JPH04504106A - 表面レセプター活性のクラスｉｍｈｃ調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 表面レセプター活性のクラスＩＭＨＣ８ｌｉ節艮歪分！ 本発明の分野は表面膜応答の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）に関する。

１五 主要組織適合複合体（＋ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｓｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　 ｃｏｍｐｌｅｘ。

ＭＨＣ）クラス１抗原は検査した実質的にすべてのタイプのを椎動物細胞上に発 現する。これらの高多形性トランスメンプラン糖たん０賞は短い細胞質Ｃ末端尾 部、トランスメンブラン領域、および３つのドメインα１、α２およびα３を含 む細胞外Ｎ末端配列とからなる４５ＫＤＯ長饋を有する。α１−およびαオード メインは免疫学的多形質すべてを含み、膜基部α、は１２ＫＤβ８ミクログロブ リンと非共有的に会合している。

ＭＨＣクラス１抗原は、種々の多形ＭＨＣ１１１抗原、即ち、Ｈ−２に、−Ｄま たは−Ｌ（マウス）あるいはＨＬＡ−Ａ、−Ｂまたは−Ｃ（ヒト）の優先的利用 を含む細胞障害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）のターゲット細胞の作用項目（レパー トリ−）の制限において、例えば、ウィルス悪染細胞の乾乾において本質的な役 割を果す、殆んどの場合、注目はＴ細胞活性の制限におけるＭＨＣクラス１抗原 の役割に向けられている。しかしながら、鳥人かの著者は以下に述べる上記抗原 のより広範な役割を示唆している。

閏」し１跋 ＭＨＣクラス１抗原の生物学的機能の再検討には、０ｈｎｏ＋　ｒｍｍ−ｕｎｏ ｌ　Ｒｅｖ、　（１９７？）　主１：　５９−６９　；およびＳｉｓ＋ｏｎｓｅ ｎ＋Ｐｒｏ　ＡＩｔｅｒ　（１９８５）■：１５１−１７６を参照されたい、イ ンシュリンレセプターの説明については、Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ＋」工注、Ｃ ｈｅｍ　（１９７２）　１」ＬＬ：　１９８０−１９９１　；Ｋａｓｕｇａ等、 −」旦、（１９８２）１エユ：　１０３９２−１０３９９　；　にａｓｕｇａ等 、１ｂｉｄ、（１９８３）　主ｉ工：　１０９７３−１０９８０を参照されたい 、クラス１抗原とインシュリンレセプターが相互作用する示唆については、０１ ｓｓｏｎ、　Ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｆｕｓｉｏｎ：　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　 ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒ−ニ（１９８３）１３４Ｄ：８５−９２を参照された い。レセプターｍＲＮＡ内の制限領域の逆相補体をリガンドＤＮＡ配列内で同定 しているレセプターとその特異的リガンド間の関係はＢｏｓ　を等、−敗旦り一 勤ユＬ−ム徂し−シュエ」Ｌ旦」ヨ（１９８４）８２：上１１主？　・”　Ｂｏ ｓｔ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

（１９８５）　１ＪＬＪＬ：　１３７３−１３８０において記載されている。Ｍ ＨＣ産生物とインシュリンレセプター間の反応を支持する他の証拠は、Ｆｅｂｌ ｎ＋ａｎ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８ ５）　ＪＬＪＬ：　８６３４−８６３７　；Ｐｈ１ｌｉｐｓ等、皿。

（１９８６）■：３４７４　３４７８；　Ｄｕｅ等、１ｂｉｄ、　（１９８６） ８３：６００７−６０１１；およびＳａｌｗｓｏｎ等、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｕ −（１９８６）上主ユ１２９３−２２９８において見い出し得る。

ある種のクラス１産生物と特定の腫瘍の転移増強間の相関に関する示唆は−ａｌ ｌｉｃｈ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）ｉユｊ：３０１−３０５；Ｋａｔｚａｖ 等、Ｔｎｔ、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ（１９８４）　１エ：４７−４１５；０１ｓｓ ｏｎ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｖ、（１９８６）　３　：　９１　１１４　；およ びＧｏｏｄｅｎｅ−等、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　１ユ■：　７７７−７ ８３において見い出し得る。

生玉生血旦 細胞表面レセプターの活性を調節するための方法および組成物が提供される。こ れらの方法はＭＨＣクラス１抗原の細胞産生物の上方または下方調整を用いるか あるいは細胞レセプターまたはＭＨＣクラス１抗原に非共有的に結合してＭＨＣ クラス１抗原と細胞レセプター間の複合体化に影響を与えるかクラス１抗原の作 用を模倣するアゴニストまたはアンタゴニスト物質を用いる。これらの方法およ び組成物は診断および治療に用い得る。

の　雪　の− 細胞表面レセプターの応答を細胞表面レセプターとＭＨＣクラス１抗原間の反応 を変化させることよって調整する方法および組成物が提供される。その変形は表 面でのクラス１抗原産生または濃度の上方または下方調整の結果としてあり得、 アゴニストまたはアンタゴニストを用いてクラス１抗原のレセプターへの非共有 結合を模倣するかあるいはそのような結合を抑制し得る。クラス１抗原−レセプ ター反応の調節は細胞膜レセプターに伴う広範囲の状態を診断し治療するのに使 用できる。

ヒトＭＨＣクラスｌ抗原はＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｑ、およびＴ１である。細胞レ セプターの調節において特に興味あるのはＨＬＡ−Ｂおよび一〇抗原とりわけα １およびα２　ドメインであり、さらにもっと興味あるのはα１−ドメインであ る。α、およびα２の多形質類域中に含まれ、アミノ酸５０からアミノ酸９０特 にアミノ酸５５から９０　（通常は６０から９０特に６５から９０）またはアミ ノ酸９０から１２０特に９０から１１６の範囲にあるアミノ酸配列は特に興味が ある。これら興味あるアミノ酸配列は通常α１　ドメインのＣ末端およびα２　 ドメインのＮ末端中にある。領域６０〜８５、特に、６５〜８５または７０〜８ ５は特に興味あることが見い出されている。

８３から８５のアミノ酸は特に有意であり得ることが見い出されている。ＭＨＣ クラスＩＤおよびＫの両方またはアナログＨＬＡ−ＢまたはＣにおいては、該配 列はＲＹＹである。特に興味あるペプチドはこの配列を含むであろうしまた配列 のいずれかの側に少なくとも約２０個、通常は少なくとも約１５個好ましくは約 １０個以下のアミノ酸を含み得、好ましくはＮ−末端側で少なくとも５個のアミ ノ酸を有し、より好ましくはＣ末端側では約５個以上のアミノ酸を有しない。２ 個のチロシンの存在はインシュリンレセプターにおいて特に望ましい。

望ましいのは、アミノ酸の総数は上記の配列において２０個を越えないこと、好 ましくは約１８個を越えないことより好ましくは約１５個を越えないことである 。

また、およそアミノ酸３０〜アミノｆｌＩ４５特に３２〜４０の領域、特に、少 なくとも４個のアミノ酸より通常は少なくとも約６個のアミノ酸好ましくは少な くとも約８個のアミノ酸のオリゴペプチドであってその配列が１個の中性アミノ 酸特に少なくとも５個の炭素原子の中性アミノ酸で分離された酸性アミノ酸と塩 基性アミノ酸を含む４量体を含み、酸性または塩基性アミノ酸の１つが中性アミ ノ酸により隣接されているものも興味がある。介在中性アミノ酸が芳香族または 脂肪族炭化水素アミノ酸、例えば、グリシンまたはフェニルアラニンである場合 特に興味ある。

多数の表面膜たん白質は信号の形質導入によって含まれ、広範囲のリガンド用の レセプターとして機能する。殆んどの場合、レセプターはそのレセプターを形質 導入のために活性化するリガンドによって限定されるか、またはリガンドをエン ドサイト−シスするように作用する。これらのレセプターには内分泌、バラ分泌 および自己分泌系のレセプター、アドレナリン系レセプター、リポプロティンレ セプター、オピエートレセプター、およびステロイドレセプターがある。これら のレセプターには、アシアログリコプロティン、インシュリン、ソマトスタチン 、ソマトトロピン；成長ホルモン、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因 子、表皮増殖因子、α−形質転換性増殖因子、神経成長因子、繊維芽細胞増殖因 子、ソマトメジン、バソプレッシン、プロスタグランジン、好酸球走化性因子、 アセチルコリン、チロキシン（Ｔ　Ｓ　Ｈ）、エピネフリンのような成長因子； トンドルフィン、エンケファリンおよびグイノルフィン；ニューロテンシン、オ キシトシン、トランスフェリン、物質ｐｓ　１−．２−．３−および４−等のリ ンホカイン；　ＧＭ−ＣＦＳ、Ｍ−ＣＦＳ、Ｅ−ＣＦＳ等のコロニー刺激因子； 低密度リボたん白質のようなリボたん白質；エストロゲン、アンドロゲン、グル ココルチコイド、コルチコステロイド等のストロイドの各々用の表面たん白質レ セプターがある。特に興味あるのは細胞質中に環化され、即ち、インターナイゼ ーシッンされ次いでプラズマ膜表面に戻されるレセプターである。これらのレセ プターの例にはインシュリン、ＥＧＦＳＬＤＬ、）ランスフェリン、インターロ イキンおよびアシアログリコプロティン用のレセプターがある。

ＭＨＣクラス１抗原活性化の調節は種々の方法で達成できる。

表面でのＭＨＣ抗原分子の数はクラス１抗原産生を活性化または抑制する化合物 を用いることによって増減することができる。これらの化合物にはインターフェ ロン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　、テトラデシルホルビルアセテ−１ −（ＴＰＡ）　、およびレチノイン酸がある。また、クラス１抗原とレセプター 間の反応を抑制するα１−またはα２　ドメイン特にα１−ドメインに対する抗 体を用いることによっても複合体形成を調節できる。ポリクローナルまたはモノ クローナル抗体、特にモノクローナル抗体も使用できる。また、抗イデオタイブ 抗体産生用の免疫原として用いるα、−ドメインに対して特異的なモノクローナ ル抗体も使用でき、上記抗イデオタイブ抗体はモノクローナル抗体が結合するク ラスｌ抗原エピトープのコンホメーシツンを模倣するであろう。即ち、抗イデオ タイブは代替クラス１抗原として機能し得かつ自己免疫をブロックするよう作用 し得る。全抗体を用いる必要はなく、可変領域、またはＦａｂまたはＦ（ａｂ’ ）ｚ、Ｆａｂ’等のような大きいフラグメントで十分である。

