JP5355561B2 - 生物活性ペプチドおよびその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、生物活性ペプチドに関する。

既知で特徴付けられていないＧＰＣＲは現在、薬物作用および開発の主要な標的を構成している。

新規のＧタンパク質共役受容体を同定し、既知のＧＰＣＲを非個別化する努力が継続的になされており、ＧＰＣＲは潜在的な予防的特性および治療的特性を有するアゴニスト並びにアンタゴニストのためのスクリーニングに使用することができる。

本発明は、新規のペプチド、変異体、相同体、オルソログ、またはそれらの誘導体の同定に一部基づき、：
ペプチドＰ５９−Ｓ−アミド（アミド）：ＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：１）；
ペプチドＰ５９−ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：２）；
ペプチドＰ５９−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：３）；
ペプチドＰ５９（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：４）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：５）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：６）；
ペプチドＰ７４−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：７）；
ペプチドＰ７４（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：８）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：９）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：１０）；
ペプチドＰ５９ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１１）；
ペプチドＰ５９−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１２）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１３）；
ペプチドＰ７４−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１４）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１５）；
ペプチドＰ５９−チンパンジー：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２０）；
ペプチドＰ５９−オランウータン：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２１）；
ペプチドＰ５９−アカゲザル：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２２）；
ペプチドＰ５９−雌ウシ：ＧＱＫＧＱＡＧＬＰＧＡＱＣＰＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２３）；
ペプチドＰ５９−ニワトリ：ＧＱＫＧＱＰＧＰＱＧＨＳＣＫＱＬＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２４）；
ペプチドＰ５９−Ｃ１ＱＴＮＦ１（ヒト）：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＥＲＣＫＳＨＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２５）；
ペプチドＰ５９−ラット：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＤＨＣＫＳＱＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２６）；
これらペプチドは、ＲＸＦＰ１（ＬＧＲ７）、ＲＸＦＰ２（ＬＧＲ８）、ＲＸＦＰ３およびＲＸＦＰ４からなる群より選択されるリラキシン関連ＧＰＣＲのための、並びに／または、ＬＲＲ（Ａ１０）含有ＧＰＣＲ：ＦＳＨＲ（ＬＧＲ１）、ＬＨＣＧＲ（ＬＧＲ２）、ＴＳＨＲ（ＬＧＲ３）、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰｌ）およびＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）に限定されないがこれらからなる群から選択されるＬＧＲファミリーのＧＰＣＲの、リガンドである。

ある態様においては、本発明は、長さがアミノ酸１００個未満のペプチドを特徴付け、このペプチドは、式Ｉ：
Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−Ｘ^５−Ｘ^６−Ｘ^７−Ｘ^８−Ｘ^９−Ｘ^１０−Ｘ^１１−Ｘ^１２−Ｘ^１３−Ｘ^１４−Ｘ^１５−Ｘ^１６−Ｘ^１７−Ｘ^１８−Ｘ^１９−Ｘ^２０−Ｘ^２１−Ｘ^２２−Ｘ^２３−Ｘ^２４−Ｘ^２５−Ｘ^２６−Ｘ^２７−Ｘ^２８−Ｘ^２９−Ｘ^３０−Ｘ^３１−Ｘ^３２−Ｘ^３３、
Ｘ^１は、存在しないか、Ｇまたは小さな天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２は、存在しないか、Ｑまたは極性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^３は、存在しないか、Ｋまたは塩基性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^４は、存在しないか、Ｇまたは小さな天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^５は、存在しないか、ＱまたはＳ、極性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^６は、存在しないか、ＶまたはＡまたはＰまたはＭまたは疎水性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^７は、存在しないか、Ｇまたは小さな天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^８は、存在しないか、ＰまたはＬまたはＡ、天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^９は、存在しないか、ＰまたはＱ、天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^１０は、存在しないか、Ｇまたは小さな天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^１１は、存在しないか、ＡまたはＨまたはＥまたはＤまたは、疎水性のもしくは小さなもしくは酸性の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１２は、存在しないか、ＡまたはＰまたはＱまたはＳまたはＲまたはＨまたは、疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１３は、存在しないか、ＣまたはＶまたは疎水性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^１４は、存在しないか、ＲまたはＫまたはＱまたはＰまたは、塩基性のもしくは極性の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１５は、存在しないか、ＲまたはＱまたはＳまたは、塩基性のもしくは極性の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１６は、存在しないか、ＡまたはＬまたはＨまたはＱまたは、疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１７は、存在しないか、Ｙまたは、疎水性のもしくは芳香族の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１８は、存在しないか、Ａまたは、疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１９は、存在しないか、Ａまたは疎水性の小さな天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２０は、存在しないか、Ｆまたは、疎水性のもしくは芳香族の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^２１は、存在しないか、ＳまたはＴまたは極性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２２は、存在しないか、Ｖまたは疎水性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２３は、存在しないか、Ｇまたは疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であるか、またはアミドで置換され；
Ｘ^２４は、存在しないか、Ｒまたは塩基性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２５は、存在しないか、Ｒまたは塩基性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２６は、Ａまたは疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^２７は、Ｙまたは疎水性のもしくは芳香族の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^２８は、Ａまたは疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^２９は、Ａまたは疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^３０は、Ｆまたは疎水性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^３１は、ＳまたはＴまたは極性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^３２は、Ｖまたは疎水性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^３３は、存在しないか、Ｇまたは疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であるか、またはアミドで置換される）
のアミノ酸配列またはその薬剤的に許容可能な塩を含む。

いくつかの実施形態においては、該ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１〜１５および２０〜２６に記載の天然アミノ酸配列と比較して、少なくとも１個または少なくとも２個または少なくとも３個のアミノ酸が異なっている。

いくつかの実施形態においては、本発明のペプチドは、天然アミノ酸配列と実質的に同一の長さのペプチドの活性の少なくとも４分の１、例えば３分の１、２分の１または同じ活性を有する。「実質的に同一の長さ」とは、同じ長さまたは長さの違いが１０％以下であることを意味する。

いくつかの実施形態においては、ペプチドは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）タンパク質に結合する。

いくつかの実施形態においては、ＧＰＣＲタンパク質は、ＲＸＦＰ１（ＬＧＲ７）と、ＲＸＦＰ２（ＬＧＲ８）と、ＲＸＦＰ３と、ＲＸＦＰ４とを含むリラキシン関連ＧＰＣＲからなる群から選択されるリラキシン関連ファミリーのＧＰＣＲタンパク質に属する、および／または、ＬＲＲ（Ａ１０）含有ＧＰＣＲ：ＦＳＨＲ（ＬＧＲ１）、ＬＨＣＧＲ（ＬＧＲ２）、ＴＳＨＲ（ＬＧＲ３）、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰｌ）およびＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）に限定されないがこれらからなる群から選択されるＬＧＲファミリーのＧＰＣＲのＧＰＣＲタンパク質である。

いくつかの実施形態においては、ペプチドは、ＬＧ７Ｒ７および／またはＬＧＲ８を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞中で、フォルスコリンが媒介するｃＡＭＰレベルの上昇を阻害する。

いくつかの実施形態においては、ペプチドは、細胞から単離された天然タンパク質の分解産物である。他の実施形態においては、ペプチドは、細胞中で組み換え生産されたタンパク質から単離される。該細胞は、例えば、原核細胞または真核細胞であり得る。

いくつかの実施形態においては、ペプチドは、インビトロで化学合成される。所望により、ペプチドをビオチン部分に共役結合させて提供することができる。いくつかの実施形態においては、ペプチドはジスルフィド結合を含む。

ペプチドは、直鎖ペプチドまたは環状ペプチドとして提供することができる。いくつかの実施形態においては、ペプチドは環状ラクタムである。いくつかの実施形態においては、ペプチドは分岐ペプチドである。

いくつかの実施形態においては、ペプチドは、例えばセリン、トレオニン、またはチロシン残基においてリン酸化される。

いくつかの実施形態においては、ペプチドＰ５９配列またはペプチドＰ７３配列中のシステイン残基が、第二のアミノ酸、例えば、二量化を抑制するもので置換される。適切なアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、アラニンおよびバリンが含まれる。

いくつかの実施形態においては、ペプチドはそのアミノ末端で修飾されている。アミノ末端修飾の例には、Ｎ‐糖化、Ｎ‐アルキル化、Ｎ‐アセチル化またはＮ‐アシル化アミノ酸が含まれる。

いくつかの実施形態においては、ペプチドがＰＥＧ化されている。

いくつかの実施形態においては、ペプチドは、Ｃ‐末端アミド化アミノ酸を含む。他の実施形態においては、ペプチドはそのカルボキシ末端にアミド化アミノ酸を含まない。

いくつかの実施形態においては、天然アミノ酸は、オメガ‐アミノ酸、例えばベータ‐アラニン（ｂｅｔａ‐Ａｌａ）、または３‐アミノプロピオン酸（３‐ａＰ）である。

いくつかの実施形態においては、ペプチドは小さな非天然アミノ酸、例えば、サルコシン（Ｓａｒ）、β‐アラニン（β‐Ａｌａ）、２，３‐ジアミノプロピオン酸（２，３‐ｄｉａＰ）またはアルファ‐アミノ酪酸（Ａｉｂ）；オメガ酸ベータ‐アラニン（ｂｅｔａ‐Ａｌａ）または３‐アミノプロピオン酸（３‐ａＰ）を含む。

いくつかの実施形態においては、ペプチドは疎水性の非天然アミノ酸、例えばｔ‐ブチルアラニン（ｔ‐ＢｕＡ）、ｔ‐ブチルグリシン（ｔ‐ＢｕＧ）、Ｎ‐メチルイソロイシン（Ｎ‐ＭｅＩｌｅ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチルバリン（Ｍｖｌ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ＮａＩ、β２‐チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、２−ナフチルアラニン（２‐ＮａＩ）または１，２，３，４‐テトラヒドロイソキノリン‐３カルボン酸（Ｔｉｃ）を含む。

いくつかの実施形態においては、ペプチドは塩基性の非天然アミノ酸、例えばオルニチン（Ｏｒｍ）またはホモアルギニン（Ｈａｒ）を含む。

いくつかの実施形態においては、ペプチドは中性で極性の非天然アミノ酸、例えば、シトルリン（Ｃｉｔ）、アセチルリシン（Ａｃｅｔｙｌ Ｌｙｓ）またはメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）を含む。

いくつかの実施形態においては、ペプチドのアミノ酸の数は、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６または５未満である。

ペプチドを修飾して、１つ以上の修飾を含ませることができる。したがって、いくつかの実施形態においては、Ｃ末端がアミド化され、内部システインが上記式Ｉ中の１３番目（Ｃ１３Ｖ）においてバリンで置換される。他の実施形態においては、両方の修飾が存在する：
ペプチドＰ−５９Ｓ（アミド）：ＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：１）；
ペプチドＰ−５９Ｓ（遊離酸）：ＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：２）；
ペプチドＰ５９−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：３）；
ペプチドＰ５９（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：４）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：５）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：６）；
ペプチドＰ７４−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶアミド（配列番号：７）；
ペプチドＰ７４（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：８）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶアミド（配列番号：９）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：１０）；
ペプチドＰ５９ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１１）；
ペプチドＰ５９−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１２）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１３）；
ペプチドＰ７４−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１４）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１５）；
ペプチドＰ５９−チンパンジー：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２０）；
ペプチドＰ５９−オランウータン：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２１）；
ペプチドＰ５９−アカゲザル：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２２）；
ペプチドＰ５９−雌ウシ：ＧＱＫＧＱＡＧＬＰＧＡＱＣＰＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２３）；
ペプチドＰ５９−ニワトリ：ＧＱＫＧＱＰＧＰＱＧＨＳＣＫＱＬＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２４）；
ペプチドＰ５９−Ｃ１ＱＴＮＦｌ１（ヒト）：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＥＲＣＫＳＨＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２５）；
ペプチドＰ５９−ラット：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＤＨＣＫＳＱＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２６）。

別の一実施形態において、本発明は前述のペプチドのいずれか１つを含み、ここで該ペプチドは第二のペプチドかポリペプチドに接合もしくは融合され、ここで該第二のペプチドかポリペプチドは多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）であってよく、またはここで、該第二のペプチドかポリペプチドは免疫グロブリンの一部を含み、またはここで、該第二のペプチドかポリペプチドはアルブミンもしくはアルブミンの一部を含む。

別の一実施形態において、本発明は前述のペプチドのいずれか１つを含み、ここで該第二のペプチドまたはポリペプチドはシグナル配列を含む。

別の一実施形態において、本発明は前述のペプチドのいずれか１つを含み、ここでシグナル配列は、ＭＡＡＰＡＬＬＬＬＡＬＬＬＰＶＧＡ（配列番号：１１）；ＭＡＡＰＡＬＬＬＬＡＬＬＬＰＶＧＡＷＰ（配列番号：１２）；またはＭＡＡＰＡＬＬＬＬＡＬＬＬＰＶＧＡＷＰＧＬＰ（配列番号：１３）を含む。

別の一実施形態において、本発明は前述のペプチドのいずれか１つおよび薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物を含む。

別の一実施形態において、本発明は前述のペプチドのいずれか１つの断片を含み、ここで該ペプチド断片はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）タンパク質に結合またはこれを活性化し、ここで該ＧＰＣＲタンパク質は、ＲＸＦＰ１（ＬＧＲ７）、ＲＸＦＰ２（ＬＧＲ８）、ＲＸＦＰ３およびＲＸＦＰ４を含むリラキシン関連ＧＰＣＲからなる群から選択されるタンパク質のファミリー、並びに／または、ＬＲＲ（Ａ１０）含有ＧＰＣＲ：ＦＳＨＲ（ＬＧＲ１）、ＬＨＣＧＲ（ＬＧＲ２）、ＴＳＨＲ（ＬＧＲ３）、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＧＲ７およびＬＧＲ８に限定されないがこれらからなる群から選択されるＬＧＲファミリーのＧＰＣＲに属する。

別の一実施形態において、本発明は前述のペプチドのいずれか１つ、変異体、相同体、オルソログまたはそれらの誘導体をコードする精製された核酸配列を含む。

別の一実施形態において、本発明は治療に有効な量の式Ｉのペプチドを対象に投与することを含む方法であって、リラキシン関連ＧＰＣＲおよび／またはＧＰＣＲ受容体もしくはＬＧＲファミリーの受容体の調節や活性化が効果的かつ／または治療上価値がある、疾患の治療方法を含む。疾患は、以下に限定されないが、過形成性疾患；新生物疾患；癌；線維症（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）；コラーゲン沈着の疾患；繊維分解（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）；結合組織の再構成（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）；無制御の（ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）もしくは異常なコラーゲンやフィブロネクチンの形成または分解；創傷治癒や瘢痕（ｓｃａｒｒｉｎｇ）を含む皮膚損傷；強皮症；女性生殖障害、男性および女性不妊症、潜在停留睾丸症（ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄｉｓｍ）、精子形成および性腺下降を含む生殖発達の非制御（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）；子癇前症や陣痛の合併症等の妊娠に付随する状態；血管新生に関連する疾患；循環器疾患；血管拡張；血管収縮または高血圧症；内皮の機能不全および血管疾患；うっ血性心不全；冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）；虚血および虚血再潅流障害；末梢血管疾患；動脈硬化または腎臓毛細血管のその他狭窄に付随する腎臓病；眼内または末梢指節、盲腸間膜、肺および末梢脈管構造における等の体内毛細血管の狭窄（ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ｎａｒｒｏｗｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｄｙ）；ＣＮＳに関連する疾患；神経障害；認知および記憶に関連する徴候（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ） ；うつ病；神経学的改変（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍、自己免疫疾患等の炎症性疾患；ウイルス感染並びに線維症および肝硬変を含む感染に関連する疾病に付随する炎症状態；レイノー病；レイノー現象；骨粗鬆症を含む骨に関連する状態；摂食および水分摂取を含む代謝異常、糖尿病、肥満；喘息、ＣＯＰＤ、気管支疾患、肺疾患、嚢胞性線維症、ＡＲＤＳ、ＳＡＲＳを含む呼吸器疾患または肺疾患から選択される。

別の一実施形態において、本発明は高血圧症およびその合併症を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該高血圧症に付随する疾患は、高血圧症並びに、高血圧性心疾患；抗高血圧症（ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）（血圧降下）；全身性と肺性高血圧；脳血管疾患と脳卒中；心不全と心発作；左心室肥大（ＬＶＨ）；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；高血圧症、高血圧；血管拡張；腎性高血圧症；利尿；腎炎；ナトリウム利尿；強皮症；腎発症；狭心症（安定および不安定狭心症）；心筋梗塞；心臓発作；冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）；冠状動脈性心疾患；不整脈；心房細動；門脈圧亢進症；眼圧上昇（ｒａｉｓｅｄ ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）；脈管再狭窄；慢性高血圧症；弁膜症；心筋虚血；急性肺水腫；急性冠動脈症候群；高血圧性網膜症；高血圧性悪阻；子癇前症；レイノー現象；勃起不全および緑内障を含むがこれらに限定されない高血圧症の合併症、からなる群から選択される。これらペプチドはまた、血管拡張薬としておよび抗血栓療法にて使用される。

別の一実施形態において、本発明は循環器病およびそれらの合併症を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該循環器疾患は、心筋梗塞；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心筋障害；心筋肥大；虚血性心筋症；収縮期心不全；拡張期心不全；心発作；血栓性梗塞（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｓｔｒｏｋｅ）；求心性左心室肥大；心筋炎；心筋症；肥大型心筋症；心筋炎；非代償性心不全；虚血性心筋症；先天性心疾患；狭心症；心筋梗塞後の心臓再構成（ｈｅａｒｔ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）もしくは心室再構成（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）；虚血および虚血後現象（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｎｄ ｐｏｓｔ−ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｖｅｎｔ）（例えば、心筋梗塞）における虚血再潅流障害；脳血管障害；僧帽弁逆流（ｍｉｔｒａｌ ｖａｌｖｅ ｒｅｇｕｒｇｉｔａｔｉｏｎ）；高血圧症；低血圧症；再狭窄；線維症；血栓症；または血小板凝集を含むがこれらに限定されない末梢血管疾患および冠状動脈疾患からなる群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は炎症後または虚血再潅流障害後の組織再構成を伴う線維症を対象において治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該線維症は心内膜心筋線維症および心臓線維症；縦隔線維症；特発性肺線維症；肺線維症；後腹膜線維症；脾臓の線維症；膵臓の線維症；アルコール関連および非アルコール関連（ＨＡＶ，ＨＢＶおよびＨＣＶ等のウイルス感染を含む）肝線維症（肝硬変）；線維腫症；肉芽腫性肺疾患；糸球体腎炎；心筋梗塞後の心筋瘢痕（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｃａｒｒｉｎｇ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）；子宮内膜線維症および子宮内膜症；損傷（ｉｎｊｕｒｙ）または外科的処置による創傷の治癒；並びに糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）に関連する創傷線維症（ｗｏｕｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を含むがこれらに限定されない、炎症後または虚血再潅流障害後の組織再構成を伴う線維症からなる群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は対象において内皮の機能不全疾患を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該内皮の機能不全疾患は循環器病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、血栓症、心筋梗塞、心不全、腎臓病、多代謝異常症候群（ｐｌｕｒｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、勃起不全、脈管炎および中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患からなる群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は呼吸器疾患を対象において治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該呼吸器疾患は喘息、気管支疾患、肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、線維症に関連する喘息および嚢胞性線維症からなる群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は皮膚損傷もしくは組織修復（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐａｉｒ）を予防または治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該皮膚損傷は、真皮再建（ｄｅｒｍａｌ ｒｅｐａｉｒ）、創傷治癒、火傷、紅斑、外傷、外科的処置後の創傷治癒；乾癬、狼瘡およびカポジ肉腫を含むがこれらに限定されない状態に誘導される外傷を含む皮膚または組織の外傷；強皮症；並びに皮膚のコラーゲン性疾患および皮膚腫瘍に限定されないがこれらを含む群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は泌尿生殖器疾患または泌尿生殖器‐泌尿器科疾患を対象において治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該泌尿生殖器疾患または泌尿生殖器−泌尿器科疾患は、腎臓病；膀胱疾患；生殖器系の疾患；婦人科疾患；尿路疾患；失調症；男性生殖器系（精子形成や精子運動性）および女性生殖器系の疾患；性機能障害；勃起不全；胚形成；並びに妊娠に付随する状態に含むがこれらに限定されない泌尿生殖器疾患または泌尿生殖器−泌尿器科疾患から選択される。これらは妊娠のモニタリングでも使用される。本明細書で使用の通り、「妊娠に付随する状態」なる語は、受精、妊娠、分娩および泌乳の状態を含むがこれらに限定されない。別の一実施形態において、本発明は、例えば配列番号：６〜７、９〜１６、１８〜２５、２７〜３１に描写されるペプチド等の、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドを使用することを含み、ここで該妊娠に関連する疾患は、異常な子宮内膜血管新生；胎盤発達欠損（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）；子宮頚管の成熟（ｒｉｐｅｎｉｎｇ）（軟化）；異常な着床；乳頭の発達および機能障害；妊娠に関連する子宮組織の再構成；子宮内膜症；子癇前症；乳汁分泌障害；エストロゲンおよび非エストロゲンに関連するホルモン障害；早期出産；過期出産並びに分娩合併症からなる群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は癌または癌に付随する炎症の患者を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該癌は大腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、膵癌、卵巣癌、腎臓癌、精巣癌、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）または肝臓癌（ＨＢＶ／ＨＣＶ関連もしくは非関連）を含むがこれらに限定されない固形癌からなる群から選択される。あるいは該癌は、黒色腫、神経膠腫、肉腫、白血病またはリンパ腫であり得る。これらペプチドは、浸潤癌もしくは転移癌の予防または治療にも有用である。

別の一実施形態において、本発明は骨以上および骨に関連する異常の患者を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該骨疾患は骨粗鬆症；変形性関節症；大理石骨病；骨不整合（ｂｏｎｅ ｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）；骨肉腫；および骨への癌転移に限定されないがこれらを含む群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は代謝異常および代謝に関連する異常の患者を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、該代謝異常は糖尿病、糖尿病症（ｄｉａｂｅｔｉｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、リポジストロフィ、甲状腺機能亢進症、緑内障、高脂血症、インスリン非依存性糖尿病、摂食、水分摂取、摂食および飲水行動、食欲不振症（ａｎｏｒｅｘｉａ）、悪液質（癌関連および非癌関連）、脂肪および脂質代謝、活力コントロール（Ｅｎｅｒｇｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）、食欲制御並びに肥満に限定されないがこれらからなる群から選択される。

別の一実施形態において、本発明はＣＮＳおよび認知障害の患者を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該ＣＮＳおよび認知障害は、中枢神経および末梢神経の変性神経障害；神経保護；認知障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）、不安障害、疼痛管理、摂食、行動障害、学習障害、睡眠障害、記憶障害、麻酔に対する病理学的応答（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、嗜癖、うつ病、片頭痛、月経異常、筋痙攣、アヘン剤依存、痴呆、アルツハイマー病；パーキンソン病、皮質機能、歩行活動、アルコールおよび薬物嗜癖並びに乱用、記憶減損（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｍｅｍｏｒｙ）；摂食と飲水に関連する行動、ストレス管理、双極性障害；精神分裂病；分裂情動障害；多発性硬化症（ＭＳ）；脳卒中および脳卒中損傷の修復（ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ ｄａｍａｇｅ ｒｅｐａｉｒ）（虚血保護）；脳内での脈管構造形成および脈管構造再形成（ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｒｅ−ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ）；並びに脳組織再生および末梢神経系障害に限定されないがこれらを含む群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は患者の臓器および組織における虚血並びに虚血後事象に付随する虚血再潅流障害を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで臓器および組織疾患における虚血並びに虚血後事象に付随する該虚血再潅流障害は、血栓性梗塞（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｓｔｒｏｋｅ）；心筋梗塞；狭心症；塞栓性脈管閉塞；末梢血管機能不全；内臓動脈閉塞；血栓または塞栓症による動脈閉塞；腸間膜血流（ｌｏｗ ｍｅｓｅｎｔｒｉｃ ｆｌｏｗ）または敗血症後等の非閉塞性プロセスによる動脈閉塞；腸間膜動脈閉塞；腸間膜静脈閉塞；腸間膜微小循環への虚血再潅流障害；虚血性急性腎不全；大脳組織への虚血再潅流障害；腸管重積症（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｏｎ）；血流力学的ショック；組織機能障害；臓器不全；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；血栓症；血小板凝集に限定されないがこれらを含む群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は患者における心臓手術；臓器手術；臓器移植；血管造影；心肺および脳蘇生（ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ）等の処置に限定されないがこれらを含む状態後の虚血再潅流障害を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は感染、例えば細菌感染またはウイルス感染に付随する炎症状態の患者を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで感染に付随する該炎症状態は、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）もしくはＨＦＶ−２、後天性免疫不全（ＡＩＤＳ）、ウエストナイル脳炎ウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、ＨＣＶ、ＨＢＶまたはＨＡＶによるウイルス感染；出血熱；耳化学的感染症（ｏｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）；敗血症および副鼻腔炎に限定されないがこれらを含む群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は腎臓病の患者を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該腎臓病は以下に限定されないが、糖尿病性ネフロパチー；糸球体硬化症；腎症；腎臓機能障害；強皮症；腎発症および慢性腎不全から選択される。

別の一実施形態において、本発明は血管新生に関連する状態の患者を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該血管新生に関連する状態は、糖尿病、未熟児網膜症および加齢性黄斑変性等の多数のヒト眼疾患における網膜血管新生、または、前立腺癌、脳癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮頚部癌、黒色腫、軟部組織肉腫、リンパ腫、頭頚部癌およびグリア芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）を含むがこれらに限定されない原発性癌もしくは転移性癌における癌関連血管新生からなる群から選択される。

別の一実施形態において、本発明は炎症性疾患の患者を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該炎症性疾患は、胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍、慢性気管支炎、喘息、アレルギー、急性肺損傷、肺炎症、気道過敏性、脈管炎、敗血症性ショック並びに乾癬、アトピー性皮膚炎および湿疹を含むがこれらに限定されない炎症性皮膚疾患から選択されるが、これらに限定されない。

