JP2004502134A - レセプター結合化合物およびそれらの同定のための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、一般に、Gタンパク質共役レセプター(「GPCR」)に関し、そしてより詳細には、Gタンパク質共役レセプターに結合する化合物に関する。本発明の方法は、Gタンパク質共役レセプターに結合する治療化合物を同定および調製することによって、疾患の処置に有用である。本発明は、Gタンパク質共役レセプターについての結合化合物の組成物を提供し、そしてGタンパク質共役レセプターについての結合化合物を同定するための方法を提供する。本発明はまた、このような化合物を含む治療剤も提供する。
Description
【0001】
(関連出願)
本出願は、米国特許出願第60/190,946号、同第60/190,996号および同第60/191,299号の利益を主張し、これらの各々の開示は、参考として本明細書に援用される。代理人書類番号CNS−005およびCNS−007により識別される2001年3月20日に出願された出願への参照もまた行われ、これらの各々の開示は、本明細書に参考として援用される。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、一般に、Gタンパク質共役レセプター(「GPCR」)に関し、そしてより詳細には、Gタンパク質共役レセプターに結合する化合物に関する。本発明の方法は、Gタンパク質共役レセプターに結合する治療化合物を同定および調製することによって、疾患の処置に有用である
(発明の背景)
レセプターは、一般に、抗原、ホルモンまたは神経伝達物質のような細胞外因子と弱い可逆的結合を形成する、細胞膜中または細胞内に位置する分子構造である。各レセプターは、特異的因子と結合するために設計されている。レセプターの特定のファミリーに、7回膜貫通(「7TM」)、Gタンパク質共役レセプター(「GPCR」)がある。これらのレセプターは、これらレセプターが結合した細胞外因子からシグナルを伝えるために、グアニンヌクレオチド結合性タンパク質(「Gタンパク質」)と連結する。このGタンパク質は、グアニンジホスフェート(「GDP」)と結合するとき、Gタンパク質は不活性であるか、または「オフ・ポジション」にある。同様に、このGタンパク質がグアニントリホスフェート(「GTP」)と結合するとき、Gタンパク質は活性であるか、または「オン・ポジション」にあり、それによって細胞内の生物学的応答の活性化が媒介される。
【0003】
一般に、身体中のほとんどすべての細胞の活性は、細胞外シグナルにより調節されている。ヒト中および広範な範囲の生物との多くの生理学的事象は、GPCRを経由する、タンパク質媒介膜貫通シグナル伝達を用いる。特定のGPCRからのシグナルは、細胞中のGタンパク質の活性化を引き起こす。シグナルの大部分は、GPCRにより細胞内部に伝達される。シグナルの伝達は、リガンド結合および連結Gタンパク質の活性化により達成される。このシグナル伝達プロセスには多くの局面が存在し、これには、GPCRの複数のレセプターサブタイプおよびそれらのGタンパク質連結相当物、ならびに種々の連結細胞内メッセンジャーが含まれる。このシグナル伝達は、関与するタンパク質に依存して、細胞内プロセス(単数または複数)の全体的活性化もしくは部分的活性化または不活性化を生じ得る。GPCRに結合する重要なシグナル伝達分子または神経伝達物質は、例えば、モルヒネ、ドパミン、ヒスタミン、5−ヒドロキシトリプタミン、およびアデノシンを含む。
【0004】
GPCRは、タンパク質のスーパーファミリーを構成する。現在、2000を超えるGPCRが文献で報告され、これらは、3つのファミリーに分類される:ロドプシン様ファミリー、代謝調節型グルタミン酸ファミリー、およびカルシトニンレセプターである。例えば、Ji THら、J.Biol.Chem.273(28):17299−302(1998)を参照のこと。報告されたGPCRは、特徴付けられたレセプター、およびリガンドが同定されていないオーファンレセプターの両方を含む。例えば、Wilson Sら、G protein−coupled receptors.Haga T、Bernstein G編 CRC press、Boca Raton、97−116頁(1999):Wilson Sら、Br.J.Pharmacol.125(7):1387−92(1998);およびMarchese Aら、Trends Pharmacol.Sci.20(9):370−375(1999)を参照のこと。GPCRの数の多さにもかかわらず、一般に、各GPCRは、類似の分子構造を共有している。各GPCRは、種々の長さのアミノ酸残基のストリングを含む。GPCRは、トランスメンブレンと呼ばれる7つの別のコイルにある細胞膜内にある。GPCRのアミノ末端は、細胞外ループを有して細胞の外側にあり、その一方、カルボキシル末端は、細胞内ループを有して細胞の内側にある。
【0005】
一般に、三次構造の類似性もまた同様にGタンパク質によって共有されている。代表的には、Gタンパク質はまた、ヘテロトリマーGタンパク質とも呼ばれ、3つのサブユニット、α、βおよびγからなる。代表的なGタンパク質では、このαサブユニットは、GTPaseドメインおよびαヘリックスドメインの2つのドメインを含む。このGTPaseドメインは、βシートを取り囲むヘリックスを含む。αヘリックスドメインは、Gタンパク質に特有であり、そして5つのより短いヘリックスにより取り囲まれた長い中央ヘリックスを含む。βおよびγサブユニットは、しばしば、β−γダイマーと呼ばれる。このβサブユニットは、プロペラ上にブレードのように配置されたシート、αヘリックスおよびこのヘリックスを「プロペラブレード」と連結するループを含む、「βプロペラ」タンパク質である。その一方、γサブユニットは、一般に、内因性の三次構造をもたず;それに代わって、構造的支持は、βサブユニットに依存すると考えられている。βサブユニットとの相互作用は、一部、個々のサブユニットのN末端ヘリックス間のコイルドコイル相互作用によって媒介されると考えられている。
【0006】
GPCRに対するリガンドは、低分子ならびにペプチドおよび小タンパク質を含む。これらのリガンドとそれらのレセプターとの間の相互作用は、システムによって変動するが、それらはすべて、4つの細胞外ドメインおよびN末端のいくつかにある残基との相互作用を必要とし得る。既知のリガンドをもつGPCRは、多発性硬化症、糖尿病、慢性関節リウマチ、喘息、アレルギー、炎症性大腸炎、いくつかの癌、甲状腺疾患,心臓病、網膜色素変性症、肥満、神経学的障害、骨粗鬆症、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染および後天性免疫不全症候群(「AIDS」)に関連している。例えば、Murphy PHら、Pharm.Rev.52(1):145−176(2000);Mannstadt Mら、Am.J.Physiol.277(5):F665−75(1999);Berger EAら、Ann.Rev.Immunol.17:657−700(1999);Saunders Jら、Drug Discov.Today4(2):80−92(1999);Hebert TEら、Biochem.Cell.Biol.76(1):1−11(1998);Jacobson EDら、Dig.Dis.15(4−5):207−42(1997);Meji JT、Mol.Cell.Biochem.157(1−2):31−8(1996);およびChanmers Jら、Nature 400:261−4(1999)を参照のこと。一般に、Gタンパク質共役レセプターは、結合するリガンドのタイプに基づき、異なるクラス:ペプチド、生体アミン、ヌクレオチド関連、脂質ベース、アミノ酸ベース、および網膜(すなわち光ベース)、にさらに分類され得る。特に重要なのは、例えば、CCケモカインレセプター5およびCXCケモカインレセプター4のようなペプチド基質を結合するレセプターのクラスであって、これは、最大の規定されたクラスである。
【0007】
GPCRは、シグナル伝達のためのレセプターとして供されることが示されているが、研究者が、GPCRの高解像度X線結晶学的構造を得ることは困難であった。なぜなら、ネイティブな立体配座のために脂質との複雑な相互作用を必要とする7TMタンパク質を結晶化することの困難性のためである。脂質との相互作用の必要性はまた、GPCRの生物学的に活性な形態の調製を困難にする。なぜなら、これらの脂質の不在下では、これらは、可溶化の間に生物学的活性な立体配座を保持するために多大な注意を払わなければ、特異的にリガンドを結合する能力が最小であるかもしくはその能力のない、変性された凝集物を容易に形成するからである。X線構造の非存在下で、リガンド結合に関与するGPCRの領域を規定するために、種々のアプローチが用いられている。これらのアプローチは、一般に、GPCRの活性のための構造的要求を研究するために、非ヒトホモログ、キメラレセプター、および点変異体との結果を比較することを含む。
【0008】
例えば、CCケモカインレセプター5(「CCR5」)およびCXCケモカインレセプター4(「CXCR4」)のような、HIV感染およびAIDSに関連する特異的GPCRは、HIVのコレセプターとして供され、その結果、それらは、HIVと相互作用し、細胞中へのウイルスの侵入を容易にする。従って、研究は、細胞中へのウイルスの侵入を阻害する治療的薬剤として作用する、天然リガンドを同定することを求めている。その他のGPCRに関し、CCR5およびCXCR4は、可溶化および精製することが非常に困難である。なぜなら、それらは、通常、折り畳まれ、かつ細胞膜のネイティブな脂質の存在下で維持される必要があるからである。
【0009】
従って、当該分野では、GPCR結合性化合物を同定する方法、および、例えば、HIV感染およびAIDSのような疾患および障害を防止または処置するためのGPCR結合性治療剤の同定に対する必要性がある。このような治療剤は、GPCRへの天然リガンドの結合を阻害し得る、ペプチド、ペプチド模倣物、または低分子を含み得る。このような方法および組成物は本明細書中に提供される。
【0010】
(発明の要旨)
本発明は、GPCRに結合する化合物、およびこれらの結合性化合物を同定する方法を提供する。1つの実施形態では、GPCRに結合するモチーフおよびGPCRに結合し得るリガンドを提供するためのスクリーニング方法が提供される。別の実施形態では、本発明は、例えば、HIV感染およびAIDSのような疾患または障害の予防または処置における使用に適切な、治療ペプチド、ペプチド模倣物、または低分子の設計および同定を含む。
【0011】
1つの実施形態では、本発明の方法は、GPCRに結合するモチーフのスクリーニングおよび同定、ならびにその潜在的なリガンドのスクリーニングに有用な、線状および環状ペプチドライブラリーの合成および精製を提供する。本発明の方法は、このようなライブラリーにおける使用のための線状または環状ペプチド中への非天然アミノ酸およびD立体配座のアミノ酸の取り込みを提供する。このようなアミノ酸を有するペプチドを含むライブラリーは、増大した結合親和性およびタンパク質分解に対する抵抗性から生じるインビボの作用の持続時間を示す。
【0012】
好ましい実施形態では、本発明は、リードリガンド同定工程のために、ペプチド(線状および環状、天然および非天然アミノ酸)、ペプチド模倣物、および低分子化合物の高度に多様なライブラリーの使用を提供する。このようなリガンドは、GPCR結合活性に対し、直接的または間接的にアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【0013】
好ましい実施形態では、本発明は、予備的なモチーフ情報の同定のためのファージディスプレイ方法の使用、次いで、本発明の精製されたレセプター調製物および高度に多様なライブラリーを用いるアフィニティー精製の付加的なラウンドを提供する。特に好ましい実施形態では、ファージディスプレイ技術は、環状ペプチドおよび/またはペプチド模倣物ライブラリーの使用と組み合わせられる。
【0014】
本発明の別の実施形態では、コンピューター支援設計技術を用い、GPCR活性に対するアゴニストまたはアンタゴニスト能力について、リード化合物を、実質的にスクリーニングし、同定し、設計し、または評価する。このような技術は、GPCRおよび潜在的な結合パートナーの両方の分子情報および構造情報に基づき、このタンパク質を結合パートナーと実際に整列することによって、コンピューターで生成した三次元イメージを用いる。コンピュータ支援スクリーニングのために設計されたライブラリーの場合では、リードの最適化のために必要な大量の情報は、ライブラリー設計から直接得られる。1つの実施形態では、潜在的なリードは、実際のライブラリーの予備スクリーニングまたは特定のその他の手段により同定される。本発明の1つの実施形態は、構造を基礎にした合理的薬物設計による生物学的に適切や薬物のスクリーニングを含む。このような場合では、タンパク質(または類似のファミリーメンバー)、ペプチドまたは分子の三次元構造が決定され、そして潜在的なアゴニストおよび/またはアンタゴニストが、コンピューターモデリングで支援されて設計される。本発明の好ましい実施形態では、適切な薬物が同定された後、この薬物をGPCRと接触させ、それによって、結合複合体が、可能な薬物とGPCRとの間で形成される。薬物をGPCRに接触させる方法は、一般に、薬物開発の技術分野の当業者により理解される。
【0015】
別の実施形態において、本発明は、部分的に精製されたGPCRの、治療的に有用な化合物の同定において密に結合するリガンドの選択、同定、および改良を実施するための因子としての使用を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、修飾されたGPCRを生成するための標識方法の使用を含み、このタンパク質は、スクリーニング方法に関与する精製工程および同定工程を容易にするように機能する。別の実施形態において、本発明は、ベクター中に操作された適切な特異的プロテアーゼ部位を有する標識配列(すなわち、GST、FLAG、6×His、2重標識されたFLAG−GST、C−MYC、MBP、V5、Xpress、CBP、HA)に融合されたGPCRに対応する核酸配列を含む。
【0016】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、GPCRの可溶化および固定化を提供し、本明細書において提供されるリガンド選択方法を容易にする。GPCRは、任意の供給源(不活性な沈殿したタンパク質調製物;細胞膜調製物;および細胞全体の調製物が挙げられるが限定されない)に由来し得る。1つの実施形態において、本発明は、バキュロウイルス発現系または任意の他の適切な発現系由来の膜を用いて、一般的な親和性判定について、コンビナトリアルライブラリーを直接スクリーニングする方法を提供する。本発明の1つの実施形態において、部分的に精製されたGPCRは、密な結合リガンドの選択、同定、および改良の実施に用いられる。好ましい実施形態において、部分的に精製された標識化GPCRは、隔離された形態で使用され、多様化したライブラリー(集中または高度な多様化)を密に結合するリガンドのアフィニティー精製のためにスクリーニングされる。本発明の好ましい実施形態において、適切なリガンドの可溶化および固定化についての条件は、低塩(例えば、低マグネシウム濃度または低カルシウム濃度);および塩化ナトリウムなし(「NaCl」)(0.0nM NaCl)での使用を提供する。
【0017】
別の実施形態において、本発明は、N末端が特異的にブロックされたペプチドまたは配列決定し得ない他のアナログを有する固定されたタンパク質から、ライブラリーの結合成分を溶出する工程を包含する。なお別の実施形態において、本発明は、コンビナトリアルライブラリーを樹脂固定化タンパク質に結合する工程を包含する。別の実施形態において、本発明は、標識化配列を有する精製ポリペプチドを含み、このポリペプチドは、アッセイのために適切な親和性樹脂上に固定化され得る。さらなる実施形態は、N末端が特異的にブロックされたペプチドまたは配列決定し得ない他のアナログを用いてその結合ライブラリーを有する標識化されたタンパク質を放出または溶出する工程を包含する。なお別の実施形態において、本発明の方法は、親和性樹脂上に固定化された後およびコンビナトリアルライブラリーが複合体を放出するために結合された後、目的のタンパク質から標識を、(タンパク質/ベクター内で設計されるような)特異的なプロテアーゼを用いて、切断する工程を包含する。
【0018】
なお別の実施形態において、標的リガンドは、直鎖状ペプチドのライブラリー、ペプチド模倣物のライブラリー、環状ペプチドのライブラリー、またはファージディスプレイ技術によって同定された最初のモチーフを用いて開発された重点ライブラリー(focused library)あるいは上記のいずれかを組合わせたライブラリーから選択される。別の実施形態において、標的リガンドは、ペプチドもしくは他のリガンドを用いてか、またはpH変化もしくはカオトロピックな因子(例えば、尿素または塩酸グアニジン)(これらは、水の水素結合構造および疎水性の影響を減少することによって濃縮された溶液中のタンパク質を変性し得る)を用いることによって、レセプター調製物から溶出される。本明細書中に開示される方法を用いて同定されたGPCRに対するリガンドがまた、本発明によって意図される。本発明のなお別の実施形態において、タンパク質配列決定技術が、アフィニティー精製工程によって同定されるリガンドの構造決定のために使用される。
【0019】
別の実施形態において、本発明は、例えば、疾患または障害(例えば、HIV感染またはAIDSのような)の処置に適切な、本発明の方法を用いて同定されたGPCR結合の低分子アンタゴニストのような治療剤を含む。別の実施形態において、疾患または障害に罹患する患者は、本発明の方法(例えば、GPCRの低分子アンタゴニスト結合のような)を使用して同定された化合物を含む治療剤で処置される。別の実施形態において、疾患または障害に罹患する患者(例えば、HIV感染およびAIDSのような)は、治療剤(例えば、GPCRインヒビターおよび逆転写酵素ならびにプロテアーゼインヒビターを含む)の併用した使用を通して処置される。
【0020】
本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明が、以下に提供される。本発明の他の実施形態が、続く詳細な説明を再考に基づいて明らかである。
【0021】
(発明の詳細な説明)
一般的に、本発明の方法は、GPCRの結合モチーフの決定を提供する。さらに、本発明の方法は、GPCRとその天然のリガンドとの相互作用の、アゴニストまたはアンタゴニストの同定を提供し、それによって、治療リード化合物の同定を提供する。本発明において特に有用である、ライブラリー設計のための方法およびライブラリー合成のための方法、ならびにライブラリーのスクリーニングのための方法が、以下の特許および特許出願に記載され、これらの各々の開示は、本明細書中に参考として援用される:Cantleyら、米国特許第5,532,167号;Cantleyら、U.S.S.N.08/369,643(1998年12月17日出願);Cantleyら、U.S.S.N.08/438,673(1999年11月12日出願);Hung−Senら、U.S.S.N.09/086,371(1998年5月28日出願);Hung−Senら、U.S.S.N.08/864,392(1999年6月24日出願);ならびにLaiら、U.S.S.N.09/387,590(1999年8月31日出願)。
【0022】
本発明の方法に従って、GPCRは、クローン化され、そして発現され、そして活性について試験される。GPCRは、GPCRのリガンド結合特性の特徴の決定を容易にするために、C末端上またはN末端上に標識され得る。例示的な標識としては、6×His、FLAG、GST、V5、Xpress、c−myc、HA、CBD、およびMBPが挙げられるが、これらに限定されない。標識されたGPCRは、例えば、天然および/もしくは非天然の、アミノ酸、ペプチド模倣物および/もしくは低分子を有する、直鎖状ペプチドならびに/または環状ペプチドを含むライブラリーのスクリーニングにおいて使用される。このようなペプチド模倣物および低分子は、任意の天然または合成の、化合物、組成物、化学物質、タンパク質、またはGPCRの結合化合物に関するスクリーニングに使用される上記のいずれかの任意の組み合わせもしくはGPCRの結合化合物に関するスクリーニングに使用される上記のいずれかの任意の改変を含み得る。
【0023】
1つの局面において、本発明の方法において有用な配向された変性ペプチドライブラリー方法は、リガンド結合について重要であることが知られているかもしくは疑われる非変性位置中の1つ以上のアミノ酸、ならびに、例えば変性位置におけるおおよそ等しい割合の18アミノ酸からなる可溶性ペプチドライブラリーを使用する。システインおよびトリプトファンは、配列決定に対する特定の分析的な困難性を回避するために削除され得る。このようなライブラリーは、図1に示され、ここで、Xは、任意の18アミノ酸からなる変性位置を表し、そしてリジンもしくはアルギニンは、非変性位置に固定されている。さらなる残基が、図1に示される配列のN末端に付加され得る。なぜなら、最初および第2の配列決定サイクルにおいて妨害物質がしばしば存在するからである。さらなる残基が、C末端に付加され得、シーケンサーカートリッジ中のフィルターへこのポリペプチドを良好に固着するためのアミノ酸を提供する。
【0024】
本発明の別の局面は、続く同定工程のために、ペプチド(直鎖状アミノ酸および環状アミノ酸、天然アミノ酸および非天然アミノ酸)、ペプチド模倣物、ならびに低分子化合物の非常に多様なライブラリーの使用を提供する。例えば、これらのリガンドは、レセプターに対するこの機能において、反発的であるかまたは拮抗的であり得る。一般に、本発明は、治療的に有用な化合物の経路として密接に結合したリガンドの選択、同定、および改良を実行するための因子として、部分的に精製されたGPCRを使用する。さらに、本発明は、本明細書中で提供される効率的なリガンド選択方法を容易にする、可溶化手順および固定化手順の開発ならびに使用を提供する。詳細には、特定のGPCRの効率的なリガンド選択についての最適な条件は、低塩(例えば、マグネシウムもしくはカルシウム濃度が低いかまたは存在せず、そしてNaCl濃度が存在しない使用を包含する。例えば、不活性な沈殿タンパク質、細胞膜調製物および全細胞調製物を使用するリガンド選択方法が、さらに本明細書中に提供される。
【0025】
本発明の1つの局面において、スクリーニング工程は、ファージディスプレイ技術を包含し得る。このようなファージディスプレイシステムは、選択された標的分子に結合するペプチドライブラリーをスクリーニングするため、および所望の特性についてこれらのタンパク質をスクリーニングするための可能性を有する機能的タンパク質を提示するために、使用されてきた。このディスプレイアプローチのより最近の改良は、バクテリオファージ表面上に酵素ならびに抗体フラグメントを発現することを可能にし、従って、特定のリガンドで選択することによって特定の特性の選択を可能にする。例えば、Smith SFら、Methods Enzym.217:228〜257(1993)を参照のこと。ファージディスプレイ方法は、予備モチーフの情報の同定のために使用され、そして続いて、本発明の精製されたレセプター調製物および非常に多様なライブラリー(特に、環状ペプチドおよびペプチド模倣物ライブラリー)を用いるさらなる回数の親和性精製のために使用され得る。このファージディスプレイ方法は、天然のアミノ酸のモチーフを同定することを可能にする。ファージディスプレイに由来する情報は、例えば、増強された薬学的特性を有するリガンドを選択するために、新規なアミノ酸アナログまたは環状ペプチドを含む合成ライブラリーを使用する親和性精製方法中に取り入れられ得る。初期ライブラリー、二次ライブラリーおよび三次ライブラリーの使用は、結合部位の特異性の定義をより完全にする。初期ライブラリーからの情報を組み込む二次ライブラリーが、配列決定され得る。初期ライブラリーにおいて、いくつかの変性位置が、特定のアミノ酸について高い性能をもたらし得、そしてこれらは、第2のライブラリーにおいて好ましいアミノ酸からなる非変性位置になり得る。例えば、Wu R、J Biol Chem 271(27):15934〜41(1996)を参照のこと。
