DE60020997T2

DE60020997T2 - Verbindungen zur Behandlung von abnormaler Glomerulusfiltration, Ductus arteriosus apertus und Osteoporose

Info

Publication number: DE60020997T2
Application number: DE60020997T
Authority: DE
Inventors: G. Krishna PERI; Sylvain Chemtob
Original assignee: Hopital Sainte Justine
Current assignee: Hopital Sainte Justine
Priority date: 1999-12-06
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2020-12-07
Also published as: AU2134001A; ATE298346T1; EP1244693B1; EP1244693A1; MXPA02005626A; ES2246915T3; WO2001042281A1; NZ520762A; DE60020997D1; AU784630B2; ZA200205795B; US7442763B2; JP2003516417A; CA2396739A1; US20030017988A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verbindungen und die Verwendung von neuen peptidischen und peptidomimetischen Antagonisten eines G-Protein-gebundenen Rezeptors bei Behandlungen, die konzentriert sind auf die Regulierung der Fluidfiltration in der Niere bei akutem Nierenversagen, Nierenerkrankung im Endstadium, Glomerulonephritis und anderen Nephropathien, auf die abnehmende Resorption und den Knochenmineralverlust, wie bei Osteoporose und Zahnkrankheiten, und zusätzlich auf den Ductus arteriosus (DA)-Verschluss bei Frühgeborenen oder tierischen Feten.
(b) Beschreibung der bisherigen Technik
Prostaglandine entstammen der Oxygenierung von Arachidonsäure durch Prostaglandin (PG)-Synthasen. Prostaglandine vermitteln eine breite Vielzahl von physiologischen Wirkungen wie Gefäßbeweglichkeit, Schlaf/Wach-Zyklus, Darmsekretion, Lipolyse, Glomerulusfiltration, Mastzellen-Degranulation, Neurotransmission, Plättchenaggregation, Leukozytolyse, Myometrium-Zusammenziehung und Entbindung, Entzündung und Arthritis, Ductus arteriosus apertus persistens, Zellwachstum und Zelldifferenzierung. Prostanoide vermitteln ihre Wirkungen über das Binden an distinkte Rezeptoren, die der Superfamilie der Rhodopsin-artigen sieben helikalen Transmembranrezeptoren angehören. Diese Rezeptoren sind an heterotrimere G-Proteine gebunden, die aus α-, β- und γ-Untereinheiten bestehen, die bei Aktivierung Veränderungen im Zellkalzium hervorrufen, die Phosphoinositid-Hydrolyse oder Promotion oder Repression der cyclischen Adenosinmonophosphat-Synthese auslösen.
Von den 5 pharmakologisch-distinkten Prostanoid-Rezeptoren für PGE₂, PGI₂, PGD₂, PGF_2α, und TxA₂ sind 4 Subtypen des PGE₂-Rezeptors beschrieben (Ichikawa, et al. 1996). Diese sind EP₁, EP₂, EP₃, das mehrere Spleiß-Varianten aufweist, und EP₄. Kloniertes Human-EP₄ (auch als Prostaglandin-E2-Rezeptor-Subtyp EP4 bekannt) ist ein 488-Aminosäure-Glycoprotein, das mit G_αs verknüpft und an der Stimulierung der Adenylatcyclase und cAMP-Synthese beteiligt ist (Abramovitz, M. et al., US-Patent-Nrn. 5,759,789 und 5,605,814). Der EP₄-Rezeptor wird auf hohem Niveau im Darm exprimiert, jedoch auf einem viel geringeren Niveau in Lunge, Niere, Thymus, Uterus und Gehirn (Bastien, Y. et al. 1994 J. Biol. Chem. 269 (16): 11873–77). EP₄ wird im Ductus arteriosus exprimiert (Bhattacharya, M. et al. 1999. Circulation 100: 1751–56). Paradoxerweise sterben EP₄-knock-out-Mäuse nach der Geburt auf Grund eines unzureichenden Verschlusses des Ductus arteriosus (Nguyen, M. et al. 1997. Nature. 390: 78–81; Segi, E. et al., 1998). Daher bleiben der Mechanismus des Ductus-Verschlusses und die Rolle von EP4 schwer erfassbar.
PGE₂ wird in der Niere reichlich produziert und ist an der Regulierung der renalen Mikrozirkulation, am Salz- und Wassertransport und an der Renin-Freisetzung beteiligt (Breyer, M. D. et al. 1998. Kidney Int. 54 (Suppl. 67): S. 88–94). Sämtliche EP-Rezeptoren haben eine regionale Verteilung in den Nierenstrukturen gezeigt (Morath, R. et al. 1999. J. Am. Soc. Nephrol. 10: 1851–60), und ihnen sind spezifischen Funktionen zugeordnet. Alle Studien über die Verteilung von EP-Rezeptoren in der Niere zeigten, dass der EP₄-Rezeptor allein in den Glomeruli exprimiert wird (Breyer, M. D. et al. 1996. Am. J. Physiol. 270: F912–918; Morath, R., 1999), allerdings wird die Gegenwart dieses Rezeptors in anderen Strukturen des Nephrons, wie im Sammel-Ductus (Breyer, M. D., et al. 1996), die Media von Nierenarterien und Vasa recta (Morath, R. et al. 1999), vielfach beschrieben. EP₄-Transcripte wurden auch in den juxtaglomerulären Körnerzellen festgestellt, was mit der PGE₂-induzierten cAMP-Synthese in diesen Zellen im Einklang steht; daher kann EP₄ auch bei der Reninsekretion eine Rolle spielen. Es wird davon ausgegangen, dass glomeruläre Prostaglandine die Filtration (Schlondoff D. et al. 1987. Kidney Int. 29: 108–19) und Reninfreisetzung beeinflussen. PGE₂ erhöht die cAMP-Spiegel in isolierten Glomeruli (Freidlander, G. et al., 1983. Mol. Cell. Endocrinol. 30: 201–214). Es wird nahe gelegt, dass der mit der cAMP-Synthese gekoppelte EP₄-Rezeptor die Glomerulusfiltration regulieren kann (Sugimoto, Y. et al., 1994), obwohl ein direkter Beweis seiner Rolle fehlt. Was besonders bedeutend ist, so gibt es in der Literatur keine Daten darüber, ob die Stimulierung oder der Antagonismus des EP₄-Rezeptors zu einer erhöhten Glomerulusfiltration führen würde, oder wie die Verbesserung der Glomerulusfiltration bei akuter Nierenerkrankung, Nierenerkrankung im Endstadium, Glomerulonephritis und diabetischer Nephropathie therapeutische Vorteile haben könnte.
Knochen durchlaufen einen kontinuierlichen Umbau, wobei die Knochenbildung von den Osteoplasten und die Knochenresorption von den Osteoklasten durchgeführt werden. Diese Prozesse werden durch mehrere humorale Faktoren, wie Paratyroidhormon, Östradiol, Vitamin D, Cytokine, Wachstumsfaktoren und Prostaglandine, gesteuert. Es ist bekannt, dass die Osteoklasteninduktion durch Interleukin-1 (IL-1) durch Aspirin-artige Arzneimittel gehemmt wird (Tai, H., et al., 1997. Endocrinology. 138: 2371–2379). PGE2-Analoge mit EP₄-Rezeptor-agonistischer Aktivität beschleunigten die Osteoklastenbildung in Cokulturen von Maus-Osteoblasten und Knochenmarkszellen, und vergleichbare Experimente unter Verwendung von Zellen aus EP₄-knock-out-Mäusen führten zu einer herabgesetzten Osteoklastenbildung, was für den EP₄-Rezeptor eine Rolle bei der Osteoklastengenese in Mäusen nahe legt (zitiert bei Narumiya, S. et al., 1999. Physio. Rev., 79: 1193–1226). Daher wird erwartet, dass EP₄-Antagonisten therapeutische Vorteile bei medizinischen Zuständen, wie Osteoporose, Zahnkrankheiten und weitere Krankheiten, wobei der Knochenverlust ein integraler Teil des Krankheitsprozesses ist, haben würden. Der Mangel an selektiven EP₄-Rezeptorantagonisten beeinträchtigte den Fortschritt auf diesem Forschungsgebiet; es ist darum eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung, einen oder mehrere dieser Mängel der Technik zu beheben.