別の一実施形態において、本発明は自己免疫疾患の患者を治療する方法を含み、該方法は、治療に有効な量の式Ｉで表わされる前述のペプチドのいずれか１つを、治療を必要とする対象に投与することを含む。別の一実施形態において、本発明は前述の方法を含み、ここで該自己免疫疾患が多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植拒絶反応、グラフト移植拒絶反応（ｇｒａｆｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）に付随する免疫障害、良性リンパ性腸管炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーブズ病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存性糖尿病症、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性作用肝炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｓ ｃｏｌｉｔｉｓ）、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、炎症性リウマチ、変性リウマチ、関節外リウマチ、膠原病、慢性多発性関節炎、関節症性乾癬、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、肩関節周囲炎（ｐｅｒｉａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｈｕｍｅｒｏｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）、結節性多発動脈炎（ｐａｎａｒｔｅｒｉｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、進行性全身性強皮症、尿酸塩性関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｕｒａｔｉｃａ）、皮膚筋炎、筋肉リウマチ、筋炎、筋硬症および軟骨石灰化症から選択されるが、これらに限定されない。

別の一実施形態において、本発明は本発明のペプチド配列をコードするｃＤＮＡを含み、これは遺伝子治療に使用できる。所望により、遺伝子治療を使用して本発明のペプチドを対象に送達することができる。該ペプチドをコードする核酸をベクターに挿入することができ、これらベクターをその後遺伝子治療ベクターとして使用する。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈注射、局所投与または定位注射によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、遺伝子治療ベクターを許容可能な希釈剤中で含むことができ、または遺伝子送達ビヒクルが包埋される緩効性マトリックス（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ ｍａｔｒｉｘ）を含むことができる。代わりに、完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターが無傷で組み換え細胞から生産できる場合、該医薬製剤は遺伝子送達系を生産する１つ以上の細胞を含むことができる。

別の一実施形態において本発明は、本発明のペプチドの１つ以上を別の治療薬または薬剤との組み合わせで使用する併用療法を含む。本明細書で使用の通り、「併用療法」なる語は、２種類以上の治療薬の同時使用を伴う単一の状態または疾患の治療に関する。

別の一実施形態において、本発明は前述のペプチドのいずれか１つにおけるエピトープに選択的に結合する抗体を含む。

更なる態様において、本発明は式Ｉのペプチド中のエピトープに選択的に結合する抗体を含む。

いくつかの実施形態においては、該抗体は、以下の配列に選択的に結合および／または産生される：
ペプチドＰ−５９Ｓ−アミド（アミド）：ＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：１）；
ペプチドＰ−５９Ｓ（遊離酸）：ＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：２）；
ペプチドＰ５９−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：３）；
ペプチドＰ５９（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：４）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：５）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：６）；
ペプチドＰ７４−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶアミド（配列番号：７）；
ペプチドＰ７４（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：８）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶアミド（配列番号：９）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：１０）；
ペプチドＰ５９ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１１）；
ペプチドＰ５９−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１２）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１３）；
ペプチドＰ７４−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１４）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１５）；
ペプチドＰ５９−チンパンジー：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２０）；
ペプチドＰ５９−オランウータン：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２１）；
ペプチドＰ５９−アカゲザル：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２２）；
ペプチドＰ５９−雌ウシ：ＧＱＫＧＱＡＧＬＰＧＡＱＣＰＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２３）；
ペプチドＰ５９−ニワトリ：ＧＱＫＧＱＰＧＰＱＧＨＳＣＫＱＬＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２４）；
ペプチドＰ５９−Ｃ１ＱＴＮＦ１（ヒト）：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＥＲＣＫＳＨＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２５）；
ペプチドＰ５９−ラット：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＤＨＣＫＳＱＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２６）。

別の一実施形態において、本発明は前述の抗体のいずれか１つを含み、ここで該抗体はモノクローナル抗体である。

別の一実施形態において、本発明は前述の抗体のいずれか１つを含み、ここで該抗体は検出可能な標識、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識もしくは治療薬に接合または共役結合される。

特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有するものである。本明細書に記載の方法や材料に類似または同等の方法や材料を実際に使用したり本発明の試験に使用したりできるが、好適な方法および材料は以下に記載されるものである。本明細書で言及する出版物、特許出願、特許およびその他の参考文献の全てが、その全体で参照により組み入れられるものとする。矛盾が生じた場合は、種々の定義を含む本明細書が優先するであろう。更に、材料、方法および実施例は例証の目的のみであり、いかなる限定を意図するものではない。

本発明の上記以外の特徴や利点は、以下の詳細な説明や請求項から明らかになるであろう。

図１は、ＬＧＲ７およびＬＧＲ８を一過性にトランスフェクトされ、フォルスコリンで処理されたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）のＧｉ（ｃＡＭＰ阻害）効果を示す図である。

図２は、ＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）を一過性にトランスフェクトされ、２０μＭのフォルスコリンで前処理されたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）およびＩＮＳＬ３の１μＭないし１０μＭ濃度でのＧｉ（ｃＡＭＰ阻害）用量反応曲線を示す図である。

図３Ａは、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、およびＬＧＲ６をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、無処置またはＨＣＧ（コントロール）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）それぞれによる処置後のＧｓ（ｃＡＭＰ増加）を示すグラフである。

図３Ｂは、ＬＧＲ５をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における２０μＭのフォルスコリンでの前処理に続く、無処置またはＨＣＧ（コントロール）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）それぞれによる処置後のＧｉ（ｃＡＭＰ阻害）アッセイを示すグラフである。

図３Ｃは、ＬＧＲ４をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における２０μＭのフォルスコリンでの前処理に続く、無処置またはＨＣＧ（コントロール）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）それぞれによる処置後のＧｉ（ｃＡＭＰ阻害）アッセイを示すグラフである。

図４Ａは、ＬＧＲ７を一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、２０μＭのフォルスコリンでの前処理および増加性（１ｎＭ〜１０μＭ）の量のＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）またはリラキシンによる処理後のｃＡＭＰ用量反応性活性化を示すグラフである。

図４Ｂは、ＬＧＲ７を一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、低濃度（１〜１００ｎＭ）のＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）またはリラキシンによる処理後のＧｓ（ｃＡＭＰ増加）用量反応性活性化を示すグラフである。

図５は、ＲＸＦＰ３受容体（Ｃａｔ：Ｄ８８４３７、アッセイｃａｔ：ＥＳ−６５６−ＭＧ）を発現するＥｕｒｏｓｃｒｅｅｎ組み換え細胞株の、Ｇｓ（ｃＡＭＰ増加）用量反応性活性化を示すグラフである。ｃＡＭＰの用量反応性をリラキシン３（陽性コントロール）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）の間で、リラキシン３は１ｐＭ〜１μＭ、およびＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）は１ｎＭ〜１０μＭの濃度において比較した。

図６Ａ−Ｂは、ＬＧＲ８を発現するＨＥＫ２９３細胞の、ＩＮＳＬ３（陽性コントロールとして）、およびペプチドＰ５９−ＳアミドおよびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（図６Ａ）；またはＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（Ｐ５９−アミド）（図６Ｂ）による刺激に対する反応における、ｃＡＭＰ反応性エレメント（ＣＲＥ）読み取りを示すグラフである。Ｘ軸はペプチド濃度（対数）を表し、Ｙ軸はＩＮＳＬ３の最大活性に対するＣＲＥ活性化を示す（％において）。

図７Ａ−Ｂは、ＬＧＲ７を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の、５μＭフォルスコリンによる前処理、および陽性コントロールとしてのＨ２リラキシン（Ｈ２）とこれに比較したペプチドＰ５９−ＳアミドおよびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（図７Ａ）；または、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（Ｐ５９−アミド）（図７Ｂ）による刺激に対する反応における、ｃＡＭＰ反応性エレメント（ＣＲＥ）読み取りを示すグラフである。Ｘ軸はペプチド濃度（対数）、およびＹ軸はベースラインのフォルスコリン活性に対するＣＲＥ活性化を示す（ペプチドでの無処置を１００％とした％において）。このグラフは別々の３実験の平均の結果である（Ｎ＝３）。

図８Ａ−Ｂは、ＬＧＲ８を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の、５μＭフォルスコリンによる前処理、および陽性コントロールとしてのＩＮＳＬ３とこれに比較したペプチドＰ５９−ＳアミドおよびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（図８Ａ）；または、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（Ｐ５９−アミド）（図８Ｂ）による刺激に対する反応における、ｃＡＭＰ反応性エレメント（ＣＲＥ）読み取りを示すグラフである。Ｘ軸はペプチド濃度（対数）、およびＹ軸はベースラインのフォルスコリン活性に対するＣＲＥ活性化を示す（ペプチドでの無処置を１００％とした％において）。このグラフは別々の３実験の平均の結果である（Ｎ＝３）。

図９は、ＬＧＲ７の、ユーロピウム（放射性）結合リラキシン（Ｈ２）と、非放射性Ｈ２リラキシンならびに各ペプチド：Ｐ５９−Ｓ−アミド、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（Ｐ５９−アミド）のいずれかとの間の競合的結合を示すグラフである。Ｘ軸はペプチド濃度（対数）、およびＹ軸は放射活性（％）で表される特異的結合を表す。

図１０は、ＬＧＲ８の、ユーロピウム（放射性）結合ＩＮＳＬ３と、非放射性ＩＮＳＬ３ならびに各ペプチド：Ｐ５９−Ｓ−アミド、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（Ｐ５９−アミド）のいずれかとの間の競合的結合を示すグラフである。Ｘ軸はペプチド濃度（対数）、およびＹ軸は放射活性（％）で表される特異的結合を表す。

図１１は、トランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｋ１細胞における、Ｈ２リラキシン（１μＭ）、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４−１０μＭ）、０．１％ＢＳＡ（陰性コントロールとして）、および１μＭのカルシトニン（ＣＨＯ−Ｋ１細胞に内因的に発現するＧＰＣＲであるＣａｌｃＲのリガンド。陽性内部コントロールとして。）の細胞インピーダンスおよび細胞骨格再構築効果（ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより測定）を示すグラフである。Ｘ軸は実験時間（負荷時間を垂線で示す）を示し、Ｙ軸はペプチドの負荷時間に対して標準化された細胞指数（細胞インピーダンスにおける変化の測定）を示す。コードは以下の通りである：丸は１μＭのカルシトニンを表し；短い横線は１μＭのＨ２を表し；四角は１０μＭのＰ７４を表し；かつダイアモンド形は０．１％のＢＳＡを表す。

図１２は、ＧＰＲ３９（リラキシンに関連しないＧＰＣＲ）をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、Ｈ２リラキシン（１μＭ）、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４−１０μＭ）、０．１％ＢＳＡ（陰性コントロールとして）、および１μＭのカルシトニン（ＣＨＯ−Ｋ１細胞に内因的に発現するＧＰＣＲであるＣａｌｃＲのリガンド、陽性内部コントロールとして）の細胞インピーダンスおよび細胞骨格再構築効果（ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより測定）を示すグラフである。Ｘ軸は実験時間（負荷時間を垂線で示す）を示し、Ｙ軸はペプチドの負荷時間に対して標準化された細胞指数（細胞インピーダンスにおける変化の測定）を示す。コードは以下の通りである：丸は１μＭのカルシトニンを表し；ダイアモンド形は１０μＭのＰ７４を表し；かつ短い横線は０．１％のＢＳＡを表す。

図１３は、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、Ｈ２リラキシン（１μＭ）、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４−１０μＭ）、０．１％ＢＳＡ（陰性コントロールとして）、および１μＭのカルシトニン（ＣＨＯ−Ｋ１細胞に内因的に発現するＧＰＣＲであるＣａｌｃＲのリガンド、陽性内部コントロールとして）の細胞インピーダンスおよび細胞骨格再構築効果（ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより測定）を示すグラフである。Ｘ軸は実験時間（負荷時間を垂線で示す）を示し、Ｙ軸はペプチドの負荷時間に対して標準化された細胞指数（細胞インピーダンスにおける変化の測定）を示す。コードは以下の通りである：ダイアモンド形は１０μＭのＰ７４を表し；丸は１μＭのＨ２を表し；短い横線は１μＭのカルシトニンを表し；かつ四角は０．１％のＢＳＡを表す。

図１４は、ＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、Ｈ２リラキシン（１μＭ）、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４−１０μＭ）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）．０．１％ＢＳＡ（陰性コントロールとして）、および１μＭのカルシトニン（ＣＨＯ−Ｋ１細胞に内因的に発現するＧＰＣＲであるＣａｌｃＲのリガンド、陽性内部コントロールとして）の細胞インピーダンスおよび細胞骨格再構築効果（ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより測定）を示すグラフである。Ｘ軸は実験時間（負荷時間を垂線で示す）を示し、Ｙ軸はペプチドの負荷時間に対して標準化された細胞指数（細胞インピーダンスにおける変化の測定）を示す。コードは以下の通りである：ダイアモンド形は１μＭのＰ５９を表し；丸は１μＭのＨ２を表し；短い横線は１μＭのカルシトニンを表し；四角は１０μＭのＰ７４を表し；かつ三角は０．１％のＢＳＡを表す。

図１５は、ＬＧＲ４（オーファン）をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、Ｈ２リラキシン（１μＭ）、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４−１０μＭ）、０．１％ＢＳＡ（陰性コントロールとして）、および１μＭのカルシトニン（ＣＨＯ−Ｋ１細胞に内因的に発現するＧＰＣＲであるＣａｌｃＲのリガンド、陽性内部コントロールとして）の細胞インピーダンスおよび細胞骨格再構築効果（ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより測定）を示すグラフである。Ｘ軸は実験時間（負荷時間を垂線で示す）を示し、Ｙ軸はペプチドの負荷時間に対して標準化された細胞指数（細胞インピーダンスにおける変化の測定）を示す。コードは以下の通りである：丸は１０μＭのＰ７４を表し；ダイアモンド形は１μＭのＨ２を表し；四角は１μＭのカルシトニンを表し；かつ短い横線は０．１％のＢＳＡを表す。

図１６Ａ−Ｂは、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、異なる濃度のＨ２リラキシンの用量依存性反応としての細胞インピーダンスおよび細胞骨格再構築効果（ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより測定）を示すグラフである。図１６Ａ：Ｘ軸は実験時間（負荷時間を垂線で示す）を示し、Ｙ軸はペプチドの負荷時間（左の垂線により示す）に対して標準化された細胞指数（細胞インピーダンスにおける変化の測定）を示す。各線は異なる濃度（図の説明文による）を示す。 図１６Ｂ：図１６Ａの結果に従ってＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより算出した用量反応曲線。Ｘ軸はペプチド濃度をモル濃度の対数で示す。Ｙ軸は実験終了時の標準化された細胞指数（図１６Ａの右の垂線により示す）を示す。図１６Ａのコードは以下の通りである：黒丸；三角；四角；ダイアモンド形；白丸；および横線はそれぞれ、０．１６ｎＭ；０．８ｎＭ；４ｎＭ；２０ｎＭ；１００ｎＭ；および５００ｎＭを示す。

図１７Ａ−Ｂは、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、異なる濃度のＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）の用量依存性反応としての細胞インピーダンスおよび細胞骨格再構築効果（ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより測定）を示すグラフである。図１７Ａ：Ｘ軸は実験時間（負荷時間を垂線で示す）を示し、Ｙ軸はペプチドの負荷時間（左の垂線により示す）に対して標準化された細胞指数（細胞インピーダンスにおける変化の測定）を示す。各線は異なる濃度（図の説明文による）を示す。 図１７Ｂ：図１７Ａの結果に従ってＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより算出した用量反応曲線。Ｘ軸はペプチド濃度をモル濃度の対数で示す。Ｙ軸は実験終了時の標準化された細胞指数（図１７Ａの右の垂線により示す）を示す。図１７Ａのコードは以下の通りである：黒丸；三角；四角；ダイアモンド形；白丸；および横線はそれぞれ、４１ｎＭ；１２３ｎＭ；３７０ｎＭ；１．１μＭ；３．３μＭ；および１０μＭを示す。

図１８Ａ−Ｂは、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、異なる濃度のＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）の用量依存性反応としての細胞インピーダンスおよび細胞骨格再構築効果（ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより測定）を示すグラフである。図１８Ａ：Ｘ軸は実験時間（負荷時間を垂線で示す）を示し、Ｙ軸はペプチドの負荷時間（左の垂線により示す）に対して標準化された細胞指数（細胞インピーダンスにおける変化の測定）を示す。各線は異なる濃度（図の説明文による）を示す。 図１８Ｂ：図１８Ａの結果に従ってＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより算出した用量反応曲線。Ｘ軸はペプチド濃度をモル濃度の対数で示す。Ｙ軸は実験終了時の標準化された細胞指数（図１８Ａの右の垂線により示す）を示す。図１８Ａのコードは以下の通りである：黒丸；三角；四角；ダイアモンド形；白丸；および横線はそれぞれ、４１ｎＭ；１２３ｎＭ；３７０ｎＭ；１．１μＭ；３．３μＭ；および１０μＭを示す。

図１９Ａ−Ｂは、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）をトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞における、異なる濃度のＰ５９Ｓ−アミドの用量依存性反応としての細胞インピーダンスおよび細胞骨格再構築効果（ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより測定）を示すグラフである。図１８Ａ：Ｘ軸は実験時間（負荷時間を垂線で示す）を示し、Ｙ軸はペプチドの負荷時間（左の垂線により示す）に対して標準化された細胞指数（細胞インピーダンスにおける変化の測定）を示す。各線は異なる濃度（図の説明文による）を示す。 図１９Ｂ：図１９Ａの結果に従ってＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳシステムにより算出した用量反応曲線。Ｘ軸はペプチド濃度をモル濃度の対数で示す。Ｙ軸は実験終了時の標準化された細胞指数（図１９Ａの右の垂線により示す）を示す。図１９Ａのコードは以下の通りである：黒丸；三角；四角；ダイアモンド形；白丸；および横線はそれぞれ、４１ｎＭ；１２３ｎＭ；３７０ｎＭ；１．１μＭ；３．３μＭ；および１０μＭを示す。

図２０は、チンパンジー（配列番号：２０）、オランウータン（配列番号：２１）、アカゲザル（配列番号：２２）、雌ウシ（配列番号：２３）、ニワトリ（配列番号：２４）、およびラット（配列番号：２６）を含む様々な生物由来の相同配列と共に隣接の２塩基（ＫまたはＲ）の切断部位を含む、未変性の前駆体（Ｃ１ＱＴＮＦ８−配列番号：１９）の一部としてのＰ５９−Ｇ（配列番号：１２）配列、およびヒトパラログのＣ１ＱＴＮＦ１（配列番号：２５）からの相当するペプチド配列の複数アラインメントを示す図（全ての配列は２塩基の切断部位を含む）である。Ｎ−末端（４アミノ酸）およびＣ−末端（７アミノ酸）の両方は、全ての種において同等であることがみとめられる。両端の切断部位もまた高度に保存されている（時折ＫのＲによる置換を伴う）。二量化の目的でバリンにより置換された中央のシステイン残基（Ｃ１３）もまた高度に保存されている。

本発明は生物活性ペプチドを提供する。これらのペプチドは特に、以下に考察される様々な徴候および疾患の治療のために有用である。幾つかの実施形態によれば、該ペプチドはＧＰＣＲ受容体のリガンドである。

ここに開示されるペプチドは、ＬＧＲおよびリラキシンファミリーのＧＰＣＲリガンドに関する：
１．ＬＧＲファミリー：ＬＧＲ１（ＦＳＨＲ）、ＬＧＲ２（ＬＨＣＧＲ）、ＬＧＲ３（ＴＳＨＲ）、ＫＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）およびＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）を含むＧＰＣＲを包含する全てのＬＲＲから成る。
２．リラキシン関連ファミリー：ＲＸＦＰ１（ＬＧＲ７）、ＲＸＦＰ２（ＬＧＲ８）、ＲＸＦＰ３（ＧＰＣＲ１３５）およびＲＸＦＰ４（ＧＰＣＲ１４２）を含む全てのリラキシン活性化受容体から成る。

ＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：ＲＸＦＰ２＿ＨＵＭＡＮ）は、リラキシン（Ｈ２およびＨ１）の低親和性受容体である。この受容体の活性は大部分がアデニル酸シクラーゼの刺激およびｃＡＭＰの増加を導くＧタンパク質により仲介されるが、これに限定されない。リガンドの結合はＴＲＫ経路を活性化する。ＬＧＲ８はまた、ライディッヒインスリン様３ペプチド（ＩＮＳＬ３）の高親和性受容体でもある。ＬＧＲ８はＧタンパク質共役受容体１ファミリーに属し、１のＬＤＬ受容体クラスＡドメインおよび１０のＬＲＲ（ロイシンリッチ）反復を含む。ＬＧＲ８は脳、腎臓、筋肉、甲状腺、精巣、胎盤、子宮、卵巣、副腎、前立腺、皮膚、末梢血液細胞、骨髄、骨芽細胞、および心臓に発現する。ＬＧＲ８の欠損は、誕生したヒト男子の２〜５％に関与する最も高頻度の先天性異常の一つであり、障害性の精巣下降としても知られる潜在停留睾丸症の原因である。潜在停留睾丸症は不妊症および精巣癌のリスク増大に関連する。ＬＧＲ８はアルツハイマーのようなＣＮＳ関連疾患に関わる（Ｓｈｅｎ ＰＪ，．ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２００５；１０４１：５１０−５）。リラキシンによる刺激は、インビトロでの細胞増殖、侵襲性、および接着を増大する。リラキシンの阻害は、細胞の侵襲性を９０％まで、増殖を２５％まで減少させ、かつ細胞のアポトーシスを２．２倍まで増加させた（Ｆｅｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００７））。ＬＧＲ８はまた、骨粗鬆症、女性の不妊症、および潜在停留睾丸症に関連しない男性の不妊症にも関する。

ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：ＲＸＦＰ１＿ＨＵＭＡＮ）はリラキシンの受容体である。ＬＧＲ７は全てのヒトリラキシンペプチドに高親和性で結合するが、ＩＮＳＬ３に対しては非常に低親和性である。この受容体の活性は、組織および細胞型により、アデニル酸シクラーゼの刺激およびｃＡＭＰの増加、ならびにアデニル酸シクラーゼの阻害およびｃＡＭＰの減少の両方を導くＧタンパク質により仲介される。リガンドの結合は、ｃＡＭＰを分解するホスホジエステラーゼ活性を阻害するＴＲＫ経路を活性化する。ＬＧＲ７はＧタンパク質共役受容体１ファミリーに属し、１のＬＤＬ受容体クラスＡドメインおよび１０のＬＲＲ（ロイシンリッチ）反復を含む。ＬＧＲ７は脳、肝臓、腎臓、精巣、乳房、胎盤、子宮、子宮内膜、子宮頚部、膣、卵巣、副腎、前立腺、皮膚、破骨細胞、および心臓に発現する。ＬＧＲ７受容体はエストロゲンおよびエストロゲン受容体の活性化により調節される。ＬＧＲ７は、コラーゲン沈着および瘢痕化、着床および子宮頚部熟化を含む妊娠ならびに分娩過程、血管拡張、腫瘍進行および侵襲性、摂食、ならびに骨粗鬆症を含む多数の過程に関与する。

ＬＧＲ４（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：ＬＧＲ４＿ＨＵＭＡＮ；Ｇタンパク質共役受容体４８（ＧＰＲ４８））は、Ｇタンパク質共役受容体１ファミリーに属するオーファン７回膜貫通受容体であり、１５のＬＲＲ（ロイシンリッチ）反復を含む。ＬＧＲ４は複数のステロイド産生組織：胎盤、卵巣、精巣および副腎に発現し、脊髄、甲状腺、胃、気管、心臓、膵臓、腎臓、前立腺および脾臓にもまた発現する。

ＬＧＲ５（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：ＬＧＲ５＿ＨＵＭＡＮ；Ｇタンパク質共役受容体４９；Ｇタンパク質共役受容体６７（ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７））は、Ｇタンパク質共役受容体１ファミリーに属するオーファン７回膜貫通受容体であり、１７のＬＲＲ（ロイシンリッチ）反復を含む。ＬＧＲ５は、特異的な胚組織の増殖および分化を制御するシグナルのために重要な受容体であると予想される［Ｍｏｒｉｔａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４Ｎｏｖ；２４（２２）：９７３６−４３］。

ＬＧＲ６（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：ＬＧＲ６＿ＨＵＭＡＮ）は、Ｇタンパク質共役受容体１ファミリーに属するオーファン７回膜貫通受容体であり、１６のＬＲＲ（ロイシンリッチ）反復を含む。ＬＧＲ６は複数のステロイド産生組織：胎盤、卵巣、精巣および副腎に発現し、脊髄、甲状腺、胃、気管、心臓、膵臓、腎臓、前立腺および脾臓にもまた発現する。

ＧＰＣＲ１３５（ＲＸＦＰ３）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：ＲＬ３Ｒ１＿ＨＵＭＡＮ；リラキシン−３受容体１、ＲＬＮ３受容体１、リラキシンファミリーペプチド受容体３、ソマトスタチン−およびアンジオテンシン−様ペプチド受容体、Ｇタンパク質共役受容体ＳＡＬＰＲ、ＧＰＣＲ１３５）は、リラキシン−３（Ｈ３リラキシン）の受容体である。ＲＸＦＰ３受容体はまた、リラキシン２（Ｈ２リラキシン）に対しても低親和性を持つ。リガンドの結合は、Ｇｉタンパク質との共役によってｃＡＭＰの蓄積を阻害する。この受容体は主に脳領域に発現する。最も高い発現は黒質および下垂体に見られ、海馬、脊髄、扁桃体、尾状核および脳梁がそれに続き、小脳では極めて低いレベルである。末梢組織では、副腎で比較的高レベル、膵臓、唾液腺、胎盤、乳腺および精巣で低レベルである。マウスにおけるこの受容体の欠損、同様にその主要なリガンドであるリラキシン３の減少は、体重および摂食行動の低下の原因となる。

