JP2003528319A

JP2003528319A - Ｃｃケモカインレセプター５に対する結合化合物およびそれらを同定するための方法

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Publication number: JP2003528319A
Application number: JP2001569482A
Authority: JP
Inventors: ジョンジェイ．ジュニアネスター，; キャロルジェイ．ウィルソン，; レイモンドエイチ．シー，; ヘヒル，クリスティナエイ．タン
Original assignee: コンセンサスファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2000-03-21
Filing date: 2001-03-21
Publication date: 2003-09-24
Also published as: EP1268523A2; WO2001071346A3; JP2004502134A; CA2403784A1; WO2001070765A9; WO2001070765A1; CA2404139A1; EP1268520A2; EP1268521A1; WO2001071346A2; WO2001070768A3; AU2001247674A1; WO2001070768A2; AU2001247675A1; AU2001253870A1; CA2403788A1

Abstract

(57)【要約】ＣＣケモカインレセプター５に対する結合化合物の組成物、およびＣＣケモカイン５レセプターに対する結合化合物を同定するための方法が提供される。このような化合物を含む治療因子もまた提供される。１つの実施形態において、ＣＣＲ５に対する結合モチーフの同定、およびＣＣＲ５に対し結合し得るリガンドの同定のためのスクリーニング方法が提供される。別の実施形態において、本発明は、ＨＩＶおよびＡＩＤＳの予防または処置における使用に適切な、治療的ペプチド、ペプチド模倣物、または低分子の設計および同定を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本願は、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１９０，９４６、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１
９０，９９６およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１９１，２９９（これらの各々の開
示は、本明細書中に参考として援用される）の利益を主張する。参照はまた、弁
護士事件整理番号ＣＮＳ−００６およびＣＮＳ−００７（これらの各々の開示は
、本明細書中に参考として援用される）によって同定される、２００１年３月２
０日に出願された出願に対してなされる。

【０００２】（発明の分野）本発明は一般に、システイン−システインケモカインレセプター５（「ＣＣＲ
５」または「ＣＣケモカインレセプター５」）に関し、より詳細には、ＣＣケモ
カインレセプター５についての結合化合物に関する。本発明の方法は、ＣＣケモ
カインレセプター５についての治療的結合化合物を同定および調製することによ
る疾患の処置に有用である。

【０００３】（発明の背景）ケモカイン（化学誘引物質サイトカイン）は、血球の特定の型の遊走および活
性化を誘導する能力を共有する約７０〜１１０アミノ酸の構造的に関連した分泌
タンパク質のファミリーを含む。ＰｒｏｏｓｔＰ．ら（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｒｓｅ．２６：２１１−２２３；Ｐｒｅｍａｃｋら（１９
９６）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２：１１７４−１１７８；Ｙｏｓｈｉ
ｅら（１９９７）Ｊ．ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢｉｏｌ．６２：６３４−６４４を
参照のこと。３０を超える異なるヒトケモカインが、現在までに記載されている
。これらのヒトケモカインは、主に、白血球の活性化および補充を担うが、これ
らは、異なる白血球型（好中球、単球、好酸球、好塩基球、リンパ球、樹状細胞
など）に対するこれらの特異性、およびケモカインが合成される細胞および組織
の型において変化する。このファミリーのタンパク質のさらなる分析は、これが
、２つのさらなるサブファミリーのタンパク質に分けられ得ることを示した。こ
れらは、ＣＸＣまたはα−ケモカインと命名され、そしてタンパク質のアミノ末
端の近くの２つの保存されたシステイン残基の間隔に基づいて、ＣＣまたはβケ
モカインと命名されている。

【０００４】ケモカインは、代表的に、組織損傷またはストレスの部位で生成され、ここで
、これらは、白血球の組織への浸潤を促進し、そして炎症反応を容易にする。い
くつかのケモカインは、Ｔ細胞またはＢリンパ球のサブセットまたは抗原提示細
胞のような免疫系細胞に選択的に作用し、そしてそれにより、抗原に対する免疫
応答を促進し得る。さらに、いくつかのケモカインは、特定の白血球型に正常に
分化する造血前駆細胞および造血幹細胞の増殖または遊走を調節する能力を有し
、それにより、血液における白血球数を調節する。

【０００５】ケモカインの活性は、７回膜貫通（「７ＴＭ」）Ｇタンパク質結合レセプター
（「ＧＰＣＲ」）のファミリーのメンバーである細胞表面レセプターによって媒
介される。ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、Ｃ
ＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、およびＣＸＣＲ４を
含む、少なくとも１２の異なるヒトケモカインレセプターが知られている。これ
らのレセプターは、特定のケモカインについてのそれらの特異性において変化す
る。いくつかのレセプターは、単一の公知のケモカインに結合するが、他方は、
複数のケモカインに結合する。ケモカインのそのレセプターへの結合は、代表的
に、細胞質のカルシウム濃度の一過的な上昇のような細胞内シグナル伝達応答を
誘導し、この後、走化性のような細胞性生物学的応答が続く。さらに、いくつか
のケモカインレセプター（例えば、ＣＣＲ５）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）の補助レセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として役立ち、その結果、こ
れらのレセプターは、ＨＩＶおよび細胞性ＣＤ４レセプターと相互作用し、細胞
へのウイルス侵入を容易にする。

【０００６】ケモカインは、医療において重要である。なぜなら、これらは、以下を含むが
これらに限定されない多数の疾患状態において白血球の移動および生物学的活性
を調節するためである：アレルギー性障害、自己免疫疾患、虚血／再灌流傷害、
アテローム動脈硬化症斑、癌（化学療法における使用のための造血幹細胞の動員
または化学療法の間の骨髄保護（ｍｙｅｌｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を含む）、
慢性炎症性障害、移植器官または組織移植片の慢性拒絶、慢性骨髄性白血病、お
よびＨＩＶおよび他の病原体による感染。さらに、特にＣＣＲ５は、多発性硬化
症および慢性関節リウマチのような疾患に関与している。例えば、Ｂａｌａｓｈ
ｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９６：６８７３−
６８７８（１９９９）；およびＭａｃｋら、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．
４２（５）：９８１−８（１９９９）を参照のこと。

【０００７】ケモカインレセプターのアンタゴニストは、過剰の炎症および免疫系応答を減
少させることによって、これらの疾患の多数において有益であり得る。ＨＩＶ感
染の場合において、ＨＩＶ補助レセプターに結合するケモカインおよびアンタゴ
ニストは、細胞へのウイルス侵入を阻害する際に有用性を有し得る。ＨＩＶは、
後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）を引き起こし、これは、米国および世界
中で主要な死因のうちの１つである。疾病管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ
ＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ）によると、世界中の少なくとも３０６０万
人の人々が、ＨＩＶに感染している。ＨＩＶは、免疫系を攻撃し、そして種々の
生命を脅かす病気に対して体を脆弱にする。十分に機能する免疫系を有する人々
においては疾患を引き起こさない普通の細菌、酵母、およびウイルスは、しばし
ば、ＨＩＶに感染した人々においてこれらの病気を引き起こす。

【０００８】ＨＩＶに感染した全ての患者が、ＡＩＤＳを有するというわけではない。代表
的には、ＨＩＶに感染した患者は、ＨＩＶが、患者の免疫系を損傷するので、ゆ
っくりとＡＩＤＳを発症する。免疫系損傷の重篤度は、ＣＤ４^＋リンパ球の絶対
計数によって測定される；２００細胞／μｌ未満の計数を有する患者は、ＡＩＤ
Ｓを有すると考えられる。ＣＤ４タンパク質は、約６０，０００の分子量の糖タ
ンパク質であり、そして成熟した胸腺由来の（Ｔ）リンパ球の細胞膜において発
現され、そしてより少ない程度に、単球／マクロファージ系統の細胞において発
現される。代表的には、ＣＤ４細胞は、Ｂ細胞へ活性化シグナルを提供すること
によって、細胞傷害性／サプレッサー細胞になる相互ＣＤ８マーカーを保有する
Ｔリンパ球を誘導することによって、および／または主要組織適合複合体（ＭＨ
Ｃ）クラスＩＩ分子を保有する標的と相互作用することによって、機能するよう
である。

【０００９】ＨＩＶおよびＡＩＤＳのための予防剤または治療剤の検索は、この疫病が世界
中に増殖したので、特に激しい。研究によって、細胞に侵入するＨＩＶの能力は
、ｅｎｖ遺伝子によってコードされるＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の、ＣＤ
４レセプターへの結合を必要とすることが発見された。これらの糖タンパク質は
、ｅｎｖ遺伝子によってコードされ、そして前駆体ｇｐ１６０（これは、引き続
き、ｇｐ１２０およびｇｐ４１に切断される）として翻訳される。ｇｐ１２０は
、感受性の標的細胞の表面に存在するＣＤ４タンパク質に結合し、細胞膜とウイ
ルスの融合を生じ、そしてウイルスの宿主への侵入を容易にする。ＨＩＶ感染宿
主細胞の表面でのｅｎｖの最終的な発現は、この細胞が、感染されていないＣＤ
４^＋細胞と融合することを可能にし、これによりウイルスが蔓延する。しかし、
ＨＩＶとの感染に応答して、宿主免疫系は、ｇｐ１２０の種々の抗原性部位（す
なわち、決定基）に対して標的化された抗体を産生する。これらの抗体のいくつ
かは、中和効果を有し、そしてＨＩＶ感染性を阻害する。この中和効果は、ＨＩ
Ｖの細胞接着を阻害するこの抗体の能力に起因すると考えられている。この効果
はまた、最初のセロコンバージョンと臨床的症状の発症との間のかなり長い潜伏
期間を部分的に説明し得ると考えられている。

【００１０】最近の研究によって、ＨＩＶ融合プロセスが、内因的にヒトＣＤ４を発現する
かまたはヒトＣＤ４を発現するように操作されたかのいずれかの広範なヒト細胞
型と共に生じることが示された。しかし、この融合プロセスは、ヒトＣＤ４を発
現するように操作された非ヒト細胞型と共には生じない。このような非ヒト細胞
はなお、ｅｎｖを結合し得るが、膜融合は伴わない。ヒト細胞型と非ヒト細胞型
との間の相違は明らかに存在し、これは、膜融合が、ヒトＣＤ４およびヒト細胞
型に特異的な補助レセプターの同時発現を必要とするためである。これらは、こ
の補助レセプター補助因子を欠くので、ヒトＣＤ４のみを発現するように操作さ
れた非ヒト細胞型は、膜融合し得ず、従って、ＨＩＶ感染を許容しない。さらに
、いくつかのヒト細胞株におけるＣＤ４の発現は、ＨＩＶ−１感染に対する耐性
を与えるのに不十分であった。さらに、いくつかのＨＩＶ−１株は、Ｔ細胞向性
（Ｔ向性）であり、他は、マクロファージ向性（Ｍ向性）であったが、両方の細
胞は、ＣＤ４抗原を保有した。さらなる研究によって、特定のケモカインが、Ｍ
向性の感染性をブロックし得るが、Ｔ向性ＨＩＶ株の感染性はブロックし得ない
ことが示された。その後、特定のレセプターが、Ｔ向性株の活性のために必要で
あることが示された。例えば、ＨｏｒｕｋＲ．，ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ
２０（２）：８９−９４（１９９９）；ＤｏｍｓＲＷ，ＰｅｉｐｅｒＳＣ
．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３５（２）：１７９−９０（１９９７）；Ｗａｒｄ
ＳＧ，ＢａｃｏｎＫ，ＷｅｓｔｗｉｃｋＪ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ９（１）
：１−１１（１９９８）；ＢｅｒｓｏｎＪＦ，ＤｏｍｓＲＷ．，Ｓｅｍｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌ１０（３）：２３７−４８（１９９８）を参照のこと。

【００１１】ＨＩＶは、ＣＣＲ５を細胞侵入のための補助レセプターをして使用することが
実証されているが、そのネイティブなコンホメーションのために脂質との複雑な
相互作用を必要とするような７ＴＭタンパク質を結晶化させる際の困難性のため
に、研究者らが、ＣＣＲ５の高解像度のＸ線結晶構造を得ることは困難であった
。脂質との相互作用の必要性はまた、ＧＰＣＲのような生物学的に活性な形態の
調製を困難にする。なぜなら、これらの脂質の非存在下において、これらは、可
溶化の間に生物学的に活性なコンホメーションを保存するように多大な注意が払
わなければ、リガンドを特異的に結合するための最小能力を有するかまたは能力
を有さずに変性凝集体を容易に形成するためである。Ｘ線構造の非存在下で、種
々のアプローチを使用して、ｇｐ１２０結合およびウイルス取り込みに関与する
ＣＣＲ５の領域を規定する。これらのアプローチは、一般に、結果を、非ヒトホ
モログ、キメラレセプター、およびＣＣＲ５の補助レセプター活性についての構
造必要条件を研究するための点変異と比較する工程を包含する。ＣＣＲ５結合に
最も重要な残基は、１０アミノ酸からの側鎖接触と共に間隙を形成すると考えら
れている。重要な残基は、アミノ酸の２つの短い配列に関連している：残基４１
９〜４２２および残基４３７〜４４４。図４を参照のこと。ＣＣＲ５（３５２ア
ミノ酸タンパク質）は、７つの推定膜貫通（「ＴＭ」）セグメント（推定で、Ｔ
Ｍ１＝残基３２〜５６、ＴＭ２＝６７〜８８、ＴＭ３＝１０３〜１２４、ＴＭ４
＝１４４〜１６７、ＴＭ５＝１９８〜２２０、ＴＭ６＝２３６〜２５７、および
ＴＭ７＝２８１〜３０１）、細胞外Ｎ末端、膜貫通セグメントを連結する３つの
細胞外ループおよび３つの細胞内ループ、ならびに細胞内Ｃ末端を有する。Ｍ向
性ウイルスは、ＣＣＲ５の細胞外ドメイン（最も重要な第２のループを有する）
の残基と相互作用すると考えられている。Ｎ末端ドメインにおける変化は、Ｍ向
性ウイルスに十分に許容性であり、ループ１〜３における残基との相互作用が侵
入に十分であることを示唆する。例えば、ＤｏｍｓＲＷ，ＰｅｉｐｅｒＳＣ
．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３５（２）：１７９−９０（１９９７）を参照のこと
。