抗体は通常の方法に従って調製し得る。特に、クラス１抗原を免疫原として用い 、適当な宿主を利にはマウスに注入して免疫応答を開始させ得る。１回以上のブ ースター注入を２週間またはそれ以上の間隔で用い得る。最後の注入の２〜３日 後に、動物宿主を殺し、ひ臓を単離し、Ｂリンパ球を不死化させ得る。不死化、 有利にはミエローマ細胞と融合させ、次いで、ハイブリドーマを選定し、限定希 釈条件下で所望の特性を有する抗体を産生ずる／’ｔイブリドーマをスクリーニ ングするには種々の方法が存在する。

即ち、現状においては、クラス１抗原をスクリーニングに使用でき、抗イデオタ イプの場合には、興味あるドメインに対する抗体を用い得る。

抗体を用いる代りに、レセプターとの結合におけるクラス１抗原の部位またはク ラス１抗原に結合するレセプターの部位を模倣し得るオリゴペプチドを使用でき る。即ち、クラス１抗原の結合ドメインまたはその活性フラグメントの配列と実 質的に一致する配列を有するオリゴペプチドを調製することにより、クラス１抗 原の存在を、このオリゴペプチドの使用によりレセプターの活性化に置換え得る 。配列の修正により、例えば、通常１〜３個、より普通には１〜２個のアミノ酸 が含まれる配列の置換、欠落または挿入により、上記ペプチドのレセプターに対 する改良された結合性を得ることができる。

非維持性置換（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖａ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ）とは極性および／またはサイズに関して実質的に異なる置換を意味し、次の表 の各列は何が維持性の置換かを示している。

ｌ−一人 中性 脂肪族 非極性 極性 オキシまたはチオ　Ｓ、Ｔ、Ｃ，Ｍ アミド　Ｎ・Ｑ 芳香族　Ｆ、　Ｗ、　Ｈ，Ｙ 荷電型 酸性　Ｄ、　Ｅ 塩基性　Ｋ、　Ｒ （）はそのアミノ酸を同じ列の他のアミノ酸の置換物としては通常使用しないで あろうことを示す。

レセプターに結合する上記ペプチドはレセプター活性を向上させることが見い出 された。理論に拘束することは望まないけれども、上記ペプチドはレセプターの 中和を抑制することによって含まれるようである。この方法において、リガンド −レセプター複合体の寿命を延長させ、リガンドのレセプターへの結合の結果と して向上した活性を観察する。さらに、結合アフィニテイを改善し得るアロステ リンク効果、ペプチドがレセプターの活性化をもたらして信号の細胞質への形質 導入を与えるような活性化効果、または結果の総計がレセプターに結合するペプ チドまたはＭＨＣの不存在に比して高められた効果であるような他の効果のよう な上記ペプチドの上記以外の効果も存在し得る。

種々の病状において、疾患は表面での特定のレセプターの存在の減少またはリガ ンドに対する低いアフィニティーの結果である。

この状況において、クラス１ＭＭＣ抗原の濃度を減少させるかあるいはレセプタ ーの活性化を可能にする適切な濃度で上記ペプチドを用いる。糖尿病、グレーゲ ス病、関節炎、強直性を椎炎、ライチル病、疼痛、無痛覚症、ウィルス疾患等の 症状は不適切なレセプター応答に伴い得る。

一方、他の状況においては、レセプター応答を消失させたい場合、レセプター結 合性を下方調整することを所望し得る。そのような病状の例は新形成、関節炎、 紅斑性狼癒等であり、増殖を促進する増殖因子または他の分泌型因子に対する応 答または他の望ましくない応答を低減することが望ましい、この場合、ターゲッ ト細胞を表面でのクラス１抗原の個体群を増大させ薬物で処理できるであろう。

本発明のペプチドはレセプターの１つの活性に異なる活性と別個に影響を与える ６例えば、インシュリンレセプターにおいては、グルコース取込みは促進される けれども、チロシンキナーゼ活性は消失する。即ち、本発明のペプチドは複数の 活性を有するレセプターを選択的に修正し得る。

表面でのＭＨＣクラスｌ抗原個体群を変化させる代りに、レセプターと複合体化 するクラス１抗原の有効濃度を低減し得る。表面でのかつ適切な状況でのウィル ス感染減損クラスｌ抗原もこの目的に使用できることに注目されたい、前述した ように、クラス１抗原減損（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）はまた複合化部位またはその 近くでクラス１抗原に結合してレセプターとの複合体化を抑制するかまたは複合 化部位またはその近くでレセプターと結合してクラス１抗原との複合体化を抑制 する抗体またはオリゴペプチドを用いて達成できる。これらの化合物は特にクラ ス１抗原、とりわけ、ＨＬＡ−Ｂまたは−Ｃ抗原（マウスＨ−２ＬまたはＤ）中 のα１−ドメイン中の多形質配列に匹敵する配列を用いて調製できる。

特に興味あるのは下記の配列の１つの少な（とも１部を含むオリゴペプチドであ り、これらのオリゴペプチドは活性配列として、少なくとも６個のアミノ酸、通 常は少なくとも８個のアミノ酸、より普通には少なくとも１２個のアミノ酸でか つ４０個以下のアミノ酸通常は３０個以下のアミノ酸より好ましくは２５個以下 のアミノ酸を含み、好ましくは、約８〜約２５個のアミノ酸、より好ましくは約 ８〜２０個のアミノ酸を含む、５個までより通常は約３個までの置換または欠落 を上記の配列中でなし得、その変化は活性配列中のアミノ酸の数の約２０数量％ 以下通常は約１０数量％以下であろうことを理解されたい、また、下記の配列は 連続的にあるいは約２０個以下のアミノ酸より通常は約１０個以下のアミノ酸の ブリッジにより一緒に結合させ得る。さらにまた、配列がオーバーランプする場 合、オーバーランピング配列は繰返さないでむしろ非オーバーラッピング配列を 適切な配列で結合することが望まれる。

上記オリゴペプチドは下記の配列中に含まれる配列と同じまたは実質的に同じで ある少なくとも６個のアミノ酸を有するであろう。

１、Ｄ　Ｔａａ”　Ｆ　Ｖ　ＲＦ　Ｄ　Ｓ　Ｄａａ”ａａ”２、　Ｆ　Ｖ　ＲＦ 　Ｄ　Ｓ　Ｄａａ”ａａ”　Ｓ　Ｐ　Ｒａａ”３．　Ｗａａ”ＥＱａａ”ａａ” Ｇ　Ｐ　ＥＹＷ４、Ｗａａ”ａａ″″ａａｔｈ３Ｔａａ”ａａ”ａａｈ１Ｋａａ ｈ９ａａ”ａａ”Ｑ５、Ｗａａ”ａａ”ａａ”ａａ”ａａ”ａａｈｈａａ”Ｋａ ａ’″ａａ７０ａａ７Ｉａａ７２ａａ７３ａａ　ａａ　ａａ　ａａ　ａａ　ａａ 　ａａ　ａａ　ａａ　ａａ　ａａ　ａａ６、　ＥＱａａ”ａａ”ＲＶａａ”ａａ ”Ｒａａ”ａａ”ａａ”ＲＹＹ上記上記各台いて、 ａａ３ｚは４〜６個の炭素原子の任意の中性脂肪族アミノ酸、特に、Ｎ、　Ｑ、 　Ｖ、Ｉ、またはしてあり、とりわけ、ＱまたはＬであり；ａ　ａ　４６は２〜 ５個通常２〜４個の炭素原子の荷電型または非荷電型の通常非極性または酸性の 脂肪族アミノ酸、特に、Ｇ、Ａ、Ｐ。

ＤまたはＥであり、とりわけ、ＡまたはＤであり；ａ　ａ　４１は２〜５個通常 ３〜５個の炭素原子の荷電型または非荷電型の脂肪族アミノ酸、特に、Ｇ、　Ａ 、Ｐ、Ｓ、　Ｔ、　ＤまたはＥであり、とりわけ、Ａ、ＴまたはＥであり；ａ　 ａ　４４はＰ、　ＮまたはＱ、特に、ＰまたはＱであり；ａ　ａ　４５は任意の 脂肪族アミノ酸、特に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｋ。

ＲまたはＥであり、とりわけ、Ｇ、　ＥまたはＫであり；ａ　ａ　Ｓ　２は４〜 ６個の炭素原子の中性脂肪族アミノ酸、特に、■。

１、Ｌ、またはＭであり、とりわけ、■またはＩであり；ａ　ａ　５　Ｓは任意 の荷電型アミノ酸、特に、Ｋ、Ｒ，ＤまたはＥであり、とりわけ、ＫまたはＥで あり； ａ　ａ　Ｓ　＆は荷電型アミノ酸特にり、　Ｅ、ＫまたはＲであり、とりわけ、 ＥまたはＫであり； ａ　ａ　＆　＋はＤまたはＥであり； ａ　ａ　ｂｌはに、Ｒ，ＧまたはＡ特にＲまたはＧであり；ａ　ａ　６３は４〜 ６個の炭素原子の塩基性以外の任意の脂肪族アミン酸、特に、Ｄ、　Ｅ、Ｉ、Ｌ 、　Ｖ、　ＮまたはＱ、とりわけ、Ｅ、　ＮまたはＱであり； ａ　ａ　ｈ　４はＳ、ＴまたはＭ、特に、Ｔであり；ａ　ａ　ｈ　Ｓは４〜６個 の炭素原子の任意の極性または塩基性アミノ酸、特に、Ｎ、Ｑ、ＫまたはＲ９と りわけ、Ｑであり；ａ　ａ　＆　＆は４〜６個の炭素原子の任意の脂肪族アミノ 酸、特に、Ｌ。

１、　Ｖ、　Ｋ、　Ｒ，ＮまたはＱｌとりわけ、Ｋ、ＩまたはＮであり；ａａ６ ？は任意の中性脂肪族または芳香族アミノ酸、特に、Ｇ、Ａ。

Ｌ、　Ｖ、Ｉ、　Ｓ、　Ｔ、　Ｍ、　Ｃ，Ｆ、　Ｙ、　ＮまたはＱ、とりわけ、 Ｃ，Ｓ、ＹまたはＭであり； ａ　ａ　ｈ　ＩはＫまたはＲ特にＫであり；ａ　ａ　６　？は任意の脂肪族の中 性または酸性アミノ酸、特に、Ｄ、Ｅ。

Ｇ、　Ａ、　Ｓ、　ＴまたはＭ、とりわけ、ＡまたはＴであり；ａ　ａ　？　Ｇ は３〜６個通常４〜６個の炭素数の中性、極性または塩基性の（酸性以外の）任 意の脂肪族アミノ酸、特に、Ｎ、　Ｑ、　Ｋ。