ＧＰＣＲ１４２（ＲＸＦＰ４）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：ＲＬ３Ｒ２＿ＨＵＭＡＮ；リラキシン−３受容体２、リラキシンファミリーペプチド受容体４、Ｇタンパク質共役受容体１００、ＧＰＣＲ１４２）は、ＩＮＳＬ５の受容体である。この受容体はまたリラキシン３、リラキシン２、同様にブラジキニンおよびカリジンによっても活性化される。リガンドの結合は、Ｇｉタンパク質との共役によってｃＡＭＰの蓄積を阻害する。この受容体は、脳、腎臓、精巣、胸腺、胎盤、前立腺、唾液腺、甲状腺および結腸を含む広範囲の組織に発現する。

現在リラキシンリガンドのスーパーファミリーは、比較的高度な配列相同性を有する１０メンバーを含む。これらのファミリーメンバーはインスリン、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ、リラキシン１、２、および３、ならびにインスリン様ホルモンＩＮＳＬ３、４、５、および６を含む。リラキシンスーパーファミリーメンバーは、当該技術分野において十分に記述されている広範囲の生物活性を有する。

リラキシン（主に１および２）の作用は、子宮収縮の阻害能、結合組織再構築の刺激、ならびに子宮頚部および産道組織の軟化の誘導を含む。加えて、リラキシン（１、２）は乳腺および乳頭の成長および分化を増大し、繊維性組織と同様に結合組織の主要な成分の１つであるコラーゲンの分解を誘導する（主に、コラーゲンのようなＥＣＭ成分を分解するＭＭＰタンパク質の誘導、同様にコラーゲン合成のようなＥＣＭを誘導するＴＩＭＰタンパク質の阻害によって）。リラキシンはコラーゲン合成を減少させ、コラゲナーゼの放出を増加させる。機能的な活性のあるリラキシン遺伝子を欠如する雌マウスは、恥骨結合の恥骨間靭帯を弛緩および伸長できず、かつ子に授乳できず、次にリラキシン野生型またはリラキシンへテロ接合の仮親と交雑育成しない限り２４時間以内に死亡した。

リラキシン（１および２）はさらに、腎臓、盲腸間膜、肺および末梢脈管構造において血管を広げる（血管拡張）原因となることが報告されており、これらの組織における血流または灌流量の増大を導く。それはまた心拍数および冠状動脈の血流の増大も刺激し、かつ糸球体濾過率および腎血漿流量の両方も増大させる。リラキシン（１、２）はまた、ヒスタミン放出およびカルシウムの蓄積を阻害、同様に心臓性アナフィラキシーの間に一酸化窒素合成を促進することも見出されてきた。

脳はリラキシンの別の標的組織であり、脳室周囲器官の受容体に結合したペプチドが血圧、摂食および飲水に影響することが示されている。

リラキシン（１、２）はまた、血小板凝集および巨核球によるその放出の抑制にも関係すると考えられ、それ故に凝固疾患に関連する可能性がある。

ＩＮＳＬ３のようなＩＮＳＬペプチドは、精巣の成熟および下降、同様に精子細胞の生存、卵胞の発生および卵母細胞の成熟に関わることが示されている。従って、ＩＮＳＬ３アゴニストおよびアンタゴニストの可能な臨床応用は、受胎能疾患の治療、または受胎能レベルの制御を含む。

ＩＮＳＬ３は、心臓におけるリラキシン活性の制御にも関係すると考えられる。従って、本発明のＩＮＬ３アゴニストは心臓疾病の治療に有用であり得る。さらに、ＩＮＳＬ３の多形性は甲状腺の過形成および新生物疾患であり、これらの病態の病因におけるリラキシンスーパーファミリーメンバーの役割を示唆する。

本発明は式Ｉの範囲内で表される生物活性ペプチドを提供する。
式Ｉは、以下の式の範囲内で表され、式中：
Ｘ^１は、存在しないか、Ｇまたは小さな天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２は、存在しないか、Ｑまたは極性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^３は、存在しないか、Ｋまたは塩基性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^４は、存在しないか、Ｇまたは小さな天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^５は、存在しないか、ＱまたはＳ、極性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^６は、存在しないか、ＶまたはＡまたはＰまたはＭまたは疎水性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^７は、存在しないか、Ｇまたは小さな天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^８は、存在しないか、ＰまたはＬまたはＡ、天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^９は、存在しないか、ＰまたはＱ、天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^１０は、存在しないか、Ｇまたは小さな天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^１１は、存在しないか、ＡまたはＨまたはＥまたはＤまたは、疎水性のもしくは小さなもしくは酸性の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１２は、存在しないか、ＡまたはＰまたはＱまたはＳまたはＲまたはＨまたは、疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１３は、存在しないか、ＣまたはＶまたは疎水性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^１４は、存在しないか、ＲまたはＫまたはＱまたはＰまたは、塩基性のもしくは極性の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１５は、存在しないか、ＲまたはＱまたはＳまたは、塩基性のもしくは極性の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１６は、存在しないか、ＡまたはＬまたはＨまたはＱまたは、疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１７は、存在しないか、Ｙまたは、疎水性のもしくは芳香族の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１８は、存在しないか、Ａまたは、疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^１９は、存在しないか、Ａまたは疎水性の小さな天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２０は、存在しないか、Ｆまたは、疎水性のもしくは芳香族の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^２１は、存在しないか、ＳまたはＴまたは極性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２２は、存在しないか、Ｖまたは疎水性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２３は、存在しないか、Ｇまたは疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であるか、またはアミドで置換され；
Ｘ^２４は、存在しないか、Ｒまたは塩基性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２５は、存在しないか、Ｒまたは塩基性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^２６は、Ａまたは疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^２７は、Ｙまたは疎水性のもしくは芳香族の天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^２８は、Ａまたは疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^２９は、Ａまたは疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であり；
Ｘ^３０は、Ｆまたは疎水性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^３１は、ＳまたはＴまたは極性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^３２は、Ｖまたは疎水性の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
Ｘ^３３は、存在しないか、Ｇまたは疎水性のもしくは小さな天然か非天然のアミノ酸であるか、またはアミドで置換される；
化合物またはその薬剤的に許容可能な塩を含む。

幾つかの実施形態によれば、式Ｉで表されるペプチドは以下のアミノ酸配列：
ペプチドＰ５９−Ｓ−アミド（アミド）：ＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：１）；
ペプチドＰ５９−ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：２）；
ペプチドＰ５９−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：３）；
ペプチドＰ５９（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：４）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：５）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：６）；
ペプチドＰ７４−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：７）；
ペプチドＰ７４（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：８）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：９）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：１０）；
ペプチドＰ５９ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１１）；
ペプチドＰ５９−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１２）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１３）；
ペプチドＰ７４−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１４）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１５）；
ペプチドＰ５９−チンパンジー：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２０）；
ペプチドＰ５９−オランウータン：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２１）；
ペプチドＰ５９−アカゲザル：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２２）；
ペプチドＰ５９−雌ウシ：ＧＱＫＧＱＡＧＬＰＧＡＱＣＰＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２３）；
ペプチドＰ５９−ニワトリ：ＧＱＫＧＱＰＧＰＱＧＨＳＣＫＱＬＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２４）；
ペプチドＰ５９−Ｃ１ＱＴＮＦ１（ヒト）：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＥＲＣＫＳＨＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２５）；
ペプチドＰ５９−ラット：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＤＨＣＫＳＱＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２６）のうちの１を含み、
この配列は、ＲＸＦＰ１（ＬＧＲ７）、ＲＸＦＰ２（ＬＧＲ８）、ＲＸＦＰ３（ＧＰＣＲ１３５）およびＲＸＦＰ４（ＧＰＣＲ１４２）から成る群より選択されるリラキシン関連ＧＰＣＲ；および／またはＬＲＲを含むＧＰＣＲ：ＦＳＨＲ（ＬＧＲ１）、ＬＨＣＧＲ（ＬＧＲ２）、ＴＳＨＲ（ＬＧＲ３）、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）およびＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）から成る群より選択されるがこれらに限定されないＬＧＲファミリーのＧＰＣＲに対するリガンドである。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、同様にここに記述されるアミノ酸配列によるポリペプチドも包含する。

本発明はまた、以下に述べるアミノ酸配列に対し少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはさらに１００％である、これらのポリペプチドの相同体も包含し、これはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを用い、任意にかつ好ましくは以下：ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｏｎ（このオプションはＳｅｇ（タンパク質）プログラムを用いて、反復性または低複雑性の配列をクエリーから選別する）、タンパク質に対するｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘはＢＬＯＳＵＭ６２、ｗｏｒｄ ｓｉｚｅは３、Ｅ値は１０、ｇａｐ ｃｏｓｔは１１、１（初期化および拡張）を含む初期設定パラメーターを用いて決定できる。任意にかつ好ましくは、核酸配列同一性／相同性はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアを用い、好ましくはＤＵＳＴフィルタープログラムの使用を含み、かつ好ましくは１０のＥ値、低複雑性配列の選別、および１１のｗｏｒｄ ｓｉｚｅもまた含む、初期設定パラメーターを用いて決定される。最後に本発明は、上記のポリペプチドの断片、および、天然に発生したかまたは無作為もしくは標的の様式により人工的に導入されたかのいずれかである、１以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換のような変異を有するポリペプチドもまた包含する。

ここで用いられる、本発明のペプチドに関する「相同体」との語は、配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドに対し、実質的に同じアミノ酸配列および実質的に同じ生物活性を有するペプチドを包含すると理解されなければならない。従って相同体は、結果として配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドそれぞれの生物活性を保持するペプチドを提供した１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換により、配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドと異なってよい。当業者は確立された公知の方法を用い、どのアミノ酸残基が付加、欠失または置換されたか（どのアミノ酸によりこのような置換が行われたかを含む）を容易に決定できる。配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドの相同体の例は、配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドそれぞれの全てよりも少ないアミノ酸残基を含む欠失相同体、特定された１以上のアミノ酸残基がその他のアミノ酸残基により（例えば類似の特性を持つアミノ酸、またはＤ−アミノ酸、または非天然アミノ酸により）置き換えられた置換相同体、および配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドそれぞれの末端または内側の部分に１以上のアミノ酸残基が付加される付加相同体である。

本発明のペプチドに関する「誘導体」との語は、配列番号：１〜１５、２０〜２６それぞれに示されるペプチドに対し、実質的に同じアミノ酸配列および実質的に同じ生物活性を有するペプチドを包含すると理解されなければならない。従って誘導体は、グリコシル化、アミド化、アセチル化、アルキル化、アルケニル化、アルキニル化、リン酸化、硫化、水酸化、水素化などのような、しかしこれらに限定されない修飾により、配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドと異なってよい。従って本発明のペプチドの誘導体は、結果として配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドそれぞれの生物活性を保持するペプチドを提供した１以上のアミノ酸残基における修飾により、配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドと異なってよい。当業者は確立された公知の方法を用い、どのアミノ酸残基が修飾され得るかを容易に決定できる。一実施形態によれば、本発明のペプチドはそのＣ−末端がアミド化され、Ｎ−末端がアセチル化される。

「変異体」は、参照ポリペプチドとは異なるが、本質的な特性は保持するポリペプチドを意味する。一般に相違は限られており、参照ポリペプチドおよび変異体の配列は全体として密接に類似し、かつ多くの領域は同一である。変異体および参照ポリペプチドは、１以上の置換、付加、および／または欠失のいずれの組み合わせにより、アミノ酸配列において異なってよい。置換された、または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされるかまたはされないものであってよい。ポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のような天然発生のものであってよいか、または天然発生が知られていない変異体であってよい。ポリペプチドの非天然発生の変異体は、変異誘発技術または直接の合成により作製されてよい。

一般に変異体は、残基が類似の特性（例えば酸性、塩基性、芳香族など）を持つ別のものにより置換される保存されたアミノ酸置換により、参照ポリペプチドと異なってよい。典型的な置換はＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕとＩｌｅの間；ＳｅｒとＴｈｒの間；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの間；ＡｓｎとＧｌｎの間；および塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの間；または芳香族残基のＰｈｅとＴｙｒの間である。

ここで用いられる「実質的に同じ生物活性を持つペプチド」は、天然発生のアミノ酸配列と実質的に同じ長さのペプチドとして、少なくとも４分の１、例えば３分の１、２分の１、または同じ活性を持つペプチドを包含すると理解されなければならない。「実質的に同じ長さ」は、同じ長さ、または長さにおける１０％を超えない相違を意味する。

式Ｉの範囲内のペプチドは、特定されたアミノ酸配列を含む、より長いペプチドの一部として提供できる。例えば該ペプチドは、２００、１５０、１２５、１００、７５、５０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１３、１１、１０、９、８または７アミノ酸よりも短いペプチドについて提供できる。

好ましい実施形態によればペプチド断片は、１以上の完全長ペプチドに付随する活性、例えばＧＰＣＲレセプターへの結合および／もしくは活性化、またはここに述べられる条件に反する活性を保持する。幾つかの実施形態によれば式Ｉで表されるペプチドは、好ましくはリラキシン関連ＧＰＣＲまたはＬＧＲファミリーＧＰＣＲであるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に結合する。さらなる好ましい実施形態によればリラキシン関連ＧＰＣＲは、ＲＸＦＰ１、ＲＸＦＰ２、ＲＸＦＰ３またはＲＸＦＰ４から成るがこれらに限定されない群から、またはＦＳＨＲ（ＬＧＲ１）、ＬＨＣＧＲ（ＬＧＲ２）、ＴＳＨＲ（ＬＧＲ３）、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）および／もしくはＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）タンパク質から成るがこれらに限定されないＬＧＲ関連ファミリー群から選択される。

幾つかの実施形態によれば、式Ｉで表されるペプチドはＧＰＣＲタンパク質を活性化する。ＧＰＣＲタンパク質の活性化は公知の方法を用いて測定できる。

式Ｉで表されるペプチドは、第２のペプチドまたはポリペプチドに結合して提供できる。第２のペプチドまたはポリペプチドの例は、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）およびシグナル配列である。適切なシグナル配列は例えば、ＭＡＡＰＡＬＬＬＬＡＬＬＬＰＶＧＡ（配列番号：１６）、ＭＡＡＰＡＬＬＬＬＡＬＬＬＰＶＧＡＷＰ（配列番号：１７）、ＭＡＡＰＡＬＬＬＬＡＬＬＬＰＶＧＡＷＰＧＬＰ（配列番号：１８）を含む。

幾つかの実施形態によれば、第２のペプチドまたはポリペプチドは免疫グロブリン配列（例えばＩｇＧ配列）である。本発明における標的成分としての使用のための免疫反応リガンドは、抗原認識免疫グロブリン（「抗体」とも称される）またはその抗原認識断片、例えば腫瘍関連抗原を認識できる免疫グロブリンを含む。ここで用いられる「免疫グロブリン」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのような、免疫グロブリンのいずれの認識クラスまたはサブクラスも意味する。

免疫グロブリンのＩｇＧクラスに含まれる免疫グロブリンが好ましい。免疫グロブリンはいずれの種由来であってもよい。しかしながらヒト、マウス、またはウサギ起源の免疫グロブリンが好ましい。加えて、免疫グロブリンはポリクローナルまたはモノクローナルであってよいが、モノクローナルが好ましい。

本発明の結合体は抗原認識免疫グロブリン断片を含んでよい。このような免疫グロブリン断片は例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖもしくはＦａｂ断片、またはその他の抗原認識免疫グロブリン断片を含んでよい。例えばこのような免疫グロブリン断片は、例えばペプシンまたはパパイン消化によるタンパク質分解性の酵素消化、還元的アルキル化、あるいは組み換え技術により調製できる。このような免疫グロブリン断片を調製するための材料および方法は当該技術分野において公知である。Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３１，２８９５，１９８３；Ｌａｍｏｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，５６，２３５，１９８３を参照のこと。

ここで「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」との語は、アミノ酸残基の重合体を意味するため互換的に用いられる。これらの語は、１以上のアミノ酸残基が、相当する天然発生のアミノ酸の類似体または模倣であるアミノ酸重合体へ、同様に天然発生のアミノ酸重合体へ適用される。これらの語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合により互いに結合した２以上のアミノ酸を含むいずれのペプチド（環状ペプチドを含む）またはタンパク質を包含する。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーを意味する短鎖、および一般にタンパク質を意味する長鎖の両方を意味する。

「ポリペプチド」は、天然過程により、または当該技術分野において公知の化学修飾技術のいずれかにより修飾されるアミノ酸配列を含む。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシル末端を含むポリペプチド内のどこにでも起こってよい。ポリペプチドは、例えば糖タンパク質を形成する炭水化物残基の付加により修飾できる。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」との語は、糖タンパク質、同様に非糖タンパク質を含む。

本発明内のペプチドは、当該技術分野において公知の方法を用いて、例えば天然発生タンパク質またはペプチドからのペプチド配列の精製により産生できる。当該技術分野において公知の方法を用いて望まれるペプチドを産生するため、精製を切断または分解（酵素的または非酵素的のいずれか）と共に行うことができる。

あるいは産物は、例えば固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合、古典的溶液合成により生化学的に合成できる。これらの方法は、ペプチドが比較的短い（すなわち１０ｋＤａ）とき、および／または組み換え技術により産生できない（すなわち核酸配列によってコードされていない）ときに好ましく用いられる。

固相ポリペプチド合成方法は当該技術分野において公知であり、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ （２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４）にさらに述べられている。

合成ポリペプチドは調製用の高速液体クロマトグラフィー［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．Ｎ．Ｙ．］によって精製でき、この組成物はアミノ酸配列決定により確認できる。

ポリペプチドまたはペプチドは、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４，Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９，Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３１０：５１１−５１４，Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：３０７−３１１，Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：１６７１−１６８０およびＢｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：８３８−８４３，Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５およびＷｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＳｅｃｔｉｏｎＶＩＩＩ，ｐｐ４２１−４６３により記載されているような組み換え技術を代わりに用いて合成できる。

本発明内のペプチドは１以上の修飾を含んでよい。例えば、それはリン酸化され（典型的にはセリン、スレオニン、またはチロシン残基において）、ＰＥＧ化され、ビオチン成分に結合されて提供されてよく、または別のペプチド、ポリペプチド、もしくはアミノ酸へのジスルフィド結合を含んでよい。ペプチドは環状形、例えば環状ペプチドまたはラクタムとして提供されてよい。あるいは、または加えて、ペプチドは分岐ペプチドとして提供されてよい。

ペプチドはそのアミノ末端またはカルボキシ末端において（直鎖状の場合）さらに修飾されていてもよい。アミノ末端修飾の例は、例えばＮ−糖化、Ｎ−アルキル化、Ｎ−アセチル化、またはＮ−アシル化されたアミノ酸を含む。末端修飾はＰＥＧ化を含むことができる。カルボキシ末端修飾の例は、ｃ−末端アミド化アミノ酸である。

本発明のペプチドは、２０遺伝子によりコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含んでよい。アミノ酸がＤ−またはＬ−アミノ酸として命名されていないとき、該アミノ酸は、状況が特定の異性体を必要としない限りＬ−アミノ酸であるか、またはＤ−もしくはＬ−アミノ酸のいずれかであり得る。

ここで用いられるポリペプチドアミノ酸残基に対する記号は当該技術分野において一般的に用いられる略語である。あまり一般的ではない略語であるＡｂｕ、Ｃｐａ、Ｎｌｅ、Ｐａｌ、Ｔｌｅ、Ｄｉｐ、４−Ｆｐａ、およびＮａｌはそれぞれ、２−アミノ−酪酸、ｐ−クロロフェニルアラニン、ノルロイシン、３−ピリジル−２−アラニン、ｔｅｒｔ−ロイシン、２，２−ジフェニルアラニン、４−フルオロ−フェニルアラニン、および３−（２−ナフチル）−アラニンもしくは３−（１−ナフチル）−アラニンを表す。

非天然発生アミノ酸の一例は、オメガ−アミノ酸、例えばベータ−アラニン（ベータ−Ａｌａ）、または３アミノプロピオン酸（３−ａＰ）である。その他の例は、非天然発生アミノ酸、例えばサルコシン（Ｓａｒ）、β−アラニン（β−Ａｌａ）、２，３ジアミノプロピオン酸（２，３−ｄｉａＰ）またはアルファ−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ベータ−アラニン（ベータ−Ａｌａ）、または３アミノプロピオン酸（３−ａＰ）であるオメガ酸；ｔ−ブチルアラニン（ｔＢｕＡ）、ｔブチルグリシン（ｔ ＢｕＧ）、Ｎメチルイソロイシン（Ｎ ＭｅＩｌｅ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチルバリン（Ｍｖｌ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ＮａＩ、β２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、２ナフチルアラニン（２Ｎａｌ）、または１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３カルボン酸（Ｔｉｃ）のような、疎水性非天然発生アミノ酸；オルニチン（Ｏｒｎ）またはホモアルギニン（Ｈａｒ）のような塩基性アミノ酸；およびシトルリン（Ｃｉｔ）、アセチルリジン、またはメチオニンスルホキシドである中性／極性非天然発生アミノ酸（ＭＳＯ）である。

その他の非従来的なアミノ酸を表６に記載する。

修飾
融合タンパク質
免疫グロブリンの定常部を含む免疫グロブリンの一部と融合させることにより、本発明のペプチドから融合タンパク質が調製されてよい。さらに好ましくは該免疫グロブリンの一部は重鎖定常部を含み、該重鎖定常部は任意に、かつ、さらに好ましくはヒト重鎖定常部である。重鎖定常部は最も好ましくはＩｇＧ重鎖定常部であり、任意に、かつ最も好ましくはＦｃ鎖であり、最も好ましくはＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧＦｃ断片である。いずれのＩｇＧサブタイプも任意に用いられてよいが、ＩｇＧ１サブタイプが好ましい。Ｆｃ鎖は任意に知られているか、または「野生型」Ｆｃ鎖、もしくは変異していてよい。変異の限定されない、説明的な、代表的な型は、２００６年２月１６日に公表され、ここに完全に説明されているかのように参照として取り込まれる米国特許出願公開第２００６００３４８５２号に記載される。「Ｆｃ鎖」との語は、Ｆｃ断片のいずれの型もまた任意に含む。

ＩｇＧサブクラスにおける抗体定常部を介する活性に重要な、幾つかの特異的アミノ酸残基が同定されてきた。それ故にこれらの特異的アミノ酸の含有、置換または排除は、特異的免疫グロブリン定常部を介する活性の含有または排除を可能にする。さらに特異的変化は、例えばグリコシル化および／またはＦｃ鎖へのその他の望まれる変化をもたらすであろう。少なくとも幾つかの変化は、以下に十分に詳述されるように、望まれない免疫システムの効果のような、望まれないとみなされるＦｃの機能を遮断するために任意に作り出される。

融合タンパク質の活性を調節するために作られてよい、Ｆｃに対する変異の限定されない説明的な例は、以下の変化（Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，１９９１から、Ｋａｂａｔにより定められたＦｃ配列の名称に関して与えられた）：２２０Ｃ→Ｓ；２３３−２３８ＥＬＬＧＧＰ→ＥＡＥＧＡＰ；２６５Ｄ→Ａ、好ましくは４３４Ｎ→Ａとの組み合わせ；２９７Ｎ→Ａ（例えばＮ−グリコシル化の阻害のため）；３１８−３２２ＥＹＫＣＫ→ＡＹＡＣＡ；３３０−３３ＩＡＰ→ＳＳ；またはそれらの組み合わせを含む（これらの変異およびその効果の記述は、例えば、Ｍ． Ｃｌａｒｋ，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，ｐｐ１−３１を参照）。上記の変化を特徴付けるＦｃ鎖の構築は、任意にかつ好ましくはヒンジ領域とＣＨ２およびＣＨ３ドメインとの組み合わせを含む。

上記の変異は、望まれる特性を増大するため、また代わりに望まれない特性を遮断するため、任意に実行されてよい。例えば、抗体のグリコシル化は望まれる結合機能性を維持することが示されたが、一方で任意に望まれない機能であり得る、Ｔ細胞枯渇の遮断、またはサイトカイン放出を起こす（Ｍ． Ｃｌａｒｋ，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，ｐｐ１−３１を参照）。セリンの３３１プロリンへの置換は、任意に望まれない機能とみなし得る、補体活性化能を遮断し得る。この変化と３３０アラニンのセリンへの変化との組み合わせもまた、望まれる効果である補体活性化能の遮断を増大し得る。

残基２３５および２３７は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与することが示され、ＡＤＣＣが望まれない機能とみなされる場合、２３３−２３８の残基の区画をここに述べるように変化させることにより、このような活性もまた遮断されるであろう。

ＩｇＧ１由来のＦｃの残基２２０は通常システインであり、重鎖が軽鎖と共に共有結合を形成する場である。いずれの型の共有結合も避けるため、この残基を任意にセリンへ変化させてよい（Ｍ．Ｃｌａｒｋ，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，ｐｐ１−３１を参照）。

上記の残基２６５および４３４への変化は、その免疫システム機能に関わるＦｃの望まれない機能性を任意に遮断する可能性があるＦｃ受容体への結合を減少または遮断するため、任意に実行されてよい（“Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧｌ ｆｏｒ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”，Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．ｖｏｌ ２７６，ｐｐ ６５９１−６６０４，２００１を参照)。

上記の変化は任意の変化の説明のみを意図し、どのようにも限定しようとするものではない。さらに上記の説明は記述目的のみで提供され、単一の仮説に結びつけようとするものではない。

基の付加
本発明のペプチドが直鎖状分子の場合、化学修飾に感受性であるかまたは適した直鎖状分子の様々な点において、様々な官能基を配置することが可能である。官能基は直鎖型ペプチドの末端に付加できる。幾つかの実施形態によれば、官能基は、安定性、透過（細胞膜および／または組織関門を通した）、組織局在性、有効性における改善、減少されたクリアランス、減少された毒性、改善された選択性、改善された細胞ポンプによる排出への抵抗性などを含むがこれらに限定されない１以上の特性に関するペプチドの活性を改善する。便宜目的で、これに限定しようとするものではなく、本発明の組成物中に含まれる一配列の遊離Ｎ−末端は、該組成物のＮ−末端として名付けられ、かつ該配列のＣ−末端は該組成物のＣ−末端としてみなされるであろう。配列のＣ−末端またはＮ−末端のいずれか、または両方は、それぞれカルボン酸官能基またはアミン官能基に結合できる。