【００１２】ＣＣＲ５遺伝子においてホモ接合性の３２塩基対欠失を有する個体は、健康で
あり、そしてＨＩＶ感染に対して高度に耐性であることが示されている。例えば
、ＤｏｍｓＲＷら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３５（２）：１７９−９０（１９９
７）（ＣＣＲ５の喪失は、一般に健康を害さないことを示唆する）を参照のこと
。その欠失に対してホモ接合性である患者は、この疾患のゆっくりとした進行を
有する。例えば、ＭｏｏｒｅＪＰ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６（５３０９）：５
１−２（１９９７）を参照のこと。

【００１３】ＣＣＲ５のいくつかのインヒビターが報告されている。ＴＡＫ７７９は、ＲＡ
ＮＴＥＳ（活性化の際に調節され、正常なＴ細胞によって発現および分泌される
）のＣＣＲ５発現チャイニーズハムスター卵巣細胞への結合と拮抗し、ＣＣＲ５
媒介Ｃａ^２＋シグナル伝達をナノモル濃度で阻害した。ＴＡＫ−７７９によるＣ
Ｃケモカインレセプターの阻害は、ＣＣＲ５に特異的であるようである。ＴＡＫ
−７７９は、細胞傷害性を示すことなく、Ｒ５ＨＩＶ−１複製の高度に強力か
つ選択的な阻害を示す。この化合物は、Ｒ５ＨＩＶ−１の臨床分離株ならびに
研究室株の複製を、末梢血単核細胞において１．６〜３．７ｎＭの濃度で阻害す
るようであるが、Ｔ細胞株向性ＨＩＶ−１に対しては不活性であった。例えば、
ＢａｂａＭら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６（
１０）：５６９８−７０３（１９９９）を参照のこと。

【００１４】アミノオキシペンタン（ＡＯＰ）−ＲＡＮＴＥＳ［２−６８］は、ケモカイン
ＲＮＡＴＥＳの化学的に改変された形態である。（ＡＯＰ）−ＲＡＮＴＥＳは、
走化性を誘導せず、そして単球におけるＣＣＲ５機能のナノモル以下のアンタゴ
ニストである。これは、Ｍ向性ＨＩＶ−１株によるマクロファージの感染を強力
に阻害する。従って、ケモカインによる細胞の活性化は、ウイルスの取り込みお
よび複製の阻害のための必須条件ではない。例えば、ＳｉｍｍｏｎｓＧら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２７６（５３１０）：２７６−９（１９９７）を参照のこと。よ
り最近では、別の化学的に改変されたＲＡＮＴＲＳが、より強力であると記載さ
れている：（ＮＮＹ）−ＲＡＮＴＲＳ［２−６８］。例えば、ＨｏｗａｒｄＯ
Ｍら、ＪＭｅｄＣｈｅｍ４１（１３）：２１８７−９３（１９９８）を参
照のこと。

【００１５】さらに以前の研究は、ＨＩＶの細胞への侵入をインビトロでブロックすること
が以上に報告されているジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）の一連のウレ
イドアナログを、ケモカインアンタゴニスト活性について評価した。ジスタマイ
シンアナログの１つ（ＮＳＣ６５１０１６）は、合胞体形成および細胞融合を
阻害する。例えば、ＨｏｗａｒｄＯＭら、ＪＭｅｄＣｈｅｍ４１（１３
）：２１８４−９３（１９９８）を参照のこと。

【００１６】ＣＣＲ５の以前のインヒビターの制限の結果として、効果的なＨＩＶ予防剤お
よび治療剤、ならびにその候補を同定するための方法の必要性がなお残ったまま
である。ＨＩＶは、ＣＣＲ５をその天然リガンドによってブロックされ得る細胞
侵入のための補助レセプターとして使用することが実証され、このことが、ＣＣ
Ｒ５に対する高親和性リガンドを重要な治療標的とする。一般に、ＧＰＣＲ（特
に、ＣＣＲ５）は、可溶化および精製するのが非常に困難である。なぜなら、こ
れらは、通常、折り畳まれ、そして細胞膜のネイティブな脂質の存在下で維持さ
れる必要があるためである。抗体を用いる簡単な発現および沈澱は、ネイティブ
なリガンドに特異的に結合する能力をほとんど有さないかまたは全く有さない変
性凝集体を通常生じる。従って、ＣＣＲ５結合化合物を同定する方法およびＡＩ
ＤＳのような疾患を予防または処置するＣＣＲ５結合治療剤を同定するための方
法の必要性が、当該分野において存在する。このような治療剤は、ＣＣＲ５への
天然リガンドの結合を阻害し得るペプチド、ペプチド模倣物、または低分子を含
み得る。このような方法および組成物が、本明細書中で提供される。

【００１７】（発明の要旨）本発明は、ＣＣＲ５に対する結合化合物およびこれらの結合化合物を同定する
方法を提供する。１つの実施形態において、ＣＣＲ５に対する結合モチーフの同
定、およびＣＣＲ５に対し結合し得るリガンドの同定のためのスクリーニング方
法が提供される。別の実施形態において、本発明は、ＨＩＶおよびＡＩＤＳの予
防または処置における使用に適切な、治療的ペプチド、ペプチド模倣物、または
低分子の設計および同定を含む。

【００１８】１つの実施形態において、本発明の方法は、ＣＣＲ５に対する結合モチーフの
スクリーニングおよび同定、ならびにこれらの潜在的なリガンドのスクリーニン
グに有用な、線状および環状ペプチドライブラリーの合成および精製を提供する
。本発明の方法は、非天然アミノ酸およびＤ配置のアミノ酸の、このようなライ
ブラリーにおける使用のための線状または環状ペプチドの取り込みを提供する。
このようなアミノ酸を有するペプチドを含むライブラリーは、タンパク質分解に
対する抵抗性から生じる、増強された結合親和性およびインビボにおける増強さ
れた作用の持続時間を実証する。

【００１９】好ましい実施形態において、本発明は、リードリガンド同定工程のための高度
に多様化したペプチドライブラリー（線状および環状、天然および非天然アミノ
酸）、ペプチド模倣物ライブラリー、および低分子化合物ライブラリーの使用を
提供する。このような、リガンドは、ＣＣＲ５結合活性に対して直接的または間
接的にアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。

【００２０】好ましい実施形態において、本発明は、予備的なモチーフ情報の同定のための
ファージディスプレイ法の使用を提供し、これには、精製されたレセプターの調
製物および本発明の高度に多様化したライブラリーを用いたアフィニティー精製
のさらなる回が続く。特に好ましい実施形態において、ファージディスプレイ技
術は、環状ペプチドライブラリーおよび／またはペプチド模倣物ライブラリーの
使用と併用される。

【００２１】本発明の別の実施形態において、コンピュータに支援された設計技術を用いて
、ＣＣＲ５活性に関するアゴニストまたはアンタゴニスト潜在性について、リー
ド化合物を実質的にスクリーニング、同定、設計、または確認する。このような
技術は、仮想的にタンパク質を結合パートナーと整列させることによるＣＣＲ５
および潜在的結合パートナーの両方の分子的および構造的情報に基づく、コンピ
ュータが産生する、３次元画像を使用する。コンピュータに支援されたスクリー
ニングのために設計されたライブラリーの場合、リードの最適化に必要な大量の
情報は、ライブラリーの設計から直接得られる。１つの実施形態において、潜在
的なリードは、実際のライブラリーの事前のスクリーニングまたはいくつかの他
の手段を介して同定される。本発明の１つの実施形態は、構造に基づく合理的な
薬物設計に依存する生物学的に適切な薬物のスクリーニングを含む。この場合、
タンパク質（または、同様のファミリーメンバー）、ペプチド、または分子の３
次元構造が、決定され、そして潜在的なアゴニストおよび／またはアンタゴニス
トは、コンピュータモデリングの支援を用いて設計される。本発明の好ましい実
施形態において、適切な薬物が同定された後、この薬物は、ＣＣＲ５に接触され
、ここで潜在的薬物とＣＣＲ５の間で結合複合体が形成される。ＣＣＲ５に薬物
を接触させる方法は、薬物開発における当業者に一般に理解される。

【００２２】別の実施形態において、本発明は、部分的に精製されたＣＣＲ５レセプタータ
ンパク質の、治療的に有用な化合物の同定において密に結合するリガンドの選択
、同定、および改良を実施するための因子としての使用を提供する。好ましい実
施形態において、本発明は、修飾されたＣＣＲ５レセプタータンパク質を生成す
るための標識方法の使用を含み、このタンパク質は、スクリーニング方法に関与
する精製工程および同定工程を容易にする。別の実施形態において、本発明は、
ベクター中に操作された適切な特異的プロテアーゼ部位を有する標識配列（すな
わち、ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓ、２重標識されたＦＬＡＧ−ＧＳＴ、Ｃ−
ＭＹＣ、ＭＢＰ、Ｖ５、Ｘｐｒｅｓｓ、ＣＢＰ、ＨＡ）に融合されたレセプター
ＣＣＲ５に対応する核酸配列を含む。

【００２３】特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＣＣＲ５の可溶化および固
定化を提供し、本明細書において提供されるリガンド選択方法を容易にする。Ｃ
ＣＲ５は、任意の供給源（例えば、細胞膜調製物および細胞全体の調製物）に由
来し得る。１つの実施形態において、本発明は、バキュロウイルス発現系または
任意の他の適切な発現系由来の膜を用いて、一般的な親和性判定について、コン
ビナトリアルライブラリーを直接スクリーニングする方法を提供する。本発明の
１つの実施形態において、部分的に精製されたＣＣＲ５は、密な結合リガンドの
選択、同定、および改良の実施に用いられる。特に好ましい実施形態において、
部分的に精製された標識化ＣＣＲ５は、隔離された形態で使用され、多様化した
ライブラリー（集中または高度な多様化）を密に結合するリガンドのアフィニテ
ィー精製のためにスクリーニングする。本発明の非常に好ましい実施形態におい
て、適切なリガンドの可溶化および固定化についての条件は、低い塩（例えば、
低マグネシウム濃度または低カルシウム濃度）；および塩化ナトリウム（「Ｎａ
Ｃｌ」なし）（０．０ｎＭＮａＣｌ）での使用を提供する。

【００２４】別の実施形態において、本発明は、Ｎ末端が特異的にブロックされたペプチド
または配列決定し得ない他のアナログを有する固定されたタンパク質から、ライ
ブラリーの結合成分を溶出する工程を含む。なお別の実施形態において、本発明
は、コンビナトリアルライブラリーを樹脂固定化タンパク質に結合する工程を含
む。別の実施形態において、本発明は、標識化配列を有する精製ポリペプチドを
含み、このポリペプチドは、アッセイのために適切な親和性樹脂上に固定化され
得る。さらなる実施形態は、Ｎ末端が特異的にブロックされたペプチドまたは配
列決定し得ない他のアナログを伴う結合ライブラリー標識化されたタンパク質を
放出または溶出する工程を含む。なお別の実施形態において、本発明の方法は、
親和性樹脂上に固定化された後およびコンビナトリアルライブラリーが複合体を
放出するために結合された後、目的のタンパク質から標識を、（タンパク質／ベ
クター内で設計されるような）特異的なプロテアーゼを用いて、切断する工程を
含む。

【００２５】なお別の実施形態において、標的リガンドは、線状ペプチドのライブラリー、
ペプチド模倣物のライブラリー、環状ペプチドのライブラリー、またはファージ
ディスプレイ技術によって同定された最初のモチーフを用いて開発された重点ラ
イブラリー（ｆｏｃｕｓｅｄｌｉｂｒａｒｙ）あるいは上記のいずれかを組合
わせたライブラリーから選択される。別の実施形態において、標的リガンドは、
ペプチドもしくは他のリガンドを用いてか、またはｐＨ変化もしくはカオトロピ
ックな因子（例えば、尿素または塩酸グアニジン）（これらは、水の水素結合構
造および疎水性の影響を減少することによって濃縮された溶液中の変性タンパク
質を崩壊し得る）を用いることによって、レセプター調製物から溶出される。本
明細書中に開示される方法を用いて同定されたＣＣＲ５に対するリガンドがまた
、本発明によって意図される。本発明のなお別の実施形態において、タンパク質
配列決定技術が、アフィニティー精製工程によって同定されるリガンドの構造決
定のために使用される。