Ｒ，ＳまたはＴ、とりわけ、Ｎ、　ＱまたはＫであり；ａａ’Ｊよ２〜５個の炭 素原子の塩基性以外の任意の脂肪族アミノ酸、特に、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｄまたは Ｅ、とりわけ、ＡまたはＴであり； ａａ７ｚはＮまたはＱ特にＱであり； ａａ７３はＳ、　Ｔ、Ｆ、　Ｙ、　ＨまたはＷ、特に、Ｔであり；ａ　ａ　１４ はり、　Ｅ、Ｆ、　Ｙ、　ＨまたはＷ９特に、ＹまたはＤであり；ａ　ａ　？　 ５はＫまたはＲ２特に、Ｒであり；ａ　ａ　？　ｋは４〜６個の炭素原子の塩基 性以外の脂肪族アミノ酸、特に、Ｄ、Ｅ、　Ｖ、Ｉまたはり、とりわけ、Ｅまた は■であり；ａ　ａ　７１は３〜６個の炭素原子の極性脂肪族アミノ酸、特に、 Ｎ。

Ｑ、Ｓ、　Ｔ、　’ＤまたはＥ、とりわけ、Ｎ、ＤまたはＳであり；ａ　ａ　？ 　１１は３〜６個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸、特に、Ａ。

Ｐ、　Ｖ、Ｉまたはり、とりわけ、してあり；ａ　ａ　’ｒ　９はＫまたはＲ２ 特に、Ｒであり；ａ　ａ　ｆｉ　Ｏは３〜６個通常４〜６個の炭素原子の中性脂 肪族アミノ酸、特に、Ｓ、　Ｔ、　Ｎ、　Ｑ、１．　Ｖまたはり、とりわけ、Ｎ 、　Ｔまたは■であり； ａ　ａ　ＩＩ　＋は脂肪族非極性アミノ酸、特に、Ｇ、Ａ、Ｌ、ＩまたはＶ。

とりわけ、ＡまたはＬであり； ａ’ａ　ＩＩ　ｔは２〜６個通常５〜６個の炭素原子の酸性以外の脂肪族アミノ 酸、特に、Ｋ、　Ｒ，Ｇ、　Ａ、Ｌ、ＩまたはＶ、とりわけ、ＬまたはＲであり ； ａ　ａ　ａ　３は２〜６個の炭素原子の酸性以外の脂肪族アミノ酸、特に、Ｋ、 　Ｒ，Ｇ、　Ａ、　Ｌ、Ｉまたは■、とりわけ、ＧまたはＲであり；、ａｓａ− ｓｓは芳香族アミノ酸、特に、Ｆ、Ｙ、ＨまたはＷ、とりわけ、Ｙである。

好ましくは、上記の配列において、置換、欠落または挿入としての３個以上の変 異は通常存在しないであろう。

特に興味あるのは下記の配列に含まれる少なくとも６個通常は少なくとも８個の アミノ酸のアミノ酸配列である。

ＷＤ／　Ｅ　Ｒａａ”ＴＱ／　Ｒａａ”ａａ６７Ｋａａ６９ａａ”ａａ”ＱＴ　 ／　Ｗａａ”ＲＶ　／　Ｅａａ”Ｌ　Ｒａａ”Ｌ　／　Ａ　Ｌ　／　ＲＧ／　Ｒ Ｙ　Ｙ式中： ａ　ａ　６３はＥ、ｌまたはＮであり；ａ　ａ　＆　＆は１．　ＮまたはＫ特に Ｉであり：ａ　ａ　６７はＡ、Ｃ，Ｓ、　ＭまたはＹ、特に、ＹまたはＣであり ；ａ　ａ　６９はＧ、　Ａ、　ＴまたはＰ、特に、ＡまたはＴであり；ａ　ａ　 ７６はＱ、　ＮまたはＫであり；ａ　ａ　？　ＩはＡ、ＥまたはＴであり；ａ　 ａ　？　４はり、ＦまたはＹ、特に、ＤまたはＹであり；ａ　ａ　１（ｌはＮ、 　ＳまたはＤであり；ａａ”°はＩ、ＮまたはＴである。

２個のアミノ酸を特定の部位で必要とする場合、いずれかのアミノ酸を交換でき るように使用し得る。３個までのアミノ酸を維持性または非維持性変化に供し得 、０〜２個のアミノ酸の欠落または１〜２個のアミノ酸の挿入があり得る。

上記のオリゴペプチドは種々の方法で調製でき、非野性タイプの隣接領域に融合 たん白質として結合させ、結合基により結合させ、あるいはシスチン（ジスルフ ィド）またはペプチド結合により直接共有結合させる。上記のオリゴペプチドは ＮまたはＣ末端の単一アミノ酸にまたはアミノ酸連鎖に結合させ得る。融合ペプ チドは延長させて有利な結合部位、例えば、システィンまたはりシンを与え、安 定性を高め、特定のレセプターへ結合し、精製を容易にし、物理特性、例えば、 溶解性、荷電性等を変化させ、コンホメーションを変える等ができる。上記オリ ゴペプチドはＮまたはＣ末端性あるいは中部的であり得る。

上記オリゴペプチドは他のペプチドに種々の目的で結合させ得る。上記オリゴペ プチドはマレイミド安息香酸、メチルジチオ酢酸、メルカプト安息香酸、Ｓ−ピ リジルジチオプロピオネート等のような種々の２官能性試剤を介して結合させ得 る。上記オリゴペプチドはたん白質に結合させて抗体産生用の免疫原を調製でき る。上記オリゴペプチドは、特に細胞内開裂性結合により、部位特異性作用のた めの抗体に結合させ得る。上記オリゴペプチドはペプチドに結合させて、部位特 異性作用のための安定性を高めてさらなる生理学的活性等を与え得る。接合技術 としては、例えば、米国特許第３，８１７．８３７号、第３，８５３，９１４号 、第３，８５０．７５２号、第３，９０５，６５４号、第４，１５６，０８１号 、第４，０６９．１０５号、および第４．０４３，９８９号を参照されたい、こ れら米国特許の記載は参考として本明細書に引用する。

上記のオリゴペプチドはベシクル、例えば、リポソームの内空（ルーメン）中に 含有させることによって変形でき、これらのベシクルは特定の細胞または組織に 特異性のりガントまたはレセプターに結合し得る。

上記オリゴペプチドはリガンドとして使用して診断薬として特定のレセプターの 存在を測定できる。即ち、細胞を、インタクトまたは溶解物として、上記オリゴ ペプチドに結合する１種以上のレセプターの個体群としてスクリーニングできる 。上記オリゴペプチドは検出可能な信号を与える標識、例えば、ラジオアイソト ープ、蛍光体、酵素、粒子、化学発光体等で直接または間接的に標識できる。即 ち、組織、例えば、生検体、血液等からの細胞をインビトロまたはインビボで上 記オリゴペプチドに結合するレセプターの存在について検査し得る。さらに゛、 種々の細胞のＭＨＣクラス１抗原の結合パターンも試験し得る。ＭＨＣクラス１ 抗原とレセプター間の不適切な複合体化の結果としての病状を検査できる。多く のプロトコールが公知であり、開発され、特許および科学文献に記載されている 。商業的に入手できるアッセイにはＥＬ　ＩＳＡ、ＥＭＩＴ、ＳＬＦ　ｒＡ、Ｒ ＩＡ等がある。

上記のオリゴペプチドは種々の方法で使用できる。治療においては、上記のオリ ゴペプチドは、非経口的に、例えば、特定の部位、例えば、皮下、服腔内または 静脈内注射によって投与できる。

調製物は、通常、脱イオン水、食塩水、水性エタノール、エタノール、リン酸緩 衝溶液等のような生理学上許容し得る媒質を含むであろう。バッファー、安定剤 、他のたん白質または殺菌剤等の他の添加剤も含有させ得る。調製方法は調製物 の目的、レセプター活性を調整するのに用いる特定の方式、目的とする治療等に よって変化するであろう、調製物はカプセル、リポソーム、時間遅延コーティン グ、ビルを含み得、あるいは連続投与用のポンプ中で調製し得る。広範囲の治療 方式、変動する応答または異なる病状等の故に、活性成分の濃度に有用な制限は ない、これらは公知の方法によって経験的決定できる０例えば、”　Ｈａｒｒｉ ｓｏｎ　’　５１Ｐｒｆｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃ ｉｎｅ”、第１１版、　Ｂｒａｕｎｗａｌｄ等編集、ＭｃＧｒａｗ旧１１　Ｂｏ ｏｋ社、−ｓ−ヨーク、１９８７を参照されたい。

本発明のオリゴペプチドは合成、組換え技術等の通常の方法によって調製できる ０例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：ａ　 １ａｂｏｒａｔｏｒｙ　＠ａｎｕａｌ、　ＣＳ　ＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９８２　；ベックマンモデル９９０ペプチドシンセサイ ザーまたは他の市販のシンセサイザーの使用を参照されたい。

以下の実施例は例示として提示するもので限定のためではない。

皇−肢 化学変異誘発によるマウス胸腺腫由来の変異体系ＲＩＥ（ＰａｒｉｓおよびＳｅ ｉｄｍａｎ＋皿（１９８２）１工：　６６１−６６９；Ａ１１ｅｎ等、Ｐｒｏｃ 　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　３人（１９８６）　ｉｉニア４４７−７４ ５１）は、Ｒ１と対照的に、ＲＩＢ中のＲ２−ミクログロブリン（β２ｍ）遺伝 子内に誘起された病変による原体（オリジン）のＣ５８株の親Ｈ２”ハブロタイ ブ抗原を発現しない。

ＲＩＥマウス胸腺腫細胞および種々のＲＩＥ移入体への特異的インシュリン結合 性を測定した。結合はＧａｖｉｎ等、Ｊ、Ｂｉｏ＋。

Ｃｈｅｗ、（１９７３）　Ｘ１ｊＬ：　２２０２−２２０７、およびＤｕｅ等、 肛硅虹虹姐凰（１９８５）２工：７４９−７５５に記載されているようにして行 った。

すべての細胞を１５％仔牛血清（Ｆｅ２）および指示された種々の添加剤を含む ＲＰＭｌ　１６４０（Ａｌｉｅｎ等、前出（１９８６）　）中で培養した。イン シュリン結合アッセイ前に、細胞を１０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ−１６４０中に ２Ｘ１０’細胞／−の濃度で種付し、３日後に採取し、生存度をトリパン染料排 除により〉９５％と確認し、次いで、インシュリン結合性のためのアッセイバッ ファー中に７．５Ｘ１０’細胞／＋ｄの濃度で再懸濁させた。

５０ＰＭの最後濃度でのｌ！Ｊ標識ヒトインシュリン（Ａ１４位置で標識したも の、ダンマークのノボ社より入手）を加え、細胞を振盪水浴中で１８℃、９０分 間インキュベートした。２−の水冷アッセイバッファーをインキュベーシヨンの 終りに加え、細胞を３００ｇで５分間、１００ｇで１０分間遠心し、ベレット中 の１！Ｊ−インシュリンの量をＴ−カウンターで計数した。非特異結合は１０４ Ｍ標識インシュリンの存在下での１２ｓ！−インシュリンの量とみなし、特異的 インシュリン結合はＩ！Ｊ−インシュリンの非標識インシュリン有りおよび無し での結合の差として計算した。〈１％の特異結合は、スカッチャード（Ｓｃａ　 ｔｃｈａｒｄ）プロットおよび細胞数に関連しての特異結合を考慮して非特異で あるとみなした。

