用する７−膜貫通ドメイン受容体ファミ リーのメンバーであることを示す。成熟Ｃ１４０受容体は、アスパラギン連動グ リコシル化のためのいくつかのコンセンサス部位を有する相対的に長い細胞外ア ミノ酸延長物を有する。該受容体は、第１膜貫通領域中の保存されたアスパラギ ン、第２膜貫通領域中のモチーフＬｅｕ−Ａｌａ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ、第４膜貫通 領域中のＴｒｐ、および複数のセリンおよびスレオニン残基を含むカルボキシ末 端テイルも含む。インサイチュの受容体の提案モデルは図４に示す。 図５を参照すると、トロンビン受容体に対する相同性が容易に理解される。図 ５は、マウスＣ１４０受容体のアミノ酸配列とトロンビン受容体のアミノ酸配列 を比較する。トロンビン受容体は４１番目と４２番目のＡｒｇ−Ｓｅｒ結合がタ ンパク質分解酵素により分断されて、受容体のリフォールディングおよび新たに 生じたアミノ末端を通した活性化を可能ならしめる活性化ペプチドを放出する。 同様の様式において、Ｃ１４０受容体は３４番目と３５番目のＡｒｇ−Ｓｅｒ結 合の分断により活性化されて推定される成熟タンパク質の第１位から分断部位ま での活性化ペプチドを放出する。２８番目のＡｒｇは成熟タンパク質のアミノ末 端のアミノ酸残基であると信じられているから、活性化ペプチドは配列ＲＮＮＳ ＫＧＲを含む。このペプチドは即ち、Ｃ１４０受容体の活性化の指標として用い られた。いずれにせよ、成熟タンパク質のＮ−末端の正確な位置はアゴニストま たはアンタゴニストのデザインには重要でない。活性化ペプチドは腎臓により自 由に濾過されるらしく、そしておそらく尿中で濃縮され、そしてＣ１４０受容体 の活性化の指標として用いられうる。 活性化ペプチドの解放により受容体タンパク質がリフォールディングされて受 容体が活性化される。このことは図４に模式的に示されるが、活性化ペプチドの 放出およびリフォールディングによるコンフォメーションの変化が受容体の細胞 内のコンフォメーションの変化をもたらすことも示す。この仮説は、活性化によ り生じた新たなアミノ末端を模したペプチドによりＣ１４０受容体が活性化され うるという発見により確認される。したがって、新たなアミノ末端のＮ−末端を 活性化受容体に模すると、アゴニストのように挙動する。受容体活性化に関して 受容体において新たに生じたアミノ末端の最初の５アミノ酸の重要性も以下のと おりに確認された。 この情報に基づくと共に、トリプシンに対するトリプシノーゲン活性化および トロンビン受容体の活性化の基礎となる機構の類推により、リガンドが受容体を 分断するときに新たに露出したセリン上の陽性電荷アミノ基が受容体活性化に重 要な役割をはたすらしい。Ｃ１４０受容体を結合するアゴニストペプチド配列に 基づいたペプチドであってフリーなα−アミノ基を欠くように修飾されたものは 、この受容体のアンタゴニストとして機能しうる。即ち、特定の活性化相互作用 の能力を欠くアゴニストペプチドの修飾物はＣ１４０受容体アンタゴニストとし て機能する。本発明の化合物 本発明のペプチド化合物を説明するのに使用する命名法は、Ｎ-末端アミノ基 がペプチド中の各アミノ酸残基の左側にあり、カルボキシ基が各アミノ酸残基の 右側にくるものとする慣用法に従う。本発明の選択された特定態様を示す式中、 アミノ-及びカルボキシ-末端基は、特定的には示されていないことが多いが、他 に特定しない限り、生理学的ｐＨ値で予測される形にあるものと理解する。従っ て、生理学的ｐＨに於けるＮ-末端Ｈ⁺ ₂及びＣ-末端Ｏ^-は、特に特定の実施例ま たは遺伝子式に特定したり示したりする必要はないが、存在するものと理解され る。アミノ酸残基の側鎖上の遊離官能基は、アミド化、アシル化または、例えば 、それらの活性に影響を与えることなく化合物の溶解性を変化させ得る他の置換 法によっても変形し得る。 示されているペプチド中、好適な場合には、各遺伝子でコードされた残基は、 以下の慣用のリストに従って、アミノ酸の略式の名称に対応する１文字によって 表される。 遺伝子的にコードされていないアミノ酸は、以下のディスカッション中では、 略語にて表す。 本願発明中で示される特定のペプチドでは、Ｄ-型をダガーの上つき(⁺)で示さ ない限り、光学異性体を有する任意のアミノ酸残基のＬ-型を示すものとする。 本発明の化合物は、指定された種類のアミノ酸残基によって一部限定されてい るペプチドである。アミノ酸残基は、通常、以下のような４つの大きなサブクラ スに分けることができる。 酸性：残基は、生理学的ｐＨに於いてＨイオンの損失により負の電荷を有し、 残基は、ペプチドが生理学的ｐＨに於いて水性媒体中にあるときには、それが含 まれる媒体中でペプチドのコンフォメーション内で表面の位置を探すために水溶 液により誘引される。 塩基性：残基は、生理学的ｐＨに於いてＨイオンを伴うため正の電荷を有し、 残基は、ペプチドが生理学的ｐＨに於いて水性媒体中にあるときには、それが含 まれる媒体中でペプチドのコンフォメーション内で表面の位置を探すために水溶 液により誘引される。 中性/非極性：残基は生理学的ｐＨに於いて帯電せず、残基は、ペプチドが水 性媒体中にあるときにペプチドが含まれている水性媒体中でペプチドのコンフォ メーション内で内側の位置を探すために水溶液によって反発される。これらの残 基は、本明細書中、『疎水性』とも表現される。 中性/極性：残基は生理学的ｐＨに於いて帯電しないが、残基は、ペプチドが 水性媒体中にあるとき、ペプチドが含まれている水性媒体中でペプチドのコンフ ォメーション内で外側の位置を探すために水溶液により誘引される。 勿論、個々の残基分子の統計的集合内では幾つかの分子が帯電していても、幾 つかは帯電していなかったり、多少水性媒体からの誘引または反発があるものと 理解される。『帯電している(charged)』という定義に合わせるためには、かな りの割合（少なくとも約25％）の個々の分子が生理学的ｐＨで帯電されていなけ ればならない。極性または非極性として分類するのに必要な誘引または反発の程 度は任意であるので、本発明により特定的に予期されたアミノ酸は、一方または 他方にも分類された。特定的に命名されていない殆どのアミノ酸は、既知の挙動 を基礎として分類され得る。 アミノ酸残基は、残基の側鎖の置換基に対して自明な分類、環式または非環式 、芳香族または非芳香族、及び大小によってサブクラスに分け得る。残基が、カ ルボキシル炭素以外に全部で４個以下の炭素原子を含む場合には、残基は小さい ものと見なされる。勿論、小さな残基は、常に非芳香族である。 天然のタンパク質アミノ酸に関しては、サブクラス分類は以下のスキームの通 りである。 酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸； 塩基性/非環式：アルギニン、リジン； 塩基性/環式：ヒスチジン； 中性/極性/小さい：グリシン、セリン、システイン； 中性/非極性/小さい：アラニン； 中性/極性/大きい/非芳香族：トレオニン、アスパラギン、グルタミン； 中性/極性/大きい芳香族：チロシン； 中性/非極性/大きい/非芳香族：バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニ ン； 中性/非極性/大きい/芳香族：フェニルアラニン及びトリプトファン。 遺伝子でコードされた第２級アミノ酸プロリンは、この規則では、中性/非極 性/大きい/環式及び非芳香族に分類されるが、ペプチド鎖の二次的なコンフォメ ーション上の公知の作用による特別なケースであるので、この定義の群には含ま れない。 