KR19980701637A - 재조합 ｃ１４０ 리셉터, 그것의 아고니스트 및 길항제, 그리고 리셉터를 코드화하는 핵산 - Google Patents

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KR19980701637A
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KR1019970705031A
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조한 선델린
로버트 엠 스카보로
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찰스 홈시
씨오알 데라퓨틱스 인코퍼레이티드
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Abstract

C140 세포 표면 리셉터를 코드화하는 핵산분자가 클로닝되고 시퀀싱되었다. C140 리셉터의 유용성은 난모세포를 포함하는 세포의 표면에서 생산될 수 있는 C140 리셉터의 재조합 생산을 허용한다. 핵산분자는 리셉터 아고니스트나 아니면 길항제, C140 리셉터 활성에 영향을 미치는 물질의 검출을 위한 분석에서 유용하다. 또한, C140 리셉터의 구조의 해명은 이러한 분석에서 유용한 아고니스트 및 길항제 화합물의 설계를 허용한다. C140 리셉터의 유용성은 또한 리셉터의 하나 이상의 항원성 에피토프와 특이적으로 면역반응성인 항체의 생산을 허용한다.

Description

재조합 Ｃ１４０ 리셉터, 그것의 아고니스트 및 길항제, 그리고 리셉터를 코드화하는 핵산
대부분의 치료학적 및 예방학적 약제에 대한 동물의 반응은 세포표면에 있는 리셉터를 통하여 매개된다. 그러한 리셉터의 한가지 부류는 G-단백질-결합된 리셉터로 이루어지며, 그것의 생리학적 효과는 서브유니트의 후속 방출과 함께 이러한 유형의 리셉터에 결합되어 추가의 세포외 추이를 움직이는 G-단백질이라고 하는 세개의 서브유니트 단백질 복합체에 의해 매개된다.
이 세부부류의 리셉터는 그중에서도 아드레날린 작용성 리셉터, 뉴로펩티드 리셉터, 트롬빈 리셉터 및 본 발명의 목적인 C140 리셉터를 포함한다. 이 부류의 리셉터는 세포표면내에 리셉터를 고정시킨 일곱개의 트랜스멤브레인 부위의 존재를 특징으로 한다.
부작용의 부재하에 환자에게 원하는 반응을 실행하기 위한 치료학적 물질은 연구자에게는 어려운 목표이다. 따라서, 트롬빈 리셉터와 같이, 특이적인 리셉터를 표적하도록 설계된 약제는 트롬빈 리셉터와 특이적으로 반응해야하며 관련 리셉터에 영향을 미치지 않아야 한다. 본 발명의 C140 리셉터는 혈압은 조절하는데 개입될 수 있으며, 이 리셉터의 우연한 자극 또는 차단은 예측 불가능하며 따라서 원치않는 결과가 얻어진다. 그러므로 이것은 예를들면 트롬빈 리셉터를 표적하도록 설계된 치료학적 약제가 C140 리셉터와의 반응에 원치않는 부작용이 있는지 없는지를 미리 결정하는데 유용하다. 용이한 분석 시스템에서 C140 리셉터의 생성을 위한 재조합 물질 뿐만아니라 이 분석에서 사용하기 위한 아고니스트와 길항제를 제공함으로써, 본 발명은 후보약제중에서 C140 리셉터와의 반응에 대한 부작용의 유무를 미리 결정하는 것이 가능하게 된다. 이 부작용은 보통, C140 리셉터가 종양 및 면역 저해와 관련된 세린 프로테아제와 같은 효소에 반응한다고 믿어지기 때문에 바람직하지 않다.
본 발명은 G-단백질 결합된 리셉터 상과(上科)의 구성원인 새로 발견된 리셉터에 관한 것이다. 리셉터는 혈관내 내피세포에서 발현된다. 이 리셉터에 대한 영향의 회피는 이러한 과의 다른 리셉터를 자극하기 위해 투여되는 약제의 부작용을 제한함에 있어서 필수 요소이다. 본 발명은 또한 리셉터 단백질 또는 펩티드를 코드화하는 핵산 서열에도 관련된다.
도 1a-1b는 쥐과 동물 C140 리셉터의 DNA 그리고 유도된 아미노산 서열을 보여준다.
도 2a-2b는 인간 C140 리셉터의 DNA 그리고 유도된 아미노산 서열을 보여준다.
도 3는 인간 C140 리셉터 및 쥐과 동물 C140 리셉터의 아미노산 서열의 비교를 보여준다.
도 4는 유도된 아미노산 서열에 기한 C140 리셉터 활성의 제안된 모델을 보여준다.
도 5는 마우스 C140 리셉터 및 인간 트롬빈 리셉터의 아미노산 서열의 비교를 보여준다.
도 6는 다양한 마우스 조직내의 C140 리셉터를 코드화하는 mRNA의 존재를 검출하는 노던 블로트(Northern Blot)의 결과를 보여준다.
도 7는 C140 아고니스트(agonist) 펩티드의 생체내 저혈압 효과를 설명해 주는 혈압의 자취를 보여준다.
도 8a-8b는 C140 리셉터 아고니스트 펩티드에 의해 유도된 래트(rat) 대퇴정맥에서의 혈압 팽창을 보여준다.
도 8a는 고정화된 정맥에서의 이들 결과를 보여주고;
도 8b는 내비세포가 고갈된 고정화된 정맥에 대한 이들 결과를 보여준다.
도 9a-9c는 플라스민, 칼리크레인 또는 트립신에 의해 개구리 난모세포에서 발현되는 C140 리셉터의 활성화에 대한 분석의 결과를 보여주고;
도 9a는 플라스민에 의한 결과를 보여주고;
도 9b는 칼리크레인에 의한 결과를 보여주고;
도 9c는 트립신에 의한 결과를 보여준다.
도 10a-10b는 쥐과 동물 C140 리셉터를 코드화하는 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 그리고 유도된 아미노산 서열을 보여준다.
도 11a-11b는 인간 C140 리셉터를 코드화하는 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 그리고 유도된 아미노산 서열을 보여준다.
도 12는 마우스 C140 리셉터를 갖는 절개된 신생 마우스의 원위치(in situ) 혼성화의 결과를 보여준다.
도 13는 인간 C140 리셉터 프로브에 혼성화된 인간세포로 부터의 전체 RNA의 노던 블로트를 보여준다.
(발명의 개시)
본 발명은 분석 시스템내에서 바람직하지 않은 부작용을 주는 후보약제의 효능을 결정하는데 유용한 방법과 물질을 제공한다. C140 리셉터의 단리, 재조합 생성 및 특성은 기질로서 리셉터를 사용하고 분석내 컨트롤 시약으로서 리셉터에 대한 아고니스트와 길항제를 사용하는 분석시스템의 설계를 허용한다.
따라서, 한가지 양태에서, 본 발명은 C140 리셉터의 생성과 관련된 재조합물질에 관한 것이다. 예를들면, 이들은 표면에 C140 리셉터를 나타낼 수 있도록 배양될 수 있는 트랜스펙트된 세포를 포함하며, 따라서 천연 C140 리셉터와의 물질의 상호작용을 위한 분석시스템을 제공한다. 일반적으로, 이들 분석시스템에 유용한 숙주세포에 대한 제한 점은 세포가 그 표면위에 리셉터를 나타내고 세포내 반응에 대한 매개인자로서 G-단백질을 함유하는 적당한 메카니즘을 가져야한다는 것이다(그러나 단지 결합을 평가하는 분석은 G-단백질이 필요하지 않다). 대부분의 동물 세포는 이들 조건을 충족시킨다.
다른 양태에서, 본 발명은 리셉터 단백질의 세포외 부분의 활성화 형태를 모사하는 C140 리셉터 아고니스트에 관련된다. 이들 아고니스트는 분석 시스템의 작업성을 입증하기 위한 상술된 분석에서 컨트롤 시약으로서 유용하다. 또한, C140 리셉터에 대한 아고니스트는 생체내 혈압강하 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 아고니스트로 그 자체로 항고혈압제로서 유용할 수 있다.
더 다른 양태에서, 본 발명은 C140 리셉터 길항제에 관한 것이다. 이들 길항제는 리셉터의 활성화에 필요한 필수 양태가 결핍된 C140 리셉터 아고니스트 펩티드의 변형된 형태를 포함한다. 리셉터와의 이들 길항제 결합은 그것을 활성화시키지 않으며 아고니스트와 천연 리셉터- 결합 리간드에 의한 리셉터 활성화를 방지한다.
길항제의 두번째 군은 리셉터 단백질의 특이적인 부분과 결합하도록 설계된 항체를 포함한다. 일반적으로, 이들은 C140 리셉터의 어떤 원하는 부위에 대해 고도로 특이적인 모노클론 항체 제제이다. 본 발명의 항체도 리셉터 단백질에 대한 면역분석, 예를들면, 재조합 시스템내 유전자의 성공적인 발현을 평가하는데 유용하다.
본 발명의 또다른 관점은 이러한 C140 리셉터 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 제공하는 것이고, 지혈 또는 면역반응 조정에 진단용도 또는 잠재적인 치료학적 사용을 위해 재조합 세포 배양물에서 폴리펩티드를 생산하기 위해 이 핵산을 사용하는 것이다.
여전히 다른 관점에서, 본 발명은 표지되거나 비표지된 C140 리셉터를 코드화하는 분리된 핵산분자와 C140 리셉터를 코드화하는 핵산 서열에 상보적이거나 또는 긴축조건 하에서 거기에 혼성화하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명의 분리된 핵산분자는 아드레날린 리셉터, 뉴로펩티드 리셉터, 트롬빈 리셉터 등과 같은 C140 리셉터가 아닌 다른 공지의 G 단백질 결합된 리셉터를 코드화하는 핵산 서열을 코드화하거나 그 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 제외한다.
게다가, 본 발명은 벡터에 의해 형질전환된 숙주에 의해 인식된 조절 서열에 작동가능하게 연결된 C140 리셉터를 코드화하는 핵산분자로 이루어지는 복제 가능 벡터, 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포, 그리고 형질전환된 숙주세포의 배양물에서 핵산분자를 발현시키고 숙주세포 배양물로부터 C140 리셉터를 회수하는 것으로 이루어지는 C140 리셉터의 생산을 실행하기 위한 C140 리셉터를 코드화하는 핵산분자의 사용방법을 제공한다. 핵산 서열은 또한 C140 리셉터 코드화 핵산분자에 대한 혼성화 분석에 또한 유용하다.
여전히 더 이상의 구체예에서, 본 발명은 전사에 영향을 주도록 C140 리셉터 코드화 서열에 충분히 근접 및 배향하여 전사조절 요소를 C140 리셉터를 코드화하는 핵산 서열을 함유하는 세포의 DNA에 삽입하는 것으로 이루어지며, 선택적인 더 이상의 단계는 전사조절 요소와 C140 리셉터-코드화 핵산 서열을 함유하는 세포를 배양하는 것으로 이루어지는 C140 리셉터의 제조방법을 제공한다.
여전히 더 이상의 구체예에서, 본 발명은 C140 리셉터를 코드화하는 핵산 서열과 전사에 영향을 미치도록 상기 코드화 서열에 충분히 근접 및 배향하여 외인성 전사 조절요소로 이루어지는 세포; 그리고 숙주세포에 의해 인식된 외인성 조절 서열에 작동가능하게 연결된 C140 리셉터를 코드화하는 핵산 서열을 함유하는 숙주세포를 제공한다.
그리고 또한 (a) 핵산분자를 함유하는 세포를 제공하는 단계;
(b) 전사조절 요소를 세포에 도입하는 단계; 그리고
(c) 핵산분자의 전사를 증가 또는 감소시키는 세포에 대한 세포를 스크리닝하는 단계로 이루어지는,
C140 리셉터를 코드화하는 핵산분자의 증가 또는 감소된 전사를 갖는 세포를 얻는 방법을 제공한다.