【００２６】別の実施形態において、本発明は、例えば、疾患または障害（例えば、ＨＩＶ
感染またはＡＩＤＳなど）の処置に適切な、本発明の方法を用いて同定されたＣ
ＣＲ５結合の低分子アンタゴニストのような治療剤を含む。別の実施形態におい
て、ＨＩＶに感染した患者は、本発明の方法を用いて同定された化合物またはＣ
ＣＲ５結合の低分子アンタゴニストを含む治療剤を用いて処置される。別の実施
形態において、ＨＩＶに感染した患者は、治療剤（例えば、ＣＣＲ５インヒビタ
ー、逆転写酵素プロテアーゼインヒビター、および他の抗ＨＩＶ治療剤を含む）
の併用した使用を通して処置される。

【００２７】本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明が、以下に提供される。本発明
の他の実施形態が、続く詳細な説明を再考に基づいて明らかである。

【００２８】（発明の詳細な説明）一般的に、本発明の方法は、ＣＣＲ５の結合モチーフの同定を提供する。さら
に、本発明の方法は、ＣＣＲ５とその天然のリガンドとの相互作用の、アゴニス
トまたはアンタゴニストの同定を提供し、それによって、治療リード化合物の同
定を提供する。本発明において特に有用である、ライブラリー設計のための方法
およびライブラリー合成のための方法、ならびにライブラリーのスクリーニング
のための方法が、以下の特許および特許出願に記載され、これらの各々の開示は
、本明細書中に参考として援用される：Ｃａｎｔｌｅｙら、米国特許第５，５３
２，１６７号；Ｃａｎｔｌｅｙら、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／３６９，６４３（１
９９８年１２月１７日出願）；Ｃａｎｔｌｅｙら、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４３
８，６７３（１９９９年１１月１２日出願）；Ｈｕｎｇ−Ｓｅｎら、Ｕ．Ｓ．Ｓ
．Ｎ．０９／０８６，３７１（１９９８年５月２８日出願）；Ｈｕｎｇ−Ｓｅｎ
ら、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８６４，３９２（１９９９年６月２４日出願）；な
らびにＬａｉら、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３８７，５９０（１９９９年８月３１
日出願）。

【００２９】本発明の方法に従って、ＣＣＲ５は、クローン化され、そして発現され、そし
て活性について試験される。ＣＣＲ５は、ＣＣＲ５のリガンド結合特性の特徴の
決定を容易にするために、Ｃ末端上またはＮ末端上に標識され得る。例示的な標
識としては、６×Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ、Ｖ５、Ｘｐｒｅｓｓ、ｃ−ｍｙｃ
、ＨＡ、ＣＢＤ、およびＭＢＰが挙げられるが、これらに限定されない。標識さ
れたＣＣＲ５は、例えば、天然および／もしくは非天然の、アミノ酸、ペプチド
模倣物および／もしくは低分子を有する、線状のペプチドならびに／または環状
ペプチドを含むライブラリーのスクリーニングにおいて使用される。このような
ペプチド模倣物および低分子は、任意の天然または合成の、化合物、組成物、化
学物質、タンパク質、またはＣＣＲ５の結合化合物に関するスクリーニングに使
用される上記のいずれかの任意の組み合わせもしくはＣＣＲ５の結合化合物に関
するスクリーニングに使用される上記のいずれかの任意の改変を含み得る。

【００３０】１つの局面において、本発明の方法において有用な配向された変性ペプチドラ
イブラリー方法は、リガンド結合について重要であることが知られているかもし
くは疑われる非変性位置中の１つ以上のアミノ酸、ならびに変性位置におけるお
およそ等しい割合の１８アミノ酸からなる可溶性ペプチドライブラリーを使用す
る。システインおよびトリプトファンは、配列決定に対する特定の分析的な困難
性を回避するために削除され得る。このようなライブラリーは、図２に示され、
ここで、Ｘは、任意の１８アミノ酸からなる変性位置を表し、そしてリジンもし
くはアルギニンは、非変性位置に固定されている。さらに、配向された残基とし
てのアルギニンもしくはリジンの選択は、ｇｐ１２０の塩基性残基がＣＣＲ５に
対する結合において重要な決定基であるという事実に基づく。本発明の別の局面
は、配向された残基としての任意のアミノ酸の選択を含む。さらに、さらなる残
基が、図２に示される配列のＮ末端に付加され得る。なぜなら、最初および第２
の配列決定サイクルにおいて妨害物質がしばしば存在するからである。さらなる
残基が、Ｃ末端に付加され得、配列決定カートリッジ中のフィルターへこのポリ
ペプチドを良好に固着するためのアミノ酸を提供する。

【００３１】本発明の別の局面は、続く同定工程のために、ペプチド（直鎖状アミノ酸およ
び環状アミノ酸、天然アミノ酸および非天然アミノ酸）、ペプチド模倣物、なら
びに低分子化合物の非常に多様なライブラリーの使用を提供する。例えば、これ
らのリガンドは、レセプターに対するこの機能において、反発的であるかまたは
拮抗的であり得る。一般に、本発明は、治療的に有用な化合物の経路として密接
に結合したリガンドの選択、同定、および改良を実行するための因子として、部
分的に精製されたＣＣＲ５を使用する。さらに、本発明は、本明細書中で提供さ
れる効率的なリガンド選択方法を容易にする、可溶化手順および固定化手順の開
発ならびに使用を提供する。詳細には、効率的なリガンド選択について可溶化お
よび固定化するための最適な条件は、低塩（例えば、マグネシウムもしくはカル
シウム濃度が低いかまたは存在せず、そしてＮａＣｌ濃度が存在しない（０．０
ｎＭＮａＣｌ）の使用を包含する。例えば、不活性な沈殿タンパク質、細胞膜
調製物および全細胞調製物を使用するリガンド選択方法が、さらに本明細書中に
提供される。

【００３２】本発明の１つの局面において、スクリーニング工程は、ファージディスプレイ
技術を包含し得る。このようなファージディスプレイシステムは、選択された標
的分子に結合するペプチドライブラリーをスクリーニングするため、および所望
の特性についてこれらのタンパク質をスクリーニングするための可能性を有する
機能的タンパク質を提示するために、使用されてきた。このディスプレイアプロ
ーチのより最近の改良は、バクテリオファージ表面上に酵素ならびに抗体フラグ
メントを発現することを可能にし、従って、特定のリガンドで選択することによ
って特定の特性の選択を可能にする。例えば、ＳｍｉｔｈＳＦら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓＥｎｚｙｍ．２１７：２２８〜２５７（１９９３）を参照のこと。ファー
ジディスプレイ方法は、予備モチーフの情報の同定のために使用され、そして続
いて、本発明の精製されたレセプター調製物および非常に多様なライブラリー（
特に、環状ペプチドおよびペプチド模倣物ライブラリー）を用いる親和性精製の
さらなる回転のために使用され得る。このファージディスプレイ方法は、天然の
アミノ酸のモチーフを同定することを可能にする。ファージディスプレイに由来
する情報は、例えば、増強された薬学的特性を有するリガンドを選択するために
、新規なアミノ酸アナログまたは環状ペプチドを含む合成ライブラリーを使用す
る親和性精製方法中に取り入れられ得る。初期ライブラリー、二次ライブラリー
および三次ライブラリーの使用は、結合部位の特異性の定義をより完全にする。
初期ライブラリーからの情報を組み込む二次ライブラリーが、配列決定され得る
。初期ライブラリーにおいて、いくつかの変性位置が、特定のアミノ酸について
高い性能をもたらし得、そしてこれらは、第２のライブラリーにおいて好ましい
アミノ酸からなる非変性位置になり得る。例えば、ＷｕＲ、ＪＢｉｏｌＣ
ｈｅｍ２７１（２７）：１５９３４〜４１（１９９６）を参照のこと。

【００３３】あるいは、またはさらに、コンピューター補助設計技術が、ペプチド、ペプチ
ド模倣物および低分子のスクリーニングならびに／または設計において使用され
得る。例えば、ＣＣＲ５配列、膜貫通予測、および変異形成研究から得られた任
意の構造情報に加えて、ロドプシンの結晶構造（例えば、Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９（５４８０）：７３９〜７４５（２０００）を参照
のこと）のような情報と共に、コンピューター補助設計技術は、実質的に、その
ＣＣＲ５活性に関して潜在的な化合物をスクリーニング、同定、設計および検査
し得る。適切なペプチド、ペプチド模倣物および低分子の設計において補助する
ために使用され得るコンピュータープログラムとしては、例えば、Ｄｏｃｋ、Ｆ
ｒｏｄｏおよびＩｎｓｉｇｈｔが挙げられる。生物学的に適切な薬物のスクリー
ニングについての方法の例は、合理的な薬物設計に基づく構造に依存する。この
ような場合、このタンパク質、ペプチドまたは分子の三次元構造は、決定され（
または密接なファミリーメンバーの後にモデリングされ）、そして可能性のある
アゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、コンピューターモデリングを用
いて設計される。例えば、Ｂｕｔｔら、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａ
ｎ，１２月号９２〜９８（１９９３）；Ｗｅｓｔら、ＴＩＰＳ，１６：６７〜
７４（１９９５）；Ｄｕｎｂｒａｃｋら、Ｆｏｌｄｉｎｇ＆Ｄｅｓｉｇｎ，２：
２７〜４２（１９９７）を参照のこと。適切な薬物が同定された後、この薬物は
ＣＣＲ５と接触し、ここで、結合複合体は、可能性のある薬物とＣＣＲ５との間
に形成される。ＣＣＲ５への薬物の接触方法は、薬物開発分野の当業者によって
一般に理解される。

【００３４】スクリーニング工程は、液相において実行されても良いし、またはアフィニテ
ィカラム上で固定されているＣＣＲ５を用いて実行されても良い。親和性樹脂を
使用する標識化ＣＣＲ５の固定化に加えて、配列決定の他の形態は、ライブラリ
ーからの選択リガンドの親和性精製を実行するために使用され得る。この形態と
しては、以下の例が挙げられるがこれらに限定されない。このレセプターおよび
結合ライブラリー成分は、平衡透析を使用して、非結合ライブラリー成分から分
離され得る。この標識化レセプターは、特定の親和性膜に結合され得、これはプ
レートの形態であるか、または別々である。次いで、このライブラリーは、この
膜と共にインキュベートされ得、そして容易に洗浄して、非特異的結合成分を除
去し得る。サイズ排除方法論が、ライブラリーとのレセプターのプレインキュー
ベーションの後に、非結合成分から精製レセプター結合ライブラリー複合体を分
離するために使用され得る。さらに、レセプターを含むミセル複合体（これは、
脂質ならびに界面活性剤を取り込んでも良いし、取り込まなくても良い）は、選
択親和性成分の結合後に、差次的遠心分離によってライブラリーから分離され得
る。一般に、高親和性リガンドは、低ｐＨまたは高塩濃度を使用して放出され得
、そして本明細書中に記載される配列決定によって構造が同定される。

【００３５】標的レセプターに対する最も高い親和性を有するこれらのリガンドを決定する
目的で、一般に、２００よりも多くのペプチドライブラリーが、それぞれのライ
ブラリーのそれぞれの阻害結合を決定するためにスクリーニングされた。一般に
、１００μＭで、１０％より高い阻害は、親和性精製を介する配列の連続する評
価のために有意であった。本発明のさらなる局面において、一旦、好ましいアミ
ノ酸残基が、高い優先値（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｖａｌｕｅ）に起因してライ
ブラリーの変性位置でＣＣＲ５によって同定されると、特定のペプチドは、ライ
ブラリー合成のために使用されるのと同じ方法によって合成される。本発明の１
つの実施例において、高優先値は、１よりも大きい。この値は、サンプルの値か
らコントロールの値を引き、そして参照値で割ることによって決定される。本発
明の好ましい実施形態において、この優先値は、１．２よりも大きい。本発明の
より好ましい実施形態において、優先値は、２よりも大きい。同定されたペプチ
ド配列の合成の後、このペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰ
ＬＣ」）によって精製され、そして組成は、マトリックス支援レーザー脱離イオ
ン化飛行時間型質量分析計（「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ」）およびＥｄｍａｎ
配列決定によって確認される。一般に、相対的親和性は、レセプター精製におい
て使用される放射標識結合アッセイを改変することによって測定され得る。