Bereits früher wurden Peptide als ein Antimimotop (WO9718236), ein Melanom-Antigen (WO9529193), ein HLA-A2.1-Bindungspeptid (WO9734621 und WO9420127), eine Protease-Nexin-1-Variante (WO9511987), eine Tyrosin-IA-2-, GAD- und Rotavirus-VP7-Phosphatase (WO9955849), als Knochen-stimulierende Faktoren (WO9826070), als ein Antiprostatakrebs-Peptid (WO9712624), Dopamin-Rezeptorpeptid und Antipeptid-Antikörper (WO9606856) und als ein Grenzflächenpeptid (Antiviral Res. (1996), 30 (2, 3), 155–170), allerdings nicht als Antagonist des Prostaglandin-E2-Rezeptor-Subtyps EP4 beschrieben. Obgleich Antagonisten des Prostaglandin-E2-Rezeptor-Subtyps EP4 bereits offenbart wurden (WO9619233 und Prostaglandins, Leukotriens and Essential Fatty Acids, Bd. 58, Seiten 77–84), wurden es Peptide keineswegs. Wünschenswert wäre die Bereitstellung eines Prostaglandin-E2-Rezeptor-Subtyp-EP4-Rezeptor-Antagonisten, der in der Lage ist, mindestens eine funktionelle Konsequenz der Rezeptoraktivität zu hemmen.
Wünschenswert wäre die Bereitstellung eines Verfahrens zur Verwendung eines solchen Antagonisten in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung mit dem Zweck der Verbesserung der Glomerulusfiltration und/oder der Urinausscheidung eines Patienten während der Behandlung von Nierenerkrankung im Endstadium, Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie oder akutem Nierenversagen oder Ductus arteriosus (DA)-Verschluss bei frühgeborenen Patienten oder Verhinderung von weiterem Knochenverlust bei Osteoporose, Zahnkrankheit und andere medizinische Zustände, wobei der Knochenverlust ein Problem ist.
Zur weiteren Suche nach kleinmoleküligen Antagonisten des EP4-Rezeptors unter Einsatz von durchsatzstarken Screening-Möglichkeiten ist die Bereitstellung eines Biotests oder einer Packung (Kit) wünschenswert, wobei ein erfindungsgemäßer entsprechend markierter Antagonist des EP4-Rezeptors als Ligand verwendet werden könnte.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer peptidischen oder peptidomimetischen Form eines Prostaglandin-E2-Rezeptor-Subtyp-EP4 Antagonisten, der in der Lage ist, mindestens eine der funktionellen Konsequenzen der Rezeptoraktivierung zu hemmen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Verbindung, die ein Peptid der folgenden allgemeinen Formel umfasst:
Y1-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Z1
wobei Y1 an den N-Terminus des Peptids gebunden ist und ein Proton oder eine Blockierungsgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Carbamatgruppe und einer Acylgruppe, bestehend aus einem hydrophoben Anteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cyclohexyl, Phenyl, Benzyl, und kurzkettig linearen und verzweigten Alkylgruppen aus 1 bis 8 Kohlenstoffen;
R1 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Val, Ala, Ile, Gln, Leu oder Arg;
R2 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Ile, Phe, Arg oder Leu;
R3 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pro, Thr, Ser, Tyr, Leu oder Val;
R4 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Met, Ala, Gly, Ser, Val oder Ile;
R5 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Thr, Pro, Tyr, Leu, Gly oder Gln;
R6 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Val, Cys, Ile, Gly, Glu oder Ser;
R7 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pro, Val, Cys, Leu, Glu oder Asn;
R8 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ser, Leu, Thr oder Ala;
Z1 an den Carboxyterminus des Peptids gebunden und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Proton, NH₂, Arylalkylaminen und aliphatischen Aminen, die kurzkettig lineare und verzweigte Alkylgruppen von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen besitzen, und wobei das genannte Peptid ein anderes als Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr ist.
Die Erfindung betrifft auch die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine peptidische oder peptidomimetische Verbindung enthält, wobei die Verbindung in der Lage ist, mindestens eine funktionelle Konsequenz der Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyp-EP4-Aktivität zu hemmen.
Noch eine weitere Aufgabe besteht in der Offenbarung einer Verbindung, wobei die Verbindung ein Peptid mit einer Strukturformel:
Y2-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Z2
umfasst,
wobei Y2 an den N-Terminus des Peptids gebunden und ein Proton oder eine Blockierungsgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Carbamatgruppe und einer Acylgruppe, bestehend aus einem hydrophoben Anteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cyclohexyl, Phenyl, Benzyl, und kurzkettig linearen und verzweigten Alkylgruppen aus 1 bis 8 Kohlenstoffen;
AA1 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus keine Aminosäure, Ile, Leu und Phe;
AA2 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus keine Aminosäure, Leu, Ile und Phe;
AA3 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus keine Aminosäure, Ala, Ser und Thr;
AA4 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ser und Thr;
AA5 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Tyr und Phe;
AA6 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Glu, Gln, Asp und Asn;
AA7 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus keine Aminosäure, Ala, Cys, Ser und Thr;
AA8 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus keine Aminosäure, Ile, Ala, Leu und Phe;
Z2 an den Carboxyterminus des Peptids gebunden und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einen Proton, NH₂, Arylalkylaminen und aliphatischen Aminen mit kurzkettig linearen und verzweigten Alkylgruppen aus 1 bis 8 Kohlenstoffen.
Das Ziel der der Erfindung besteht auch in der Bereitstellung von Peptidomimetika, Derivate der Verbindungen, die synthetische Polypeptide sein können, wobei diese konservativen Substitutionen einzelner Aminosäuren enthalten.
Ein weiterer Gegenstand ist die Bereitstellung von Verbindungen, die in der Lage sind, die funktionellen Konsequenzen des Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps EP4 in Tests zu modulieren, wobei Zellkulturen, Gewebe und Tiere verwendet werden.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die auch Bereitstellung einer Zusammensetzung, die einen Antagonisten des Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps EP4 in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyp-EP4-Antagonisten enthält, zur Verbesserung der Glomerulusfiltration und/oder der Urinausscheidung bei einem Patienten, zur Behandlung von Nierenerkrankung im Endstadium oder von akutem Nierenversagen oder zum Verschließen des Ductus arteriosus (DA) bei frühgeborenen Patienten vorzusehen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyp-EP4-Antagonisten zur Behandlung von Osteoporose enthält, vorzusehen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Verwendung eines Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyp-EP4-Antagonisten in einem Biotest und in einer Packung (Kit) vorzusehen, die die Verwendung des Antagonisten zum Screening von Bibliotheken der Verbindungen umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 erläutert die Wirkungen von PHG213 auf die Änderungen im okulären Perfusionsdruck als Reaktion auf PGE₂;
2 erläutert die Wirkungen von PHG213 auf die Glomerulusfiltrationsrate und das Urinvolumen in gesunden Ratten;
3 erläutert die Wirkungen von PHG213 auf die Glomerulusfiltrationsrate und das Urinvolumen in diabetischen Ratten;
4 erläutert die Wirkungen von PHG213 auf den Ductus arteriosus-Durchmesser in Schaf-Feten, gemessen durch Doppler-Echokardiographie; und
5 erläutert die Wirkung von PHG213 auf die Osteoklastengenese (TRAP+ Zellen) mit menschlichen fetalen Milzzellen in Cokultur mit fixierten SAOS-2 Zellen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Prostanoid-Rezeptoren sind G-Protein-gebundene Rezeptoren, deren natürliche Liganden die Cyclooxygenase-Produkte der Arachidonsäure, eine C20:4-ungesättigte Fettsäure, sind. Es sind keine Liganden dieser Rezeptoren mit peptidischer Natur bekannt. Prostaglandin-E2 bindet viele G-Protein-gebundene Rezeptorsubtypen, wovon der Subtyp EP4 bei mehreren Pathologien von besonderer Bedeutung ist. Es stehen weder spezifische Antagonisten des EP4-Rezeptors noch eine Validierung der funktionellen Rolle dieses Rezeptors auf die Säugerphysiologie zur Verfügung.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, an solchen technischen Mängeln zu arbeiten und einen selektiven Hemmstoff des EP4-Rezeptors bereitzustellen.
Ein neuer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der peptidischen Natur der beschriebenen Antagonisten des Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps EP4. Ebenfalls bereitgestellt wird hier eine Struktur eines solchen Antagonisten und die möglichen Derivate, die die funktionellen und strukturellen Merkmale des Antagonisten in Tests, die Zellen, Gewebe und Tiere einschließen, nachstellen können, wie es der Fachwelt bekannt ist.