또다른 관점에서, 본 발명은 후보약제의 아고니스트와 길항제 활성에 대해 스크리닝하기 위해 재조합 C140 리셉터를 이용하는 분석 시스템에 관한 것이다. 이 분석은 이들 치료약제가 C140 리셉터의 활성화 또는 억제로 말미암는 원하지 않는 부작용을 갖지 않음을 보장하는데 특히 유용하다. 어떤 경우에는 이 리셉터 시스템에서 아고니스트 활성은 치료학적 이용을 가질 수도 있다. 이들 분석 시스템의 어떤 것은 양의 대조표준으로서 아고니스트 펩티드의 사용을 포함한다. 분석은 또한 아고니스트 효과를 저해하는 길항제를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 관점은 혈액 또는 소변 같은 체액에서 리셉터가 활성화될 때 C140 리셉터로부터 절단된 펩티드의 검출에 의한 C140 리셉터의 활성화를 특징으로 하는 상태의 진단에 관한 것이다. 본 발명에 속하는 또다른 진단방법은 활성화된 리셉터에 특이적인 항체를 사용하여 활성화된 리셉터에 영상화제를 국소화시킴으로써 리셉터의 활성화된 형태를 시각화시키는 것이다.
본 발명의 여전히 또다른 관점은 C140 리셉터를 코드화하는 DNA 또는 RNA 분자의 전사 또는 번역을 방해함으로써 C140 리셉터의 발현을 차단 또는 조절하는 여러 가지 기술의 치료, 예방 및 연구 용도에 관한 것이다. 이것은 C140 리셉터의 발현을 저해 또는 조절하기에 충분한 양으로 C140 리셉터 코드화 DNA와 또는 C140 리셉터 코드화 DNA의 DNA 조절발현과 안티센스이거나 또는 삼중나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드 분자를 세포에 제공하여, 이로써 세포에서 C140 리셉터의 발현을 저해 또는 조절하는 것으로 이루어지는, 세포에서 C140 리셉터의 발현을 저해 또는 조절하는 방법을 포함한다. 또한 환자에서 C140 리셉터의 발현을 저해 또는 조절하기에 충분한 양으로 C140 리셉터 코드화 DNA와 또는 C140 리셉터 코드화 DNA의 DNA 조절발현과 안티센스이거나 또는 삼중나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드 분자를 환자에 투여하여, 이로써 환자에서 C140 리셉터의 발현을 저해 또는 조절하는 것으로 이루어지는, 환자에서 C140 리셉터의 발현을 저해 또는 조절하는 방법을 포함한다. 상기 방법에서 안티센스분자 또는 삼중나선 형성분자는 바람직하게는 DNA 또는 RNA 올리고 뉴클레오티드이다.
본 발명의 추가의 관점은 본 발명의 아고니스트와 길항제를 함유하는 약제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 아고니스트는 항저혈압제이고; 거꾸로 길항제는 원한다면 혈압을 상승시킬 수 있다. 본 발명의 다른 관점은 전사 또는 번역의 수준에서 세포에서 또는 환자에서 C140 리셉터 발현을 저해 또는 조절하기 위해 유용한 약제조성물을 포함하는데, 이 조성물은 C140 리셉터 코드화 핵산의 서열의 일부에 해당하는 상기한 바와 같은 안티센스 또는 삼중나선형성 분자로 이루어진다.
(발명을 실행하는 방법)
여기서의 본 발명에 의해 밝혀진 C140 리셉터의 특성은 도 1a-1b-도 4에 요약된다. 도 1a-1b는 쥐과 동물 리셉터를 코드화하는 클론의 완전한 DNA 서열과 함께 유도된 아미노산 서열을 보여준다. 여기서 사용되어진 바와같은, C140 리셉터는 여기 실시예 1에 기재되어 있는 클론 C140에 함유된 쥐과 동물 리셉터에 상응하는 어떤 동물 종에 있는 리셉터를 칭한다. 이 리셉터의 쥐과 동물형을 코드화하는 고유 DNA를 사용하여, 여기서 설명되어진 바와같이 인간을 포함한 다른 종에 존재하는 상응 리셉터를 얻을 수도 있다. 도 2a-2b는 인간 리셉터의 상응 DNA 그리고 유도된 아미노산 서열을 보여준다. 쥐과 동물 리셉터의 전체 아미노산 서열은 27 아미노산 신호 펩티드를 포함하여 395개 아미노산을 함유하는데, 신호 펩티드가 절단되면, 368 아미노산의 성숙한 리셉터 단백질을 결과로 얻는다. 유사하게, 도 2a-2b에 보여지는 바와같이 인간 리셉터는 아마도 29 아미노산 신호 펩티드 서열을 포함한 398 아미노산에 상응하는 개방형 리딩 프레임(open reading frame)에 의해 코드화되며, 그 결과로서 369 아미노산의 성숙한 리셉터 단백질을 얻는다.
도 3는 인간 및 쥐과 동물 아미노산의 비교를 보여준다; 보여지는 바와같이, 이들 서열은 고도의 상동성을 나타낸다.
도 1a-1b 및 도 2a-2b에 보여지는 본 서열의 소수성/친수성 도시는 성숙한 C140 리셉터는 7-트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인 리셉터 패밀리의 구성원이며, 세포에 대한 이것의 효과는 G-단백질에 의해 조정된다. 성숙한 C140 리셉터는 아스파라긴- 연결 글리코실화를 위한 여러 컨센서스(consensus) 부위를 함유하는 비교적 긴 세포외 아미노산 연결체를 갖는다. 또한 그것은 첫번째 트랜스멤브레인 영역에 보존된 아스파라긴, 두 번째 트랜스멤브레인 영역에 Leu-Ala-X-X-Asp 모티프, 네 번째 트랜스멤브레인 영역에 Trp 그리고 다수의 세린 및 트레오닌 잔기를 함유하는 카르복시 말단부를 함유한다. 원위치 리셉터의 제안된 모델은 도 4에 보여진다. 도 5에 따르면, 트롬빈 리셉터에 대한 유사성이 쉽게 보여진다. 도 5는 쥐과 동물 C140의 아미노산 서열과 트롬빈 리셉터의 아미노산 서열을 비교한다. 트롬빈 리셉터는 위치 41 및 42의 Arg-Ser 결합의 단백질 분해적 절단에 의해 활성화되는데, 이 절단은 활성화 펩티드를 방출하여 리셉터의 재접힘 그리고 새롭게 만들어진 아미노 말단에 의한 활성화를 가능케 한다. 유사한 방법으로, C140 리셉터는 위치 34 및 35의 Arg-Ser 결합의 절단에 의해 활성화되며, 또한 추정상의 성숙한 단백질의 위치 1으로 부터 절단부위까지 뻗어 있는 활성화 펩티드을 방출한다. Arg-28이 성숙한 단백질의 아미노 말단 아미노산 잔기라고 믿어지며, 따라서 활성화 펩티드는 서열 RNNSKGR 을 갖는다. 따라서, 이 펩티드는 C140 리셉터의 활성화에 대한 지표로서 사용될 수 있다. 어떤 경우에도, 성숙한 단백질의 N-말단의 정확한 위치는 아고니스트 또는 길항제의 고안에 중요하지 않다. 활성화 펩티드는 신장에 의해 자유롭게 여과될것 같고 아마도 소변에 농축될것 같고 C140 리셉터의 활성화에 대한 지표로서 사용될 수 있다.
활성화 펩티드의 방출은 리셉터 단백질의 재접힘(refolding)이 리셉터를 활성화하도록 허용한다. 이것은 도 4에서 개략적으로 도시되고, 도 4는 또한 구조적 변화가 활성화 펩티드의 유리에 의해 초래되고, 재접힘은 리셉터의 세포내 구조적 변화를 초래한다는 것을 보여준다. 이 가설은 C140 리셉터가 활성화에 의해 생성된 새로운 아미노 말단을 의태(mimicking)한 펩티드에 의해 활성화될 수 있다는 것을 발견함으로써 확인된다. 따라서 활성 리셉터상의 새로운 아미노 말단의 N-말단의 의태는 그것에 대한 아고니스트로서 작용한다. 리셉터 활성화를 위한 리셉터의 새롭게 생성된 아미노 말단의 처음 5개 아미노산의 중요성도 또한 하기에 의해 확인된다.
이 정보에 기초하고, 트립신으로의 트립시노겐 활성화 및 트롬빈 리셉터의 활성화의 기초를 이루는 메카니즘과의 상동성에 의해 리간드가 리셉터를 절단했을때 새롭게 노출되는 세린상의 양전하를 띤 아미노기는 리셉터 활성화에서 중요한 역할을 수행한다는 것이 나타난다. C140 리셉터에 결합하는 아고니스트 펩티드 서열에 기초하나, 유리 α-아미노기를 결여하도록 변형된 펩티드는 이 리셉터의 길항제로서 기능할 수 있다. 그래서 특이적 활성화 상호작용을 위한 능력을 결여한 아고니스트 펩티드의 변형은 C140 리셉터 길항제로서 작용한다.
보통, 여기서 특허청구된 C140 리셉터와 그것의 유사체는 보통(common) C140 리셉터 서열(도 1a-1b 또는 도 2a-2b에 개시된 것과 같은것)과 적어도 75% 아미노산 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다.
보통 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 여기서 필요하다면 최대 퍼센트 상동성을 달성하기 위해 서열을 정렬 및 갭을 도입한 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 어떤 종래의 치환을 고려하지 않고 공지의 C140 리셉터와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. C140 리셉터 서열에 N-말단, C-말단 또는 내부연장, 결실 또는 삽입의 어떤 것도 상동성에 영향을 미치는 것으로는 생각되지 않을 것이다.
따라서, 본 발명의 주제인 특허청구된 C140 리셉터 및 유사체 분자는 C140 리셉터 아미노산 서열을 갖는 분자; 보통 C140 리셉터 서열로부터 적어도 10, 15, 20, 25, 30 또는 40 아미노산 잔기의 연속 서열을 갖는 단편; C140 리셉터 서열 또는 상기한 바와 같은 그것의 단편에 또는 안에 아미노산 잔기가 N- 또는 C-말단 삽입된 보통 C140 리셉터 서열의 아미노산 서열 변이체; 또다른 잔기에 의해 치환된 보통 C140 리셉터 서열 또는 상기한 바와 같은 그것의 단편의 아미노산 서열 변이체를 포함한다. C140 리셉터 폴리펩티드는 예를들어서 상동성 재조합, 부위 지정 또는 PCR 돌연변이에 의한 지정된 돌연변이와 토끼, 래트, 쥐, 돼지, 소, 양, 말 및 사람 아닌 영장류 종을 포함하나 이들에 제한되지 않는 다른 동물 종의 C140 리셉터 폴리펩티드를 함유하는 것들 그리고 전술한 종과 사람 서열의 C140 리셉터의 대립 유전자 또는 다른 자연발생 변이체; C140 리셉터 또는 그것의 단편이 자연발생 아미노산 이외의 부분(예를들면 효소 또는 방사성 동위원소와 같은 검출가능부분)으로 치환, 화학적, 효소학적, 또는 다른 적당한 수단에 의해 공유 변형된 보통 알려진 C140 리셉터 또는 그것의 단편의 유도체; C140 리셉터의 글리코실화 변이체(적당한 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환에 의한 글리코실화 부위의 삽입 또는 어떤 글리코실화 부위의 결실); 그리고 C140의 가용성 형태를 포함한다.
본 발명의 신규한 단백질 및 펩티드는 바람직하게는 C140 리셉터와 보통의 생물학적 활성을 공유하는 것들이며, 이펙터 또는 리셉터 기능 또는 교차반응 항원성을 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 이러한 단편 및 변이체는 어떤 동물종의 어떤 공지의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 이제까지 공공연히 만들어진, 달리는 35 U.S.C. §102 하에서 예상되는 어떤 C140 리셉터 폴리펩티드와 또한 35 U.S.C. §103 하에 이러한 공지된 단백질 또는 폴리펩티드를 통하여 자명한 폴리펩티드는 제외한다. 구체적으로는 본 발명 C140 리셉터 단백질, 유사체, 단편 및 변이체는 아드레날린 리셉터, 뉴로펩티드 리셉터, 트롬빈 리셉터 등과 같은 C140 리셉터가 아닌 다른 공지의 G 단백질 결합된 리셉터는 제외한다.