【0026】
あるいは、またはさらに、コンピューター補助設計技術が、ペプチド、ペプチド模倣物および低分子のスクリーニングならびに/または設計において使用され得る。例えば、GPCR配列、膜貫通予測、および変異誘発研究から得られた任意の構造情報に加えて、ロドプシンの結晶構造(例えば、Palczewskiら、Science 289(5480):739〜745(2000)を参照のこと)のような情報と共に、コンピューター補助設計技術は、実質的に、そのGPCR活性に関して潜在的な化合物をスクリーニング、同定、設計および検査し得る。適切なペプチド、ペプチド模倣物および低分子の設計において補助するために使用され得るコンピュータープログラムとしては、例えば、Dock、FrodoおよびInsightが挙げられる。生物学的に適切な薬物のスクリーニングについての方法の例は、合理的な薬物設計に基づく構造に依存する。このような場合、このタンパク質、ペプチドまたは分子の三次元構造は、決定されるかまたはモデリングされ、そして可能性のあるアゴニストおよび/もしくはアンタゴニストは、コンピューターモデリングを用いて設計される。例えば、Buttら、Scientific American,12月号 92〜98(1993);Westら、TIPS,16:67〜74(1995);Dunbrackら、Folding&Design,2:27〜42(1997)を参照のこと。適切な薬物が同定された後、この薬物はGPCRと接触し、ここで、結合複合体は、可能性のある薬物とGPCRとの間で形成される。GPCRへの薬物の接触方法は、薬物開発分野の当業者によって一般に理解される。
【0027】
スクリーニング工程は、液相において実行されても良いし、またはアフィニティカラム上で固定されているGPCRを用いて実行されても良い。親和性樹脂を使用する標識化GPCRの固定化に加えて、配列決定の他の形態は、ライブラリーからの選択リガンドの親和性精製を実行するために使用され得る。これらの形態としては、以下の例が挙げられるがこれらに限定されない。このレセプターおよび結合ライブラリー成分は、平衡透析を使用して、非結合ライブラリー成分から分離され得る。この標識化レセプターは、特定の親和性膜に結合され得、これはプレートの形態であるか、または別々である。次いで、このライブラリーは、この膜と共にインキュベートされ得、そして容易に洗浄して、非特異的結合成分を除去し得る。サイズ排除方法論が、ライブラリーとのレセプターのプレインキューベーションの後に、非結合成分から精製レセプター結合ライブラリー複合体を分離するために使用され得る。さらに、レセプターを含むミセル複合体(これは、脂質ならびに界面活性剤を取り込んでも良いし、取り込まなくても良い)は、選択親和性成分の結合後に、差次的遠心分離によってライブラリーから分離され得る。一般に、高親和性リガンドは、低pHまたは高塩濃度を使用して放出され得、そして本明細書中に記載される配列決定によって構造が同定される。
【0028】
標的レセプターに対する最も高い親和性を有するこれらのリガンドを決定する目的で、一般に、200よりも多くのペプチドライブラリーが、それぞれのライブラリーのそれぞれの阻害結合を決定するためにスクリーニングされ得る。一般に、100μMで、10%より高い阻害は、親和性精製を介する配列の連続する評価のために有意であった。本発明のさらなる局面において、一旦、好ましいアミノ酸残基が、高い優先値(preference value)に起因してライブラリーの変性位置でGPCRによって同定されると、特定のペプチドは、ライブラリー合成のために使用されるのと同じ方法によって合成される。本発明の1つの実施例において、高優先値は、1よりも大きい。この値は、サンプルの値からコントロールの値を引き、そして参照値で割ることによって決定される。本発明の好ましい実施形態において、この優先値は、1.2よりも大きい。本発明のより好ましい実施形態において、この優先値は、2よりも大きい。同定されたペプチド配列の合成の後、このペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィ(「HPLC」)によって精製され、そして組成は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(「MALDI−TOF MS」)およびEdman配列決定によって確認される。一般に、相対的親和性は、レセプター精製において使用される放射標識結合アッセイを改変することによって測定され得る。
【0029】
親和性精製ペプチドから得られたモチーフの特異性を増強するために、他の方法が使用され得る。このライブラリーの結合成分は、特定のN末端ブロックペプチドまたは他の配列決定不可能なアナログを用いて固定化されたタンパク質から溶出され得る。ライブラリーの結合の後に親和性樹脂からの微量の汚染物の放出を避けるために、その結合ライブラリーで標識したGPCRの放出/溶出は、特定のN末端ブロックペプチドまたは他の配列決定不可能なアナログを使用して、達成され得る。これは、アセチル化FLAGペプチドを使用して行なわれ、樹脂からGPCR−FLAGレセプターを溶出し得る。あるいは、このGPCR由来の標識は、親和性樹脂上に固定化した後に、そしてコンビナトリアルライブラリーが複合体から放出される後に、特異的プロテアーゼ(タンパク質/ベクター中に設計されるような;エンテロキナーゼまたはトロンビンのいずれか)を使用して切断され得る。最後に、ライブラリーは、単一アッセイかまたはアレイアッセイにおいて、(有意に少ないタンパク質を使用して)レセプターに結合するライブラリーの能力について、例えば、Sf9細胞(Spodoptera frugiperda)もしくはHigh Five細胞(Trichoplusia ni)(両方共Invitrogenから入手し得る)由来のGPCR−含有膜を使用する結合アッセイによってプレスクリーニングされ得る。このスクリーニングは、GPCRならびに多くの直鎖状および環状ライブラリーを使用して、結合についての天然のリガンドを阻害する際の、これらのライブラリーの有効性を決定するために実行され得る。
【0030】
さらに、GPCRに加え、他のレセプターおよび可溶性タンパク質は、本方法を用いて、スクリーニングされて、治療的用途のアゴニストまたはアンタゴニストを生成し得る。本スクリーニング方法論に従うタンパク質の型の例は、1回膜貫通型タンパク質、PIGテールレセプター、プロゲステロンレセプター、アレスチン、核レセプター、サイトカインレセプター、および本質的には、任意のタンパク質結合タンパク質、または任意のペプチド結合タンパク質を含むが、これに限定されない。IL−12は、サイトカインレセプターの1つの型であり、これは、本発明の方法において、I型糖尿病のような疾患の処置のための治療的化合物を同定するのに有用である。例えば、Falcone Mら、Curr.Opin.Immunol.11:670〜676(1999)を参照のこと。PIGテールレセプターは、カテプシンD(25)およびナチュラルキラー細胞レセプター(例えば、CD48およびCD55)(26)を含む。例えば、Ogier−Denis Eら、Biochem.Biophys.Res.Comm.211(3):935〜42(1995);およびScubert Jら、Blood 76(6):1181〜7(1990)を参照のこと。プロゲステロンレセプターは、生物学な関連を有する周知の核レセプターである。例えば、Chauchereau Aら、J.Biol.Chem.275(12):8540〜8548(2000);Fewings PEら、J.Neurosurg.92(3):401〜405(2000)を参照のこと。アレスチンは、可溶性タンパク質結合タンパク質のファミリーであって、これは、シグナル終末における役割によって、広範な疾患に関与する。例えば、Wilson CJら、Curr.Biol.3(10):683〜6(1993)を参照のこと。これらは、本様式に容易に適用され得るタンパク質のわずかな例である。
【0031】
本発明の方法はさらに、HIV感染あるいはAIDSのような疾患または障害を有する患者の処置のために適切なGPCR活性に対して拮抗的である、ペプチド、ペプチド模倣物、および/または低分子を含む治療剤の設計を包含する。GPCRについての結合化合物ならびに最適な合成の同定およびそれらの精製は、多くの疾患または障害(例えば、AIDSおよびHIV感染など)の有効な処置を提供する。一般に、本発明の小さいペプチドリガンド結合化合物(環状ペプチドリガンドおよび直鎖状ペプチドリガンドの両方)は、増大した結合親和性および作用を有し、そしてタンパク質溶解に耐性であることを示す。例えば、CXCR4、CCR5、性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター(「GnRHR」)、および特定の環状ペプチドについてのライブラリー由来のペプチドは、標的タンパク質に対する増大した結合活性を示すことが、確認されている。
【0032】
本発明の特定の実施形態は、以下の実施例において記載され、これらは限定を意味するものではない。
【0033】
(実施例)
(実施例1:標識化GPCRの調製および配向された直鎖状ペプチドライブラリーを使用するスクリーニング)
種々のGPCRベクターを、レセプターの精製をより容易にする当業者に公知な標準的技術を使用して、エピトープ標識を含むバキュロウイルス発現系のために調製し得る。標識は、タンパク質のN末端またはC末端で組み込まれ得る。GPCRについて、このレセプターのC末端の標識は、組み込まれて、レセプターのリガンド結合特性(これはこの分子のN末端または細胞外領域にある)の特徴を決定する。C末端 6×Hisタグ構築物およびC末端FLAG構築物の構築は、実施例として以下で提供される。代替の標識としては、例えば、GST、V5、Xpress、c−myc、HA、CBDおよびMBPが挙げられ得る。これらの構築物を、当業者に公知の標準的な技術を使用して、類似の手順によって作製した。
【0034】
この6×Hisタグは、ニッケルキレート化を使用して、一段階精製を可能にする。GPCRのためのcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)ならびに所望の遺伝子の3’末端および5’末端についてのプライマー、ならびにこの遺伝子の中央を使用して、適切なcDNAライブラリーから単離し得る。C末端標識を作製するために、目的の遺伝子をE.coliベクター(pET30a)に、C末端6×Hisタグを用いてサブクローニングした。次いで、この新規に作製されたレセプターを切除し、そしてpBlueBac(バキュロウイルス転移ベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA))に連結した。この構築物を、制限消化および配列決定の両方を使用して分析し、次いで、タンパク質発現分野の当業者によって代表的に行なわれるように、発現のためにSf9昆虫細胞(Pharmingen,San Diego,CA)にトランスフェクトした。
【0035】
C末端細菌FLAG構築物を、Sigmaから入手し得る(pFLAG−CTC)。標準的な技術を使用する同様のストラテジーを、このベクターの構築に使用した。このGPCRをpFLAG−CTCプラスミドを用いて連結し、次いでC末端FLAG標識中にサブクローニングし、そして消化したpBlueBacベクター中に連結した。この構築物を、制限消化および配列決定の両方を使用して分析し、そして発現のためにSf9昆虫細胞またはHigh Five昆虫細胞中にトランスフェクトした。
【0036】
Sf9細胞またはHigh Five細胞においてGPCR遺伝子を発現するために、GPCR挿入物を含むpBlueBacベクターを、Bac−N−Blue DNAと共に、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションを用いて標準的な技術を使用して同時トランスフェクトした。GPCRを、相同組替えによってバキュロウイルスゲノム中に挿入した。細胞を、トランスフェクション後24時間から4〜5日までモニターした。約72時間後、このトランスフェクション上清を、標準的なプラークアッセイを使用して、組替えプラークについてアッセイした。組替えウイルスを有する細胞は、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドイル−β−D−ガラクトシド)の存在下で増殖させた場合、青いプラークを生成した。これらのプラークを精製し、そしてこの単離物を、標準的技術を使用する組替えの正確さについて、PCRによって確認した。これにより、高力価ストックを生成し、そして発現研究のために、感染をこのストックから標準的技術を使用して実行した。トランスフェクトについてのコントロールとしては、細胞のみおよび転移ベクターが挙げられる。
【0037】
GPCRの発現のための構築物は、開始ベクターpBlueBac4.5(Invitrogen)から作製され、上記ベクターにおけるトロンビンおよびエンテロキナーゼ切断部位を除去し得る。GSTタグは、PCRを用いてマルチクローニングサイトに添加されて、GSTタグを生じ、次いで、当業者に公知の標準的な手順を用いて、切断されたベクター(SmaI/EcoRI)に連結される。その後、ベクターは、操作の簡便化のためにLifetechから提供されるGateway技術を用いて、適合性にされる。これは、この技術(Lifetechから得られる)に所望される組換え部位を含む、SmaI部位カセットに連結されることによって達成される。目的のGPCRは、組換えのための接着部位を含むように遺伝子を伸長するためのプライマーを用いたPCRを使用して増幅される。次いで、このPCR産物を、バキュロウイルスベクターに、BPクロナーゼ(clonase)(相同組換えに必要とされる酵素)を用いて取り込み、バキュロウイルス発現のための、エンテロトキシンまたはトロンビン切断部位を伴わず、C末端GSTタグを有するGPCRを含む、ベクターを作製する。このベクターは、Sf9細胞に、発現に必要なウイルスストックの調製のために同時トランスフェクトされる。このウイルスは、精製されたプラークであり、PCRおよび配列決定されたクローンは、GPCRの発現のために使用され得る。3つのGPCRを有するこの構築物の時間経過は、レセプターの最大の発現に必要な時間がより少なく、タンパク質分解がより少ないことを実証した。例えば、CCR5、CXCR4、およびGnRHRについては、発現に24〜48時間必要とした。GnRHRおよびCCR5に、より少ないタンパク質分解が生じた。
【0038】
Sf9細胞またはHigh Five細胞においてGPCR標識化レセプターを発現するために、標識挿入物を含むpBlueBacベクターを、Bac−N−Blue DNAと共に、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションを用いて標準的な技術を使用して同時トランスフェクトした。この標識化レセプターを、相同組替えによってバキュロウイルスゲノム中に挿入した。細胞を、トランスフェクション後24時間から4〜5日までモニターした。約24〜72時間後、このトランスフェクション上清を、標準的なプラークアッセイを使用して、組替えプラークについてアッセイした。組替えウイルスを有する細胞は、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドイル−β−D−ガラクトシド)の存在下で増殖させた場合、青いプラークを生成した。これらのプラークを精製し、そしてこの単離物を、標準的技術を使用する組替えの正確さについて、PCRによって確認した。これにより、高力価ストックを生成し、そして発現研究のために、感染をこのストックから標準的技術を使用して実行した。トランスフェクトについてのコントロールとしては、細胞および転移ベクターが挙げられる。
【0039】
Sf9細胞またはHigh Five細胞を、当業者に公知である標準的技術を使用して、接着培養物および懸濁培養物の両方として維持した。この接着細胞を、コンフルエントになるまで増殖させ、そして1:5の比で、脱落技術(sloughing technique)を使用して継代した。懸濁細胞を、(剪断を最小にするために)0.1%のプルロニック(pluronic)F−68を有するスピナーフラスコ中で1×106細胞/mlの密度まで継代培養することによって2〜3ヶ月、維持した。
【0040】
組替えウイルスでの感染後の時間経過を使用して、標準的な技術を使用して発現についての最適な増殖条件を決定した。スピナーフラスコからの細胞のアリコートを、この時間経過ににわたって採取し、800×gで10分間4℃で遠心分離し、そして上清とペレットの両方を、SDS−PAGE/ウェスタンブロット分析によってアッセイした。このGPCRを、膜分画(ペレット)中にあると予測した。全ての実行可能な系を、発現のレベルについてこの様式でアッセイした。標準的放射性結合アッセイを、膜調製物において、天然リガンドを用いて行って、活性について系を評価する。しばしばあるオーファンレセプターの場合のように、天然リガンドが公知でない場合(ここで、レセプターの活性は、規定されていない)、この活性は、当業者に公知の標準的な細胞に基づくアッセイを用いて、Gタンパク質共役シグナル活性について、アッセイされる。
【0041】
この膜分画を、最初に全Sf9細胞をペレット化し(800×g、10分間4℃)、次いでこのペレットを溶解緩衝液に均質化によって再懸濁することによって単離する。代表的な溶解緩衝液は、中性pHの付近であり、そしてプロテアーゼインヒビターのカクテルを含み、この両方は、当業者にとって標準的な技術である。例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼは、阻害剤(例えば、PMSF、アプロチニン、ロイペプチン、フェナトロリン、ベンズアミジンHCl)と共に使用され得る。膜をペレット化する。可溶化をまた、異なる界面活性剤(例えば、β−ドデシルマルトシド、n−オクチル−グルコシド、CHAPS、デオキシコール酸、NP−40、TritonX−100、Tween−20、ジギトニン、両性洗浄剤、CYMAL、ラウロイルサルコシンなどであるが、これらに限定されない)によるこのレセプターの可溶化を、量および活性について比較した。可溶化をまた、変化するNaCl濃度を使用して行った。従来の考えにも関わらず、低塩(例えば、低カルシウムおよび低マグネシウム濃度)を使用する、実質的にNaClが存在しないこの可溶化の工程により、量および活性について比較した場合、予期しなかった最適な可溶化条件が得られた。0.0nMのNaClを有することで、カウンター直感(counter−intuitive)であるが、結合特性を有する可溶化および固定化候補(例えば、CCR5およびCXCR4)の場合、最もよい条件を提供した。単離のための候補を、以下に記載するように精製を達成した。
【0042】
可溶化および活性のための適切な界面活性剤(例えば、NP−40)を決定した後、GPCRを、膜分画から精製した。正確な精製スキームは、選択した構築物に依存し、これは活性および可溶化の簡便さの問題である。6×His標識化レセプターの精製のために、膜分画をNi−NTAカラム(Quiagen,Valencia,CA)上に界面活性剤(例えば、NP−40)の存在下でロードし、十分に洗浄し、そしてイミダゾールで溶出した。FLAG標識化レセプターの精製を、抗FLAG M2親和性マトリクス(Sigma,St.Louis,MO)を使用して、界面活性剤の存在下で実行し、そしてグリシンで溶出した。この精製を、本明細書において記載される実験中の系について見出される適切な界面活性剤(例えば、NP−40)の存在下で実行した。精製したレセプターの活性は、本明細書に記載されるように評価した。
【0043】
ペプチドを、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル/ter.−ブチル(「Fmoc」/「tBu」)に基づく方法を介し、Applied Biosystems 433A合成機を用いて、Rinkアミド樹脂(NovaBiochem、置換レベル0/.54mmol/g)上に取り付けた。tBuをAsp、Glu、Ser、ThrおよびTyrの側鎖の保護のために使用し、tert.−ブチルオキシカルボニル(「Boc」)をLysおよびTrpの側鎖の保護のために使用し、2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル(「Pbf」)をArgの側鎖の保護のために使用し、そしてトリフェニルメチル(「トリチル」,「Trt」)をCys、His、AsnおよびGlnの側鎖の保護のために使用した。合成のスケールを0.20mmolとした。この樹脂を、最初にN−メチルピロリジノン(「NMP」)で洗浄し、その後、ピペリジン:NMP(1:4)の1×3分および1×7.6分の処置をNα−Fmoc除去のために行った。全てのFmoc−アミノ酸を、以下の製造者のプロコトルに従ってN−[(1H−ベンゾトリアゾ−ル−1−イル)(ジメチルアミノ)メチレン]−N−メチルメタナミニウムヘキサフルオロホスフェートN−オキシド(N−[(1H−benzotriazol−1−ly)(dimethylamino)methylene])−N−methylmethanaminium hexafluorophosphate N−oxide)(「HBTU」)と結合した:(a)1.0mmolの誘導体化したアミノ酸を2.1gのNMP中に溶解した;(b)0.9mmolの、N,N−ジメチルホルムアミド(「DMF」)中で0.5MのHBTUをこのアミノ酸のカートリッジに添加し、そしてこの溶液を6分間混ぜ合わせた;(c)1.0mLの2.0MのN,N−ジイソプロピルエチルアミン(「DIEA」)を含有するNMPをこのカートリッジに添加した;(d)HBTU溶液をこの樹脂に移し、混ぜ合わせる間、気温で40分間反応させた。この樹脂を濾過し、そして総体積90mlのNMPで6回リンスして、そしてこのサイクルを繰り返した。高度に縮重し指向されたペプチドライブラリーを構築するためのこの1ポット法(one pot method)において、樹脂のバッチを、この樹脂のどのような分割もなしに、コンビナトリアルアミノ酸の混合物と反応させた。
【0044】
出発混合物中のアミノ酸濃度を調整することによって、相対的な結合速度を制御し、これによってライブラリー中のアミノ酸の等しい取りこみを確実にする。天然のBoc保護されたアミノ酸およびFmoc保護されたアミノ酸の混合物の1ポット合成に対しての最適化は、以前に記載されている(例えば、米国特許第5,225,533号;Ivanetichら、Combinatorial Chemistry,267巻、Academic Press,San Diego,CA USA、247〜260頁(1996);Buettnerら、InnovationおよびPerspectives in Solid Phase Synthesis:Peptides,Proteins,andNucleic Acids,Mayflower Worldwide Ltd.、Birmingham,UK,169〜174頁(1994);Ostreshら、Biopolymers 34:1681〜9(1994);Songyangら、Methods in Mol Biol 87:87〜98(1998);およびHermanら、Molecular Diversity 2:147〜155(1996)を参照)。開裂反応を、トリフルオロ酢酸(「TFA」):H2O:アニソール:トリイソプロピルシラン(「iP3SiH」)(87.5:5:5:2.5,約6mL)中のペプチジル樹脂を、3時間、25℃で攪拌することにより実施した(例えば、Hermanら、1996を参照)。濾液を回収して、この樹脂をさらにTFAで洗浄した。冷(−78℃)ジエチルエーテルを、合わせた抽出物に添加し、そしてこの溶液を−78℃まで冷却した。上清を除去した後、得られた沈澱物を、冷エーテルで数回洗浄して、氷酢酸中に溶解し、そして凍結乾燥した。