Darum wird eine Verbindung bereitgestellt, die ein Peptid von mindestens 8 Aminosäuren der folgenden allgemeinen Formel umfasst:
Y1-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Z1
wobei
Y1 an den N-Terminus des Peptids gebunden ist und ein Protein oder eine Blockierungsgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Carbamatgruppe und einer Acylgruppe, bestehend aus einem hydrophoben Anteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cyclohexyl, Phenyl, Benzyl, und kurzkettig linearen und verzweigten Alkylgruppen aus 1 bis 8 Kohlenstoffen, wofür Acyl und Benzoyl Beispiele sind;
R1 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Val, Ala, Ile, Gln, Leu oder Arg;
R2 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Ile, Phe, Arg oder Leu;
R3 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pro, Thr, Ser, Tyr, Leu oder Val;
R4 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Met, Ala, Gly, Ser, Val oder Ile;
R5 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Thr, Pro, Tyr, Leu, Gly oder Gln;
R6 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Val, Cys, Ile, Gly, Glu oder Ser;
R7 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pro, Val, Cys, Leu, Glu oder Asn;
R8 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ser, Leu, Thr oder Ala;
Z1 an den Carboxyterminus des Peptids gebunden und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Proton, NH₂, Arylalkylaminen, wie Benzylamin, Phenylethylamin, Phenylpropylamin und aliphatischen Aminen, die kurzkettig lineare und verzweigte Alkylgruppen aus 1 bis 8 Kohlenstoffen besitzen; und wobei das Peptid anders als Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr ist.
Zusätzlich wird auch eine Zusammensetzung offenbart, wobei die Zusammensetzung ein Peptid mit der Struktur:
Y2-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Z2
umfasst, wobei
Y2 an den N-Terminus des Peptids gebunden und ein Proton oder eine Blockierungsgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Carbamatgruppe und einer Acylgruppe, bestehend aus einem hydrophoben Anteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cyclohexyl, Phenyl, Benzyl, und kurzkettig linearen und verzweigten Alkylgruppen aus 1 bis 8 Kohlenstoffen, wofür Acetyl und Benzoyl Beispiele sind;
AA1 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus keine Aminosäure, Ile, Leu und Phe;
AA2 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus keine Aminosäure, Leu, Ile und Phe;
AA3 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus keine Aminosäure, Ala, Ser und Thr;
AA4 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ser und Thr;
AA5 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ala, Tyr und Phe;
AA6 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Glu, Gln, Asp und Asn;
AA7 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus keine Aminosäure, Ala, Cys, Ser und Thr;
AA8 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus keine Aminosäure, Ile, Ala, Leu und Phe;
Z2 an den Carboxyterminus des Peptids gebunden und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einen Proton, NH₂, Arylalkylaminen und aliphatischen Aminen mit kurzkettig linearen und verzweigten Alkylgruppen aus 1 bis 8 Kohlenstoffen.
Der Begriff "Aminosäure", wie hier verwendet, umfasst sowohl die L- als auch D-Isomere der natürlich vorkommenden Aminosäuren sowie andere Nichtprotein-Aminosäuren, die in der Peptidchemie zur Herstellung von synthetischen Analogen von Peptiden eingesetzt werden. Beispiele für natürlich vorkommende Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, etc., wohingegen nicht natürlich vorkommende Aminosäuren Norleucin, Norvalin, Cyclohexylalanin, Biphenylalanin, Homophenylalanin, Naphthylalanin, Pyridylalanin, Phenylalanine, substituiert in der ortho-, para- und meta-Position mit Alkoxy-, Halogen- oder Nitrogruppen, etc. sind. Diese Verbindungen sind in der Fachwelt der Peptidchemie bekannt.
Der Begriff "polare Aminosäure" bedeutet jede Aminosäure, die einen ungeladenen Rest enthält, aber in Wasser relativ löslich ist.
Der Begriff "hydrophobe Aminosäure" bedeutet jede Aminosäure, die eine ungeladene Seitenkette enthält, die in Wasser unlöslich ist.
Der Begriff "Patient" bezeichnet ein beliebiges Tier, insbesondere Menschen.
Zum Zwecke der Klarheit sind nachstehend die allgemein akzeptierten Bezeichnungen für die Aminosäuren angegeben:
Peptidomimetika: Aus der Technik des Drugdesigns ist es hinreichend bekannt, eine Ersatzverbindung zu benennen, die die Konformation des Peptids nachstellt, und daher seine funktionelle Aktivität reproduziert und gleichzeitig die unerwünschten Merkmale von Peptiden vermeidet, wie Biegsamkeit, Protease-Empfindlichkeit, Oxidierbarkeit der Bestandteile, Barriere-Nichtdurchgängigkeit und Größe. Eine solche Verbindung, die das Peptid nachahmt, wird als "Peptidomimetikum" bezeichnet.
Die Verfahren zum Design und zur Synthese von Peptidomimetika sind der Fachwelt gut bekannt.
Beim Design von Peptidomimetika analysieren die Fachleute die Struktur eines gegebenen Peptids, indem konservative und nicht konservative Substitutionen, Deletionen an jeder Position der Aminosäure vorgenommen werden, und korrelieren solche Änderungen mit Veränderungen in der physikalischen oder biologischen Aktivität. Beispielsweise können konservative Aminosäureänderungen an der tatsächlichen Sequenz des Peptids vorgenommen werden, die, obwohl sie die Primärsequenz des Peptids verändern, normalerweise nicht seine Funktion verändern. Konservative Aminosäure-Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen in den folgenden Gruppen:
Glycin, Alanin;
Valin, Isoleucin, Leucin;
Asparaginsäure, Glutaminsäure;
Asparagin, Glutamin;
Serin, Threonin;
Lysin, Arginin;
Phenylalanin, Tyrosin.
Modifikationen (die die Primärsequenz normalerweise nicht verändern) umfassen in vivo oder in vitro eine chemische Derivatisierung von Polypeptiden, z.B. Acetylierung oder Carboxylierung. Weitere Modifikationen umfassen das Verknüpfen mit Polyethylenglycol-Molekülen verschiedener Molekulargewichte (PEGylierung) zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit, Fettsäure-Modifikation zur Verbesserung seiner Barriere-Durchdringfähigkeit und Modifikationen durch auf Gewebe ausgerichtete Antikörper oder Polypeptide, auch kleine Moleküle sind hier mit umfasst.
Ebenfalls mit umfasst sind Polypeptide, die unter Anwendung der Peptidchemie modifiziert wurden, so dass ihr Widerstand gegenüber dem proteolytischen Abbau verbessert wird oder die Löslichkeitseigenschaften optimiert werden oder sie als therapeutische Mittel geeigneter gemacht werden. Analoge von solchen Polypeptiden umfassen diejenigen, die Reste enthalten, die anders sind als die natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, z.B. D-Aminosäuren oder nicht natürlich vorkommende synthetische Aminosäuren, wie sie den Fachleuten der peptidomimetischen Chemie bekannt sind.
Wenn nicht anderweitig angegeben, enthielten sämtliche Peptide und Peptidomimetika, die bei der Erfindung eingesetzt wurden, D-Aminosäuren.
Außerdem sind der Ersatz von Blöcken von Aminosäuren durch synthetische Gerüste, wie es im Falle der Mimetika der beta-Reihe praktiziert wird, oder die Verwendung von beta-Aminosäuren an Stelle der natürlichen Aminosäuren einige der Praktiken in der peptidomimetischen Chemie.
Peptid-Synthese: Die Synthese der bei der Erfindung beschriebenen Peptide und peptidomimetischen Verbindungen kann entweder durch eine komplette Festphasensynthese oder eine Mischtechnik, wobei das gesamte Peptid oder der größte Teil des Peptids Festphasen-synthetisiert wird und die anschließenden Additionen in Lösung vorgenommen werden können, durchgeführt werden.
Bei der herkömmlichen Peptid-Synthese werden die Aminosäuren sequenziell gekoppelt, um ein vollständiges Peptid zu erhalten. Die Aminosäuren werden mit verschiedenen Schutzgruppen, wie BOC und Fmoc, konjugiert, daher auch die Bezeichnung BOC- und Fmoc-Chemie. Informationen zum Hintergrund über die Peptid-Synthese können unter Bezugnahme auf "Solid phase peptide synthesis", Stewart & Young, W h Freeman Co. San Francisco, 1969, und Erikson und Merrifield, "The Proteins" Bd. 2 (Hrsg. Neurath & Hill), Academic Press, New York, 1976) erhalten werden.
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die einen Antagonisten eines G-Protein-gebundenen Rezeptors von Prostaglandin-E2, Subtyp EP4, in Verbindung mit einem pharmakologisch oder physiologisch oder pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Die Wahl des Trägers wird durch die spezielle Anwendung vorgegeben, für die der Antagonist eingesetzt wird.