(발명의 화합물)
본 발명의 펩티드 화합물을 기술하기 위해 사용되는 명명법은 N-말단 아미노기가 펩티드에서 각각의 아미노산 잔기의 왼쪽에 있는 것으로, 카르복시기는 그것의 오른쪽에 있는 것으로 가정되는 관례법을 따른다. 본 발명의 선택된 특정 구체예를 나타내는 식에서, 아미노- 및 카르복시- 말단기는 비록 가끔 특이적으로 보이지 않지만, 다른 특정 표시가 없으면 생리학적 pH 값에서 취하는 형태에 있는 것으로 이해될 수 있다. 그래서 생리학적 pH에서 N-말단 H+ 2및 C-말단 O-는, 비록 필수적으로 특정화하여 나타내지는 않지만, 특정 실시예에서 또는 일반식에서 존재하는 것으로 이해해야 한다. 아미노산 잔기의 측쇄상의 유리작용기는 또한 아미드화, 아실화 또는 다른 치환에 의해 변형될 수 있으며, 그것은 예를들면 화합물의 활성에 영향을 주지않고 그것의 용해성을 변화시킬 수 있다.
나타낸 펩티드에서, 각각의 유전자- 코드화 잔기는 적당하다면 다음 관례표에 따라 아미노산의 일반 명칭에 해당하는 단일 글자 명칭에 의해 나타낸다.
아미노산 한 글자 기호 세 글자 기호
알라닌 A Ala
아르기닌 R Arg
아스파라긴 N Asn
아스파르트산 D Asp
시스테인 C Cys
글루타민 Q Gln
글루탐산 E Glu
글리신 G Gly
히스티딘 H His
이소루신 I Ile
루신 L Leu
리신 K Lys
메티오닌 M Met
페닐알라닌 F Phe
프롤린 P Pro
세린 S Ser
트레오닌 T Thr
트립토판 W Trp
티로신 Y Tyr
발린 V Val
유전적으로 코드화되지 않는 아미노산은 하기에 표시된 대로 간략화한다.
만약 D-형이 칼표 어깨표시(+)에 의해 명백히 표시되지 않으면 본 출원에 보여진 특정 펩티드에서 광학이성체를 갖는 어떤 아미노산 잔기도 L-형으로 의도된다.
본 발명의 화합물은 지정된 클래스의 아미노산 잔기에 의해 부분적으로 정의되는 펩티드이다. 아미노산 잔기는 일반적으로 다음과 같이 4가지 주요 서브클래스로 하위 분류될 수 있다.
산성: 잔기는 생리학적 pH에서 H이온의 손실때문에 음전하를 띠고, 잔기는 수용액에 의해 펩티드가 생리학적 pH의 수성매질에 있을때 함유되는 펩티드의 구조에서 표면위치를 찾도록 끌어당겨진다.
염기성: 잔기는 생리학적 pH에서 H 이온과의 연합 때문에 양전하를 띠고, 잔기는 수용액에 의해 펩티드가 생리학적 pH의 수성매질에 있을때 함유되는 펩티드의 구조에서 표면위치를 찾도록 끌어당겨진다.
중성/비극성: 잔기는 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않고, 잔기는 수용액에 의해 펩티드가 수성매질에 있을때 함유되는 펩티드의 구조에서 내부위치를 찾도록 반발된다. 이들 잔기는 또한 여기서 '소수성 이라고 지칭된다.
중성/ 극성: 잔기는 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않으나, 잔기는 수용액에 의해 펩티드가 수성매질에 있을때 함유되는 펩티드의 구조에서 외부위치를 찾도록 유인된다.
개개의 잔기분자의 통계 집단에서 몇몇 분자는 전하를 띨것이고 몇몇은 그렇지 않을 것이며, 수성매질로부터 더 크거나 더 작은 정도로 인력 또는 척력이 있을 것으로 물론 이해된다. 전하를 띤이라는 명칭에 알맞게, 상당한 백분율(최소한 약 25%)의 개개의 분자는 생리학적 pH에서 전하를 띤다. 극성 또는 비극성의 분류에 필요한 인력 또는 척력의 정도는 임의적이며, 그러므로 본 발명에 의해 특히 의도된 아미노산은 극성 또는 비극성으로 분류되었다. 특별히 명명되지 않는 대부분의 아미노산은 기지의 작용에 기초하여 분류된다.
아미노산잔기는 잔기의 측쇄치환기에 관하여 환형 또는 비환형, 및 방향족 또는 비방향족의 자명한 분류로서, 그리고 소형 또는 대형으로서 더 하위분류될 수 있다. 잔기는 카르복실탄소를 포함하여 총 4개이하의 탄소원자를 함유하면 소형으로서 간주된다. 물론 소형잔기는 항상 비방향족이다.
천연 단백질 아미노산에 대해, 전술한 체계에 따른 하위분류는 다음과 같다.
산성: 아스파르트산 및 글루탐산 ;
염기성/비환형: 아르기닌, 리신 ;
염기성/환형: 히스티딘 ;
중성/극성/소형: 글리신, 세린, 시스테인 ;
중성/비극성/소형: 알라닌 ;
중성/극성/대형/비방향족: 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민 ;
중성/극성/대형/방향족: 티로신 ;
중성/비극성/대형/비방향족: 발린, 이소루신, 루신, 메티오닌 ;
중성/비극성/대형/방향족: 페닐알라닌, 및 트립토판.
유전자- 코드화 2차 아미노산인 프롤린은 기술적으로는 중성/비극성/대형/환형 및 비방향족기에 속하지만 펩티드 사슬의 2차 구조에 대한 그것의 공지된 효과 때문에 특수한 경우이며, 따라서 이와 같이 정의된 기에는 포함되지 않는다.
유전코드에 의해 코드화되지 않는, 일반적으로 마주치는 일정 아미노산으로는 예를들면 베타- 알라닌 (베타-Ala), 또는 기타 오메가- 아미노산, 예컨대 3- 아미노 프로피온산, 2,3-디아미노 프로피온산(2,3-diaP), 4-아미노 부티르산 등, 알파- 아미노이소부티르산(Aib), 사르코신(Sar), 오르니틴(Orn), 시트룰린(Cit), t-부틸알라닌(t-BuA), t- 부틸글리신(t-BuG), N-메틸이소루신(N-MeIle), 페닐글리신(Phg) 및 시클로헥실알라닌(Cha), 노르루신(Nle), 시스테산(Cya) 2-나프틸알라닌(2-Nal) ; 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3- 카르복실산(Tic) ; β-2- 티에닐알라닌(Thi) ; 및 메티오닌 술폭사이드(MSO)를 들 수 있다. 이들은 또한 특정 카테로기로 편리하게 구분되기도 한다.
상기 정의에 의거하여,
Sar, 베타-Ala, 2,3-diaP 및 Aib는 중성/비극성/소형이고 ;
t-BuA, t-BuG, N-MeIle, Nle, Mvl 및 Cha는 중성/비극성/대형/비방향족이고 ;
Orn은 염기성/비환형이고,
Cya는 산성이고,
Cit, 아세틸 Lys, 및 MSO는 중성/극성/대형/비방향족이고 ;
Phg, Nal, Thi 및 Tic는 중성/비극성/대형/방향족이다.
각종 오메가- 아미노산은 크기에 따라 중성/비극성/소형 (베타-Ala, 즉 3- 아미노프로피온산, 4-아미노부티르산) 또는 대형(나머지 전부)으로서 분류된다.
유전자에서 코드화되는 것들의 기타 아미노산 치환체도 또한 본 발명 범주내의 펩티드 화합물에 포함될 수 있으며 그 구조에 따라 이러한 일반적인 체계안에서 분류될 수 있다.
본 발명의 모든 화합물은 아미노산이 C- 말단을 형성할 때 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 형태일 수 있다. 염은 예컨대 Na+, K+, Ca+2, Mg+2등일 수 있으며, 에스테르는 일반적으로 탄소 1-6개의 알코올의 것이다.
본 발명의 모든 펩티드에서 한개 이상의 아미드 결합(-CO-NH-) 은 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2, -CH=CH- (cis 및 trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO- 와 같은 등배 전자인 또다른 결합으로 임의로 치환될 수 있다. 이러한 치환은 당업계에 공지된 방법으로 행할 수 있다. 다음 참고문헌에는 이러한 선택적 결합부분을 포함하는 펩티드 유사체의 제법이 기재되어 있다 : Spatola, A.F.,Vega Data(March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Spatola, A.F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983)(general review); Morley, J.S.,Trends Pharm Sci(1980) pp. 463-468 (general review); Hudson, D., et al.,Int J Pept Prot Res(1979)14:177-185 (-CH2NH-,-CH2CH2-); Spatola, A.F., et al.,Life Sci(1986)38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, M.M.,J Chem Soc Perkin Trans I(1982) 307-314 (-CH-CH-, cis and trans); Almguist, R.G., et al.,J Med Chem(1980)23: 1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White, C., et al.,Tetrahedron Lett(1982)23: 2533 (-COCH2-); Szelke, M., et al., European Application EP 45665(1982) CA:97:39405(1982)(-CH(OH)CH2-); Holladay, M.W., et al.,Tetrahedron Lett(1983)24:4401-4404(-C(OH)CH2-); and Hruby, V.J.,Life Sci(1982)31:189-199 (-CH2-S-).
A.아고니스트
본 발명의 아고니스트는 하기식의 일련의 펩티드로 이루어진다.
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Z (1)
여기서 AA1은 소형 아미노산 또는 트레오닌이고,
AA2및 AA3는 각각 독립적으로 중성/비극성/대형/비방향족 아미노산이고;
AA4는 소형 아미노산이고;
AA5는 염기성 아미노산이고;
AA6는 있거나 또는 없을 수 있고 있다면 중성/비극성/대형/비방향족 아미노산이고;
AA7은 AA6가 없다면 없고, AA6가 있다면 있거나 없을수도 있으며 산성아미노산이고;
Z는 아고니스트 활성을 간섭하지 않는 치환기이다.
식(1)의 펩티드는 추가의 아미노산 서열에 의해 C-말단(N-말단이 아님)에서 연장될 수 있어 비간섭 치환기를 포함한다(Z에 포함되는 것으로서 나타냄).
식(1)의 화합물의 C-말단에서 카르복실기는 비유도체화 형태이거나 아미드화되거나 에스테르일 수 있다. 비유도체화 형태에서 카르복실은 유리산이거나 염, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 염일 수 있다.
C-말단이 아미드화되면, C-말단에서 카르보닐탄소에 공유결합된 아미도기의 질소원자는 NR'R' 일 것이며, 여기에서 각 R'는 독립적으로 수소이거나 1-6C의 직쇄 또는 분지쇄알킬이며, 이런 알킬은 메틸, 에틸, 이소펜틸, n-헥실등과 같은 1-6C 직쇄- 또는 분지쇄 포화 히드로카르빌 잔기이다. 그 중에 이런 아미도기의 대표적인 것은 -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2, -NHCH2CH3, -NHCH2CH(CH3)2및 -NHCH2CH(CH3)CH2CH3이다. 더욱이 하나 또는 양 R'는 예컨대 -OR'-, -NR'R', 할로, -NR'CNR'NR'R' 등과 같은 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 차례로 치환될수 있으며, 여기서, 각 R'는 상기에서 독립적으로 정의된 것과 같다. 따라서 Z는 -OH, 또는 그것의 에스테르(OR') 또는 염형태, 또는 -NR'R' 일수 있으며, R'는 상기에서 정의된 바와같다.