スカッチャードブロットは系Ｒ１、ＲＩＢ、ＲＩＢ／β２ｍ、ＲＩ　Ｅ／Ｄ’　 、ＲＩ　Ｅ／β２ｍ／に’　、ＲＩ　Ｅ／βｚ　Ｍ　／　Ｄ　’　−ＲＩ　Ｅ／ β２ｍ／Ｄ’Δ、およびＲＩＥ／β２ｍ／Ｄ’　−（１＋２）において３Ｘ１０ ’細胞／サンプルで行い、各ポイントは重複または三重複サンプルを示した。ス カッチャードブロフトを各試験において３〜１０回繰返した。Ｒ１およびＲＩ　 Ｅ／β２ｍ／Ｄ’のみが妥当な量のインシュリンレセプター（ＩＲ）を示した。

観察したカーブは、高アフィニティＩＲに加え、これらの細胞ががなりの量のイ ンシュリンに対して低アフィニティを有するレセプターも有していることを示し ており、これは、ある程度、ＩＧＦ−１のレセプターのような他のインシュリン 結合性レセプターの移入および／または共発現の間接的効果に基づき得る（Ｒｅ ｃｈｌｅｒおよびＨｅ５ｓｌｅｙ、　Ｉｎ　Ｐｏｔ　ｅ　ｔｉｄｅ　Ｈｏｒｍｏ ｎｅ　Ｒｅｃｅ　ｔｅｒｓ　（ｅｄＢ、　１．　Ｐｏ５ｎｅｒ）　、２２７−２ ９７　、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ＋　ＮｅＩＩＹｏｒｋ（１９８５））。

ＲＩネズミ胸腺腫細胞は、インシュリンアッセイにおいてしばしば使用されかつ 例外的に多量の非官能性ＩＲを有するニブスティン−バールウィルス形質転換系 であるヒトＩＭ−９細胞系と対照的に、他のリンパ球細胞集団に匹敵するＩＲ細 胞表面密度を有する。従って、Ｒ１／ＲＩＥ系においてはサンプル当り比較的高 量の細胞を用いることが必要である。細胞数に関しての特異的インシュリン結合 性の滴定は特異的インシュリン結合に対する最適の細胞数／サンプルは７Ｘ１０ ’細胞であることを示している（すべてのスカッチャードブロフトでの使用には 実際的でない）。

Ｒ１とＲＩＥ／β２　ｍ　／　Ｋ　’の各カーブはこれら２つの系が有意量の夏 Ｒを発現しなかったことを示している。

Ｒ１、ＲＩＥおよびＲＩＥ移入体中のインシュリンレセプターｍＲＮＡを次のよ うにして測定した。全ＲＮＡを各細胞がらＣｈｉｒｇｗｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓ江１（１９７９）上ｉ　：　５２９４−５２９９におけるようにして単離し 、ポリＡ″ＲＮＡをＭａｎｉａｔｆｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　 Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃ３ＨＬａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ＋　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（１９８２）にお けるようにして選択した。ノーサンプロット分析において、５μｇのポリＡ０選 択マウス肝ＩＩｍ　ＲＮ　Ａを１．０％アガロース−ホルムアルデヒドゲル（Ｃ ｈｕｒｃｈ　およびＧ１１ｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

脇り凪、壜；Ａ（１９８４）ｊｌＪ−：１９９１　１９９５）上で分画し、ゼー タ−プローブナイロン膜（バイオラッドラボラトリーズ社、リッチモンド、カル ホルニア州）上でプロットした。

インシュリンレセプター特異性配列をインシュリンレセプターｃＤＮＡプレカー サーから推定したアミノ酸７３２−７４１を示す合成りＮＡオリゴヌクレオチド によるハイブリッド形成によって検出した（Ｕｌｌｒｉｃｈ等、Ｎａｔｕｒｅ　 （１９８５）　ｆｌｚ：’ｙｓｓ−７６１）、ハイブリッド形成および洗浄条件 はＣｈｕｒｃｈおよびＧ１１ｂｅｒｔ、前出（１９８４）に従ったが、ハイブリ ッド形成と洗浄は４５℃であった。およそ１μｇでかつ１：１０希釈のマウス肝 臓からのポリＡ′″選択ｍＲＮＡと適当な細胞系を上記のゼータ−プローブ膜上 に落し上記のようにしてハイブリッド形成させた。

ノーサンプロット分析における分子量マーカーはベセスタリサーチラボラトリー ズ社（ベセスタ、メリーランド州）から購入した。

マウス肝臓からの４．８ｋｂの主要種をヒトインシュリンレセプターオリゴヌク レオチドにハイブリッド形成させた。この種は、また、［１１１ｒｉｃｈ等、前 出（１９８５）により、放射能標識クローン化ヒトインシュリンレセプターｃＤ ＮＡ配列を含むヒト胎盤ｍＲＮＡにおいても見い出されている。

Ｄゞα１とインシュリンレセプター間の逆相補性を次のようにして測定した。マ ウスＭＨＣクラスＩＤＸおよびＫＫ遺伝子の逆（３’−５’）補体をＤＮＡ５Ｉ Ｓ（ヒタチ社（日本）、およびインテリジエネティソクス社（カルホルニア州バ ロアルト））コンピュータープログラムを用いて核酸およびたん白質配列につい てスクリーニングした。７５％のアミノ酸相同性がＫＫα１ａａ３４−４１の逆 補体とヒトインシュリンレセプターシグナルペプチドａａ１４−２２との間で見 い出された。ＤＫまたはＫＫとヒトインシュリン、エストロゲン、表皮増殖因子 またはインターロイキン−２の各レセプターとの間の見い出された相同性はすべ て上記より低かった（く５０％）。ＤＫαｌとＩＲ間の相同性の程度はＢｏｓｔ 等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　（１９ ８５）　１２８：１３７３−１３８０により有意であるとみなされた相同性の限 界内である。

第　３　図 Ｎ末端　Ｃ末端 ＤＫａａ　３４−４１　−−−　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａ ｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　−−−５′３′ ＤＫｎｔ　１００−１２５−−−　ＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＣＧ　 ＧＡＧ　ＡＡＴ　−−−↓ 逆（３’　−５’　） 相補体からの　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌ ｅｕ推定ペプチド インシュリン　レセプター　−−−Ａｒｇ　Ｇａｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　−−−シグナル配列 ａａ　−２２〜−１４ ＤＫα１の逆補体とヒトＩＲ間の正しい相同性を示さない２個のアミアミノ酸は 第３塩基コドン中の不整合である。正しい相同性は２個の・で示され、一方、第 ３塩基不整合は１個の・で示される。バイオネットシーンバンク中での４０００ の入手可能な配列を走査することによっては、推定ペプチドまたはそのＤＮＡ等 個物間に有意の相同性は検出されなかった。

種々の細胞系の表面たん白質を蛍光標識モノクローナル抗体とＦＡＣ３を用いて スクリーニングした。

表−−１ 蛍光活性化詞唾最拐１（ＦＡＣ３）分析ＲＲＥ、、、″″にＨ−’　ｍの ＦＩＴＣ分子数／細胞　ｘ　ｌ　Ｑ−３ｍ°−細胞系　Ｈ−２特異性　ＫＫが　 Ｋ”　Ｋゝ　が　Ｄｌ　β２＋１ゝβシ（、ｖ’ｔｏ−ｔｙｂ＠体　”　（２Ｂ −８−６）　（１１，４）　（２０−８−４）　（１５−５−５）　（２８−１ ４−８）Ｒ１７５０５０５＜１０　４３５　１６　＜１０　１７５ＲＩＥ　２５ 　＜１０　＜１０　＜１０　＜１０　＜１０　＜１０ＲＩＥ／β２＋ｓ　２９０ 　８０　１５　９０　１５２２５８０ＲＩＥ／Ｄ’　１４５　３０　＜１０　３ ０　５７０　＜１０　＜１０ＲＩＥ／β２ｍ／Ｄ’　３７０　１１５　１０　１ ７０　１２４０　ａ３９０ＲＩＥ／β’；！ｓ／に’　４００　２１５　４１０ 　２６０　＜１０　５１０　４２５ＲＩＥ／β２１１／Ｄβ　３４５　１７０　 １０　３２０　２５０　２００　１０５ＲＩＥ／　Ｄゝ　−（１＋２）　１９０ 　７０　＜１０　５０　８２５　＜１０　＜１０ＲＩＥ／β２ｍ／Ｄｂ−（１＋ ２）　３５０　１０５　１０　１３０　８８０　２１０　１６０表」Ｊυ支医 ａ　モノクローナル抗体は従来から開示されている（Ｏｚａｔｏ等、ｋ飢扛り虹 紅抜ｎ　（１９８２）ｉ土：１１３−１２０３．染色においては、１０＆個の細 胞を１ａｇ抗体／−と４℃、１時間インキュベートし、リン酸緩衝液（ＰＢＳ） で２回洗浄し、さらに１時間、４℃でフルオレスセインイソチオシアネート（Ｆ 　Ｉ　ＴＣ）接合ウサギ抗マウスポリクローナル抗体（ダンマークのＤＡＫＤ社 より購入）とインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し分析した。ＦＩ ＴＣ接合二次抗体とインキュベートした細胞は陰性コントロールとして機能した 。−次蛍光尺度上の〉１５チヤネル数のシフトを有意とみなし；すべでのサンプ ルを対数および一次蛍光尺度の両方で測定した。細胞当りの結合ＦＩＴＣ分子の 絶対数は以前から開示されているようにして推定した（Ｄｕｅ等、前出、（１９ ８５））、留意すべきなのは、同じ一次抗原を用いた場合、ＦＡＣＳデータを比 較して異なるＨ−２分子の相対割合を推定することのみが正当であり得るという ことである。　” ｂ　Ｈ−２の発現をすべての細胞系において二次試薬としての１！Ｊ標識プロテ インＡによる固相ラジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）と上述のＦＡＣ３の両方によ り測定した。要約すれば、ＲＩＡアッセイ（Ｗｅｉｓｓ等、Ｎａｔｕｒｅ　（１ ９８４）　ｌ］」ノロ５Ｏ−６５５）は、５Ｘ１０’細胞（９６ウエルマイクロ タイタープレート）を５０μｌのイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）＋　１０％ ＦＣ３中で塗抹することによって行った。