遺伝子コードによりコードされない特定の一般のアミノ酸としては、例えば、 β-アラニン（β-Ａｌａ）、または他のω-アミノ酸、例えば3-アミノプロピオ ン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸（2,3-ｄｉａＰ）、4-アミノ酪酸等、α-アミ ノイソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトル リン（Ｃｉｔ）、t-ブチルアラニン（t-ＢｕＡ）、t-ブチルグリシン（t-ＢｕＧ ）、N-メチルイソロイシン（N-ＭｅＩｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）及び シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（ Ｃｙａ）、2-ナフチルアラニン（2-Ｎａｌ）；1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリ ン-3-カルボン酸（ＴｉＣ）；β-2-チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；及びメチオニ ンスルホキシド（ＭＳＯ）が挙げられる。これらのアミノ酸もまた、特定のカテ ゴリーに都合よく分類される。 上記の定義に従って、 Ｓａｒ、β-Ａｌａ、2,3-ｄｉａＰ及びＡｉｂは、中性/非極性/小さいに分類 され； t-ＢｕＡ、t-ＢｕＧ、N-ＭｅＩｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍｖｌ及びＣｈａは、中性/非 極性/大きい/非芳香族に分類され； Ｏｒｎは塩基性/非環式に分類され； Ｃｙａは酸性に分類され； Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ及びＭＳＯは、中性/極性/大きい/非芳香族に分類さ れ；及び Ｐｈｇ、Ｎａｌ、Ｔｈｉ及びＴｉｃは、中性/非極性/大きい/芳香族に分類さ れる。 種々のω-アミノ酸は、大きさに従って、中性/非極性/小さい（β-Ａｌａ、即 ち3-アミノプロピオン酸、4-アミノ酪酸）または大きい（他のすべて）に従って 分類される。 遺伝子中にコードされたこれらの他のアミノ酸置換体もまた、本発明の範囲内 のペプチド化合物に含まれ、それらの構造に従ってこの一般スキームで分類され 得る。 アミノ酸がＣ-末端を形成する場合、本発明のすべての化合物は、医薬的許容 可能な塩またはエステルの形であってもよい。塩としては、例えば、Ｎａ⁺、Ｋ⁺ 、Ｃａ⁺²、Ｍｇ⁺²等が挙げられ、エステルは通常、１−６Ｃのアルコールのエス テルである。 本発明のすべてのペプチドに於いて、１個以上のアミド結合（-CO-NH-）は、 場合により、等配電子形である他の結合、例えば、-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂CH₂、 -CH=CH-（シス及びトランス）、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-及び-CH₂SO-と置き換わっ てもよい。この置換は、当業者には公知の方法によって実施し得る。以下の文献 は、これらの代替結合部分を含むペプチド類似物の製造について記載したもので ある。Spatola，A.F.，Vega Data(1983年3月)、第１巻、第３刷、"Peptide Back bone Modifications"（総説）;Spatola，A.F.，"Chemistry and Biochemistry o f Amino Acids Peptides and Proteins"，B.Weinstein,編，Marcel Dekker，New York，p.267（1983）（総説）;Morley，J.S.，Trends Pharm Sci（1980）pp.46 3-468（総説）;Hudson，D.,ら，Int J Pept Prot Res（1979）14:177-185（-CH₂ NH-,-CH₂CH₂-）;Spatola，A.F.,ら，Life Sci（1986）38:1243-1249(-CH₂-S);Ha nn，M.M.，J Chem Soc Perkin Trans I（1982）307-314(-CH-CH,シス及びトラン ス); Almquist，R.G.,ら，J.Med.Chem（1980）23:1392-1398(-COCH₂-); Jenning s-White，C.,ら，Tetrahedron Lett（1982）23:2533(-COCH₂-);Szelke,M.,ら，E uropean Application EP 45665（1982）CA:97:39405(1982)(-CH(OH)CH₂-)；Holl aday，M.W.,ら，Tetrahedron Lett（1983）24:4401-4404（-C(OH)CH₂-）;及びHr uby，V.J.，Life Sci（1982）31:189-199(-CH₂-S-)。 Ａ．アゴニスト 本発明のアゴニストは以下の式の一連のペプチドからなる： ＡＡ₁−ＡＡ₂−ＡＡ₃−ＡＡ₄−ＡＡ₅−ＡＡ₆−ＡＡ₇−Ｚ （１） （式中、 ＡＡ₁は小さいアミノ酸またはスレオニンであり； ＡＡ₂およびＡＡ₃はそれぞれ独立に中性／非極性／大きい／非芳香族アミノ酸 であり； ＡＡ₄は小さいアミノ酸であり； ＡＡ₅は塩基性アミノ酸であり； ＡＡ₆は存在しても存在しなくてもよく、存在する場合には、中性／非極性／ 大きい／非芳香族アミノ酸であり； ＡＡ₇は、もしもＡＡ₆が存在しない場合には存在せず、もしもＡＡ₆が存在す る場合には存在しても存在しなくてもよく、酸性アミノ酸であり；そして Ｚはアゴニスト活性を妨害しない置換基である）。 式１のペプチドは、（Ｚに含めて示されるように）妨害しない置換基からなる さらなるアミノ酸配列でＣ末端において（しかしＮ末端においてではない）伸長 できる。 式１の化合物のＣ末端において、カルボキシル基は非誘導体形であるか、ある いはアミド化されているか、あるいはエステルであってよく；非誘導体形の場合 にはカルボキシルは遊離酸または塩、好ましくは薬剤的に受容できる塩でありう る。 Ｃ末端がアミド化されている場合には、Ｃ末端のカルボニル炭素と共有結合し たアミド基の窒素原子はＮＲ’Ｒ’（式中、各Ｒ’は独立に水素であるか、また は１−６Ｃの直鎖または分枝鎖アルキルであり、このようなアルキルはメチル、 エチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシルなどの１−６Ｃの直鎖または分枝鎖飽和炭 化水素である）となるであろう。このようなアミド基の代表例には、−ＮＨ₂、 −ＮＨＣＨ₃、−Ｎ（ＣＨ₃）₂、−ＮＨＣＨ₂ＣＨ₃、−ＮＨＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂ 、および−ＮＨＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₃がある。さらに、Ｒ’の一方また は両方が、例えば−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、ハロ、−ＮＲ’ＣＮＲ’ＮＲ’Ｒ’ などの１以上の置換基で任意に置換されていてもよく、ここで各Ｒ’は独立に先 に定義した通りである。したがって、Ｚは−ＯＨまたはエステル（ＯＲ’）また はその塩の形、あるいは−ＮＲ’Ｒ’（ここでＲ’は先に定義した通りである） でありうる。 ＡＡ₁の好ましい態様は、２，３−ジアミノプロピオニル（２，３−ｄｉａＰ ）上のＳｅｒである。ＡＡ₂およびＡＡ₃の好ましい態様はＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｃｈ ａおよびＬｅｕである。