AA1의 바람직한 예는 2,3-디아미노프로피오닐(2,3-diaP)상의 Ser이다. AA2및 AA3의 바람직한 예는 Val, Ile, Cha 및 Leu이다. 식(1)의 화합물의 나머지에서의 잔기에 대한 바람직한 예는 AA4는 Gly, AA5는 Lys, Arg 또는 Har, AA6는 있다면 Val, Ile, Cha 또는 Leu이고 AA7은 있다면 Asp 또는 Glu인 것이다. 특히 바람직한 것은 SLIGRLETQPPIT, SLIGRLETQPPI, SLIGRLETQPP, SLIGRLETQP, SLIGRLETQ, SLIGRLET, SLIGRLE, SLIGRL, SLIGR, SLLGKVDGTSHVT, SLLGKVDGTSHV, SLLGKVDGTSH, SLLGKVDGTS, SLLGKVDGT, SLLGKVDG, SLLGKVD, SLLGKV, SLLGK, S(Cha)IGR, S(Cha)LGK, (2,3-diaP)-IGR, (2,3-diaP)LLGK, SLLGKR-NH2, SLIGRR-NH2, S(Cha)LGKK-NH2, S(Cha)IGRK-NH2, (2,3-diaP)-LIGRK-NH2, (2,3-diaP)-LLGKK-NH2및 그것의 아미드화된 형태로 구성된 기로부터 선택되는 식(1)의 화합물이다.
B.길항제
C140 리셉터에 의해 매개된 활성을 방해하는 본발명의 화합물은 N- 말단 세린잔기가 부족한 변형 아고니스트 펩티드와 C140 리셉터상에서 여러가지 중요한 위치들과 면역 반응성인 항체를 포함한다.
펩티드 길항제
제1군의 길항제-변형된 아고니스트-는 다음 식으로 나타낼수 있다.
X-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Z
여기에서 X는 ser, ala, thr, cys, 2,3-diaP 또는 gly 이외의 아미노산 잔기이거나 데사미노 또는 알킬화 또는 아실화 아미노산이다.
여기에서 AA2및 AA3는 각각 독립적으로 중성/비극성/대형/비방향족 아미노산이며;
AA4는 소형 아미노산이며;
AA5는 염기성 아미노산이며;
AA6는 있거나 또는 없으며, 있다면 중성/비극성/대형/비방향족 아미노산이며;
AA7은 AA6가 없으면 없고, AA6가 있으면 있거나 없을 수도 있고 그리고 산성 아미노산이고;
Z는 아고니스트 활성을 방해하지 않는 치환기이다.
바람직한 아실기는 식 RCO- 인 것이며, 여기서 R는 1-6C의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이다. 아세틸이 특히 바람직하다.
X의 바람직한 예는 3-메르캅토프로피온산(Mpr), 3-메르캅토발레르산(Mvl), 2- 메르캅토벤조산(Mba), S-메틸-3-메르캅토프로피온산(SMeMpr)의 잔기이다. AA2내지 AA7에 대하여 바람직한 예는 상기 아고니스트에 대하여 기술한 바와 같고, Z도 또한 기술한 바와같다.
이 분류의 길항제 펩티드 중의 특히 바람직한 것은 Mpr-LLGK, Mpr-LIGR, Mpr-(Cha)LKG, Mpr-(Cha)IGR, Mpr-LLGKK-NH2, Mpr-LIGRK-NH2, Mpr-LIGRKETQP-NH2, Mpr-LLGKKDGTS-NH2, (n-펜틸)2-N-Leu-Ile-Gly-Arg-Lys-NH2및 (Me-N-(n-펜틸)-Leu-Ile-Gly-Arg-Lys-NH2로 이루어진 기로부터 선택된 것들이다.
항체
C140 리셉터의 중요 위치들과 면역 반응성인 항체인 길항제는 항체에 의해 표적되는 C140 리셉터의 이들부분을 항원성 부위로서 함유하는 펩티드로 적합한 포유동물 환자를 면역화함에 의해 얻는다.
중요영역들은 단백질분해성 절단의 영역, 활성화에 중요한 세포외 세그먼트의 세그먼트(이것은 절단부위를 포함하고 있다) 및 세포외 루프를 형성하는 서열의 부분들을 포함하고 있고 보다 상세히는 활성화된 리셉터 세포외영역의 N- 말단과 상호 작용하는 영역이다. 본발명의 아고니스트 펩티드는 이 경우에 면역원으로서 사용될수 있다.
따라서, 펩티드는 단백질분해영역 즉, 예컨대 SKGRSLIGRLET, ISY HLHGNNWVYGEALC; QTIYIPALNITTCHDVLPEEVLVGDMFNYFL; 및 HYFLIKTQRQSHVYA를 포함하는 것들과 같은 세포외 루프를 함유하는 것이다. 이하에서 설명될 아고니스트 펩티드는 또한 면역원으로서 사용된다. 항체는 펩티드합텐을 충분한 길이이면 단독으로 사용하거나 또는 원한다면 또는 면역원을 향상시키는데 필요하다면, 적당한 담체에 컨쥬케이트된 것을 사용하는 적당한 면역화 프르토콜로 적당한 포유동물숙주를 면역화함으로써 제조된다.
BSA, KLH과 같은 담체 또는 다른 담체단백질로 면역원 컨쥬게이트를 제조하는 방법은 당해기술분야에서 공지되어 있다. 어떤 상황하에서는 예컨대 카르보디이미드 시약을 사용한 직접 컨쥬케이트션이 효과적일수 있다. 다른 경우에는 미합중국 일리노이주 로크 포드에 위치한 피어스 케미칼 캄파니에서 공급된 것들과 같은 결합시약은 합텐으로의 접근 가능성을 제공하는데 바람직할 수 있다. 합텐펩티드는 담체와의 연결을 용이하게하기 위하여 Cys잔기로 아미노 또는 카르복시 말단에서 연장될수 있으며 또는 시스테인잔기가 군데군데 넣어질수 있다. 면역원의 투여는 종래기술에서 통상 이해되는 바와같이 적당한 기간에 걸쳐 주사함으로써 또한 적당한 보조약의 사용으로 통상 시행된다.
면역화 스케줄동안에 항체의 역가는 충분한 항체형성을 결정하도록 채용된다.
이 방법으로 생성된 폴리클로날 항혈청은 제약조성물을 위하여 약간의 이용을 만족시킬 수도 있지만 모노클로날 제제의 사용이 바람직하다. 희망하는 모노클로날 항체를 분비하는 무한생존성 세포주는 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이 림프구 또는 비장세포의 무한생존화를 행하는 Kohler와 Milstein의 표준방법 또는 변경한 방법을 사용하여 제조될 수도 있다. 희망하는 항체를 분비하는 무한생존성 세포주는 항원이 펩티드 합텐이거나 재조합 숙주세포상에 디스플레이된 C140 리셉터인 면역분석법에 의해서 스크리닝된다. 희망하는 항체를 분비하는 적당한 무한생존성 세포배양조직이 동정될 때 이 세포는 생체외에서 또는 복수액에서 생산에 의해서 배양될 수 있다.
따라서 희망하는 모노클로날 항체는 배양상청액 또는 복수상청액으로부터 회수된다. 면역학적으로 중요한 부분을 함유하고 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항혈청의 단편은 길항제로서, 또한 본래 대로의 항체로서 사용될 수 있다. Fab, Fab' 또는 F(ab')2의 단편과 같은 면역학적으로 반응성인 단편의 사용은 이들 단편이 전체 면역글로불린보다 일반적으로 덜 면역원성이기 때문에, 특히 치료와 관련하여 종종 바람직하다.
항체 또는 단편은 또한 재조합수단에 의해서 현재의 기술을 사용하여 생산될 수도 있다. 리셉터의 희망하는 부위에 특이적으로 결합하는 부위는 또한 다수 종기원을 갖는 키메라와 관련하여 생산될 수 있다.
이렇게 제조된 항체는 본 발명의 분석에서 길항제의 역할을 하는 리셉터를 위한 잠재적 길항제(potential antagonists)로서 뿐만 아니라 활성리셉터를 검출하기 위한 면역분석에서도 또한 유용하다. 이들 항체는 그 자체로서 국소화된 항체의 검출이 활성 또는 비활성 형태중의 하나로 C140 리셉터의 위치를 확인가능하도록 환자에게 투여하기 위하여 영상화제에 결합될 수 있다. 게다가, 이들 시약은 생체외에서 예를 들면 재조합 숙주세포의 표면에 전개된 C140 리셉터의 성공적인 생산을 검출하는데 유용하다.
펩티드 아고니스트 및 길항제의 제조
본 발명의 펩티드 아고니스트 및 길항제는 이 분야에서 공지된 바와 같이 표준고체상(또는 용액상) 펩티드 합성방법을 사용하여 제조될 수 있다. 게다가, 이들 펩티드를 코드화하는 DNA는 시중구입 가능한 올리고뉴클레오티드 합성장치를 사용하여 합성될 수도 있고 표준 재조합 생성시스템을 사용하여 재조합으로 제조될 수도 있다. 고체상 펩티드 합성을 사용한 생산은 비유전자 코드화 아미노산이 포함되어 있다면 필요하게 된다.
C140 리셉터 핵산의 제조
C140 리셉터 핵산은 C140 리셉터를 코드화하거나, RNA 또는 DNA로서 정의되거나, C140 리셉터를 코드화하는 핵산 서열에 상보적이거나, 또는 이러한 핵산에 혼성화하고 긴축조건하에 안정하게 결합되어 있거나 또는 도 3, 10a-10b 또는 11a-11b에 나타낸 번역된 아미노산 서열과 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85% 서열 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코드화하는 RNA 또는 DNA로서 정의된다. 그것은 전형적으로 적어도 약 10개 뉴클레오티드 길이이고 바람직하게는 도 4에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 활성화 펩티드 단편을 코드화하는 핵산을 포함하는 C140 리셉터 생물학적 또는 면역학적 활성을 갖는다. 구체적으로, 게놈 DNA, cDNA, mRNA 및 안티센스분자, 뿐만아니라 교호골격에 기초하거나 자연공급원으로부터 유도되든지 합성되든지 교호골격을 포함하는 핵산이 생각된다. 그러나, 이러한 혼성화 또는 상보적 핵산은 공지의 G 단백질 결합된 리셉터를 코드화하는 핵산을 코드화하거나, 긴축조건 하에서 혼성화하거나 또는 거기에 상보적인 것을 포함하여 어떤 종래기술 핵산을 통해서도 자명하지 않으며 신규한 것으로서 또한 정의된다.
긴축조건은 (1) 낮은 이온강도와 높은 세척온도, 예를들면 50℃에서 0.015M NaCℓ/0.0015M 타르타르산나트륨/0.1% NaDodSO4를 사용하거나, 또는 (2) 포름아미드, 예를들어서, 42℃에서 0.1% 소혈청알부민을 갖는 50% (부피/부피)포름아미드/0.1% Ficoll/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750mM NaCℓ, 75mM 시트르산나트륨을 갖는 50mM 인산나트륨 완충액, pH 6.5와 같은 변성제를 혼성화 동안에 사용하는 것들이다. 또다른 예는 42℃에서 50% 포름아미드, 5×SSC (0.75M NaCℓ, 0.075M 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5×Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어정액 DNA (50mu g/㎖), 0.1% SDS, 그리고 10% 황산덱스트란, 0.2×SSC와 0.1% SDS에서 42℃에서의 세척의 사용이다.
분리된 핵산은 핵산공급원으로부터 다른 폴리펩티드를 코드화하는 오염 핵산으로부터 분리되고 확인된 핵산일 것이다. 핵산은 진단분석법과 관련하여 유용한 본 분야에 공지 및 기술된 어떤 표지를 사용해서도 진단 및 프로브 목적으로 표지될 수 있다.