【0045】
環状ペプチドライブラリーに対して、Fmoc−Asp(OH)−ODmab(Dmab,4−[N−(1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソキシシクロヘキシリジン)−3−メチルブチル)アミノ]−ベンジル(4−[N−(1−(4,4−dimethyl−2,6−dioxoxcyclohexylidene)−3−methylbutyl)amino]−benzyl))は、上記のように鎖が伸長された後に、Rinkアミド樹脂にアンカーされた側鎖である。直鎖状のアセンブリの後、Dmab基およびFmoc基の除去を、ヒドラジン:DMF(1:49)を用いた7分間の処理およびピペリジン:NMP(1:4)の6×3分の処理のそれぞれによって、達成した。この樹脂を、手動の環化のために、ポリプロピレンフリットを含んだシリンジに移した。樹脂上のヘッドトゥテイル(head to tail)環化を、NMP:DMF:ジクロロメタン、メチレンクロリド、DCM)(1:1:1)中の1%Trition Xを含む溶液中の7−アザベンゾトリアゾ−ル−1−イロキシ)−トリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(「PyAOP」):DIEA(1:2、4当量)を用いて、55℃で2時間、実施した。未反応の直鎖状前駆体を、DMF中のFmoc−Nva−OH/PyAOP/DIEA(「Nva」、「ノルバリン」)(1:1:2、4当量)で、1×18時間および1×3時間、処理をした。続く上記のような開裂および側鎖の脱保護によって、環状ペプチドライブリーおよび対応する直鎖状(非環化)配列を含む混合物を産生した。所望の環状ペプチドライブラリーを精製して、逆相高速液体クロマトグラフィー(「RP−HPLC」)によって直鎖状夾雑物を除去した。
【0046】
ペプチドおよびペプチドライブラリーを、HPLC、MALDI−TOF MS(Louisiana State University)、およびエドマン分解によって、特徴づけた。MALDI−TOF MS分析によって、不完全な脱保護、脱ブロック化、またはアルキル化に起因する、高分子量の不純物の存在の検出が可能である。エドマン分解は、ライブラリー中の各縮重位置における各アミノ酸量についての定量的な情報を提供する。
【0047】
合成された出発ライブラリーは、単一の非縮重指向化アミノ酸(すなわち、M−X−X−X−X−R−X−X−X−X−A、ここでXは、システイン以外の全てのアミノ酸の縮重した等モル混合物である)を有する。環状ライブラリー(ヘッドトゥテイル)はまた、単一の、非縮重指向化アミノ酸を用いて調製した。これらの出発ライブラリーの使用を通して、いくつかの縮重した位置において最適化された残基を規定し、そして2次ライブラリーを作製し、これらの位置を固定する。例えば、ヘッドトゥテイル環化ライブラリー シクロ(M−X−X−X−X−R−X−X−X−X−N)は、(固定されたRから)第−4位はリジンであるべきであり、その第−2位はアスパラギン酸であるべきであり、第−1位はヒスチジンであるべきであり、そして第+3位はリジンであるべきであり、結果として第2ライブラリーは、シクロ(M−K−X−D−H−R−X−X−K−N)であることを示す。
【0048】
指向された線形ペプチドライブラリーを、固定化されたGPCRおよび単離された高親和性ペプチドの小画分を含むカラムに適用した。結合ドメインを使用したペプチドライブラリースクリーニングを示した概念図を、図2に示し得る。洗浄後、結合ペプチドをこのカラムから溶離した。次に、結合したペプチドおよびこのカラムに適用したライブラリー全体の両方を、別個にエドマン分解に供し、そして位置の関数としてアミノ酸分布を決定した。最後に、縮重位置でのアミノ酸の傾向を決定する。例えば、セリンが、出発ライブラリー中のアミノ酸の第+1位で5%であるが、高親和性ペプチド中の第+1位で、アミノ酸の15%である場合、第+1位はセリンに対する選択が存在する。その位置での優先値3が得られる。表1は、結合ドメインを使用したペプチドライブラリー法の使用の選択的な概観を提供する。
【0049】
【表1】
(実施例2:GSTタグ化CCR5の調製およびスクリーニング)
ライブラリーを、Rink Amide MBHA樹脂(置換:0.54mmol/gm)を使用して9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護基と共に、ABI 433A(Applied Biosystems,Forster City,CA)上に合成した。縮重位置に対するアミノ酸のほぼ等しいカップリングを得るために、アミノ酸量を、文献値を考慮して経験的に調節した。例えば、Hook W.ら、Fed.Proc.44:1323(1985)を参照のこと。例示的なカップリング試薬は、1当量のペプチドに対して1当量の、HBTU/HOBT/DIEAであった。開裂はカクテル(82% TFA、5%フェノール、5%チオアニソール、2.5% 1,2−エタンジチオール、5%水)によって達成した。ペプチドをメチル−tert−ブチルエーテルから沈澱した。ライブラリーをMALDI−TOF MS(Lousiana State University)およびアミノ酸配列決定によって特徴づけた。
【0050】
出発ライブラリーは、例えば、単一な非縮重指向化アミノ酸(すなわち、X−X−X−X−R−X−X−X−X)を使用した。2次ライブラリーは、いくつかの縮重位置に見出された最適な残基を固定化することにより調製し得る。例えば、X−X−X−X−R−X−X−X−Xは、第−4位がプロリンであるべきであり、その結果2次ライブラリーは、P−X−X−X−R−X−X−X−Xであることを示し得る。
【0051】
レセプターのGST形態を用いたペプチドライブラリーの使用を本明細書中で提供する。GSTタグ化GPCRの場合、このレセプターはこのライブラリーに曝露され得、そして、遠心分離によりこれらの膜を、ペレットすることによって、遊離ペプチドと結合したペプチドとの分離を達成した。GSTタグ化精製レセプターをペプチドライブラリー、約1μmoleのペプチドおよび約1nmolの結合部位と共にインキュベートした。インキュベーション後、結合したペプチドを伴ったレセプターを、遠心分離によって非結合ペプチドから分離した(ペレット中のレセプター・ペプチド複合体、上清中の非結合ペプチド)。非特異的に結合したペプチドを、徹底的な洗浄によって除去し得、そして低いpH(2.5以下)のペレットの再懸濁物を使用して結合したペプチドを除去した。このペプチドを配列決定し、コンセンサス配列を決定した。
【0052】
FLAG−タグ化GPCRを、ペプチドライブラリースクリーニングのために使用する場合、このレセプターを抗FLAG M2親和性マトリックス(St.Louis、MO)上に固定化した。さらなる精製アプローチはGST構築物および固定したグルタチオン(Pierce、Rockford、IL)を使用し得た。
【0053】
結合したペプチド混合物と出発ペプチドライブラリーの両方を、標準的な技術を使用して配列決定し得た。各アミノ酸量を、位置の関数として、決定した。各位置の各アミノ酸に対する優先値を、出発ライブライブラリーに存在するアミノ酸量とペプチドの結合画分とを比較することによって計算した。これらの手順を使用して、多くの結合ドメインと相互作用するペプチドの好ましい配列を生成し、そしてこれを表1に記載した。
【0054】
また、2次ライブラリーを出発ライブラリーからの情報を組み込むことによって配列決定し得た。特徴付けのこの第1のラウンドについて、ファージディスプレイ技術をまた使用して予備的な結合モチーフを同定する。ファージディスプレイ法は、天然のアミノ酸のモチーフの同定を提供する。ファージディスプレイ技術は、DNA配列を、ファージ被覆タンパク質の1つをコードする遺伝子中へ挿入することを包含する。この遺伝子を特定の位置に挿入して、その結果発現されたタンパク質挿入物は他の分子と相互作用し得る。結果として、コードされたペプチドまたはタンパク質配列を、ファージ表面上に提示し、そして結合のために曝露する。縮重ヌクレオチドを挿入することによって、各ファージは、異なったペプチド配列を発現し得る(「ファージライブラリー」)。このファージライブラリーと固定したレセプターとのインキュベーションを使用して、このレセプターに特異的に結合する配列を同定し得る。シグナルは、単離されたファージを増殖することよって増幅することができるので、微弱なシグナルでさえ検出し得る。ファージディスプレイから導出した情報は、薬学的特徴を増大したリガンドを選択するために、新規のアミノ酸アナログまたは環状ペプチドを含む合成ライブラリーを使用する、親和性精製法に対して適用可能である。出発ライブラリー、2次ライブラリーおよび3次ライブラリーの使用によって、結合部位の特異性の完全な定義を提供した。
【0055】
一旦、好ましいアミノ酸残基を、このライブラリーの縮重位置における、高い優先値を使用して同定すると、特異的なペプチドをライブラリー合成に用いたような方法によって合成し得た。これらをHPLCによって精製し、そして組成をMALDI−TOF MSによって確認した。
【0056】
相対的な親和性を、レセプター精製に使用したヨウ素化結合アッセイを改変することによって測定し得る。従って、この精製したレセプター膜から[125I]−リガンドを提示するこれらのペプチドの能力を測定し得た。しかし、この天然リガンドが既知でない場合、この活性を当該分野で標準的な細胞に基いたアッセイを使用して測定し得る。また、会合定数を当該分野で標準的な技術を使用して決定し得る。
【0057】
(実施例3:タグ化したCCR5の調製と分析およびこれのライブラリースクリーニング)
(A.CCR5のクローニングおよび発現)
CCR5 cDNA(図4の配列を参照)をベクターpCDNA3中のReceptor Biology(Beltsville,MD)から得た。タグを、レセプターのC末端に加え、本明細書中に記載のような、標準的な技術を使用する親和性精製アッセイのために、レセプターを固定するのに使用した。さらに、GenBank 登録番号U57840に相関するCCR5 cDNAを、ベクターpCDNA3中で使用し得る。Receptor Biology由来のCCR5 cDNAと、GenBank 登録番号U57840に相関するCCR5 cDNAとの間の唯一の違いは、第180位の塩基の点変異(このアミノ酸配列において、ロイシンをグルタミンに変化させる)である。以下は、このタグ化方法を使用した実験からの具体的な例である:
(C末端ヒスチジンタグを伴ったCCR5の構築(昆虫選択発現系))
CCR5−HIS構築物をこの系から誘導した。PCRをCCR5/pcDNA5(Receptor Biology製)をテンプレートとして使用して、そしてプライマー5−Age Hisおよびプライマー5−Spe Hisを使用して実施した。この最初のプライマーによって、独特のSpeI部位を、CCR5の開始ATGの直前に誘導した。第2のプライマーによって、CCR5の終止コドンを、pIZT/V5−His(Invitrogen、Carlsbad、CA)のヒスチジンタグとインフレームであるAgeI部位の中へ変異した。PCR産物をSpeIとAgeIで消化し、次いで、同様に消化されたpIZT/V5−Hisの中へ連結した。この構築物は、CCR5−His−PIZTとして同定される。
【0058】
(C末端ヒスチジンタグを伴ったCCR5の構築(バキュロウイルス発現系))
CCR5−His−PIZTをHaeIIとSpeIで消化し、次いで、クレノウフラグメントで埋めた。CCR5−Hisを含むこのフラグメントを、予めNheIで消化され、そしてクレノウで平滑化したpBluebac 4.5(Invitrogen)中へ、連結した。この構築物を方向の正確さについてチェックした。これは、CCR5−HISと呼ばれる。この構築物を、制限消化および標準的な技術を用いた配列決定によって確認した。この構築物を発現のために使用し、そして十分に発現され、そして親和性精製スクリーニングでの使用のための活性形態にあることを決定した。
【0059】
(C末端FLAGタグを有するCCR5の構築)
標準的な技術を使用するPCRを、テンプレートとしてCCR5/pcDNA3(Receptor Biology製)ならびにプライマー5−Xho pFLAGおよびプライマー5−Sal pFLAGを使用して実施した。第1のプライマーは、CCR5のイニシエーターATGの直前の固有のXhoI部位を操作した。第2のプライマーは、CCR5の停止コドンをSalI制限部位に変異した(Sigma製のpFLAG−CTCのFLAGタグを用いてインフレームで)。PCR産物を、XhoIおよびSalIで消化し、そして同様に消化したpFLAG−CTC(細菌の発現ベクター)に連結した。この構築物を、CCR5−FLAG−CTCと呼ぶ。次いで、CCR5−FLAGを、XhoIおよびScaIで消化し、そしてクレノウ断片で充填した。CCR5−FLAG−CTCを含むフラグメントを、最初にNheIで消化し、次いで、クレノウで平滑化したpBluebac4.5に連結した。この最終構築物を、CCR5−FLAGとして同定する。この構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術を使用して配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを決定した。
【0060】
(C末端GSTタグを有するCCR5の構築)
PCRを、テンプレートとしてCCR5/pcDNA3(Receptor Biology製)ならびにプライマーGST−BamHIおよびプライマーGST−NdeIを使用して実施した。第1のプライマーを、CCR5の停止コドンを、BamHI制限部位に変異した(pESP−3のFLAG/GSTタグを用いてインフレームで)。第2のプライマーを、CCR5の開始コドンにおける固有のNdeI部位に導入した。PCR産物を、BamHIおよびNdeIで消化し、そして同様に消化したpESP−3(酵母発現ベクター)に連結した。この構築物を、pCP8と呼ぶ。次いで、pCP8を、NdeIおよびSmaIで消化し、そしてクレノウ断片で充填した。CCR5−GSTを含むフラグメントを、最初にBglIIで消化し、次いでクレノウで平滑化した、pBluebac4.5に連結した。この最終構築物を、pCP10として同定する。このタンパク質を記載する場合、この構築物を、CCR5−GSTとして同定する。この構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術によって配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを判定した。
【0061】
3つの新しい構築物のためのベクター(CCR5−FLAG、CCR5−GSTおよびCCR5−HIS)を使用して、それぞれのウイルスストックの産生のためにSf9細胞を同時トランスフェクトした。これらのウイルスストックを、標準的なプラークアッセイを使用して精製し、次いで実験に使用して、種々のC末端タグを有するCCR5の発現の最適化のために感染させた。High Five細胞(Invitrogen)をまた、これらのCCR5タグ化構築物でトランスフェクトし、そしてCCR5の発現について試験した。全ての構築物について、適切なタグ化レセプターを発現することを判定した。72時間後の発現レベルは、Sf9細胞について発現レベルよりもHigh Five細胞において5倍ほど高かった。全ての上記の実験を、当業者に公知の標準的な技術を使用して行なった。
【0062】
CCR5の発現のための第4の構築物を、スターティングベクターpBlueBac4.5(Invitrogen)から作製し、以前記載したベクターにおけるトロンビン開裂部位およびエンテロキナーゼ開裂部位を除去した。GSTタグを、PCRを使用することによってマルチクローニング部位に付加してGSTタグを精製し、次いで、当業者に公知の標準的な方法を使用して消化したベクター(SmaI/EcoRI)に連結した。次に、このベクターを、操作の容易化のためにLifetech製のGateway技術と適合性にした。これを、この技術のために必要な組換え部位を含むカセット(Lifetech製)にSmaIを連結することによって行なった。CCR5を、プライマーを使用してPCRを用いて増幅して、組換えのための結合部位を含む遺伝子を伸長した。次いで、PCR産物を、BPクロナーゼ(相同組換えに必要な酵素)を使用してバキュロウイルスベクターに組み込んで、エンテロキナーゼ開裂部位またはトロンビン開裂部位を有さず、C末端GSTタグ有するCCR5を含むバキュロウイルス発現のためのベクターを作製した。このベクターを、発現のために必要なウイルスストックの調製のためにSf9細胞に同時トランスフェクトした。このウイルスをプラーク精製し、そしてPCRおよび配列チェックしたクローンを、CCR5の発現のために使用した。この構築物のタイムコースは、タンパク質のより少ないのタンパク質分解が観察され、そしてより少ない時間が、レセプターの最大の発現を得るために必要であったことを示した。
【0063】
(B.CCR5の活性)
それぞれのタグ化CCR5遺伝子(CCR5−GST、CCR5−FLAGおよびCCR5−HIS)を、本明細書中に記載されるように、Sf9細胞およびHigh Five細胞において発現させた。全てのSf9細胞株由来の全細胞およびHigh Five細胞株由来の全細胞を、低張緩衝液(10mM Tris(pH7.4)、5mM EDTA)を使用して溶解し、そして膜調製物を、当業者に公知の標準的な技術を使用するホモジナイズおよび遠心分離によって作製した。CCR5−GST、CCR5−FLAGおよびCCR5−HISに関する膜調製物を、それぞれ、標準的な放射リガンド結合アッセイを使用してアッセイした。結合アッセイを、50mMのHepes(pH7.5)、1% BSA中の5μgの膜を用いて実施した。放射リガンドMIP1−β(New England Nuclear、「NEN」から得た)を、冷MIP1α(競合リガンド;CCR5に対する天然のリガンドは、RANTES、MIP1βおよびMIP1αである)と共に、および冷MIP1αなしで室温で1時間、膜と共にインキュベートし、濾過し、洗浄し、そして結合した放射活性計数を、シンチレーションカウンターを使用して測定した。非トランスフェクト細胞を、この実験のコントロールとして使用した。膜調製物の活性は、少なくとも20%の活性タンパク質を有するReceptor Biology(MIP1−β結合に関してKd<1nM)によって得られた膜調製物に匹敵した。
【0064】
(C.CCR5の可溶化)
溶解した全細胞調製物および膜調製物の両方を、可溶化のために使用した。CCR5(CCR5−FLAG、CCR5−GSTおよびCCR5−HIS)のタグ化バージョンの可溶化を、約6.8〜約8.2の範囲のpHで、界面活性剤(例えば、NP−40、TritonX−100、β−D−マルトシド、n−オクチルグルコシド、CYMAL、Zwittergents、Tween−20、ライソホスファチジルコリン、CHAPSなど)、塩(例えば、NaCl、CaCl2、MgCl2、MnCl2、KClなど)、緩衝液(例えば、Tris、Hepes、Hepps、Pipes、Mes、Mops、酢酸、リン酸、イミダゾールなど)の多くの異なる組み合わせを使用して実施した。最適な可溶化のための条件を、pH8.1でZwittergent3〜14および低塩(例えば、低いマグネシウムおよびカルシウムであって、NaClはない(0.0nM NaCl)を使用して見出した。好ましい実施形態において、少なくとも20%の可溶化された、固定化タンパク質は、活性である。非常に好ましい実施形態において、少なくとも30%、40%、50%および75%の可溶化された固定化タンパク質は、活性である。
【0065】
(D.CCR5の固定化)
可溶化後、CCR5−GSTとCCR5−FLAGの両方を、精製のためおよびペプチドライブラリーのスクリーニングのための活性タンパク質として使用するためにアフィニティーカラムに固定化した。ライブラリーからのアフィニティー精製のためのGPCRの固定化を示す概略図を図3に示す。CCR5−GSTを、グルタチオン−アガロース(Pierce)およびグルタチオン−セファロース(Amersham Pharamacia Biotech)に結合し、そして固定化し、そしてCCR5−FLAGを、FLAGエピトープを認識する特異的な抗体カラム(M2カラム,Sigma)に固定化した。活性形態におけるタンパク質の固定化は、カラムにある間、活性を維持するための界面活性剤ならびに適切なpHおよび適切な塩状態を必要とした。この活性を、放射標識化MIP−1β(上記の膜アッセイに用いた)および冷MIP−1αを用いた競合を使用して放射活性結合によって測定した。トランスフェクトされていない細胞を、カラム単独と同様に、この活性のためのコントロールとして使用した。これらの実験は、活性形態の樹脂に(アフィニティー精製スクリーニングに十分な)精製形態のマイクログラム量のレセプターを固定する能力を実証した。
【0066】
(E.ペプチドライブラリー合成)
ライブラリーを、Rink Amide MBHA樹脂(置換:0.54mmol/gm)を使用して9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護基を有するABI 433A(Applied Biosystems,Forster City,CA)において合成した。アミノ酸の混合物を、位置を縮重するために使用する場合、およそ等量のアミノ酸の結合を、文献値を考慮にいれた後、経験的にアミノ酸の量を調節することによって得た(例えば、Ivanetichら,Combinatorial Chemistry,第267巻,Academic Press,San Diego,CA USA,247〜260頁(1996)を参照のこと)。結合剤は、HBTU/HOBT/DIEA(等価のペプチドあたり1当量)であった。切断を、カクテル(82% TFA、5% フェノール、5% チオアニソール、2.5% 1,2−エタンジチオール、5% 水)によって行なった。ペプチドは、メチル三級ブチルエーテルから沈殿させた。ライブラリーを、MALDI−TOF MS(Louisiana State University)およびアミノ酸配列決定によって特徴付けた。
【0067】
第1のライブラリーは、単一、縮重塩基性ベースアミノ酸(すなわち、M−X−X−X−X−W−X−X−X−X−A−K−K−K)を使用した。これらの第1のライブラリーの使用を介して、幾つかのまたは全ての縮重位置における最適な残基を、規定した。第2のライブラリーを、全ての位置を規定していなかった場合、作製し、それによって規定の位置を固定した。
【0068】
(F.固定化CCR5を使用するペプチドライブラリーのスクリーニング)