式（１）の化合物の残りの残基の好ましい態様は、ＡＡ₄ がＧｌｙであり、ＡＡ₅がＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨａｒであり、ＡＡ₆がもし存 在する場合にはＶａｌ、Ｉｌｅ、ＣｈａまたはＬｅｕであり、そしてＡＡ₇がも し存在する場合にはＡｓｐまたはＧｌｕである。特に好ましいのは、ＳＬＩＧＲ ＬＥＴＱＰＰＩＴ、ＳＬＩＧＲＬＥＴＱＰＰＩ、ＳＬＩＧＲＬＥＴＱＰＰ、ＳＬ ＩＧＲＬＥＴＱＰ、ＳＬＩＧＲＬＥＴＱ、ＳＬＩＧＲＬＥＴ、ＳＬＩＧＲＬＥ、 ＳＬＩＧＲＬ、ＳＬＩＧＲ、ＳＬＬＧＫＶＤＧＴＳＨＶＴ、ＳＬＬＧＫＶＤＧＴ ＳＨＶ、ＳＬＬＧＫＶＤＧＴＳＨ、ＳＬＬＧＫＶＤＧＴＳ、ＳＬＬＧＫＶＤＧＴ 、ＳＬＬＧＫＶＤＧ、ＳＬＬＧＫＶＤ、ＳＬＬＧＫＶ、ＳＬＬＧＫ、Ｓ（Ｃｈａ ）ＩＧＲ、Ｓ（Ｃｈａ）ＬＧＫ、（２，３−ｄｉａＰ）−ＩＧＲ、（２，３−ｄ ｉａＰ）−ＬＬＧＫ、ＳＬＬＧＫＲ−ＮＨ₂、ＳＬＩＧＲＲ−ＮＨ₂、Ｓ（Ｃｈａ ）ＬＧＫＫ−ＮＨ₂、Ｓ（Ｃｈａ）ＩＧＲＫ−ＮＨ₂、（２，３−ｄｉａＰ）−Ｌ ＩＧＲＫ−ＮＨ₂、（２，３−ｄｉａＰ）−ＬＩＧＫＫ−ＮＨ₂およびそのアミド 化形からなる群から選択される式（１）の化合物である。 Ｂ．アンタゴニスト Ｃ１４０受容体によって媒介される活性を妨害する本発明の化合物は、Ｎ末端 セリン残基を欠失する修飾アゴニストペプチド；およびＣ１４０受容体の様々な 重要な位置と免疫反応する抗体を含む。ペプチドアンタゴニスト 第１群のアンタゴニスト、すなわち修飾アゴニストは以下の式によって表され る： Ｘ−ＡＡ₂−ＡＡ₃−ＡＡ₄−ＡＡ₅−ＡＡ₆−ＡＡ₇−Ｚ （式中、 ＸはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、２，３−ｄｉａＰまたはＧｌｙ以外の アミノ酸残基であるか、あるいはデスアミノまたはアルキル化またはアシル化ア ミノ酸であり； ＡＡ₂およびＡＡ₃はそれぞれ独立に中性／非極性／大きい／非芳香族アミノ酸 であり； ＡＡ₄は小さいアミノ酸であり； ＡＡ₅は塩基性アミノ酸であり； ＡＡ₆は存在しても存在しなくてもよく、存在する場合には、中性／非極性／ 大きい／非芳香族アミノ酸であり； ＡＡ₇は、もしもＡＡ₆が存在しない場合には存在せず、もしもＡＡ₆が存在す る場合には存在しても存在しなくてもよく、酸性アミノ酸であり；そして Ｚはアゴニスト活性を妨害しない置換基である）。 好ましいアシル基は式ＲＣＯ−であり、ここでＲは１−６Ｃの直鎖または文枝 鎖アルキルを表す。アセチルが特に好ましい。 Ｘの好ましい態様には、３−メルカプトプロピオン酸（Ｍｐｒ）、３−メルカ プト吉草酸（Ｍｖｌ）、２−メルカプト安息香酸（Ｍｂａ）およびＳ−メチル− ３−メルカプトプロピオン酸（ＳｍｅＭｐｒ）を含む。ＡＡ₂からＡＡ₇までの好 ましい態様は先にアゴニストについて記載した通りであり；またＺについても先 に記載した通りである。 このクラスのアンタゴニストペプチドのうちで特に好ましいのは、Ｍｐｒ−Ｌ ＬＧＫ、Ｍｐｒ−ＬＩＧＲ、Ｍｐｒ−（Ｃｈａ）ＬＫＧ、Ｍｐｒ−（Ｃｈａ）Ｉ ＧＲ、Ｍｐｒ−ＬＬＧＫＫ−ＮＨ₂、Ｍｐｒ−ＬＩＧＲＫ−ＮＨ₂、Ｍｐｒ−ＬＩ ＧＲＫＥＴＱＰ−ＮＨ₂、Ｍｐｒ−ＬＬＧＫＫＤＧＴＳ−ＮＨ₂、（ｎ−ペンチル ）₂−Ｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂および（Ｍｅ−Ｎ− （ｎ−ペンチル）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂からなる 群から選択されるものである。抗体 Ｃ１４０受容体の重要部分との免疫反応性を有する抗体であるアンタゴニスト は、抗体により標的とされることが意図されるＣ１４０受容体のこれらの部分を 抗原性領域として含有するペプチドを用いて好適な哺乳動物被験体を免疫感作す ることにより得られる。重要領域は、タンパク質分解的切断の領域、活性化のた めに重要な細胞外断片の断片（これは切断部位を含む）、および細胞外ループを 形成する配列部分を含み、特に、この領域は、活性化された受容体細胞外領域の Ｎ末端と相互作用する。本発明のアゴニストペプチドはこの場合免疫原として使 用してもよい。 従って、ペプチドは、タンパク質分解領域、即ち、例えば、ＳＫＧＲＳＬＩＧ ＲＬＥＴ、細胞外ループ、例えばＩＳＹＨＬＨＧＮＮＷＶＹＧＥＡＬＣ；ＱＴＩ ＹＩＰＡＬＮＩＴＴＣＨＤＶＬＰＥＥＶＬＶＧＤＭＦＮＹＦＬ；およびＨＹＦＬ ＩＫＴＱＲＱＳＨＶＹＡを含むもの等を含む。以下に記載するアゴニストペプチ ドも免疫原として有用である。 抗体は、ペプチドハプテンが十分な長さを有する場合にはそれを単独で用いて 、あるいは、所望ならば、または免疫原性を高めることが必要であるならば、好 適な担体と結合させたペプチドハプテンを用いて、適当な免疫感作方法で好適な 哺乳類宿主を免疫感作することによって調製される。ＢＳＡ、ＫＬＨ、または他 の担体タンパク質等の担体との免疫原性結合体を調製するための方法は、当技術 分野で周知である。ある状況下では、例えばカルボジイミド試薬を用いる直接結 合が有効かもしれない；他の例では、Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，に より供給されるもののようなリンキング試薬が、ハプテンへの接近し易さを生じ させるのに望ましいかもしれない。ハプテンペプチドは、アミノまたはカルボキ シ末端にＣｙｓ残基とともに伸びていてもよく、あるいは、システイン残基が散 在 していてもよく、例えば、これにより担体へのリンキングが容易になる。抗原の 投与は、当技術分野で一般的に理解されるように、好適な期間を通じて好適なア ジュバンドを使用して、一般的には注入により行われる。免疫感作のスケジュー ル中に、抗体の力価を計算して抗体の形成の適性度を決定する。 このようにして産生されたポリクローナル抗血清は一定の応用のためには十分 ではある一方で、医薬組成物のためには、モノクローナル調製物の使用が好まし い。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化した細胞系は、一般的に知られ ているように、リンパ球細胞または脾細胞を不死化するKohler and Milstein の 標準的方法またはその改良法を用いて調製することができる。所望の抗体を分泌 している不死化細胞系は、イムノアッセイによってスクリーニングされるが、こ の場合、抗原はペプチドハプテンであるか組換え宿主細胞上に提示されたＣ１４ ０受容体それ自体である。所望の抗体を分泌する適当な不死化細胞培養物を同定 したら、細胞は、in vitroで、または腹水液体中での産生により、培養すること ができる。 次いで、所望のモノクローナル抗体は培養上清から、または腹水上清から回収 される。免疫学的に有意な量を含むモノクローナルまたはポリクローナル抗血清 のフラグメントは、無傷な抗体と同様に、アンタゴニストとして使用することが できる。Ｆ（ａｂ’）₂のＦａｂ、Ｆａｂ’フラグメントのような免疫学的に反 応性のあるフラグメントの使用は、特には治療関係においては好ましいことが多 いが、これはこれらのフラグメントは免疫グロブリン全体よりも免疫原性が一般 的に低いからである。 抗体またはフラグメントはまた、組換え手段により、既存技術を用いて、調製 することもできる。受容体の所望の領域に特異的に結合する領域はまた、複数種 の起源を有するキメラの関係において産生することもできる。 このようにして産生された抗体は、本発明のアッセイにおいてアンタゴニスト の役割を満たす、受容体のための潜在的アンタゴニストとしてのみならず、活性 化された受容体を検出するためのイムノアッセイにおいても有用である。