구체적으로 관심 있는 것은 본래 대로의 신호서열을 포함하나 반드시는 아닌 전길이 분자를 코드화하는 C140 리셉터 핵산이다. 전길이 단백질을 코드화하는 핵산은 처음으로 여기 개시된 유도된 아미노산 서열을 사용하고, 필요하다면 5' 코드화 단부에서 완전한 DNA를 확보하기 위한 종래의 프라이머 연장 과정을 사용하여 선별된 cDNA (신장아님) 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어진다. 이러한 클론은 원래 서열을 갖는 판독 프레임에서 개시 코돈의 존재에 의해 쉽게 확인된다.
C140 리셉터의 아미노산 서열 변이체를 코드화하는 DNA는 하기한 바와같이 또는 본 분야에서 공지된 여러 가지 방법에 의해서 제조된다. 이들 방법은 자연공급원으로 부터의 분리(자연발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-중재된(또는 부위 지정된) 돌연변이, PCR 돌연변이 및 C140 리셉터의 초기 제조된 변이체 또는 비변이체의 카세트 돌연변이에 의한 제조를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
핵산을 분리 및 다루는 기술은 예를들어서 다음 문헌들: U.S. 5,030,576, U.S. 5,030,576 및 국제특허공개 WO 94/11504 및 WO 93/03162에 개시되어 있다. 또한, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, and Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Wiley-Interscience, New York, 1987참조. 이들 문헌의 명세서는 전부 여기에 참고로 명백히 포함된다.
분석에서 사용을 위한 C140 리셉터의 재조합 생산
본 발명은 재조합 세포의 표면상에 전개시키기 위하여 C140 리셉터의 생산을 위한 재조합 물질을 제공한다. 이들 재조합 방법을 사용한 리셉터의 생산은 C140 리셉터에 결합하거나, 활성화시키거나, 또는 중화시키도록 후보약제의 능력을 결정하는데 유용한 시약을 제공한다. 이들 성질의 결정은 다른 관련 리셉터를 결합시키기 위하여 의도된 약제의 특이성을 측정하는데 필수적이다.
이 재조합 생산을 위하여 도 1a-2b 및 도 2a-2b에서 제시된 것 또는 이들의 실질적인 등가물 또는 이들의 변성유사물과 같은 C140 리셉터를 코드화하는 DNA 서열은 하기에 제시된 본래의 서열의 회복에 의해서 또는 프로브와 같은 공지된 본래의 서열의 실질적인 부위를 사용함으로써 제조되거나, 또는 표준과정을 사용하여 새로이 합성될 수 있다. 이 DNA를 원하는 숙주에 적합한 발현벡터속에 결합시키고 적합한 세포로 형질 전환시킨다. C140 리셉터 코드화 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 세포를 배양하고 표면에서 리셉터를 나타내는 세포를 분석에 사용하기 위해 수거한다.
숙주세포는 전형적으로는 동물세포, 가장 전형적으로는 포유동물세포이다. 분석에서 유용해지려면 세포는 도 4에서 일반적으로 보여지는 형태로 세포 표면에서 리셉터가 발현되게 하는 세포내 기작을 가져야만 한다. 이 분석이 검출시스템으로서 활성화된 리셉터에 대한 세포반응을 이용하면, 세포는 또한 리셉터의 활성화에 대한 반응을 위해 G-단백질 연결 기작을 포함해야 한다. 대부분의 포유동물 및 기타 동물세포는 이러한 조건을 충족한다.
본 발명의 방법에서 사용하는데 특히 유용한 세포는Xenopus laevis개구리 난모세포인데, 이것은 전형적으로 원하는 단백질을 코드화하는 DNA로부터 진행하는 표준 재조합 발현시스템 보다는 cRNA를 이용한다. 캡핑된 RNA(5'-단부에서)는 전형적으로 리셉터를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 선형화된 벡터로부터 생산된다. 반응은 RNA 폴리머라제 및 표준 시약을 이용하여 수행된다. cRNA는 전형적으로는 에탄올과 함께 페놀/클로로포름 침전을 이용하여 수거하고 난모세포속에 주사한다.
그다음엔 C140 리셉터를 코드화하는 DNA를 발현하는 동물숙주세포 또는 cRNA-주사된 난모세포를 배양하여, 코드화 핵산의 발현을 일으켜서 그것의 표면에서 도 4에서 보여지는 것과 유사한 방식으로 전개된 C140 리셉터를 생산한다. 그 다음 이들 세포를 후보 약제가 리셉터에 결합, 길항작용, 또는 활성화하는 것을 평가하기 위한 분석에 직접 사용한다.
분석
쉽게 수행되는 분석의 한 유형에서는 아고니스트 또는 공지된 결합 길항제와 후보 약제의 리셉터 결합에 대한 경쟁을 시험할 수 있다. 한 방법에서는 경쟁하는 아고니스트 또는 길항제를 표지화시킬 수 있다; 물론 리셉터에 결합하는 것으로 알려진 표지화된 물질이 합성 펩티드일 수 있다. 한 전형적인 프로토콜에서는 각종 농도의 후보가 일정 농도의 표지화된 아고니스트 또는 길항제와 함께 공급되고 리셉터와 표지의 결합의 억제를 공지기술을 이용하여 평가할 수 있다.
다소 더 복합한 방법에서는, 아고니스트―유도된 반응에 대한 후보 화합물의 효과를 하기에서 기술되는 것처럼 C140 리셉터를 재조합적으로 발현하는 세포에서 측정할 수 있다. 이들 세포에 대한 리셉터의 활성화 효과의 분석 시스템은 칼슘 이동화 및 전압 클램프를 포함하는데 이것은 여기서 상세히 기술된다. 이 분석은 단순히 리셉터에 결합할 수 있는 능력이 아닌 리셉터 활성에 대한 후보약제의 효과의 평가를 가능하게 한다. C140 리셉터를 생성하는 다른 재조합 세포 또는 C140 리셉터를 코드화하는 cRNA를 발현하는 난모세포에 의한45Ca 방출의 아고니스트―유도된 증가는 공표된 기술에 의해 평가한다(Williams, J.A., et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1988)85:4939-4943). 간단히는 세포내 칼슘 푸울은 50μCi45CaCℓ2(10-40mCi/㎎ Ca; Amersham)을 포함하는 300㎕ 칼슘―제거 변형 Barth 용액(MBSH)에서 30 난모세포의 그룹을 RT에서 4시간동안 배양함으로써 표지화된다. 표지화된 난모세포 또는 세포를 세척한 다음 항생제 없는 MBSH Ⅱ에서 90분간 배양한다. 5난모세포의 그룹을 선택하고 항생제없는 0.5㎖/웰 MBSH Ⅱ를 포함하는 24-웰 조직 배양 플레이트(Falcon 3047)에서 각 웰속에 넣는다. 이 배지를 제거하고 매 10분마다 새로운 배지로 대체한다; 수거한 배지는 각 10분 배양동안 난모세포에 의해 방출된45Ca를 결정하기 위해 신틸레이션 카운팅에 의해 분석한다. 단위시간당45Ca 방출의 안정된 기준 치에 도달할 때까지 10-분 배양을 계속한다. 두번의 추가적인 10분 수집물을 얻은 다음 아고니스트를 포함하는 시험 배지를 첨가하고 아고니스트―유도된45Ca 방출을 측정한다.
상기의 분석을 이용하여 후보 약제가 리셉터를 활성화할 수 있는 능력을 직접 시험할 수 있다. 이 경우 본 발명의 아고니스트를 컨트롤로서 사용한다. 게다가, 재조합 리셉터를 활성화하기 위해 본 발명의 아고니스트를 사용함으로써 이 활성화에 대한 후보 약제의 효과를 직접 시험할 수 있다. 리셉터를 코드화하는 핵산을 발현하는 재조합 세포는 후보 화합물이 있는 그리고 없는 아고니스트의 존재하에서 분석시 배양된다. 후보의 존재시 활성화의 감소는 길항제 효과를 나타낼 것이다. 반대로, 본 발명의 길항제의 길항효과를 역전시킬 수 있는 후보약제의 능력을 또한 시험할 수 있다.
칼슘 이동화를 측정하는 다른 방법에서는 전압 클램프 분석이 리셉터 활성화의 척도로서 이용될 수 있다. 단일 전극 전압―클램프 기술이 이용되는 것을 제외하고는, 본질적으로 종전에 기술된 것처럼(Julius, D., et al.Science(1988)241: 558-563) 재조합 발현 시스템으로부터 DNA를 발현하는 세포 또는 C140 리셉터 코드화 cRNA를 발현하는 전압―클램프 난모세포에서 아고니스트―유도된 내부 클로라이드 전류가 측정된다.
활성화된 리셉터의 검출
한가지 구체예에서, 재조합 C140 리셉터 단백질의 유용성으로 인해 생체내에서 활성화된 리셉터의 진단 영상화에 사용될 수 있는 리셉터의 활성화 형태에 면역특이성이 있는 항체의 생산이 가능하다. 이들 항체는 재조합하여 생산된 리셉터의 활성화형이나 여기서 기술된 신 아미노 말단 펩티드를 대표하는 펩티드로 생산된다. 결과적으로 얻어지는 항체나 Fab, Fab', Fab'2단편과 같은 그것의 면역특이적인 단편은, 테크네튬99과 인듐111을 포함하는 방사성 표지 또는 이 분야에서 공지된 다른 방사성 표지와 같은 공지 방법에 의해 검출되는 표지에 컨쥬게이트된다. 생체내에 주사되었을 때 이들 항체는 활성 리셉터의 부위에 돌아오므로, 따라서 활성 리셉터를 포함하는 영역의 국소화를 가능케 한다. 또다른 구체예에서, 체액이나 배양 배지내의 활성화 펩티드의 존재가 검출되고 측정될 수 있다. 항체는 상술된 바와 같은 활성화 펩티드로 만들어지고, 한 예로서 소변내의 활성화 펩티드의 초과량을 검출하기 위한 표준 ELISA나 RIA 분석에서 사용된다.
약제로서 아고니스트와 길항제의 투여
아고니스트로 행동하는 본 발명의 펩티드는 이 분야에서 공지된 전신 투여를 위한 통상적인 제제로 투여된다. 그러한 전형적 제제는 한 예로서 (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, lastest edition)에서 찾아볼 수 있다.
펩티드의 전신투여에 바람직한 형태는 주사, 전형적으로, 정맥내 주사를 포함한다. 피하주사, 근육내 주사, 복막내 주사와 같은 다른 주사경로가 또한 사용될 수 있다. 더욱 최근에는 담즙염분이나 푸시드산이나 기타의 청정제와 같은 투과제를 사용함으로써 점막투과 및 피부투과 투여제를 포함하는 펩티드의 조직투여에 대한 대체수단이 강구되어 왔다. 또한, 장용성 또는 캡슐화된 제제로 제제화된다면 구강투여도 가능하다. 이들 성분의 투여는 또한 연고, 페이스트, 겔 등의 형상으로 국소적 및/또는 국부적으로도 가능하다.
필요한 투여량은 펩티드의 선택, 투여경로, 제제화의 성질, 환자의 상태 및 돌보는 외과의사의 판단에 달려 있다. 그러나, 적정 투여량은 0.1-100㎍/㎏ 환자의 범위이다. 유용한 펩티드의 다수 존재 및 다양한 투여경로에 따른 서로다른 효용성을 고려하자면 필요한 복용량에 있어서는 넓은 변동이 예견되는 바이다. 가령, 경구투여법에 따를 경우 정맥내 주사에 의한 투여보다 더 높은 투여량이 예견된다. 이들 투여량 수준에 있어서의 변동은 그 분야에 있어 잘 이해된 바와 같이 최적을 위한 표준화된 경험적 방법을 이용함으로써 조정될 수 있다. 아래 보는 바와 같이 본 발명의 아고니스트는 항저혈압제로 작용한다; 길항제는 반대 효과를 보인다. 이리하여 혈압을 높이거나 낮출 필요가 있는 환자들이 적합한 펩티드의 투여로 이로운 효과를 보게된다. 또한, 아고니스트는 염증방지성 및 상처치료성질을 가진다.