【００３６】親和性精製ペプチドから得られたモチーフの特異性を増強するために、他の方
法が使用され得る。このライブラリーの結合成分は、特定のＮ末端ブロックペプ
チドまたは他の配列決定不可能なアナログを用いて固定化されたタンパク質から
溶出され得る。ライブラリーの結合の後に親和性樹脂からの微量の汚染物の放出
を避けるために、その結合ライブラリーで標識したＣＣＲ５の放出／溶出は、特
定のＮ末端ブロックペプチドまたは他の配列決定不可能なアナログを使用して、
達成され得る。これは、アセチル化ＦＬＡＧペプチドを使用して行なわれ、樹脂
からＣＣＲ５−ＦＬＡＧレセプターを溶出し得る。また、この結合ペプチドは、
Ｎ末端ブロックペプチドもしくはリガンド、または他の配列決定不可能なアナロ
グを使用して、例えば、（ＡＯＰ）−ＲＡＮＴＥＳを使用して直接的に溶出され
得る。あるいは、このＣＣＲ５由来の標識は、親和性樹脂上に固定化した後に、
そしてコンビナトリアルライブラリーが複合体から放出される後に、特異的プロ
テアーゼ（タンパク質／ベクター中に設計されるような；エンテロキナーゼまた
はトロンビンのいずれか）を使用して切断され得る。最後に、ライブラリーは、
単一アッセイかまたはアレイアッセイにおいて、（有意に少ないタンパク質を使
用して）レセプターに結合するライブラリーの能力について、例えば、Ｓｆ９細
胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）もしくはＨｉｇｈＦｉｖ
ｅ細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）（両方共Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから
入手）由来のＣＣＲ５−含有膜を使用する結合アッセイによってプレスクリーニ
ングされ得る。このスクリーニングは、ＣＣＲ５ならびに多くの直鎖状および環
状ライブラリーを使用して、結合についての天然のリガンドを阻害する際の、こ
れらのライブラリーの有効性を決定するために実行され得る。

【００３７】本発明の方法はさらに、ＡＩＤＳのような疾患を有する患者の処置のために適
切なＣＣＲ５活性に対して拮抗的である、ペプチド、ペプチド模倣物、および／
または低分子を含む治療剤の設計を包含する。ＣＣＲ５についての結合化合物な
らびに最適な合成の同定およびそれらの精製は、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染の有
効な処置を提供する。例えば、本発明の小さいペプチドリガンド結合化合物（環
状ペプチドリガンドおよび直鎖状ペプチドリガンドの両方）は、増大した結合親
和性および作用を有し、そしてタンパク質溶解に耐性である。増大した親和性お
よび作用を示す化合物としては、例えば、Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｓ−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｒ−Ｐ
−Ａ−Ｋ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ａ、Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｓ−Ｌ−Ｉ−Ｗ−Ｒ−Ｐ−Ａ
−Ｋ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｋ、およびシクロ（Ｍ−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｒ−Ｗ−Ｋ−Ｎ）が挙
げられる。アミノ酸およびペプチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉ
ｏｎｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２４７，９７７〜９８３（１９７２）の規定に従って省略され、
そして命名される。アミノ酸記号は、他に指示されない限り、Ｌ型配置を意味す
る。

【００３８】一般に、ウイルス取り込みのために重大であるｇｐ１２０の残基由来のアミノ
酸は、以下および米国特許第５，５３２，１６７（この開示は本明細書中で参考
として援用される）に記載される志向性（ｏｒｉｅｎｔｅｄ）ペプチドライブラ
リー方法において使用するためのペプチドライブラリーにおいて、固定化された
位置か、または非変性位置を特定するために使用され得る。例えば、Ｒｉｚｚｕ
ｔｏＣＤら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０（５３７１）：１９４９〜５３（１９９
８）を参照のこと。また図１を参照のこと。

【００３９】本発明の特定の実施形態は、以下の実施例において記載され、これらは限定を
意味するものではない。

【００４０】（実施例）（実施例１：標識化ＣＣＲ５の調製；直鎖状ペプチドライブラリーのスクリー
ニング）種々のＣＣＲ５ベクターを、レセプターの精製をより容易にする当業者に公知
な標準的技術を使用して、エピトープ標識を含むバキュロウイルス発現系のため
に調製した。標識は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端で組み込まれ得る。ＣＣ
Ｒ５について、標識は、このレセプターのＣ末端で組み込まれ、レセプターのリ
ガンド結合特性（これはこの分子のＮ末端または細胞外領域にある）の特徴を決
定する。Ｃ末端６×Ｈｉｓタグ構築物およびＣ末端ＦＬＡＧ構築物の構築は、
実施例として以下で提供される。代替の標識としては、例えば、ＧＳＴ、Ｖ５、
Ｘｐｒｅｓｓ、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ、ＣＢＤおよびＭＢＰが挙げられ得る。これら
の構築物を、当業者に公知の標準的な技術を使用して、類似の手順によって作製
した。

【００４１】この６×Ｈｉｓタグは、ニッケルキレート化を使用して、一段階精製を可能に
する。ＣＣＲ５のためのｃＤＮＡは、ＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅ
ｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。Ｃ末端標識を作製するために、ＣＣＲ
５を市販のベクター（ｐｃＤＮＡ３）によって消化し、そしてＥ．ｃｏｌｉベク
ター（ｐＥＴ３０ａ）に、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを用いて連結した。次いで、こ
の新規に作製されたＣＣＲ５−６×Ｈｉｓタグを切除し、そしてｐＢｌｕｅＢａ
ｃ（バキュロウイルス転移ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ
，ＣＡ））に連結した。この構築物を、制限消化および配列決定の両方を使用し
て分析し、次いで、タンパク質発現分野の当業者によって代表的に行なわれるよ
うに、発現のためにＳｆ９昆虫細胞（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇ
ｏ，ＣＡ）にトランスフェクトした。

【００４２】Ｃ末端細菌ＦＬＡＧ構築物を、Ｓｉｇｍａから入手した（ｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ
）。標準的な技術を使用する同様のストラテジーを、このベクターの構築に使用
した。このＣＣＲ５をｐｃＤＮＡ３から切除し、同様に消化したｐＦＬＡＧ−Ｃ
ＴＣプラスミドを用いて連結し、次いでＣ末端ＦＬＡＧ標識を用いて切除し、そ
して消化したｐＢｌｕｅＢａｃベクター中に連結した。この構築物を、制限消化
および配列決定の両方を使用して分析し、そして発現のためにＳｆ９昆虫細胞ま
たはＨｉｇｈＦｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）昆虫細胞中にトラン
スフェクトした。

【００４３】Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞においてＣＣＲ５遺伝子を発現する
ために、ＣＣＲ５挿入物を含むｐＢｌｕｅＢａｃベクターを、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌ
ｕｅＤＮＡと共に、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションを用いて
標準的な技術を使用して同時トランスフェクトした。ＣＣＲ５を、相同組替えに
よってバキュロウイルスゲノム中に挿入した。細胞を、トランスフェクション後
２４時間から４〜５日までモニターした。約７２時間後、このトランスフェクシ
ョン上清を、標準的なプラークアッセイを使用して、組替えプラークについてア
ッセイした。組替えウイルスを有する細胞は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド）の存在下で増殖させた場合、青
いプラークを生成した。これらのプラークを精製し、そしてこの単離物を、標準
的技術を使用する組替えの正確さについて、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」
）によって確認した。これにより、高力価ストックを生成し、そして発現研究の
ために、感染をこのストックから標準的技術を使用して実行した。トランスフェ
クトについてのコントロールとしては、細胞のみおよび転移ベクターが挙げられ
る。

【００４４】Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を、当業者に公知である標準的技術
を使用して、接着培養物および懸濁培養物の両方として維持した。この接着細胞
を、コンフルエントになるまで増殖させ、そして１：５の比で、脱落技術（ｓｌ
ｏｕｇｈｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用して継代した。懸濁細胞を、（剪
断を最小にするために）０．１％のプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８
を有するスピナーフラスコ中で１×１０^６細胞／ｍｌの密度まで継代培養するこ
とによって２〜３ヶ月、維持した。

【００４５】組替えウイルスでの感染後の時間経過を使用して、標準的な技術を使用して発
現についての最適な増殖条件を決定した。スピナーフラスコからの細胞のアリコ
ートを、この時間経過ににわたって採取し、８００×ｇで１０分間４℃で遠心分
離し、そして上清とペレットの両方を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット
分析によってアッセイした。このＣＣＲ５を、膜分画（ペレット）中にあると予
測した。全ての実行可能な系を、発現のレベルについてこの様式でアッセイした
。活性について、ＭＩＰ−１α（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，
ＣＡ）および［^１２５Ｉ］−ＭＩＰ−１β（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌ
ｅａｒ，「ＮＥＮ」，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用する膜調製物に対する標準的
な結合アッセイを使用して、系をアッセイした。

【００４６】この膜分画を、最初に全Ｓｆ９細胞をペレット化し（８００×ｇ、１０分間４
℃）、次いでこのペレットを溶解緩衝液に均質化によって再懸濁することによっ
て単離した。代表的な溶解緩衝液は、中性ｐＨの付近であり、そしてプロテアー
ゼインヒビターのカクテルを含み、この両方は、当業者にとって標準的な技術で
ある。膜をペレット化した。可溶化をまた、変化するＮａＣｌ濃度を使用して行
った。従来の考えにも関わらず、低塩（例えば、低カルシウムおよび低マグネシ
ウム濃度）を使用する、実質的にＮａＣｌが存在しないこの可溶化の工程により
、量および活性について比較した場合、予期しなかった最適な可溶化条件が得ら
れた。０．０ｎＭのＮａＣｌを有することで、カウンター直感（ｃｏｕｎｔｅｒ
−ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ）であるが、ＣＣＲ５の結合特性を有する可溶化および固
定化候補の場合、最もよい条件を提供した。異なる界面活性剤（例えば、β−ド
テシルマルトシド、ｎ−オクチル−グルコシド、ＣＨＡＰＳ、デオキシコレート
、ＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、ジギトニン、両
性洗浄剤、ＣＹＭＡＬ、ラウロイルサルコシンなどのような）によるこのレセプ
ターの可溶化を、量および活性について比較した。単離のための候補を、以下に
記載するように精製を達成した。

【００４７】可溶化および活性のための適切な界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０）を決定し
た後、ＣＣＲ５を、膜分画から精製した。正確な精製スキームは、選択した構築
物に依存し、これは活性および可溶化の簡便さの問題である。６×ＨｉｓタグＣ
ＣＲ５の精製のために、膜分画をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｖａｌ
ｅｎｃｉａ，ＣＡ）上に界面活性剤の存在下でロードし、十分に洗浄し、そして
イミダゾールで溶出した。ＦＬＡＧ標識化ＣＣＲ５の精製を、抗ＦＬＡＧＭ２
親和性マトリクス（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、可溶化
について０．３％濃度のＮＰ−４０の存在下で、および固定化について０．１％
濃度のＮＰ−４０の存在下において実行し、そしてグリシンで溶出した。この精
製を、ＮＰ−４０の存在下で実行した。精製したレセプターの活性は、ＭＩＰ−
１αおよび［^１２５Ｉ］−ＭＩＰ−１βを使用する標準的な結合／置換アッセイ
を使用して評価した。

【００４８】ペプチドを、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル／ｔｅｒ．−ブチル（
「Ｆｍｏｃ」／「ｔＢｕ」）に基づく方法を介し、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍ４３３Ａ合成機を用いて、Ｒｉｎｋアミド樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈ
ｅｍ、置換レベル０／．５４ｍｍｏｌ／ｇ）上に取り付けた。ｔＢｕをＡｓｐ、
Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒの側鎖の保護のために使用し、ｔｅｒｔ．
−ブチルオキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）をＬｙｓおよびＴｒｐの側鎖の保護の
ために使用し、２，２，４，６、７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−
スルホニル（「Ｐｂｆ」）をＡｒｇの側鎖の保護のために使用し、そしてトリフ
ェニルメチル（「トリチル」，「Ｔｒｔ」）をＣｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｎおよびＧ
ｌｎの側鎖の保護のために使用した。合成のスケールを０．２０ｍｍｏｌとした
。この樹脂を、最初にＮ−メチルピロリジノン（「ＮＭＰ」）で洗浄し、その後
、ピペリジン：ＮＭＰ（１：４）の１×３分および１×７．６分の処置をＮα−
Ｆｍｏｃ除去のために行った。全てのＦｍｏｃ−アミノ酸を、以下の製造者のプ
ロコトルに従ってＮ−［（１Ｈ−ベンゾトリアゾ−ル−１−イル）（ジメチルア
ミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタナミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−
オキシド（Ｎ−［（１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｌｙ）（ｄｉｍｅｔ
ｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎａ
ｍｉｎｉｕｍｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅＮ−ｏｘｉｄｅ)（「
ＨＢＴＵ」）と結合した：（ａ）１．０ｍｍｏｌの誘導体化したアミノ酸を２．
１ｇのＮＭＰ中に溶解した；（ｂ）０．９ｍｍｏｌの、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド（「ＤＭＦ」）中で０．５ＭのＨＢＴＵをこのアミノ酸のカートリッジに
添加し、そしてこの溶液を６分間混ぜ合わせた；（ｃ）１．０ｍＬの２．０Ｍの
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（「ＤＩＥＡ」）を含有するＮＭＰをこの
カートリッジに添加した；（ｄ）ＨＢＴＵ溶液をこの樹脂に移し、混ぜ合わせる
間、気温で４０分間反応させた。この樹脂を濾過し、そして総体積９０ｍｌのＮ
ＭＰで６回リンスして、そしてこのサイクルを繰り返した。高度に縮重し指向さ
れたペプチドライブラリーを構築するためのこの１ポット法（ｏｎｅｐｏｔ
ｍｅｔｈｏｄ）において、樹脂のバッチを、この樹脂のどのような分割もなしに
、コンビナトリアルアミノ酸の混合物と反応させた。