適切な官能基の限定されない例は、その教示がここに参照として取り込まれるＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ５および７，１９９１に記載される。好ましい保護基は、例えば有効成分の親水性を減少させ、かつ親油性を増大させることによってそこに付着する有効成分の細胞内への輸送を促進するものであり、これらは「細胞膜を越える輸送のための成分」の例となる。

これらの成分は細胞の内部で加水分解により、または酵素的に、任意にかつ好ましくｉｎ ｖｉｖｏで切断される（Ｄｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５７：７８３（１９６８）；Ｄｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５７：８２８（１９６８）；Ｄｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５８：５５７（１９６９）；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６：２２９４（１９８７）；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ１７：３１１（１９８９）；およびＴｕｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．３７：３８６７（１９８８），Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３９：５３８（１９８５） ａｎｄ Ｓｉｎｇｈａｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１：２２０（１９８７））。水酸基保護基は、エステル、炭酸、およびカルバミン酸保護基を含む。アミン保護基は、上でＮ−末端保護基について述べられたように、アルコキシ、およびアリールオキシカルボニル基を含む。カルボン酸保護基は、上でＣ−末端保護基について述べられたように、脂肪族、ベンジル、およびアリールエステルを含む。一実施形態によれば、本発明の組成物中の１以上のグルタミン酸、またはアスパラギン酸残基の側鎖内のカルボン酸基は、好ましくはメチル、エチル、ベンジル、または置換ベンジルエステルにより、さらに好ましくはベンジルエステルとして保護される。

Ｎ−末端保護基の限定されない説明的な例は、アシル基（−ＣＯ−Ｒ１）およびアルコキシカルボニルもしくはアリールオキシカルボニル基（−ＣＯ−Ｏ−Ｒ１）であり、ここでＲ１は脂肪族、置換脂肪族、ベンジル、置換ベンジル、芳香族または置換芳香族基である。アシル基の特定の例は、アセチル、（エチル）−ＣＯ−、ｎ−プロピル−ＣＯ−、イソ−プロピル−ＣＯ−、ｎ−ブチル−ＣＯ−、ｓｅｃ−ブチル−ＣＯ−、ｔ−ブチル−ＣＯ−、ヘキシル、ラウロイル、パルミトイル、ミリストイル、ステアリル、オレオイルフェニル−ＣＯ、置換フェニル−ＣＯ−、ベンジル−ＣＯ−および（置換ベンジル）−ＣＯ−を含むがこれらに限定されない。アルコキシカルボニルおよびアリールオキシカルボニル基の例は、ＣＨ３−Ｏ−ＣＯ−、（エチル）−Ｏ−ＣＯ−、ｎ−プロピル−Ｏ−ＣＯ−、イソ−プロピル−Ｏ−ＣＯ−、ｎ−ブチル−Ｏ−ＣＯ−、ｓｅｃ−ブチル−Ｏ−ＣＯ−、ｔ−ブチル−Ｏ−ＣＯ−、フェニル−Ｏ−ＣＯ−、置換フェニル−Ｏ−ＣＯ−およびベンジル−Ｏ−ＣＯ−、（置換ベンジル）−Ｏ−ＣＯ−、アダマンタン、ナフタレン、ミリストオレイル、トルエン、ビフェニル、シンナモイル、ニトロベンゾイル、トルオイル、フロイル、ベンゾイル、シクロヘキサン、ノルボルナン、またはＺ−カプロンを含む。Ｎ−アシル化を促進するため、分子のＮ−末端に１から４のグリシン残基が存在できる。

化合物のＣ−末端のカルボキシル基は、例えばアミド（すなわちＣ−末端の水酸基が−ＮＨ_２、−ＮＨＲ_２および−ＮＲ_２Ｒ_３により置換される）またはエステル（すなわちＣ−末端のヒドロキシル基が−ＯＲ_２により置換される）を含むがこれらに限定されない基によって保護できる。Ｒ_２およびＲ_３は任意に独立して脂肪族、置換脂肪族、ベンジル、置換ベンジル、アリール、または置換アリール基である。加えて、Ｒ_２およびＲ_３は窒素原子と結合して、窒素、酸素、または硫黄のような約０〜２のさらなるヘテロ原子によるＣ４からＣ８の複素環を任意に形成できる。限定されない適切な複素環の適切な例は、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリノ、チオモルホリノまたはピペラジニルを含む。Ｃ−末端保護基の例は、−ＮＨ_２、−ＮＨＣＨ_３、−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−ＮＨ（エチル）、−Ｎ（エチル）_２、−Ｎ（メチル）（エチル）、−ＮＨ（ベンジル）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）（ベンジル）、−ＮＨ（フェニル）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）（フェニル）、−ＯＣＨ_３、−Ｏ−（エチル）、−Ｏ−（ｎ−プロピル）、−Ｏ−（ｎ−ブチル）、−Ｏ−（イソ−プロピル）、−Ｏ−（ｓｅｃ−ブチル）、−Ｏ−（ｔ−ブチル）、−Ｏ−ベンジルおよび−Ｏ−フェニルを含むがこれらに限定されない。

ペプチド模倣成分による置換
本発明の組成物中のアミノ酸は、「ペプチド模倣の有機成分」により、保存的および非保存的置換の両方として置換できる。これらの成分はまた「非天然アミノ酸」とも称され、アミノ酸残基、アミノ酸を任意に置換するか、またはペプチド内で欠失したアミノ酸の代わりにスペーサー基として働く。ペプチド模倣有機成分は任意にかつ好ましくは、置換されたアミノ酸と同様の立体的、電気的、または配置の特性を有し、このようなペプチド模倣物は重要な位置にあるアミノ酸を置換するために用いられ、保存的な置換とみなされる。しかしながらこのような類似性は必ずしも必要とされない。本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の天然ペプチドタンパク質に比較して、組成物が少なくともその生理的活性を実質的に保持する１以上のペプチド模倣物が選択される。

ペプチド模倣物は、酵素的またはその他の分解性過程によるペプチドの分解を阻害するため、任意に用いられてよい。ペプチド模倣物は、有機合成技術により任意にかつ好ましく合成できる。適切なペプチド模倣物の限定されない例は、相当するＬアミノ酸のＤアミノ酸、テトラゾール（Ｚａｂｒｏｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：５８７５−５８８０（１９８８））；アミド結合の同配体（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：３８５３−３８５６ （１９８８））；ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン（ｐｒｏｐｅｎｉｄｏｎｅ）−６−カルボン酸（ＬＬ−Ａｃｐ）（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：５８３４−５８３８（１９８５））を含む。同様の類似体は、Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：５０８１−５０８２（１９８８）、同様にＫｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：５０５７−５０６０（１９８８），Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：４９３５−４９３８（１９８８）およびＫｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：１０９−１１５（１９８７）に示される。その他の適切な、しかし代表的なペプチド模倣物は、Ｎａｇａｉ ａｎｄ Ｓａｔｏ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６：６４７−６５０（１９８５）；Ｄｉ Ｍａｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．，１６８７（１９８５）；Ｋａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３０：２３１７（１９８９）；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：３２３−３３３（１９９０）；Ｇａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６：４３６（１９９０）に示される。さらなる適切で代表的なペプチド模倣物は、ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸塩（Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔａｋｅｄａ Ｒｅｓ．Ｌａｂｓ４３：５３−７６（１９８９））；１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸塩（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３３：２２７５−２２８３（１９９１））；ヒスチジンイソキノロンカルボン酸（ＨＩＣ）（Ｚｅｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４３（１９９１））；（２Ｓ、３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ、３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｒ、３Ｓ）−メチル−フェニルアラニンおよび（２Ｒ、３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ ａｎｄ Ｈｒｕｂｙ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９１））を含む。

代表的で説明的であるが、限定されない非天然アミノ酸は、ベータ−アミノ酸（ベータ３およびベータ２）、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、芳香族アミノ酸、ＰｒｏおよびＰｙｒ誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換ＰｈｅおよびＴｙｒ誘導体、直鎖状コアアミノ酸またはジアミノ酸を含む。これらは例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）のような様々な納入業者から入手可能である。

化学修飾
本発明におけるペプチドのいずれの部分も任意に化学修飾、すなわち官能基を付加されてよい。例えば天然配列にみられるアミノ酸残基の側鎖は任意に修飾されてよい。しかしながら、アミノ酸残基の側鎖に加え、またはその代わりに、下記のように該タンパク質のその他の部分が代わりに任意に修飾されてよい。化学合成過程がそれに続く場合、例えば化学的に修飾されたアミノ酸の付加により、修飾は分子の合成の間に任意に行われてよい。しかしながらアミノ酸の化学修飾は、それが既に分子内に存在する場合（「ｉｎ ｓｉｔｕ」修飾）にもまた可能である。

分子のいずれの配列領域のアミノ酸も、以下の代表的な型の修飾（概念的に「化学修飾された」とみなされるペプチドにおける）のいずれか１により任意に修飾できる。修飾の限定されない代表的な型は、カルボキシメチル化、アシル化、リン酸化、グリコシル化、または脂肪酸アシル化を含む。エーテル結合は、セリンまたはスレオニン水酸基を糖の水酸基に結合するため、任意に使用できる。アミド結合は、グルタミン酸またはアスパラギン酸カルボキシル基を糖のアミノ基に結合するため、任意に使用できる（Ｇａｒｇ ａｎｄ Ｊｅａｎｌｏｚ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ． ４３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）；Ｋｕｎｚ，Ａｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ２６：２９４−３０８（１９８７））。アセタールおよびケタール結合もまた、アミノ酸と炭水化物の間で任意に形成される。脂肪酸アシル誘導体は、例えば遊離アミノ基（例えばリジン）のアシル化により任意に産生できる（Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｉｖｉｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌ，ｅｄｓ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌ．，Ｌｅｉｄｅｎ，１０７８−１０７９（１９９０））。

ここで用いられる「化学修飾」との語が本発明のタンパク質またはペプチドを参照するとき、そのアミノ酸残基の少なくとも一つが、プロセシングまたはその他の翻訳後修飾のような天然過程、または当該技術分野において公知の化学修飾技術のいずれかにより修飾されるタンパク質またはペプチドを参照する。多数の公知の修飾の例は、アセチル化、アシル化、アミド化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、脂質または脂質誘導体の共有結合性付着、メチル化、ミリスチル化、ＰＥＧ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化、またはいずれの類似の過程を典型的に含むがこれらに限定されない。

その他の型の修飾は、全てがここに説明されるかのように参照として取り込まれるＰＣＴ出願国際公開第２００６／０５０２６２号に記載されるように、タンパク質のような生物学的分子へのシクロアルカン成分の付加を任意に含む。これらの成分は生物分子と共に使用するため設計され、かつタンパク質の様々な特性を与えるために任意に使用されてよい。

さらに、タンパク質のいずれの点も任意に修飾されてよい。例えば、全てがここに説明されるかのように参照として取り込まれるＰＣＴ出願国際公開第２００６／０５０２４７号に記載されるように、タンパク質のグリコシル化成分のＰＥＧ化が任意に行われてよい。１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が、Ｏ−結合型および／またはＮ−結合型グリコシル化に任意に付加されてよい。ＰＥＧ基は任意に分岐または直線状であってよい。水溶性重合体のいずれの型も、グリコシルリンカーを通してタンパク質のグリコシル化部位に任意に付着されてよい。

本発明のペプチドの共有結合性の修飾は本発明の範囲内に含まれる。その他の型のペプチドの共有結合性修飾は、標的アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ−もしくはＣ−末端残基と反応できる有機誘導体化剤と共に反応させることにより分子内に導入される。

システイニル残基は最も一般的に、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなα−ハロ酢酸（および相当するアミン）と反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸、２−クロロ第二水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。

ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０におけるジエチルピロカーボネートとの反応によっても誘導体化される。その理由はこの薬剤がヒスチジル側鎖に比較的に特異的なためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、反応は好ましくはｐＨ６．０にて０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。

リシニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸またはその他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤との誘導体化はリシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノを含む残基の誘導体化に適切なその他の薬剤は、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロホウ化水素、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシル酸によるトランスアミナーゼ触媒反応を含む。

アルギニル残基は１または数種の従来の試薬との反応により修飾され、その中にフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、反応をアルカリの条件で行うことが必要とされる。さらにこれらの試薬は、アルギニンイプシロン−アミノ基と同様にリジン基と反応し得る。

チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により、チロシル残基内にスペクトル標識を導入することへの特別な関心により行なわれてよい。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンはそれぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために用いられる。ラジオイムノアッセイでの使用のための標識タンパク質を調製するため、チロシル残基は１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化され、上記のクロラミンＴ法が適している。

カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）との反応により選択的に修飾され、ここでＲおよびＲ’は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのような、異なるアルキル基である。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。

二官能性の薬剤による誘導体化は、抗ＣＨＦ抗体を精製する方法における使用のため、水に不溶性の支持マトリックスまたは表面へＣＨＦを架橋結合することに有用であり、その逆もまた同様である。一般に使用される架橋結合薬剤は、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸のエステル、３，３’−ジチオビス（サクシニミジルプロピオン酸）のようなジサクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびｂｉｓ−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドを含む。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導化剤は、光存在下で架橋結合を形成できる光活性化可能な中間体を産生する。あるいは、米国特許第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号；および第４，３３０，４４０号に記載される、臭化シアン活性化炭水化物のような水に不溶性のマトリックスおよび反応基質が、タンパク質不動化のために用いられる。

グルタミニルおよびアスパラギニル残基はしばしば、相当するグルタミルおよびアスパルチル残基へそれぞれ脱アミド化される。これらの残基は中性または塩基性の条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド型は本発明の範囲内に含まれる。

その他の修飾は、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルおよびスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６［１９８３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびいずれのＣ−末端カルボキシル基のアミド化を含む。

変化したグリコシル化
本発明のペプチドは、変化したグリコシル化のパターンを有するように修飾されてよい（すなわち本来の、または天然のグリコシル化パターンからの変化）。ここで用いられる「変化した」は、本来のタンパク質に１以上の炭水化物成分の欠失がみられること、および／または少なくとも一つのグリコシル化部位が付加されることを意味する。

タンパク質のグリコシル化は典型的にはＮ−結合型またはＯ−結合型である。Ｎ−結合型はアスパラギン残基の側鎖への、炭水化物成分の付着を意味する。トリペプチド配列であって、Ｘがプロリンを除くいずれのアミノ酸でもあるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の酵素的付着の認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ−結合型グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうち１の糖の、ヒドロキシアミノ酸への付着を意味する。このヒドロキシアミノ酸として５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも用いられてよいが、最も一般的にはセリンまたはスレオニンである。

本発明のペプチドへのグリコシル化部位の付加は、タンパク質の配列を変化させて１以上の上記のトリペプチド配列を含ませることにより、便利に達成される（Ｎ−結合型グリコシル化部位に関して）。該変化はまた、本来のタンパク質の配列中への１以上のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはこれらによる置換によっても行われる（Ｏ−結合型グリコシル化に関して）。タンパク質のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変更の導入によってもまた変化する。

タンパク質の炭水化物成分の数を増大させるための他の方法は、グリコシドの、タンパク質のアミノ酸残基への化学的または酵素的な結合による。使用する結合方法に依存して、糖は（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインに存在するような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンに存在するような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに存在するような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基へ付着されてよい。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９−３０６（１９８１）に記載される。

本発明のペプチドのいずれの炭水化物成分の除去も、化学的または酵素的に達成されてよい。化学的脱グリコシル化は、タンパク質のトリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物への曝露を必要とする。この処理は、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分または全ての糖を、アミノ酸配列を未変化のままに残して切断する。

化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）；およびＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）により記載されている。タンパク質の炭水化物成分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）により記載されるような、様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成できる。

生物活性ペプチドに対する抗体
本発明はまた、ここに開示される生物活性ペプチドまたは生物活性ペプチドの断片に対する抗体も含む。幾つかの実施形態によれば、生物活性ペプチドはＧＰＣＲリガンドである。

「抗体」は、単数もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、またはそれらの断片により実質的にコードされ、エピトープ（例えば抗原）に特異的に結合し、かつ認識する、ポリペプチドリガンドを意味する。抗体は例えば、未変化の免疫グロブリン、または断片、例えば様々なペプチダーゼでの消化により産生された断片として提供できる。これは例えば、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’_２Ｆｖ（２つの鎖として発現される軽鎖の可変部および重鎖の可変部を含む、遺伝子改変断片として定義される）；および適切なポリペプチドリンカーにより遺伝的に融合した単鎖分子として結合された軽鎖の可変部および重鎖の可変部を含む、遺伝子改変分子である（５）単一鎖抗体（「ＳＣＡ」）を含む。ここで用いられる「抗体」との語はまた、抗体全体の修飾または組み換えＤＮＡ方法論を用いたｄｅ ｎｏｖｏでの合成のいずれかにより産生された、抗体断片も含む。それはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単鎖抗体を含む。抗体の「Ｆｃ」部分は、１以上の重鎖定常部ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含むが重鎖可変部は含まない、免疫グロブリン重鎖の部分を意味する。

抗体は例えば、式Ｉで表されるペプチドのエピトープに対して産生される。幾つかの実施形態によれば、抗−ＧＰＣＲペプチドリガンド抗体は、
ペプチドＰ５９−Ｓ−アミド（アミド）：ＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：１）；
ペプチドＰ５９−ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：２）；
ペプチドＰ５９−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：３）；
ペプチドＰ５９（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：４）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：５）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：６）；
ペプチドＰ７４−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：７）；
ペプチドＰ７４（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：８）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：９）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：１０）；
ペプチドＰ５９ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１１）；
ペプチドＰ５９−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１２）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１３）；
ペプチドＰ７４−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１４）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１５）；
ペプチドＰ５９−チンパンジー：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２０）；
ペプチドＰ５９−オランウータン：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２１）；
ペプチドＰ５９−アカゲザル：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２２）；
ペプチドＰ５９−雌ウシ：ＧＱＫＧＱＡＧＬＰＧＡＱＣＰＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２３）；
ペプチドＰ５９−ニワトリ：ＧＱＫＧＱＰＧＰＱＧＨＳＣＫＱＬＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２４）；
ペプチドＰ５９−Ｃ１ＱＴＮＦ１（ヒト）：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＥＲＣＫＳＨＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２５）；
ペプチドＰ５９−ラット：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＤＨＣＫＳＱＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２６）に対して産生される。

ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、同様にその断片を産生する方法は当該技術分野において公知である（例えば、ここに参照として取り込まれるＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８を参照）。

抗体断片は、抗体のタンパク質分解性の加水分解、または断片をコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞培養またはその他のタンパク質発現システム）内での発現により調製できる。抗体断片は従来の方法により、抗体全体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。

生物活性ペプチド抗体は、相当する単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドとしてさらに提供できる。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、興味ある抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。このような遺伝子は、例えば抗体産生細胞のＲＮＡ由来の可変部を合成するための、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ａｎｄ Ｆｒｙ ［Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０（１９９１）］を参照。

非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、または抗体のその他の抗原結合サブ配列）のキメラ分子である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、望まれる特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、またはウサギのＣＤＲ由来の残基により置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの実例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム構造残基は、相当する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体もしくは移入されたＣＤＲに見られない残基、またはフレーム構造配列も含んでよい。一般にヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンの相当するＣＤＲ領域の全てもしくは実質的に全て、およびヒト免疫グロブリンの共通配列のＦＲ領域の全てもしくは実質的に全てである、少なくとも１、および典型的には２の可変部の実質的な全てを含み得る。ヒト化抗体はまた、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の、少なくとも一部も含み得る［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，２：５９３−５９６（１９９２）］。

非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野において公知である。一般にヒト化抗体は、非ヒトである源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。しばしばこれらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的に移入可変部から取られた移入残基を意味する。ヒト化は基本的に、ヒト抗体の相当する配列をげっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによる、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って行うことができる［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］。従ってこのようなヒト化抗体は、未変化のものよりも実質的に少ないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の相当する配列により置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際に、ヒト化抗体は典型的には、幾つかのＣＤＲ残基、および場合により幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似部位由来の残基により置換されたヒト抗体である。

ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野において公知の様々な技術を用いても産生できる［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．およびＢｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である［Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体はトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン座位の導入により作製できる。チャレンジにより、遺伝子再構成、集合、およびレパトアを含む、ヒトに見られる全ての点について密接に似ているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチは例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；５，５４５，８０６号；５，５６９，８２５号；５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；５，６６１，０１６号、および以下の科学論文：Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８ ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８２６（１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，６５−９３（１９９５）に記載される。

この抗体は好ましくは、ＧＰＣＲペプチドリガンドに特異的（または選択的）に結合する。抗体へ「特異的（または選択的）に結合する」または「特異的（または選択的）に免疫反応する」との句がタンパク質またはペプチドを参照するとき、タンパク質およびその他の生物学の異質性集団におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を意味する。従って、指定された免疫アッセイの条件下で、特定の抗体は特定のタンパク質に少なくとも２回のバックグラウンドで結合し、サンプル中に存在するその他のタンパク質に、実質的に有意な量においては結合しない。このような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対する特異性によって選択される抗体を必要とするであろう。様々な免疫アッセイの型式が、特定のタンパク質に特異的に免疫反応する抗体を選択するために用いられてよい。例えば固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質に特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に用いられる（特異的な免疫反応性を決定するために用いることができる免疫アッセイ形式および条件の記述のために、例えばＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照のこと）。特異的または選択的反応は、典型的には少なくとも２回のバックグラウンドシグナルもしくはノイズ、さらに典型的には１０から１００回を超えるバックグラウンドであり得る。

望まれれば、抗体は検出可能な標識、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、もしくは治療薬に接合または共役結合して提供できる。

治療法
本発明のさらなる態様によれば、対象における上記の疾病、疾患または状態を治療する方法が提供される。

本発明による対象は哺乳類、好ましくは上記の疾患、疾患または状態のうちの一つと診断されるか、または代わりに上記の疾病、疾患または状態の少なくとも一つの型にかかりやすいヒトである。

ここで用いられる「治療する」との語は、上記の疾病、疾患または状態の有害な効果の予防、治癒、逆転、源弱、軽減、最小化、抑制、または停止を意味する。

本発明による治療は、対象において少なくとも一つの本発明のポリペプチドの発現を特異的に上昇させることにより、もたらすことができる。

任意に、上昇は、ここに記載される少なくとも一つの本発明のポリペプチド（例えば組み換えまたは合成）またはその有効部分を対象へ投与することによりもたらされ得る。ポリペプチドまたはペプチドは、以下にさらなる詳細を述べる医薬組成物の一部として任意に投与されてよい。

本発明による上記疾病の治療は、当該技術分野において公知のその他の治療法と併用してよい（すなわち併用療法）ことが認識されるであろう。従って、本発明の薬剤を用いる悪性腫瘍の治療は、例えば放射線療法、抗体療法および／または化学療法、外科手術と、あるいはその他の生物的薬剤、従来の薬物との併用療法および／または癌のための免疫抑制剤もしくは細胞傷害性薬物のようなその他のいずれの抗癌剤との併用療法において、あるいは補体調節タンパク質（ＣＲＰ）を標的とする治療薬との併用において、併用されてよい。上に述べる本発明の化合物または医薬組成物それぞれのうちの一つはまた、その他の化合物との結合においても投与されてよい。

例えば併用療法は、細胞傷害性および細胞増殖抑制性などである化学療法剤、インターフェロンおよびインターロイキン、成長ホルモン、またはその他のサイトカインのような免疫学的修飾因子、葉酸、ビタミン、ミネラル、アロマターゼ阻害剤、ＲＮＡｉ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、プロテアソーム阻害剤などを含むがこれらに限定されない、その他の治療または免疫調節薬の少なくとも一つと併用した本発明の化合物を含むことができる。

あるいは、または加えて、上昇の方法は、対象において本発明のポリペプチドまたはその有効部分の少なくとも一つの量を特異的に上昇させる（任意の発現）ことによって任意にもたらされてよい。

本発明の治療ペプチドの発現の上昇は、真核細胞（例えば哺乳類細胞）内でのコード配列発現のために設計された核酸発現コンストラクトに連結された、少なくとも一つの本発明の外来性ポリペプチド配列の投与を通じてもたらされてよい。従って、外来性ポリペプチド配列は、本発明のペプチドまたはその有効部分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列であってよい。

核酸コンストラクトは、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療（例えば上記のウィルス形質転換を用いる）を含むいずれの適切な投与の型を用いて、個体へ投与できることが認識されるであろう。あるいは核酸コンストラクトは、必要に応じて適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同組み換えなど）および発現システムを通じて適切な細胞内へ導入され、その後改変された細胞を培養により増殖し、個体内へ戻す（すなわちｅｘ−ｖｉｖｏ遺伝子治療）。

このような細胞（すなわち本発明の核酸コンストラクトをトランスフェクトしたもの）は、個体由来の腎臓、骨髄、角化細胞、リンパ球、成体幹細胞、臍帯血細胞、胚性幹細胞のようないずれの適切な細胞でもよく、上記のような本発明のポリペプチドの発現のために設計されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトされる。

本発明のｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞の投与は、静脈内、腹腔内、腎臓内、胃腸管内、皮下、経皮、筋肉内、皮内、くも膜下腔内、硬膜外、および直腸のようないずれの適切な経路を用いてもたらすことができる。現在好ましい実施形態によれば、本発明のｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞が、腎臓内、胃腸管内および／または腹腔内投与を用いて個体に導入される。

本発明のｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞は、自己骨髄細胞のような自己源、または骨髄もしくは非自己源由来のその他の細胞のような同種間源のいずれかに由来できる。非自己細胞は、身体へ投与されたとき免疫反応を誘導すると考えられることから、非自己細胞の拒絶の可能性を減少させるために幾つかのアプローチが開発された。これらは、レシピエントの免疫システムを抑制すること、または移植前に、免疫的に隔離された半透性の膜内に非自己細胞または組織を被包することのいずれかを含む。