Zahlreiche pharmazeutisch verträgliche Träger sind aus der Technik bekannt und können mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren formuliert werden.
Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in vitro kann sie in jedem beliebigen verträglichen Träger, wie physiologische Salzlösung oder jeder andere Puffer, der mit dem bestimmten Zell- oder Gewebssystem, das erforscht wird, kompatibel ist, suspendiert werden. In vitro Formulierungen sind somit für den Fachmann auf dem Gebiet der Durchführung von Liganden-Bindungstests unter Verwendung von Membranen oder ganzen Zellen, von physiologischen Experimenten unter Verwendung von Geweben schnell einsehbar.
Die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen könnte durch eine Vielzahl von Testsystemen getestet werden. Diese sind in der Literatur dokumentiert und den Fachleuten bekannt. Beispielsweise können Zellen, in denen der EP4-Rezeptor natürlicherweise exprimiert wird, wie NIH3T3, oder cDNAs, die unter Verwendung von rekombinanten Expressionsvektoren exogen exprimiert werden, zum Messen der Effizienz und Stärke des Antagonismus der hier offenbarten Verbindungen eingesetzt werden. Alternativ können Gewebe, die bekanntlich den EP4-Rezeptor exprimieren, beispielsweise die Vena saphena, die glatte Darmmuskulatur, etc. in Organbad-Tests zur Messung der Zusammenziehung/Erweiterung der Gewebefragmente oder Membranen, die von den Geweben stammen, mit radioaktiv-markierten Liganden inkubiert werden, um die Liganden-Verdrängung, GTP-Bindung und -Hydrolyse, und die Sekundärmessenger (z.B. cAMP und Inositphosphate)-Synthese zu messen. Alle diese Tests umfassen das Messen von einer oder mehreren der biochemischen und physiologischen Konsequenzen der Signaltransmission aus dem Rezeptor, wobei die Konsequenzen aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus einer GPT-Bindung und Hydrolyse durch G_α-Proteine, cyclischer Adenosinmonophosphatsynthese, Veränderungen im Zellkalzium, glatter Muskelzusammenziehung oder -erweiterung, Zellwachstum und/oder Zelldifferenzierung, veränderter Genexpression und glatter Muskelzusammenziehung oder -erweiterung.
Ein mehr physiologischer Weg zum Testen der Aktivität einer hier aufgelisteten Verbindung besteht im Einbringen der Verbindung zusammen mit einem geeigneten Träger in ein Tier unter Anwendung eines Dosisbereichs von 1 μg bis 1000 mg/kg Körpergewicht und eines geeigneten Verabreichungsweges (siehe nachstehend). Die Manipulationen der Tiere, die Verabreichungswege und die Dosierungsvorgaben sind in der Fachwelt bekannt. Beispielsweise enthält die vorliegende Erfindung die Beschreibung der Wirkungen von bestimmten an Ratten, Schweinen und Schafen getesteten Verbindungen, und die Methoden sind in den Beispielen angegeben.
Wenn ein erfindungsgemäßer Antagonist an einen Patienten, der einer Behandlung bedarf, verabreicht wird, kann er in jeder geeigneten Formulierung formuliert sein, die von einer Anzahl von Faktoren, einschließlich des bestimmten zu behandelnden Zustandes, des Alters, des Krankheits- oder Störungsgrades etc., abhängt. Die erfindungsgemäßen Hemmstoffen können einem Patienten in einer der traditionellen Weisen (z.B. oral, parenteral, transdermal oder transmukosal) in einer verzögert freisetzenden Formulierung unter Verwendung eines biologisch abbaubaren biokompatiblen Polymers oder durch Vor-Ort-Abgabe unter Verwendung von Micellen, Gelen, und Liposomen, oder rektal (z.B. durch Suppositorien oder Klistiere) oder nasal (z.B. durch ein Nasenspray) verabreicht werden. Der geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger ist den Fachleuten bekannt und hängt zum großen Teil von dem Verabreichungsweg ab. Die Formulierungen können auch diejenigen einschließen, die den Hemmstoff in die Lage versetzen, die Blut-Hirn-Schranke zu überqueren, bei einer Verabreichung auf jedem beliebigen anderen Weg. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Hemmstoffe so formuliert sein, dass auf spezielle Typen von Zellen ausgerichtet sind. Beispielsweise ist es aus der Technik bekannt, Verbindungen einzukapseln oder anderweitig zu formulieren, derart, dass sie auf spezielle Rezeptoren auf Zellen ausgerichtet sind. Solche Formulierungen umfassen Antikörper-Tagging-Formulierungen, Rezeptor-Ligand-Bindungsformulierungen, etc.
Die erfindungsgemäßen Hemmstoffe können auch auf peripherem Weg verabreicht werden, oder sie können dem Patienten systemisch verabreicht werden. "Periphere Verabreichung", wie hier verwendet, bezeichnet die Verabreichung einer Verbindung über einen beliebigen Weg, der anders ist als die direkte Verabreichung an das Gehirn. Somit umfasst die periphere Verabreichung, ist allerdings nicht beschränkt auf, die orale, nasopharyngeale, intraperitoneale, intramuskuläre und intravenöse Verabreichung einer der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Die Behandlungsvorgaben, die berücksichtigt werden, umfassen eine einzige Dosis oder eine Dosierung, die stündlich, täglich, wöchentlich oder monatlich oder jährlich verabreicht wird. Die Dosierungen können von 1 μg bis 1000 mg/kg Körpergewicht des Patienten variieren und liegen in einer zur Abgabe der Verbindung geeigneten Form vor. Der Verabreichungsweg kann auch in Abhängigkeit von der zu behandelnden Störung variieren.
Im Einklang mit der obigen Beschreibung ergibt die Verwendung einer pharmakologischen Zusammensetzung, die einen EP4-Antagonisten enthält, in Situationen, wobei die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten mit Therapiebedarf zu einem Anstieg der Glomerulusfiltration und Urinausscheidung führt. Es wird auch berücksichtigt, dass die Formulierung an Patienten, die mit akutem Nierenversagen oder Nierenerkrankung im Endstadium diagnostiziert wurden, oder bei einer Vielzahl von Glomerulopathien oder Nephropathien verabreicht werden kann.
Ebenfalls erwähnt wird, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Antagonisten des EP4-Rezeptors enthält, einem Patienten oder einem Tier verabreicht werden kann, der mit Knochenmineralverlust diagnostiziert wurde, wie bei osteoporotischen Zuständen oder Zahnkrankheit oder vielen Immun- und Krebs-verwandten Krankheiten festgestellt.
Auch die Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung, die EP4-Antagonist enthält, ist bei der vorliegenden Erfindung mit umfasst, wobei ein Bedürfnis zum Verschluss des Ductus arteriosus apertus persistens zur Vermeidung des pulmonalen Hochdrucks bei einem Frühgeborenen besteht.
Die Dosis eines EP4-Antagonisten kann 1 μg bis 1 g/kg Körpergewicht des Patienten oder Tiers bei Verabreichung auf peripherem Weg betragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass die Peptid-Antagonisten, die in der Erfindung beschrieben wurden, als Werkzeug zur Validierung der neuen Rollen des Prostaglandin-E2-Rezeptor-Subtyps EP4 in Geweben oder in ganzen Tieren verwendet werden könnte. Obwohl der EP4-Rezeptor beispielsweise bekanntlich im Glomerulus (Breyer, M. D., 1996; Morath, R., 1999) und Ductus arteriosus (Bhattacharya, M. et al., 1999) vorhanden ist, ist die exakte Funktion des Rezeptors in diesen Strukturen und in der Physiologie des Tieres nicht bekannt. Wie in der Erfindung unter Verwendung spezieller Antagonisten beschrieben, wird gezeigt, dass die Hemmung des EP4-Rezeptors die Glomerulusfiltration und die Urinausscheidung in Ratten steigert, den Ductus arteriosus in Schaf-Feten schließt und die Osteoklastengenese in menschlichen Milzzellen-Osteoblasten-Cokulturen vermindert. Durch Bereitstellung solcher spezifischer Antagonisten des Rezeptors mit oder ohne die Kenntnis des natürlichen Liganden können die Fachleute die neuen Rollen des Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps EP4 oder von anderen G-Protein-gebundenen Rezeptoren in Geweben sowie in ganzen Tieren studieren.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung des Antagonisten des EP4-Rezeptors in einem biochemischen Test zur Validierung der Funktion unbekannter Liganden, der physikalischen Identifizierung und Lokalisierung des Rezeptors in Zellen und Geweben unter Anwendung solcher Techniken, wie Autoradiographie, Radioligand-Binden, Radioszintigraphie, Positronenemissionstomographie etc.. Die speziellen Techniken variieren mit dem Test-Individuum und sind der Fachwelt gut bekannt. Darum ist erfindungsgemäß auch ein Packung eingeschlossen, die den EP4-Rezeptor-Antagonisten gebunden an verschiedene Markierer, wie Fluorochrome, Radionuclide, Immunaffinitätshaptene, Antikörper und andere Affinitätsmarkierungen, enthält.