このよ うなこれらの抗体は、被験体への投与のために像形成剤と結合させることができ 、これにより局在化した抗体の検出が可能になり、Ｃ１４０受容体が活性化型か 不 活性化型かのいずれかの状態でいるのかを確認することができる。さらに、これ らの試薬はin vitroで、例えば、組換え宿主細胞の表面に配置されたＣ１４０受 容体の活発な産生を検出するのに有用である。ペプチドアゴニストおよびアンタゴニストの調製 本発明のペプチドアゴニストおよびアンタゴニストは、当技術分野で公知の標 準的固相（または液相）ペプチド合成法を用いて調製できる。それに加え、これ らのペプチドをコードするＤＮＡを、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用い て合成でき、および標準的組換え製造システムを用いて組換え法でも製造できる 。もし、遺伝子がコードしないアミノ酸を含めるのであれば、固相ペプチド合成 を用いる製造が必要である。アッセイに用いるためのＣ１４０受容体の組換え製造 本発明は、組換え細胞表面に提示するためのＣ１４０受容体の製造のための組 換え材料を提供する。これらの組換え法を用いる受容体の製造は、Ｃ１４０受容 体に結合し、活性化し、または拮抗する候補薬剤の能力を決定するための、有用 な試薬を提供する。これらの性質の決定は、他の関連受容体を結合させることを 意図する薬剤の特異性の評価にとって、不可欠である。 この組換え製造のため、Ｃ１４０受容体をコードするＤＮＡの配列（例えば図 １および２に示すものまたはそれらの実質的均等物またはそれらの縮重類縁体） を、下記に示す天然配列の採取によるか又は公知天然配列の実質的部分をプロー ブとして用いることにより調製するか、或いは標準的方法によりｄｅ ｎｏｖｏ で合成することができる。このＤＮＡを好ましい宿主に適する発現ベクターに連 結し、適合する細胞を形質転換する。細胞をＣ１４０受容体コード遺伝子の発現 に適する条件下で培養し、その表面に該受容体を提示する細胞をアッセイのため に採取する。 宿主細胞は典型的には動物細胞、最も典型的には哺乳類細胞である。アッセイ において有用であるためには、細胞は、受容体が図４において一般的に示す形状 （コンフィギュレーション）で細胞表面に提示されることを可能にする細胞内メ カニズムを持っている必要がある。もしアッセイが検出システムとして活性化さ れた受容体に対する細胞の応答を利用する場合は、細胞は受容体の活性化にたい する応答のための、Ｇ−タンパク質にリンクしたメカニズムを有するべきである 。大部分の哺乳類および他の動物細胞は、このような要求を満足している。 本発明の方法に使用するために特に適する細胞は、ゼノパス・レビスのカエル 卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ｆｒｏｇ ｏｏｃｙｔｅｓ）であり 、これは所望タンパク質をコードするＤＮＡから進行する標準的組換え発現シス テムではなく、典型的にはｃＲＮＡを使用する。典型的には、受容体をコードす るＤＮＡ配列を含む直線化ベクターから、キャップされたＲＮＡを製造する。こ の反応はＲＮＡポリメラーゼおよび標準的試薬を用いて行う。ｃＲＮＡは、典型 的には、エタノールによるフェノール／クロロホルム沈澱法によって回収し、卵 母細胞に注入する。 次に、Ｃ１４０受容体をコードするＤＮＡを発現する動物宿主細胞またはｃＲ ＮＡを注入した卵母細胞を培養して、コードする核酸の発現をおこさせ、細胞の 表面に図４に示すものと類似の様子で提示されたＣ１４０受容体を製造させる。 次に、これらの細胞を直接用いてアッセイし、候補薬剤の受容体に対する結合性 、拮抗性、又は活性化を評価する。アッセイ 容易に行い得るアッセイの一つのタイプにおいては、候補薬剤の受容体に対す る結合性を、アゴニストもしくは公知の結合性アンタゴニストとの競合性によっ て試験することができる。一つの方法においては、競合させるアゴニストもしく はアンタゴニストを標識することができ；受容体に結合することが知られている 標識物質は、勿論合成ペプチドであってもよい。一つの典型的プロトコールにお いては、種々の濃度の候補物質を、一定濃度の標識アゴニストもしくはアンタゴ ニストと一緒に加え、受容体に対する標識の結合の阻止を公知の方法によって調 べることができる。 それよりもやや洗練されたアプローチとして、アゴニストが誘発する応答に対 する候補化合物の効果を、Ｃ１４０受容体を組換え発現する細胞によって、後述 のように測定することができる。これら細胞上の受容体の活性化に対する効果を 調べるためのアッセイシステムは、本明細書においてさらに詳細に記載する、カ ルシウム移動法（ｃａｌｃｉｕｍ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）および電位固定 法（ｖｏｌｔａｇｅ ｃｌａｍｐ）を含む。これらのアッセイは、受容体への単 なる結合能力ではなく、候補薬剤の受容体活性に対する効果を評価することを可 能ならしめる。 Ｃ１４０受容体をコードするｃＲＮＡを発現する卵母細胞またはＣ１４０受容 体を製造する他の組換え細胞において、アゴニストが誘発する⁴⁵Ｃａ放出の増加 を、文献記載の技術（Williams，J．A.，ら，Proc Natl Acad Sci USA(1988)85: 4939-4943）により評価する。簡単にのべるなら、３０卵母細胞づつのグループ を、５０μCiの⁴⁵ＣａＣｌ₂（１０−４０ｍCi／mg Ｃａ；アマーシャム）を含 む３００μｌのカルシウム不含修正バース溶液（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂａｒｔｈ ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＭＢＳＨ））中で、室温にて４時間インキュベート することにより、細胞内カルシウムプールを標識する。標識した卵母細胞または 細胞を洗浄し、次に抗生物質を含まないＭＢＳＨ II中で９０分間インキュベー トする。５卵母細胞づつのグループを選択し、０．５ml／ウェルの抗生物質を含 まないＭＢＳＨ IIが入っている２４−ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０４７）の各ウェルに加える。１０分置きに培地を除去して、新鮮な培地に 交換し；採取した培地をシンチレーションカウントして分析し、各１０分間のイ ンキュベーション中に放出された⁴⁵Ｃａを決定する。１０分間のインキュベーシ ョンは、単位時間当たりの⁴⁵Ｃａ放出が安定なベースラインに達するまで続ける 。さらに２回の１０分間採取を行い、次にアゴニストを含む試験培地を加え、そ してアゴニスト誘発性の⁴⁵Ｃａ放出を測定する。 上記のアッセイを用いて、候補薬剤が受容体を活性化する能力を直接試験でき る。この場合、本発明のアゴニストはコントロールとして用いられる。さらに、 本発明のアゴニストを組換え受容体の活性化のために用いることにより、この活 性化に対する候補薬剤の効果を直接に試験できる。このアッセイにおいて、受容 体をコードする核酸を発現する組換え細胞は、候補化合物の存在下もしくは不存 在下でインキュベートされる。候補化合物の存在下における活性化の減少は、ア ンタゴニスト効果を意味する。逆に、候補薬剤が本発明のアンタゴニストのアン タゴニスト効果を逆行させる能力を試験することも可能である。 カルシウム移動を測定する代わりに、代替法として受容体活性化の指標として 電位固定法を用いることもできる。アゴニストが誘発する内側方向へのクロライ ドの流れを、電位固定した、Ｃ１４０受容体をコードするｃＲＮＡを発現する卵 母細胞または組換え発現システムからのＤＮＡを発現する細胞で、実質上文献記 載のように(Julius，D.,ら，Science (1988) 241: 558-563)測定するが、但し、 単一電極の電位固定技術を用いる。