被包技術は一般に、大き目のフラットシートおよびホローファイバー膜を含む小さな球状のビヒクルおよびマクロ被包を伴う、マイクロ被包として分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０００；４２：２９−６４）。

マイクロカプセルを調製するための方法は当該技術分野において公知であり、例えばＬｕ ＭＺ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｇｉｎａｔｅ ａｎｄ ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０００，７０：４７９−８３，Ｃｈａｎｇ ＴＭ ａｎｄ Ｐｒａｋａｓｈ Ｓ．Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１，１７：２４９−６０，およびＬｕ ＭＺ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙ （ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）．Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．２０００，１７：２４５−５１により開示されるものを含む．

例えばマイクロカプセルは、コラーゲンを２−ヒドロキシエチルメチルアクリレート（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のｔｅｒ−重合体シェルにより修飾した複合体により調製され、厚さ２〜５μｍのカプセルがもたらされる。このようなマイクロカプセルは、陰性に荷電した滑面を与え、かつ血漿タンパク質吸収を最小化するため、追加の２〜５μｍのｔｅｒ−重合体シェルによりさらに被包できる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００２ ２３：８４９−５６）。

その他のマイクロカプセルは、海産の多糖であるアルギン酸（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ． Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｓｌｅｔｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｈｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３，５：６６５−８）またはその誘導体に基づく。例えばマイクロカプセルは、塩化カルシウム存在下でのポリカチオンポリ（メチレン−ＣＯ−グアニジン）塩酸塩による、アルギン酸ナトリウムと硫酸セルロースナトリウムのポリアニオンの間でのポリ電解質複合体形成によって調製できる。

医薬組成物およびその送達
生物活性ペプチドリガンドは、ヒト患者への医薬組成物の投与に適した薬剤的に許容可能な担体において、典型的に提供される。当業者によって認識され得るように、担体は以下に述べるような投与経路、標的となる問題の位置、送達される薬物、薬物送達の時間経過などに基づいて選択されてよい。

「薬剤的に許容可能な担体」との語は、無毒性、不活性固体、半固体、もしくは液体注入剤、希釈液、被包物質、またはいずれの型の製剤補助物を意味する。代表的な、薬剤的に許容可能な担体の一つは、生理食塩水である。その他の薬剤的に許容可能な担体およびその製剤は当業者に公知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ），．Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に記載される。薬剤的に許容可能な担体として役立つ幾つかの物質は、ラクトース、グルコース、およびショ糖のような糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースならびにその誘導体；粉末トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスのような賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油のような油；プロピレングリコールのようなグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；ＴＷＥＥＮ（商標）８０のような界面活性化剤；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝液、同様にラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのようなその他の無毒性の適合潤滑剤を含むがこれらに限定されず、同様に着色料、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、保存料、ならびに抗酸化剤もまた、処方者の判断により組成物中に存在できる。

「薬剤的に許容可能な塩」により、製薬工業において一般に用いられる、無毒性の酸付加塩または金属複合体が意味される。酸付加塩の例は、酢酸、乳酸、パモン酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸などのような有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどの重合酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、；および塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸を含む。金属複合体は亜鉛、鉄などを含む。

医薬組成物は、経口および非経口経路を含む、当該技術分野において公知のいずれの方法によっても患者に投与できる。ここで用いられる「患者」との語は、ヒトと同様に、例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類および魚類を含む非ヒトも意味する。好ましくは、非ヒトは哺乳類（例えばげっ歯類（マウスまたはラットを含む）、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、雌ウシ、ブタ、ウマ）である。非ヒトの動物は、代わりに鳥類、例えばニワトリまたはシチメンチョウであり得る。

特定の実施形態によれば、消化管に見出される消化酵素との接触を避けることから、非経口経路が好まれる。このような実施形態によれば、治療薬を含む発明組成物は注射（例えば静脈内、皮下または筋肉内、腹腔内注射）、経直腸、経膣、局所（粉末、クリーム、軟膏、または液滴として）により、または吸入（スプレーによるもの）により、鼻腔内、肺もしくは頬内に投与されてよい。

注射可能な製剤、例えば無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液は、適切な分散もしくは湿潤剤および懸濁剤を用いる公知の技術分野に従って処方されてよい。無菌の注射可能な製剤はまた、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液としての、無菌の非経口的に許容可能な希釈液または溶媒中の、無菌の注射可能な溶液、懸濁液、または乳剤であってもよい。許容可能なビヒクルおよび溶媒の間で用いられてよいものは、水、リンゲル液Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張の塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の固定油が溶媒または懸濁溶媒として従来から用いられている。この目的のため、合成モノ−またはジグリセリドを含むいずれの無菌の固定油も用いることができる。加えて、注射可能物の調製において、オレイン酸のような脂肪酸が用いられる。特定の好ましい実施形態によれば、治療薬は、１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ８０（商標）を含む担体液体中に懸濁される。注射可能な製剤は、例えば細菌保持フィルターを通す濾過により、または、使用前に無菌水もしくはその他の無菌の注射可能な溶媒中に溶解または分散できる無菌固体組成物の形態の殺菌薬剤を取り込むことにより滅菌できる。

直腸または膣投与のための組成物は好ましくは、治療薬を、外気温では固体であるが体温では液体であるため、直腸または膣腔内で融解して治療薬を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐薬ワックスのような無刺激性の賦形剤または担体と共に混合することにより調製できる坐薬である。

治療薬を含む医薬組成物の局所または経皮投与のための剤形は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入薬またはパッチを含む。治療薬は、必要とされ得るように、無菌条件下で薬剤的に許容可能な担体および必要ないずれの保存料もしくは緩衝液と混合される。眼科製剤、点耳薬および点眼薬もまた、本発明の範囲にあるものとして企図される。軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本発明の治療薬に加え、動物および植物油脂、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物のような賦形剤を含んでよい。経皮パッチは、身体への化合物の制御された送達を提供する、追加の利点を有する。このような剤形は、治療薬を適切な溶媒中に溶解または分注することにより調製できる。吸収促進薬もまた、皮膚を横断する化合物の流動を増大させるために使用できる。比率は、比率制御膜の提供、または重合体マトリックスまたはゲル中への治療薬の分散のいずれかによって制御できる。

粉末およびスプレーもまた、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、もしくはポリアミド粉末、またはそれらの薬物の混合物のような賦形剤を含むことができる。スプレーは、クロロフルオロ炭化水素のような通例の噴霧剤をさらに含むことができる。

経口投与するとき、治療薬は任意に被包される。様々の適切な被包システムが当該技術分野において公知である（“Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄｏｕｂｒｏｗ，Ｍ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９２；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ５：１３，１９８７；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ６：２７５，１９８７；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．３５：７５５，１９８８；Ｌａｎｇｅｒ Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３３：９４，２０００；Ｌａｎｇｅｒ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ６２：７，１９９９；Ｕｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９９：３１８１，１９９９；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ７５：２７，２００１；およびＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：３８９，１９９５）。例えば、治療薬は生物分解性の重合体ミクロスフェアまたはリポソーム内に被包できる。生物分解性のミクロスフェアの調製に有用な天然および合成重合体の例は、アルギン酸、セルロース、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリアミド、ポリホスファゼン、ポリプロピルフマル酸、ポリエーテル、ポリアセタル、ポリシアノアクリレート、生物分解性ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリ（オルトエステル）およびその他の生物分解性ポリエステルのような炭水化物を含む。リポソームの産生に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドのようなホスファチジル化合物を含む。

経口投与のための医薬組成物は、液体または固体であることができる。発明組成物の経口投与に有用な液体剤形は、薬剤的に許容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含む。被包された、またはされていない治療薬に加え、液体剤形は例えば、水またはその他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、キャスター、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルのような、可溶化剤および乳化剤ならびにそれらの混合物を含んでよい。不活性な希釈液に加え、経口組成物はまた、アジュバント、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味料、香味料および香料も含むことができる。ここで用いられる「アジュバント」との語は、免疫反応の非特異的調節物であるいずれの化合物を意味する。ある好ましい実施形態によれば、アジュバントは免疫反応を刺激する。いずれのアジュバントも本発明に従い使用されてよい。多数のアジュバント化合物が当該技術分野において公知である（Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：３，１９９８；Ｕｎｋｅｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２５１，１９９８；およびＰｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ１０：１５１，１９９２）。

経口投与のための固形剤形は、カプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒を含む。このような固形剤形において、被包された、またはされていない治療薬は、クエン酸ナトリウムもしくは第二リン酸カルシウムおよび／または（ａ）デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトールおよびケイ酸のような注入剤または増量剤、（ｂ）例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖およびアカシアのような結合剤、（ｃ）グリセロールのような保湿剤、（ｄ）寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、あるケイ酸、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤、（ｅ）パラフィンのような遅延剤、（ｆ）四級アンモニウム化合物のような吸収促進剤、（ｇ）例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤、（ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤、および（ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムのような潤滑剤およびそれらの混合物、のような不活性の薬剤的に許容可能な賦形剤または担体の少なくとも一つと混合される。カプセル、錠剤、および丸剤の場合もまた、剤形は緩衝剤を含んでよい。

類似型の固形組成物もまた、軟および硬ゼラチン注入カプセルにおいて、ラクトースまたはミルク、同様に高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いる注入剤として用いられてよい。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒の固形剤形は、腸溶コーティングおよびその他の製薬技術において公知のコーティングのような、コーティングおよびシェルにより調製できる。

治療薬の正確な用量は、治療される患者を考慮して個別の医師により選択される。一般に用量および投与は、治療される患者へ有効量の治療薬を供給するために調節される。ここで用いられる治療薬の「有効量」は、望まれる生物学的反応を引き出すために必要な量を意味する。当業者により認識され得るように、治療薬の有効量は、望まれる生物学的終点、送達される薬物、標的組織、投与経路などのような因子に依存して変動し得る。例えば、抗癌剤を含む治療薬の有効量は、望まれる期間にわたって望まれる量により腫瘍サイズの減少をもたらす量であり得る。考慮され得るさらなる因子は、疾病状態の重症度；治療される患者の年齢、体重および性別；食事、投与の回数および頻度；薬物の併用；反応感受性；および治療への耐性／反応を含む。長時間作用の医薬組成物は、特定の組成物の半減期およびクリアランス速度に依存して、３から４日毎、１週間毎、または２週間毎に投与されてよい。

本発明の治療薬は、好ましくは、投与の容易さおよび用量の均一性のための用量単位に処方される。ここで用いられる「用量単位型」との表現は、治療される患者に適切な治療薬の、物理的に別々の単位を意味する。しかしながら、本発明の組成物の一日使用の総量は、医学的判断と考えられる範囲内で、担当医師により決定され得ることが理解されるであろう。いずれの治療薬も、治療的有効量は最初に、細胞培養アッセイ、または通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタである動物モデルのいずれかにおいて推定できる。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するためにも用いられる。このような情報はその後、ヒトにおける投与の有用量および経路の決定のために用いることができる。治療薬の治療的有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準の薬理学的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療に有効な量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）により決定できる。毒性効果の治療効果に対する量の比率は治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療的指標を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲の公式化において使用される。

幾つかの異なる治療的様式（例えば異なる治療薬による）が同時に投与され、その後単一の医薬組成物内へ併用されてよい。あるいは、後に混合されるかまたは単に一つずつ投与される、別々の組成物として調製されてよい。幾つかの異なる治療薬（例えば異なる治療薬による）が別々の時間に投与される場合、別々の組成物として調製されるのが好ましい。併用療法において追加の薬物を含める場合、それらは１以上の治療薬に追加できるか、または別々の組成物として調製できる。

ペプチドは、生物分布、薬物動態および溶解度のような特性を変化させるため、化学的に修飾されてよい。薬物の溶解度および安定性を増大させるために様々な方法、中でも有機溶媒の使用、エマルジョンまたはリポソーム内への取り込み、ｐＨの調節、化学修飾およびシクロデキストリンとの複合体化が用いられている。シクロデキストリンは環状オリゴ糖ファミリーであり、グルコピラノースの６、７、または８単位を含む。立体相互作用のため、シクロデキストリンは内部腔をもつ錐体形の環状構造を形成する。これらは修飾可能である化学的に安定な化合物である。シクロデキストリンホストは、その腔の中で様々な疎水性のゲストと複合体を形成する。シクロデキストリンは、薬物の溶解および被包のために用いられる。

リポソームと制御放出
薬物送達システムを設計するため、必要量の薬物を標的部位へ必要な期間、効果的かつ正確に送達するための様々な種類の高機能担体物質が開発されている。シクロデキストリン、生物分解性または非生物分解性重合体、リポソーム、エマルジョンである。ゲスト分子の物理的、化学的および生物学的特性を変化させる能力により、複数のエマルジョンがこの役割のための強力な候補である。重合体マイクロカプセル、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソームおよびエマルジョンを含むがこれらに限定されない、幾つかの薬物送達システムが存在する。これらの多くは、ポリ無水物およびポリヒドロキシ酸のような、合成生物分解性重合体から調製される。これらのシステムにおいて薬物は、生物内部で日、月、または年までの期間に、薬物の少量かつ制御された一日量を放出する重合体ミクロスフェアに取り込まれる。

幾つかの重合体が、制御放出システムにおいて既に試験された。例えばポリウレタンがその弾力性について、ポリシロキサンまたはシリコンがその十分な遮蔽性について、メタクリル酸ポリメチルがその物理的形について；ポリビニルアルコールがその疎水性および抵抗性について、ポリエチレンがその硬度および非透過性について（Ｇｉｌｄｉｎｇ，Ｄ．Ｋ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｐｌ．Ｍａｔｅｒ．２：２０９−２３２，１９８１）。生物分解性重合体および生物適合性重合体は、その表面分解を起こす能力のため、制御放出システムにおけるビヒクルとして広く研究されてきた。これらの種類の重合体は、Ｔａｍａｄａ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄｎ，３（４）：３１５−３５３に記載されるように、ポリ（２−ヒドロキシ−メタクリル酸エチル）、ポリアクリルアミド、乳酸からの重合体（ＰＬＡ）、グリコール酸からの重合体（ＰＧＡ）、および各コポリマー（ＰＬＣＡ）の一つ、ならびにポリ（無水物）から選択される。

適切な制御放出ビヒクルは、生物適合性重合体、その他の重合体マトリックス、カプセル、マイクロカプセル、ナノカプセル、マイクロ粒子、ナノ粒子、ボーラス製剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフェアおよび移植可能か、可能でない経皮送達システムを含むがこれらに限定されない。

制御放出の満足なシステムは、シクロデキストリン、生物適合性重合体、生物分解性重合体、その他の重合体マトリックス、カプセル、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ボーラス製剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフェアおよび経皮投与システムを含むがこれらに限定されない。制御放出のその他の組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕで温度変化を与えたときに固体またはゲルを形成する液体を含む。

リポソームは、分子、例えば薬物が、個体への薬物投与の後に薬物の制御放出に至らせる対象と共に被包される、水溶性の内部区画を含む脂質小胞である。リポソーム調製のための多数の異なる技術が提案されている［米国特許第４，５５２，８０３号、Ｌｅｎｋ；米国特許第４，３１０，５０６号、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒ；米国特許第４，２３５，８７１号、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ；米国特許第４，２２４，１７９号、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ；米国特許第４，０７８，０５２号、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ；米国特許第４，３９４，３７２号、Ｔａｉｌｏｒ；米国特許第４，３０８，１６６号、Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ；米国特許第４，４８５，０５４号、Ｍｅｚｅｉ；および米国特許第４，５０８，７０３号、Ｒｅｄｚｉｎｉａｋ；Ｗｏｏｄｌｅ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７１：１９３−２１５（１９８９）］。単層の小胞は単一の膜を示す［Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ８：３３４−３５２（１９６９）］が、複数層の小胞（ＭＬＶ）は多数の同心円上の膜を有する［Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−２５２（１９６５）］。Ｂａｎｇｈａｍ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−２５２（１９６５）］の方法は、水溶性の区画の間での不均等な溶質分布、および結果として浸透圧の違いを提示する、「通常のＭＬＶ」を産生する。Ｌｅｎｋ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，５２２，８０３号；米国特許第５，０３０，４５３号および米国特許第５，１６９，６３７号）、Ｆｏｕｎｔａｉｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，５８８，５７８号）、Ｃｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，９７５，２８２号）およびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．（国際公開第９９／６５４６５号）は、区画の間で実質的に均質な溶質分布を提示するＭＬＶの調製法を紹介した。異なる区画の間での類似の溶質分布は、より大きな薬物被包効率、同様にこれらのＭＬＶを通常のＭＬＶよりも安定化する、より小さい浸透圧の違いを意味する。単層の小胞は、ＭＬＶの超音波処理［Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９６８）］により、またはポリカーボネート膜を通した噴出［Ｃｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，００８，０５０号）およびＬｏｕｇｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，０５９，４２１号）］により産生できる。

満足な脂質は例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、コレステロール、ホスファチジル酸、スフィンゴ脂質、糖脂質、脂肪酸、ステロール、ホスファチジルエタノールアミン、重合型または非重合型の重合可能な脂質、これらの脂質の混合物を含む。

リポソームの組成物は、器官または細胞型特異的になるように操作できる。リポソームの標的指向化は、解剖学的因子に基づくか、またはそれらの環境との相互作用の機序に基づくかのいずれかに分類されてきた。解剖学的分類は、その選択性のレベル、例えば器官特異性または細胞特異性に基づく。機序の観点からは、標的指向化は受動性または能動性として考慮できる。

受動的標的指向化は、網内系の細胞、すなわち主に肝臓、脾臓、および骨髄に固着するマクロファージにより捕獲される、従来のリポソームの自然な傾向を利用する。

立体的に安定化されたリポソーム（「ＰＥＧ−リポソーム」としても知られる）は、血液循環からの排除率の低下により特徴付けられる［Ｌａｓｉｃ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９５）］。

ＰＥＧ−リポソームは、そのオプソニンのような血漿タンパク質との相互作用を減少させ、その細胞による取り込み率を低下させる幾つかのリン脂質の頭部基に結合したポリエチレングリコール重合体を提示する。結果としてもたらされた立体障害は、これらのリポソームを従来のリポソームよりも長時間、循環中に留めることを可能にする［Ｌａｓｉｃ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９５）；Ｗｏｏｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１ １０５：１９３−２００（１９９２）；Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１ １９０：９９−１０７（１９９４）；Ｂｅｄｕ Ａｄｄｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７１８−７２４（１９９６）］。ＰＥＧ−リポソーム内への薬物の被包は、多数の化学療法剤［Ｌａｓｉｃ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｓｔｅａｌｔｈ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９５）］および生物活性ペプチド［Ａｌｌｅｎ Ｔ．Ｍ．Ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｎｅｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｆ．Ｐｕｉｓｉｅｕｘ，Ｐ．Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，Ｊ．Ｄｅｌａｔｔｒｅ，Ｊ．−Ｐ．Ｄｅｖｉｓｓａｇｕｅｔ Ｅｄ．），Ｅｄｉｔｉｏｎｓ ｄｅ Ｉａ Ｓａｎｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ，１９９５，ｐｐ．１２５］の有効性の改善をもたらした。

この領域での研究は、異なる因子がＰＥＧ−リポソームの有効性に作用することを示した。理想的には、小胞の直径は２００ｎｍ未満、ＰＥＧにおける単位数はおおよそ２，０００、およびＰＥＧ化脂質の割合は３から５ｍｏｌ％でなければならない［Ｌａｓｉｃ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９５）；Ｗｏｏｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１０５：１９３−２００（１９９２）；Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ１ １９０：９９−１０７（１９９４）；Ｂｅｄｕ Ａｄｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７１８−７２４（１９９６）］。

活性のある標的指向化は、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、タンパク質、重合体のようなリガンドとの会合を通した、または、従来のリポソームが蓄積するものとは異なる器官もしくは細胞を標的とするために脂質組成物もしくはリポソームサイズを変更することによる、リポソームの変化に関与する。

粘膜送達増強剤
「粘膜送達増強剤」は、水、塩および／または一般的な緩衝液、ならびに本発明の範囲内のペプチドを含む製剤（コントロール製剤）に添加したとき、最大血液、血清、または脳脊髄液濃度（Ｃｍａｘ）により、または濃度対時間のプロットにおける曲線下面積、ＡＵＣにより測定される、粘膜を横断するペプチド輸送の著しい増大を起こす製剤を産生する化学薬品およびその他の賦形剤として定義される。粘膜は鼻、口腔、腸、頬、気管支肺、膣、および直腸の粘膜表面を含み、かつ実際には外部と連絡する全ての体腔または経路を裏打ちする全ての粘液分泌膜を含む。

持続放出の組成物および方法
本発明は、１以上の粘膜送達増強剤および任意の単数または複数の持続放出増強剤と組み合わせた本発明の範囲内のペプチドを含む製剤の、改善した粘膜（例えば鼻の）送達を提供する。本発明の粘膜送達増強剤は、送達の効果的な増大、例えば粘膜に投与されたペプチドの治療活性を増強する最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）の増大をもたらす。血漿およびＣＮＳ中のペプチドの治療活性に影響を及ぼす第２の因子は、滞留時間（ＲＴ）である。鼻腔内送達増強剤と組み合わせた持続放出増強剤は、ペプチドのＣｍａｘを増大し、かつ滞留時間（ＲＴ）を増大する。持続放出増強剤をもたらす本発明の重合体送達ビヒクルおよびその他の薬剤ならびに方法、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をここに開示する。本発明の粘膜送達製剤および方法の範囲内で、粘膜送達のためペプチドはしばしば適切な担体またはビヒクルと組み合わせて、または協調的に投与される。ここで用いられる「担体」との語は、薬剤的に許容可能な固体または液体注入剤、希釈液または被包物質を意味する。水を含む液体担体は、酸性化剤、アルカリ化剤、抗微生物保存料、抗酸化剤、緩衝液、キレート剤、錯化剤、可溶化剤、保湿剤、溶媒、懸濁および／または粘度増強剤、等張化剤、湿潤剤、またはその他の生物適合性物質のような薬剤的に許容可能な添加剤を含むことができる。上のカテゴリーに収載した成分の作表はＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，１８５７−１８５９，（１９９０）に見出すことができる。ここで用いられる「粘膜送達増強剤」は、ペプチドまたはその他の生物活性化合物の放出または溶解度（例えば製剤送達ビヒクルからの）、拡散率、透過能およびタイミング、取り込み、滞留時間、安定性、有効な半減期、ピークまたは持続濃度レベル、クリアランスおよびその他の望まれる粘膜送達特性（例えば送達部位、または血流もしくは中枢神経系のような活性の標的部位において測定されるものとして）を増強する薬剤を含む。本発明の特定の態様によれば、本発明のペプチドの協調的投与または組み合わせ製剤のための吸収促進剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド、エタノール、プロピレングリコール、および２−ピロリドンを含むがこれらに限定されない、親水性小分子から選択される。あるいは、長鎖の両親媒性分子、例えばジアシルメチルスルホキシド、アゾン、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸、および胆汁酸が、ペプチドの粘膜透過性を増強するために用いられてよい。さらなる態様によれば、界面活性剤（例えばポリソルベート）が、ペプチドの鼻腔内送達を増強する補助化合物、処理剤、または製剤添加剤として用いられる。ＤＮＳＯ、ポリエチレングリコール、およびエタノールのような薬剤が送達環境に十分な高濃度で存在していれば（例えば前投与または治療製剤内への取り込みによって）、粘膜の水層に進入し、その可溶化特性を変化させ、それによってビヒクルから粘膜へのペプチドの分配を増大させる。本発明の粘膜治療および予防組成物は、粘膜関門を横切るペプチドの吸収、拡散、または透過を促進する、いずれの適切な透過促進剤が追加されてよい。透過促進剤は、薬剤的に許容可能ないずれの促進剤であってもよい。

電荷修飾およびｐＨ制御剤および方法
疎水性粘膜関門を横切る増強された送達のための生物活性薬剤（本発明のペプチドを含む）の輸送特性を改善するため、本発明は選択された生物活性薬剤またはここに述べる送達増強剤の電荷修飾のための技術および試薬もまた提供する。これについて、高分子の相対透過性は一般にその分配係数に関連する。分子のｐＫａおよび粘膜表面のｐＨに依存する分子のイオン化の程度は、分子の透過性にもまた影響を及ぼす。粘膜送達のための、本発明のペプチドを含む生物活性薬剤の浸透および分配は、活性剤または透過剤の電荷変化または電荷拡散により促進されてよく、これは例えば荷電官能基の変化により、活性剤が送達される送達ビヒクルまたは溶液のｐＨの変更により、または電荷もしくはｐＨ変更試薬と活性剤との協調的投与により達成される。これらの一般的教示に一致して、本発明のペプチドを含む荷電高分子種の粘膜送達は、活性剤が実質的に非イオン化または中性の電気的荷電状態において粘膜表面に送達されるとき、実質的に改善される。

本発明での使用のための、粘膜製剤の特定のペプチドおよびタンパク質成分は、ペプチドまたはタンパク質の陽性電荷密度の増大をもたらすため、電荷修飾され得る。これらの修飾はまた、ペプチドおよびタンパク質結合、担体、およびここに開示されるその他の送達型の陽イオン化にも及ぶ。