Herstellung der Hemmstoffe und Materialien
Chemische Synthese der Peptide und Peptidomimetika:
Wir haben unter Anwendung der F-moc-Chemie und der Festphasen-Merrifield-Methode mehrere Peptide und Peptidomimetika synthetisiert. Die Reinheit dieser Peptide wurde durch HPLC und Massenspektroskopie bewertet. Die allgemeinen Verfahren werden unter Bezugnahme auf die folgenden Abhandlungen verstanden: "Solid phase peptide synthesis" Stewart & Young, W h Freeman Co. San Francisco, 1969 und Erikson und Merrifield, "The proteins" Bd. 2. (Hrsg. Neurath & Hill), Academic press, New York. 1976).
Wenn nicht anderweitig angegeben, enthielten sämtliche Peptide und Peptidomimetika D-Aminosäuren. Für die in vitro Experimente wurden die Peptide abgewogen und bei 10 mM in Dimethylsulfoxid und für die in vivo Experimente in den angegebenen Konzentrationen in steriler Salzlösung gelöst. Die Lösungen wurden frisch hergestellt und nach der Verwendung verworfen.
Expression von EP₄-cDNA in HEK293-Zellen
Die menschliche EP₄-codierende Region wurde aus Jurkat-Zellen unter Verwendung von RT-PCR amplifiziert. Kurz gesagt wurde die Gesamt-RNA aus den Jurkat-Zellen (ca. 10⁷ Zellen) unter Verwendung von Trizol^TM-Reagens (Life technologies, Burlington, ON) extrahiert. Reinheit und Menge der RNA wurden bewertet, indem die Absorption bei 260 und 280 nm bestimmt wurde. Ein Aliquot der RNA wurde unter Verwendung von Superscript II reverser Transcriptase (Life technologies, Burlington, ON) (200 U) und 100 μM Oligo(dT)_12-18 in dem Reaktionspuffer (50 mM Tris-CHl pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT) 1 h bei 42°C revers transcribiert. Ein Teil der cDNA (entsprechend 1 μg RNA) wurde durch PCR unter Verwendung von 10 μM jeweils der Primer EP4.1 (5' ATC ATG TCC ACT TCC GGG GTC 3' SEQ ID Nr: 10) und EP4.2 (5' CTA TTA TAT ACA TTT TTC TGA TAA GTT CAG 3' SEQ ID Nr: 11) und von 2 U Vent^TM Polymerase (New England Biolabs, Mississaugua, ON) in Thermopol^TM (New England Biolabs, Mississauga, ON)-Reaktionspuffer (20 mM Tris HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, 0,2 mM dNTPs und 5% DMSO) für 30 Zyklen (94°C-1 min; 55°C-1 min; 72°C-1,5 min) amplifiziert. Das DNA-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese gereinigt, durch T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und in die Hind-II-Stelle von pGEM-3 (Progema Madison, WI) durch Blunt-end-Ligation unter Anwendung molekularbiologischer Standardmethoden (Maniatis, T. et al. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Press. New York) kloniert. Die Sequenz der EP₄-cDNA wurde durch Sequenzieren bestimmt. Die EP₄-codierende Region (HindIII-XbaI-Fragment) wurde unter Erhalt des EP₄/RC-CMV-Plasmids in einen eukariotischen Expressionsvektor, pRC-CMV (Invitrogen, San Diego, CA), kloniert.
HEK293-Zellen (2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in einer 6-Well-Platte) wurden mit EP₄/RC-CMV unter Verwendung von Lipofectamine^TM (Life technologies, Burlington, ON) nach den vom Hersteller gelieferten Anweisungen transfiziert. Kurz gesagt wurden 2 μg Plasmid mit 4 μl Lipid in OPTI-MEM-Medium 30 min komplexiert, und die DNA-Lipidkomplexe wurden den Zellen zugesetzt und 6 h bei 37°C belassen. Später wurde das Medium mit DMEM ersetzt, das 10% FBS enthielt. Nach zwei Tagen wurden die Zellen auf DMEM-Medium aufgeteilt, und die Antibiotikum-resistenten Zellen wurden mit 1 mg/ml G418 (Life technologies, Burlington, ON) selektiert. Nach 10–12 Tagen der Selektion wurden die G418-resistenten Kolonien vereinigt und propagiert. Die EP₄-Rezeptorexpression in der vereinigten Population von Zellen wurde durch Radioligand-Binden und cAMP-Synthese als Reaktion auf PGE₂ bestätigt.
Die vorliegende Erfindung wird leichter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden, die zur Erläuterung der Erfindung statt zur Einschränkung ihres Umfangs angegeben sind.
Beispiel I
Basale und PGE₂-stimulierte cyclische Adenosin-Monophosphat-Spiegel als Reaktion auf PHG 213
Die basalen cAMP-Spiegel in EP₄/293-Zellen waren im Vergleich zu den ursprünglichen HEK293-Zellen in Gegenwart von Isobutylmethylxanthin (IBMX), ein Phosphodisterase-Hemmstoff, erhöht. Dies wird hauptsächlich der erhöhten basalen Aktivität von Adenylatcyclase auf Grund der Überexpression von EP₄-Rezeptor zugeschrieben. Die Effizienz der Peptid-Hemmstoffe wurde auf die basalen Spiegel von cAMP in diesen Zellen getestet.
Verfahren: EP₄/293-Zellen wurden bei 5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in 6-Well-Platten ausgesät und am nächsten Tag mit 100 μM IBMX 1 h in Gegenwart oder Abwesenheit von PHG213 (100 μM) behandelt. Das Medium wurde entfernt, und 0,3 ml Ethanol wurde zur Ausfällung des Proteins und zur Extraktion von cAMP zugesetzt. Die Protein-freien Überstände, die nach der Zentrifugation erhalten wurden, wurden lyophilisiert. Die Rückstände wurden in Bindungspuffer resuspendiert, und die cAMP-Spiegel wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Kits bestimmt.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 angegeben. Die Zellen wurden mit PHG213 (SEQ ID Nr: 1)(100 μM) in Gegenwart von 100 μM IBMX 1 h behandelt. Forskolin und PGE₂ wurden für nur 15 min zugesetzt. Die Daten sind über 4 Wiederholungen gemittelt. Tabelle 1 erläutert die Änderungen in den basalen und PGE₂-stimulierten cyclischen Adenosinmonophosphat-Spiegeln als Reaktion auf PHG213.
Tabelle 1 Wirkung von PHG213 auf die basalen cAMP-Spiegel in EP₄/293-Zellen
Die basalen cAMP-Spiegel erhöhten sich mit der Zeit in Gegenwart von IBMX in den EP₄/293-Zellen. PHG213 verminderte sehr wirksam die Akkumulation von cAMP. Die Zugabe von PGE2 (1 μM) oder Forskolin (100 μM), ein Adenylatcyclase-Aktivator, erhöhte die cAMP-Spiegel, was nahe legt, dass der aus Adenylatcyclase bestehende EP₄-Signalisierungsweg in diesen Zellen voll aktiv war. Somit ist offensichtlich, dass PHG213 ein sehr wirksamer Hemmstoff der basalen Aktivität des EP₄-Rezeptors in diesen Zellen ist.
Beispiel II
Wirkung von PHG213 und seinen peptidomimetischen Varianten auf die PGE2-induzierte Erweiterung von Vena saphena-Streifen in einem Organbadtest
Zur Erzeugung eines potenten Antagonisten wurden verschiedene Modifikationen der Sequenz von 213 (SEQ ID Nr: 1) konzipiert und unter Anwendung der Fmoc-Chemie synthetisiert. Die Peptide und Peptidomimetika wurden unter Anwendung von HPLC gereinigt. Diese umfassen 213.2: (SEQ ID Nr: 2); 213.4: (SEQ ID Nr: 3); 213.6: (SEQ ID Nr: 4); 213.7: (SEQ ID Nr: 5); 213.9: (SEQ ID Nr: 6); 213.15 (SEQ ID Nr: 7); 213.16: (SEQ ID Nr: 8); 213.17 (SEQ ID Nr: 9).