活性化受容体の検出 一つの態様において、組換えＣ１４０受容体タンパク質が入手可能になったこ とは、受容体の活性化型に免疫特異的な抗体の製造を可能ならしめ、これを活性 化受容体のｉｎ ｖｉｖｏにおける診断的画像形成に用いることができる。これ らの抗体は組換え法で製造した受容体の活性化型に対して、または本明細書に記 載する「新規アミノ末端」ペプチドであるペプチドに対して製造される。得られ た抗体またはその免疫特異性フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ'₂ フラグメントは、次に、公知方法で検出される標識、例えばテクネチウム⁹⁹およ びインジウム¹¹¹を含む放射線標識または他の公知の放射活性標識と結合する。 ｉｎ ｖｉｖｏで注射されると、これらの抗体は活性化受容体の部位にすみかを 見出し、こうして活性化受容体を含む領域をつきとめることが可能である。 他の態様において、体液または培養培地中の活性化ペプチドの存在を検出およ び測定することができる。活性化ペプチドに対する抗体は上記のように製造して 、標準的ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイを用いて、例えば尿中の活性化ペプチ ドの過剰量を検出できる。医薬としてのアゴニストおよびアンタゴニストの投与 アゴニストとして作用する本発明のペプチドは、当該技術分野で公知の全身投 与用の慣用製剤として投与される。そのような製剤の典型的例は、例えば、Remi ngton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.，Easton PA, 最新版 に記載されている。 ペプチドの好ましい全身投与用型は、注射を含み、典型的には静注である。他 の注射経路、例えば皮下、筋肉内、または腹腔内投与もまた使用可能である。 より最近、ペプチドの全身投与の代替法が工夫されており、それらには、胆汁 酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透促進剤を使用する経粘 膜投与および経皮投与が含まれる。さらに、経腸剤またはカプセル剤として適当 に製剤化されるなら、経口投与も可能である。これら化合物の投与は、局所用お よび／または局在用の、膏薬、ペースト、ゲル等の剤形でも可能である。 要求される用量範囲は、選択したペプチド、投与経路、製剤の性質、患者の状 態、および担当医の判断に依存する。しかしながら、適当な用量範囲は、患者の 体重kg当たり、０．１〜１００μg である。しかしながら、種々のペプチドが入 手可能であることおよび種々の投与経路により効果が相違することから、必要量 には幅広い範囲の変化が予期される。例えば、経口投与は静脈注射よりも高用量 を必要とするであろう。そのような用量レベルの変更は、この分野でよく理解さ れているようにして、最適化のための標準的経験ルーチンにより調整される。 下記のように、本発明のアゴニストは抗低血圧剤として作用し、アンタゴニス トはその逆の作用を有する。こうして、血圧の上昇または降下を必要とする患者 は、適当なペプチドの投与により利益を受ける。 以下の実施例は説明のためのもので、発明を限定するためのものではない。 実施例 １ マウスＣ１４０受容体をコードする遺伝子の単離 マウス・コスミッド・ゲノミックライブラリー［Ｒ．Ａ．Ｗｅｔｓｅｌ博士（ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉ ｃｉｎｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ州）から取得且つＲ．Ａ．Ｗｅ ｔｓｅｌ氏等著、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９０）２６５：２４３５−２４ ４０に記載）をウシ物質Ｋ受容体ｃＤＮＡのｂｐ１９０−２４９および７４２− ８０１ｉ各に相当する二種類の³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドでスクリーニングし た（Ｙ．Ｍａｓｕ氏等著、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８３６−８３８） 。ハイブリダイゼーションは５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．１％ＳＤ Ｓ、０．１ｍｇ／ｍｌ精子ＤＮＡ、１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの標識オリゴヌクレオチ ドの条件で一晩放置した後、６０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗う。 単離したクローンの一つ（Ｃ１４０）において、ハイブリダイゼーション領域 は３．７ｋｂ ＰｓｔＩ断片に存在していた。この断片は市販のｐＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔベクター内にサブクローンした。ハイブリダイゼーション領域及び隣接 する領域をサンガーのチェインターミネーター法により両方向から配列決定をし た。図１は、マウスＣ１４０受容体のヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸 配列を示す。仮のシグナル配列（ＳＰ）及び７トランスメンブラン領域の上に線 を付し、アスパラギン−結合糖鎖形成部位と思われる箇所に黒矢印を付し、そし てＡｒｇ３４−Ｓｅｒ３５における推定プロテアーゼ受容体開裂部位に白矢印を 付した。 実施例 ２ ヒトＣ１４０受容体をコードする遺伝子の単離 マウスプロテアーゼＣ−１４０受容体をコードするゲノムＤＮＡが単離された ので、相当するヒト遺伝子の読みだしが可能となった。ベクターＥＭＢＬ３中で クローンしたヒト・ゲノミック・ライブラリーのスクリーニングはマウスクロー ンの全コード領域をプローブとして使用し、実施例１と正確に同じ条件で行った 。ＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を含む回収されたヒト遺伝子を図２に示す。以 後の実験により、ヒトトロンビン受容体遺伝子について報告されたのと同様に、 ヒトＣ１４０遺伝子は第５番目のクロモソーム（５ｑ１２−５ｑ１３）のロング アーム領域に位置していることが判明した。 更に、１．１ｋｂゲノムＤＮＡ断片を、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎ ｃ．（商業的スクリーニングサービス）から入手した。これはヒトＣ１４０タン パク質コード領域の３５０−ヌクレオチドにわたる断片を発生するプライマー対 を用いたＰＣＲにおいて陽性であった。１．１ｋｂ ｂａｍＨ１断片をサブクロ ーンし且つ配列決定することによりプロモーター配列の８００個のヌクレオチド がこの断片に含まれることが判明した。このプロモーターにはＴＡＴＡボックス とＣＡＡＴボックスの両方が欠如しているが、ＧおよびＣに富んでおり、これら の特徴は多くの自家遺伝子のプロモーターに共通する特徴である。ＳＰ１及びＡ Ｐ２に対して特異的な二種類の結合要素を確認した。 実施例 ３ 関連するＧ−タンパク質受容体の比較 図３に示されているように、ヒトプロテアーゼＣ１４０受容体の推定アミノ酸 配列はマウスの配列に非常に（＞９０％）類似していることを示す。 図５は、マウスＣ１４０受容体と関連するＧ−タンパク質受容体ヒトトロンビ ン受容体（Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．