特定の樹脂に固定化されたタンパク質を用いて(例えば、CCR5−GSTをグルタチオン−セファロースにかまたはCCR5−FLAGをM2抗体−アガロースに固定化する)、無数の化合物のスクリーニングを、一緒にインキュベートすること、およびCCR5によって好まれるリガンドを精製する自然の選択および結合親和性を可能にすることによって行い得る。これらの実験を、直鎖状ライブラリー4P4(+)および他のライブラリーを使用して実施した。
【0069】
(G.ファージディスプレイ)
スクリーニングにおいて有用な代替の方法またはさらなる方法として、固定された機能的CCR5を使用して、当業者に公知の標準的な技術を使用してCCR5に結合するファージを単離した。アッセイにおいて使用されたグルタチオン−セファロースビーズ、BSAおよびMIP1βからのバックグラウンドのサブトラクションを、これらの化合物の混合物と共にファージライブラリーをインキュベートすることによって実施した。レセプターとの、サブトラクションしたファージライブラリー(すなわち、NEB、PhD C7C)のインキュンベーション後、結合したファージを、天然のCCR5リガンド(MIP−1β)およびグリシン、pH2.2の両方とによって溶出した。PhD C7Cは、ジスルフィド間に7個の無作為なアミノ酸を有する特殊なファージライブラリーであり、そしてNew England Biolabs(「NEB」)から得られ得る。複数回のスクリーニングを実施した。両方の条件は、CCR5に結合し、そしてリガンド結合を阻害し得る特定の配列を提供した。
【0070】
(実施例4:タグ化CXCR4の調製および分析ならびにそのライブラリースクリーニング)
(A.CXCR4のクローニングおよび発現)
CXCR4を、二等分した脾臓cDNAライブラリーから単離し、そして一緒にスプライスした。これらの2つのフラグメントを、PCR技術ならびに3’末端および5’末端に対するプライマーならびにCXCR4遺伝子の中央部を使用して単離した。全長クローンを、3’プライマーおよび5’プライマーを使用して単離しなかったが;しかし、2等分を、単離し、そして遺伝子内の固有のBamHI部位を使用して一緒に連結した。構築物の同定を、配列決定によって確認した。選択的スプライス短縮形態もまた、単離した。これを、CXCR4短縮型と呼ぶ。タグを、レセプターのC末端に付加し、標準的な技術を使用するアフィニティー精製アッセイのためにそれらを固定するために使用した。以下は、このタグ化方法を使用した実験からの具体的な実施例である。
【0071】
(C−末端ヒスチジンタグを有するCXCR4の構築(昆虫選択発現系))
GnRHR(性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター)に関する遺伝子を含む以前の構築物を、使用して、第1のCXCR4構築物を作製した。GnRHRに関する遺伝子を、スプライスし、そしてCXCR4に関する単離したcDNAによって置換した。このベクターは、本来、C末端に6×Hisタグを有するpet30aベクターであった。
【0072】
(C末端FLAGタグを有するCXCR4構築物の構築)
PCRを、プライマー5’BspE1 CXCR4およびプライマー3’Bgl CXCR4を使用して実施し、そしてSigma製のpFLAG−CTC(細菌発現ベクター)のFLAGタグを有するインフレームCXCR4の連結のための固有の部位を操作した。この構築物を、CXCR4−FLAG−CTCと呼ぶ。次いで、CXCR4−FLAGを、消化によって除去し、そしてクレノウ断片で充填した。CXCR4−FLAGを含むフラグメントを、最初に、消化し、次いで、クレノウで平滑化したpBluebac4.5に連結した。この最終構築物を、CXCR4−FLAGと呼ぶ。この構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術を使用して配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを判定した。
【0073】
(C末端GSTタグを有するCXCR4構築物の構築)
新しく構築されたCXCR4−FLAG cDNAを、CTCベクターから除去し、そしてCCR5の代わりに(BglおよびBspE1を使用して)別の構築物(CCR5−GST)にサブクローニングした。これは、1工程を使用してCXCR4−GSTのためのベクターを作製した。の構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術を使用して配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを判定した。
【0074】
(N末端6×Hisタグを有するCXCR4の構築)
この構築物を市販のベクター、pBluebacHis2b(Invitrogen)にCXCR4をサブクローニングすることにより調製した。この構築物を、標準的技術を用いた制限消化および配列決定により確認した。
【0075】
3つの新規の構築物、CXCR4−FLAG、CXCR4−GST、およびCXCR4−HISのベクターを用いて、それぞれのウイルスストックの作成のためにSf9細胞を同時トランスフェクトした。これらのウイルスストックを、標準的なプラークアッセイを用いて精製し、次いでその種々のC末端タグを有するCXCR4の発現の最適化に関する感染実験において用いた。High Five細胞(Invitrogen)もまた、これらのCXCR4タグ化構築物を用いてトランスフェクトし、そしてCXCR4の発現について試験した。全ての構築物を適切にタグ化したレセプターを発現するために決定した。High Five細胞における72時間後の発現レベルは、Sf9細胞におけるレベルよりも5倍高かった。
【0076】
(B.CXCR4の活性)
それぞれのタグ化CXCR4遺伝子(CXCR4−FLAG、CXCR4−GST、およびCXCR4−HIS)を、本明細書中に記載される、Sf9およびHigh Five細胞に同時トランスフェクションするために用いた。Sf9およびHigh Five細胞株由来の全細胞を、低張緩衝液(10mM Tris(pH7.4)、5mM EDTA)を使用して溶解し、そして膜調製物を、当業者に公知の標準的な技術を使用するホモジナイズおよび遠心分離によって作製した。CXCR4−GST、CXCR4−FLAGおよびCXCR4−HISについての膜調製物を、標準的な放射性リガンド結合アッセイを使用してアッセイした。放射リガンド[125I]−SDR−1(NEN)を、冷SDF−1(競合する天然のリガンド)と共に、およびそれを伴わずに、室温にて1時間、膜と共にインキュベートし、濾過し、洗浄し、そして結合した放射性計数をシンチレーション計数を用いて検出した。非トランスフェクト細胞を、この実験のコントロールとして使用した。膜調製物の活性は、少なくとも20%の活性タンパク質を生じた。
【0077】
(C.CXCR4の可溶化)
溶解した全細胞および膜調製の両方を、可溶化のために使用した。CXCR4にタグ化バージョン(CXCR4−FLAG、CXCR4−GSTおよびCXCR4−HIS)の可溶化を、界面活性剤(例えば、NP−40、TritonX−100、β−D−マルトシド、n−オクチルグルコシド、CYMAL、Zwittergents、Tween−20、ライソホスファチジルコリン、CHAPSなど)、塩(例えば、NaCl、CaCl2、MgCl2、MnCl2、KClなど)、緩衝液(例えば、Tris、Hepes、Hepps、Pipes、Mes、Mops、酢酸、リン酸、イミダゾールなど)の多くの異なる組み合わせを約6.8〜約8.2の範囲のpHにて使用して実施した。最適な可溶化のための条件を、pH8.1でZwittergent3〜14および低塩(例えば、低いマグネシウムおよびカルシウムであって、NaClはない(0.0nM NaCl)を使用して見出した。好ましい実施形態において、少なくとも20%の可溶化された、固定化タンパク質は、活性である。非常に好ましい実施形態において、少なくとも30%、40%、50%および75%の可溶化された、固定化タンパク質は、活性である。
【0078】
(D.CXCR4の固定化)
可溶化後、CXCR4−GSTを、精製のためおよびペプチドライブラリーのスクリーニングにおける使用のための活性タンパク質として使用するためにアフィニティーカラムに固定化した。ライブラリーからのアフィニティー精製のためのGPCRの固定化の示す概略図を、図3に示す。CXCR4−GSTを、グルタチオン−アガロース(Pierce)およびグルタチオン−セファロース(Amersham Pharamacia Biotech)に結合し、そして固定化した。活性形態のタンパク質の固定化は、カラム上に置かれる間、活性形態を維持するために界面活性剤の使用ならびに適切なpHおよび塩濃度を必要とした。この活性を、放射標識したSDF−1(上記の膜アッセイを伴う場合)放射性結合および冷SDF−1との競合により決定した。トランスフェクトされていない細胞を、カラム単独と同様に、この活性のためのコントロールとして使用した。これらの実験は、活性形態の樹脂に、アフィニティー精製スクリーニングに十分な精製形態のマイクログラム量のレセプターを固定する能力を実証した。
【0079】
(E.ペプチドライブラリー合成)
ライブラリーを、Rink Amide MBHA樹脂(置換:0.54mmol/gm)を使用して9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護基を有するABI 433A(Applied Biosystems,Forster City,CA)において合成した。アミノ酸の混合物を、位置を縮重位置について使用する場合、およそ等量のアミノ酸の結合を、文献の値を考慮にいれた後、経験的にアミノ酸の量を調節することによって得た(例えば、Ivanetichら,Combinatorial Chemistry,第267巻,Academic Press,San Diego,CA USA,247〜260頁(1996)を参照のこと)。結合剤は、HBTU/HOBT/DIEA(等価のペプチドあたり1当量)であった。切断を、カクテル(82% TFA、5% フェノール、5% チオアニソール、2.5% 1,2−エタンジチオール、5% 水)によって行なった。ペプチドは、メチル三級ブチルエーテルから沈殿した。ライブラリーを、MALDI−TOF MS(Louisiana State University)およびアミノ酸配列決定によって特徴付けた。
【0080】
第1のライブラリーは、単一、非縮重塩基性ベースアミノ酸(すなわち、M−X−X−X−X−W−X−X−X−X−A−K−K−K)を使用した。これらの第1のライブラリーの使用を介して、幾つかのまたは全ての縮重位置における最適な残基を、規定した。第2のライブラリーを、全ての位置を規定していなかった場合、作製し、それによって規定の位置を固定した。
【0081】
(F.固定化CXCR4を使用するペプチドライブラリーのスクリーニング) タンパク質を、特定の樹脂に固定化し(例えば、CXCR4−GSTをグルタチオン−セファロースに固定化する)、無数の化合物のスクリーニングを、一緒にインキュベートすること、およびCXCR4に好まれるリガンドを精製する自然の選択および結合親和性を可能にすることによって行い得る。これらの実験を、10のライブラリーを使用して実施した。そしてこれらの実験は、他のライブラリーを用いて実施し得る。
【0082】
(G.ファージディスプレイ)
スクリーニングにおいて有用な代替の方法またはさらなる方法として、固定された機能的CXCR4を使用して、当業者に公知の標準的な技術を使用してCXCR4に結合するファージを単離した。アッセイにおいて使用されたグルタチオン−セファロースビーズ、BSAおよびSDF1αからのバックグラウンドのサブトラクションを、これらの化合物の混合物と共にファージライブラリーをインキュベートすることによって実施した。レセプターとの、サブトラクションしたファージライブラリー(すなわち、NEB PhD C7C)のインキュンベーション後、結合したファージを、天然のCXCR4リガンド(SDF1α)およびグリシン、pH2.2の両方とによって溶出した。PhD C7Cは、ジスルフィド間に7個の無作為なアミノ酸を有する特殊なファージライブラリーであり、そしてNew England Biolabs(「NEB」)から得られ得る。複数回のスクリーニングを実施した。両方の条件は、CXCR4に結合し、そしてリガンド結合を阻害し得る特定の配列を提供した。
【0083】
(実施例5:疾患および障害の予防または処置)
しかし、現在、治療用ペプチド、ペプチド模倣物、または疾患および障害(例えば、AIDSおよびHIV感染)の予防および処置のために使用されるGPCR結合の低分子アゴニストもしくはアンタゴニストの生産、処方および使用の間に、いくつかの複雑な問題が生じる。GPCRの治療的結合化合物の商業的生産のコストおよび技術的難易度を最小化する生物学的に適切なアンタゴニストまたはアゴニストはさらに、本発明によって意図される。さらに、アンタゴニストまたはアゴニストに対する免疫学的応答を与えず、その結果その有効性を妨害する、GPCR結合の生物学的に適切なアンタゴニストまたはアゴニストは、本発明によって意図される。さらに、生成されたGPCR結合のアンタゴニストまたはアゴニストの、生物学的効力の有意な喪失を伴わない、商業的に妥当な有効期限を与える適切な処方は、本発明において意図される。さらに、AIDSおよびHIV感染のような疾患および状態の予防および処置のために適切な、個体に対する投与のための有用な用量は、本発明において意図される。
【0084】
単独でまたは他の適切な分子と混合した、GPCR結合の阻害に関してコンピテントな適切な候補物の同定は、本発明によって意図される。このような候補物はさらに、AIDSおよびHIV感染のような疾患および状態の予防および処置のために生物学的に適切な、上記で同定された候補物の商業的に重要な量の生産を意図する。さらに、本発明は、最初に同定されたアナログの所望されない任意の特性(例えば、インビボでの毒性または貯蔵の際の分解傾向)が緩和される、GPCR結合アンタゴニスト、アゴニストまたは誘導体の治療的品質の商業的に重要な量の生産を提供する。
【0085】
ペプチド、ペプチド模倣物、またはGPCR結合活性の低分子アンタゴニストの同定および設計後の、AIDSおよびHIV感染のような疾患を予防および処置する方法は、本明細書中に記載のようなGPCR結合を阻害し得る化合物を含む組成物を投与する工程を包含する。投与は、任意の適合性の経路によるものであり得る。従って、適切な場合、投与は、経口または非経口(投与の静脈内および腹腔内の投与経路を含む)を含み得る。特に好ましい方法は、適切な処方物の徐放性注射によるものである。さらに、投与は、組成物のボーラスの定期的な注射によるものであり得るかまたは体外(例えば、静脈内バッグ)または体内(例えば、生物分解性の(bioerodable)移植)であるリザーバからの静脈内または腹腔内投与によってより連続的になされ得る。
【0086】
本発明によって意図される治療的組成物を、任意の適切な手段によって、直接(例えば、注射、移植または組織部位に対する局所的投与によるように局所的に)、または全身的に(例えば、非経口的にまたは経口的に)個体に提供し得る。組成物が非経口的に(例えば、静脈内、皮下、分子内、眼、腹腔内、筋内、頬、直腸、膣、眼窩内、頸部内、頭蓋内、脊髄内、室内、鞘内、大槽内、嚢内、鼻腔内によって)またはエアロゾル投与によって提供される場合、この組成物は、水性または生理学的に適合な液体懸濁物または溶液の部分を含み得る。従って、キャリアまたはビヒクルは、生理学的に受容可能であり、その結果、所望の組成物の被験体への送達に加えて、患者の電解質および/または容量バランスに他の悪影響を及ぼさない。
【0087】
非経口投与に有用な溶液は、薬学の分野で周知の方法(例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE(Gennaro,A.、編)、Mack Pub.、1990に記載される方法)のいずれかによって調製され得る。本発明の治療用薬剤の処方物としては、例えば、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリエチレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなど)が挙げられ得る。特に、直接投与のための処方物は、所望の部位での薬剤の維持を補助するグリセロールおよび他の高粘度の組成物を含み得る。生体適合性、好ましくは生体吸収性(bioresorbable)のポリマー(例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸三カルシウム、ポリブチレート、ラクチドならびにグリコリドポリマーおよびラクチド/グリコリドコポリマーを含む)は、インビボで薬剤の放出を制御する有用な賦形剤であり得る。ペプチド薬物についての徐放性注射可能処方物の概念は、十分受け入れられており、そしていくつかの利点を提供する。第一に、例えば、バイオアベイラビリティーが高い。第二に、処置レジメンは、1ヶ月または3ヶ月当たり1回(AbottのLeupron(登録商標)のように)または1年に1回(例えば、AlzaのViadur(登録商標))からなり得る。第三に、徐放性注射可能処方物は、実質的に、使用され得る用量を減少させる(Leupron注射用量は、1mg/日であるが、90日の処方物使用量(formulationuse)は、総量11.25mgである)。また、増大した効力は、治療が感染性を予防するために連続して存在する場合に達成され得る。この考えは、感染のslow−to−clear沈着の再形成(例えば、記憶T細胞コンパートメント)を予防することにより疾患の治癒を達成する必要性の観点から特に重要である。例えば、Lee,V.編、Peptide and Protein Drug Delivery、Marcel Dekker,Inc.、NY(1991)を参照のこと。
【0088】
これらの薬剤のための他の潜在的に有用な非経口送達システムとしては、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームが挙げられる。吸引投与のための処方物は、賦形剤として、例えば、ラクトースを含むか、または水溶液(例えば、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む)かもしくは鼻ドロップまたは鼻腔内へ適用されるためのゲルの形態での投与のための油性溶液であり得る。非経口投与のための処方物はまた、頬投与のためのグリココレート、結腸投与のためのメトキシサリチラート、または膣投与のためのクエン酸(cutric acid)を含み得る。
【0089】
本発明のさらなる局面および実施形態は、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、固定された非変性リジンもしくはアルギニン、ならびにおおよそ等しい割合の18アミノ酸からなる8個の変性位置を有する、ペプチドライブラリーを示す。
【図2】図2は、結合ドメインを用いたペプチドライブラリーのスクリーニングを示す。
【図3】図3は、ライブラリーからのアフィニティー精製のためのGPCRの固定化を示す。
(関連出願)
本出願は、米国特許出願第60/190,946号、同第60/190,996号および同第60/191,299号の利益を主張し、これらの各々の開示は、参考として本明細書に援用される。代理人書類番号CNS−005およびCNS−007により識別される2001年3月20日に出願された出願への参照もまた行われ、これらの各々の開示は、本明細書に参考として援用される。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、一般に、Gタンパク質共役レセプター(「GPCR」)に関し、そしてより詳細には、Gタンパク質共役レセプターに結合する化合物に関する。本発明の方法は、Gタンパク質共役レセプターに結合する治療化合物を同定および調製することによって、疾患の処置に有用である
(発明の背景)
レセプターは、一般に、抗原、ホルモンまたは神経伝達物質のような細胞外因子と弱い可逆的結合を形成する、細胞膜中または細胞内に位置する分子構造である。各レセプターは、特異的因子と結合するために設計されている。レセプターの特定のファミリーに、7回膜貫通(「7TM」)、Gタンパク質共役レセプター(「GPCR」)がある。これらのレセプターは、これらレセプターが結合した細胞外因子からシグナルを伝えるために、グアニンヌクレオチド結合性タンパク質(「Gタンパク質」)と連結する。このGタンパク質は、グアニンジホスフェート(「GDP」)と結合するとき、Gタンパク質は不活性であるか、または「オフ・ポジション」にある。同様に、このGタンパク質がグアニントリホスフェート(「GTP」)と結合するとき、Gタンパク質は活性であるか、または「オン・ポジション」にあり、それによって細胞内の生物学的応答の活性化が媒介される。
【0003】
一般に、身体中のほとんどすべての細胞の活性は、細胞外シグナルにより調節されている。ヒト中および広範な範囲の生物との多くの生理学的事象は、GPCRを経由する、タンパク質媒介膜貫通シグナル伝達を用いる。特定のGPCRからのシグナルは、細胞中のGタンパク質の活性化を引き起こす。シグナルの大部分は、GPCRにより細胞内部に伝達される。シグナルの伝達は、リガンド結合および連結Gタンパク質の活性化により達成される。このシグナル伝達プロセスには多くの局面が存在し、これには、GPCRの複数のレセプターサブタイプおよびそれらのGタンパク質連結相当物、ならびに種々の連結細胞内メッセンジャーが含まれる。このシグナル伝達は、関与するタンパク質に依存して、細胞内プロセス(単数または複数)の全体的活性化もしくは部分的活性化または不活性化を生じ得る。GPCRに結合する重要なシグナル伝達分子または神経伝達物質は、例えば、モルヒネ、ドパミン、ヒスタミン、5−ヒドロキシトリプタミン、およびアデノシンを含む。
【0004】
GPCRは、タンパク質のスーパーファミリーを構成する。現在、2000を超えるGPCRが文献で報告され、これらは、3つのファミリーに分類される:ロドプシン様ファミリー、代謝調節型グルタミン酸ファミリー、およびカルシトニンレセプターである。例えば、Ji THら、J.Biol.Chem.273(28):17299−302(1998)を参照のこと。報告されたGPCRは、特徴付けられたレセプター、およびリガンドが同定されていないオーファンレセプターの両方を含む。例えば、Wilson Sら、G protein−coupled receptors.Haga T、Bernstein G編 CRC press、Boca Raton、97−116頁(1999):Wilson Sら、Br.J.Pharmacol.125(7):1387−92(1998);およびMarchese Aら、Trends Pharmacol.Sci.20(9):370−375(1999)を参照のこと。GPCRの数の多さにもかかわらず、一般に、各GPCRは、類似の分子構造を共有している。各GPCRは、種々の長さのアミノ酸残基のストリングを含む。GPCRは、トランスメンブレンと呼ばれる7つの別のコイルにある細胞膜内にある。GPCRのアミノ末端は、細胞外ループを有して細胞の外側にあり、その一方、カルボキシル末端は、細胞内ループを有して細胞の内側にある。
【0005】
一般に、三次構造の類似性もまた同様にGタンパク質によって共有されている。代表的には、Gタンパク質はまた、ヘテロトリマーGタンパク質とも呼ばれ、3つのサブユニット、α、βおよびγからなる。代表的なGタンパク質では、このαサブユニットは、GTPaseドメインおよびαヘリックスドメインの2つのドメインを含む。このGTPaseドメインは、βシートを取り囲むヘリックスを含む。αヘリックスドメインは、Gタンパク質に特有であり、そして5つのより短いヘリックスにより取り囲まれた長い中央ヘリックスを含む。βおよびγサブユニットは、しばしば、β−γダイマーと呼ばれる。このβサブユニットは、プロペラ上にブレードのように配置されたシート、αヘリックスおよびこのヘリックスを「プロペラブレード」と連結するループを含む、「βプロペラ」タンパク質である。その一方、γサブユニットは、一般に、内因性の三次構造をもたず;それに代わって、構造的支持は、βサブユニットに依存すると考えられている。βサブユニットとの相互作用は、一部、個々のサブユニットのN末端ヘリックス間のコイルドコイル相互作用によって媒介されると考えられている。