안티센스, 삼중나선 및 유전자 요법측면
세포에서 안티센스 RNA의 구조적 발현은 포유동물과 식물에서 약 20가지의 다른 유전자들의 발현을 저해하는 것으로 나타났으며, 그 수가 계속 늘어나고 있다(Hambor, J.E. et al., J. Exp. Med. 168:1237-1245(1988); Holt, J.T. et al., Proc. Nat Acad. Sci. 83:4794-4798(1986); Izant, J.G. et al., Cell 36:1007-1015(1984); Izant, J.G., et al., Science 229:345-352(1985) 및 De Benedetti, A. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84:658-662 (1987)). 안티센스 효과의 가능한 메카니즘은 스플라이싱의 번역 차단 또는 방지인데, 둘다 생체외적으로 관찰되었다. 스플라이싱의 방해는 인트론 서열의 사용을 허용하는데(Munroe, S.H., EMBO. J. 7:2523-2532(1988)) 이것은 덜 보존되어야 하고 따라서 한가지 종의 단백질의 발현을 저해하는데에는 더 큰 특이성을 가져오나 다른 종에서 그것의 상동체는 그렇지 않다.
치료유전자 조절은 안티센스 방법을 사용하여 달성되는데, 여기서 세포 또는 유기체에서의 표적유전자의 기능은 특정 표적 유전자의 발현을 저해하는데 특이적으로 작용하는 안티센스 RNA를 코드화하는 DNA, 아마도 올리고뉴클레오티드의 트랜스펙션에 의해 차단된다. 안티센스 DNA의 서열은 저해하고자 하는 유전자 또는 mRNA의 세그먼트에 실질적으로 상보적인 완전 또는 바람직하게는 부분적 안티센스 RNA 전사체를 가져오도록 설계된다. 상보성은 충분하여서 작용이 스플라이싱, 전사 또는 번역의 수준인지에 무관하게 안티센스 RNA가 표적유전자(또는 mRNA)에 혼성화할 수 있고 표적유전자의 기능을 저해하도록 해야한다. 당업자라면 부당한 실험없이 쉽게 식별할 수 있는 저해의 정도는 세포를 저해하거나 표적유전자를 발현할 수 없게 하기에 충분해야 한다. 당업자는 안티센스 RNA 방법이 특이적 유전자 발현을 차단하기 위해 사용될 수 있는 많은 공지의 메카니즘중 하나에 불과함을 인정할 것이다.
용어 안티센스는 안티센스 RNA가 mRNA의 번역을 저해하도록 안티센스 RNA와 mRNA 사이에 분자 혼성화를 일으키는데 특이적인 특정 mRNA 분자에 충분히 상보적인 RNA 서열, 뿐만아니라 그것을 코드화하는 DNA 서열을 말한다. 이러한 혼성화는 생체내 조건에서, 즉 세포내부에서 일어나야 한다. 안티센스 RNA의 작용은 세포에서 유전자 발현의 특이적 저해를 가져온다(Albers, B. et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, 2nd Ed., Garland Publishing, Inc., New York, NY(1989), 구체적으로 195-196페이지 참조).
본 발명의 안티센스 RNA는 코드화 서열, 3' 또는 5' 미번역 영역 또는 다른 인트론 서열을 포함하는 표적 mRNA의 몇 개의 부분들중 어떤 것에 혼성화 가능하다. 바람직한 안티센스 RNA는 사람 C140 리셉터 mRNA에 상보적인 것이다. 당업자라면 쉽게 식별하는바, 본 발명에 의해 요구되는 상동성의 최소량은 다른 mRNA 분자의 기능과 다른 유전자의 발현에 영향을 미치지 않으면서 특이적 표적 mRNA에의 혼성화를 가져오고 그것의 번역 또는 기능의 저해를 가져오기에 충분한 것이다.
안티센스 RNA는 프로모터를 포함하는 적당한 조절서열을 가진 안티센스 RNA를 코드화하는 DNA를 놓은 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션에 의해 세포로 전달되어 숙주세포에서 안티센스 RNA의 발현을 가져온다.
삼중나선 또는 트리플렉스 방법은 상호 선형 트리플렉스를 형성하도록 듀플렉스 DNA의 주 그루브에 결합하는 합성 올리고뉴클레오티드의 생산을 수반한다. 이러한 트리플렉스 형성은 세포성장을 조절 및 저해할 수 있다. 예를들면, Hogan et al., 미국특허 5, 176,996; Cohen, J.S. et al., Sci. Amer., Dec. 1994, P. 76-82; Helene, C., Anticancer Drug Design 6:569-584(1991); Maher Ⅲ, L. J. et al., Antisense Res. Devel. 1:227-281 (Fall 1991); Crook, S.T. at al. eds. ANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS, CRC Press, 1993참조. 그것은 부분적으로 유전자 조절 영역에서 듀플렉스 DNA 표적에 트리플렉스 형성에 의해 DNA 올리고뉴클레오티드가 결합할 수 있어 전사 개시를 억제한다는 발견에 부분적으로 기초한다(Cooney M. et. al. (1988) Science 241:456). 본 발명은 Hogan et al, 상기 참조(이것은 전부 여기에 참고로 포함됨)의 방법들과 같은 방법을 이용하여 C140 리셉터 코드화 DNA의 일부 또는 그것의 조절 서열로 이루어지는 듀플렉스 DNA 표적에 견고하고 특이적으로 결합할 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 그러므로, 이러한 트리플렉스 올리고뉴클레오티드는 이 유전자의 발현을 선택적으로 조정하기 위해 약 분자의 부류로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드가 DNA 듀플렉스에 결합하여 상호선형 트리플렉스를 형성하도록 표적 C140 리셉터-코드화 DNA 서열 또는 그것의 조절서열의 DNA 듀플렉스에 세포흡수 및 결합을 위해 충분한 양으로 합성 올리고뉴클레오티드를 세포에 제공 또는 환자에 투여하는 것에 관련된다. 이 방법은 체외적으로 또는 체내에서 세포에서의 리셉터의 발현을 저해하기 위해 사용된다. 바람직하게는 표적서열은 RNA 전사 기원에 인접한 DNA 도메인내에 위치된다. 이 방법은 또한 이 리셉터의 발현에 의존하는 세포의 성장을 저해하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 또한 이러한 트리플렉스-형성 합성 올리고뉴클레오티드를 투여함으로써 세포 또는 조직에서 발현된 C140 리셉터의 상대적인 양 또는 비율을 변경하기 위해 사용될 수도 있다.
다음의 실시예는 발명을 제한하기 위한 것이 아니라 설명하기 위하여 의도된 것이다.
실시예 1
쥐 C140 리셉터를 코드화하는 유전자의 분리
마우스 코스미드 게놈 라이브러리(Dr. R.A. Wetsel, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri로부터 구입함, Wetsel, R.A. et al.,J Biol Chem(1990)265: 2435-2440 참조)는 소 물질 K 리셉터 cDNA (Masu, Y. et al.,Nature(1987)329:836-838)의 각각의 bp 190-249와 742-801에 해당하는 2개의32P-표지된 올리고뉴클레오티드로 스크리닝하였다. 혼성화 조건은 5 x SSC, 5 x Denhardt's, 0.1% SDS, 0.1㎎/㎖ 정액 DNA, 106cpm/㎖의 표지된 올리고뉴클레오티드이었고, 60℃에서 밤새도록이어서 60℃에서 1 x SSC, 0.1% SDS로 세척하였다.
분리된 클론(C140)중 하나에서, 혼성화 부위는 3.7kb PstI 단편에 국소화하였다. 이 단편은 시중에서 구입가능한 pBluescript 벡터내로 서브클론되어 있다. 혼성화 및 인접 영역은 상거 사슬 종결법에 의해 양 방향으로 서열결정되었다. 도 1a-1b는 마우스 C140 리셉터의 유도된 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열 양자를 도시하고 있다. 임시신호서열(SP)과 7개의 트랜스멤브레인 영역는 윗줄쳐져 있고 잠재적 아스파라긴―결합된 글리코실화 부위는 짙은 화살표로 표시되고, Arg34-Ser35에서 추정상의 프로테아제 리셉터 절단 부위는 옅은 화살표로 마크되어 있다.
실시예 2
사람 C140 리셉터를 코드화하는 유전자의 분리
마우스 프로테아제 C140 리셉터를 코드화하는 게놈 DNA의 유용성은 해당 사람 유전자의 회복을 허용한다. vector EMBL3에 클로닝된 사람 게놈 라이브러리는 프로브로서 쥐 클론의 전체적인 코드화 영역을 사용하는 실시예 1의 조건에서 정확하게 스크리닝된다. DNA 서열과 유도된 아미노산 서열을 포함하는 회복된 사람 유전자가 도 2a-2b에 도시되어 있다. 후속적인 실험은 사람 C140 유전자는 사람 트롬빈 리셉터 유전자에 관해 보고된 바와 같이 염색체 번호 5 (5q12-5q13)의 긴 팔의 동일 영역에서 위치하고 있음을 보였다.
부가하여, 1.1kb 게놈 DNA 단편은 시판 스크리닝 서비스인 Genome Systems Inc로부터 얻어졌고 사람 C140 단백질 코드화 영역의 350-뉴클레오티드로 이루어진 단편을 생성케 하는 프라이머 쌍에 대해 PCR-포지티브이었다. 1.1kb bamH1 단편은 서브클로닝되고 서열 결정되었고 프로모터 서열의 800-뉴클레오티드를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 프로모터는 TATA 박스와 CAAT 박스 양자를 결핍하지만 많은 우수(housekeeping) 유전자의 프로모터에 공통인 특징; G's와 C's는 풍부하다. SP1과 AP2에 특이적인 2개의 결합 요소가 확인되었다.
실시예 3
관련된 G-프로틴 리셉터의 비교
도 3에 도시된 바와 같이, 사람 프로테아제 C140 리셉터의 유도된 아미노산 서열은 마우스 서열의 광범위한 유사성(90%)을 나타낸다.
도 5는 마우스 C140 리셉터와 관련된 G-단백질 리셉터 사람 트롬빈 리셉터(Coughlin, S.Cell) 사이의 아미노산 서열 정렬을 도시하고 있다. 임시 신호 서열(SP), 트랜스멤브레인 영역 그리고 프로테아제 절단 부위가 표시되어 있다.
실시예 4
마우스 C140 cDNA의 회복
마우스 위로부터의 cDNA 라이브러리는 λgt10으로 구성되고 C1040 게놈 DNA를 포위하는 프로브로 스크린되었다. 단일파지클론은 분리되고 EcoRI로 절단된다. 삽입체가 pBluescript 및 pSG5 내로 클로닝되어 서열결정되었다.
분리된 cDNA는 16염기 polyA-신장부를 포함하는 2732 뉴클레오티드 길이이었고 5'RACE는 5' 단부에 단지 27염기의 첨가를 가져왔다. 외견 코드화 영역의 5' 단부는 게놈 DNA의 개방 판독 프레임의 5' 단부와 상이하다. cDNA의 5' 단부가 올바른 것으로 믿어진다. C140을 코드화하는 쥐과 동물 cDNA의 완전한 뉴클레오티드서열과 유도된 아미노산 서열은 도 10a-10b에 도시되어 있다.
실시예 5
C140을 코드화하는 인간 cDNA의 회복
인간 장암 cDNA 라이브러리는 실시예 2의 게놈클론으로부터 설계된 프라이머를 이용한 PCR을 받았고, 증폭된 단편을 pSG5에서 클로닝되어 서열결정되었다. 뉴클레오티드서열과 유도된 아미노산 서열은 도 11a-11b에 도시되어 있다. 도 11a-11b에 도시된 바와 같이 게놈 DNA에 의해 코드화된 것과 cDNA 코드화된 서열사이를 비교하여 보면 4개의 아미노산의 차이가 있다.