Tiere. Yorkshire-Ferkel (2–4 Tage alt) wurden bei dieser Studie nach einem Protokoll, der vom Animal Care Committee of the Research Centre of Ste-Justine Hospital genehmigt wurde, verwendet. Kurz gesagt, wurden die Tiere mit 1,5% Halothan anästhesiert, und die unteren externen Venae saphenae wurden entfernt und in kalten Krebs-Puffer (pH 7,4) der folgenden Zusammensetzung (mM): NaCl 120, KCl 4,5, CaCl₂ 2,5, MgSO₄ 1,0, NaHCO₃ 27, KH₂PO₄ 1,0, Glucose 10, wozu 1,5 U/ml Heparin zugesetzt wurden, verbracht.
Organbadtest. Die Venae saphenae wurden von Fremdgewebe gereinigt und in 4-mm-Ringe geschnitten, die in einzel ummantelte Organbäder (15 ml; Radnoti Glass, Monrovia, CA), enthaltend Krebs-Puffer und gehalten bei 37°C, verbracht wurden. Durch die Lösung wurde ein Gemisch von 95% O₂–5% CO₂ hindurch geblasen. In jedem Experiment wurden 8 Ringe verwendet (4 von jeder Vena saphena) und 60 min unter einer passiven Spannung von 2,0 g unter häufigem Waschen und Spannungseinstellung äquilibriert. Die Spannung wurde durch Kraftverschiebungstransducer gemessen und auf einem Datensammel-Computersystem unter Verwendung der Work Bench Software (beides von Kent Scientific, Litchfield, CT) aufgezeichnet.
Experimentelles Protokoll. Bei einer ersten Reihe von Experimenten wurde die relative Verteilung von erweiternden EP-Rezeptorsubtypen unter Verwendung einer Kombination von EP-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten sichergestellt. Die gefäßerweiternde Reaktion der unteren externen Venae saphenae auf PGE₂ war anscheinend das Ergebnis der Stimulation von 30% EP₂ und 70% EP₄. Die Gewebe wurden anfangs mit 2 × 10^–7 U46619 provoziert, was eine Zunahme von 1,5 bis 2 g in der Spannung auslöste. Die Ringe, die nicht reagierten, wurden verworfen. Wenn die Reaktion auf U46619 einen Gleichgewichtszustand erreichte, wurden die Mittel zugesetzt. Wurde keine Reaktion auf die Mittel festgestellt, wurde ein Zeitraum von 10 min zugegeben, um eine ordnungsgemäße Verteilung der Mittel in dem Gewebe sicherzustellen. Die Dosis-Reaktionskurven auf PGE₂ (10^–10–10^–6 M) wurden sodann in Gegenwart oder Abwesenheit jeweils der getesteten Arzneimittel erhalten.
Die Ergebnisse der Experimente wurden in Tabelle 2 nachstehend gezeigt. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von 2 bis 8 Experimenten. Die Ergebnisse sind als Umkehr in Prozent der 1 μM PGE₂-induzierten Zusammenziehung in Gegenwart von 1 μM Peptiden tabellarisch zusammengefasst. Die Peptide, die hier gezeigt sind, enthalten produktive und effektive Substitutionen des Ursprungspeptids PHG213 (SEQ ID Nr: 1).
Tabelle 2 Wirkungen von peptidomimetischen Derivaten von PHG213 auf die PGE2-induzierte Gefäßrelaxation in der Vena saphena eines Ferkels
Beispiel III
Wirkungen von PHG213 auf die okulären Perfusionsraten in einem Schweineaugen-Modell
Zum Testen der Wirksamkeit von PHG213 (SEQ ID Nr. 1) auf die EP₄-Rezeptorfunktion wurde ein ex vivo Test der Gefäßbeweglichkeit von Schweine-Chorioidea angewandt. Bereits früher wurde gezeigt, dass die erweiternde Reaktion auf PGE₂ in diesem Gefäßbett durch den EP₄-Rezeptor vermittelt wird (Abran, D. et al. 1997. Am. J. Physiol. 272: R995–1001).
Verfahren: Das Verfahren, wie ausführlich von Abran et al. (1997) beschrieben, wurde exakt befolgt. Eine Vena vorticosa aus dem Auge eines neugeborenen Schweins wurde mit einer 27er Nadel katheterisiert und mit Krebs-Lösung perfundiert, bis der Perfusionsdruck stabil war. Die Blutgefäße wurde zuerst mit einem Thromboxan-Mimetikum, U46619 (1 μM), zusammengezogen, und dann wurde PGE₂ bei 1 μM infundiert. Nachdem die Umkehr der Zusammenziehung ein Plateau erreichte, wurde PHG213 bei 100 μM infundiert, und der Perfusionsdruck wurde aufgezeichnet.
Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Positive Werte des Perfusionsdrucks geben eine Zusammenziehung an, wohingegen negative Werte eine Erweiterung der Blutgefäße angeben. PGE₂ kehrte die von U46619 hervorgerufene Zusammenziehung um. Die Perfusion von PHG213 blockierte diesen erweiternden Effekt von PGE₂ vollständig. Da bekannt ist, dass die erweiternden Wirkungen von PGE₂ vorwiegend durch den EP₄-Rezeptor in der Chorioidea des neugeborenen Schweins vermittelt werden, antagonisierte PHG213 die Wirkungen des EP₄-Rezeptors und blockierte die von diesem Rezeptor hervorgerufene Erweiterung.
Beispiel IV
Wirkungen von PHG213 auf die Glomerulusfiltrationsrate und das Urinvolumen in gesunden Ratten
Der EP₄-Rezeptor ist im Glomerulus und möglicherweise im Sammelductus lokalisiert, und wir nahmen an, dass ein EP₄-Antagonist die Glomerulusfiltrationsrate steigern kann. Zu diesem Zweck haben wir PHG213 (SEQ ID Nr: 1) an einem in vivo Rattenmodell entwickelt und getestet.
Verfahren: Erwachsene Sprague-Dawley-Ratten (ca. 250 g) wurden mit 50 mg/kg Pentobarbiton anästhesiert. Die linke Vena jugularis (zur Infusion) und die linke Arteria carotis (zum Messen des Blutdrucks) wurden katheterisiert, und ein weiterer Katheter wurde an der Spitze der Blase zum Sammeln von Urin angebracht. Die Infusion von [³H]-Inulin in Salzlösung (2 μCi/kg/h) wurde begonnen und zur Stabilisierung des Systems 2 h fortgesetzt. Die Urinsammlung betrug exakt 20 min und bei einer Marke von 10 min wurden 0,1 ml Blut in heparinisierte Röhrchen abgenommen. Das Blut wurde zentrifugiert, und die Radioaktivität im Plasma wurde gezählt. Nach 10 min und 30 min (30 min und 60 min seit dem Start der vorherigen Urinsammlung) wurde der Prozess wiederholt. Der Antagonist, PHG213, wurde in Salzlösung i.v. bei 6 μmol/kg/h 1 h vor Beginn der ersten Urinsammlung infundiert. Das Urinvolumen (UV) wird berechnet und als μl Urin/h, korrigiert um das Gewicht des Tieres, ausgedrückt. GFR wurde als Verhältnis der Urin-Inulin-Konzentration zur Plasma-Inulin-Konzentration, korrigiert um das Volumen des Urins und das Gewicht des Tieres, berechnet.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Der mittlere Blutdruck war durch das Peptid nicht signifikant verändert. Die Urinfließgeschwindigkeit (UV) erhöhte sich dramatisch um das 2,3-Fache, und die Glomerulusfiltrationsrate (GFR) erhöhte sich um 157%. Diese Änderungen in der Urinausscheidung sind Anzeichen dafür, dass der EP₄-Rezeptor-Antagonist im Glomerulus, wo er die Filtration steigerte, und auf den Sammelductus, wo er die Reabsorption hemmte, wirkt, was somit zu einer höheren Urinausscheidung führte.
Beispiel V
Wirkungen von PHG213 auf die Glomerulusfiltrationsrate und das Urinvolumen in diabetischen Ratten
Die verminderte Glomerulusfunktion ist ein Wahrzeichen für die Nierenerkrankung im Endstadium (ESRD), und Arzneimittel, die GFR verbessern, sind von ungeheurem therapeutischem Wert bei der Verzögerung der Progression der Krankheit. Um herauszufinden, ob EP₄-Antagonisten die Glomerulusfunktion steigern könnten, haben wir die Streptozotocin-induzierte diabetische Ratte als Modell verwendet.