【0006】
GPCRに対するリガンドは、低分子ならびにペプチドおよび小タンパク質を含む。これらのリガンドとそれらのレセプターとの間の相互作用は、システムによって変動するが、それらはすべて、4つの細胞外ドメインおよびN末端のいくつかにある残基との相互作用を必要とし得る。既知のリガンドをもつGPCRは、多発性硬化症、糖尿病、慢性関節リウマチ、喘息、アレルギー、炎症性大腸炎、いくつかの癌、甲状腺疾患,心臓病、網膜色素変性症、肥満、神経学的障害、骨粗鬆症、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染および後天性免疫不全症候群(「AIDS」)に関連している。例えば、Murphy PHら、Pharm.Rev.52(1):145−176(2000);Mannstadt Mら、Am.J.Physiol.277(5):F665−75(1999);Berger EAら、Ann.Rev.Immunol.17:657−700(1999);Saunders Jら、Drug Discov.Today4(2):80−92(1999);Hebert TEら、Biochem.Cell.Biol.76(1):1−11(1998);Jacobson EDら、Dig.Dis.15(4−5):207−42(1997);Meji JT、Mol.Cell.Biochem.157(1−2):31−8(1996);およびChanmers Jら、Nature 400:261−4(1999)を参照のこと。一般に、Gタンパク質共役レセプターは、結合するリガンドのタイプに基づき、異なるクラス:ペプチド、生体アミン、ヌクレオチド関連、脂質ベース、アミノ酸ベース、および網膜(すなわち光ベース)、にさらに分類され得る。特に重要なのは、例えば、CCケモカインレセプター5およびCXCケモカインレセプター4のようなペプチド基質を結合するレセプターのクラスであって、これは、最大の規定されたクラスである。
【0007】
GPCRは、シグナル伝達のためのレセプターとして供されることが示されているが、研究者が、GPCRの高解像度X線結晶学的構造を得ることは困難であった。なぜなら、ネイティブな立体配座のために脂質との複雑な相互作用を必要とする7TMタンパク質を結晶化することの困難性のためである。脂質との相互作用の必要性はまた、GPCRの生物学的に活性な形態の調製を困難にする。なぜなら、これらの脂質の不在下では、これらは、可溶化の間に生物学的活性な立体配座を保持するために多大な注意を払わなければ、特異的にリガンドを結合する能力が最小であるかもしくはその能力のない、変性された凝集物を容易に形成するからである。X線構造の非存在下で、リガンド結合に関与するGPCRの領域を規定するために、種々のアプローチが用いられている。これらのアプローチは、一般に、GPCRの活性のための構造的要求を研究するために、非ヒトホモログ、キメラレセプター、および点変異体との結果を比較することを含む。
【0008】
例えば、CCケモカインレセプター5(「CCR5」)およびCXCケモカインレセプター4(「CXCR4」)のような、HIV感染およびAIDSに関連する特異的GPCRは、HIVのコレセプターとして供され、その結果、それらは、HIVと相互作用し、細胞中へのウイルスの侵入を容易にする。従って、研究は、細胞中へのウイルスの侵入を阻害する治療的薬剤として作用する、天然リガンドを同定することを求めている。その他のGPCRに関し、CCR5およびCXCR4は、可溶化および精製することが非常に困難である。なぜなら、それらは、通常、折り畳まれ、かつ細胞膜のネイティブな脂質の存在下で維持される必要があるからである。
【0009】
従って、当該分野では、GPCR結合性化合物を同定する方法、および、例えば、HIV感染およびAIDSのような疾患および障害を防止または処置するためのGPCR結合性治療剤の同定に対する必要性がある。このような治療剤は、GPCRへの天然リガンドの結合を阻害し得る、ペプチド、ペプチド模倣物、または低分子を含み得る。このような方法および組成物は本明細書中に提供される。
【0010】
(発明の要旨)
本発明は、GPCRに結合する化合物、およびこれらの結合性化合物を同定する方法を提供する。1つの実施形態では、GPCRに結合するモチーフおよびGPCRに結合し得るリガンドを提供するためのスクリーニング方法が提供される。別の実施形態では、本発明は、例えば、HIV感染およびAIDSのような疾患または障害の予防または処置における使用に適切な、治療ペプチド、ペプチド模倣物、または低分子の設計および同定を含む。
【0011】
1つの実施形態では、本発明の方法は、GPCRに結合するモチーフのスクリーニングおよび同定、ならびにその潜在的なリガンドのスクリーニングに有用な、線状および環状ペプチドライブラリーの合成および精製を提供する。本発明の方法は、このようなライブラリーにおける使用のための線状または環状ペプチド中への非天然アミノ酸およびD立体配座のアミノ酸の取り込みを提供する。このようなアミノ酸を有するペプチドを含むライブラリーは、増大した結合親和性およびタンパク質分解に対する抵抗性から生じるインビボの作用の持続時間を示す。
【0012】
好ましい実施形態では、本発明は、リードリガンド同定工程のために、ペプチド(線状および環状、天然および非天然アミノ酸)、ペプチド模倣物、および低分子化合物の高度に多様なライブラリーの使用を提供する。このようなリガンドは、GPCR結合活性に対し、直接的または間接的にアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【0013】
好ましい実施形態では、本発明は、予備的なモチーフ情報の同定のためのファージディスプレイ方法の使用、次いで、本発明の精製されたレセプター調製物および高度に多様なライブラリーを用いるアフィニティー精製の付加的なラウンドを提供する。特に好ましい実施形態では、ファージディスプレイ技術は、環状ペプチドおよび/またはペプチド模倣物ライブラリーの使用と組み合わせられる。
【0014】
本発明の別の実施形態では、コンピューター支援設計技術を用い、GPCR活性に対するアゴニストまたはアンタゴニスト能力について、リード化合物を、実質的にスクリーニングし、同定し、設計し、または評価する。このような技術は、GPCRおよび潜在的な結合パートナーの両方の分子情報および構造情報に基づき、このタンパク質を結合パートナーと実際に整列することによって、コンピューターで生成した三次元イメージを用いる。コンピュータ支援スクリーニングのために設計されたライブラリーの場合では、リードの最適化のために必要な大量の情報は、ライブラリー設計から直接得られる。1つの実施形態では、潜在的なリードは、実際のライブラリーの予備スクリーニングまたは特定のその他の手段により同定される。本発明の1つの実施形態は、構造を基礎にした合理的薬物設計による生物学的に適切や薬物のスクリーニングを含む。このような場合では、タンパク質(または類似のファミリーメンバー)、ペプチドまたは分子の三次元構造が決定され、そして潜在的なアゴニストおよび/またはアンタゴニストが、コンピューターモデリングで支援されて設計される。本発明の好ましい実施形態では、適切な薬物が同定された後、この薬物をGPCRと接触させ、それによって、結合複合体が、可能な薬物とGPCRとの間で形成される。薬物をGPCRに接触させる方法は、一般に、薬物開発の技術分野の当業者により理解される。
【0015】
別の実施形態において、本発明は、部分的に精製されたGPCRの、治療的に有用な化合物の同定において密に結合するリガンドの選択、同定、および改良を実施するための因子としての使用を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、修飾されたGPCRを生成するための標識方法の使用を含み、このタンパク質は、スクリーニング方法に関与する精製工程および同定工程を容易にするように機能する。別の実施形態において、本発明は、ベクター中に操作された適切な特異的プロテアーゼ部位を有する標識配列(すなわち、GST、FLAG、6×His、2重標識されたFLAG−GST、C−MYC、MBP、V5、Xpress、CBP、HA)に融合されたGPCRに対応する核酸配列を含む。
【0016】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、GPCRの可溶化および固定化を提供し、本明細書において提供されるリガンド選択方法を容易にする。GPCRは、任意の供給源(不活性な沈殿したタンパク質調製物;細胞膜調製物;および細胞全体の調製物が挙げられるが限定されない)に由来し得る。1つの実施形態において、本発明は、バキュロウイルス発現系または任意の他の適切な発現系由来の膜を用いて、一般的な親和性判定について、コンビナトリアルライブラリーを直接スクリーニングする方法を提供する。本発明の1つの実施形態において、部分的に精製されたGPCRは、密な結合リガンドの選択、同定、および改良の実施に用いられる。好ましい実施形態において、部分的に精製された標識化GPCRは、隔離された形態で使用され、多様化したライブラリー(集中または高度な多様化)を密に結合するリガンドのアフィニティー精製のためにスクリーニングされる。本発明の好ましい実施形態において、適切なリガンドの可溶化および固定化についての条件は、低塩(例えば、低マグネシウム濃度または低カルシウム濃度);および塩化ナトリウムなし(「NaCl」)(0.0nM NaCl)での使用を提供する。
【0017】
別の実施形態において、本発明は、N末端が特異的にブロックされたペプチドまたは配列決定し得ない他のアナログを有する固定されたタンパク質から、ライブラリーの結合成分を溶出する工程を包含する。なお別の実施形態において、本発明は、コンビナトリアルライブラリーを樹脂固定化タンパク質に結合する工程を包含する。別の実施形態において、本発明は、標識化配列を有する精製ポリペプチドを含み、このポリペプチドは、アッセイのために適切な親和性樹脂上に固定化され得る。さらなる実施形態は、N末端が特異的にブロックされたペプチドまたは配列決定し得ない他のアナログを用いてその結合ライブラリーを有する標識化されたタンパク質を放出または溶出する工程を包含する。なお別の実施形態において、本発明の方法は、親和性樹脂上に固定化された後およびコンビナトリアルライブラリーが複合体を放出するために結合された後、目的のタンパク質から標識を、(タンパク質/ベクター内で設計されるような)特異的なプロテアーゼを用いて、切断する工程を包含する。
【0018】
なお別の実施形態において、標的リガンドは、直鎖状ペプチドのライブラリー、ペプチド模倣物のライブラリー、環状ペプチドのライブラリー、またはファージディスプレイ技術によって同定された最初のモチーフを用いて開発された重点ライブラリー(focused library)あるいは上記のいずれかを組合わせたライブラリーから選択される。別の実施形態において、標的リガンドは、ペプチドもしくは他のリガンドを用いてか、またはpH変化もしくはカオトロピックな因子(例えば、尿素または塩酸グアニジン)(これらは、水の水素結合構造および疎水性の影響を減少することによって濃縮された溶液中のタンパク質を変性し得る)を用いることによって、レセプター調製物から溶出される。本明細書中に開示される方法を用いて同定されたGPCRに対するリガンドがまた、本発明によって意図される。本発明のなお別の実施形態において、タンパク質配列決定技術が、アフィニティー精製工程によって同定されるリガンドの構造決定のために使用される。
【0019】
別の実施形態において、本発明は、例えば、疾患または障害(例えば、HIV感染またはAIDSのような)の処置に適切な、本発明の方法を用いて同定されたGPCR結合の低分子アンタゴニストのような治療剤を含む。別の実施形態において、疾患または障害に罹患する患者は、本発明の方法(例えば、GPCRの低分子アンタゴニスト結合のような)を使用して同定された化合物を含む治療剤で処置される。別の実施形態において、疾患または障害に罹患する患者(例えば、HIV感染およびAIDSのような)は、治療剤(例えば、GPCRインヒビターおよび逆転写酵素ならびにプロテアーゼインヒビターを含む)の併用した使用を通して処置される。
【0020】
本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明が、以下に提供される。本発明の他の実施形態が、続く詳細な説明を再考に基づいて明らかである。
【0021】
(発明の詳細な説明)
一般的に、本発明の方法は、GPCRの結合モチーフの決定を提供する。さらに、本発明の方法は、GPCRとその天然のリガンドとの相互作用の、アゴニストまたはアンタゴニストの同定を提供し、それによって、治療リード化合物の同定を提供する。本発明において特に有用である、ライブラリー設計のための方法およびライブラリー合成のための方法、ならびにライブラリーのスクリーニングのための方法が、以下の特許および特許出願に記載され、これらの各々の開示は、本明細書中に参考として援用される:Cantleyら、米国特許第5,532,167号;Cantleyら、U.S.S.N.08/369,643(1998年12月17日出願);Cantleyら、U.S.S.N.08/438,673(1999年11月12日出願);Hung−Senら、U.S.S.N.09/086,371(1998年5月28日出願);Hung−Senら、U.S.S.N.08/864,392(1999年6月24日出願);ならびにLaiら、U.S.S.N.09/387,590(1999年8月31日出願)。
【0022】
本発明の方法に従って、GPCRは、クローン化され、そして発現され、そして活性について試験される。GPCRは、GPCRのリガンド結合特性の特徴の決定を容易にするために、C末端上またはN末端上に標識され得る。例示的な標識としては、6×His、FLAG、GST、V5、Xpress、c−myc、HA、CBD、およびMBPが挙げられるが、これらに限定されない。標識されたGPCRは、例えば、天然および/もしくは非天然の、アミノ酸、ペプチド模倣物および/もしくは低分子を有する、直鎖状ペプチドならびに/または環状ペプチドを含むライブラリーのスクリーニングにおいて使用される。このようなペプチド模倣物および低分子は、任意の天然または合成の、化合物、組成物、化学物質、タンパク質、またはGPCRの結合化合物に関するスクリーニングに使用される上記のいずれかの任意の組み合わせもしくはGPCRの結合化合物に関するスクリーニングに使用される上記のいずれかの任意の改変を含み得る。
【0023】
1つの局面において、本発明の方法において有用な配向された変性ペプチドライブラリー方法は、リガンド結合について重要であることが知られているかもしくは疑われる非変性位置中の1つ以上のアミノ酸、ならびに、例えば変性位置におけるおおよそ等しい割合の18アミノ酸からなる可溶性ペプチドライブラリーを使用する。システインおよびトリプトファンは、配列決定に対する特定の分析的な困難性を回避するために削除され得る。このようなライブラリーは、図1に示され、ここで、Xは、任意の18アミノ酸からなる変性位置を表し、そしてリジンもしくはアルギニンは、非変性位置に固定されている。さらなる残基が、図1に示される配列のN末端に付加され得る。なぜなら、最初および第2の配列決定サイクルにおいて妨害物質がしばしば存在するからである。さらなる残基が、C末端に付加され得、シーケンサーカートリッジ中のフィルターへこのポリペプチドを良好に固着するためのアミノ酸を提供する。
【0024】
本発明の別の局面は、続く同定工程のために、ペプチド(直鎖状アミノ酸および環状アミノ酸、天然アミノ酸および非天然アミノ酸)、ペプチド模倣物、ならびに低分子化合物の非常に多様なライブラリーの使用を提供する。例えば、これらのリガンドは、レセプターに対するこの機能において、反発的であるかまたは拮抗的であり得る。一般に、本発明は、治療的に有用な化合物の経路として密接に結合したリガンドの選択、同定、および改良を実行するための因子として、部分的に精製されたGPCRを使用する。さらに、本発明は、本明細書中で提供される効率的なリガンド選択方法を容易にする、可溶化手順および固定化手順の開発ならびに使用を提供する。詳細には、特定のGPCRの効率的なリガンド選択についての最適な条件は、低塩(例えば、マグネシウムもしくはカルシウム濃度が低いかまたは存在せず、そしてNaCl濃度が存在しない使用を包含する。例えば、不活性な沈殿タンパク質、細胞膜調製物および全細胞調製物を使用するリガンド選択方法が、さらに本明細書中に提供される。
【0025】
本発明の1つの局面において、スクリーニング工程は、ファージディスプレイ技術を包含し得る。このようなファージディスプレイシステムは、選択された標的分子に結合するペプチドライブラリーをスクリーニングするため、および所望の特性についてこれらのタンパク質をスクリーニングするための可能性を有する機能的タンパク質を提示するために、使用されてきた。このディスプレイアプローチのより最近の改良は、バクテリオファージ表面上に酵素ならびに抗体フラグメントを発現することを可能にし、従って、特定のリガンドで選択することによって特定の特性の選択を可能にする。例えば、Smith SFら、Methods Enzym.217:228〜257(1993)を参照のこと。ファージディスプレイ方法は、予備モチーフの情報の同定のために使用され、そして続いて、本発明の精製されたレセプター調製物および非常に多様なライブラリー(特に、環状ペプチドおよびペプチド模倣物ライブラリー)を用いるさらなる回数の親和性精製のために使用され得る。このファージディスプレイ方法は、天然のアミノ酸のモチーフを同定することを可能にする。ファージディスプレイに由来する情報は、例えば、増強された薬学的特性を有するリガンドを選択するために、新規なアミノ酸アナログまたは環状ペプチドを含む合成ライブラリーを使用する親和性精製方法中に取り入れられ得る。初期ライブラリー、二次ライブラリーおよび三次ライブラリーの使用は、結合部位の特異性の定義をより完全にする。初期ライブラリーからの情報を組み込む二次ライブラリーが、配列決定され得る。初期ライブラリーにおいて、いくつかの変性位置が、特定のアミノ酸について高い性能をもたらし得、そしてこれらは、第2のライブラリーにおいて好ましいアミノ酸からなる非変性位置になり得る。例えば、Wu R、J Biol Chem 271(27):15934〜41(1996)を参照のこと。
【0026】
あるいは、またはさらに、コンピューター補助設計技術が、ペプチド、ペプチド模倣物および低分子のスクリーニングならびに/または設計において使用され得る。例えば、GPCR配列、膜貫通予測、および変異誘発研究から得られた任意の構造情報に加えて、ロドプシンの結晶構造(例えば、Palczewskiら、Science 289(5480):739〜745(2000)を参照のこと)のような情報と共に、コンピューター補助設計技術は、実質的に、そのGPCR活性に関して潜在的な化合物をスクリーニング、同定、設計および検査し得る。適切なペプチド、ペプチド模倣物および低分子の設計において補助するために使用され得るコンピュータープログラムとしては、例えば、Dock、FrodoおよびInsightが挙げられる。生物学的に適切な薬物のスクリーニングについての方法の例は、合理的な薬物設計に基づく構造に依存する。このような場合、このタンパク質、ペプチドまたは分子の三次元構造は、決定されるかまたはモデリングされ、そして可能性のあるアゴニストおよび/もしくはアンタゴニストは、コンピューターモデリングを用いて設計される。例えば、Buttら、Scientific American,12月号 92〜98(1993);Westら、TIPS,16:67〜74(1995);Dunbrackら、Folding&Design,2:27〜42(1997)を参照のこと。適切な薬物が同定された後、この薬物はGPCRと接触し、ここで、結合複合体は、可能性のある薬物とGPCRとの間で形成される。GPCRへの薬物の接触方法は、薬物開発分野の当業者によって一般に理解される。
【0027】
スクリーニング工程は、液相において実行されても良いし、またはアフィニティカラム上で固定されているGPCRを用いて実行されても良い。親和性樹脂を使用する標識化GPCRの固定化に加えて、配列決定の他の形態は、ライブラリーからの選択リガンドの親和性精製を実行するために使用され得る。これらの形態としては、以下の例が挙げられるがこれらに限定されない。このレセプターおよび結合ライブラリー成分は、平衡透析を使用して、非結合ライブラリー成分から分離され得る。この標識化レセプターは、特定の親和性膜に結合され得、これはプレートの形態であるか、または別々である。次いで、このライブラリーは、この膜と共にインキュベートされ得、そして容易に洗浄して、非特異的結合成分を除去し得る。サイズ排除方法論が、ライブラリーとのレセプターのプレインキューベーションの後に、非結合成分から精製レセプター結合ライブラリー複合体を分離するために使用され得る。さらに、レセプターを含むミセル複合体(これは、脂質ならびに界面活性剤を取り込んでも良いし、取り込まなくても良い)は、選択親和性成分の結合後に、差次的遠心分離によってライブラリーから分離され得る。一般に、高親和性リガンドは、低pHまたは高塩濃度を使用して放出され得、そして本明細書中に記載される配列決定によって構造が同定される。
【0028】
標的レセプターに対する最も高い親和性を有するこれらのリガンドを決定する目的で、一般に、200よりも多くのペプチドライブラリーが、それぞれのライブラリーのそれぞれの阻害結合を決定するためにスクリーニングされ得る。一般に、100μMで、10%より高い阻害は、親和性精製を介する配列の連続する評価のために有意であった。本発明のさらなる局面において、一旦、好ましいアミノ酸残基が、高い優先値(preference value)に起因してライブラリーの変性位置でGPCRによって同定されると、特定のペプチドは、ライブラリー合成のために使用されるのと同じ方法によって合成される。本発明の1つの実施例において、高優先値は、1よりも大きい。この値は、サンプルの値からコントロールの値を引き、そして参照値で割ることによって決定される。本発明の好ましい実施形態において、この優先値は、1.2よりも大きい。本発明のより好ましい実施形態において、この優先値は、2よりも大きい。同定されたペプチド配列の合成の後、このペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィ(「HPLC」)によって精製され、そして組成は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(「MALDI−TOF MS」)およびEdman配列決定によって確認される。一般に、相対的親和性は、レセプター精製において使用される放射標識結合アッセイを改変することによって測定され得る。
【0029】