Ｃｅｌｌ）双方のアミノ酸配列が一致するこ とを示す。仮のシグナル配列（ＳＰ）、トランスメンブラン領域、及びプロテア ーゼ開裂部位に記しを付けた。 実施例 ４ マウスＣ１４０ ｃＤＮＡの回収 マウスの胃からのｃＤＮＡライブラリーをλ ｇｔ１０中で構築し、Ｃ１０４ ０ゲノムＤＮＡを含むプローブを用いてスクリーニングした。単一フアージクロ ーンを単離し、ＥｃｏＲＩで切断した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ及びｐＳＧ５中 に挿入物をクローン化し、配列決定した。 単離したｃＤＮＡは１６塩基ポリＡ−ストレッチを含む２７３２ヌクレオチド に相当する長さであり、５′ＲＡＣＥは５′末端に対してわずか２７個の塩基の 付加をもたらしたのみであった。見かけのコード領域の５′末端はゲノムＤＮＡ のオープンリーデイングフレームの５′末端と異なっている。ｃＤＮＡの５′末 端は正しいと思われる。Ｃ１４０をコードするマウスｃＤＮＡの完全ヌクレオチ ド配列及び推定アミノ酸配列を図１０に示す。 実施例 ５ Ｃ１４０をコードするヒトｃＤＮＡの回復 ヒトの腸腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを実施例２のゲノミッククローンで示した プライマーを使用してＰＣＲに付し、増幅された断片をｐＳＧ５中にクローン化 し、配列決定をした。ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を図１１に示す。図 １１に示されているようにｃＤＮＡコード化配列とゲノムＤＮＡによりコードさ れたそれとの間に４個のアミノ酸の差異がある。 実施例６ 卵母細胞におけるプロテアーゼＣ１４０受容体の活性化 在来（ｎａｔｉｖｅ）および突然変異Ｃ１４０受容体の両方を卵母細胞中で産 生し、新しいアミノ末端を擬態するペプチドによって、あるいは、蛋白分解酵素 トリプシン（細胞外領域を解裂する）によって活性化した。在来受容体は、ポリ メラーゼ連鎖反応を使用して受容体遺伝子のコード領域を発現ベクターｐＳＧ− ５（Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．らＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ（１９８８）１６： ３６９）にクローニングすることによって産生された。クローニングされたコー ド領域の配向および完全性は、ヌクレオチド配列をサンガ−鎖−末端化法によっ て決定することによって評価された。部位決定突然変異を利用してｐＳＧ−５中 に突然変異受容体を構築した。３つの突然変異受容体をつくり、それらの中のセ リン−３５を各々プロリン、アルギニン、およびヒスチジンに置換した。上記３ つの突然変異受容体のヌクレオチド配列を上述のように評価した。 卵母細胞の表面に受容体を生成するために、該受容体をコードするｃＲＮＡを 以下のように生成した。ｐＳＧ−５Ｃ１４０プラスミドＤＮＡをＸｂａＩによる 消化によって線状につくり、インビトロでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するこ とによってキャップされたｃＲＮＡを生成した（Ｋｒｉｅｇ ａｎｄ Ｍｅｌｔ ｏｎ，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８７）１５５：３９７−４１５）。 ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞を採り、文献の技術 を使用して調製した（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ａ．，ｉｎ Ｈａｍｅｓ、Ｂ．Ｄ．およ びＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．出版のＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒ ａｎｓｌａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐ ｒｅｓｓ，ｐｐ．２７１−３０２；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ａ．らＰｒｏｃ Ｎ ａｔｌ Ａｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ（１９８８）８５：４９３９−４９４３）。 濾胞細胞を除くために、卵母細胞を各々２ｍｇ／ｍｌのコラーゲナーゼ１Ａとヒ アルロニダーゼ１Ｓを含みカルシウムを含まないＢａｒｔｈ中で震盪させつつ１ 時間半インキュベートした。卵母細胞を次いで５回通常のＢａｒｔｈ中で洗い、 １８℃で１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン および２．５ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＢａｒｔｈ中でインキュベート した。段階Ｖの卵母細胞を選択して、３０ｎｌのｃＲＮＡ（０．３３μｇ／μｌ 水）あるいは水のみを注射し、ついで０．２５ｍｌの培地とともに９６穴培養プ レートの４つの穴を１群としてインキュベートした。３６時間後、卵母細胞を⁴⁵ Ｃａ（２５０μＣｉ／ｍｌ）とともにインキュベートした。１２時間インキュベ ート後、卵母細胞を洗い、５分毎に０．２ｍｌの培地を加えて換えた。得られた 培地をシンチレイションカウンターで分析した。５回換えた後、⁴⁵Ｃａの基底放 出量を測定のため、アゴニスト、たとえば、ＳＬＩＧＲＬを添加した被験培地を 加えて誘発⁴⁵Ｃａ放出量を測定した。 卵母細胞に野生型マウスＣ１４０受容体（ＷＴ）あるいは上記３つの突然変異 受容体３５Ｐｒｏ，３５Ａｒｇおよび３５Ｈｉｓのいずれかをコードするキャッ プされたｃＲＮＡ（約１０ｎｇ）を注射した。３６時間後、ｃＲＮＡを注射した 卵母細胞および対照の水を注射した卵母細胞を⁴⁵Ｃａに担持させ、１２時間後、 ペプチドまたはトリプシン−誘導⁴⁵Ｃａ放出量を上記のようにして測定した。ペ プチドＳＬＩＧＲＬを１００μＭ、およびトリプシンを３００ｐＭ加えた。該ペ プチドによる促進はトリプシンによる促進の後と同じ群の卵母細胞で見られた。 表１に示されたデータは３つの複製物測定の平均を示し、水を注射した卵母細胞 に比べての増加を示している。 表１に示すように、アゴニストペプチドＳＬＩＧＲＬは野生型と突然変異の両 方の受容体を活性化できる。一方、細胞外領域の解裂によってのみ活性化できる トリプシンは野生型受容体のみを活性化できるにすぎない。 実施例７ Ｃ１４０受容体の異なるアゴニストペプチドによる活性化 種々のペプチドを１００μＭで上記アッセイにおいて卵母細胞において発現さ れた野生型マウス受容体を使用して試験した。結果を表２に示した。 ”在来”ペプチドＳＬＩＧＲＬは最も有効で、６位のＬをアラニンで置換する と低下して活性をなくせない。２および３位はより感受性が高い。１位はアラニ ンでの置換には耐えるが活性が１０の位低下する。このアンタゴニストの活性は 類似の血栓受容体アンタゴニストＳＦＦＬＲＷに匹敵する。 実施例８ 種々の組織でのＣ１４０受容体の発現 ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをマウス組織から調製し、５０％ホルムアミドを含む１． ２％アガロースゲル上で解像し、ハイボンドＣエキストラ膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ ｅｘｔｒａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（アマーシャム製）上にブロットした。