次いで、ＭＥＭ＋１０％ＦＣ３中の５０μｌの希釈抗体を加えた。　１１５１− プロティンＡを１００．　ＯＯＯｃｐｍに加え（Ａｍｅｒｓ−ｈａｍ　）　、４ ℃で１６時間インキュベートした。細胞をベレット化Ｌ、ベックマンガンマーカ ウンターで計数する前にＭＥＭ＋１０％ＦＣ３で３回洗浄した。すべてのサンプ ルを２回行い、すべてのサンプルの５％以下の変化を計数した。

ｃ　Ｒ１、ＲＩＥ系、Ｈ−２におよびＨ−２Ｄ遺伝子、並びに移入手順は従来よ り詳細に開示されている（Ａｌｉｅｎ等、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８６）　８３　ニア４４７ −７４５１；Ｇｏｏｄｅｎｏｗ等、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８２）　Ｊ＝上ｉ： 　６７７−６７９）。

各表示は次のとおりである：　ＲＩ　Ｅ／β２ｍｓβ２ゝで移入したちの；ＲＩ Ｅ／に’　、に’で移入したもの、　ＲＩ　Ｅ／β２ｍ／にゝ、β２ｍとＫｂで 移入したもの、　ＲＩ　Ｅ／β２ｍ／Ｄ’、β２ｍとＤゝで移入したもの、ただ し、Ｄｂ細胞表面抗原はＤｂに対するモノクローナル抗体で下方調節した。　Ｒ Ｉ　Ｅ／β２ｍ／Ｄ’　−（１＋２）　、β２ｍと細胞表面上にα３−ドメイン を発現するのみの端部切取りＤゝ遺伝子とで移入したちの：ＲＩＥ／Ｄ’　−（ １＋２）　、α槍−ドメインを発現するのみの端部切取りＤゝで移入したもの。

腺癌細胞系Ｌ　Ｔ　８５　（Ｃａｌｌａｈａｎ等、Ｊ、　Ｉｍ＋ｎｕｎｏ１．　 （１９８３）４７１−４７４）は起源株の特性を示すＨ−２抗原のかなりの細胞 表面発現を欠如する。インターフェロン−α（Ｉ　ＦＮ−α）処理はＨ−２ＫＫ 、Ｈ−２ＤＫの両方の細胞表面密度を有意に増大させかつインシュリンの特異的 結合性を同時に増大させる。また、紫外線誘起線繊肉腫Ｌ　Ｒ３３５（Ｄａｙｎ ｅｓ等、Ｔｒａｎｓ　１ａｎｔａｔｉｏｎ（１９７７）２主：３４３−３４８） は、ＲＩＥまたはＬＴ８５と異なり、ＩＦＮで誘起させぬ限り、無視し得るＨ− ２ＤＫを含む起源株に対して内因性のかなりの量のＨ−２ＫＫ抗原を発現する。

表２に示すように、ＩＦＮ処理はＨ−２ＤＫ発現とインシュリン結合性の両方を 著しく増大させ、試験した他の陽性細胞系のレヘルに達する。これらの結果はＲ ＬＢ移入体についての研究：Ｍ　ＨＣＤ　ｗＩ域末端へのＩＲ発現マツプの調整 から引き出された結論を支持している。

ＭＨＣクラスｌおよびインシュリンレセプター発現に゛しるイン　−フェロンの ｔ Ｈ−，１゛　−１ 細胞系　インターフェロン　Ｋ　Ｋ　ｐ　Ｋ　特異的インシュリン几　−−−− 七ム　χ ＬＴ８５　なし　３，３７０　１．０３０　２．０＋　１９．１７０　６，５０ ０　３．２ＬＲ３３５なし　１６，２３０　１．０００　＜１．０＋　２８．７ ７０　６，６３９　２．１ａ　表１で述べたようなラジオイムノア、セイで測定 、結果はｃｐｓ　１５　ｘ　１０’細胞として示す。

ｂ　インターフェロン処理はα−インターフェロンで行った。

第３ハブロタイブ中のインシュリンレセプターの調製をマツピングするために、 ＢＡＬＢ／Ｃ３４９胸腺ｌ系の幾つかのクラス１変異体（Ｊｏｓｅｐｈ等、Ｊ、 　Ｉｍｗ＋ｕｎｏ１．　（１９８６）上３７　：　４０１６−４０２０）をイン シュリン結合性について試験した。表３に示すように、Ｈ−２に／Ｈ−２Ｄ陽性 変異体はＨ−２に陰性変異体に対して有意のホルモン結合性を示し、０分子がレ セプターの細胞表面発現を支持していることを示唆した。Ｈ−２ＤゝとＨ−２Ｌ ’間の相同性はＨ−２Ｌ座もまたＩＲと相互作用を発揮することを示唆している 。

表−一」− ２種の異なるハブロタイブの６種のマウス細胞系中でのＭＨＣ−ス　ゝ　゛イン シュ１ンレセ　−のＭＨＣクラス１発現ｂ　（細胞系）１ ３ＬＬ／Ｇ２　３ＬＬ／Ｇ４　２８　３３　３６　２９ａ　すべての細胞系は何 かに記載されている（Ｏｌｓｓｅｎ　およびＦｏｒｅｈｈａｍｍｅｒ、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　（１９８４）８１：３ ３８９−３３９３；Ｊｏｓｅｐｈ等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８６）１３ ７：４０１６−４０２０）。２８．３３．３６および２９と番号付した系は、そ れぞれ、以前はＳ４９．１、Ｓ４９．２、Ｓ４９．３およびＳ４９．４と表示さ れていた。

ｂ　前述したようなモノクローナル抗体によるＲＩＡ（表１参照）によりて測定 、また、データはｃｐｍ１５Ｘ１０’細胞として示した。

ＭＨＣ−ス■ペブの　力　・　び １１ＥＩ ＲＩＥ及びＲＩＥＩ−ランスフエクタント以外の全ての細胞系は、２ｍＭのグル タミン、５０Ｕ／−のペニシリン、５０ａｇ／−のペニシリン、５０ａｇ／−の ストレプトマイシン、１．０％の非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウ ム及び１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を追加した最小必須培地（Ｍｆ ！Ｍ、　Ｇｉｂｃｏ）中で成長し、ＲＩＥ及びＲＩＥＩ−ランスフェクタントは ＲＰ　Ｍ　Ｉ　（Ｇｉｂｃｏ）及び上記で加えたものの中で成長する。下記の細 胞系が本研究に使用される：Ｈ−２’起源のＰ８１５−マウス肥満細胞腫（ａｌ ａｓ　ｔ−ｏｃｙｔｏｍａ）　；　Ｈ−２”起源であるが、Ｈ−２’遺伝子（Ａ ｌｉｅｎ　ｅｔａｌ、、　（１９８６）　）でトランスフェクシ四ンされたＲＩ Ｅ及び関連トランスフエフタントーマウスリンパ腫；２種の関連する個体からの 、ヒトリンパ芽球系＃１及び＃　２　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス形質転 換リンパ球、なお、＃２は■型糖尿病である１Ｈ−２に起源のＬＲ３３５−ＵＶ 誘導マウス線維肉腫。

主土至１級合 ホルモン結合分析は、Ｆｒｅｙｃｈｅｔ　Ｄｉａｂ旦虹」凰（１９７６）上ｌユ 、ｉ）：８５−１００及びＦｒｅｙｃｈｅｔ等、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｕ− （１９７７”Ｊ　１ｊＬＬ：　１１５−１２１を基礎として、変更を加えて行わ れる。全ての反応は、９６ウエルの丸底マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔ ｅｃｈ　Ｌａｂｓ＋　ＶＡ　）中、膜タンパク質のインターナリゼーシヲン及び 続いての減成を防ぐために、０．５％ウシ胎児血清アルブミン（シグマフラクシ ョン■）及び０．１％のナトリウムアジドを含むＭ　Ｅ　Ｍ　（Ｇｉｂｃｏ）中 、２００μβの容量で実施される。

０．１％のナトリウムアジドはインシュリン結合を変化させない。

細胞は、細胞のタイプに依存してｌＸｌ０’〜ｉ　ｘ　ｉ　ｏ”で再懸濁され、 適当な場合には、１００μｇ／−のペプチドの存在下、４℃で１時間ブレインキ ュベーションされる。特定のインシュリン結合は、トレーサーとして＋ｔｓｌ− インシュリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ。

２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、３７０ｋＢｑ／ｌ　ＯμＣｉ　）を用いて５０−１ ００ｐＭで測定する。インキュベーションは、２０°で９０分間行う。

その後、細胞を氷冷したＭＥＭ中、３回洗浄して未結合インシュリンを除去し、 ペレットを１００μｌに再懸濁し、ベックマンガンマーカウンターで計測する。

非特定インシュリン結合は、１００μｇ／ｄの非標識ブタインシュリン（Ｓｉｇ ｍａ）の存在下で測定される。特定のＥＧＦ結合は、トレーサーとして”Ｊ−Ｅ ＧＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　１５０　μｃｉ／ｍｇ）を用い、同様の方法で測定 され、冷却競合剤として非標識マウス顎下腺ＥＧＦ　（Ｓｉｇｍａ）がｌμｇ／ ｙｄ用いられる。

級−果 ＭＨＣクラス■ペプチドを　と　る促進されたインシュリン持金 細胞表面へのＨ−２／ＩＲ相互作用を調べるために、Ｈ−２Ｌ’タンパク質のα １　ドメイン　、　ａａ８＋−８’に対応するペプチドを合成した。配列は、Ｅ −Ｒ−１−Ｔ−Ｑ−１−Ａ−に−Ｇ−Ｑ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｒ−Ｖ−Ｎ−Ｌ−Ｒ −Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｙ−Ｙであった。

このペプチドを量を増加して培地中の細胞に加えると、合成りラス■類似物は、 投与量に依存する形で、Ｐ８１５肥満細胞腫細胞へのホルモン結合を顕著に促進 させる。該ペプチドは少なくともマグニチュードの点でレセプターの活性を促進 させることができるが、Ｔ−ｃｅｌｌレセプターからの配列又はＭＨＣクラスＩ Ｉ配列を表す同じサイズのペプチドは、Ｐ８１５へのホルモン結合のレベルを増 加できない。さらに、７１位のグルタミンがなく、他はＬ’６１−８５と同一の 合成されたＨ−２Ｌ’ペプチドも、インシュリン結合に影響を与えることができ ず、レセプターに対する本発明のペプチドの非常に優れた特性を示唆する。

いくつかの他のタイプの細胞、例えば新たに単離されたマウスの肺臓を、Ｌ″ペ プチドインシュリン結合の促進について試験した。（第４表参照）ヒト起源及び マウス起源の細胞の双方ともインシュリン結合促進の程度がＬ４ペプチドにより 変化することを示した。Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ肺臓細胞への誘導の大きさは該 ペプチドのｉｖ　ｖｉｖｏでの効果を裏付ける。