分解酵素阻害剤および方法
経粘膜製剤に含まれてよい別の賦形剤は分解酵素阻害剤である。生物活性薬剤を保護するために酵素活性を阻害するいずれの阻害剤も、本発明の組成物および方法中に有用に用いられてよい。生物活性タンパク質およびペプチドの保護のための有用な酵素阻害剤は、例えば大豆トリプシン阻害剤、膵臓トリプシン阻害剤、キモトリプシン阻害剤、ならびにジャガイモ（ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）塊茎から分離されたトリプシンおよびキモトリプシン阻害剤を含む。阻害剤は担体、例えば鼻粘膜に接触する剤形の表面にコートされた親水性ポリマーに取り込まれるかもしくは結合してよく、または生物活性薬剤との組み合わせ、もしくは別々に投与される（例えば前投与される）製剤において表面の表層に取り込まれる。本発明での使用のためのさらなる酵素阻害剤は、その効力および毒性の程度が異なる広範囲の非タンパク質阻害剤から選択される。以下にさらに詳細に述べるように、これらの補助剤のマトリックスもしくはその他の送達ビヒクルへの不動化、または化学的に修飾された類似体の開発は、それらが遭遇したときに毒性効果を減少または除去するために容易に実行され得る。候補となる広範囲な群の間で、本発明での使用のための酵素阻害剤は、強力で不可逆的なセリンプロテアーゼ（例えばトリプシンおよびキモトリプシン）阻害剤であるジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）のような有機リン阻害剤である。本発明の方法および組成物での使用のための酵素阻害剤のさらに別の型は、特定の治療化合物の酵素分解を阻害するアミノ酸および修飾アミノ酸である。

本発明の治療薬は、ＧＰＣＲ関連シグナル伝達経路の調節が効果的な疾患の治療のために使用できる。例えば、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドが、細胞または対象におけるリラキシン関連ＧＰＣＲ受容体および／またはＧＰＣＲのＬＧＲファミリー反応の調節または活性化が効果的である疾患の治療のために使用される。このようなペプチドの例を配列番号：１〜１５、２０〜２６に示す。別の例によれば、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドが、ＧＰＣＲのリラキシン関連ファミリーおよび／またはＧＰＣＲのＬＧＲファミリーにおけるリラキシンまたはリラキシン関連ペプチド活性のアゴニストに付随する活性化および／または調節に関与するいずれの疾病または状態を治療するため、それ自体でまたはリラキシンもしくはいずれのリラキシン関連ペプチドもしくはその他の化合物との組み合わせのいずれかによってさらに用いられ、ここで受容体の活性化および／または調節は、受容体または該受容体もしくはその他のいずれの関連経路により活性化されたＧ−タンパク質に直接関連する下流経路の直接的な活性化により、あるいは、リラキシンまたはいずれのリラキシン関連ペプチドもしくはその他の化合物のいずれかによる間接的な活性化によることができる。疾患は過形成性疾患、新生物疾患、癌；線維症、コラーゲン沈着疾患、繊維分解、結合組織の再構成、無制御のまたは異常なコラーゲンもしくはフィブロネクチン形成または分解；創傷治癒および瘢痕、強皮症を含む皮膚損傷；女性生殖疾患、男性および女性不妊症、潜在停留睾丸症、生殖腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節障害、を含む泌尿生殖器疾患；子癇前症または分娩合併症のような妊娠に付随する状態；血管新生に関連する疾患；循環器疾患、血管拡張、血管収縮または高血圧症、内皮の機能不全および血管疾患、うっ血性心不全、冠状動脈疾患、虚血、および虚血再潅流障害、末梢血管疾患；腎臓病、動脈硬化または腎臓毛細血管のその他狭窄に付随する腎臓病；眼、末梢指節、盲腸間膜、肺および末梢脈管構造などに起こる体内毛細血管の狭窄；ＣＮＳ関連疾患、神経障害、認知および記憶に関連する徴候、うつ病、神経学的改変；胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍のような炎症性疾患；自己免疫疾患；ウイルス感染並びに線維症および肝硬変を含む感染に関連する疾病に付随する炎症状態；レイノー病、レイノー現象；骨粗鬆症を含む骨に関連する状態；摂食および水分摂取を含む代謝異常、糖尿病、肥満；喘息、ＣＯＰＤ、気管支疾患、肺疾患、嚢胞性線維症、ＡＲＤＳ、ＳＡＲＳを含む呼吸器疾患または肺疾患から選択されるがこれらに限定されない。

別の態様によれば、本発明はリラキシン関連ＧＰＣＲファミリーまたはＧＰＣＲのＬＧＲファミリーを介するかまたはこれに関連する疾患または状態の患者における症状を治療、予防、または寛解する方法を提供する。疾患または状態は、過形成性疾患、新生物疾患、癌；線維症、コラーゲン沈着疾患、繊維分解、結合組織の再構成、無制御のまたは異常なコラーゲンもしくはフィブロネクチン形成または分解；創傷治癒および瘢痕、強皮症を含む皮膚損傷；女性生殖疾患、男性および女性不妊症、潜在停留睾丸症、生殖腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節障害、を含む泌尿生殖器疾患；子癇前症または分娩合併症のような妊娠に付随する状態；血管新生に関連する疾患；循環器疾患、血管拡張、血管収縮または高血圧症、内皮の機能不全および血管疾患、うっ血性心不全、冠状動脈疾患、虚血、および虚血再潅流障害、末梢血管疾患；腎臓病、動脈硬化または腎臓毛細血管のその他狭窄に付随する腎臓病；眼、末梢指節、盲腸間膜、肺および末梢脈管構造などに起こる体内毛細血管の狭窄；ＣＮＳ関連疾患、神経障害、認知および記憶に関連する徴候、うつ病、神経学的改変；胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍のような炎症性疾患；自己免疫疾患；ウイルス感染並びに線維症および肝硬変を含む感染に関連する疾病に付随する炎症状態；レイノー病、レイノー現象；骨粗鬆症を含む骨に関連する状態；摂食および水分摂取を含む代謝異常、糖尿病、肥満；喘息、ＣＯＰＤ、気管支疾患、肺疾患、嚢胞性線維症、ＡＲＤＳ、ＳＡＲＳを含む呼吸器疾患または肺疾患から成るが、これらに限定されない群から選択される。該方法は、有効量の本発明のペプチドを患者に投与することを含む。

さらなる態様によれば、本発明はＧＰＣＲのリラキシン関連ファミリーまたはＬＧＲ ＧＰＣＲファミリー関連疾患または状態に関わるいずれの疾病または状態の患者を治療するための、薬物の製造における本発明の類似体および／または医薬組成物の使用を企図する。疾患は、過形成性疾患、新生物疾患、癌；線維症、コラーゲン沈着疾患、繊維分解、結合組織の再構成、無制御のまたは異常なコラーゲンもしくはフィブロネクチン形成または分解；創傷治癒および瘢痕、強皮症を含む皮膚損傷；女性生殖疾患、男性および女性不妊症、潜在停留睾丸症、生殖腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節障害、を含む泌尿生殖器疾患；子癇前症または分娩合併症のような妊娠に付随する状態；血管新生に関連する疾患；循環器疾患、血管拡張、血管収縮または高血圧症、内皮の機能不全および血管疾患、うっ血性心不全、冠状動脈疾患、虚血、および虚血再潅流障害、末梢血管疾患；腎臓病、動脈硬化または腎臓毛細血管のその他狭窄に付随する腎臓病；眼、末梢指節、盲腸間膜、肺および末梢脈管構造などに起こる体内毛細血管の狭窄；ＣＮＳ関連疾患、神経障害、認知および記憶に関連する徴候、うつ病、神経学的改変；胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍のような炎症性疾患；自己免疫疾患；ウイルス感染並びに線維症および肝硬変を含む感染に関連する疾病に付随する炎症状態；レイノー病、レイノー現象；骨粗鬆症を含む骨に関連する状態；摂食および水分摂取を含む代謝異常、糖尿病、肥満；喘息、ＣＯＰＤ、気管支疾患、肺疾患、嚢胞性線維症、ＡＲＤＳ、ＳＡＲＳを含む呼吸器疾患または肺疾患から成るが、これらに限定されない群から選択される。

ここで用いられる「ＧＰＣＲのリラキシン関連ファミリー、またはＬＧＲ、ＧＰＣＲファミリー関連疾患もしくは状態」との語は、ＧＰＣＲのリラキシン関連ファミリー、またはＬＧＲ、ＧＰＣＲファミリーが、疾病または状態の発生、維持もしくは進行を伴うか、または関係する状態を意味する。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、炎症または虚血再潅流障害に続く組織修復に関与し、心内膜心筋線維症および心臓線維症を含むがこれらに限定されない繊維化状態；縦隔線維症；特発性肺線維症；肺線維症；後腹膜線維症；脾臓の線維症；膵臓の線維症；アルコールに関連するか、またはしない（ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶのようなウイルス感染を含む）肝線維症（肝硬変）；線維腫症；肉芽腫性肺疾患；糸球体腎炎、心筋梗塞後の心筋瘢痕；子宮内膜線維症および子宮内膜症；損傷または外科的処置による創傷の治癒、糖尿病に関連する創傷線維症の治療にも有用である。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、循環器病およびその合併症、末梢血管疾患および心筋梗塞を含むがこれに限定されない冠状動脈疾患；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心筋障害；心筋肥大；虚血性心筋症；収縮期心不全；拡張期心不全；脳卒中；血栓性梗塞；求心性左心室肥大、心筋炎；心筋症；肥大型心筋症；心筋炎；非代償性心不全；虚血性心筋症；先天性心疾患；狭心症；心筋梗塞後の心臓再構成または心室再構成；虚血および虚血後事象（例えば心筋梗塞）における虚血再潅流障害；脳血管障害；僧帽弁逆流；高血圧症；低血圧症；再狭窄；線維症；血栓症；または血小板凝集の治療にも有用である。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドは、血栓性梗塞；心筋梗塞；狭心症；塞栓性脈管閉塞；末梢血管機能不全；内臓動脈閉塞；血栓または塞栓症による動脈閉塞、腸間膜血流または敗血症後等の非閉塞性プロセスによる動脈閉塞；腸間膜動脈閉塞；腸間膜静脈閉塞；腸間膜微小循環への虚血再潅流障害；虚血性急性腎不全；大脳組織への虚血再潅流障害；腸管重積症（；血流力学的ショック；組織機能障害；臓器不全；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；血栓症；血小板凝集を含むがこれに限定されない、器官および組織における虚血および虚血後事象に付随する虚血再潅流障害の治療に有用である。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドは、心臓手術のような手段を含むがこれに限定されない状態に続く虚血再潅流障害；臓器手術；臓器移植；血管造影；心肺および脳蘇生の治療に有用である。

別の態様によれば、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドは、高血圧性心疾患；抗高血圧症；全身性および肺性高血圧；脳血管疾患および脳卒中；心不全および発作；左心室肥大（ＬＶＨ）；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；高血圧症、高血圧；血管拡張；腎性高血圧症；利尿；腎炎；ナトリウム利尿；強皮症、腎発症；狭心症（安定および不安定）；心筋梗塞；心臓発作；冠状動脈疾患；冠状動脈性心疾患；不整脈；心房細動；門脈圧亢進症；眼圧上昇；脈管再狭窄；慢性高血圧症；弁膜症；心筋虚血；急性肺水腫；急性冠動脈症候群；高血圧性網膜症；高血圧性悪阻；子癇前症；レイノー現象；勃起不全および緑内障を含むが、これらに限定されない高血圧症およびその合併症の予防および治療に用いられる。これらのペプチドはまた、抗血栓療法における血管拡張薬としても用いられる。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、感染に付随する炎症状態、例えば細菌感染、またはヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＴＶ−１）またはＨＴＶ−２、後天性免疫不全（ＡＩＤＳ）、ウエストナイル脳炎ウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＡＶにより引き起こされるウイルス感染を含むがこれらに限定されないウイルス感染、出血熱；耳化学的感染症；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、敗血症および副鼻腔炎の治療にも有用である。

別の態様によれば、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、癌、または大腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、膵癌、卵巣癌、腎臓癌、精巣癌、骨癌、骨肉腫、または肝臓癌（ＨＢＶ／ＨＣＶに関連するか、または関連しない）を含むがこれらに限定されない固形癌のような癌に付随する炎症の予防および治療においても有用である。癌は、あるいは黒色腫、神経膠腫、肉腫、白血病、またはリンパ腫であってよい。これらのペプチドはまた、浸潤性および転移性癌の予防および治療においても有用である。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドは、真皮再建を含むがこれに限定されない皮膚損傷、創傷治癒；火傷、紅班、外傷、外科的処置に続く創傷治癒；乾癬、狼瘡およびカポジ肉腫を含むがこれらに限定されない状態に誘発される外傷を含む皮膚または組織の外傷；強皮症、および皮膚のコラーゲン性疾患および皮膚癌における予防および治療に用いられる。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドは、腎臓病；膀胱疾患；生殖器系の疾患；婦人科疾患；尿路疾患；失調症；男性生殖器系（精子形成や精子運動性）および女性生殖器系の疾患；性機能障害；勃起不全；胚形成；および妊娠に付随する状態を含むがこれに限定されない、泌尿生殖器疾患または泌尿生殖器−泌尿器科疾患の予防または治療において用いられる。これらはまた、妊娠のモニタリングにも用いられる。ここで用いられる「妊娠に付随する状態」との語は、受精、妊娠、出産、および授乳の状態を含むがこれらに限定されない。本発明の別の実施形態によれば、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドの使用を含み、ここで前記の妊娠に関連する疾患は、異常な子宮内膜の血管新生；胎盤発生の欠損；子宮頚部熟化（軟化）；異常な着床；乳頭の発達および機能障害；妊娠に関連する子宮組織の再構成；子宮内膜症；子癇前症；乳汁分泌障害；エストロゲンおよび非エストロゲンに関連するホルモン障害；早期出産；過期出産；および分娩合併症から成る群より選択される。

本発明はまた、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドのような、式Ｉの範囲内のペプチドも提供し、これらは喘息を含むがこれに限定されない呼吸器疾患、気管支疾患、肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、喘息に関連する線維症、嚢胞性線維症の予防または治療において用いられる。

本発明はまた、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるペプチドのような、式Ｉの範囲内のペプチドも提供し、これらは糖尿病、糖尿病症、リポジストロフィ、甲状腺機能亢進症、緑内障、高脂血症、インスリン非依存性糖尿病、摂食；水分摂取；摂食行動および飲水行動、食欲不振症、悪液質；脂肪および脂質代謝；ならびに活力コントロール、食欲制御および肥満を含むがこれらに限定されない代謝異常の予防または治療において用いられる。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、糖尿病性ネフロパチー；糸球体硬化症；腎症；腎臓機能障害；強皮症、腎発症および慢性腎不全を含むがこれらに限定されない腎臓病の予防および治療においても用いられる。これらのペプチドはまた、抗利尿薬としても使用できる。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、幾つかのヒトの眼疾患、例えば糖尿病症、未熟児網膜症および加齢性黄斑変性における網膜血管新生、または前立腺癌、脳癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮頚部癌、黒色腫、軟部組織肉腫、リンパ腫、頭頚部癌およびグリア芽腫を含むがこれらに限定されない原発性癌もしくは転移性癌における癌関連血管新生、を含むがこれらに限定されない血管新生に関連する状態の予防および治療においても用いられる。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、中枢神経および末梢神経の変性神経障害；神経保護；認知障害；不安障害、疼痛管理、摂食、行動障害、学習障害、睡眠障害、記憶障害、麻酔に対する病理学的応答、嗜癖、うつ病、片頭痛、月経異常、筋痙攣、アヘン剤依存、痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、皮質機能、歩行活動、アルコールおよび薬物嗜癖並びに乱用；記憶減損；摂食および飲水に関連する行動；ストレス管理、双極性障害；精神分裂病；分裂情動障害；多発性硬化症（ＭＳ）；脳卒中および脳卒中損傷の修復（虚血保護）；脳内での脈管構造形成および脈管構造再形成；および脳組織再生および末梢神経系障害を含むが、これらに限定されない中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の治療のためにも用いられる。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、骨粗鬆症；変形性関節症；大理石骨病；骨不整合；骨肉腫；および骨への癌転移を含むがこれらに限定されない骨および骨関連疾患の患者の治療のためにも用いられる。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、循環器病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、血栓症、心筋梗塞、心不全、腎臓病、多代謝異常症候群、勃起不全；脈管炎；中枢神経系（ＣＮＳ）の疾病から成る群より選択される内皮の機能不全疾患の治療のためにも用いられる。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、炎症性疾患の対象の治療のためにも用いられる。該炎症性疾患は、胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍、慢性気管支炎、喘息、アレルギー、急性肺損傷、肺炎症、気道過敏性、脈管炎、敗血症性ショック、および乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹を含むがこれらに限定されない炎症性皮膚疾患であってよい。

例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるような、式Ｉの範囲内の本発明のペプチドはまた、自己免疫疾病または疾患の対象の治療のためにも用いられる。該自己免疫疾病は、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植拒絶反応、グラフト移植拒絶反応に付随する免疫疾患、良性リンパ性腸管炎，紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーブズ病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存性糖尿病症、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性作用肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患，多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、炎症性リウマチ、変性リウマチ、関節外リウマチ、膠原病、慢性多発性関節炎、関節症性乾癬、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、肩関節周囲炎、結節性多発動脈炎、進行性全身性強皮症、尿酸塩性関節炎、皮膚筋炎、筋肉リウマチ、筋炎、筋硬症および軟骨石灰化症であってよい。

式Ｉの化合物は、ここに述べられる疾患、疾病および／または状態を、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチドを投与することにより治療するために使用できる。

本発明はまた、ＧＰＣＲ関連シグナル伝達経路の調節が効果的な疾患の治療のための方法も提供する。例えば本発明は、ＧＰＣＲのリラキシン関連ファミリーおよび／またはＧＰＣＲのＬＧＲファミリーの調節が効果的な疾患を、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより治療する方法を提供する。このような疾病、疾患および／または状態は、過形成性疾患、新生物疾患、癌；線維症、コラーゲン沈着疾患、繊維分解、結合組織の再構成、無制御のまたは異常なコラーゲンもしくはフィブロネクチン形成または分解；創傷治癒および瘢痕、強皮症を含む皮膚損傷；女性生殖疾患、男性および女性不妊症、潜在停留睾丸症、生殖腺下降を含む精子形成および生殖発生の調節障害、を含む泌尿生殖器疾患；子癇前症または分娩合併症のような妊娠に付随する状態；血管新生に関連する疾患；循環器疾患、血管拡張、血管収縮または高血圧症、内皮の機能不全および血管疾患、うっ血性心不全、冠状動脈疾患、虚血、および虚血再潅流障害、末梢血管疾患；腎臓病、動脈硬化または腎臓毛細血管のその他狭窄に付随する腎臓病；眼、末梢指節、盲腸間膜、肺および末梢脈管構造などに起こる体内毛細血管の狭窄；ＣＮＳ関連疾患、神経障害、認知および記憶に関連する徴候、うつ病、神経学的改変；胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍のような炎症性疾患；自己免疫疾患；ウイルス感染並びに線維症および肝硬変を含む感染に関連する疾病に付随する炎症状態；レイノー病、レイノー現象；骨粗鬆症を含む骨に関連する状態；摂食および水分摂取を含む代謝異常、糖尿病、肥満；喘息、ＣＯＰＤ、気管支疾患、肺疾患、嚢胞性線維症、ＡＲＤＳ、ＳＡＲＳを含む呼吸器疾患または肺疾患から選択されるがこれらに限定されない。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、炎症性疾患を治療する方法も提供する。該炎症性疾患は、胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍、慢性気管支炎、喘息、アレルギー、急性肺損傷、肺炎症、気道過敏性、脈管炎、敗血症性ショック、および乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹を含むがこれらに限定されない炎症性皮膚疾患であってよい。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、組織修復に関与する繊維症を治療する方法も提供する。該繊維症は、心内膜心筋線維症および心臓線維症；縦隔線維症；特発性肺線維症；肺線維症；後腹膜線維症；脾臓の線維症；膵臓の線維症；アルコールに関連するか、またはしない（ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶのようなウイルス感染を含む）肝線維症（肝硬変）；線維腫症；肉芽腫性肺疾患；糸球体腎炎、心筋梗塞後の心筋瘢痕；子宮内膜線維症および子宮内膜症；損傷または外科的処置による創傷の治癒、糖尿病に関連する創傷線維症であってよい。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、自己免疫疾病または疾患を治療する方法も提供する。該自己免疫疾病は、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植拒絶反応、グラフト移植拒絶反応に付随する免疫疾患、良性リンパ性腸管炎，紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーブズ病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存性糖尿病症、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性作用肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患，多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、炎症性リウマチ、変性リウマチ、関節外リウマチ、膠原病、慢性多発性関節炎、関節症性乾癬、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、肩関節周囲炎、結節性多発動脈炎、進行性全身性強皮症、尿酸塩性関節炎、皮膚筋炎、筋肉リウマチ、筋炎、筋硬症および軟骨石灰化症であってよい。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、循環器病を治療する方法も提供する。該循環器病は、末梢血管疾患および心筋梗塞を含むがこれに限定されない冠状動脈疾患；冠状動脈性心疾患；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；心筋障害；心筋肥大；虚血性心筋症；収縮期心不全；拡張期心不全；脳卒中；血栓性梗塞；求心性左心室肥大、心筋炎；心筋症；肥大型心筋症；心筋炎；非代償性心不全；虚血性心筋症；先天性心疾患；狭心症；心筋梗塞後の心臓再構成または心室再構成；虚血および虚血後事象（例えば心筋梗塞）における虚血再潅流障害；脳血管障害；僧帽弁逆流；高血圧症；低血圧症；再狭窄；線維症；血栓症；または血小板凝集であってよい。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、虚血再潅流障害を治療する方法も提供する。該虚血再潅流障害は、血栓性梗塞；心筋梗塞；狭心症；塞栓性脈管閉塞；末梢血管機能不全；内臓動脈閉塞；血栓または塞栓症による動脈閉塞、腸間膜血流または敗血症後等の非閉塞性プロセスによる動脈閉塞；腸間膜動脈閉塞；腸間膜静脈閉塞；腸間膜微小循環への虚血再潅流障害；虚血性急性腎不全；大脳組織への虚血再潅流障害；腸管重積症；血流力学的ショック；組織機能障害；臓器不全；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；血栓症；血小板凝集を含むがこれに限定されない、器官および組織における虚血および虚血後事象に付随してよい。あるいは該虚血再潅流障害は、心臓手術；臓器手術；臓器移植；血管造影；心肺および脳蘇生を含むがこれらに限定されない状態に続いて起こり得る。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、高血圧症およびその合併症を予防ならびに治療する方法も提供する。該高血圧症およびその合併症は、高血圧性心疾患；抗高血圧症；全身性および肺性高血圧；脳血管疾患および脳卒中；心不全および発作；左心室肥大（ＬＶＨ）；うっ血性心不全（ＣＨＦ）；高血圧症、高血圧；血管拡張；腎性高血圧症；利尿；腎炎；ナトリウム利尿；強皮症、腎発症；狭心症（安定および不安定）；心筋梗塞；心臓発作；冠状動脈疾患；冠状動脈性心疾患；不整脈；心房細動；門脈圧亢進症；眼圧上昇；脈管再狭窄；慢性高血圧症；弁膜症；心筋虚血；急性肺水腫；急性冠動脈症候群；高血圧性網膜症；高血圧性悪阻；子癇前症；レイノー現象；勃起不全および緑内障であってよい。これらのペプチドはまた、血管拡張薬として、また抗血栓療法においても用いられる。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、炎症性疾患および／または感染に付随する状態を治療する方法も提供する。該感染に付随する炎症状態は、細菌感染、またはヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＴＶ−１）またはＨＴＶ−２、後天性免疫不全（ＡＩＤＳ）、ウエストナイル脳炎ウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、ＨＡＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶにより引き起こされるウイルス感染を含むがこれらに限定されないウイルス感染、出血熱；耳化学的感染症；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、敗血症および副鼻腔炎であってよい。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、癌、または癌に付随する炎症を治療する方法も提供する。該癌、または癌に付随する炎症は、大腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、膵癌、卵巣癌、精巣癌、骨癌、骨肉腫、肝臓癌（ＨＢＶ／ＨＣＶに関連するか、または関連しない）、または腎臓癌を含むが、これらに限定されない固形癌であってよい。該癌は、あるいは黒色腫、神経膠腫、肉腫、白血病、またはリンパ腫であってよい。これらのペプチドはまた、浸潤性および転移性癌の予防および治療においても有用である。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、皮膚損傷疾病、疾患および／または状態を治療する方法も提供する。該皮膚損傷疾病、疾患および／または状態は、真皮再建、創傷治癒；火傷、紅班、外傷、外科的処置に続く創傷治癒；乾癬、狼瘡およびカポジ肉腫を含むがこれらに限定されない状態に誘発される外傷を含む皮膚または組織の外傷；強皮症、および皮膚のコラーゲン性疾患および皮膚癌であってよい。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、泌尿生殖器疾患または泌尿生殖器−泌尿器科疾患を予防または治療する方法も提供する。該泌尿生殖器疾患または泌尿生殖器−泌尿器科疾患は、腎臓病；膀胱疾患；生殖器系の疾患；婦人科疾患；尿路疾患；失調症；男性生殖器系（精子形成や精子運動性）および女性生殖器系の疾患；性機能障害；勃起不全；胚形成；および妊娠に付随する状態であってよい。これらはまた、妊娠のモニタリングにも用いられる。ここで用いられる「妊娠に付随する状態」との語は、受精、妊娠、出産、および授乳の状態を含むがこれらに限定されない。別の実施形態による本発明は前述の方法を含み、ここで前記の妊娠に関連する疾患は、異常な子宮内膜の血管新生；胎盤発生の欠損；子宮頚部熟化（軟化）；異常な着床；乳頭の発達および機能障害；妊娠に関連する子宮組織の再構成；子宮内膜症；子癇前症；乳汁分泌障害；エストロゲンおよび非エストロゲンに関連するホルモン障害；早期出産；過期出産；および分娩合併症から成る群より選択される。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉ，ＩＩ，ＩＶおよびＶＩの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、呼吸器疾患を予防または治療する方法も提供する。該呼吸器疾患は、喘息、気管支疾患、肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、喘息に関連する線維症、嚢胞性線維症であってよい。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、代謝異常を予防または治療する方法も提供する。該代謝異常は、糖尿病、糖尿病症、リポジストロフィ、甲状腺機能亢進症、緑内障、高脂血症、インスリン非依存性糖尿病、摂食；水分摂取；摂食行動および飲水行動、食欲不振症、悪液質；脂肪および脂質代謝；ならびに活力コントロール、食欲制御および肥満であってよい。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の１の範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、腎臓病を予防および治療する方法も提供する。該腎臓病は、糖尿病性ネフロパチー；糸球体硬化症；腎症；腎臓機能障害；強皮症、腎発症および慢性腎不全であってよい。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、血管新生に関連する状態を予防および治療する方法も提供する。該血管新生に関連する状態は、幾つかのヒトの眼疾患、例えば糖尿病症、未熟児網膜症および加齢性黄斑変性における網膜血管新生、または前立腺癌、脳癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮頚部癌、黒色腫、軟部組織肉腫、リンパ腫、頭頚部癌およびグリア芽腫を含むがこれらに限定されない原発性癌もしくは転移性癌における癌関連血管新生、を含むがこれらに限定されない。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を治療する方法も提供する。該中枢神経系（ＣＮＳ）疾患は、中枢神経および末梢神経の変性神経障害；神経保護；認知障害；不安障害、疼痛管理、摂食、行動障害、学習障害、睡眠障害、記憶障害、麻酔に対する病理学的応答、嗜癖、うつ病、片頭痛、月経異常、筋痙攣、アヘン剤依存、痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、皮質機能、歩行活動、アルコールおよび薬物嗜癖並びに乱用；記憶減損；摂食および飲水に関連する行動；ストレス管理、双極性障害；精神分裂病；分裂情動障害；多発性硬化症（ＭＳ）；脳卒中および脳卒中損傷の修復（虚血保護）；脳内での脈管構造形成および脈管構造再形成；および脳組織再生および末梢神経系障害を含むが、これらに限定されない。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、骨および骨関連疾患を治療する方法も提供する。該骨および骨関連疾患は、骨粗鬆症；変形性関節症；大理石骨病；骨不整合；骨肉腫；および骨への癌転移を含むがこれらに限定されない。