Verfahren: Erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten (ca. 250 g) wurden i.p. Streptozotocin (45–50 mg/kg) injiziert, und 2 Tage später wurde der Urin auf Glucose und Proteinurie getestet. 2 Wochen später wurden die Ratten, die für beide Markierer positiv getestet wurden, zum Testen der Wirkung von PHG213 (SEQ ID Nr: 1) auf GFR und UV unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens ausgewählt.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Die systemische Infusion von EP4.3 steigerte gemäß seiner postulierten Hemmung der PGE₂-Wirkungen über den EP₄-Rezeptor sowohl GFR als auch UV. Der mittlere Blutdruck war bei diesen Tieren nicht signifikant verändert, was nahe legt, dass der EP₄-Rezeptor zur Blutdruckhomöostase minimal beiträgt, was ein wünschenswertes Attibut des Arzneimittels ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei diabetischen Tieren, ähnlich wie bei den gesunden Tieren, der EP₄-Rezeptor exprimiert wird und die Glomerulusfiltration reguliert.
Beispiel VI
Wirkungen von PHG213 auf den Ductus arteriosus von Schaf-Feten
Schwangere Mutterschafe (129–140 Tage Tragzeit) wurden mit Ketamin (30 mg/kg i.v.) anästhesiert, es wurde ein Kaiserschnitt durchgeführt, und der Fetus wurde entnommen. Zur Nachstellung der fetalen Atmungsbedingungen wurde der Kopf des Fetus in einen mit Salzlösung gefüllten Handschuh eingetaucht. Die Vena femoralis und jugularis wurden für die systemischen Blutdruckmessungen bzw. Arzneimittelinfusionen katheterisiert. Der Ductus arteriosus (DA)-Durchmesser wurde unter Verwendung der Doppler-Echokadiographie, wie bereits beschrieben (Teyssier, G. et al. 1989. J. Cardiovascular Technol. 8: 259–266), gemessen. Die Echokardiographie-Messungen wurden mit einem Acuson 128 XP/10C Realzeit-Ultraschall-Bildsystem unter Verwendung eines 7,5 oder 5 MHz-Transducers, dupliziert mit einem range-gate-Doppler, durchgeführt. Die Doppler-Signale wurden über ein 100-Hz-Hochpassfilter gefiltert. Der DA wurde über einen left second Intercostal-Parasternalweg sichtbar gemacht. Nach Injektion der Arzneimittel wurden Messungen des DA-Durchmessers dreimal in 5-min-Intervallen für die nächsten 20 bis 25 min wiederholt.
Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Der DA war 40 min während der Stabilisierungszeit unverändert. Innerhalb von Minuten nach Infusion von PHG213 (SEQ ID Nr: 1) (2 mg Bolus anschließend 1 mg/kg Infusion über 15 min) begann sich der DA zusammenzuziehen und setzte es noch weitere 15 min fort und war irreversibel. PHG213, ein Peptid-Antagonist des EP₄-Rezeptors, blockierte die erweiternde Wirkung des Rezeptors, der dafür verantwortlich ist, dass der Ductus im Fetus offen gehalten wird.
Beispiel VII
Wirkungen von PHG213 auf die Osteoklastengenese in Cokultur von menschlichen Milzzellen und SAOS-2-immortalisierten und fixierten menschlichen Osteoblasten
Osteoklasten heften sich an den Knochen an und führen zur Resorption oder zum Knochenverlust. Es ist von therapeutischem Vorteil, die Zunahme in der Anzahl von Osteoklasten (Osteoklasten-Differenzierung) bei Osteoporose zu hemmen, um den Knochenverlust zu verhindern. Zum Testen der Wirksamkeit von PHG213 (SEQ ID Nr: 1) auf die Osteoklasten-Differenzierung wurde ein Cokultursystem von menschlichen fetalen Milzzellen und menschlichen Osteoblasten-Zellen verwendet.
Verfahren: SAOS-2 Zellen (immortalisierte Zelllinie von menschlichen Osteoblasten) wurden 4 Tage lang in 24-Well-Platten in alpha-MEM-Medium, enthaltend 10% fetales Kälberserum, Vitamin D3 (10^–7), wachsen gelassen. Die confluenten SAOS-2 Zellen wurden in 1% Paraformaldehyd M) und Dexamethason (10^–8 M) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) 8 min fixiert. Die Zellen wurden 4 Mal mit PBS gespült, und alpha-MEM, enthaltend 10% fetales Kälberserum und Vitamin D3 (10^–7 M), wurde zugesetzt.
Zwei Tage zuvor wurde die Milz menschlicher Aborte zu kleinen Stücken geschnitten und mehrere Male verrieben, um die Zellen freizusetzen. Die Milzzellen wurden in alpha-MEM, enthaltend 10% fetales Kälberserum, 2 Tage kultiviert. Die Milzzellen wurden trypsinisiert, einmal in PBS gespült und unter Verwendung eines Coulter-Zählers gezählt. Ein Aliquot von Milzzellen (10⁵ Zellen/Vertiefung) wurde über die Monoschicht von 2 h fixierten SAOs-2 Zellen aufgebracht, wonach PHG213 (100 μM) zugesetzt wurde. Drei Tage später wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert, mit Wasser gespült, und die Tatrat-resistente alkalische Phosphatase (TRAP) wurde unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Sigma, St. Louis, MO) angefärbt. TRAP-positive Zellen wurden unter einem Mikroskop sichtbar gemacht und gezählt.
Die Ergebnisse der Experimente wurden in 5 gezeigt. Die Daten sind ein Durchschnitt aus mehreren Experimenten (n = 10). Die Zugabe von PHG213 verminderte die Anzahl von TRAP-positiven Zellen (Osteoklasten) um die Hälfte bei diesem menschlichen Zell-Cokultur-System. Dies ist das erste Mal, dass ein spezifischer Hemmstoff des menschlichen EP₄-Rezeptors, PHG213, die Differenzierung von Progenitorzellen in der Milz, um zu Osteoklasten zu werden, verhinderte. Somit besitzt die Hemmung des EP₄-Rezeptors eine potentielle Anwendung bei der Behandlung der Osteoporose, die durch einen durch Osteoklasten vermittelten übermäßigen Knochenverlust gekennzeichnet ist.
Obgleich die Erfindung in Verbindung mit speziellen Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, dass weitere Modifikationen möglich sind, und diese Anmeldung soll sämtliche Variationen, Anwendungen oder Anpassungen der Erfindung, die im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen, und einschließlich solcher Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, wie sie bekannte oder übliche Praxis in der Technik sind, auf die sich die Erfindung erstreckt, und wie sie auf die wesentlichen Merkmale, die hier zuvor ausgeführt wurden, zutreffen kann, und wie es aus dem Umfang der beigefügten Ansprüche folgt, abdecken.
SEQUENZLISTUNG

Claims

Peptid der folgenden Formel: Y1-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Z1, wobei Y1 an den N-Terminus des Peptids gebunden und ein Proton oder eine Blockierungsgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Carbamatgruppe und einer Acrylgruppe, bestehend aus einem hydrophoben Anteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cyclohexyl, Phenyl, Benzyl und kurzkettig linearen und verzweigten Alkylgruppen aus 1–8 Kohlenstoffen; R1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Val, Ala, Ile, Gln, Leu und Arg; R2 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Ile, Phe, Arg und Leu; R3 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pro, Thr, Ser, Tyr, Leu und Val; R4 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Met, Ala, Gly, Ser, Val und Ile; R5 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Thr, Pro, Tyr, Leu, Gly und Gln; R6 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Val, Cys, Ile, Gly, Glu und Ser; R7 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pro, Val, Cys, Leu, Glu und Asn; R8 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ser, Leu, Thr und Ala; Z1 an den Carboxy-Terminus des Peptids gebunden und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Proton, NH₂, Arylakylaminen und aliphatischen Aminen, die kurzkettig lineare und verzweigte Alkylgruppen von 1 bis 8 Kohlenstoffen besitzen und wobei das genannte Peptid ein anderes als Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr ist.