第　４　表 Ｌ６ペプチドの細胞のタイプ／ホルモンレセプターに対する効果 ｃｐｍ”ｓ■−インシュリン　（％結合／遊離）ペプチドによる　増 細胞のタイプ／系　起源　ホルモン　Ｌ６ベブチド　ペプチド未添加　加の相対 値ＢＡＬＢ１０　肺臓　マウス　インシュリン　２．８０３　１６３　１５０（ ６，０）　（，０４） ｐ８１５肥満細胞腫　マウス　インシュリン　１，２２３　９５　１３．３（２ ，０）　（，１５） リ　ンパ芽球系＃ｌ　ヒ　ト　インシュリン　５，９０５　３，７４３　１．６ （１３）　（８，０） リ　ンパ芽球系＃２　ヒ　ト　インシュリン　２，４０９　１，３０６　１．７ （５，０）　（３，０） ＬＲ３３５線維肉腫　マウス　インシュリン　２，３９４　２．５４３　０（３ ，８）　（４，１） クラスＨ−２Ｌ’ペプチドの存在下及び不存在での種々のタイプの細胞へのイン シュリンの結合全ての細胞系は上記に記載されている。細胞を、Ｌ′ペプチドを 伴って、又は伴わずに、プレインキユベーシッンした。ａａｔｈ′−Ｉ′及び特 定の１２５■−インシュリン結合を、上記の方法により測定した。Ｌ４ペプチド の代わりに、２つの非りラス■ペプチド、マウスのＴ細胞レセプター及びマウス のクラスＩＩペプチドを使用すると、ペプチドを加えないのと同様の結果となっ た。結果は、１２５１−インシュリンの結合ｃｐｓ及び結合／遊＠＋ｚｓｌイン シュリンのカウント％により表した。

さらに、上皮増殖因子（ＥＧＦ）結合が線維肉腫発現ＥＧＦレセプター上で測定 される場合には何ら効果が見られず、前記ペプチドのインシュリンレセプターと の相互作用における特異性がさらに示された。

さらにインシュリン結合の研究が、クラスＩ／ＩＲ複合体の異なる表面発現特性 を有する一連の関連細胞についてなされた。

ＲＴ　Ｅ、ＲＩ　Ｅ＋Ｂ２Ｍ＋Ｄｂに対するインシュリン結合レベルを、Ｌ１ペ プチドの存在下及び不存在下を試験した。Ｈ−２Ｌ’ペプチドはＤ’　）ランス フェクタントに見出されるＩＲを単独でも増加することができ、ＲＩＥ及びＲＩ 　Ｅ＋Ｂ２Ｍ＋Ｄ’のいずれも適当なＬ４ペプチドにより誘導されるインシュリ ン結合の促進を示すことができなかった。

第　５　表 ＲＩＥ、ＲＩＢ＋β！　Ｍ＋Ｄゝ、ＲＩＥ＋β１　Ｍ＋にゝへのインシュリン結 合に対するＬ４ペプチドの効果ｃ　ｐ　ｍ　ｌ　ｔ　Ｓ　ｉ−インシュリン　（ ％Ｂ／Ｆ）細胞系　止ゴ旦　Σ因１０ ＲＩＥ７５２　（１，０）　３９３　（１，０）ＲＩＥ＋βｚ　Ｍ＋Ｄ’　９３ ５　（２，０）　４７１　（１，０）ＲＩＥ＋βｔＭ＋に’　４７８（１，０） 　４３２（１，０）ペプチドで誘導されたホルモン結合は認められなかったので 、前記の見解に一致して、Ｈ−２に’）ランスフェクタントが細胞表面ＩＲを欠 くことが明らかになった。従って、これらのデータにより、Ｄ末端生成物が細胞 表面へのレセプターの移動を制御することが確認される。

他の研究を、ＤＩ＋抗原の６１−８５断片を用いて、並びに多くの対照用ペプチ ドを用いて行われた。インシュリン活性は二つのファクター、即ちチロシンキナ ーゼ活性及びグルコース消費に分二つのＭＨＣクラスＩ誘導ペプチド、ＤＫ−（ ６１−８５）及びＫＫ−（６１−８５）は、双方ともＭＨＣクラス■分子（Ｋｌ ｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒａｌ　Ｈ４５ｔｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏ ｍｐａｔｔｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｌｅｘ（Ｗｉｌｅｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）） のα１のドメインの同じ領域からのものである。いずれのペプチドもＡｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、　（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、　ＣＡ ）により合成され、質量スペクトルにより品質がコントロールされている。

いくつかの実験のために、ＤＸ　−（６１−８５）及びＫＫ−（６１−８５）ペ プチドを、純同位元素Ｎａ　’　”　Ｉ　（Ａｍｅｒｓｈａｔａ）及びヨードビ ーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、２０分間インキュベーションし、その後逆相Ｈ ＰＬＣにより、Ｃ１１ｌカラム（Ｂｅｃｋｔｍａｎ）で、３０〜５０％の直線勾 配の５ｍＭ）リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のＣＨｘＣＮで精製することにより、 ヨウ化した。最初に溶離したＩＺＳｌ−で標識したペプチドを、５０％のＣＨ３ ＣＮ／　５　ｍＭＴＦＡ中、４℃で貯蔵した。標識したペプチドはこれらの条件 下で、少なくとも３か月間安定であった。

対照用ペプチド：ＡＣＴＨ−（１−２４）（ヒト）　、ＣＣＫ−３３（ブタ）、 グイノルフィンＡ（ブタ）、β−エンドルフィン−（１−２７）　（ラクダ）、 グルカゴン（ヒト）、及びプロソマトスタチン−（１−３２）　（ブタ）は全て Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ−ｉｅｓ＋　Ｂｅ１ｍｏｎｔ＋　ＣＡ から購入した。インシュリン（ブタ）のＡ−鎖及びＢ−鎖及びグルカゴン−（１ −２１）（ヒト）はＮｏｖｏ　Ｉｎｄ−ｕｓｔｒｙ、　Ｄｅｎｍａｒｋから得た 。ＡＣＴＨ−（１−２４）を通常の対照用ペプチドとして使用した。

′１インシュ■ンレセブ　− 精製ヒトＩＲ及びクローン化された細胞質キナーゼドメイン（ＩＲＫＤ）は、Ｅ ｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）　ｎ皿紐■６２　：１６３４　３９；Ｒｏ ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ＋。

２６１　罎３７５３−５７に記載されている。簡潔に言えば、ヒトＩＲを、胎盤 からイムノアフィニティカラムにより、モノクローナル抗体及び［Ｒの小麦胚芽 凝集素への結合を用いて精製した。

生成物は、各々−１３０ｋＤａの二つの重鎮と各々−９０ｋＤａの二つの軽鎖を 有する四量体であった。

ロジンキナーゼ゛ 細胞質のクローン化Ｉ　ＲＫＤを、ＩＲ配列から構築しく　Ｅｂｅｎａ等（１９ ８５）　Ｃｅ１１．４０　：　７４７−７５８　；　Ｕｌｌｒｉｃｈ等（１９８ ５）■胆阻１工主：　７５６−７６１）　、バキュロウィルス発現ベクターを用 いて、昆虫の細胞に発現した。ドメインは、溶解性（Ｍｒ　−４８ｋＤａ　）で あり、キナーゼ活性はｉｎ　ｖｉｔｒｏで本質的に発現する。ＩＲＫＤをイムノ アフィニティクロマトグラフィにより均質になるまで精製した。

精製したＩＲ及びＩ　ＲＫＤのキナーゼ活性及びインシュリンの作用の測定方法 は、別に記載されている（Ｒｏｔｈ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）前掲書）。簡潔 に言えば、５．０μ！の精製されたＩＲを５．　ＯＡｌ　ｊ！のインシュリン（ 最終濃度１．０μＭ）と混合し、そして緩衝液（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７ ，６，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，１％のＴｒｉｔｏｎＸ　１００　）を加えて 、最終容量を２０ｐ１とした。ペプチドを使用した場合は、５．０μｌに添加し 、緩衝液を加えることにより、容量を２０μｉに合わせ、混合物をインキュベー ジタンした（１時間、４℃）、インキュベージタンの後、２．５μＣ１の３２Ｐ 標識Ａ　Ｔ　Ｐ　（３０００Ｃｉ／＋ｗｍｏｌ、　ｒ−標識；　Ａｍｅｒｓｈａ ｍ）、５０ｍＭのＨＢＰＥＳ％ｐＨ７，６，１５０ｍＭのＮａＣｆ、０１１０％ のＴｒｉｔｏｎＸ　１００．３７．５４Ｍの非標＠ＡＴＰ、１５ｍＭのＭｇＣ１ ，、及び６ｍＭのＭ　ｎ　ＣＩｔ　ｔを含む溶液１０ｐＨを添加して最終容量を ３０μｌにした。その後、混合物を２４℃で３０分間インキュベージテンした。

インキュベーションの後、１５μｌのサンプル緩衝液を添加し、サンプルを５分 間煮沸し、そして１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥに一晩かけた。ゲルを乾燥し、５〜１ ０時間の暴露時間でオートラジオダラムを行った。定量的試験のため、ＩＲのβ −サブユニットバンド及びＴＲＫＤハンドを切り出し、シンナレーションカウン ターで乾燥計測した（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）　＊基質としてポリ−（（Ｇｌｕ、　 Ｔｙｒ）　；　４　：　１）　（Ｓｔｇｍａ）を用いて、基質リン酸化を行った 。基質を最終濃度が１．０ｍｇ／ｄとなるまで添加し、上記のようにリン酸化の 分析を行った。定量的試験のため、インシュリンレセプターバンドのすぐ下の全 レーンを２Ｏ−ｋＤａマーカーまで切り出し、計測するか、又は基質をＴＣＡで 沈澱させた。後者の場合、５μｉのサンプルを３ＭＭの祇（ｌａｔｍａｎ）に点 うち、氷冷した１０％ＴＣＡ中で３０分間洗浄し、５％ＴＣＡ中で１０分間煮沸 し、その後蒸留水で２回、エタノールで２回洗浄し、最後に乾燥させ、計測した 。

工ｌ之五ユヱ益金 ブタのモノヨウ化（＋ｇｓｌ）−インシュリン（↑ｙｒＡ１４でヨウ化、１９０ ０　２０００Ｃｉ／ａ＋＋ｍｏｌ）を、Ｎ０ＶＯＩｎｄｕｓｔｒｙ及びＡｍｅｒ ｉｓｈａｍから得た。非標識ブタインシュリン（ＮＯＶＯ）を１０ｍＭのＨＣＩ に１ｍＭの濃度で溶解し、直ちに−２（ｌで貯蔵した。