【００４９】出発混合物中のアミノ酸濃度を調整することによって、相対的な結合速度を制
御し、これによってライブラリー中のアミノ酸の等しい取りこみを確実にする。
天然のＢｏｃ保護されたアミノ酸およびＦｍｏｃ保護されたアミノ酸の混合物の
１ポット合成に対しての最適化は、これまでに記載されてきた（例えば、米国特
許第５，２２５，５３３号；Ｉｖａｎｅｔｉｃｈら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａ
ｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７巻、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡＵＳＡ、２４７〜２６０頁（２６０）；Ｂｕｅｔｔｎｅｒら
、ＩｎｎｏｖａｔｉｏｎおよびＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｉｎＳｏｌｉｄＰ
ｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ，およびＮ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，ＭａｙｆｌｏｗｅｒＷｏｒｌｄｗｉｄｅＬｔｄ
．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ，１６９〜１７４頁（１９９４）；Ｏｓｔｒｅｓ
ｈら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，３４：１６８１〜９（１９９４）；Ｓｏｎｇｙ
ａｎｇら、ＭｅｔｈｏｄｉｎＭｏｌＢｉｏｌ８７：８７〜９８（１９９
８）；およびＨｅｒｍａｎら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉｖｅｒｓｉｔｙ２：
１４７〜１５５（１９９６）を参照）。開裂反応を、トリフルオロ酢酸（「ＴＦ
Ａ」）：Ｈ_２Ｏ：アニソール：トリプロピルシラン（「ｉＰ_３ＳｉＨ」）（８７
．５：５：５：２．５，約６ｍＬ）中のペプチジル樹脂を、３時間、２５℃（Ｈ
ｅｒｍａｎら、１９９６を参照）で攪拌することにより実施した。濾液を回収し
て、この樹脂をさらにＴＦＡで洗浄した。冷（−７８℃）ジエチルエーテルを、
合わせた抽出物に添加し、そしてこの溶液を−７８℃まで冷却した。上清を除去
した後、得られた沈澱物を、冷エーテルで数回洗浄して、氷酢酸中に溶解し、そ
して凍結乾燥した。

【００５０】環状ペプチドライブラリーに対して、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＯＤｍａｂ
（Ｄｍａｂ，４−［Ｎ−（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソキシシク
ロヘキシリジン）−３−メチルブチル）アミノ］−ベンジル（４−［Ｎ−（１−
（４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６−ｄｉｏｘｏｘｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｉｄ
ｅｎｅ）−３−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ）ａｍｉｎｏ］−ｂｅｎｚｙｌ））は、
上記のように鎖が伸長された後に、Ｒｉｎｋアミド樹脂にアンカーされた側鎖で
ある。直鎖状のアセンブリの後、Ｄｍａｂ基およびＦｍｏｃ基の除去を、ヒドラ
ジン：ＤＭＦ（１：４９）を用いた７分間の処理およびピペラジン：ＮＭＰ（１
：４）の６×３分の処理のそれぞれによって、達成した。この樹脂を、手動の環
化のために、ポリプロピレンフリットを含んだシリンジに移した。樹脂上のヘッ
ドトゥテイル（ｈｅａｄｔｏｔａｉｌ）環化を、ＮＭＰ：ＤＭＦ：ジクロロ
メタン、メチレンクロリド、ＤＣＭ）（１：１：１）中の１％Ｔｒｉｔｉｏｎ
Ｘを含む溶液中の７−アザベンゾトリアゾ−ル−１−イロキシ）−トリス（ピロ
リジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（「ＰｙＡＯＰ」）：ＤＩ
ＥＡ（１：２、４当量）を用いて実施した。未反応の直鎖状前駆体を、ＤＭＦ中
のＦｍｏｃ−Ｎｖａ−ＯＨ／ＰｙＡＯＰ／ＤＩＥＡ（「Ｎｖａ」、「ノルバリン
」）（１：１：２、４当量）で、１×１８時間および１×３時間、処理をした。
続く上記のような開裂および側鎖の脱保護によって、環状ペプチドライブリーお
よび対応する直鎖状（非環化）配列を含む混合物を産生した。所望の環状ペプチ
ドライブラリーを精製して、逆相高速液体クロマトグラフィー（「ＲＴ−ＨＰＬ
Ｃ」）によって直鎖状夾雑物を除去した。

【００５１】ペプチドおよびペプチドライブラリーを、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭ
Ｓ（ＬｏｕｉｓｉａｎａＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、およびエドマ
ン分解によって、特徴づけた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析によって、不完全
な脱保護、脱ブロック化、またはアルキル化に起因する、高分子量の不純物の存
在の検出が可能である。エドマン分解は、ライブラリー中の各縮重位置における
各アミノ酸量についての定量的な情報を提供する。

【００５２】合成された出発ライブラリーは、単一の非縮重指向化アミノ酸（すなわち、Ｍ
−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ、ここでＸは、システイン以外の全
てのアミノ酸の縮重した等モル混合物である）を有する。環状ライブラリー（ヘ
ッドトゥテイル）はまた、単一の、非縮重指向化アミノ酸を用いて調製した。こ
れらの出発ライブラリーの使用を通して、いくつかの縮重した位置において最適
化された残基を規定し、そして２次ライブラリーを作製し、これらの位置を固定
する。例えば、ヘッドトゥテイル環化ライブラリーシクロ（Ｍ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｎ）は、（固定されたＲから）第−４位はリジンであ
るべきであり、その第−２位はアスパラギン酸であるべきであり、第−１位はヒ
スチジンであり、そして第＋３位はリジンであり、結果として第２ライブラリー
は、シクロ（Ｍ−Ｋ−Ｘ−Ｄ−Ｈ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｋ−Ｎ）であることを示す。

【００５３】指向された線形ペプチドライブラリーを、固定化されたＣＣＲ５および単離さ
れた高親和性ペプチドの小画分を含むカラムに適用した。結合ドメインを使用し
たペプチドライブラリースクリーニングを示した概念図を、図３に示し得る。洗
浄後、結合ペプチドライブラリーのメンバーをこのカラムから溶離した。次に、
結合したペプチドおよびこのカラムに適用したライブラリー全体の両方を、別個
にエドマン分解に供し、そして位置の関数としてアミノ酸分布を決定した。最後
に、縮重位置でのアミノ酸の傾向を決定する。例えば、セリンが、出発ライブラ
リー中のアミノ酸の第＋１位で５％であるが、高親和性ペプチド中の第＋１位で
、アミノ酸の１５％である場合、第１位はセリンに対する選択が存在する。その
位置での優先値３が得られる。表１は、結合ドメインを使用したペプチドライブ
ラリー法の使用の選択的な概観を提供する。

【００５４】

【表１】（実施例２：ＧＳＴタグ化ＣＣＲ５の調製；これを使用したスクリーニング）ライブラリーを、ＲｉｎｋＡｍｉｄｅＭＢＨＡ樹脂（置換：０．５４ｍｍ
ｏｌ／ｇｍ）を使用して９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護
基とともに、ＡＢＩ４３３Ａ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ,Ｆｏｒｓ
ｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）上に合成した。縮重位置に対するアミノ酸のほぼ等し
いカップリングを得るために、アミノ酸量を、文献値を考慮して経験的に調節し
た。ＯｓｔｒｅｓｈＪＭら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ３４（１２）：１６８１
〜９（１９９４）参照のこと。結合剤は、１当量のペプチドに対して１当量の、
ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ／ＤＩＥＡであった。開裂はカクテル（８２％ＴＦＡ、５
％フェノール、５％チオアニソール、２．５％１，２エタンジチオール、５％
水）によって達成した。ペプチドをメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルから沈澱
した。ライブラリーをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ＬｏｕｓｉａｎａＳｔａｔ
ｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびアミノ酸配列決定によって特徴づけた。

【００５５】出発ライブラリーは、単一な非縮重指向化アミノ酸（すなわち、Ｍ−Ａ−Ｘ−
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）を使用した。しかし、他のライブラリーは、
ｇｐ１２０ループ結合ＣＣＲ５の配列１および配列２から取ったさらなる非縮重
アミノ酸を使用し得る。図１を参照。例としては、配列１をベースにしたＸ−Ｘ
−Ｒ−Ｉ−Ｘ−Ｑ−Ｘ−Ｘまたは配列２をベースにしたＲ−Ｐ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ
−Ｘ−Ｘである。ダッシュは、この残基を必要としないことを示す。第２ライブ
ラリーを作製し、いくつの縮重位置で見出した最適な残基を固定した。これらの
出発ライブラリーの使用を通して、モチーフを規定する。例えば、Ｍ−Ａ−Ｘ−
Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘは、第−４位がプロリンであり、その結果第２
ライブラリーはＭ−Ａ−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘであることを示す
。

【００５６】ＧＳＴタグ化ＣＣＲ５の場合、このレセプターはこのライブラリーに曝露され
、そして、遠心分離によりこれらのメンバーを、ペレットすることによって、遊
離ペプチドと結合したペプチドとの分離を達成した。ＧＳＴタグ化ＣＣＲ５精製
レセプターをペプチドライブラリー、約１μｍｏｌのペプチドおよび約１ｎｍｏ
ｌの結合部位とともにインキュベートした。インキュベーション後、結合したペ
プチドを伴ったレセプターを、遠心分離によって非結合ペプチドから分離した（
ペレット中のレセプター・ペプチド複合体、上清中の非結合ペプチド）。非特異
的に結合したペプチドを、徹底的な洗浄によって除去し、そして低いｐＨ（２．
５以下）のペレットの再懸濁物を使用して結合したペプチドを除去した。このペ
プチドを配列決定し、コンセンサス配列を決定した。

【００５７】ＦＬＡＧ−タグ化ＣＣＲ５を、ペプチドライブラリー研究のために使用し、こ
のレセプターを抗ＦＬＡＧＭ２親和性マトリックス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ
）上に固定化した。さらなる精製アプローチによってＣＣＲ５−ＧＳＴ構築物を
使用し、そしてグルタチオン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を固定
した。

【００５８】結合したペプチド混合物と出発ペプチドライブラリーの両方を、標準的な技術
を使用して配列決定した。各アミノ酸量を、位置の関数として、決定した。各位
置の各アミノ酸に対する優先値を、出発ライブライブラリーに存在するアミノ酸
量とペプチドの結合画分を比較することによって計算した。これらの手順を使用
して、多くの結合ドメインと相互作用するペプチドの好ましい配列を決定し、そ
してこれを表１に記載した。

【００５９】また、第２のライブラリーを出発ライブラリーからの情報を組み込むことによ
って配列決定した。特徴付けのこの第１のラウンドについて、ファージディスプ
レイ技術をまた、使用して予備的な結合モチーフを同定する。ファージディスプ
レイ法は、天然のアミノ酸のモチーフの同定を提供する。ファージディスプレイ
は、ＤＮＡ配列を、ファージ被覆タンパク質の１つをコードする遺伝子中へ挿入
することを包含する。この遺伝子を特定の位置に挿入して、その結果発現された
タンパク質挿入物は他の分子と相互作用し得る。結果として、コードされたペプ
チドまたはタンパク質配列を、ファージ表面上に提示し、そして結合のために曝
露する。縮重ヌクレオチドを挿入することによって、各ファージは、異なったペ
プチド配列（「ファージディスプレイ」）を発現し得る。このファージディスプ
レイと固定したレセプターとのインキュベーションは、このレセプターに特異的
に結合する配列を同定し得る。微弱なシグナルでさえ検出し得るが、これは、単
離されたファージを増殖することよって増幅することができるためである。ファ
ージディスプレイから導出した情報は、薬学的特徴を増大するリガンドを選択す
るために、新規のアミノ酸アナログまたは環状ペプチドを含む合成ライブラリー
を使用する、親和性精製法に対して適用可能である。出発ライブラリー、第２ラ
イブラリーおよび第３ライブラリーの使用によって、結合部位の特異性の完全な
定義を提供した。

【００６０】一旦、好ましいアミノ酸残基を、このライブラリーの縮重位置における、ＣＣ
Ｒ５の高い優先値を使用して同定すると、特異的なペプチドをライブラリー合成
に用いる方法によって合成した。次いで、ペプチドをＨＰＬＣによって精製し、
そして組成をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって確認した。

【００６１】相対的な親和性を、レセプター精製に使用した放射性標識結合アッセイを改変
することによって測定した。従って、精製したＣＣＲ５膜からこれらのペプチド
の［^１２５Ｉ］−ＭＩＰ−１βを提示する能力を測定した。