親和性精製ペプチドから得られたモチーフの特異性を増強するために、他の方法が使用され得る。このライブラリーの結合成分は、特定のN末端ブロックペプチドまたは他の配列決定不可能なアナログを用いて固定化されたタンパク質から溶出され得る。ライブラリーの結合の後に親和性樹脂からの微量の汚染物の放出を避けるために、その結合ライブラリーで標識したGPCRの放出/溶出は、特定のN末端ブロックペプチドまたは他の配列決定不可能なアナログを使用して、達成され得る。これは、アセチル化FLAGペプチドを使用して行なわれ、樹脂からGPCR−FLAGレセプターを溶出し得る。あるいは、このGPCR由来の標識は、親和性樹脂上に固定化した後に、そしてコンビナトリアルライブラリーが複合体から放出される後に、特異的プロテアーゼ(タンパク質/ベクター中に設計されるような;エンテロキナーゼまたはトロンビンのいずれか)を使用して切断され得る。最後に、ライブラリーは、単一アッセイかまたはアレイアッセイにおいて、(有意に少ないタンパク質を使用して)レセプターに結合するライブラリーの能力について、例えば、Sf9細胞(Spodoptera frugiperda)もしくはHigh Five細胞(Trichoplusia ni)(両方共Invitrogenから入手し得る)由来のGPCR−含有膜を使用する結合アッセイによってプレスクリーニングされ得る。このスクリーニングは、GPCRならびに多くの直鎖状および環状ライブラリーを使用して、結合についての天然のリガンドを阻害する際の、これらのライブラリーの有効性を決定するために実行され得る。
【0030】
さらに、GPCRに加え、他のレセプターおよび可溶性タンパク質は、本方法を用いて、スクリーニングされて、治療的用途のアゴニストまたはアンタゴニストを生成し得る。本スクリーニング方法論に従うタンパク質の型の例は、1回膜貫通型タンパク質、PIGテールレセプター、プロゲステロンレセプター、アレスチン、核レセプター、サイトカインレセプター、および本質的には、任意のタンパク質結合タンパク質、または任意のペプチド結合タンパク質を含むが、これに限定されない。IL−12は、サイトカインレセプターの1つの型であり、これは、本発明の方法において、I型糖尿病のような疾患の処置のための治療的化合物を同定するのに有用である。例えば、Falcone Mら、Curr.Opin.Immunol.11:670〜676(1999)を参照のこと。PIGテールレセプターは、カテプシンD(25)およびナチュラルキラー細胞レセプター(例えば、CD48およびCD55)(26)を含む。例えば、Ogier−Denis Eら、Biochem.Biophys.Res.Comm.211(3):935〜42(1995);およびScubert Jら、Blood 76(6):1181〜7(1990)を参照のこと。プロゲステロンレセプターは、生物学な関連を有する周知の核レセプターである。例えば、Chauchereau Aら、J.Biol.Chem.275(12):8540〜8548(2000);Fewings PEら、J.Neurosurg.92(3):401〜405(2000)を参照のこと。アレスチンは、可溶性タンパク質結合タンパク質のファミリーであって、これは、シグナル終末における役割によって、広範な疾患に関与する。例えば、Wilson CJら、Curr.Biol.3(10):683〜6(1993)を参照のこと。これらは、本様式に容易に適用され得るタンパク質のわずかな例である。
【0031】
本発明の方法はさらに、HIV感染あるいはAIDSのような疾患または障害を有する患者の処置のために適切なGPCR活性に対して拮抗的である、ペプチド、ペプチド模倣物、および/または低分子を含む治療剤の設計を包含する。GPCRについての結合化合物ならびに最適な合成の同定およびそれらの精製は、多くの疾患または障害(例えば、AIDSおよびHIV感染など)の有効な処置を提供する。一般に、本発明の小さいペプチドリガンド結合化合物(環状ペプチドリガンドおよび直鎖状ペプチドリガンドの両方)は、増大した結合親和性および作用を有し、そしてタンパク質溶解に耐性であることを示す。例えば、CXCR4、CCR5、性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター(「GnRHR」)、および特定の環状ペプチドについてのライブラリー由来のペプチドは、標的タンパク質に対する増大した結合活性を示すことが、確認されている。
【0032】
本発明の特定の実施形態は、以下の実施例において記載され、これらは限定を意味するものではない。
【0033】
(実施例)
(実施例1:標識化GPCRの調製および配向された直鎖状ペプチドライブラリーを使用するスクリーニング)
種々のGPCRベクターを、レセプターの精製をより容易にする当業者に公知な標準的技術を使用して、エピトープ標識を含むバキュロウイルス発現系のために調製し得る。標識は、タンパク質のN末端またはC末端で組み込まれ得る。GPCRについて、このレセプターのC末端の標識は、組み込まれて、レセプターのリガンド結合特性(これはこの分子のN末端または細胞外領域にある)の特徴を決定する。C末端 6×Hisタグ構築物およびC末端FLAG構築物の構築は、実施例として以下で提供される。代替の標識としては、例えば、GST、V5、Xpress、c−myc、HA、CBDおよびMBPが挙げられ得る。これらの構築物を、当業者に公知の標準的な技術を使用して、類似の手順によって作製した。
【0034】
この6×Hisタグは、ニッケルキレート化を使用して、一段階精製を可能にする。GPCRのためのcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)ならびに所望の遺伝子の3’末端および5’末端についてのプライマー、ならびにこの遺伝子の中央を使用して、適切なcDNAライブラリーから単離し得る。C末端標識を作製するために、目的の遺伝子をE.coliベクター(pET30a)に、C末端6×Hisタグを用いてサブクローニングした。次いで、この新規に作製されたレセプターを切除し、そしてpBlueBac(バキュロウイルス転移ベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA))に連結した。この構築物を、制限消化および配列決定の両方を使用して分析し、次いで、タンパク質発現分野の当業者によって代表的に行なわれるように、発現のためにSf9昆虫細胞(Pharmingen,San Diego,CA)にトランスフェクトした。
【0035】
C末端細菌FLAG構築物を、Sigmaから入手し得る(pFLAG−CTC)。標準的な技術を使用する同様のストラテジーを、このベクターの構築に使用した。このGPCRをpFLAG−CTCプラスミドを用いて連結し、次いでC末端FLAG標識中にサブクローニングし、そして消化したpBlueBacベクター中に連結した。この構築物を、制限消化および配列決定の両方を使用して分析し、そして発現のためにSf9昆虫細胞またはHigh Five昆虫細胞中にトランスフェクトした。
【0036】
Sf9細胞またはHigh Five細胞においてGPCR遺伝子を発現するために、GPCR挿入物を含むpBlueBacベクターを、Bac−N−Blue DNAと共に、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションを用いて標準的な技術を使用して同時トランスフェクトした。GPCRを、相同組替えによってバキュロウイルスゲノム中に挿入した。細胞を、トランスフェクション後24時間から4〜5日までモニターした。約72時間後、このトランスフェクション上清を、標準的なプラークアッセイを使用して、組替えプラークについてアッセイした。組替えウイルスを有する細胞は、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドイル−β−D−ガラクトシド)の存在下で増殖させた場合、青いプラークを生成した。これらのプラークを精製し、そしてこの単離物を、標準的技術を使用する組替えの正確さについて、PCRによって確認した。これにより、高力価ストックを生成し、そして発現研究のために、感染をこのストックから標準的技術を使用して実行した。トランスフェクトについてのコントロールとしては、細胞のみおよび転移ベクターが挙げられる。
【0037】
GPCRの発現のための構築物は、開始ベクターpBlueBac4.5(Invitrogen)から作製され、上記ベクターにおけるトロンビンおよびエンテロキナーゼ切断部位を除去し得る。GSTタグは、PCRを用いてマルチクローニングサイトに添加されて、GSTタグを生じ、次いで、当業者に公知の標準的な手順を用いて、切断されたベクター(SmaI/EcoRI)に連結される。その後、ベクターは、操作の簡便化のためにLifetechから提供されるGateway技術を用いて、適合性にされる。これは、この技術(Lifetechから得られる)に所望される組換え部位を含む、SmaI部位カセットに連結されることによって達成される。目的のGPCRは、組換えのための接着部位を含むように遺伝子を伸長するためのプライマーを用いたPCRを使用して増幅される。次いで、このPCR産物を、バキュロウイルスベクターに、BPクロナーゼ(clonase)(相同組換えに必要とされる酵素)を用いて取り込み、バキュロウイルス発現のための、エンテロトキシンまたはトロンビン切断部位を伴わず、C末端GSTタグを有するGPCRを含む、ベクターを作製する。このベクターは、Sf9細胞に、発現に必要なウイルスストックの調製のために同時トランスフェクトされる。このウイルスは、精製されたプラークであり、PCRおよび配列決定されたクローンは、GPCRの発現のために使用され得る。3つのGPCRを有するこの構築物の時間経過は、レセプターの最大の発現に必要な時間がより少なく、タンパク質分解がより少ないことを実証した。例えば、CCR5、CXCR4、およびGnRHRについては、発現に24〜48時間必要とした。GnRHRおよびCCR5に、より少ないタンパク質分解が生じた。
【0038】
Sf9細胞またはHigh Five細胞においてGPCR標識化レセプターを発現するために、標識挿入物を含むpBlueBacベクターを、Bac−N−Blue DNAと共に、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションを用いて標準的な技術を使用して同時トランスフェクトした。この標識化レセプターを、相同組替えによってバキュロウイルスゲノム中に挿入した。細胞を、トランスフェクション後24時間から4〜5日までモニターした。約24〜72時間後、このトランスフェクション上清を、標準的なプラークアッセイを使用して、組替えプラークについてアッセイした。組替えウイルスを有する細胞は、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドイル−β−D−ガラクトシド)の存在下で増殖させた場合、青いプラークを生成した。これらのプラークを精製し、そしてこの単離物を、標準的技術を使用する組替えの正確さについて、PCRによって確認した。これにより、高力価ストックを生成し、そして発現研究のために、感染をこのストックから標準的技術を使用して実行した。トランスフェクトについてのコントロールとしては、細胞および転移ベクターが挙げられる。
【0039】
Sf9細胞またはHigh Five細胞を、当業者に公知である標準的技術を使用して、接着培養物および懸濁培養物の両方として維持した。この接着細胞を、コンフルエントになるまで増殖させ、そして1:5の比で、脱落技術(sloughing technique)を使用して継代した。懸濁細胞を、(剪断を最小にするために)0.1%のプルロニック(pluronic)F−68を有するスピナーフラスコ中で1×106細胞/mlの密度まで継代培養することによって2〜3ヶ月、維持した。
【0040】
組替えウイルスでの感染後の時間経過を使用して、標準的な技術を使用して発現についての最適な増殖条件を決定した。スピナーフラスコからの細胞のアリコートを、この時間経過ににわたって採取し、800×gで10分間4℃で遠心分離し、そして上清とペレットの両方を、SDS−PAGE/ウェスタンブロット分析によってアッセイした。このGPCRを、膜分画(ペレット)中にあると予測した。全ての実行可能な系を、発現のレベルについてこの様式でアッセイした。標準的放射性結合アッセイを、膜調製物において、天然リガンドを用いて行って、活性について系を評価する。しばしばあるオーファンレセプターの場合のように、天然リガンドが公知でない場合(ここで、レセプターの活性は、規定されていない)、この活性は、当業者に公知の標準的な細胞に基づくアッセイを用いて、Gタンパク質共役シグナル活性について、アッセイされる。
【0041】
この膜分画を、最初に全Sf9細胞をペレット化し(800×g、10分間4℃)、次いでこのペレットを溶解緩衝液に均質化によって再懸濁することによって単離する。代表的な溶解緩衝液は、中性pHの付近であり、そしてプロテアーゼインヒビターのカクテルを含み、この両方は、当業者にとって標準的な技術である。例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼは、阻害剤(例えば、PMSF、アプロチニン、ロイペプチン、フェナトロリン、ベンズアミジンHCl)と共に使用され得る。膜をペレット化する。可溶化をまた、異なる界面活性剤(例えば、β−ドデシルマルトシド、n−オクチル−グルコシド、CHAPS、デオキシコール酸、NP−40、TritonX−100、Tween−20、ジギトニン、両性洗浄剤、CYMAL、ラウロイルサルコシンなどであるが、これらに限定されない)によるこのレセプターの可溶化を、量および活性について比較した。可溶化をまた、変化するNaCl濃度を使用して行った。従来の考えにも関わらず、低塩(例えば、低カルシウムおよび低マグネシウム濃度)を使用する、実質的にNaClが存在しないこの可溶化の工程により、量および活性について比較した場合、予期しなかった最適な可溶化条件が得られた。0.0nMのNaClを有することで、カウンター直感(counter−intuitive)であるが、結合特性を有する可溶化および固定化候補(例えば、CCR5およびCXCR4)の場合、最もよい条件を提供した。単離のための候補を、以下に記載するように精製を達成した。
【0042】
可溶化および活性のための適切な界面活性剤(例えば、NP−40)を決定した後、GPCRを、膜分画から精製した。正確な精製スキームは、選択した構築物に依存し、これは活性および可溶化の簡便さの問題である。6×His標識化レセプターの精製のために、膜分画をNi−NTAカラム(Quiagen,Valencia,CA)上に界面活性剤(例えば、NP−40)の存在下でロードし、十分に洗浄し、そしてイミダゾールで溶出した。FLAG標識化レセプターの精製を、抗FLAG M2親和性マトリクス(Sigma,St.Louis,MO)を使用して、界面活性剤の存在下で実行し、そしてグリシンで溶出した。この精製を、本明細書において記載される実験中の系について見出される適切な界面活性剤(例えば、NP−40)の存在下で実行した。精製したレセプターの活性は、本明細書に記載されるように評価した。
【0043】
ペプチドを、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル/ter.−ブチル(「Fmoc」/「tBu」)に基づく方法を介し、Applied Biosystems 433A合成機を用いて、Rinkアミド樹脂(NovaBiochem、置換レベル0/.54mmol/g)上に取り付けた。tBuをAsp、Glu、Ser、ThrおよびTyrの側鎖の保護のために使用し、tert.−ブチルオキシカルボニル(「Boc」)をLysおよびTrpの側鎖の保護のために使用し、2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル(「Pbf」)をArgの側鎖の保護のために使用し、そしてトリフェニルメチル(「トリチル」,「Trt」)をCys、His、AsnおよびGlnの側鎖の保護のために使用した。合成のスケールを0.20mmolとした。この樹脂を、最初にN−メチルピロリジノン(「NMP」)で洗浄し、その後、ピペリジン:NMP(1:4)の1×3分および1×7.6分の処置をNα−Fmoc除去のために行った。全てのFmoc−アミノ酸を、以下の製造者のプロコトルに従ってN−[(1H−ベンゾトリアゾ−ル−1−イル)(ジメチルアミノ)メチレン]−N−メチルメタナミニウムヘキサフルオロホスフェートN−オキシド(N−[(1H−benzotriazol−1−ly)(dimethylamino)methylene])−N−methylmethanaminium hexafluorophosphate N−oxide)(「HBTU」)と結合した:(a)1.0mmolの誘導体化したアミノ酸を2.1gのNMP中に溶解した;(b)0.9mmolの、N,N−ジメチルホルムアミド(「DMF」)中で0.5MのHBTUをこのアミノ酸のカートリッジに添加し、そしてこの溶液を6分間混ぜ合わせた;(c)1.0mLの2.0MのN,N−ジイソプロピルエチルアミン(「DIEA」)を含有するNMPをこのカートリッジに添加した;(d)HBTU溶液をこの樹脂に移し、混ぜ合わせる間、気温で40分間反応させた。この樹脂を濾過し、そして総体積90mlのNMPで6回リンスして、そしてこのサイクルを繰り返した。高度に縮重し指向されたペプチドライブラリーを構築するためのこの1ポット法(one pot method)において、樹脂のバッチを、この樹脂のどのような分割もなしに、コンビナトリアルアミノ酸の混合物と反応させた。
【0044】
出発混合物中のアミノ酸濃度を調整することによって、相対的な結合速度を制御し、これによってライブラリー中のアミノ酸の等しい取りこみを確実にする。天然のBoc保護されたアミノ酸およびFmoc保護されたアミノ酸の混合物の1ポット合成に対しての最適化は、以前に記載されている(例えば、米国特許第5,225,533号;Ivanetichら、Combinatorial Chemistry,267巻、Academic Press,San Diego,CA USA、247〜260頁(1996);Buettnerら、InnovationおよびPerspectives in Solid Phase Synthesis:Peptides,Proteins,andNucleic Acids,Mayflower Worldwide Ltd.、Birmingham,UK,169〜174頁(1994);Ostreshら、Biopolymers 34:1681〜9(1994);Songyangら、Methods in Mol Biol 87:87〜98(1998);およびHermanら、Molecular Diversity 2:147〜155(1996)を参照)。開裂反応を、トリフルオロ酢酸(「TFA」):H2O:アニソール:トリイソプロピルシラン(「iP3SiH」)(87.5:5:5:2.5,約6mL)中のペプチジル樹脂を、3時間、25℃で攪拌することにより実施した(例えば、Hermanら、1996を参照)。濾液を回収して、この樹脂をさらにTFAで洗浄した。冷(−78℃)ジエチルエーテルを、合わせた抽出物に添加し、そしてこの溶液を−78℃まで冷却した。上清を除去した後、得られた沈澱物を、冷エーテルで数回洗浄して、氷酢酸中に溶解し、そして凍結乾燥した。
【0045】
環状ペプチドライブラリーに対して、Fmoc−Asp(OH)−ODmab(Dmab,4−[N−(1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソキシシクロヘキシリジン)−3−メチルブチル)アミノ]−ベンジル(4−[N−(1−(4,4−dimethyl−2,6−dioxoxcyclohexylidene)−3−methylbutyl)amino]−benzyl))は、上記のように鎖が伸長された後に、Rinkアミド樹脂にアンカーされた側鎖である。直鎖状のアセンブリの後、Dmab基およびFmoc基の除去を、ヒドラジン:DMF(1:49)を用いた7分間の処理およびピペリジン:NMP(1:4)の6×3分の処理のそれぞれによって、達成した。この樹脂を、手動の環化のために、ポリプロピレンフリットを含んだシリンジに移した。樹脂上のヘッドトゥテイル(head to tail)環化を、NMP:DMF:ジクロロメタン、メチレンクロリド、DCM)(1:1:1)中の1%Trition Xを含む溶液中の7−アザベンゾトリアゾ−ル−1−イロキシ)−トリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(「PyAOP」):DIEA(1:2、4当量)を用いて、55℃で2時間、実施した。未反応の直鎖状前駆体を、DMF中のFmoc−Nva−OH/PyAOP/DIEA(「Nva」、「ノルバリン」)(1:1:2、4当量)で、1×18時間および1×3時間、処理をした。続く上記のような開裂および側鎖の脱保護によって、環状ペプチドライブリーおよび対応する直鎖状(非環化)配列を含む混合物を産生した。所望の環状ペプチドライブラリーを精製して、逆相高速液体クロマトグラフィー(「RP−HPLC」)によって直鎖状夾雑物を除去した。
【0046】
ペプチドおよびペプチドライブラリーを、HPLC、MALDI−TOF MS(Louisiana State University)、およびエドマン分解によって、特徴づけた。MALDI−TOF MS分析によって、不完全な脱保護、脱ブロック化、またはアルキル化に起因する、高分子量の不純物の存在の検出が可能である。エドマン分解は、ライブラリー中の各縮重位置における各アミノ酸量についての定量的な情報を提供する。
【0047】
合成された出発ライブラリーは、単一の非縮重指向化アミノ酸(すなわち、M−X−X−X−X−R−X−X−X−X−A、ここでXは、システイン以外の全てのアミノ酸の縮重した等モル混合物である)を有する。環状ライブラリー(ヘッドトゥテイル)はまた、単一の、非縮重指向化アミノ酸を用いて調製した。これらの出発ライブラリーの使用を通して、いくつかの縮重した位置において最適化された残基を規定し、そして2次ライブラリーを作製し、これらの位置を固定する。例えば、ヘッドトゥテイル環化ライブラリー シクロ(M−X−X−X−X−R−X−X−X−X−N)は、(固定されたRから)第−4位はリジンであるべきであり、その第−2位はアスパラギン酸であるべきであり、第−1位はヒスチジンであるべきであり、そして第+3位はリジンであるべきであり、結果として第2ライブラリーは、シクロ(M−K−X−D−H−R−X−X−K−N)であることを示す。
【0048】
指向された線形ペプチドライブラリーを、固定化されたGPCRおよび単離された高親和性ペプチドの小画分を含むカラムに適用した。結合ドメインを使用したペプチドライブラリースクリーニングを示した概念図を、図2に示し得る。洗浄後、結合ペプチドをこのカラムから溶離した。次に、結合したペプチドおよびこのカラムに適用したライブラリー全体の両方を、別個にエドマン分解に供し、そして位置の関数としてアミノ酸分布を決定した。最後に、縮重位置でのアミノ酸の傾向を決定する。例えば、セリンが、出発ライブラリー中のアミノ酸の第+1位で5%であるが、高親和性ペプチド中の第+1位で、アミノ酸の15%である場合、第+1位はセリンに対する選択が存在する。その位置での優先値3が得られる。表1は、結合ドメインを使用したペプチドライブラリー法の使用の選択的な概観を提供する。
【0049】
【表1】
(実施例2:GSTタグ化CCR5の調製およびスクリーニング)