インシュリンの精製されたレセプターへの結合のためのプレートアッセーは、Ｍ ｏｒｇａｎ　ａｎｄ　Ｒｏｔｈ　（１９８５）　Ｅ’ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１６．１２２４−１２２６に記載されている。簡潔に言えば、２０ｍＭのＮａ ＨＣＯｚ、ｐＨ９，６中の５０μｌのアフィニティ精製ウサギ抗マウスＩｇＧ　 （Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、、　Ｉｎｃ、、 　ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ）（４０μｇ／ｄ）を、９６ウエルボリ塩化ビニル （Ｐ　Ｖ　Ｃ）プレートに添加した。プレートをインキュベーションしく１７〜 ２０時間、４℃）　、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，８中で３回洗浄し、１° ５０ｍＭのＮａＣｊ！、０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００，０，０５％の ＢＳＡ及び２Ｘ１０−”Ｍのモノクローナル抗体（Ａｍａｃ、　［ｎｃ、Ｊｅｓ ｔｂｒｏｏｋ、　ＭＥ）を添加した。インキュベーション（１時間、２４℃）の 後、プレートを洗浄し、インシュリン結合を測定した。

結合の測定のため、ＩｔＪ−インシュリン（３Ｘ　１０−１０　Ｍ）を増加した 量の非標識インシュリンと共に添加し、そしてインキュベーションを行い（９０ 分、２４℃）、洗浄し、そして遊離の及び結合した＋１％（−標識インシュリン の量を測定した。結合インシュリンは、ＩＲを０．１ＭのＭＣＩを用いてプレー トから溶離し、γ−カウンタ内で測定することにより調べた。データの分析のた め、非特定結合は、１０−”Ｍの非標識インシュリンの存在下で結合した量とし て定めた。

慧−来 基質（ポリ−（Ｅ、　Ｙ）　）リン酸化及びＩＲオートリン酸化のＮ方に対ｔ４ ＤＫ　−（６１−８５）の影響を、ＩＲチロシンキナーゼ活性が１０−＆Ｍイン シェリンで誘導されるペプチド濃度の関数として、調べた０両方ともμＭＤ”　 −（６１−８５）の濃度で強く抑制された。ベースのｒＲ活性（インシュリン未 添加）はＤＫ　−（６１−８５）及びＫｘ−（６１−８５）　により２４〜４０ 冗抑制された。オートリン酸化に対するＫＫ−（６１−８５）の効果はＤ”　− （６１−８５）より著しく弱く、Ｋ”−（６１−８５）及びＤＫ−（６１−８５ ）についてのＥＣ，、値〔９５％コンフィデンス間隔〕は、各々、４．０）　Ｍ 　（２，２−７，２）　Ｍ及び１、２）　Ｍ　（０，３−２，２）　Ｍ）であり 、基質リン酸化について違いは見られなかった。ＩＲチロシンキナーゼの基質と なる対照用ペプチド（例えばＡＣＴＨ−（１−２４）はなかった。

ＨＰＬＣ及びＩｔＪ−標識Ｄ”−（６１−８５）　、ＫＫ−（６１−８５）　、 ＡＣＴＨ−（１−２４）又はグイノルフィンＡについて試験したところ、実験期 間中、０．１）Ｍ以上の濃度で、重大な枯渇（分解又は吸収）は見られながった 。最大にオートリン酸化され及び３２ｐ−標識されたＩＲを氷上、１０）Ｍペプ チドとともにブレインキュベーションし、続いて５００）Ｍ冷却ＡＴＰと共に０ 〜６０分間室温でインキュベーションすることにより示されるように、ＤＫ−（ ６１−８５）ペプチドは、ＩＲＫＤリン酸化に影響を与えない。

ＤＫ−（６１−８５）はインシュリンのＩＲへの結合に何の効果も有しない。Ｉ Ｒオートリン酸化のＥＣ，。は、約３Ｘ１０−”ＭインシュリンＤＥＡＲＩ：こ れはほぼ、Ｋａ　（２，８ｘ　１ｏ　−”Ｍ）に相当する。ＤＫ−（６１−８５ ）は１０）Ｍで全てのインシュリン濃度におけるオートリン酸化を抑制する。

ＩＲ及びＩＲＫＤを活性比較のために使用する場合、ＤＫ−（６１−８５）　、 ３）Ｍはインシュリン誘導ＩＲオートリン酸化を抑制するが、インシュリンレセ プターキナーゼドメインリン酸化は抑制しない。ＩＲはインシュリンの不存在下 では、重要な基質にはならない。ＩＲはインシュリンが添加されると、Ｉ　ＲＫ Ｄの重要な基質となる。この見解は、ペプチドのＩＲオートリン酸化に対する抑 制効果により容易になる。これは、ＩＲリン酸化がＩＲのチロシンキナーゼに自 体より媒介されるＩＲリン酸化及びＩＲＫＤにより媒介されるリン酸化が検出し にくいからである。

次の研究において、ラット脂肪細胞におけるグルコース消費が行われた。脂肪細 胞は、絶食していない雄ラットの副翠丸脂肪褥（１，２−１，６ｇ脂肪／ラット ）から、コラゲナーゼ切断により得られる。緩衝液は、５％のＢＳＡを含むＫＲ Ｈであり、プラスチック管のみが使用され。切断物は、濾過され（２５μり、洗 浄され、細胞容量の約４倍に再懸濁される（脂肪比量管により計算される）。ア リコートを、２％の四酸化オスミウムで染色し、濾過し、そして塩溶液で希釈し た後、Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｃｏｕｎｔｉｎｇのために除去した。５０μＥの脂肪細 胞懸濁液をプレインキュベーション混合物：３００ｐｌ（Ｄ緩衝液、５０ｔｔｌ ｌ（Ｄインシｓ’）ン（８０μＭ）又は緩衝液；５０μｌの試験溶液（１０Ｘ） 又は緩衝液に添加し、ソシて３０分間、３７℃で、浸透水浴中でインキュベーシ ョンした。細胞のないブランクは、バックグラウンド測定のために用いられる。

Ｄ−Ｃｌ４Ｃ）−グルコースを続イテ添加しく約１０　’　ｄｐｍ／サンプル） 、６０分間インキュベーションを続けた。インキュベーションは、４００μｌの サンプルをシリコン油の最上層に積層し、続いて３００秒ミクロツユ−ジスピン 行い、そして脂肪細胞（油の最上層の細胞の薄い層があり、緩衝液は油の下にあ る）をＬＳバイアルにシンチレーシッン流体と共に採り入れることにより終わら せた。グルコース濃度は、約３００ｎＭ　（ｉｐ、ａ。

２９５＊Ｃｆ　／ｍｍｏｌ）であつた。

グルコース消費における３０μＭＤＫ　−（６１−８５）中のインシュリン濃度 の増加効果を調べた。インシュリンは、グルコース消費を最大に誘導し、そして 基礎となる消費の約８〜１１倍増加させた。Ｄ”　−（６１−８５）の追加によ り、最大消費は基礎となる上記最大インシュリン刺激のグルコース消費の１４〜 １８倍まで増加した。インシュリンの濃度を低くすると（血漿レベル及びそれ以 下）、３０μＭＤ”　−（６１−８５）がグルコース消費を１モル等量のインシ ュリンと同じか又はそれ以上に増加させる。

ＤＫ−（６１−８５）の最大効果は、１５μＭで得られた。特定のペプチドバッ チにより増加び程度が変化し、ペプチドのインシュリン効果は約２０％〜１００ ％の範囲で変動しうろことが見出された。

種々のＤ”　−（６１−８５）断片を、特定のペブチダーゼ：６１−６８断片及 び６９−８５断片を与えるｅｎｄｏ　Ｋ、７８−８５断片を与えるｅｎｄｏ　Ｅ 、６１−８４断片を与えるＣＰＹで酵素的に切断し、そしてさらに、出発断片を ヨウ化する。ヨウ化は末端チロシンに起こると予想される。各々の断片をＨＰＬ Ｃにより精製した後（９５％以上）、生物学的活性について試験し、細胞に最終 濃度３０μＭで添加した。出発断片を１００としたときの活性％の平均値上ＳＥ として報告される結果は下記のとおりである二　（６１−６８）１９±２２、（ ６９−８５）８７±２、（７８−８５）１５±３、（６１−８４）１９±３：ヨ ウ化断片９±１０゜ ラット全体のＤ”　−（６１−８５）の効果を調べた。ラット（１００−３００ ｇ）の血中グルコースレベルに対するＤに−（６１−８５）　（２，５ｍｇ／ｋ ｇ）及びインシュリン（μｇ／ｋｇ）を調べた。動物にベンドパルビタールで麻 酔をかけた後、ペプチド及びインシュリンを静脈注射により投与した。全ての動 物は実験前１６−２０時間絶食した。各測定は、４２のラットから得られた結果 をベースとして行った。４つの処理スケジュールにおいて同じラットを使用した 。スケジュールは、対照群、ペプチド単独、インシュリン単独、及びインシュリ ンとペプチドである。対照群は、測定が行われた２４０分以上、血中グルコース における重大な変化を示さなかった。ペプチド群は、約２０分で、血中グルコー スがもとの値の約６５％に落ち込み、その後、ゆっくり上がり、約９０分でほぼ もとの値まで上昇し、その後、はぼ同じ値を維持した。同じ結果がインシュリン の注射においても見られた。しかしながら、インシュリン及びペプチドが一緒に 注射されると、グルコースは約２０分間以内に、もとの値の約５５％まで降下し 、その後ゆっくり上昇し、１９５分間゛でもとの値のほぼ８５％になり、その後 約２４０分間で約９０％に上昇した。Ｔ＝０からＴ−２４０までの対照群の曲線 と実験の曲線の間の領域の計算により、インシュリン及びペプチドの領域はイン シュリン又はペプチド単独のものより著しく大きく、インシュリン又はペプチド 単独のものに比べて延長された血糖低下期間が示される。

ペプチド媒介グルコースについて、主要な標的器官を調べるために、種々の器官 のグルコース消費をオリゴペプチド静脈注射の関数として分析した。ペプチド媒 介グルコース消費のための主要な標的器官は、骨格筋、肝臓、及び腎臓であり、 器官の大きさも考慮に入れた。これらの器官のいくつかはインシュリン注射では 影響を受けないことは注目すべきことである。使用した方法は、インシュリン及 びペプチド注射６０分後の１４Ｃ２−デオキシグルコースの注射と、その後３０ 分、即ちペプチド注射後９０分に測定される１４Ｃの器官含有量である。