【００６２】（実施例３：タグ化したＣＣＲ５の調製と分析；これを使用したスクリーニン
グ）（Ａ．クローニングおよび発現）ＣＣＲ５ｃＤＮＡ（図４の配列を参照）をベクターｐＣＤＮＡ３中のＲｅｃ
eptor Ｂｉｏｌｏｇｙ(Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ)から得た。タグを、本明
細書中に記載のような、標準的な技術を使用する親和性精製アッセイのための、
レセプターのＣ末端を固定する使用のために、レセプターのＣ末端に加えた。さ
らに、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５７８４０に相関するＣＣＲ５ｃＤＮＡを
、ベクターｐＣＤＮＡ３中で使用し得る。ＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｏｌｏｇｙ由
来のＣＣＲ５ｃＤＮＡと、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５７８４０に相関する
ＣＣＲ５ｃＤＮＡとの唯一の違いは、第１８０位の塩基の点変異（このアミノ
酸配列の中で、ロイシンをグルタミンに変化する）である。以下は、Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒＢｉｏｌｏｇｙから得たＣＣＲ５ｃＤＮＡを用いたこのタグ化方法を
使用した実験からの具体的な例である：（Ｃ末端ヒスチジンタグを伴ったＣＣＲ５の構築（昆虫選択発現系））ＣＣＲ５−ＨＩＳ構築物をこの系から誘導した。ＰＣＲをＣＣＲ５／ｐｃＤＮ
Ａ５（ＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｏｌｏｇｙ製）を鋳型として使用して、そしてプ
ライマー５−ＡｇｅＨｉｓおよび５−ＳｐｅＨｉｓを使用して実施した。こ
の最初のプライマーによって、独特のＳｐｅＩ部位を、ＣＣＲ５の開始ＡＴＧの
直前に誘導した。第２のプライマーによって、ＣＣＲ５の終止コドンを、ｐＩＺ
Ｔ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のヒスチ
ジンタグとインフレームであるＡｇｅＩ部位の中へ変異した。ＰＣＲ産物をＳ
ｐｅＩとＡｇｅＩで消化し、次いで、同様に消化されたｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉ
ｓの中へ連結した。この構築物は、ＣＣＲ５−Ｈｉｓ−ＰＩＺＴとして同定され
る。

【００６３】（Ｃ末端ヒスチジンタグを伴ったＣＣＲ５の構築（バキュロウイルス発現系）
）ＣＣＲ５−Ｈｉｓ−ＰＩＺＴをＨａｅＩＩとＳｐｅＩで消化し、次いで、Ｋ
ｌｅｎｏｗフラグメントで埋め込んだ。ＣＣＲ５−Ｈｉｓを含むこのフラグメ
ントを、予めＮｈｅＩで消化され、そしてＫｌｅｎｏｗでブラントしたｐＢｌ
ｕｅｂａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へ、連結した。この構築物を方
向の正確さについてチェックした。これは、ＣＣＲ５−ＨＩＳと呼ばれる。この
構築物を、制限消化および標準的な技術を用いた配列決定によって確認した。こ
の構築物を発現のために使用し、そして十分に発現されるように、そして親和性
精製スクリーニングでの使用のための活性形態にあるように決定した。

【００６４】（Ｃ−末端ＦＬＡＧタグを有するＣＣＲ５の構築）標準的な技術を使用するＰＣＲを、テンプレートとしてＣＣＲ５／ｐｃＤＮＡ
３（ＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｏｌｏｇｙ製）ならびにプライマー５−Ｘｈｏｐ
ＦＬＡＧおよびプライマー５−ＳａｌｐＦＬＡＧを使用して実施した。第１の
プライマーは、ＣＣＲ５のイニシエーターＡＴＧの直前の固有のＸｈｏＩ部位を
操作した。第２のプライマーは、ＣＣＲ５の停止コドンをＳａｌＩ制限部位に変
異した（Ｓｉｇｍａ製のｐＦＬＡＧ−ＣＴＣのＦＬＡＧタグを用いてインフレー
ムで）。ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩで消化し、そして同様に消化し
たｐＦＬＡＧ−ＣＴＣ（細菌の発現ベクター）に連結した。この構築物を、ＣＣ
Ｒ５−ＦＬＡＧ−ＣＴＣと呼ぶ。次いで、ＣＣＲ５−ＦＬＡＧを、ＸｈｏＩおよ
びＳａｃＩで消化し、そしクレノウ断片で充填した。ＣＣＲ５−ＦＬＡＧ−ＣＴ
Ｃを含むフラグメントを、最初に、ＮｈｅＩで消化し、次いで、クレノウで平滑
化したｐＢｌｕｅｂａｃ４．５に連結した。この最終構築物を、ＣＣＲ５−ＦＬ
ＡＧと同定する。この構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術
を使用して配列決定した。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニ
ティー精製スクリーニングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現す
ることを判定した。

【００６５】（Ｃ末端ＧＳＴタグを有するＣＣＲ５の構築）ＰＣＲを、テンプレートとしてＣＣＲ５／ｐｃＤＮＡ３（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ製）ならびにプライマーＧＳＴ−ＢａｍＨＩおよびプライマーＧ
ＳＴ−ＮｄｅＩを使用して実施した。第１のプライマーを、ＣＣＲ５の停止コド
ンを、ＢａｍＨＩ制限部位に変異した（ｐＥＳＰ−３のＦＬＡＧ／ＧＳＴタグを
用いてインフレームで）。第２のプライマーを、ＣＣＲ５の開始コドンにおける
固有のＮｄｅＩ部位に導入した。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消
化し、そして同様に消化したｐＥＳＰ−３（酵母発現ベクター）に連結した。こ
の構築物を、ｐＣＰ８と呼ぶ。次いで、ｐＣＰ８を、ＮｄｅＩおよびＳｍａＩで
消化し、そしてクレノウ断片で充填した。ＣＣＲ５−ＧＳＴを含むフラグメント
を、最初に、ＢｇｌＩＩで消化し、次いでクレノウで平滑化した、ｐＢｌｕｅｂ
ａｃ４．５に連結した。この最終構築物を、ｐＣＰ１０として同定する。このタ
ンパク質を記載する場合、この構築物を、ＣＣＲ５−ＧＳＴとして同定する。こ
の構築物を、制限消化によって確認し、そして標準的な技術によって配列決定し
た。この構築物を、発現のために使用し、そしてアフィニティー精製スクリーニ
ングにおける使用のために十分にかつ活性な形態で発現することを判定した。

【００６６】これらのベクターに関するプライマーマッピングは、図５〜７において見出さ
られ得る。

【００６７】３つの新しい構築物のベクター（ＣＣＲ５−ＦＬＡＧ、ＣＣＲ５−ＧＳＴおよ
びＣＣＲ５−ＨＩＳ）を、使用して、それぞれのバイアルストックの産生のため
にＳｆ９細胞を同時トランスフェクトした。これらのバイアルストックを、標準
的なプラークアッセイを使用して精製し、次いで実験に使用して、種々のＣ末端
を有するＣＣＲ５の発現の最適化のために感染させた。ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をまた、これらのＣＣＲ５タグ化構築物でトランスフ
ェクトし、そしてＣＣＲ５の発現を試験した。全ての構築物について、適切なタ
グ化レセプターを発現することを判定した。７２時間後の発現レベルは、Ｓｆ９
細胞に関する発現レベルよりもＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞において５倍ほど高かっ
た。全ての上記の実験を、当業者に公知の標準的な技術を使用して行なった。

【００６８】ＣＣＲ５の発現のための第４の構築物を、スターティングベクターｐＢｌｕｅ
Ｂａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から作製し、以前記載したベクターにお
けるトロンビン開裂部位およびエンテロキナーゼ開裂部位を除去した。ＧＳＴタ
グを、ＰＣＲを使用することによってマルチクローニング部位に添加して、ＧＳ
Ｔタグを精製し、次いで、当業者に公知の標準的な方法を使用して消化ベクター
（ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ）に連結した。次に、このベクターを、操作の容易のた
めにＬｉｆｅｔｅｃｈ製のＧａｔｅｗａｙ技術と適合性にした。これを、この技
術のために必要な組換え部位を含むカセット（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ製）にＳｍａＩ
を連結することによって行なった。ＣＣＲ５を、プライマーを使用してＰＣＲを
用いて増幅して、組換えのための結合部位を含む遺伝子を伸長した。次いで、Ｐ
ＣＲ産物を、ＢＰクロナーゼ（相同組換えに必要な酵素）を使用してバキュロウ
イルスベクターに組み込んで、エンテロキナーゼ開裂部位またはトロンビン開裂
部位を有さず、Ｃ末端ＧＳＴタグ有するＣＣＲ５を含むバキュロウイルス発現の
ためのベクターを作製した。このベクターを、発現のために必要なウイルススト
ックの調製のためにＳｆ９細胞に同時トランスフェクトした。このウイルスを、
プラーク精製し、そしてＰＣＲおよび配列チェックしたクローンを、ＣＣＲ５の
発現のために使用した。この構築物のタイムコースは、タンパク質のより少ない
のタンパク質分解が、観察され、そしてより少ない時間が、レセプターの最大の
発現を得るために必要であったことを示す。

【００６９】（Ｂ．活性）それぞれのタグ化ＣＣＲ５遺伝子（ＣＣＲ５−ＧＳＴ、ＣＣＲ５−ＦＬＡＧお
よびＣＣＲ５−ＨＩＳ）を、実施例１に記載される、Ｓｆ９細胞およびＨｉｇｈ
Ｆｉｖｅ細胞において発現した。全てのＳｆ９細胞由来の細胞およびＨｉｇｈ
Ｆｉｖｅ細胞株を、低張緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ
ＥＤＴＡ）を使用して溶解し、そして膜調製物を、当業者に公知の標準的な技
術を使用するホモジナイズおよび遠心分離によって作製した。ＣＣＲ５−ＧＳＴ
、ＣＣＲ５−ＦＬＡＧおよびＣＣＲ５−ＨＩＳに関する膜調製物を、それぞれ、
標準的な放射リガンドアッセイを使用してアッセイした。結合アッセイを、５０
ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％ＢＳＡ中の５μｇの膜を用いて実施し
た。インキュベーションは、２７℃で１時間であった。インキュベーションを、
９６ウェルＰＣＲプレートにおいて行い、そして洗浄（非特異的な結合を減少す
るために２５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて）および計数のために９６
ウェルフィルターパンチプレート（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ）に移した。全てのサンプ
ルを、３連でアッセイした。図８は、一般に、ＣＣＲ５レセプター結合の特徴付
けを例示するチャートを示す。特に、結合に関するＫ_ｄを、図８ａに示すＣＣＲ
５に対する［^１２５Ｉ］−ＭＩＰ−１βの漸増量を加えることによる飽和実験を
使用して測定した。ＩＣ_５０定量に関するＣＣＲ５への放射リガンド（１ｎＭの
［^１２５Ｉ］−ＭＩＰ−１β）の置換を、図８ｂに示される膜調製物とカラムに
固定化された膜の両方のＭＩＰ−１αを使用して測定した。ＭＩＰ−１βの結合
は、飽和可能であり、可逆的であった。

【００７０】非トランスフェクト細胞を、この実験のコントロールとして使用した。膜調製
物の活性は、少なくとも２０％の活性タンパク質を有するＲｅｃｅｐｔｏｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ（ＭＩＰ１−結合に関してＫ_ｄ＜１ｎＭ）によって得られた膜調製
物に匹敵した。

【００７１】（Ｃ．可溶化）溶解した全細胞および膜調製の両方を、可溶化のために使用した。ＣＣＲ５（
ＣＣＲ５−ＦＬＡＧ、ＣＣＲ５−ＧＳＴおよびＣＣＲ５−ＨＩＳ）にタグ化バー
ジョンの可溶化を、界面活性剤（ＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、β−Ｄ
−マルトシド、ｎ−オクチルグルコシド、ＣＹＭＡＬ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ
ｓ、Ｔｗｅｅｎ−２０、ライソホスファチジルコリン、ＣＨＡＰＳなど）、塩（
ＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、ＫＣｌなど）、緩衝液（Ｔｒ
ｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、Ｈｅｐｐｓ、Ｐｉｐｅｓ、Ｍｅｓ、Ｍｏｐｓ、酢酸、リン酸
、イミダゾールなど）および種々のｐＨ（６．８〜８．２の範囲）の多くの異な
る組み合わせを使用して実施された。最適な可溶化のための条件を、ｐＨ８．１
でＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３〜１４および低塩（例えば、低いマグネシウムおよ
びカルシウムであって、ＮａＣｌはない（０．０ｎＭＮａＣｌ）を使用して見
出した。好ましい実施形態において、少なくとも２０％の可溶化された、固定化
タンパク質は、活性である。非常に好ましい実施形態において、少なくとも３０
％、４０％、５０％および７５％の可溶化された、固定化タンパク質は、活性で
ある。図１２は、これらの実験に使用された幾つかの例示的な条件を用いるＣＣ
Ｒ５の可溶化およびそれぞれの結果を実証する。