この ブロットを、ネズミＣ１４０受容体の全コード化領域に対して指向された³²Ｐ− 標識”ランダムプライミングプローブ”とハイブリダイズした。該プローブは４ ２℃で４８時間ハイブリダイズされ、続いて２０℃で１ｘＳＳＣで、０．１％Ｓ ＤＳで２回、各々５分づつ洗い、ついで６５℃で再び１ｘＳＳＣで、各々２０分 ２回洗い、ついで０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回各々２０分洗った。得 られた膜を５日間−８０℃で強調遺伝子スクリーンによってオートラジオグラフ した。 図６に示した結果は腎臓および小腸はＣ１４０をコードするｍＲＮＡを含むが 脾臓は含まないことを示している。図６において各レーンは１０μｇのＲＮＡを 含み、レーンＡは脾臓から、レーンＢは腎臓から、レーンＣは小腸から得られた 。 実施例９ マウスにおけるＣ１４０転写産物の発現 ³⁵Ｓ ＲＮＡプローブを用いるインサイチオハイブリダイゼーションを用いて 、マウス胚形成（embryogenesis）および成体マウス組織におけるＣ１４０転写 産物の局在を調べた。第１１．５日に胃腸管に強い信号が観察された；第１４日 に、鼻咽頭、胃腸、皮膚および太い血管（larger vessels）内の内皮細胞中の上 皮構造に対する強いハイブリダイゼーションがあった。肝臓および硬節（sclero toma）においてある程度のハイブリダイゼーションがあったが、筋肉またはＣＮ Ｓには信号がなかった。第１７日に、硬節中の信号は消失し、食道、腎糸球体、 肺、毛嚢および表皮を含む別の上皮構造がハイブリダイゼーションを示した。 新生児においては、第１７日に観察された信号は保持され、胸腺髄質および腎 髄質において追加の信号が観察された。成体は、胃、腸および結腸の粘膜、脾臓 の白色髄、胸腺および腎髄質において転写産物を示した。この場合にもまた、Ｃ ＮＳ、肝臓、肺または副腎には信号がなかった。図１２は、これらのプローブを 用いた新生児マウス切片におけるインサイチオハイブリダイゼーションの結果を 示す。 実施例１０ ヒト組織におけるＣ１４０転写産物の発現 図１３は、ヒトＣ１４０受容体プロープにハイブリダイズしたヒト細胞株から の総ＲＮＡのノーザンブロットの結果を示す。１０ｍｇの総ＲＮＡを用いた。胃 （レーン１）、Ｃａ−Ｃｏ−２細胞（レーン２）；ＨＴ−２９細胞（レーン３） 、Ａ４９８細胞（レーン５）、５６３７細胞（レーン８）；皮膚ケラチノサイト （レーン１２）、およびＨＵＶＥＣ（レーン１３および１４）からのＲＮＡでハ イブリダイゼーションが得られた。ＨｕＴｕ８０細胞、Ｊ８２細胞、ＭＣＦ−７ 、ＨｅＬａまたはＮＣＩ１２細胞（レーン４、６、９および１０）については、 ハイブリダイゼーションは検出されなかった。 実施例１１ Ｃ１４０アゴニストの降圧活性の検出 緩衝液０．２ｍｌ中の種々の濃度のＣ１４０アゴニストＳＬＩＧＲＬをラット 大腿静脈に注入し、動脈血圧をモニターした。種々の濃度の結果を図７に示す。 図７のトレースは、０．１ｍＭにおいてさえも血圧の明らかな降下が起こり、 １ｍＭの濃度においてより大きな降下が観察されたことを示す。 この効果はまた、上述のアゴニストによるラット大腿静脈の刺激の結果、血管 拡張が観察されたことによっても示された。成体スプラグドーリーラットを、ジ エチルエーテル麻酔中に放血により殺し、大腿静脈を切除し、脂肪および結合組 織を除去した。静脈の環状調製物を、臓器浴（５ｍｌ）中で、２つのＬ字型金属 ホルダー（直系０．２ｍｍ）上に固定した。金属ホルダーの１つを、Ｇｒａｓｓ ＦＴＯ Ｃ 力変位変換器のレバーの１つにねじ込んだ。浴液は、１１８ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．２ｍＭ Ｍｇ ＳＯ₄、２４．８ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、１．２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄および５．６ｍＭ グルコースを含むクレブ・リンゲル（Ｋｒｅｂ’ｓ Ｒｉｎｇｅｒ）溶液であ った。８８．５％酸素−１１．５％ＣＯ₂で浴液を連続的に処理し、温度を３７ ℃に保持した。内皮は、血管を通してＣＯ₂をバブリングすることにより除去し た。基底張力は７．５と１２ｍＮの間であった。調製物を少なくとも１時間平衡 化した後、アゴニストおよび対照物質を適用した。 これらの測定の結果を図８ａおよびｂに示す。図８ａに示されるように、ＰＧ Ｆ_2αを３×１０^-5Ｍで適用することにより誘発された収縮は、１０^-5Ｍのアゴ ニストを投与することにより弛緩した。図８ａの結果は、内皮がまだ存在してい る静脈を用いて得たものである。 図８ｂにおいては、内皮は除去されている。類似の実験において、３×１０^-5 ＭのＰＧＦ_2αにより誘発された収縮は、１０^-5Ｍのアゴニストまたは１０^-5Ｍ のアセチルコリンによって中和されない。 実施例８ プラスミンおよびカリクレインによる組換えＣ１４０受容体の活性化 図９ａおよびｂは、それぞれプラスミンおよびカリクレインが、Ｃ１４０ ｃ ＲＮＡ（○）または対照としての水（×）を注入した卵母細胞を活性化する能力 を示す。図９ｃは、トリプシンが、Ｃ１４０受容体ｃＲＮＡ（●）またはサブス タンスＫ受容体ｃＲＮＡ（○）を注入したカエル卵母細胞を活性化する能力を示 す。トリプシンは明らかにＣ１４０受容体注入卵母細胞に対して異なる効果を有 する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/28 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/10 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組換え宿主中に形質転換したときに宿主の細胞表面にＣ１４０受容体を産生 することのできる発現系からなるＤＮＡ分子であって、該発現系は、Ｃ１４０受 容体をコードするヌクレオチドと異種でありかつ該宿主細胞内で機能しうる制御 配列と機能的に結合されたＣ１４０受容体をコードするヌクレオチド配列を含む 、上記ＤＮＡ分子。 ２．請求項１記載の発現系を含むように修飾された細胞。 ３．細胞表面に配置されたＣ１４０受容体を含む細胞を産生する方法であって、 該方法は、Ｃ１４０受容体をコードするヌクレオチドの発現をもたらす条件下に 請求項２記載の細胞を培養して細胞表面に配置されたＣ１４０受容体を含む細胞 を得ることからなる、上記方法。 ４．Ｃ１４０受容体をコードするｃＲＮＡ分子。 ５．請求項４記載のｃＲＮＡを含むように修飾された卵母細胞である細胞。 ６．細胞表面に配置されたＣ１４０受容体を含む卵母細胞である細胞を産生する 方法であって、該方法は、Ｃ１４０受容体をコードするｃＲＮＡの発現をもたら す条件下に請求項５記載の卵母細胞を培養して細胞表面に配置されたＣ１４０受 容体を含む細胞を得ることからなる、上記方法。 ７．候補となる物質のＣ１４０アゴニスト活性を決定する方法であって、該方法 は以下の工程： 該物質の存在下および不在下に請求項３または６記載の細胞をインキュベート し、そして 該物質の不在下の場合と比較した存在下の場合のＣ１４０受容体の存在、不在 またはその活性化量を検出し、これによって該物質の不在下の場合と比較した存 在下の場合の活性化の増加が該物質のアゴニスト活性を示す、 からなる、上記方法。 ８．