ライブラリーを、Rink Amide MBHA樹脂(置換:0.54mmol/gm)を使用して9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護基と共に、ABI 433A(Applied Biosystems,Forster City,CA)上に合成した。縮重位置に対するアミノ酸のほぼ等しいカップリングを得るために、アミノ酸量を、文献値を考慮して経験的に調節した。例えば、Hook W.ら、Fed.Proc.44:1323(1985)を参照のこと。例示的なカップリング試薬は、1当量のペプチドに対して1当量の、HBTU/HOBT/DIEAであった。開裂はカクテル(82% TFA、5%フェノール、5%チオアニソール、2.5% 1,2−エタンジチオール、5%水)によって達成した。ペプチドをメチル−tert−ブチルエーテルから沈澱した。ライブラリーをMALDI−TOF MS(Lousiana State University)およびアミノ酸配列決定によって特徴づけた。
【0050】
出発ライブラリーは、例えば、単一な非縮重指向化アミノ酸(すなわち、X−X−X−X−R−X−X−X−X)を使用した。2次ライブラリーは、いくつかの縮重位置に見出された最適な残基を固定化することにより調製し得る。例えば、X−X−X−X−R−X−X−X−Xは、第−4位がプロリンであるべきであり、その結果2次ライブラリーは、P−X−X−X−R−X−X−X−Xであることを示し得る。
【0051】
レセプターのGST形態を用いたペプチドライブラリーの使用を本明細書中で提供する。GSTタグ化GPCRの場合、このレセプターはこのライブラリーに曝露され得、そして、遠心分離によりこれらの膜を、ペレットすることによって、遊離ペプチドと結合したペプチドとの分離を達成した。GSTタグ化精製レセプターをペプチドライブラリー、約1μmoleのペプチドおよび約1nmolの結合部位と共にインキュベートした。インキュベーション後、結合したペプチドを伴ったレセプターを、遠心分離によって非結合ペプチドから分離した(ペレット中のレセプター・ペプチド複合体、上清中の非結合ペプチド)。非特異的に結合したペプチドを、徹底的な洗浄によって除去し得、そして低いpH(2.5以下)のペレットの再懸濁物を使用して結合したペプチドを除去した。このペプチドを配列決定し、コンセンサス配列を決定した。
【0052】
FLAG−タグ化GPCRを、ペプチドライブラリースクリーニングのために使用する場合、このレセプターを抗FLAG M2親和性マトリックス(St.Louis、MO)上に固定化した。さらなる精製アプローチはGST構築物および固定したグルタチオン(Pierce、Rockford、IL)を使用し得た。
【0053】
結合したペプチド混合物と出発ペプチドライブラリーの両方を、標準的な技術を使用して配列決定し得た。各アミノ酸量を、位置の関数として、決定した。各位置の各アミノ酸に対する優先値を、出発ライブライブラリーに存在するアミノ酸量とペプチドの結合画分とを比較することによって計算した。これらの手順を使用して、多くの結合ドメインと相互作用するペプチドの好ましい配列を生成し、そしてこれを表1に記載した。
【0054】
また、2次ライブラリーを出発ライブラリーからの情報を組み込むことによって配列決定し得た。特徴付けのこの第1のラウンドについて、ファージディスプレイ技術をまた使用して予備的な結合モチーフを同定する。ファージディスプレイ法は、天然のアミノ酸のモチーフの同定を提供する。ファージディスプレイ技術は、DNA配列を、ファージ被覆タンパク質の1つをコードする遺伝子中へ挿入することを包含する。この遺伝子を特定の位置に挿入して、その結果発現されたタンパク質挿入物は他の分子と相互作用し得る。結果として、コードされたペプチドまたはタンパク質配列を、ファージ表面上に提示し、そして結合のために曝露する。縮重ヌクレオチドを挿入することによって、各ファージは、異なったペプチド配列を発現し得る(「ファージライブラリー」)。このファージライブラリーと固定したレセプターとのインキュベーションを使用して、このレセプターに特異的に結合する配列を同定し得る。シグナルは、単離されたファージを増殖することよって増幅することができるので、微弱なシグナルでさえ検出し得る。ファージディスプレイから導出した情報は、薬学的特徴を増大したリガンドを選択するために、新規のアミノ酸アナログまたは環状ペプチドを含む合成ライブラリーを使用する、親和性精製法に対して適用可能である。出発ライブラリー、2次ライブラリーおよび3次ライブラリーの使用によって、結合部位の特異性の完全な定義を提供した。
【0055】
一旦、好ましいアミノ酸残基を、このライブラリーの縮重位置における、高い優先値を使用して同定すると、特異的なペプチドをライブラリー合成に用いたような方法によって合成し得た。これらをHPLCによって精製し、そして組成をMALDI−TOF MSによって確認した。
【0056】
相対的な親和性を、レセプター精製に使用したヨウ素化結合アッセイを改変することによって測定し得る。従って、この精製したレセプター膜から[125I]−リガンドを提示するこれらのペプチドの能力を測定し得た。しかし、この天然リガンドが既知でない場合、この活性を当該分野で標準的な細胞に基いたアッセイを使用して測定し得る。また、会合定数を当該分野で標準的な技術を使用して決定し得る。
【0057】
(実施例3:タグ化したCCR5の調製と分析およびこれのライブラリースクリーニング)
(A.CCR5のクローニングおよび発現)
CCR5 cDNA(図4の配列を参照)をベクターpCDNA3中のReceptor Biology(Beltsville,MD)から得た。タグを、レセプターのC末端に加え、本明細書中に記載のような、標準的な技術を使用する親和性精製アッセイのために、レセプターを固定するのに使用した。さらに、GenBank 登録番号U57840に相関するCCR5 cDNAを、ベクターpCDNA3中で使用し得る。Receptor Biology由来のCCR5 cDNAと、GenBank 登録番号U57840に相関するCCR5 cDNAとの間の唯一の違いは、第180位の塩基の点変異(このアミノ酸配列において、ロイシンをグルタミンに変化させる)である。以下は、このタグ化方法を使用した実験からの具体的な例である:
(C末端ヒスチジンタグを伴ったCCR5の構築(昆虫選択発現系))
CCR5−HIS構築物をこの系から誘導した。PCRをCCR5/pcDNA5(Receptor Biology製)をテンプレートとして使用して、そしてプライマー5−Age Hisおよびプライマー5−Spe Hisを使用して実施した。この最初のプライマーによって、独特のSpeI部位を、CCR5の開始ATGの直前に誘導した。第2のプライマーによって、CCR5の終止コドンを、pIZT/V5−His(Invitrogen、Carlsbad、CA)のヒスチジンタグとインフレームであるAgeI部位の中へ変異した。PCR産物をSpeIとAgeIで消化し、次いで、同様に消化されたpIZT/V5−Hisの中へ連結した。この構築物は、CCR5−His−PIZTとして同定される。
【0058】
(C末端ヒスチジンタグを伴ったCCR5の構築(バキュロウイルス発現系))
CCR5−His−PIZTをHaeIIとSpeIで消化し、次いで、クレノウフラグメントで埋めた。CCR5−Hisを含むこのフラグメントを、予めNheIで消化され、そしてクレノウで平滑化したpBluebac 4.5(Invitrogen)中へ、連結した。この構築物を方向の正確さについてチェックした。これは、CCR5−HISと呼ばれる。この構築物を、制限消化および標準的な技術を用いた配列決定によって確認した。この構築物を発現のために使用し、そして十分に発現され、そして親和性精製スクリーニングでの使用のための活性形態にあることを決定した。
【0059】
(C末端FLAGタグを有するCCR5の構築)
標準的な技術を使用するPCRを、テンプレートとしてCCR5/pcDNA3(Receptor Biology製)ならびにプライマー5−Xho pFLAGおよびプライマー5−Sal pFLAGを使用して実施した。第1のプライマーは、CCR5のイニシエーターATGの直前の固有のXhoI部位を操作した。第2のプライマーは、CCR5の停止コドンをSalI制限部位に変異した(Sigma製のpFLAG−CTCのFLAGタグを用いてインフレームで)。PCR産物を、XhoIおよびSalIで消化し、そして同様に消化したpFLAG−CTC(細菌の発現ベクター)に連結した。この構築物を、CCR5−FLAG−CTCと呼ぶ。次いで、CCR5−FLAGを、XhoIおよびScaIで消化し、そしてクレノウ断片で充填した。CCR5−FLAG−CTCを含むフラグメントを、最初にNheIで消化し、次いで、クレノウで平滑化したpBluebac4.5に連結した。この最終構築物を、CCR5−FLAGとして同定する。この構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術を使用して配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを決定した。
【0060】
(C末端GSTタグを有するCCR5の構築)
PCRを、テンプレートとしてCCR5/pcDNA3(Receptor Biology製)ならびにプライマーGST−BamHIおよびプライマーGST−NdeIを使用して実施した。第1のプライマーを、CCR5の停止コドンを、BamHI制限部位に変異した(pESP−3のFLAG/GSTタグを用いてインフレームで)。第2のプライマーを、CCR5の開始コドンにおける固有のNdeI部位に導入した。PCR産物を、BamHIおよびNdeIで消化し、そして同様に消化したpESP−3(酵母発現ベクター)に連結した。この構築物を、pCP8と呼ぶ。次いで、pCP8を、NdeIおよびSmaIで消化し、そしてクレノウ断片で充填した。CCR5−GSTを含むフラグメントを、最初にBglIIで消化し、次いでクレノウで平滑化した、pBluebac4.5に連結した。この最終構築物を、pCP10として同定する。このタンパク質を記載する場合、この構築物を、CCR5−GSTとして同定する。この構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術によって配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを判定した。
【0061】
3つの新しい構築物のためのベクター(CCR5−FLAG、CCR5−GSTおよびCCR5−HIS)を使用して、それぞれのウイルスストックの産生のためにSf9細胞を同時トランスフェクトした。これらのウイルスストックを、標準的なプラークアッセイを使用して精製し、次いで実験に使用して、種々のC末端タグを有するCCR5の発現の最適化のために感染させた。High Five細胞(Invitrogen)をまた、これらのCCR5タグ化構築物でトランスフェクトし、そしてCCR5の発現について試験した。全ての構築物について、適切なタグ化レセプターを発現することを判定した。72時間後の発現レベルは、Sf9細胞について発現レベルよりもHigh Five細胞において5倍ほど高かった。全ての上記の実験を、当業者に公知の標準的な技術を使用して行なった。
【0062】
CCR5の発現のための第4の構築物を、スターティングベクターpBlueBac4.5(Invitrogen)から作製し、以前記載したベクターにおけるトロンビン開裂部位およびエンテロキナーゼ開裂部位を除去した。GSTタグを、PCRを使用することによってマルチクローニング部位に付加してGSTタグを精製し、次いで、当業者に公知の標準的な方法を使用して消化したベクター(SmaI/EcoRI)に連結した。次に、このベクターを、操作の容易化のためにLifetech製のGateway技術と適合性にした。これを、この技術のために必要な組換え部位を含むカセット(Lifetech製)にSmaIを連結することによって行なった。CCR5を、プライマーを使用してPCRを用いて増幅して、組換えのための結合部位を含む遺伝子を伸長した。次いで、PCR産物を、BPクロナーゼ(相同組換えに必要な酵素)を使用してバキュロウイルスベクターに組み込んで、エンテロキナーゼ開裂部位またはトロンビン開裂部位を有さず、C末端GSTタグ有するCCR5を含むバキュロウイルス発現のためのベクターを作製した。このベクターを、発現のために必要なウイルスストックの調製のためにSf9細胞に同時トランスフェクトした。このウイルスをプラーク精製し、そしてPCRおよび配列チェックしたクローンを、CCR5の発現のために使用した。この構築物のタイムコースは、タンパク質のより少ないのタンパク質分解が観察され、そしてより少ない時間が、レセプターの最大の発現を得るために必要であったことを示した。
【0063】
(B.CCR5の活性)
それぞれのタグ化CCR5遺伝子(CCR5−GST、CCR5−FLAGおよびCCR5−HIS)を、本明細書中に記載されるように、Sf9細胞およびHigh Five細胞において発現させた。全てのSf9細胞株由来の全細胞およびHigh Five細胞株由来の全細胞を、低張緩衝液(10mM Tris(pH7.4)、5mM EDTA)を使用して溶解し、そして膜調製物を、当業者に公知の標準的な技術を使用するホモジナイズおよび遠心分離によって作製した。CCR5−GST、CCR5−FLAGおよびCCR5−HISに関する膜調製物を、それぞれ、標準的な放射リガンド結合アッセイを使用してアッセイした。結合アッセイを、50mMのHepes(pH7.5)、1% BSA中の5μgの膜を用いて実施した。放射リガンドMIP1−β(New England Nuclear、「NEN」から得た)を、冷MIP1α(競合リガンド;CCR5に対する天然のリガンドは、RANTES、MIP1βおよびMIP1αである)と共に、および冷MIP1αなしで室温で1時間、膜と共にインキュベートし、濾過し、洗浄し、そして結合した放射活性計数を、シンチレーションカウンターを使用して測定した。非トランスフェクト細胞を、この実験のコントロールとして使用した。膜調製物の活性は、少なくとも20%の活性タンパク質を有するReceptor Biology(MIP1−β結合に関してKd<1nM)によって得られた膜調製物に匹敵した。
【0064】
(C.CCR5の可溶化)
溶解した全細胞調製物および膜調製物の両方を、可溶化のために使用した。CCR5(CCR5−FLAG、CCR5−GSTおよびCCR5−HIS)のタグ化バージョンの可溶化を、約6.8〜約8.2の範囲のpHで、界面活性剤(例えば、NP−40、TritonX−100、β−D−マルトシド、n−オクチルグルコシド、CYMAL、Zwittergents、Tween−20、ライソホスファチジルコリン、CHAPSなど)、塩(例えば、NaCl、CaCl2、MgCl2、MnCl2、KClなど)、緩衝液(例えば、Tris、Hepes、Hepps、Pipes、Mes、Mops、酢酸、リン酸、イミダゾールなど)の多くの異なる組み合わせを使用して実施した。最適な可溶化のための条件を、pH8.1でZwittergent3〜14および低塩(例えば、低いマグネシウムおよびカルシウムであって、NaClはない(0.0nM NaCl)を使用して見出した。好ましい実施形態において、少なくとも20%の可溶化された、固定化タンパク質は、活性である。非常に好ましい実施形態において、少なくとも30%、40%、50%および75%の可溶化された固定化タンパク質は、活性である。
【0065】
(D.CCR5の固定化)
可溶化後、CCR5−GSTとCCR5−FLAGの両方を、精製のためおよびペプチドライブラリーのスクリーニングのための活性タンパク質として使用するためにアフィニティーカラムに固定化した。ライブラリーからのアフィニティー精製のためのGPCRの固定化を示す概略図を図3に示す。CCR5−GSTを、グルタチオン−アガロース(Pierce)およびグルタチオン−セファロース(Amersham Pharamacia Biotech)に結合し、そして固定化し、そしてCCR5−FLAGを、FLAGエピトープを認識する特異的な抗体カラム(M2カラム,Sigma)に固定化した。活性形態におけるタンパク質の固定化は、カラムにある間、活性を維持するための界面活性剤ならびに適切なpHおよび適切な塩状態を必要とした。この活性を、放射標識化MIP−1β(上記の膜アッセイに用いた)および冷MIP−1αを用いた競合を使用して放射活性結合によって測定した。トランスフェクトされていない細胞を、カラム単独と同様に、この活性のためのコントロールとして使用した。これらの実験は、活性形態の樹脂に(アフィニティー精製スクリーニングに十分な)精製形態のマイクログラム量のレセプターを固定する能力を実証した。
【0066】
(E.ペプチドライブラリー合成)
ライブラリーを、Rink Amide MBHA樹脂(置換:0.54mmol/gm)を使用して9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護基を有するABI 433A(Applied Biosystems,Forster City,CA)において合成した。アミノ酸の混合物を、位置を縮重するために使用する場合、およそ等量のアミノ酸の結合を、文献値を考慮にいれた後、経験的にアミノ酸の量を調節することによって得た(例えば、Ivanetichら,Combinatorial Chemistry,第267巻,Academic Press,San Diego,CA USA,247〜260頁(1996)を参照のこと)。結合剤は、HBTU/HOBT/DIEA(等価のペプチドあたり1当量)であった。切断を、カクテル(82% TFA、5% フェノール、5% チオアニソール、2.5% 1,2−エタンジチオール、5% 水)によって行なった。ペプチドは、メチル三級ブチルエーテルから沈殿させた。ライブラリーを、MALDI−TOF MS(Louisiana State University)およびアミノ酸配列決定によって特徴付けた。
【0067】
第1のライブラリーは、単一、縮重塩基性ベースアミノ酸(すなわち、M−X−X−X−X−W−X−X−X−X−A−K−K−K)を使用した。これらの第1のライブラリーの使用を介して、幾つかのまたは全ての縮重位置における最適な残基を、規定した。第2のライブラリーを、全ての位置を規定していなかった場合、作製し、それによって規定の位置を固定した。
【0068】
(F.固定化CCR5を使用するペプチドライブラリーのスクリーニング)
特定の樹脂に固定化されたタンパク質を用いて(例えば、CCR5−GSTをグルタチオン−セファロースにかまたはCCR5−FLAGをM2抗体−アガロースに固定化する)、無数の化合物のスクリーニングを、一緒にインキュベートすること、およびCCR5によって好まれるリガンドを精製する自然の選択および結合親和性を可能にすることによって行い得る。これらの実験を、直鎖状ライブラリー4P4(+)および他のライブラリーを使用して実施した。
【0069】
(G.ファージディスプレイ)
スクリーニングにおいて有用な代替の方法またはさらなる方法として、固定された機能的CCR5を使用して、当業者に公知の標準的な技術を使用してCCR5に結合するファージを単離した。アッセイにおいて使用されたグルタチオン−セファロースビーズ、BSAおよびMIP1βからのバックグラウンドのサブトラクションを、これらの化合物の混合物と共にファージライブラリーをインキュベートすることによって実施した。レセプターとの、サブトラクションしたファージライブラリー(すなわち、NEB、PhD C7C)のインキュンベーション後、結合したファージを、天然のCCR5リガンド(MIP−1β)およびグリシン、pH2.2の両方とによって溶出した。PhD C7Cは、ジスルフィド間に7個の無作為なアミノ酸を有する特殊なファージライブラリーであり、そしてNew England Biolabs(「NEB」)から得られ得る。複数回のスクリーニングを実施した。両方の条件は、CCR5に結合し、そしてリガンド結合を阻害し得る特定の配列を提供した。
【0070】
(実施例4:タグ化CXCR4の調製および分析ならびにそのライブラリースクリーニング)
(A.CXCR4のクローニングおよび発現)
CXCR4を、二等分した脾臓cDNAライブラリーから単離し、そして一緒にスプライスした。これらの2つのフラグメントを、PCR技術ならびに3’末端および5’末端に対するプライマーならびにCXCR4遺伝子の中央部を使用して単離した。全長クローンを、3’プライマーおよび5’プライマーを使用して単離しなかったが;しかし、2等分を、単離し、そして遺伝子内の固有のBamHI部位を使用して一緒に連結した。構築物の同定を、配列決定によって確認した。選択的スプライス短縮形態もまた、単離した。これを、CXCR4短縮型と呼ぶ。タグを、レセプターのC末端に付加し、標準的な技術を使用するアフィニティー精製アッセイのためにそれらを固定するために使用した。以下は、このタグ化方法を使用した実験からの具体的な実施例である。
【0071】
(C−末端ヒスチジンタグを有するCXCR4の構築(昆虫選択発現系))
GnRHR(性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター)に関する遺伝子を含む以前の構築物を、使用して、第1のCXCR4構築物を作製した。GnRHRに関する遺伝子を、スプライスし、そしてCXCR4に関する単離したcDNAによって置換した。このベクターは、本来、C末端に6×Hisタグを有するpet30aベクターであった。
【0072】
(C末端FLAGタグを有するCXCR4構築物の構築)
PCRを、プライマー5’BspE1 CXCR4およびプライマー3’Bgl CXCR4を使用して実施し、そしてSigma製のpFLAG−CTC(細菌発現ベクター)のFLAGタグを有するインフレームCXCR4の連結のための固有の部位を操作した。この構築物を、CXCR4−FLAG−CTCと呼ぶ。次いで、CXCR4−FLAGを、消化によって除去し、そしてクレノウ断片で充填した。CXCR4−FLAGを含むフラグメントを、最初に、消化し、次いで、クレノウで平滑化したpBluebac4.5に連結した。この最終構築物を、CXCR4−FLAGと呼ぶ。この構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術を使用して配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを判定した。
【0073】
(C末端GSTタグを有するCXCR4構築物の構築)
新しく構築されたCXCR4−FLAG cDNAを、CTCベクターから除去し、そしてCCR5の代わりに(BglおよびBspE1を使用して)別の構築物(CCR5−GST)にサブクローニングした。これは、1工程を使用してCXCR4−GSTのためのベクターを作製した。の構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術を使用して配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを判定した。
【0074】
(N末端6×Hisタグを有するCXCR4の構築)
この構築物を市販のベクター、pBluebacHis2b(Invitrogen)にCXCR4をサブクローニングすることにより調製した。この構築物を、標準的技術を用いた制限消化および配列決定により確認した。
【0075】
3つの新規の構築物、CXCR4−FLAG、CXCR4−GST、およびCXCR4−HISのベクターを用いて、それぞれのウイルスストックの作成のためにSf9細胞を同時トランスフェクトした。これらのウイルスストックを、標準的なプラークアッセイを用いて精製し、次いでその種々のC末端タグを有するCXCR4の発現の最適化に関する感染実験において用いた。High Five細胞(Invitrogen)もまた、これらのCXCR4タグ化構築物を用いてトランスフェクトし、そしてCXCR4の発現について試験した。全ての構築物を適切にタグ化したレセプターを発現するために決定した。High Five細胞における72時間後の発現レベルは、Sf9細胞におけるレベルよりも5倍高かった。
【0076】