Peptid der folgenden Formel: Y2-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Z2, wobei Y2 an den N-Terminus des Peptids gebunden und ein Proton oder eine Blockierungsgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Carbamatgruppe und einer Acylgruppe, bestehend aus einem hydrophoben Anteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cyclohexyl, Phenyl, Benzyl und kurzkettig linearen und verzweigten Alkylgruppen aus 1–8 Kohlenstoffen; AA1 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus keine Aminosäure, Ile, Leu und Phe; AA2 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus keine Aminosäure, Leu, Ile und Phe; AA3 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus keine Aminosäure, Ala, Ser und Thr; AA4 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ser und Thr; AA5 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Tyr und Phe; AA6 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glu, Gln, Asp und Asn; AA7 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus keine Aminosäure, Ala, Cys, Ser und Thr; AA8 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus keine Aminosäure, Ile, Ala, Leu und Phe; Z2 an den Carboxy-Terminus des Peptids gebunden und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Proton, NH₂, Arylalkylaminen und aliphatischen Aminen mit kurzkettig linearen und verzweigten Alkylgruppen von 1 bis 8 Kohlenstoffen.
Peptid nach Anspruch 2, wobei das genannte Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus IFTSYECL (SEQ ID NR: 1); IFASYECL (SEQ ID NR: 2); IFTSAECL (SEQ ID NR: 3); IFTSYEAL (SEQ ID NR: 4); ILASYECL (SEQ ID NR: 5); IFTSYDCL (SEQ ID NR: 6); (4-Biphenylalanin) TSYEAL (SEQ ID NR: 7); (Diphenylalanin) TSYEAL (SEQ ID NR: 8); und (Homophenylalanin) TSYEAL (SEQ ID NR: 9).
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das genannte Peptid eine oder mehrere D-Aminosäuren umfasst.
Peptid nach Anspruch 4, wobei das genannte Peptid alle D-Aminosäuren umfasst.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das genannte Peptid in der Lage ist, eine oder mehrere biochemische und/oder physiologische Konsequenzen der Signaltransmission des Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps EP4, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einer GTP-Bindung und Hydrolyse durch Gα-Proteine, cyclischen Adenosinmonophosphatsynthese, Veränderungen im Zellkalzium, glatter Muskelzusammenziehung oder -erweiterung, Zellwachstum, veränderter Genexpression, Glomerulusfiltration und Urinausscheidung, zu hemmen.
Verbindung, umfassend eine peptidomimetische oder modifizierte Version des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung nach Anspruch 7 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die genannte Zusammensetzung für die Verabreichung an einen Patienten auf peripherem Wege zu einer Dosis von etwa 1 μg bis etwa 1000 mg/kg Körpergewicht formuliert ist, wobei der genannte Patient mit reduzierter Glomerulusfiltration und/oder Urinausscheidung diagnostiziert worden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die genannte Zusammensetzung für die Verabreichung an einen Patienten auf peripherem Wege zu einer Dosis von etwa 1 μg bis etwa 1000 mg/kg Körpergewicht formuliert ist, wobei der genannte Patient mit Nierenerkrankung im Endstadium oder akutem Nierenversagen diagnostiziert worden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die genannte Zusammensetzung für die Verabreichung an einen Patienten auf peripherem Wege zu einer Dosis von etwa 1 μg bis etwa 1000 mg/kg Körpergewicht formuliert ist, wobei der genannte Patient mit Ductus arteriosus apertus persistens diagnostiziert worden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die genannte Zusammensetzung für die Verabreichung an einen Patienten auf peripherem Wege zu einer Dosis von etwa 1 μg bis etwa 1000 mg/kg Körpergewicht formuliert ist, wobei der genannte Patient mit Knochenmineralverlust diagnostiziert worden ist.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als ein Medikament.
Verbindung nach Anspruch 7 zur Verwendung als ein Medikament.
Peptid nach Anspruch 14 oder Verbindung nach Anspruch 15, wobei das genannte Medikament zur Verbesserung der Glomerulusfiltration und/oder Urinausscheidung vorgesehen ist.
Peptid nach Anspruch 14 oder Verbindung nach Anspruch 15, wobei das genannte Medikament zur Behandlung von Nierenkrankheit im Endstadium oder akutem Nierenversagen vorgesehen ist.
Peptid nach Anspruch 14 oder Verbindung nach Anspruch 15, wobei das genannte Medikament zur Behandlung von Ductus arteriosus apertus persistens vorgesehen ist.
Peptid nach Anspruch 14 oder Verbindung nach Anspruch 15, wobei das genannte Medikament zur Vorbeugung gegen Knochenmineralverlust vorgesehen ist.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur therapeutischen Behandlung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Verbesserung der Glomerulusfiltration und/oder Urinausscheidung, der Behandlung von Nierenkrankheit im Endstadium oder akutem Nierenversagen, der Behandlung von Ductus arteriosus apertus persistens und der Vorbeugung gegen Knochenmineralverlust.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Medikaments zur therapeutischen Behandlung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Verbesserung der Glomerulusfiltration und/oder Urinausscheidung, der Behandlung von Nierenkrankheit im Endstadium oder akutem Nierenversagen, der Behandlung von Ductus arteriosus apertus persistens und der Vorbeugung gegen Knochenmineralverlust.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als ein Hemmstoff für eine oder mehrere biochemische und/oder physiologische Konsequenzen der Signaltransmission des Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps EP4, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einer GTP-Bindung und Hydrolyse durch Gα-Proteine, cyclischer Adenosinmonophosphatsynthese, Veränderungen im Zellkalzium, glatter Muskelzusammenziehung oder -erweiterung, Zellwachstum, veränderter Genexpression, Glomerulusfiltration und Urinausscheidung.
Verbindung nach Anspruch 7 zur Verwendung als ein Hemmstoff für eine oder mehrere biochemische und/oder physiologische Konsequenzen der Signaltransmission des Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps EP4, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einer GTP-Bindung und Hydrolyse durch Gα-Proteine, cyclischer Adenosinmonophosphatsynthese, Veränderungen im Zellkalzium, glatter Muskelzusammenziehung oder -erweiterung, Zellwachstum, veränderter Genexpression, Glomerulusfiltration und Urinausscheidung.
Verfahren zur Identifizierung eines Antagonisten eines Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps EP4, wobei das genannte Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst: (a) dem natürlichen oder rekombinanten Kontaktieren eines Zellen oder Gewebe exprimierenden Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps E4 mit dem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder mit der Verbindung nach Anspruch 7 in Anwesenheit oder Abwesenheit einer bekannten Konzentration eines Agonisten des genannten Rezeptors und (b) dem Messen einer oder mehrerer biochemischen und/oder physiologischen Konsequenzen der Signaltransmission des genannten Rezeptors, wobei die genannten biochemischen und/oder physiologischen Konsequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: einer GTP-Bindung und Hydrolyse durch Gα-Proteine, cyclischer Adenosinmonophosphatsynthese, Veränderungen im Zellkalzium, glatter Muskelzusammenziehung oder -erweiterung, Zellwachstum, Zelldifferenzierung und veränderter Genexpression, wobei ein Abfall der gemessenen biochemischen und/oder physiologischen Konsequenzen im Vergleich zu einer Kontrollzelle und/oder einem Kontrollgewebe darauf hindeutet, dass das genannte Peptid ein Antagonist eines Prostaglanding-E2-Rezeptorsubtyps EP4 ist.
Verfahren zur Validierung der Aktivität eines Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps EP4, wobei das genannte Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst: (a) dem natürlichen oder rekombinanten Kontaktieren eines Zellen oder Gewebe exprimierenden Prostaglandin-E2-Rezeptorsubtyps E4 mit dem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder mit der Verbindung nach Anspruch 7 in Anwesenheit oder Abwesenheit einer bekannten Konzentration eines Agonisten des genannten Rezeptors und (b) dem Messen einer oder mehrerer biochemischen und/oder physiologischen Konsequenzen der Signaltransmission des genannten Rezeptors, wobei die genannten biochemischen und/oder physiologischen Konsequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: Einer GTP-Bindung und Hydrolyse durch Gα-Proteine, cyclischer Adenosinmonophosphatsynthese, Veränderungen im Zellkalzium, glatter Muskelzusammenziehung oder -erweiterung, Zellwachstum, Zelldifferenzierung und veränderter Genexpression, wobei eine Veränderung der gemessenen biochemischen und/oder physiologischen Konsequenzen im Vergleich zu einer Kontrollzelle und/oder einem Kontrollgewebe auf die Aktivität des genannten Rezeptors hindeutet.
Packung, die folgendes umfasst: (a) das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder die Verbindung nach Anspruch 7 und wahlweise (b) Gebrauchsanleitungen.
Packung nach Anspruch 26, wobei das genannte Peptid oder die genannte Verbindung mit einem nachweisbaren Markierer versehen ist.
Packung nach Anspruch 26, wobei der genannte Markierer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Fluorochromen, Radionukliden, Immunaffinitätshaptenen, Antikörpern sowie anderen Affinitätsmarkierungen.