候補となる物質のＣ１４０アンタゴニストとして挙動する能力を評価する方 法であって、該方法は以下の工程： Ｃ１４０アゴニストの存在下に、そして該候補の存在下および不在下に請求項 ３または６記載の細胞をインキュベートし、そして 該候補の存在下および不在下におけるＣ１４０受容体の活性化を測定し、これ によって該候補の存在下における活性化の減少が該候補のアンタゴニスト活性を 示す、 からなる、上記方法。 ９．候補となる物質のＣ１４０受容体と結合する能力を評価する方法であって、 該方法は以下の工程： Ｃ１４０アゴニストまたは公知のＣ１４０アンタゴニストの存在下に、そして 該候補の存在下および不在下に請求項３または６記載の細胞をインキュベートし 、そして 該候補の存在下および不在下におけるＣ１４０アゴニストまたはＣ１４０アン タゴニストと細胞表面との結合を測定し、これによって該候補の存在下における 結合の減少が該候補の受容体との結合能力を示す、 からなる、上記方法。 １０．Ｃ１４０受容体タンパク質またはその一部の細胞外領域と特異的に免疫反 応する抗体組成物。 １１．該領域がリガンド結合領域であるか、あるいは 活性化Ｃ１４０受容体と特異的に免疫反応するか、あるいは 受容体配列ＳＬＩＧＲＬ中のエピトープを認識するか、あるいは Ｃ１４０受容体の開裂した活性化ペプチドと特異的に反応性である、 請求項１０記載の抗体組成物。 １２．活性化Ｃ１４０受容体をインサイチュで局在化する方法であって、該方法 は以下の工程： 活性化Ｃ１４０受容体をもつと推定される被験者に、活性化受容体と結合する のに有効な量の活性化受容体に特異的な抗体を投与し、そして 該抗体の局在化を検出する、 からなる、上記方法。 １３．哺乳動物被験者中の活性化Ｃ１４０受容体の存在を検出する方法であって 、該方法は以下の工程： 被験者の生物学的液体試料を、Ｃ１４０受容体の開裂した活性化ペプチドの存 在、不在またはその量を測定する検出系と接触させ、そして 該開裂したペプチドの存在、不在またはその量を検出する、 からなる、上記方法。 １４．以下の式を有するＣ１４０受容体を活性化できるアゴニストペプチド： ＡＡ₁−ＡＡ₂−ＡＡ₃−ＡＡ₄−ＡＡ₅−ＡＡ₆−ＡＡ₇−Ｚ （１） （式中、 ＡＡ₁は小さいアミノ酸またはスレオニンであり； ＡＡ₂およびＡＡ₃はそれぞれ独立に中性／非極性／大きい／非芳香族アミノ酸 であり； ＡＡ₄は小さいアミノ酸であり； ＡＡ₅は塩基性アミノ酸であり； ＡＡ₆は存在しても存在しなくてもよく、存在する場合には、中性／非極性／ 大きい／非芳香族アミノ酸であり； ＡＡ₇は、もしもＡＡ₆が存在しない場合には存在せず、もしもＡＡ₆が存在す る場合には存在しても存在しなくてもよく、酸性アミノ酸であり；そして Ｚはアゴニスト活性を妨害しない置換基である）。 １５．ＡＡ₁がＳｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒまたは２，３−ジアミノプロピ オン酸（２，３−ｄｉａＰ）であり；および／または ＡＡ₂およびＡＡ₃のそれぞれが独立にＩｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＣｈａか らなる群より選択され；および／または ＡＡ₄がＧｌｙであり；および／または ＡＡ₅がＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨａｒであり；および／または ＺがＯＲ’またはＮＲ’Ｒ’であり、ここで各Ｒ’は独立にＨであるか、ある いは１−６Ｃの直鎖または分枝鎖アルキルであり、ここで各Ｒ’は−ＯＲ’、− ＮＲ’Ｒ’および−ＮＲ’ＣＮＲ’ＮＲ’Ｒ’（ここで各Ｒ’はＨであるか、あ るいは１−６Ｃの直鎖または分枝鎖アルキルである）からなる群より選択される １以上の置換基で任意に置換されていてもよい、 請求項１４記載のペプチド。 １６．ＡＡ₁−ＡＡ₂−ＡＡ₃がＳＬＩ、ＳＬＬ、ＳＣｈａＩ、ＳＣｈａＬ、（２ ，３−ｄｉａＰ）ＬＩおよび（２，３−ｄｉａＰ）ＬＬからなる群より選択され ；および／または Ｚが１〜５個のアミノ酸からなる付加的ペプチド配列を含む、 請求項１５記載のペプチド。 １７．ＳＬＩＧＲＬＥＴＱＰＰＩＴ、ＳＬＩＧＲＬＥＴＱＰＰＩ、ＳＬＩＧＲＬ ＥＴＱＰＰ、ＳＬＩＧＲＬＥＴＱＰ、ＳＬＩＧＲＬＥＴＱ、ＳＬＩＧＲＬＥＴ、 ＳＬＩＧＲＬＥ、ＳＬＩＧＲＬ、ＳＬＩＧＲ、ＳＬＬＧＫＶＤＧＴＳＨＶＴ、Ｓ ＬＬＧＫＶＤＧＴＳＨＶ、ＳＬＬＧＫＶＤＧＴＳＨ、ＳＬＬＧＫＶＤＧＴＳ、Ｓ ＬＬＧＫＶＤＧＴ、ＳＬＬＧＫＶＤＧ、ＳＬＬＧＫＶＤ、ＳＬＬＧＫＶ、ＳＬＬ ＧＫ、Ｓ（Ｃｈａ）ＩＧＲ、Ｓ（Ｃｈａ）ＬＧＫ、（２，３−ｄｉａＰ）−ＬＩ ＧＲ、（２，３−ｄｉａＰ）−ＬＬＧＫ、ＳＬＬＧＫＲ−ＮＨ₂、ＳＬＩＧＲＲ −ＮＨ₂、Ｓ（Ｃｈａ）ＬＧＫＫ−ＮＨ₂、Ｓ（Ｃｈａ）ＩＧＲＫ−ＮＨ₂、（２ ，３−ｄｉａＰ）−ＬＩＧＲＫ−ＮＨ₂、および（２，３−ｄｉａＰ）−ＬＩＧ ＫＫ−ＮＨ₂からなる群より選択される請求項１４記載のペプチド。 １８．以下の式を有するＣ１４０受容体の機能を阻害できるペプチド： Ｘ−ＡＡ₂−ＡＡ₃−ＡＡ₄−ＡＡ₅−ＡＡ₆−ＡＡ₇−Ｚ （式中、 ＸはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、２，３−ｄｉａＰまたはＧｌｙ以外の アミノ酸残基であるか、あるいはデスアミノまたはアシル化アミノ酸であり； ＡＡ₂およびＡＡ₃はそれぞれ独立に中性／非極性／大きい／非芳香族アミノ酸 であり； ＡＡ₄は小さいアミノ酸であり； ＡＡ₅は塩基性アミノ酸であり； ＡＡ₆は存在しても存在しなくてもよく、存在する場合には、中性／非極性／ 大きい／非芳香族アミノ酸であり； ＡＡ₇は、もしもＡＡ₆が存在しない場合には存在せず、もしもＡＡ₆が存在す る場合には存在しても存在しなくてもよく、酸性アミノ酸であり；そして Ｚはアゴニスト活性を妨害しない置換基である）。 １９．ＸがＭｖｌ、Ｍｐｒ、ＭｂａまたはＳＭｅＭｐｒであり、および／または ＡＡ₂およびＡＡ₃のそれぞれが独立にＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎｖ ａ、シクロペンチルアラニンおよびＣｈａからなる群より選択され；および／ま たは ＡＡ₄がＧｌｙであり；および／または ＡＡ₅がＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＨａｒであり；および／または ＺがＯＨまたはそのエステルまたは塩であるか、あるいはＮＲ’Ｒ’であり、 ここで各Ｒ’は独立にＨであるか、あるいは１−６Ｃの直鎖または分枝鎖アルキ ルであり、ここで各Ｒ’は−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’および−ＮＲ’ＣＮＲ’ＮＲ ’Ｒ’（ここで各Ｒ’はＨであるか、あるいは１−６Ｃの直鎖または分枝鎖アル キルである）からなる群より選択される１以上の置換基で任意に置換されていて もよい、 請求項１８記載のペプチド。 ２０．ＡＡ₂−ＡＡ₃がＬＩ、ＬＬ、ＣｈａＩおよびＣｈａＬからなる群より選択 され；および／または Ｚが１〜５個のアミノ酸残基からなるペプチド伸長を含む、 請求項１９記載のペプチド。 ２１．Ｍｐｒ−ＬＬＧＫ、Ｍｐｒ−ＬＩＧＲ、Ｍｐｒ−（Ｃｈａ）ＬＫＧ、Ｍｐ ｒ−（Ｃｈａ）ＩＧＲ、Ｍｐｒ−ＬＬＧＫＫ−ＮＨ₂、Ｍｐｒ−ＬＩＧＲＫ−Ｎ Ｈ₂、Ｍｐｒ−ＬＩＧＲＫＥＴＱＰ−ＮＨ₂、Ｍｐｒ−ＬＬＧＫＫＤＧＴＳ−ＮＨ₂ 、（ｎ−ペンチル）₂−Ｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂ および（Ｍｅ−Ｎ−（ｎ−ペンチル）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙ ｓ−ＮＨ₂およびそのアミド化またはアセチル化した形からなる群より選択され る請求項１８記載のペプチド。