上記のデータに基づき、Ｄに−（６１−８５）ペプチドが、インシュリンの存在 下及び不存在下の両方で、細胞性グルコース消費量を促進するという結論に達し うる。ペプチド効果は、インシュリンの刺激により増加する。最大のペプチド効 果はペプチド濃度１０−２０μＭで達しうる。ペプチドは、最大のインシュリン 刺激により誘導されるより著しく高いグルコース消費の促進を引き起こすｅ　ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏでの効果は、細胞及びペプチドのインキュベーションの２０分後 に最大である。２．５ｍｇ／ｋｇのＤＫ−（６１−８５）のペプチドの静脈注射 により、全動物の血中グルコースの減少が起こる。インシュリンがペプチドと共 に注射されると、これは促進される。ペプチドにより誘導されるグルコース消費 は、特に、骨格筋、肝臓及び腎臓で顕著であるが、ペプチドは、血嶺インシュリ ンの値を増加することはない。

シグナルトランスダクションに影響する膜表面レセプターが、インシュリンレセ プターに例示されるように、ＭＨＣクラス■抗原、マウスのＨ−２Ｄ及び−Ｌ並 びにヒトのＨＬＡ−Ｂ及び−Ｃにより変動することが明らかである。広い範囲の 生物学的過程が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　及びｉｎ　ｖｉν０で、適当なりラスＩ抗 原と膜表面レセプターの間の相互作用の促進及び減少に認められる種々の技術に より、調節されうる。

本明細書で言及した全ての出版物及び特許出願は、本発明が主張する技術の当業 者の技術水準に示唆される。全ての出版物と特許出願は本明細書において参考文 献として挿入され、各々の個々の出版物及び特許出願が特別に及び個々に参考文 献として記載されているのと同じ意味を表す。

前期の発明は、理解の明確化の目的のための説明及び例示として詳細に記載され ているが、一定の変化及び変更が、添付の請求の範囲の範囲内で行われうろこと は明らかである。

平成　年　月　日

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）主要組織適合性複合体ヒトクラスＩＨＬＡ−Ｂ又は−Ｃ抗原又は他の哺乳 類の同等のものと、（２）細胞上の表面レセプターとの間の結合複合体又は機能 的に同等のものとの結合複合体の数を、前記表面上の前記抗原の数を変えること により、又は前記抗原若しくはレセプターに結合することができる成分を添加し て結合複合体の生成を模倣するか又は抑制することにより調整し、これにより前 記レセプターの応答を調整することを含む哺乳類の細胞の表面レセプターの応答 の調節方法。
2. （２）前記の調整が、前記抗原の結合部位と似ているオリゴペプチドを前記表面 レセプターと結合させ、前記の機能的に同等の複合体を形成することである請求 の範囲第１項記載の方法。
3. （３）前記の調整が、前記細胞を、前記細胞上の前記抗原の数に影響を及ぼす薬 剤に接触させることである請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）前記の調整が、抗体を前記抗原又は表面レセプターの一方に結合させて、 前記複合体の形成を抑制することである請求の範囲第１項記載の方法。
5. （５）前記の調整が、オリゴペプチドを前記抗原に結合させて前記複合体の形成 を抑制することである請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）前記レセプターがそのリガンドヘの結合の後にインターナリゼーションさ れる請求の範囲第１項記載の方法。
7. （７）（１）主要組織適合性複合体ヒトクラスＩＨＬＡ−Ｂ又は−Ｃ抗原と、（ ２）細胞上の内分泌系表面レセプターとの間の結合複合体又は機能的に同等の結 合複合体の数を、前記表面上の前記抗原の数を変えることにより、又は前記抗原 若しくはレセプターに結合することができる成分を添加して結合複合体の生成を 模倣するか又は抑制することにより調整し、これにより前記レセプターの応答を 調整することを含むヒト細胞の内分泌系表面レセプター応答を調節する方法。
8. （８）前記調整が、ＨＬＡ−Ｂ又は−Ｃ抗原のα１ドメインのアミノ酸配列と実 質的に同じアミノ酸配列を有する少なくとも６アミノ酸のオリゴペプチドを前記 表面レセプターに結合することである請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）前記の配列が、アミノ酸５５〜９０のアミノ酸配列の配列内にある請求の 範囲第８項記載の方法。
10. （１０）前記オリゴペプチドの前記アミノ酸配列が前記抗原のアミノ酸配列と同 一であり、少なくとも約８アミノ酸であり、配列ＲＹＹを含む請求の範囲第８項 記載の方法。
11. （１１）（１）主要組織適合性複合体ヒトクラスＩＨＬＡ−Ｂ又は−Ｃ抗原又は 他の哺乳類の同等のものと、（２）細胞上のインシュリンレセプターとの間の結 合複合体又は機能的に同等の結合複合体の数を、前記表面上の前記抗原の数を変 えることにより、又は前記抗原若しくはレセプターに結合することができる成分 を添加して結合複合体の生成を模倣するか又は抑制することにより調整し、これ により前記レセプターの応答を調整することを含む哺乳類の細胞のインシュリン レセプター応答を調節する方法。
12. （１２）前記調整が、前記インシュリンレセプターを、前記抗原のａ′ードメイ ンの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、少なくとも約８アミノ酸のオ リゴペプチドと接触させることにより行われる請求の範囲第１１項記載の方法。
13. （１３）前記配列が、アミノ酸５５〜９０のアミノ酸配列の配列内にあり、配列 ＲＹＹを含む請求の範囲第１２項記載の方法。
14. （１４）前記アミノ酸配列が、アミノ酸６１〜８５の配列である請求の範囲第１ ３項記載の方法。
15. （１５）主要組織適合性複合体ヒトクラスＩＨＬＡ−Ｂ又は−Ｃ抗原又は他の哺 乳類の同等のもののα′−ドメインの配列であって、実質的に下記の配列単位の 一つの範囲内のもの由来の配列からなるものを含む少なくとも８アミノ酸のオリ ゴペプチド。 （ａ）ＤＴａａ３２ＦＶＲＦＤＳＤａａ４０ａａ４１（ｂ）ＦＶＲＦＤＳＤａａ ４０ａａ４１ＳＰＲａａ４５（ｃ）Ｗａａ５２ＥＱａａ５５ａａ５６ＧＰＥＹＷ （ｄ）Ｗａａ６１ａａ６２ａａ６３Ｔａａ５５ａａ６６ａａ６７Ｋａａ６８ａａ ７０ａａ７１Ｑ（ｅ）Ｗａａ６１ａａ６２ａａ６３ａａ６４ａａ６５ａａ６６ａ ａ６７Ｋａａ６９ａａ７０ａａ７１ａａ７２ａａ７３ａａ７４ａａ７５ａａ７６ ａａ７７ａａ７８ａａ７９ａａ８０ａａ８１ａａ８２ａａ８３ａａ８５ａａ８６ （Ｆ）ＥＱａａ７３ａａ７４ＲＶａａ７７ａａ７８Ｒａａ８０ａａ８１ａａ８２ ＲＹＹ配列中、ａａ３２は、任意の炭素原子数４ないし６の中性脂肪族アミノ酸 であり、 ａａ４０はＧ，Ａ，Ｄ又はＥ、 ａａ４１はＧ，Ａ，Ｄ又はＥ、 ａａ４４はＰ，Ｎ，又はＱ、 ａａ４５は任意の脂肪族アミノ酸、 ａａ５２はＶ，１，Ｌ又はＭ、 ａａ５５は任意の荷電脂肪族アミノ酸、ａａ５６は荷電アミノ酸、 ａａ６１はＤ又はＥ、 ａａ６２はＫ，Ｒ，Ｇ又はＡ、 ａａ６３は炭素原子数４ないし６の塩基性のもの以外の任意の脂肪族アミノ酸、 ａａ６４はＳ，Ｔ又はＭ、 ａａ６５は炭素原子数４ないし６の任意の極性又は塩基性アミノ酸、 ａａ６６は任意の炭素原子数４ないし６の脂肪族アミノ酸、ａａ６７は任意の中 性脂肪族又は芳香族アミノ酸、ａａ６８はＫ又はＲ ａａ６９は任意の脂肪族中性アミノ酸、ａａ７０は炭素原子数３ないし６の酸性 のもの以外の任意の脂肪族アミノ酸、 ａａ７１は塩基性のもの以外の任意の脂肪族アミノ酸、ａａ７２はＮ又はＱ、 ａａ７３はＳ，Ｔ，Ｆ，Ｙ，Ｈ又はＷ、ａａ７４はＤ，Ｅ，Ｆ，Ｙ，Ｈ又はＷ、 ａａ７５はＫ又はＲ、 ａａ７６は炭素原子数４ないし６の塩基性のもの以外の脂肪族アミノ酸、 ａａ７７は炭素原子数３ないし６の極性脂肪族アミノ酸、ａａ７８は炭素原子数 ５ないし６の中性脂肪族アミノ酸、ａａ７９はＫ又はＲ、 ａａ８０は炭素原子数３ないし６の中性脂肪族アミノ酸、ａａ８１は中性脂肪族 の非極性アミノ酸、ａａ８２は酸性のもの以外の脂肪族アミノ酸、ａａ８３は酸 性のもの以外の脂肪族アミノ酸、ａａ８４及び８５は芳香族アミノ酸であり、た だし３つより多いアミノ酸の突然変異、例えば欠失、挿入又は置換は存在しない 。
16. （１６）前記オリゴペプチド配列が下記の単位の範囲内の由来である請求の範囲 第１５項記載のオリゴペプチド。 ＷＤ／ＥＲａａ６３ＴＱ／Ｒａａ６６ａａ６７Ｋａａ６９ａａ７０ａａ７１ＱＴ ／Ｗａａ７４ＲＶ／Ｅａａ７７ＬＲａａ８０Ｌ／ＡＬ／ＲＧ／ＲＹＹ。 配列中、ａａ／ａａはいずれかのアミノ酸が存在しうることを意味する。
17. （１７）少なくとも１つのアミノ酸に共有結合した請求の範囲第１５項記載のオ リゴペプチドを含み、前記アミノ酸が野性種のアミノ酸以外のものであるペプチ ド抱合体。
18. （１８）前記少なくとも１つのアミノ酸が脊椎動物の宿主の免疫応答を刺激する ことができる免疫原性ポリペプチドである請求の範囲第１７項記載のペプチド抱 合体。
19. （１９）ＭＨＣクラス１抗原依存レセプターを含むと考えられるサンプルを請求 の範囲第１６項記載のペプチド抱合体と結合させ、そして 前記ペプチド抱合体と前記レセプターとの複合体の存在を検出することを含む、 細胞表面又は溶解物の少なくとも一部に存在するＭＨＣクラス１抗原依存レセプ ターの存在の検出方法。
20. （２０）ＭＨＣクラス１抗原依存レセプターを含むと考えられるサンプルを請求 の範囲第１５項記載のオリゴペプチドと結合させ、そして 前記オリゴペプチドと前記レセプターとの複合体の存在を検出することを含む、 細胞表面又は溶解物の少なくとも一部に存在するＭＨＣクラス１抗原依存レセプ ターの存在の検出方法。
21. （２１）直接又は間接に検出されうるシグナルを提供することができる標識に結 合した請求の範囲第１５項記載のオリゴペプチド。