실시예 6
난모세포에서 프로테아제 C140 리셉터의 활성화
본래의 것과 천연돌연변이체 C140 리셉터는 둘다 난모세포에서 생산되었고 새로운 아미노말단을 의태하는 펩티드로 또는 단백질 분해효소 트립신(이것은 세포외 영역을 절단한다)에 의해 활성화되었다. 본래의 리셉터는 리셉터 유전자의 코드화영역을 폴리머라제 연쇄반응을 사용하여 발현벡터 pSG-5 (Green, S. et al.,Nucleic Acid Res(1988)16:369) 안으로 클로닝시킴으로써 제조되었다.
클로닝된 코드화영역의 방향과 완전성은 뉴클레오티드 서열을 Sanger사슬 종결방법으로 결정함으로써 입증되었다. 부위특이적 돌연변이유발은 pSG-5에서 돌연변이 리셉터를 제조하기 위해 사용하였다. 3개의 돌연변이 리셉터는 세린-35가 프로린, 아르기닌 및 히스티딘 각각으로 치환된 것이 만들어졌다. 3개의 돌연변이체의 뉴클레오티드서열은 상기로서 입증되었다.
난모세포의 표면에서 리셉터를 만들기 위하여, 리셉터를 코드화하는 cRNA가 다음과 같이 만들어졌다. pSG-5 C140 플라즈미드 DNA는 XbaI로 분해시킴으로써 선형으로 만들어지고 캐핑된 cRNA는 T7 RNA 폴리머라제(Krieg 및 Melton,Meth Enzymol(1987)155: 397-415, 이 문헌은 전부 여기에 참고로 포함됨)를 사용하여 생체외에서 제조되었다.
Xenopus laevis로부터의 난모세포는 공개된 기술(Coleman, A., in Hames, B.D. 및 Higgins, S. J., eds,Transcription and Translation:A Practical Approach, IRL Press, pp. 271-302 ; Williams, J.A., et al.Proc Natl Acad Sci USA(1988)85: 4939-4943)을 사용하여 수거되고 제조되었다. 여포세포를 제거하기 위하여, 난모세포는 각각의 콜라겐아제 1A와 히알루로니다제 1S 2㎎/㎖를 함유하는 칼슘이 없는 Barth's에서 흔들어서 1.5시간동안 배양하였다. 그다음 난모세포는 일반 Barth's에서 5번 세척하고 100 U/㎖페니실린, 100㎍/㎖스트렙토마이신 및 2.5mM피루브산 나트륨을 함유하는 Barth's배지에서 18℃에서 배양하였다. V 단계 난모세포를 선별하고 cRNA의 30nℓ(0.33㎍/㎕물) 또는 물로만 주사되고 그다음 96-웰 배양플레이트에서 웰당 4개의 그룹으로 0.25㎖의 배지로 배양하였다. 36시간 후 난모세포는45Ca(250μCi/㎖)로 배양하였다. 12시간배양후 난모세포를 세척하고 0.2㎖의 배지를 첨가하고 5분마다 바꾸었다. 수확된 배지는 신틸레이션 카운팅에 의해 분석하였다.45Ca의 기준치 방출을 결정하는 다섯번의 치환후, 아고니스트를 가진 테스트배지, 예를 들면 SLIGRL을 첨가하여 유발된45Ca- 방출을 결정하였다.
난모세포는 야생형 마우스 C140 리셉터(WT) 또는 세개의 돌연변이 리셉터 35Pro, 35Arg 및 35His중의 어느 것을 코드화하는 캡핑된 cRNA(약 10ng)로 주사하였다.
36시간이 지난후에, cDNA가 주입되고 그리고 대조군 물이 주입된 난모세포에45Ca가 충전되었고, 그리고 12시간이 더 지난후에는 펩티드나 트립신이 유도된45Ca 방출을 상술한 바와 같이 측정하였다. 펩티드 SLIGRL를 100μM, 그리고 트립신을 300pM 첨가하였다. 트립신으로 자극한 후, 동일군의 난모세포를 대상으로 펩티드로 자극을 행하였다. 표 1에 나타낸 데이타는 3번의 반복측정치에 대한 평균치를 나타내고, 그리고 물로 주입된 난모세포에 비해 증가되었음을 나타낸다.
리셉터 아고니스트 45Ca의 접힘증가
WT 트립신 6.6
35Pro 트립신 0
35Arg 트립신 0
35His 트립신 0
WT SLIGRL 11
35Pro SLIGRL 23
35Arg SLIGRL 15
35His SLIGRL 23
표 1에 나타낸 바와 같이, 아고니스트 펩티드 SLIGRL은 야생형 리셉터와 돌연변이 리셉터 둘다를 활성화시킬 수 있었다. 반면에, 세포외 영역의 절단에 의해서만 활성화될 수 있는 트립신은 야생형 리셉터를 활성화시킬 수 있을 뿐이다.
실시예 7
다른 아고니스트 펩티드에 의한 C140 리셉터의 활성화
위의 분석실험에서 난모세포에서 발현되는 야생형 마우스 C140 리셉터를 사용하여 각종 펩티드를 100μM 로 테스트하였다.
펩티드 45Ca의 접힘증가
SLIGRL 15
SLIGRA 8.5
SLIGAL 0
SLIARL 4.3
SLAGRL 0
SAIGRL 0
ALIGRL 1.3
SFFLRW 1.7
본래의 펩티드 SLIGRL 이 가장 효율적이며; 위치 6의 L을 알라닌으로 교체하는 것은 활성을 저하하지만 이를 파괴하지는 않는다. 위치 2 및 3은 더욱 민감하다. 위치 1은 알라닌과의 치환을 허용하지만 활성을 10의 인자만큼 감소시키며 ; 이 아고니스트의 활성은 트롬빈 리셉터 아고니스트 SFFLRW와 비교할만하다.
실시예 8
다양한 조직에서의 C140 리셉터의 발현
Poly(A)+RNA를 마우스의 조직으로부터 제조하였고, 50%의 포름아미드를 함유한 1.2%의 아가로스겔상에서 분해하였고, 그다음 하이본드(Hybond) C 엑스트라 막(Amersham) 위로 블로팅(blotting)하였다. 블롯을 쥐 C140 리셉터의 전체 코드화영역에 대해 지정된32P-표지화된 랜덤 프라이밍 프로브 와 혼성화하였다. 프로브를 48시간동안 42℃에서 혼성화하였고, 그 다음 계속해서 20℃에서 1×SSC, 0.1% SDS로 2회, 매회 5분 동안 세척하였고, 65℃에서 1×SSC로 2회 매회 20분동안 세척하였고, 0.1×SSC, 0.1% SDS로 2회 매회 20분동안 세척하였다. 결과적인 막을 강도 있는 스크린으로 -80℃에서 5일동안 자동방사선사진을 찍었다.
도 6에 도시된 결과는 비장을 제외한 신장 및 소장이 C140을 코드화하는 mRNA를 함유한다는 것을 가리킨다. 각 레인이 10㎍ RNA를 함유하는 도 6에서, 레인 A는 비장으로부터 유래되고, 레인 B는 신장으로부터 유래되고, 레인 C는 소장으로부터 유래된다.
실시예 9
마우스에서 C140 전사체의 발현
35S RNA 프로브를 사용하는 원위치 혼성화는 마우스 태아발생 및 어른 마우스
조직에서 C140 전사체를 위치시키는데 사용되어져 왔다. 11.5일에 위장관에서 강한 신호가 발견되었으며 ; 14일에는 비인두, 위장내, 피부 및 더 큰 혈관내의 내피세포에서 상피조직과 더 강한 혼성화가 있었다. 간 및 경절(sclerotoma)내에서는 얼마간의 혼성화가 있었으나, 근육이나 CNS내에서는 어떤 신호도 없었다. 17일에는 경절내에서의 신호가 사라졌으며, 부가적인 상피조직이 식도, 신장 신사구체, 허파, 모낭 및 표피를 포함하는 혼성화를 보여주었다.
신생마우스에서는 17일에 발견된 신호가 유지되었으며, 부가적인 신호들이 흉선수질 및 신장수질에서 발견되었다. 어른 마우스는 위점막, 내장 및 결장, 비장의 화이트펄프(white pulp), 흉선 그리고 신장수질에서 전사체를 보여주었다. 다시 말하면, CNS, 간장, 허파 또는 부신에서는 어떤 신호도 없었다. 도 12는 이러한 프로브를 사용하는 신생마우스의 해부도에서 원위치 혼성화의 결과를 보여주고 있다.
실시예 10
인간조직에서 C140 전사체의 발현
도 13는 C140 리셉터 프로브를 인체에 혼성화시킨 인간세포 쥐로부터 전체 RNA의 노턴 블로트(Northern blot)의 결과를 보여준다. 전체 RNA의 10㎎이 사용되었다. 혼성화는 RNA에서 위장 (레인1), Ca-Co-2 세포 (레인2); HT-29 세포 (레인3), A498세포 (레인5), 5637세포 (레인8) ; 피부각질세포 (레인12) 및 HUVEC (레인 13 및 14)로부터 얻어졌다. 어떤 혼성화도 HuTu 80 세포, J82 세포, MCF-7, HeLa 또는 NCI 12세포 (레인 4,6,9 및 10)에서는 검출되지 않았다.
실시예11
C140 아고니스트의 저혈압 활성의 결정
0.2㎖ 완충제에서 다양한 농도로 C140 아고니스트 SLIGRL을 래트의 대퇴부 정맥에 주입하여 동맥압력을 검사하였다. 다양한 농도에 의한 결과가 도 7에 도시되어 있다.
도 7의 흔적은 0.1mM에서 혈압의 인식할 만한 감소가 발생되고 1mM 농도에서 더 큰 혈압의 감소가 관측되었음을 나타낸다.
이 결과는 상기 아고니스트에 의한 래트의 대퇴부 정맥에 대한 자극의 결과로써 혈관확장을 관찰함으로써도 나타내었다. 성인 Sprague-Dawley 래트가 디에틸에테르 마취동안 피를 뽑음으로써 살해되고 지방 및 연결조직이 없는 대퇴부 정맥을 제거하여 해부하였다. 정맥의 원형 표본이 두개의 L형상의 금속홀더(직경이 0.2㎜) 위의 기관 욕(5㎖)에 놓여진다. 금속홀더중의 하나는 Grass FTO C 강제 변위 트랜스듀서의 레버중의 하나와 나사맞춤되었다. 욕액은 118mM NaCℓ, 4.7mM MKCℓ, 2.5 mM CaCℓ2, 1.2mM MgSO4, 24.8 mM NaHCＯ3, 1.2mM KH2PO4및 5.6mM 글루코스를 함유하는 Kreb's Ringer 용액이었다. 욕액은 88.5% 산소-11.5% CO2로 계속해서 처리하였고, 온도는 37℃로 유지되었다. 내피는 혈관을 통하여 CO2를 거품이 일게함으로써 제거되었다. 기부장력은 7.5와 12mN 사이이었다. 제제를 아고니스트와 대조군 물질을 가하기 전에 적어도 1시간동안 평형화하였다.
이러한 측정 결과가 도 8a 및 도 8b에 도시되었다. 도 8a에서 알 수 있는 바와 같이 3×10-5M에서 PGF2α의 이용에 의해 야기된 수축이 10-5M 아고니스트의 투여에 의해 이완되었다. 도 8a의 결과는 여전히 존재하는 내피를 갖는 정맥을 사용하여 얻어졌다. 도 8b에서 내피가 제거되었다. 유사 실험에서 3×10-5M PGF2α에 의해 유도된 수축은 10-5M 아고니스트 또는 10-5M 아세틸콜린에 의해 수축되지 않았다.
실시예 12
플라스민 및 칼리클레인에 의한 재조합 C140 리셉터의 활성화
도 9a 및 도 9b는 C140 cRNA (옅은 원) 또는 대조군으로서 물(엑스)이 주입된 난모 세포를 활성화시키는 각각의 플라스민 및 칼리클레인의 능력을 도시한다.