【００７２】（Ｄ．固定化）可溶化後、ＣＣＲ５−ＧＳＴとＣＣＲ５−ＦＬＡＧの両方を、精製のためおよ
びペプチドライブラリーのスクリーニングのための活性タンパク質として使用す
るためにアフィニティーカラムに固定化した。ライブラリーからのアフィニティ
ー精製のためのＧＰＣＲの固定化の示す概略図を、図９に示す。ＣＣＲ５−ＧＳ
Ｔを、グルタチオン−アガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）およびグルタチオン−セファ
ロース（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒａｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）に結合し
、そして固定化し、そしてＣＣＲ５−ＦＬＡＧを、ＦＬＡＧエピトープを認識す
る特異的な抗体カラム（Ｍ２カラム，Ｓｉｇｍａ）に固定化した。機能的タンパ
ク質の固定化を、０．３％ＮＰ−４０、１０ｍＭＨｅｐｅｓ（またはＰｉｐ
ｅｓ）（ｐＨ７．５）中のレセプターを最初に可溶化し、次いで、０．１％Ｎ
Ｐ−４０、１０ｍＭＨｅｐｅｓ（またはＰｉｐｅｓ）（ｐＨ７．５）、３ｍＭ
ＣａＣｌ_２、１５ｍＭＭｇＣｌ_２中のグルタチオン−セファロース樹脂に結
合することによって達成した。固定化レセプターの活性を、（上記の膜アッセイ
のように）放射標識化ＭＩＰ−１βと共に４℃で１時間のインキュベーションお
よび冷ＭＩＰ−１αとの競合によって決定した。トランスフェクトされていない
細胞を、カラム単独と同様に、この活性のためのコントロールとして使用した。
これらの実験は、活性形態の樹脂に（アフィニティー精製スクリーニングに十分
な）精製形態のマイクログラム量のレセプターを固定する能力を実証した（図８
ａ参照のこと）。図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した溶離液およびレ
ーン１における精製したレセプターに関するウエスタンブロット（クマシー染色
）および可溶化したＣＣＲ５−ＧＳＴのウエスタンブロットを現像したα−ＧＳ
Ｔ抗体を示す。ＣＣＲ５−ＧＳＴの精製は、グルタチオン−セファロースを使用
して行なった。ＣＣＲ５−ＧＳＴを、０．３％ＮＰ−４０の可溶化後、グルタ
チオン−セファロースに結合させた。ＮＰ−４０を、樹脂を用いて４℃で２時間
回転することによる結合の前に、０．１％に希釈した。洗浄後、なお、界面活性
剤の存在下において、ＣＣＲ５−ＧＳＴを１０ｍＭグルタチオンを使用して溶
出した。

【００７３】（Ｅ．ペプチドライブラリー合成）ライブラリーを、ＲｉｎｋＡｍｉｄｅＭＢＨＡ樹脂（置換：０．５４ｍｍ
ｏｌ／ｇｍ）を使用して９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護
基を有するＡＢＩ４３３Ａ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒ
ｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）において合成した。アミノ酸の混合物を、位置を縮
重位置について使用する場合、およそ等量のアミノ酸の結合を、文献値を考慮に
いれた後、経験的にアミノ酸の量を調節することによって得た（例えば、Ｉｖａ
ｎｅｔｉｃｈら，ＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６７
巻，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡＵＳＡ，２４
７〜２６０頁（１９９６）を参照のこと）。結合剤は、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ／Ｄ
ＩＥＡ（等価のペプチドあたり１当量）。切断を、カクテル（８２％ＴＦＡ、
５％フェノール、５％チオアニソール、２．５％１，２−エタンジチオー
ル、５％水）によって行なった。ペプチドは、メチル三級ブチルエーテルから
沈殿した。ライブラリーを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Ｌｏｕｉｓｉａｎａ
ＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびアミノ酸配列決定によって特徴付け
た。

【００７４】第１のライブラリーは、単一、縮重塩基性ベースアミノ酸（すなわち、Ｍ−Ｘ
−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｗ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｋ）を使用した。これらの第
１のライブラリーの使用を介して、幾つかのまたは全ての縮重位置における最適
な残基を、規定した。第２のライブラリーを、全ての位置を規定していなかった
場合、作製し、それによって規定の位置を固定した。

【００７５】（Ｆ：固定化ＣＣＲ５を使用するペプチドライブラリーのスクリーニング）活性な、大量のタンパク質（１ｎｍｏｌ）を、特定の樹脂に固定化し（例えば
、ＣＣＲ５−ＧＳＴをグルタチオン−セファロースにかまたはＣＣＲ５−ＦＬＡ
ＧをＭ２抗体−アガロースに固定化する）、無数の化合物のスクリーニングを、
一緒にインキュベートすること、およびＣＣＲ５によって好まれるリガンドを精
製する自然の選択および結合親和性を可能にすることによって行い得る。これら
の実験を、直鎖状ライブラリー４Ｐ４（＋）およびさらなる１８のライブラリー
を使用して実施した。さらなる実験を、他のライブラリーを用いて実施し得る。

【００７６】どのペプチドライブラリーをスクリーニングするかを同定するために、膜結合
活性を、開発して、ペプチドライブラリーと共に使用した。各ペプチドライブラ
リー（１００μＭ最終濃度、平均モル重量）を、（本明細書中に上記されるよ
うに得られた膜中の）レセプターと共にインキュベートし、［^１２５Ｉ］−ＭＩ
Ｐ−１β結合を阻害するライブラリーにおけるペプチドの能力を決定した。阻害
パーセントを、計算した。最も高い阻害パーセントの有するペプチドライブラリ
ーを、最初にアッセイした。特に、図１１に示されるように、結合阻害アッセイ
を、５μｇ膜、０．５ｎＭ［^１２５Ｉ］−ＭＩＰ−１βおよび１００μＭ
各ペプチドライブラリーのアリコートを使用して実施した。結果を阻害％として
図１１に示す。この最良の阻害を、ＣＰＩ−１００７０（Ｍ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ）およびＣＰＩ−１００２０（Ｍ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｒ
−Ｘ−Ｘ−Ｘ）を用いて観察した。ライブラリーは、種々の固定化された定位の
残基を有する直鎖状ペプチドライブラリーおよび環状ペプチドライブラリーの両
方を含む。

【００７７】１回のアフィニティー精製あたりＣＣＲ５−ＧＳＴを発現する約５００ｍＬの
１×１０^６細胞／ｍＬのＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を使用した。固定化したＣＣＲ
５−ＧＳＴ（本明細書中に記載される）を、１ｍｇのペプチドライブラリーと共
に、室温で２０分間インキュベートした。結合していないペプチドを、洗浄によ
って除去した。結合したペプチドを、３０％酢酸で溶出した。溶出したペプチ
ドを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０を使用して濾過して、酢酸と同時に溶出し得た
任意のタンパク質を除去した。このろ液を、真空下で乾燥し、水に溶解し、そし
てペプチド配列決定に供した。表２は、ＣＣＲ５およびペプチドライブラリーを
用いて実施したアフィニティー精製の悪化を要約する。第１のスクリーニングか
ら、第２の集束したライブラリーまたは定位のライブラリーを合成した。（表２：ペプチドライブラリーを使用したＣＣＲ５アフィニティー精製からの結
果の要約）

【００７８】

【表２】

【００７９】

【表３】（Ｇ．ファージディスプレイ）スクリーニングにおいて有用な代替の方法またはさらなる方法として、固定さ
れた機能的ＣＣＲ５を使用して、当業者に公知の標準的な技術を使用してＣＣＲ
５に結合するファージを単離した。アッセイにおいて使用されたグルタチオン−
セファロースビーズ、ＢＳＡおよびＭＩＰ１βからのバックグラウンドのサブト
ラクションを、これらの化合物の混合物と共にファージライブラリーをインキュ
ベートすることによって実施した。レセプターとの、サブトラクションしたファ
ージライブラリー（すなわち、ＮＥＢ、ＰｈＤＣ７Ｃ）のインキュンベーショ
ン後、結合したファージを、天然のＣＣＲ５リガンド（ＭＩＰ１β）およびグリ
シン、ｐＨ２．２の両方とによって溶出した。ＰｈＤＣ７Ｃは、ジスルフィド
間に７個の無作為なアミノ酸を有する特殊なファージライブラリーであり、そし
てＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから得られ得る。複数回のスクリー
ニングを実施した。両方の条件は、ＣＣＲ５に結合し、そしてリガンド結合を阻
害し得る特定の配列を提供した。

【００８０】

【表４】（実施例４：ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの予防または処置）しかし、現在、治療的ペプチド、ペプチド模倣物、またはＡＩＤＳおよびＨＩ
Ｖ感染の予防および処置のために使用されるＣＣＲ５結合の低分子アゴニストも
しくはアンタゴニストの生産、処方ならびに使用の間に、いくつかの合併症が生
じる。ＣＣＲ５の治療的結合化合物の商業的生産のコストおよび技術的難易度を
最小化する生物学的に適切なアンタゴニストはさらに、本発明によって意図され
る。さらに、アンタゴニストまたはアゴニストに対する免疫学的応答を与えず、
その結果その有効性を妨害する、ＣＣＲ５結合の生物学的に適切なアンタゴニス
トまたはアゴニストは、本発明によって意図される。さらに、生成されたＣＣＲ
５結合のアンタゴニストまたはアゴニストの、生物学的効力の有意な喪失を伴わ
ない、商業的に妥当な有効期限を与える適切な処方は、本発明において意図され
る。さらに、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染の予防および処置のために適切な、個体
に対する投与のための有用な用量は、本発明において意図される。

【００８１】単独でまたは他の適切な分子と混合した、ＣＣＲ５結合の阻害に関してコンピ
テントな適切な候補物の同定は、本発明によって意図される。このような候補物
はさらに、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染の予防および処置のために生物学的に適切
な、上記で同定された候補物の商業的に重要な量の生産を意図する。さらに、本
発明は、最初に同定されたアナログの所望されない任意の特性（例えば、インビ
ボでの毒性または貯蔵の際の分解傾向）が緩和される、ＣＣＲ５結合アンタゴニ
スト、アゴニストまたは誘導体の治療的品質の商業的に重要な量の生産を提供す
る。

【００８２】ペプチド、ペプチド模倣物、またはＣＣＲ５結合活性の低分子アンタゴニスト
の同定および設計後の、ＡＩＤＳおよびＨＩＶ感染を予防および処置する方法は
、本明細書中に記載のようなＣＣＲ５結合を阻害し得るこのような化合物を含む
組成物を投与する工程を包含する。投与は、任意の適合性の経路によるものであ
り得る。従って、適切な場合、投与は、経口または非経口（静脈内および腹腔内
の投与経路を含む）を含み得る。特に好ましい方法は、適切な処方物の徐放性注
射によるものである。さらに、投与は、組成物のボーラスの定期的な注射による
ものであり得るかまたは体外（例えば、静脈内バッグ）または体内（例えば、生
物腐食性の（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）移植）であるレザバからの静脈内または
腹腔内投与によってより連続的になされ得る。

【００８３】本発明によって意図される治療的組成物を、任意の適切な手段によって、直接
（例えば、注射、移植または組織部位に対する局所的投与によるように局所的に
）、または全身的に（例えば、非経口的にまたは経口的に）個体に提供し得る。
組成物が非経口的に（例えば、静脈内、皮下、分子内、眼、腹腔内、筋内、頬、
直腸、膣、眼窩内、頸部内、頭蓋内、脊髄内、室内、鞘内、大槽内、嚢内、鼻腔
内によって）またはエアロゾル投与によって提供される場合、この組成物は、水
性または生理学的に適合な液体懸濁物または溶液の部分を含み得る。従って、キ
ャリアまたはビヒクルは、生理学的に受容可能であり、その結果、所望の組成物
の被験体への送達に加えて、患者の電解質および／または容量バランスに他の悪
影響を及ぼさない。

【００８４】非経口投与に有用な溶液は、薬学の分野で周知の方法（例えば、ＲＥＭＩＮＧ
ＴＯＮ’ＳＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥ（Ｇｅｎｎａｒｏ
，Ａ．、編）、ＭａｃｋＰｕｂ．、１９９０に記載される方法）のいずれかに
よって調製され得る。本発明の治療的薬剤の処方物としては、例えば、ポリアル
キレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、植物起源の油、水素化ナ
フタレンなど）が挙げられ得る。特に、直接投与のための処方物は、所望の部位
での薬剤の維持を補助するグリセロールおよび他の高粘度の組成物を含み得る。
生体適合性、好ましくは生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）のポリマー
（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸三カルシウム、ポリブチレート、
ラクチドならびにグリコリドポリマーおよびラクチド／グリコリドコポリマーを
含む）は、インビボで薬剤の放出を制御する有用な賦形剤であり得る。ペプチド
薬物についての徐放性注射可能処方物の概念は、十分受け入れられており、そし
ていくつかの利点を提供する。第一に、例えば、バイオアベイラビリティーが高
い。第二に、処置レジメンは、１ヶ月または３ヶ月当たり１回（ＡｂｏｔｔのＬ
ｅｕｐｒｏｎ（登録商標）のように）または１年に１回（例えば、ＡｌｚａのＶ
ｉａｄｕｒ（登録商標））からなり得る。第三に、徐放性注射可能処方物は、実
質的に、使用され得る要領を減少させる（Ｌｅｕｐｒｏｎ注射用量は、１ｍｇ／
日であるが、９０日の処方物使用量（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｕｓｅ）は、総量
１１．２５ｍｇである）。また、増大した効力は、治療が感染性を予防するため
に連続して存在する場合に達成され得る。この考えは、感染のｓｌｏｗ−ｔｏ−
ｃｌｅａｒ沈着の再形成（例えば、記憶Ｔ細胞コンパートメント）を予防するこ
とにより疾患の治癒を達成する必要性の観点から特に重要である。例えば、Ｌｅ
ｅ，Ｖ．編、ＰｅｐｔｉｄｅａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＤｒｕｇＤｅｌｉｖ
ｅｒｙ、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ＮＹ（１９９１）を参照のこ
と。