(B.CXCR4の活性)
それぞれのタグ化CXCR4遺伝子(CXCR4−FLAG、CXCR4−GST、およびCXCR4−HIS)を、本明細書中に記載される、Sf9およびHigh Five細胞に同時トランスフェクションするために用いた。Sf9およびHigh Five細胞株由来の全細胞を、低張緩衝液(10mM Tris(pH7.4)、5mM EDTA)を使用して溶解し、そして膜調製物を、当業者に公知の標準的な技術を使用するホモジナイズおよび遠心分離によって作製した。CXCR4−GST、CXCR4−FLAGおよびCXCR4−HISについての膜調製物を、標準的な放射性リガンド結合アッセイを使用してアッセイした。放射リガンド[125I]−SDR−1(NEN)を、冷SDF−1(競合する天然のリガンド)と共に、およびそれを伴わずに、室温にて1時間、膜と共にインキュベートし、濾過し、洗浄し、そして結合した放射性計数をシンチレーション計数を用いて検出した。非トランスフェクト細胞を、この実験のコントロールとして使用した。膜調製物の活性は、少なくとも20%の活性タンパク質を生じた。
【0077】
(C.CXCR4の可溶化)
溶解した全細胞および膜調製の両方を、可溶化のために使用した。CXCR4にタグ化バージョン(CXCR4−FLAG、CXCR4−GSTおよびCXCR4−HIS)の可溶化を、界面活性剤(例えば、NP−40、TritonX−100、β−D−マルトシド、n−オクチルグルコシド、CYMAL、Zwittergents、Tween−20、ライソホスファチジルコリン、CHAPSなど)、塩(例えば、NaCl、CaCl2、MgCl2、MnCl2、KClなど)、緩衝液(例えば、Tris、Hepes、Hepps、Pipes、Mes、Mops、酢酸、リン酸、イミダゾールなど)の多くの異なる組み合わせを約6.8〜約8.2の範囲のpHにて使用して実施した。最適な可溶化のための条件を、pH8.1でZwittergent3〜14および低塩(例えば、低いマグネシウムおよびカルシウムであって、NaClはない(0.0nM NaCl)を使用して見出した。好ましい実施形態において、少なくとも20%の可溶化された、固定化タンパク質は、活性である。非常に好ましい実施形態において、少なくとも30%、40%、50%および75%の可溶化された、固定化タンパク質は、活性である。
【0078】
(D.CXCR4の固定化)
可溶化後、CXCR4−GSTを、精製のためおよびペプチドライブラリーのスクリーニングにおける使用のための活性タンパク質として使用するためにアフィニティーカラムに固定化した。ライブラリーからのアフィニティー精製のためのGPCRの固定化の示す概略図を、図3に示す。CXCR4−GSTを、グルタチオン−アガロース(Pierce)およびグルタチオン−セファロース(Amersham Pharamacia Biotech)に結合し、そして固定化した。活性形態のタンパク質の固定化は、カラム上に置かれる間、活性形態を維持するために界面活性剤の使用ならびに適切なpHおよび塩濃度を必要とした。この活性を、放射標識したSDF−1(上記の膜アッセイを伴う場合)放射性結合および冷SDF−1との競合により決定した。トランスフェクトされていない細胞を、カラム単独と同様に、この活性のためのコントロールとして使用した。これらの実験は、活性形態の樹脂に、アフィニティー精製スクリーニングに十分な精製形態のマイクログラム量のレセプターを固定する能力を実証した。
【0079】
(E.ペプチドライブラリー合成)
ライブラリーを、Rink Amide MBHA樹脂(置換:0.54mmol/gm)を使用して9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)保護基を有するABI 433A(Applied Biosystems,Forster City,CA)において合成した。アミノ酸の混合物を、位置を縮重位置について使用する場合、およそ等量のアミノ酸の結合を、文献の値を考慮にいれた後、経験的にアミノ酸の量を調節することによって得た(例えば、Ivanetichら,Combinatorial Chemistry,第267巻,Academic Press,San Diego,CA USA,247〜260頁(1996)を参照のこと)。結合剤は、HBTU/HOBT/DIEA(等価のペプチドあたり1当量)であった。切断を、カクテル(82% TFA、5% フェノール、5% チオアニソール、2.5% 1,2−エタンジチオール、5% 水)によって行なった。ペプチドは、メチル三級ブチルエーテルから沈殿した。ライブラリーを、MALDI−TOF MS(Louisiana State University)およびアミノ酸配列決定によって特徴付けた。
【0080】
第1のライブラリーは、単一、非縮重塩基性ベースアミノ酸(すなわち、M−X−X−X−X−W−X−X−X−X−A−K−K−K)を使用した。これらの第1のライブラリーの使用を介して、幾つかのまたは全ての縮重位置における最適な残基を、規定した。第2のライブラリーを、全ての位置を規定していなかった場合、作製し、それによって規定の位置を固定した。
【0081】
(F.固定化CXCR4を使用するペプチドライブラリーのスクリーニング) タンパク質を、特定の樹脂に固定化し(例えば、CXCR4−GSTをグルタチオン−セファロースに固定化する)、無数の化合物のスクリーニングを、一緒にインキュベートすること、およびCXCR4に好まれるリガンドを精製する自然の選択および結合親和性を可能にすることによって行い得る。これらの実験を、10のライブラリーを使用して実施した。そしてこれらの実験は、他のライブラリーを用いて実施し得る。
【0082】
(G.ファージディスプレイ)
スクリーニングにおいて有用な代替の方法またはさらなる方法として、固定された機能的CXCR4を使用して、当業者に公知の標準的な技術を使用してCXCR4に結合するファージを単離した。アッセイにおいて使用されたグルタチオン−セファロースビーズ、BSAおよびSDF1αからのバックグラウンドのサブトラクションを、これらの化合物の混合物と共にファージライブラリーをインキュベートすることによって実施した。レセプターとの、サブトラクションしたファージライブラリー(すなわち、NEB PhD C7C)のインキュンベーション後、結合したファージを、天然のCXCR4リガンド(SDF1α)およびグリシン、pH2.2の両方とによって溶出した。PhD C7Cは、ジスルフィド間に7個の無作為なアミノ酸を有する特殊なファージライブラリーであり、そしてNew England Biolabs(「NEB」)から得られ得る。複数回のスクリーニングを実施した。両方の条件は、CXCR4に結合し、そしてリガンド結合を阻害し得る特定の配列を提供した。
【0083】
(実施例5:疾患および障害の予防または処置)
しかし、現在、治療用ペプチド、ペプチド模倣物、または疾患および障害(例えば、AIDSおよびHIV感染)の予防および処置のために使用されるGPCR結合の低分子アゴニストもしくはアンタゴニストの生産、処方および使用の間に、いくつかの複雑な問題が生じる。GPCRの治療的結合化合物の商業的生産のコストおよび技術的難易度を最小化する生物学的に適切なアンタゴニストまたはアゴニストはさらに、本発明によって意図される。さらに、アンタゴニストまたはアゴニストに対する免疫学的応答を与えず、その結果その有効性を妨害する、GPCR結合の生物学的に適切なアンタゴニストまたはアゴニストは、本発明によって意図される。さらに、生成されたGPCR結合のアンタゴニストまたはアゴニストの、生物学的効力の有意な喪失を伴わない、商業的に妥当な有効期限を与える適切な処方は、本発明において意図される。さらに、AIDSおよびHIV感染のような疾患および状態の予防および処置のために適切な、個体に対する投与のための有用な用量は、本発明において意図される。
【0084】
単独でまたは他の適切な分子と混合した、GPCR結合の阻害に関してコンピテントな適切な候補物の同定は、本発明によって意図される。このような候補物はさらに、AIDSおよびHIV感染のような疾患および状態の予防および処置のために生物学的に適切な、上記で同定された候補物の商業的に重要な量の生産を意図する。さらに、本発明は、最初に同定されたアナログの所望されない任意の特性(例えば、インビボでの毒性または貯蔵の際の分解傾向)が緩和される、GPCR結合アンタゴニスト、アゴニストまたは誘導体の治療的品質の商業的に重要な量の生産を提供する。
【0085】
ペプチド、ペプチド模倣物、またはGPCR結合活性の低分子アンタゴニストの同定および設計後の、AIDSおよびHIV感染のような疾患を予防および処置する方法は、本明細書中に記載のようなGPCR結合を阻害し得る化合物を含む組成物を投与する工程を包含する。投与は、任意の適合性の経路によるものであり得る。従って、適切な場合、投与は、経口または非経口(投与の静脈内および腹腔内の投与経路を含む)を含み得る。特に好ましい方法は、適切な処方物の徐放性注射によるものである。さらに、投与は、組成物のボーラスの定期的な注射によるものであり得るかまたは体外(例えば、静脈内バッグ)または体内(例えば、生物分解性の(bioerodable)移植)であるリザーバからの静脈内または腹腔内投与によってより連続的になされ得る。
【0086】
本発明によって意図される治療的組成物を、任意の適切な手段によって、直接(例えば、注射、移植または組織部位に対する局所的投与によるように局所的に)、または全身的に(例えば、非経口的にまたは経口的に)個体に提供し得る。組成物が非経口的に(例えば、静脈内、皮下、分子内、眼、腹腔内、筋内、頬、直腸、膣、眼窩内、頸部内、頭蓋内、脊髄内、室内、鞘内、大槽内、嚢内、鼻腔内によって)またはエアロゾル投与によって提供される場合、この組成物は、水性または生理学的に適合な液体懸濁物または溶液の部分を含み得る。従って、キャリアまたはビヒクルは、生理学的に受容可能であり、その結果、所望の組成物の被験体への送達に加えて、患者の電解質および/または容量バランスに他の悪影響を及ぼさない。
【0087】
非経口投与に有用な溶液は、薬学の分野で周知の方法(例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE(Gennaro,A.、編)、Mack Pub.、1990に記載される方法)のいずれかによって調製され得る。本発明の治療用薬剤の処方物としては、例えば、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリエチレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなど)が挙げられ得る。特に、直接投与のための処方物は、所望の部位での薬剤の維持を補助するグリセロールおよび他の高粘度の組成物を含み得る。生体適合性、好ましくは生体吸収性(bioresorbable)のポリマー(例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸三カルシウム、ポリブチレート、ラクチドならびにグリコリドポリマーおよびラクチド/グリコリドコポリマーを含む)は、インビボで薬剤の放出を制御する有用な賦形剤であり得る。ペプチド薬物についての徐放性注射可能処方物の概念は、十分受け入れられており、そしていくつかの利点を提供する。第一に、例えば、バイオアベイラビリティーが高い。第二に、処置レジメンは、1ヶ月または3ヶ月当たり1回(AbottのLeupron(登録商標)のように)または1年に1回(例えば、AlzaのViadur(登録商標))からなり得る。第三に、徐放性注射可能処方物は、実質的に、使用され得る用量を減少させる(Leupron注射用量は、1mg/日であるが、90日の処方物使用量(formulationuse)は、総量11.25mgである)。また、増大した効力は、治療が感染性を予防するために連続して存在する場合に達成され得る。この考えは、感染のslow−to−clear沈着の再形成(例えば、記憶T細胞コンパートメント)を予防することにより疾患の治癒を達成する必要性の観点から特に重要である。例えば、Lee,V.編、Peptide and Protein Drug Delivery、Marcel Dekker,Inc.、NY(1991)を参照のこと。
【0088】
これらの薬剤のための他の潜在的に有用な非経口送達システムとしては、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームが挙げられる。吸引投与のための処方物は、賦形剤として、例えば、ラクトースを含むか、または水溶液(例えば、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む)かもしくは鼻ドロップまたは鼻腔内へ適用されるためのゲルの形態での投与のための油性溶液であり得る。非経口投与のための処方物はまた、頬投与のためのグリココレート、結腸投与のためのメトキシサリチラート、または膣投与のためのクエン酸(cutric acid)を含み得る。
【0089】
本発明のさらなる局面および実施形態は、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、固定された非変性リジンもしくはアルギニン、ならびにおおよそ等しい割合の18アミノ酸からなる8個の変性位置を有する、ペプチドライブラリーを示す。
【図2】図2は、結合ドメインを用いたペプチドライブラリーのスクリーニングを示す。
【図3】図3は、ライブラリーからのアフィニティー精製のためのGPCRの固定化を示す。
Claims (32)
- Gタンパク質共役レセプターに対する結合化合物を同定する方法であって、該方法は、以下:
a)2つ以上の分子のライブラリーを提供する工程;
b)Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子を提供する工程であって、該分子が支持体に結合される、工程;
c)該2つ以上の分子のライブラリー由来の分子を、該支持体に結合されたGタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する該分子に結合する工程;
d)該支持体に結合された該分子から該結合した分子を分離する工程;および
e)Gタンパク質共役レセプターに対する結合化合物として該結合した分子を同定する工程、
を包含する、方法。 - 前記2つ以上の分子のライブラリーが、直鎖ペプチド、環状ペプチド、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣化合物、および低分子化合物からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する前記分子が、部分的に精製されたGタンパク質共役レセプターである、請求項1に記載の方法。
- 前記2つ以上の分子の少なくとも1つが、レセプター、酵素、または他のタンパク質に結合し得るタンパク質を置換し得るペプチド、ペプチド模倣物、または低分子からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 実質的に塩化ナトリウムの非存在下で、Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する前記分子を溶解する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 低塩濃度を有する緩衝液を用いてGタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する前記分子を溶解する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記2つ以上の分子の少なくとも1つが、Gタンパク質共役レセプター結合活性に対する拮抗効果を有する分子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリーがファージライブラリーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記工程a、b、c、およびdが前記工程eの前に少なくとも1回繰り返される、請求項1に記載の方法。
- Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する前記分子が、Gタンパク質共役レセプター分子および以下からなる群より選択されるタグを含む、請求項1に記載の方法:GST、FLAG、6×His、C−MYC、MBP、V5、Xpress、CBP、およびHA。
- 請求項1に記載の方法に従って同定されるGタンパク質共役レセプターに対する結合化合物。
- 患者において疾患または障害を予防する方法であって、該方法は、生理学的キャリア中に請求項11に記載の化合物を含む治療組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
- 前記疾患または障害が、HIV感染である、請求項12に記載の方法。
- 前記疾患または障害が、AIDSである、請求項12に記載の方法。
- 患者において疾患または障害を処置または予防する方法であって、該方法は、徐放性の注入可能な処方物中に請求項11に記載の化合物を含む治療組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
- 前記疾患または障害が、HIV感染である、請求項15に記載の方法。
- 前記疾患または障害が、AIDSである、請求項15に記載の方法。
- Gタンパク質共役レセプターに対する試験分子の相対的な結合親和性を同定するためのコンピュータに補助される方法であって、該方法は、以下:
a)Gタンパク質共役レセプターを特徴付ける入力データをコンピュータプログラムに入力する工程;
b)その各々の配列は既知であるが、その結合親和性は未知である、少なくとも1つの試験ペプチド様分子を特徴付ける入力データを入力する工程;
c)各試験ペプチド様分子に対する相対的な結合親和性の予測を生成するために、該コンピュータプログラムを用いて適用された各試験ペプチド様分子を分析し、そしてこのような予測を出力する工程;
を包含する、方法。 - Gタンパク質共役レセプターに対する結合化合物の相互作用部位のアミノ酸配列モチーフを決定するための方法であって、該方法は、以下:
a)Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子とペプチドライブラリーを、該Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と該ペプチドライブラリーとの間の相互作用を可能にする条件下で、接触させる工程;
b)該Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子が、該ペプチドライブラリーと相互作用し、その結果、該Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と該Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と相互作用し得るライブラリーのメンバーの亜集団との間で、複合体が形成される工程;
c)該Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と相互作用し得ないライブラリーのメンバーから、該Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と相互作用し得るライブラリーのメンバーの該亜集団を分離する工程;
d)該Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子と相互作用し得るライブラリーのメンバーの該亜集団を直鎖状にする工程;
e)直鎖状にされたライブラリーのメンバーの混合物中での、各変性位置において異なるアミノ酸残基の相対的な豊富さを決定する工程;および
f)該直鎖状にされたライブラリーのメンバーの混合物中での、各変性位置において異なるアミノ酸残基の該相対的な豊富さに基づき、該Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子の相互作用部位のアミノ酸配列モチーフを決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項19に記載の方法に従って同定された、Gタンパク質共役レセプターに対する結合化合物のアミノ酸配列モチーフ。
- 請求項19に記載の方法により決定された、Gタンパク質共役レセプターに対するアミノ酸配列モチーフを有する結合化合物。
- 前記ペプチドライブラリーの少なくとも1つのメンバーが少なくとも1つの非天然のアミノ酸を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記Gタンパク質共役レセプターに対応する結合特性を有する分子が、直鎖ペプチド、環状ペプチド、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣化合物、および低分子化合物からなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記ペプチドライブラリーが、直鎖ペプチド、環状ペプチド、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣化合物、および低分子化合物からなる群より選択される少なくとも1つの分子を含む、請求項19に記載の方法。
- Gタンパク質共役レセプターに対する結合化合物の相互作用部位のアミノ酸配列モチーフに基づくメンバーを含むライブラリーであって、該モチーフは、ペプチドライブラリー由来の少なくとも1つのペプチドのメンバーが該Gタンパク質共役レセプターに対する結合化合物と相互作用することを可能にし、そして該Gタンパク質共役レセプターに対する結合化合物と相互作用する少なくとも1つのペプチドのアミノ酸配列を決定することにより決定される、ライブラリー。
- Gタンパク質共役レセプターの結合特性に対応する化合物を可溶化および固定化する方法であって、Gタンパク質共役レセプターの結合に対応する化合物を決定する場合に、該可溶化および固定化が、実質的に塩化ナトリウムの非存在下で実施される、方法。
- Gタンパク質共役レセプターの結合特性に対応する化合物を可溶化および固定化する方法であって、Gタンパク質共役レセプターの結合に対応する化合物を決定する場合に、該可溶化および固定化が、低塩濃度を用いることにより実施される、方法。
- 前記低塩濃度が、予め決定された量のマグネシウムおよびカルシウムを含む、請求項27に記載の方法。
- 構築されたGタンパク質共役レセプター転移ベクターであって、該転移ベクターがGタンパク質共役レセプター分子および以下からなる群より選択されるタグを含む、ベクター:GST、FLAG、6×His、C−MYC、MBP、V5、Xpress、CBP、およびHA。
- 薬物スクリーニングアッセイにおいてGタンパク質共役レセプターの三次元構造を使用する方法であって、該方法は、以下:
a)該三次元構造を用いて合理的な薬物設計を実施することにより潜在的な薬物を選択する工程であって、ここで、該選択工程がコンピュータモデリングと組合されて実施される、工程;
b)第1のGタンパク質共役レセプターを含む第1の分子と該潜在的な薬物とを接触させる工程;および
c)該潜在的な薬物と該第1の分子との結合を検出する工程;
を包含し、ここで、潜在的な薬物は、該潜在的な薬物が該第1の分子に結合する場合に薬物として選択される、方法。 - 前記第1の分子が標識される、請求項30に記載の方法。
- 前記第1の分子が固体支持体に結合される、請求項30に記載の方法。
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