도 9c는 C140 리셉터 cRNA(짙은 원) 또는 물질 K 리셉터 cRNA(옅은 원) 가 주입된 개구리 난모세포를 활성화시키는 트립신의 능력을 도시한다. 트립신은 C140 리셉터가 주입된 난모세포에 대해 분명히 특이한 효과를 갖는다.
특허, 저널 기사 및 서적을 포함하는 상기 인용되고 언급된 모든 참고문헌들은 명백히 포함되는지 않든지 모두 여기에 참고로 포함된다.
본 발명을 특정 구체예와 연관하여 기술한 한편, 더 이상의 수정을 할수 있음을 이해할 수 것이다. 본 출원은 발명이 속하는 기술분야에서 공지 또는 관행 안에 들고 첨부된 특허청구범위에서와 같이, 이제 까지 제시된 필수 특징들에 적용되는 바에 따른 본 명세서로 부터의 이탈을 포함하여 일반적으로 발명의 원리를 따르는 발명의 어떤 변형, 사용 또는 개작을 망라하는 것으로 한다.

Claims (26)

  1. 재조합 숙주로 형질전환될때, 숙주의 세포표면에서 C140 리셉터를 생산할 수 있는 발현시스템으로 이루어지는 DNA 분자에 있어서, 발현시스템은 상기 숙주세포에서 작동 가능한, 코드화하는 뉴클레오티드와 이종인 컨트롤서열에 작동가능하게 연결된 C140 리셉터를 코드화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
  2. 제 1 항의 발현시스템을 함유하도록 변형된 세포.
  3. 세포의 표면에서 전개된 C140 리셉터를 함유하는 세포의 제조방법에 있어서, C140 리셉터를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 영향을 미치는 조건하에서 제 2 항의 세포를 배양하여 세포의 표면에서 전개된 C140 리셉터를 함유하는 상기 세포를 얻는 것으로 이루어지는 방법.
  4. C140 리셉터를 코드화하는 cRNA 분자.
  5. 제 4 항의 cRNA를 함유하도록 변형된 난모세포인 세포.
  6. 세포의 표면에서 전개된 C140 리셉터를 함유하는 난모세포인 세포의 제조방법에 있어서, C140 리셉터를 코드화하는 cRNA의 발현을 실행하는 조건하에서 제 5 항의 난모 세포를 배양하여 세포의 표면에서 전개된 C140 리셉터를 함유하는 상기 세포를 얻는 것으로 이루어지는 방법.
  7. 후보물질의 C140 아고니스트 활성을 결정하는 방법에 있어서,
    그 물질의 존재하에서와 부재하에서 제 3 항 또는 제 6 항의 세포를 배양하는 단계와;
    상기 물질의 부재하에서와 비교한 존재하에서의 C140 리셉터의 활성화의 존재, 부재 또는 양을 검출하여 이로써 상기 물질의 부재와 비교한 존재하에서의 상기 활성화의 증가가 물질의 아고니스트 활성을 가리키게 되는 단계로 이루어지는 방법.
  8. 후보물질의 C140 아고니스트로 작용하는 능력을 산정하는 방법에 있어서,
    C140 아고니스트의 존재하에서와 상기 후보의 존재 및 부재하에서 제 3 항 또는 제 6 항의 세포를 배양하는 단계와,
    상기 후보의 존재와 부재하에서 C140 리셉터의 활성화를 측정하여 이로써 후보의 존재하에서 상기 활성화의 감소가 후보의 길항제 활성을 가리키게 되는 단계로 이루어지는 방법.
  9. 후보물질의 C140 리셉터에 결합하는 능력을 산정하는 방법에 있어서,
    C140 아고니스트 또는 공지의 C140 길항제의 존재하에서와 상기 후보의 존재 및 부재하에서 제 3 항 또는 제 6 항의 세포를 배양하는 단계와,
    상기 후보의 존재 및 부재하에서 상기 세포의 표면에 상기 C140 아고니스트 또는 C140 길항제의 결합을 측정하여 이로써 후보의 존재하에서 상기 결합에 있어서의 감소가 후보의 리셉터를 결합하는 능력을 가리키게 되는 단계로 이루어지는 방법.
  10. C140 리셉터 단백질 또는 그것의 일부의 세포외영역과 특이적으로 면역반응성인 항체 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 영역이 리간드-결합영역이거나, 또는 활성화된 C140 리셉터와 특이적으로 면역반응성이거나, 또는 리셉터 서열 SLIGRL내의 에피토프를 인식하거나, 또는 C140 리셉터의 절단된 활성화 펩티드와 특이적으로 반응성인 것을 특징으로 하는 항체 조성물.
  12. 활성화된 C140 리셉터를 원위치에서 편재화하는 방법에 있어서,
    활성화된 C140 리셉터를 추정상 품고 있는 환자에게 상기 활성화된 리셉터에 결합하기에 효과적인 상기 활성화된 리셉터에 특이적인 항체의 양을 투여하는 단계와,
    상기 항체의 위치를 검출하는 단계로 이루어지는 방법.
  13. 포유동물 환자에서 활성화된 C140 리셉터의 존재를 검출하는 방법에 있어서,
    상기 환자의 생물학적 체액 샘플을 C140 리셉터의 절단된 활성화 펩티드의 존재, 부재 또는 양을 측정하는 검출시스템과 접촉시키는 단계와,
    상기 절단된 펩티드의 존재, 부재 또는 양을 검출하는 단계로 이루어지는 방법.
  14. 다음식으로 이루어지는, C140 리셉터를 활성화할 수 있는 아고니스트 펩티드.
    AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Z
    상기 식에서 AA1은 소형 아미노산 또는 트레오닌이며,
    AA2및 AA3는 각각 독립적으로 중성/비극성/대형/비방향족 아미노산이며,
    AA4는 소형 아미노산이며,
    AA5는 염기성 아미노산이며,
    AA6는 존재할 수도 있고 없을 수도 있으며, 존재한다면, 중성/비극성/대형/비방향족 아미노산이며,
    AA7은 AA6가 없으면 없고, AA6가 존재하면 있을 수도 있고 없을 수도 있으며, 산성 아미노산이고,
    Z는 아고니스트 활성을 방해하지 않는 치환기이다.
  15. 제 14 항에 있어서, AA1은 ser, ala, gly, thr, 또는 2,3-디아미노-프로피온(2,3-diaP)이며; 및/또는
    AA2및 AA3각각은 독립적으로 ile, val, leu, 및 Cha로 구성되는 군으로부터 선택되며; 및/또는
    AA4는 Gly 이고; 및/또는
    AA5는 Arg, Lys 또는 Har 이며; 및/또는
    Z는 OR' 또는 NR'R'로 이루어지며 여기서 각 R'는 독립적으로 H이거나 직쇄 또는 분지쇄 1-6C 알킬이며, 여기서 각 R'는 -OR', -NR'R' 및 -NR'CNR'NR'R' 로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기로 선택적으로 치환될 수도 있고 여기서 각 R'는 H 이거나 직쇄 또는 분지쇄 1-6C 알킬인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  16. 제 15 항에 있어서, AA1-AA2-AA3는 SLI, SLL, SChaI, SChaL, (2,3-diaP)LI 및 (2,3-diaP)LL로 구성되는 군으로부터 선택되며; 및/또는 Z는 1-5개 아미노산의 추가 펩티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  17. 제 14 항에 있어서, SLIGRLETQPPIT, SLIGRLETQPPI, SLIGRLETQPP, SLIGRLETQP, SLIGRLETQ, SLIGRLET, SLIGRLE, SLIGRL, SLIGR, SLLGKVDGTSHVT, SLLGKVDGTSHV, SLLGKVDGTSH, SLLGKVDGTS, SLLGKVDGT, SLLGKVDG, SLLGKVD, SLLGKV, SLLGK, S(Cha)IGR, S(Cha)LGK, (2,3-diaP)-LIGR, (2,3-diaP)LLGK, SLLGKR-NH2, SLIGRR-NH2, S(Cha)LGKK-NH2, S(Cha)IGRK-NH2, (2,3-diaP)-LIGRK-NH2, 및 (2,3-diaP)-LLGKK-NH2로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  18. 다음 식으로 이루어지는, C140 리셉터의 기능을 억제할 수 있는 펩티드.
    X-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Z
    상기 식에서 X 는 ser, ala, thr, cys, 2,3-diaP 또는 gly 이외의 아미노산 잔기이거나 데스아미노 또는 아실화된 아미노산이고,
    AA2및 AA3는 각각 독립적으로 중성/비극성/대형/비방향족 아미노산이며,
    AA4는 소형 아미노산이며,
    AA5는 염기성 아미노산이며,
    AA6는 존재할 수도 있고 없을 수도 있으며, 만일 존재한다면 중성/비극성/대형/비방향족 아미노산이며,
    AA7은 AA6가 없으면 없고, AA6가 존재하면 있을 수도 있고 없을 수도 있으며, 산성 아미노산이고,
    Z는 아고니스트 활성을 방해하지 않는 치환기이다.
  19. 제 18 항에 있어서, X 는 Mvl, Mpr, Mba, 또는 SMeMpr이며; 및/또는
    AA2및 AA3각각은 독립적으로 ile, val, leu, Nle, Nva, 시클로펜틸알라닌 및 Cha로 구성되는 군으로부터 선택되며; 및/또는
    AA4는 Gly 이고; 및/또는
    AA5는 Arg, Lys, Orn 또는 Har 이며; 및/또는
    Z는 OH 또는 그것의 에스테르 또는 염 또는 NR'R'로 이루어지며, 여기서 각 R'는 독립적으로 H 이거나 직쇄 또는 분지쇄 1-6C 알킬이며, 여기서 각 R'는 -OR', -NR'R' 및 -NR'CNR'NR'R' 로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기로 선택적으로 치환될 수도 있고 여기서 각 R'는 H 이거나 직쇄 또는 분지쇄 1-6C 알킬인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  20. 제 19 항에 있어서, AA2-AA3는 LI, LL, ChaI, 및 ChaL로 구성되는 군으로부터 선택되며; 및/또는
    Z는 1-5개 아미노산 잔기의 펩티드 연장을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  21. 제 18 항에 있어서, Mpr-LLGK, Mpr-LIGR, Mpr-(Cha)LKG, Mpr-(Cha)IGR, Mpr-LLGKK-NH2, Mpr-LIGRK-NH2, Mpr-LIGRKETQP-NH2, Mpr-LLGKKDGTS-NH2, (n-펜틸)2-N-Leu-Ile-Gly-Arg-Lys-NH2및 (Me-N-(n-펜틸)-Leu-Ile-Gly-Arg-Lys-NH2, 그리고 그것의 아미드화 또는 아실화된 형태로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  22. C140 리셉터 폴리펩티드를 코드화하거나 C140 리셉터 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 또는 RNA 분자에 상보적인 분리된 핵산분자.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 C140 리셉터는 사람 C140 리셉터인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  24. 세포에서 C140 리셉터의 발현을 저해하는 방법에 있어서, 상기 C140 리셉터의 발현을 저해하기에 충분한 양으로 C140 리셉터 코드화 DNA와 또는 C140 리셉터 코드화 DNA의 DNA 조절발현과 안티센스이거나 또는 삼중나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드 분자를 상기 세포에 제공하여, 이로써 상기 발현을 저해하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 환자에서 C140 리셉터의 발현을 저해하는 방법에 있어서, 상기 C140 리셉터의 발현을 저해하기에 충분한 양으로 C140 리셉터 코드화 DNA와 또는 C140 리셉터 코드화 DNA의 DNA 조절발현과 안티센스이거나 또는 삼중나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드 분자를 상기 환자에 투여하여, 이로써 상기 발현을 저해하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제 25 항의 올리고뉴클레오티드 분자로 이루어지는 약학조성물.
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