【００８５】これらの薬剤のための他の潜在的に有用な非経口送達システムとしては、エチ
レン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システ
ム、およびリポソームが挙げられる。吸引投与のための処方物は、賦形剤として
、例えば、ラクトースを含むか、または水溶液（例えば、ポリオキシエチレン−
９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む）かもし
くは鼻ドロップまたは鼻へ適用されるためのゲルの形態での投与のための油性溶
液であり得る。非経口投与のための処方物はまた、頬投与のためのグリココレー
ト、結腸投与のためのメトキシサリチラート、または膣投与のためのクエン酸（
ｃｕｔｒｉｃａｃｉｄ）を含み得る。

【００８６】本発明のさらなる局面および実施形態は、当業者に明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＣＣＲ５結合に関与するｇｐ１２０残基を示す。

【図２】図２は、固定された非変性リジンもしくはアルギニン、ならびにおおよそ等し
い割合の１８アミノ酸からなる８個の変性位置を有する、ペプチドライブラリー
を示す。

【図３】図３は、結合ドメインを用いたペプチドライブラリーのスクリーニングを示す
。

【図４】図４は、ＣＣＲ５ｃＤＮＡ配列を示す。

【図５】図５は、ＣＣＲ５−ＨＩＳについてのバキュロウイルス移入ベクターを示す。

【図６】図６は、ＣＣＲ５−ＦＬＡＧについてのバキュロウイルス移入ベクターを示す
。

【図７】図７は、ＣＣＲ５−ＧＳＴについてのバキュロウイルス移入ベクターを示す。

【図８Ａ】図８Ａは、Ｋ_ｄを決定するための、ＣＣＲ５に対する［^１２５Ｉ］−ＭＩＰ−
１βの飽和結合の特徴付けを示すチャートである。

【図８Ｂ】図８Ｂは、膜調製物中のＭＩＰ−１αおよびカラムに固定されたＭＩＰ−１α
の両方による、ＣＣＲ５に結合する［^１２５Ｉ］−ＭＩＰ−１βの置換の特徴付
けを示すチャートである。

【図９】図９は、ライブラリーからのアフィニティー精製のためのＧＰＣＲの固定化を
示す。

【図１０】図１０は、グルタチオン−セファロースを用いたＣＣＲ５−ＧＳＴの精製を示
す。

【図１１】図１１は、ＣＣＲ５含有膜を用いたペプチドライブラリーのスクリーニングを
示す。

【図１２】図１２は、例示的な条件下での、ＣＣＲの可溶化（％）を示すチャートである
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/64 7/64 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｎ 15/09 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/566 ＺＮＡ 33/50 Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０Ｆ 33/566 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＡＧ０６Ｆ 17/30 １７０Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号６０／１９１，２９９ (32)優先日平成12年３月21日(2000．3．21) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／８１３，６５３ (32)優先日平成13年３月20日(2001．3．20) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／８１３，４４８ (32)優先日平成13年３月20日(2001．3．20) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／８１３，６５１ (32)優先日平成13年３月20日(2001．3．20) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウィルソン，キャロルジェイ．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02145，サマービル，フェルスウェイ 24，アパートメントナンバー３ (72)発明者シー，レイモンドエイチ．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02114，ボストン，ハウソーンプレイス２，アパートメントナンバー９ (72)発明者タンヘヒル，クリスティナエイ．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02474，アーリントン，フォーダムストリート 11 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA34 BB01 BB14 BB29 BB46 BB48 BB50 BB51 CB01 CB17 DA36 FB02 FB07 FB08 JA01 4B024 AA11 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 4C084 AA02 AA07 AA17 BA44 DA01 ZC552 4H045 AA10 BA15 BA16 EA29 FA72 FA74 5B075 UU18

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＣＣケモカインレセプター５に対する結合化合物を同定する
方法であって、該方法は、以下：ａ）２つ以上の分子のライブラリーを提供する工程；ｂ）ＣＣケモカインレセプター５に対応する結合特性を有する分子を提供する工
程であって、該分子が支持体に結合される、工程；ｃ）該２つ以上の分子のライブラリー由来の分子を、該支持体に結合されたＣＣ
ケモカインレセプター５に対応する結合特性を有する該分子に結合する工程；ｄ）該支持体に結合された該分子から該結合した分子を分離する工程；およびｅ）ＣＣケモカインレセプター５に対する結合化合物として該結合した分子を同
定する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記２つ以上の分子のライブラリーが、直鎖ペプチド、環状
ペプチド、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣化合物、および低分子
化合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】ＣＣケモカインレセプター５に対応する結合特性を有する前
記分子が、部分的に精製されたＣＣケモカインレセプターである、請求項１に記
載の方法。
【請求項４】少なくとも１つの前記２つ以上の分子が、レセプター、酵素
、または他のタンパク質に結合し得るタンパク質を置換し得るペプチド、ペプチ
ド模倣物、または低分子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】実質的に塩化ナトリウムの非存在下で、ＣＣケモカインレセ
プター５に対応する結合特性を有する前記分子を溶解する工程をさらに包含する
、請求項１に記載の方法。
【請求項６】低塩濃度を有する緩衝液を用いてＣＣケモカインレセプター
５に対応する結合特性を有する前記分子を溶解する工程をさらに包含する、請求
項１に記載の方法。
【請求項７】少なくとも１つの前記２つ以上の分子がＣＣケモカインレセ
プター５結合活性に対する拮抗効果を有する分子を含む、請求項１に記載の方法
。
【請求項８】前記ライブラリーがファージライブラリーを含む、請求項１
に記載の方法。
【請求項９】前記工程ａ、ｂ、ｃ、およびｄが前記工程ｅの前に少なくと
も１回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】ＣＣケモカインレセプター５に対応する結合特性を有する
前記分子が、ＣＣケモカインレセプター分子および以下からなる群より選択され
るタグを含む、請求項１に記載の方法：ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓ、Ｃ−Ｍ
ＹＣ、ＭＢＰ、Ｖ５、Ｘｐｒｅｓｓ、ＣＢＰ、およびＨＡ。
【請求項１１】請求項１に記載の方法に従い同定されるＣＣケモカインレ
セプター５に対する結合化合物。
【請求項１２】患者においてＨＩＶ感染を予防する方法であって、該方法
は、生理学的キャリア中に請求項１１に記載の化合物を含む治療組成物を該患者
に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】患者においてＡＩＤＳ感染を処置または予防する方法であ
って、該方法は、生理学的キャリア中に請求項１１に記載の化合物を含む治療組
成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】患者においてＡＩＤＳ感染を処置または予防する方法であ
って、該方法は、徐放性の注入可能な処方物中に請求項１１に記載の化合物を含
む治療組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１５】ＣＣケモカインレセプター５に対する試験分子の相対的な
結合親和性を同定するためのコンピュータに補助される方法であって、該方法は
、以下、ａ）ＣＣケモカインレセプター５を特徴付ける入力データをコンピュータプログ
ラムに入力する工程；ｂ）少なくとも１つの試験ペプチド様分子を特徴付ける入力データを入力する工
程であって、該分子は、既知の配列の各々であるが、未知の結合親和性である、
工程；ｃ）各試験ペプチド様分子に対する相対的な結合親和性の予測を生成するために
、該コンピュータプログラムを用いて各適用された試験ペプチド様分子を分析し
、そしてこのような予測を出力する工程；を包含する、方法。
【請求項１６】ＣＣケモカインレセプター５に対する結合化合物の相互作
用部位のアミノ酸配列モチーフを決定するための方法であって、該方法は、以下
：ａ）ＣＣケモカインレセプター５に対応する結合特性を有する分子とペプチドラ
イブラリーを、該ＣＣケモカインレセプター５に対応する結合特性を有する分子
と該ペプチドライブラリーとの間の相互作用を可能にする条件下で、接触させる
工程；ｂ）該ＣＣケモカインレセプター５に対応する結合特性を有する分子が、該ペプ
チドライブラリーと相互作用し、その結果、該ＣＣケモカインレセプター５に対
応する結合特性を有する分子と該ＣＣケモカインレセプター５に対応する結合特
性を有する分子と相互作用し得るライブラリーのメンバーの亜集団との間で、複
合体が形成される工程；ｃ）該ＣＣケモカインレセプター５に対応する結合特性を有する分子と相互作用
し得ないライブラリーのメンバーから、該ＣＣケモカインレセプター５に対応す
る結合特性を有する分子と相互作用し得るライブラリーのメンバーの亜集団を分
離する工程；ｄ）該ＣＣケモカインレセプター５に対応する結合特性を有する分子と相互作用
し得るライブラリーのメンバーの該亜集団を直鎖状にする工程；ｅ）直鎖状にされたライブラリーのメンバーの混合物中での、各変性位置におい
て異なるアミノ酸残基の該相対的な豊富さを決定する工程；およびｆ）該直鎖状にされたライブラリーのメンバーの混合物中での、各変性位置にお
いて異なるアミノ酸残基の相対的な豊富さに基づき、該ＣＣケモカインレセプタ
ー５に対応する結合特性を有する分子の相互作用部位のアミノ酸配列モチーフを
決定する工程、を包含する、方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法に基づき同定された、ＣＣケモカ
インレセプター５に対する結合化合物のアミノ酸配列モチーフ。
【請求項１８】以下からなる群より選択される配列を有する、請求項１６
に記載の方法に従い同定されたアミノ酸配列モチーフ：【化１】。
【請求項１９】請求項１６に記載の方法により決定された、ＣＣケモカイ
ンレセプター５に対するアミノ酸配列モチーフを有する結合化合物。
【請求項２０】以下からなる群より選択される配列を有する、請求項８に
記載の方法に従い同定された結合化合物：【化２】。
【請求項２１】前記ペプチドライブラリーの少なくとも１つのメンバーが
少なくとも１つの非天然のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】前記ＣＣケモカインレセプター５に対応する結合特性を有
する分子が、直鎖ペプチド、環状ペプチド、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペ
プチド模倣化合物、および低分子化合物からなる群より選択される、請求項１６
に記載の方法。
【請求項２３】前記ペプチドライブラリーが、直鎖ペプチド、環状ペプチ
ド、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣化合物、および低分子化合物
からなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む、請求項１６に記載の方
法。
【請求項２４】前記ペプチドライブラリーが、ＣＰＩ−１００１８、ＣＰ
Ｉ−１００２０、ＣＰＩ−１００２１、ＣＰＩ−１００２８、ＣＰＩ−１００３
１、ＣＰＩ−１００３７、ＣＰＩ−１００４２、ＣＰＩ−１００４３、ＣＰＩ−
１００４５、ＣＰＩ−１００６４、ＣＰＩ−１００７０、およびＣＰＩ−１０１
０１からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】前記ペプチドライブラリーが、以下からなる群より選択さ
れる、請求項１６に記載の方法：【化３】。
【請求項２６】ＣＣケモカインレセプター５に対する結合化合物の相互作
用部位のアミノ酸配列モチーフに基づくメンバーを含むライブラリーであって、
該モチーフは、ペプチドライブラリー由来の少なくとも１つのペプチドのメンバ
ーが該ＣＣケモカインレセプター５に対する結合化合物と相互作用することを可
能にし、そして該ＣＣケモカインレセプター５に対する結合化合物と相互作用す
る少なくとも１つのペプチドのアミノ酸配列を決定することにより決定される、
ライブラリー。
【請求項２７】ＣＣケモカインレセプター５の結合特性に対応する化合物
を溶解および固定化する方法であって、ＣＣケモカインレセプター５の結合に対
応する化合物を決定する場合に、該溶解および固定化が、実質的に塩化ナトリウ
ムの非存在下で実施される、方法。
【請求項２８】ＣＣケモカインレセプター５の結合特性に対応する化合物
を溶解および固定化する方法であって、ＣＣケモカインレセプター５の結合に対
応する化合物を決定する場合に、該溶解および固定化が、低塩濃度を用いること
により実施される、方法。
【請求項２９】前記低塩濃度が、予め決定された量のマグネシウムおよび
カルシウムを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】構築されたＣＣケモカインレセプター５転移ベクターであ
って、該転移ベクターがＣＣケモカインレセプター５および以下からなる群より
選択されるタグを含む、ベクター：ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓ、Ｃ−ＭＹＣ
、ＭＢＰ、Ｖ５、Ｘｐｒｅｓｓ、ＣＢＰ、およびＨＡ。
【請求項３１】薬物スクリーニングアッセイにおいてＣＣケモカインレセ
プター５の三次元構造を使用する方法であって、該方法は、以下：ａ）該三次元構造を用いた合理的な薬物設計を実施することにより潜在的な薬物
を選択する工程であって、ここで、該選択工程がコンピュータモデリングと組合
されて実施される、工程；ｂ）第１のＣＣケモカインレセプター５を含む第１の分子と該潜在的な薬物とを
接触させる工程；およびｃ）該潜在的な薬物と該第１の分子との結合を検出する工程；を包含し、ここで、潜在的な薬物は、該潜在的な薬物が該第１の分子に結合する
場合に薬物として選択される、方法。
【請求項３２】前記第１の分子が標識される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】前記第１の分子が固体支持体に結合される、請求項３１に
記載の方法。