本発明はまた、必要に応じて対象へ治療に有効な量の式Ｉの範囲のペプチド、例えば配列番号：１〜１５、２０〜２６に示されるようなペプチドを投与することにより、内皮の機能不全疾患を治療する方法も提供する。該内皮の機能不全疾患は、循環器病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、血栓症、心筋梗塞、心不全、腎臓病、多代謝異常症候群、勃起不全；脈管炎；中枢神経系（ＣＮＳ）の疾病から成る群より選択される。

上で詳述したように、本発明のペプチド配列をコードするｃＤＮＡが、それぞれの疾病、疾患および／または状態を治療するための遺伝子治療において任意に用いられる。

本発明を、以下の実施例において更に例証する。

実施例１：ペプチド合成
Ｃ１ＱＴ８に由来するＰ７４、Ｐ５９‐ＳおよびＰ５９に関連する全ペプチド、仮定タンパク質（配列番号：１９）またはそのオルソログもしくは相同配列を含有するコラーゲン反復：
＞Ｐ６０８２７ Ｃ１ＱＴ８＿ＨＵＭＡＮ 相補Ｃ１ｑ腫瘍壊死因子関連タンパク質８‐Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）
ＭＡＡＰＡＬＬＬＬＡＬＬＬＰＶＧＡＷＰＧＬＰＲＲＰＣＶＨＣＣＲＰＡＷＰＰＧＰＹＡＲＶＳＤＲＤＬＷＲＧＤＬＷＲＧＬＰＲＶＲＰＴＩＤＩＥＩＬＫＧＥＫＧＥＡＧＶＲＧＲＡＧＲＳＧＫＥＧＰＰＧＡＲＧＬＱＧＲＲＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＥＧＬＨＳＳＤＨＦＱＡＶＰＦＤＴＥＬＶＮＬＤＧＡＦＤＬＡＡＧＲＦＬＣＴＶＰＧＶＹＦＬＳＬＮＶＨＴＷＮＹＫＥＴＹＬＨＩＭＬＮＲＲＰＡＡＶＬＹＡＱＰＳＥＲＳＶＭＱＡＱＳＬＭＬＬＬＡＡＧＤＡＶＷＶＲＭＦＱＲＤＲＤＮＡＩＹＧＥＨＧＤＬＹＩＴＦＳＧＨＬＶＫＰＡＡＥＬ
ペプチドＰ５９−Ｓ−アミド（アミド）：ＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：１）；
ペプチドＰ５９−ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：２）；
ペプチドＰ５９−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：３）；
ペプチドＰ５９（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：４）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶ＊ＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：５）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶ＊ＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：６）；
ペプチドＰ７４−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：７）；
ペプチドＰ７４（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：８）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶ＊ＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：９）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶ＊ＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：１０）；
ペプチドＰ５９ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１１）；
ペプチドＰ５９−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１２）；
ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶ＊ＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１３）；
ペプチドＰ７４−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１４）；
ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶ＊ＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１５）；
ペプチドＰ５９−チンパンジー：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２０）；
ペプチドＰ５９−オランウータン：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２１）；
ペプチドＰ５９−アカゲザル：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２２）；
ペプチドＰ５９−雌ウシ：ＧＱＫＧＱＡＧＬＰＧＡＱＣＰＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２３）；
ペプチドＰ５９−ニワトリ：ＧＱＫＧＱＰＧＰＱＧＨＳＣＫＱＬＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２４）；
ペプチドＰ５９−Ｃ１ＱＴＮＦ１（ヒト）：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＥＲＣＫＳＨＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２５）；
ペプチドＰ５９−ラット：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＤＨＣＫＳＱＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２６）、
＊ペプチド内のＣｙｓ残基を合成ペプチド中ではＶで置換し、ペプチド中のシステイン残基での二量化を抑制するようにした。

他に断わりのない限り、ペプチドは固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法によって合成し、樹脂から切断し、ＲＰ‐ＨＰＬＣで精製した。ペプチドのアイデンティティーは質量分析法により検証した。ＲＰ‐ＨＰＬＣで測定したペプチドの最終純度は＞９０％であった。ペプチドは０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈した。全てのプレートを使用まで‐８０℃で保管した。

実施例２：ＬＧＲ７およびＬＧＲ６を発現するＣＨＯ‐Ｋ１細胞中でのｃＡＭＰ蓄積に及ぼすペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）並びにＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の効果

ｃＡＭＰ濃度に作用するペプチドの能力を、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）またはＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）を一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞中で検査した。この実験では、ペプチドの添加に対するｃＡＭＰ濃度を測定した。

ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）またはＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）を以下のようにしてＣＨＯ‐Ｋ１細胞中に一過性にトランスフェクトした：細胞（１２００万個）をトランスフェクションの前日にＴ７５フラスコ中に播種した。製造元の推奨に従って液法を用いて、ＧＰＣＲのＤＮＡおよびＧ_α１６で細胞をトランスフェクトした。細胞を５時間かけてトランスフェクトし、その後９６ウェルディッシュへ再播種して（６００００細胞／ウェル）一夜増殖させた。トランスフェクトした細胞を９６ウェルプレートの２４ウェル中に播種した。細胞は、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（刺激緩衝液）で１０分間、３７℃で前処理し、その後ポジティブコントロール（リラキシン２）または候補ペプチドのいずれかで刺激し（Ｇｓ機能検査用）、次いで１０μＭ フォルスコリンで刺激またはプレインキュベーションした（Ｇｉ機能検査用）。フォルスコリン存在下または非存在下のいずれかで、１μＭのポジティブコントロールまたは試験ペプチドのいずれかとインキュベーションして２０分間刺激した後、Ｈｉｔ Ｈｕｎｔｅｒ ｃＡＭＰキット（ＤｉｓｃｏｒＲｘ社）を用いて製造元が推奨する手順に従い細胞内ｃＡＭＰのアッセイを行った。データを標準ｃＡＭＰ検量線に当てはめてｎｍｏｌのｃＡＭＰに変換した。

ポジティブコントロールとしてリラキシンを使用した。フォルスコリンでの前処理によって、ｃＡＭＰレベルが増加した。

トランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞を１０μＭのフォルスコリン（Ａｐｐｌｉｅｄ ｃｅｌｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＡＣＳ））で１０分間処理した後、１μＭのＨ２リラキシン（ＡＣＳ）（ポジティブコントロールとして）、１μＭのペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）およびペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）で負荷した。

結果を図１に示す。図１から分かる通り、ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）とＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）の両方が、フォルスコリンによる刺激に対するｃＡＭＰ阻害効果およびＨ２リラキシンポジティブコントロールが細胞に及ぼす効果についてｃＡＭＰ阻害効果を示した。Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）とＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）は両方の受容体上で１μＭにて、明確なｃＡＭＰ阻害（Ｇｉ）効果を実証した。リラキシンはＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）受容体のみに作用した。Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）はＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）よりも強力な効果を示したが、ポジティブコントロール（リラキシン２）でのｃＡＭＰの低下と比較すると、両方のペプチドがより強力な効果を示した。

ＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）を一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞におけるＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）の用量反応効果を更に検査した（方法は上記の通り）。ＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）を一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞を２０μＭのフォルスコリンで１０分間処理した後、ＩＮＳＬ３（ポジティブコントロールとして）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）またはＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）のいずれかで、濃度を１ｎＭから１０μＭに増加させながら負荷した。結果を図２に示す。図２から分かる通り、ＩＮＳＬ３と比較して、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：１０）は１００ｎＭ未満の濃度で僅かなｃＡＭＰの減少を示し；（Ｇｉ効果）、１００ｎＭを超える濃度で僅かな増加（Ｇｓ効果）を示した。ＩＮＳＬ３は低濃度（＜１００ｎＭ；Ｇｓ効果）で僅かな用量依存的な増加を示し、高濃度（＞１００ｎＭ）で急激な減少（Ｇｉ効果）を示した。Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）は低濃度でＩＮＳＬ３と同様のパターン（ｃＡＭＰの僅かな増加）を示したが、高濃度では何らの効果も示さなかった。

実施例３：ＬＧＲ４、ＬＧＲ５またはＬＧＲ６を発現するＣＨＯ‐Ｋ１細胞中でのｃＡＭＰ蓄積に及ぼすペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の効果

ｃＡＭＰ濃度に作用するペプチドの能力を、ＧＰＣＲのＬＧＲ４、ＬＧＲ５またはＬＧＲ６を一過性にトランスフェクトし、１μＭのＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）またはポジティブコントロールとして使用したＨＣＧ（ＡＣＳ）で処理したＣＨＯ‐Ｋ１細胞中で検査した。その後、細胞中でのｃＡＭＰ蓄積を上記の通り、フォルスコリンでの前処理存在下（Ｇｉ）または非存在下（Ｇｓ）で測定した。

結果を図３に示す。図３Ａによると、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）で負荷した際、ｃＡＭＰ蓄積の有意な増加がＬＧＲ６をトランスフェクトした細胞について実証された。その他のＬＧＲをトランスフェクトしたいずれの細胞のどのペプチドについても、有意なＧｓ活性化は見られなかった。

図３Ｂによると、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）またはＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）で負荷した際、有意なＧｉ効果（ｃＡＭＰ蓄積の減少）がＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞について実証された。ポジティブコントロール（ＨＣＧ）については、有意なＧｉ活性化は見られなかった。

図３Ｃによると、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）またはＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）で負荷した際、僅かではあるが統計学的に有意なＧｉ効果（ｃＡＭＰ蓄積の減少）がＬＧＲ４をトランスフェクトした細胞について実証された。僅かではあるが有意なＧｉ活性化がポジティブコントロール（ＨＣＧ）について見られた。

図３（Ａ‐Ｃ）は、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）によるＬＧＲ６の僅かなＧｓ活性化、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の両方によるＬＧＲ５の僅かなＧｉ活性化、並びにＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の両方、更にＨＣＧによるＬＧＲ４の僅かなＧｉ活性化を示している。

実施例４：ＬＧＲ７を発現するＣＨＯ‐Ｋ１細胞中での、ペプチドＰ５９（配列番号：６）およびＰ７４（配列番号：１０）により媒介されるｃＡＭＰの用量反応刺激
ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）を一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞を１０μＭのフォルスコリンで１０分間処理した後、Ｈ２リラキシン（ポジティブコントロールとして）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）またはＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）で、濃度を１ｎＭから１０μＭに（図４Ａ）、および３ｎＭから１００ｎＭに（図４Ｂ）増加させながら負荷した。上記の通り、フォルスコリン存在下（Ｇｉ）（図４Ａ）または非存在下（Ｇｓ）（図４Ｂ）にて、各濃度点でのｃＡＭＰ濃度を定量した。

結果を図４に示す。図４Ａから分かる通り、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）は鐘型曲線を示し、Ｈ２リラキシンと比較して、低濃度、３０ｎＭおよび１００ｎＭの用量においてｃＡＭＰの増加（Ｇｓ効果）を示す一方で、リラキシンは、高濃度（＞１００ｎＭ）にて用量依存的な減少（Ｇｉ）効果を示した。このアッセイにおいて、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）は何らの有意な効果も示さなかった。

図４Ｂには、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）をトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞について、Ｇｓ（ｃＡＭＰ刺激およびｃＡＭＰ蓄積の増加）用量反応を低濃度（３〜１００ｎＭ）のＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）またはＨ２リラキシンを用いて測定したことが記載されている。Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＨ２リラキシンの両方が、ｃＡＭＰの用量依存的な増加を示した。図４Ｂが示す通り、これらの研究においては、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）がリラキシンよりも効果的にｃＡＭＰレベルを増加させた。

Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）およびＨ３リラキシンの、非ＬＧＲでリラキシン関連受容体であるＧＰＲ１３５（ＲＸＦＰ３）をトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞を活性化する能力を試験した。アッセイはＥｕｒｏｓｃｒｅｅｎにより行った。ｃＡＭＰ濃度の分析については、抗生物質を含まない培養液中で中間対数期まで増殖させたＥｕｒｏｓｃｒｅｅｎ、ｃａｔ．ＥＳ‐６５６‐Ａ‐細胞（ＲＸＦＰ３、Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ、ｃａｔ．ＥＳ‐６５６‐Ａ）をＰＢＳ‐ＥＤＴＡで脱離して遠心分離し、７．５×１０^５細胞／ｍｌの濃度にてアッセイ用緩衝液中に再懸濁した。試験は９６ウェルプレート中で行った。アゴニスト試験については、１２μｌの細胞（５×１０^３細胞／ウェル）を、１２μｌのＨ３‐リラキシンまたはＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）のいずれかのアゴニストと濃度を増加させながら混合した。その後、プレートを３０分間室温でインキュベートした。細胞溶解緩衝液を添加した後、Ｃｉｓ‐Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手したＨＴＲＦキット（ｃａｔ ｎ°６２ＡＭ２ＰＥＢ）を用いて製造元の指定に従い、ｃＡＭＰ濃度を測定した。

リラキシン３Ｆｉｔ（Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ）をポジティブコントロールとして使用した。ＲＸＦＰ３（ＧＰＣＲ１３５）をトランスフェクトした細胞を、増加する濃度のリラキシン３（Ｈ３リラキシン‐ポジティブコントロールとして‐１ｐＭ〜１μＭ）またはＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）（１μＭ〜３μＭ）で負荷した。結果を図５に示す。図５から分かる通り、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）はＲＸＦＰ３のｃＡＭＰ活性化（Ｇｓ）を示さなかったが、一方でＨ３リラキシンは強力なｃＡＭＰ刺激を実証した。

この実験では、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）はＲＸＦＰ３をトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞におけるｃＡＭＰ刺激効果を活性化しなかった。しかしながら、理論への拘束を望むものではないが、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）ペプチドはＲＸＦＰ３をトランスフェクトした細胞に適用された際、異なる経路に結合または活性化し得る。この実験は、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）がＲＸＦＰ３受容体におけるＧｉまたはＧ‐タンパク質が媒介する異なる効果を活性化する可能性を除外するものではなく、この受容体におけるその他のペプチド（すなわち、配列番号：１〜５または７〜１５）の効果を決定するものでもない。

実施例５：ｐＣＲＥ‐β‐ＧＡＬと共にＬＧＲ７またはＬＧＲ８を発現する細胞中でのｐ７４（配列番号：１０）およびＰ５９（配列番号：６）の活性
Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）、Ｐ５９Ｓ‐アミド（Ｐ５９Ｓ）（配列番号：１）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（Ｐ５９アミド）（配列番号：５）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の活性を更に試験するために、以下のアッセイを行った。このアッセイは、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）、Ｐ５９Ｓ‐アミド（Ｐ５９Ｓ）（配列番号：１）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（Ｐ５９アミド）（配列番号：５）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）のペプチドが、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）またはＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）受容体をそれぞれ発現する安定なＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株中でのＨ２リラキシンまたはＩＮＳＬ３活性を置換する能力を評価するために行われ、該アッセイはｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌと共にそれぞれＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）またはＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）を発現する細胞株中で、これらのペプチドがｃＡＭＰ活性を増加させる能力を評価することで行った。ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌアッセイは標準的なもので、Ｈｏｗａｒｄ Ｆｌｏｒｅｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（メルボルン、オーストラリア）にて確立されたものである（Ｈａｌｌｓ ＭＬ，Ｂａｔｈｇａｔｅ ＲＡ，Ｓｕｍｍｅｒｓ ＲＪ．−Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｘｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＲＸＦＰ１ ａｎｄ ＲＸＦＰ２，ｕｓｉｎｇ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００７Ｊａｎ；３２０（１）：２８１−９０）。

ＨＥＫ‐２９３ＴのＬＧＲ７／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌ安定細胞またはＬＧＲ８／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌでトランスフェクトした細胞中においてｃＡＭＰ活性に影響を及ぼすＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）、Ｐ５９Ｓ‐アミド（Ｐ５９Ｓ）（配列番号：１）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（Ｐ５９アミド）（配列番号：５）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の能力を、Ｈ２リラキシンおよびＩＮＳＬ３とそれぞれ並行して、Ｈａｌｌｓ ＭＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００７Ｊａｎ；３２０（１）：２８１−９０に記載の手順に従って試験した。

実験は少なくとも３回行った。以下の濃度の各ペプチドを試験した：０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１μＭ。

ＬＧＲ７／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌでトランスフェクトしたＨＥＫ‐２９３Ｔ細胞においては、いずれのペプチドも活性化を示さなかった（データは示さず）。

Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）、（Ｐ５９‐アミド）を有するＰ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：５）、（Ｐ５９）アミドを有しないＰ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）およびＰ５９Ｓ−アミド（配列番号：１）によるＬＧＲ８の活性化を実証する結果を、図６Ａと６Ｂに示す。結果は、ＬＧＲ８／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌをトランスフェクトしたＨＥＫ‐２９３Ｔ細胞におけるＩＮＳＬ３活性の百分率として、リガンドの濃度（Ｌｏｇ［Ｍ］で表示）に応じて表わす。

図６Ａは、３回のアッセイの全てにおいて、ＬＧＲ８／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌをトランスフェクトしたＨＥＫ‐２９３Ｔ細胞のＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）に対する応答が鐘型であることを実証している。Ｐ５９Ｓ−アミド（配列番号：１）の効果は、それよりは明確でなかった。図６Ｂは、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）がＬＧＲ８／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌをトランスフェクトしたＨＥＫ‐２９３Ｔ細胞において弱い活性化効果（ＩＮＳＬ３の２５％以下）を示す一方で、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（Ｐ５９アミド）（配列番号：５）が非常に弱い効果を有したことを示している。

Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）並びにＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（Ｐ５９アミド）（それぞれ、配列番号：６と５）がＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）とＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）とを活性化する能力を、ＬＧＲ７／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌまたはＬＧＲ８／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞中で、それぞれＨ２リラキシンおよびＩＮＳＬ３との比較で５μＭのフォルスコリンに誘導されるｃＡＭＰ活性に影響を及ぼすこれらペプチドの能力を試験することにより、更に試験した。

ＬＧＲ７をトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞を５μＭのフォルスコリンで処理してｃＡＭＰを刺激した。その後、細胞を増加する用量のＨ２リラキシン（ポジティブコントロールとして）、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）、（Ｐ５９−アミド）を有するＰ５９Ｃ１３Ｖ、（Ｐ５９）アミドを有しないＰ５９Ｃ１３ＶおよびＰ５９Ｓ‐アミド（Ｐ５９）（それぞれ、配列番号：５、６および１）で負荷した。ＬＧＲ７／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞におけるＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）、（Ｐ５９−アミド）を有するＰ５９Ｃ１３Ｖおよび（Ｐ５９）アミドを有しないＰ５９Ｃ１３Ｖ（それぞれ、配列番号：５と６）並びにＰ５９Ｓ−アミド（配列番号：１）の効果を実証する結果を図７Ａおよび７Ｂに示す。結果は、各ペプチドの増加する濃度（ｌｏｇ［Ｍ］で表示）でのフォルスコリン活性の百分率として表わす。実験の基準はフォスコリン単体での活性（１００％）とした。各点は、各実験の無関連な３回の反復を標準誤差バーと共に表している。

図７Ａは、ＬＧＲ７／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞においてＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）が示した鐘型の活性化パターンを表す。Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の活性化は（すでに図４Ａおよび４Ｂで実証した通り）Ｈ２リラキシンのそれよりも低濃度で強力なようだが、一方でＨ２リラキシンは高濃度で増加した活性化を示した。Ｐ５９Ｓ−アミド（配列番号：１）は高濃度（１００ｎＭおよび１〜１０μＭ）でのみ、中程度（フォルスコリンの２倍以下のみ）の活性化を示した。

図７Ｂは２つの活性化パターン効果を表し、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）が示す低濃度での活性化ピークと高濃度でのｃＡＭＰ活性化の第二のピーク、そしてＬＧＲ７／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞においてＰ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（Ｐ５９‐アミド）（配列番号：５）が示す僅かな活性化パターンを実証している。

ＬＧＲ８をトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞を５μＭのフォルスコリンで処理してｃＡＭＰを刺激した。その後、細胞を増加する用量のＩＮＳＬ３（ポジティブコントロールとして）、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）、（Ｐ５９−アミド）を有するＰ５９Ｃ１３Ｖと（Ｐ５９）アミドを有しないＰ５９Ｃ１３Ｖ（それぞれ、配列番号：５と６）、およびＰ５９Ｓ‐アミド（配列番号：１）で負荷した。ＬＧＲ８／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞におけるＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）、（Ｐ５９−アミド）を有するＰ５９Ｃ１３Ｖおよび（Ｐ５９）アミドを有しないＰ５９Ｃ１３Ｖ（それぞれ、配列番号：５と６）並びにＰ５９Ｓ−アミド（Ｐ５９Ｓ‐アミド）（配列番号：１）の効果を実証する結果を図８Ａおよび８Ｂに示す。結果は、ペプチドの種々の濃度（対数目盛）でのフォルスコリン活性の百分率として表わす。各点は、各実験の無関連な３回の反復を表している。

図８Ａは、ＬＧＲ８／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞において低濃度でＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）が示した、ＩＮＳＬ３のそれと同様の鐘型の活性化パターンを表す。Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の活性化は、（既にＬＧＲ７について図７Ａおよび７Ｂで実証した通り）ＩＮＳＬ３のそれと低濃度で同様であるものの僅かに弱いようだが、一方でＩＮＳＬ３は高濃度で増加した活性化を示した。Ｐ５９Ｓ−アミド（配列番号：１）は高濃度（１００ｎＭおよび１〜１０μＭ）でのみ、中程度（フォルスコリンの２倍以下のみ）の活性化を示した。

図８Ｂは２つの活性化パターン効果を表し、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）が示す低濃度での活性化ピークと高濃度でのｃＡＭＰ活性化の第二の増加、そしてＬＧＲ８／ｐＣＲＥ‐β‐ｇａｌを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞においてＰ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（Ｐ５９‐アミド）（配列番号：５）が示す僅かな活性化パターンを実証している。

実施例６：Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）とユウロピウムで標識したＨ２リラキシンもしくはＩＮＳＬ３との、ＬＧＲ７またはＬＧＲ８を発現する細胞中での競合アッセイ
ユウロピウムで標識したＨ２リラキシンまたはＩＮＳＬ３（Ｈ．Ｆｌｏｒｅｙ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）のＬＧＲ７またはＬＧＲ８をそれぞれ発現する安定なＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株への結合と競合する、ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）の能力を試験することで、ＬＧＲ７またはＬＧＲ８への既知のリガンドの結合と競合する、ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）の能力を試験した。

ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）を安定的に発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株をユウロピウムで標識したＨ２リラキシン（Ｈ．Ｆｌｏｒｅｙ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）で処理した。その後、十進で増加する濃度（０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ）の非標識のＨ２リラキシン（ポジティブコントロールとして）並びに試験ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（Ｐ５９‐アミド）（配列番号：５）、Ｐ５９‐Ｓ‐アミド（Ｐ５９Ｓ）（配列番号：１）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）で処理した。３回の独立した実験の競合結果を図９に示す。結合結果は、放射性の試験Ｈ２リラキシンの特異的結合の百分率（１００％は基準放射線レベル）として表す。図９から分かる通り、試験ペプチドのいずれも、ユウロピウム‐Ｈ２リラキシンの結合については競合を示さなかった。ある一つの理論への拘束を望むものではないが、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）に対するペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（配列番号：５）、Ｐ５９‐Ｓ‐アミド（配列番号：１）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）の活性は、上記ペプチドがＬＧＲ７へのユウロピウム‐Ｈ２リラキシンの結合に干渉、競合または作用しないため、異なる結合部位へのペプチドの結合によって媒介される可能性がある。

ＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株をユウロピウムで標識したＩＮＳＬ３（Ｈ．Ｆｌｏｒｅｙ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）で処理した。その後、十進で増加する濃度（０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ）の非標識のＩＮＳＬ３（ポジティブコントロールとして）並びに試験ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（Ｐ５９‐アミド）（配列番号：５）、Ｐ５９‐Ｓ‐アミド（Ｐ５９Ｓ）（配列番号：１）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）で処理した。３回の独立した実験の競合結果を図１０に示す。結合結果は、放射性の試験ＩＮＳＬ３の特異的結合の百分率（１００％は基準放射線レベル）として表す。図１０から分かる通り、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）は１ｎＭ以上の濃度において‐１２５％の特異的結合を示し、陽性の協同的またはアロステリック効果を実証している。このことは、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）ペプチドのＬＧＲ８受容体における結合または活性によってＥｕｒ‐ＩＮＳＬ３の結合親和性が増加したことを意味している。その他のペプチド（Ｐ５９Ｃ１３Ｖ‐アミド（Ｐ５９‐アミド）（配列番号：５）、Ｐ５９‐Ｓ‐アミド（Ｐ５９Ｓ）（配列番号：１）およびＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０））の結果は、それよりは明確ではないが、４つのペプチドの全てが、ＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）におけるユウロピウム‐ＩＮＳＬ３の結合について改変および競合またはアロステリック効果を示した。ある一つの理論への拘束を望むものではないが、ＬＧＲ８受容体へのペプチドの結合は恐らくＩＮＳＬ３の結合部位とは異なる結合部位を介したものであり、ＩＮＳＬ３リガンドへの受容体の親和性を改変する可能性のあるアロステリック効果が存在し、これはＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）受容体の活性に対する上記ペプチドおよびＩＮＳＬ３の相乗効果を示唆している。

実施例７：ＡＣＥＡ細胞インピーダンスシステムにより試験するリアルタイム活性化アッセイ
リラキシン関連ファミリーの受容体を活性化するペプチドの能力をＡＣＥＡ ＲＴ‐ＣＥＳスクリーニングを使用して分析する方法

ＡＣＥＡ ＲＴ‐ＣＥＳスクリーニングの背景：
ＡＣＥＡ ＲＴ‐ＣＥＳスクリーニングは、ＧＰＣＲのための非侵襲性かつ非標識のアッセイであり、操作された細胞株および操作されていない細胞株の両方で使用できる。このアッセイは、細胞‐電極インピーダンスの使用に基づき、細胞形態の分毎の変化をリガンド依存性ＧＰＣＲ活性化の結果として測定し、これはＮａｉｃｈｅｎ Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７８（１），３５−４３，２００６．１０．１０２１／ａｃ０５１６９５ｖＳ０００３−２７００（０５）０１６９５−１に記載されている。Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣＤＣ４２を含むＲｈｏファミリーの小ＧＴＰアーゼは、癌遺伝子、成長因子並びに接着媒介シグナル伝達経路のよく特徴付けられたエフェクターであり、ＧＰＣＲのための重要なエフェクターとしては従来考えられていない。ＲｈｏファミリーのＧＴＰアーゼは数多くの細胞プロセス、主としてはアクチン細胞骨格フレーム構造内の特定の構造の制御および維持に関与する。活性化されるＲｈｏファミリーのＧＴＰアーゼに応じて非常に特異的な様式で、ＧＰＣＲがアクチン細胞骨格、従って細胞形態を調節することが示されている。アクチン細胞骨格の現在の見識は、動的（ｄｙｎａｍｉｃ）で可塑的（ｐｌａｓｔｉｃ）なシステムのそれであり、これは細胞内シグナル伝達の反映および発現であり、細胞構成を維持するように設計された単なる静的構造ではない。ＧＰＣＲはアクチン細胞骨格網に共役結合して極めて特定の形態学的変化を誘導するため、この情報をＧＰＣＲについての機能的かつ生物学的に関連性のある読み取り情報として役立てることが可能である。

ＡＣＥＡバイオサイエンス社（ＡＣＥＡ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、細胞形態の分毎の変化を測定することが可能な、マイクロタイタープレートのウェルの底部に内蔵された電子細胞センサアレイを設計した。これら電子センサは、細胞の存在および細胞形態の動力学に起因するイオン環境の破壊の結果として、細胞‐基質インピーダンスの変化を測定する。細胞‐基質インピーダンスと細胞形態を読み取り情報として使用する主な利点は、入り混じったＧタンパク質および受容体で細胞を操作する必要または色素で細胞を標識する必要無しで、外因的に発現される受容体と内因性受容体の両方をアッセイすることが可能となる点である。更に、読み取りは非侵襲性であるため、同一のリガンドまたは異なるリガンドで複数の刺激を行い、脱感作や受容体のクロストーク等の事象を評価することができる。最後に、細胞‐基質インピーダンスと細胞形態を読取り情報として使用するもう１つの主要な側面は、シグナル伝達経路に関係なく、潜在的に全てのＧＰＣＲを機能的にモニタリングすることができる点である。

ＡＣＥＡ ＲＴ‐ＣＥＳスクリーニングの実験手順とプロトコル
他に断わりのない限り、ペプチドは固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法によって合成し、樹脂から切断し、ＲＰ‐ＨＰＬＣで精製した。ペプチドのアイデンティティーは質量分析法により検証した。ＲＰ‐ＨＰＬＣで測定したペプチドの最終純度は＞９０％であった。ペプチドは０．１％ＢＳＡを含有する水中（ＤＤＷ‐高純度）で希釈した。場合によっては、ペプチドをＴｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解させた。他の場合では、１％ＤＭＳＯの添加または短時間の音波処理のいずれかが必要であった。全てのプレートを使用まで‐８０℃で保管した。

細胞：ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ‐６１）。１０％ＨＩ−ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄ．、Ｃａｔ＃０４−１２１−１）、２．５ｍＬの食塩水中の２００ｍＭ Ｌ‐グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄ．、Ｃａｔ＃０３−０２０−１）および１００００／ｍＬのペニシリンＧと１０ｍｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンとを含む５ｍＬのペニシリン‐ストレプトマイシン溶液（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄ．、Ｃａｔ＃０３−０３１−１）で補足したＦ−１２ ＨＡＭ栄養混合液中（Ｆ−１２ ＨＡＭ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃２１７６５−０２９）で、細胞を維持して繁殖させた。

細胞の継代培養：
液体窒素から細胞を新たに解凍し、以下のプロトコルに従って週２回１：１０に継代培養した：
培地を除去して廃棄する。
０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン‐０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で細胞層を短時間洗浄してトリプシン阻害物質を含有する微量の血清を全て除去する。
３７℃で５分間、ＣＯ_２加湿インキュベータにインキュベートする。
細胞層が分散するまで顕微鏡下で検査する。
１０〜１２ｍＬの完全増殖培地を追加し、静かにピペットで吸引する。
細胞懸濁液から３００μｌのサンプルを取り出し、濃度、生存率および凝集速度を、ＣＥＤＥＸカウンタを使用してカウントする。
細胞を１２００ｒｐｍで６分間遠心分離する。
所望の細胞濃度になるよう細胞を完全増殖培地中に再懸濁する。

ＤＮＡトランスフェクション：
全てのトランスフェクションは、ＦＵＧＥＮＥ６試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ＃１１−８１４−４４３−００１、使用期限：５／０８）を使用して行った。

トランスフェクションのプロトコル：
トランスフェクションの前日、２×１０^６個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を１０ｍＬの完全増殖培地を含むＴ７５フラスコ中に播種した。トランスフェクション当日、ＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を１５分間室温でインキュベートして周囲温度まで温め、使用に先がけボルテックスして混合した。

以下を滅菌マイクロチューブ中で希釈した：５０μｌのＦＵＧＥＮＥ６を６５０μｌの無血清Ｆ‐１２−ＨＡＭ培地に入れ、チューブを室温で１０分間インキュベートした。

トランスフェクトしたＤＮＡミックスを別の滅菌マイクロチューブ中で調製した；１０μｇの標的ＧＰＣＲプラスミドと２μｇのｅＧＦＰレポーター遺伝子を有するｐＩＲＥＳプラスミドとからなる２０μｇのプラスミドＤＮＡ混合液。

その後、プラスミドＤＮＡ混合液をトランスフェクション試薬チューブに加え、内容物を混合するために５分に１度静かにたたきながら３５分間室温でインキュベートした。このＤＮＡ‐ＦｕＧｅｎｅ複合体をフラスコに滴下し、静かに振って分散させた。

トランスフェクトした細胞をＣＯ_２加湿インキュベータ中で２４時間３７℃にて維持し、ＧＥＰでトランスフェクトされた細胞が発する緑色光を検出するために蛍光顕微鏡下でモニタリングした。

ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳのプロトコル；ＧＰＣＲ活性化ペプチドのスクリーニング：
このプロトコルでは、トランスフェクしたＣＨＯ‐Ｋ１細胞の播種、モニタリングおよび活性化のためにＲＣＤ９６ Ｅ‐プレートデバイス（ＲＣＤ９６ Ｅ−ｐｌａｔｅ ｄｅｖｉｃｅ）（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用した。

Ｅ‐プレートの前処理：
１００μＬの１ｍｇ／ｍｌゼラチン（Ｆｌｕｋａ、Ｃａｔ＃４８７２０）でＥ‐プレートウェルをコーティングした。ゼラチンは、８ｍｇ／ｍＬで滅菌ＤＤＷに溶解させ、Ｅ‐プレートウェルへ添加する前にＤＤＷ中で１：８に希釈した。ゼラチンでコーティングしたプレートを、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃で４０分間インキュベートした。

１００μｌの滅菌水を添加し、液体を全て除去した。今度は２００μｌの滅菌水でプレートをもう２回洗浄し、細胞播種のためにプレートを取得した。

細胞播種：
トランスフェクとした細胞を播種する前に、８０ｍｌのＳＦＭ Ｆ１２‐ＨＡＭ培地をＥ‐プレートの各ウェルに添加し、バックグラウンドレベルを記録した。

トランスフェクションの２４〜２６時間後、培地を吸引し、細胞を０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡ溶液でトリプシン処理してＣＥＤＥＸカウンタでカウントした。

総細胞数を計算し、０．３１２５×１０^６個／ｍＬから０．４３７５×１０^６個／ｍＬまでの範囲の濃度となるように細胞を完全増殖培地中に再懸濁した。この希釈物から８０μｌの細胞懸濁液を播種すると、各Ｅ‐プレートウェルあたり、５％ＦＣＳ‐完全増殖培地中に２５０００個から３５０００個までの総細胞となった。

ペプチド負荷：
播種の２２〜２６時間後（トランスフェクションの４６〜５２時間後）、記録した細胞指数（ＣＩ）に従って、活性化ペプチドの添加のために細胞を調製した。

ペプチドの添加に先がけ、完全培地を吸引し、３７℃で予熱した１２０ｍｌのＳＦＭ Ｆ１２‐ＨＡＭ栄養混合液で置換した。

一時間後またはＣＩの読取りが安定した時、９６×Ｅ‐プレートステーションからＥ‐プレートをペプチド負荷のために取り外した。ペプチドでの負荷は、既に作成した２５０μＭ娘ストックプレート（ｄａｕｇｈｔｅｒ ｓｔｏｃｋ ｐｌａｔｅ）から５μｌのペプチド溶液を添加することにより重複で行い、１０μＭの最終ペプチド濃度とした。ペプチド溶液は、０．１％アルブミン（Ｓｉｇｍａ‐ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃Ａ３０５９、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、〜９９％、本質的にγ−ブロブリンを含まない）で補足したＤＤＷ中に溶解したペプチドを含有する。

一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞についてスクリーニングを２段階で行った：

１．スクリーニング段階：
１０μＭのスクリーニングした各ペプチドで、カルシトニン（１μＭ）をアッセイの内部ポジティブコントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）（カルシトニンの受容体は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞により内因的に発現される）０．１％ＢＳＡをネガティブコントロールとして使用した。１μＭのＨ２リラキシンをトランスフェクトした受容体についてのポジティブコントロールとして使用した。

２．用量反応段階：
０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭおよび１０μＭのスクリーニングした各ペプチドで、Ｈ２リラキシンをトランスフェクトした受容体についてのポジティブコントロールとして使用し、ＬＧＲ７をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を負荷した。

実施例７‐１：ＡＣＥＡ細胞インピーダンスデバイスにおける、Ｐ７４（配列番号：１０）およびＰ５９（配列番号：６）が媒介するＬＧＲ‐関連ファミリー受容体の活性化‐スクリーニング段階
ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）受容体とＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）受容体を活性化するペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）およびＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）の能力を、ＡＣＥＡ細胞インピーダンスデバイスにおいて上記の通り検査した。以下の結果が得られた：

まず、ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）（１０μＭで）およびＨ２リラキシン（１μＭで）が細胞インピーダンスの変化を引き起こす能力をトランスフェクトしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞中で測定した。結果を図１１に表す。細胞指数は時点Ｔ１（ペプチド投与後）に標準化し、垂直な実線で図１１中に記した（垂直な点線は実験開始後２０時間目を示す）。カルシトニン受容体はＣＨＯ−Ｋ１細胞において内因的に発現されるため、カルシトニンを内部ポジティブコントロールとして使用してアッセイの正当性を評価した。ＢＳＡ０．１％をネガティブコントロールとして使用した。図１１から分かる通り、Ｈ２リラキシンおよびペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）の両方が、トランスフェクトしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞において中程度の効果を示した。ある一つの理論への拘束を望むものではないが、この結果からの結論は、標準的な手順で検出されなくとも、たとえ残存量であれＬＧＲ７受容体またはＬＧＲ８受容体のいずれかがＣＨＯ−Ｋ１細胞によって発現されるということである。

次に、ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）（１０μＭで）およびＨ２リラキシン（１μＭで）が細胞インピーダンスの変化を引き起こす能力を、非リラキシン関連ＧＰＣＲをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞中で測定した：ＧＰＲ３９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号；ＧＰＲ３９＿ＨＵＭＡＮ：０４３１９４）。結果を図１２に表す。細胞指数は時点Ｔ１（ペプチド投与後）に標準化し、垂直な実線で図１２中に記した（垂直な点線は実験開始後２４時間目を示す）。カルシトニンをポジティブコントロールとして使用し、ＢＳＡ０．１％をネガティブコントロールとして使用した。図１２から分かる通り、Ｈ２リラキシンおよびペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の両方が、ＧＰＲ３９をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞において中程度であるが明確な効果を示した。

これらの実験から、トランスフェクションのプロセス自体が上で（図１１で）示した反応の原因ではないことが分かる。

次に、ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）（１０μＭで）およびＨ２リラキシン（１μＭで）が細胞インピーダンスの変化を引き起こす能力を、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞中で測定した。結果を図１３に表す。細胞指数は時点Ｔ１（ペプチド投与後）に標準化し、垂直な実線で図１３中に記した。カルシトニンをポジティブコントロールとして使用し、ＢＳＡ０．１％をネガティブコントロールとして使用した。図１３から分かる通り、Ｈ２リラキシンおよびペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）の両方が、ＬＧＲ７をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞において（ＡＣＥＡ測定が示す通り）細胞インピーダンス効果を示した。Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）の効果はＨ２リラキシンの効果よりも強かったが、両ペプチド（Ｈ２リラキシンおよびＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０））ともＬＧＲ７をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞において細胞応答を活性化する能力を有することが見出された。

ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）（１０μＭで）、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）（１０μＭで）およびＨ２リラキシン（１μＭで）が細胞インピーダンスの変化を引き起こす能力を、ＬＧＲ８（ＲＸＦＰ２）をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞中で更に測定した。結果を図１４に表す。上記の通り、細胞指数は時点Ｔ１（ペプチド投与後）に標準化し、垂直な実線で図１４中に記した（垂直な点線は実験開始後２３時間目を示す）。上と同様に、カルシトニンをポジティブコントロールとして使用し、ＢＳＡ０．１％をネガティブコントロールとして使用した。図１４から分かる通り、Ｈ２リラキシンおよびペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）の両方が、ＬＧＲ８をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞において強力な細胞効果を示した。Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）は、ＢＳＡと比較して有意な効果を何ら示さなかった。これらの結果から、両ペプチド（Ｈ２リラキシンおよびＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０））ともＬＧＲ８をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞において細胞応答を活性化する能力を有すると考えられるが、この実験では、ＬＧＲ８をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）の効果は実証されなかった。このことは、Ｐ５９ペプチドの分解等の本実験における技術的課題によって説明することができる。

ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）（１０μＭで）およびＨ２リラキシン（１μＭで）が細胞インピーダンスの変化を引き起こす能力を、ＬＧＲ４をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞中で更に測定した。結果を図１５に表す。上記の通り、細胞指数は時点Ｔ１（ペプチド投与後）に標準化し、垂直な実線で図１５中に記した。上と同様に、カルシトニンをポジティブコントロールとして使用し、ＢＳＡ０．１％をネガティブコントロールとして使用した。図１５から分かる通り、ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）はＬＧＲ４でトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞において中程度の効果を示した。このアッセイにおいて、Ｈ２リラキシンはそれよりずっと強力な効果を示した。ある一つの理論への拘束を望むものではないが、この結果は、ＬＧＲ４をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞において、Ｈ２リラキシンがＬＧＲ４受容体に結合し、ＬＧＲ４受容体の活性化を介して細胞応答を活性化する能力を有することを示唆している可能性があり、これは恐らく非ｃＡＭＰに関連する経路によって媒介される。

実施例７‐１：ＡＣＥＡ細胞インピーダンスデバイスにおける、Ｐ７４（配列番号：１０）およびＰ５９（配列番号：６）が媒介するＬＧＲ‐関連ファミリー受容体の活性化‐用量反応
（Ｈ２）リラキシンとＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の両方の、トランスフェクトしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞中での用量反応活性化試験は、用量依存的な活性化を示さなかったが、最も高い濃度での中程度の活性化のみを示した（すなわち、Ｐ７４Ｃ１３Ｖについては１０μＭで、Ｈ２リラキシンについては１μＭ）（データは示さず）。

実験は上記のＡＣＥＡプロトコルと同様にして行った。各ペプチドの濃度を増加させながら（図１６Ｂ、１７Ｂ、１８Ｂおよび１９ＢにおいてＬｏｇ［Ｍ］で表わす）、三重反復で添加した。細胞インピーダンスを記載した通り試験し、ペプチド添加時点に標準化した（Ｔ１‐図１６Ａ、１７Ａ、１８Ａおよび１９Ａ中の左の垂直線）。用量反応は実験終了時点で検査した（一時点‐図１６Ａ〜１９Ａにおいて右の垂直線で示す）。

図１６Ａは、Ｈ２リラキシンの濃度を増加させて負荷した、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞についての標準化細胞指数および用量反応曲線を表す（垂直な点線は実験開始後２５時間目を示す）。試験したＨ２リラキシン濃度は、０．１６ｎＭ；０．８ｎＭ；４ｎＭ；２０ｎＭ；１００ｎＭ；および５００ｎＭであった。図１６Ａが示す通り、より高濃度で明確な用量反応があり、〜１００ｎＭでＥＣ５０と推定される。

図１６Ｂは、時点２５．５時間（図１６Ａ中の右の垂直線）での、Ｈ２リラキシンの濃度を増加させて負荷した、ＬＧＲ７をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞についての標準化細胞指数および用量反応曲線を表す。用量反応は、濃度の対数（Ｌｏｇ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（Ｍ）に対する標準化細胞指数として表わされる。図１６Ｂで実証される通り、Ｈ２リラキシンによるＬＧＲ７の明確な用量依存的活性化が見出された。

図１７Ａは、ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の濃度を増加させて負荷した、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞についての標準化細胞指数および用量反応曲線を表す（垂直な点線は実験開始後２５時間目と２６時間目を示す）。試験したＰ７４Ｃ１３Ｖ（Ｐ７４）（配列番号：１０）の濃度は、４１ｎＭ；１２３ｎＭ；３７０ｎＭ；１．１μＭ；３．３μＭ；および１０μＭであった。図１７Ａが示す通り、高濃度で明確な用量反応があり、〜３００ｎＭでＥＣ５０と推定される。

図１７Ｂは、時点２６．５時間（図１７Ａ中の右の垂直線）での、ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）の濃度を増加させて負荷した、ＬＧＲ７をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞についての標準化細胞指数および用量反応曲線を表す。用量反応は、濃度の対数（Ｍ）に対する標準化細胞指数として表わされる。図１７Ｂから分かる通り、Ｐ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）によるＬＧＲ７の明確な用量依存的活性化が見出された。ＬＧＲ７に対するＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）の見出された親和性は、Ｈ２リラキシンのそれよりも低かった。

図１８Ａは、ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）の濃度を増加させて負荷した、ＬＧＲ７（ＲＸＦＰ１）でトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞についての標準化細胞指数および用量反応曲線を表す（垂直な点線は実験開始後２５時間目と２６時間目を示す）。試験したＰ５９Ｃ１３Ｖ（Ｐ５９）（配列番号：６）の濃度は、４１ｎＭ；１２３ｎＭ；３７０ｎＭ；１．１μＭ；３．３μＭ；および１０μＭであった。図１８Ａが示す通り、高濃度で中程度の用量反応が見られた。

図１８Ｂは、時点２６．５時間（図１８Ａ中の右の垂直線）での、Ｐ５９（配列番号：６）の濃度を増加させて負荷した、ＬＧＲ７をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞についての標準化細胞指数および用量反応曲線を表す。用量反応は、濃度の対数（Ｍ）に対する標準化細胞指数として表わされる。図１８Ｂから分かる通り、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）によるＬＧＲ７の中程度の用量依存的活性化が見出された。最も高い濃度（１０μＭ）でのみ、他の濃度と比較して有意に高い細胞指数レートを示した。同一のペプチドバッチがこの実験および図１４で表す実験で使用されたことは、Ｐ５９Ｃ１３Ｖペプチドのこの特定のバッチが粗悪であったとする仮定を裏付けるものである。ＬＧＲ７に対するＰ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）の見出された親和性は、Ｈ２リラキシンまたはＰ７４Ｃ１３Ｖ（配列番号：１０）のそれよりも有意に低かった。従って、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）ペプチドは高濃度で受容体を活性化することができるが、実質的な用量反応は示さなかった。

図１９Ａは、ペプチドＰ５９Ｓ−アミド（Ｐ５９Ｓ）（配列番号：１）の濃度を増加させて負荷した、ＬＧＲ７をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞についての標準化細胞指数および用量反応曲線を表す（垂直な点線は実験開始後２６時間目を示す）。試験したＰ５９Ｓ（配列番号：１）の濃度は、４１ｎＭ；１２３ｎＭ；３７０ｎＭ；１．１μＭ；３．３μＭ；および１０μＭであった。図１９Ａが示す通り、高濃度で中程度の用量反応が見られた。

図１９Ｂは、時点２６．５時間（図１８Ａ中の右の垂直線）での、Ｐ５９Ｓ−アミド（Ｐ５９Ｓ）（配列番号：１）の濃度を増加させて負荷した、ＬＧＲ７をトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞についての標準化細胞指数および用量反応曲線を表す。用量反応は、濃度の対数（Ｍ）に対する標準化細胞指数として表わされる。図１９Ｂから分かる通り、Ｐ５９Ｃ１３Ｖ（配列番号：６）によるＬＧＲ７の中程度の用量依存的活性化が見出された。最も高い濃度（１０μＭ）でのみ、他の濃度と比較して有意に高い細胞指数レートを示した。従って、このペプチドは高濃度で受容体を活性化することができるが、用量反応は示さなかった。

実施例８：Ｃ１ＱＴＮＦ８タンパク質におけるＰ５９配列は、多種およびオルソログ全体に亘って、そして少なくとも１つのヒトパラログ（Ｃ１ＱＴＮＦ１）で高度に保存されている。
図２０は、Ｐ５９‐Ｇ（配列番号：１２）の多重整列比較を示し、天然のヒト先駆体（Ｃ１ＱＴＮＦ８‐配列番号：１９）の断片並びに、チンパンジー（配列番号：２０）、オランウータン（配列番号：２１）、アカゲザル（配列番号：２２）、雌ウシ（配列番号：２３）、ニワトリ（配列番号：２４）およびラット（配列番号：２６）を含む種々の生物に由来する相同配列を表している。この多重整列比較には、ヒトパラログであるＣ１ＱＴＮＦ１（配列番号：２５）に由来する対応するペプチド配列も含まれる。見て分かる通り、Ｎ‐末端（４個のアミノ酸）およびＣ‐末端（７個のアミノ酸）が全種に同一である。量末端での切断部位もまた高度に保存されている（場合によってはＫがＲに置換される）。二量化のためにバリンで置換された中間のシステイン残基（Ｃ１３）もまた高度に保存されている。

以上の記載は例示のためになされるのであり、本発明の範囲を限定するものではない。更なる実施形態を請求項において記載する。

Claims (6)

1. 精製されたペプチドであって：
   ペプチドＰ５９−Ｓ−アミド（アミド）：ＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：１）；
   ペプチドＰ５９−Ｓ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：２）；
   ペプチドＰ５９−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：３）；
   ペプチドＰ５９（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：４）；
   ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：５）；
   ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：６）；
   ペプチドＰ７４−アミド（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：７）；
   ペプチドＰ７４（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：８）；
   ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（アミド）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ−アミド（配列番号：９）；
   ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ（遊離酸）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶ（配列番号：１０）；
   ペプチドＰ５９ＳＧ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１１）；
   ペプチドＰ５９−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１２）；
   ペプチドＰ５９Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１３）；
   ペプチドＰ７４−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１４）；
   ペプチドＰ７４Ｃ１３Ｖ−Ｇ（遊離酸Ｇｌｙ）：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＶＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧＲＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：１５）；
   ペプチドＰ５９−チンパンジー：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＡＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２０）；
   ペプチドＰ５９−オランウータン：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２１）；
   ペプチドＰ５９−アカゲザル：ＧＱＫＧＱＶＧＰＰＧＡＰＣＱＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２２）；
   ペプチドＰ５９−雌ウシ：ＧＱＫＧＱＡＧＬＰＧＡＱＣＰＲＡＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２３）；
   ペプチドＰ５９−ニワトリ：ＧＱＫＧＱＰＧＰＱＧＨＳＣＫＱＬＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２４）；
   ペプチドＰ５９−Ｃ１ＱＴＮＦ１（ヒト）：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＥＲＣＫＳＨＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２５）；
   ペプチドＰ５９−ラット：ＧＱＫＧＳＭＧＡＰＧＤＨＣＫＳＱＹＡＡＦＳＶＧ（配列番号：２６）；
   からなる群から選択される配列を有することを特徴とするペプチド。
2. 前記ペプチドが第二のペプチドまたはポリペプチドに接合または融合されていることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
3. 請求項１または２に記載のペプチドと薬剤的に許容可能な担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
4. 請求項１または２に記載のペプチドに選択的に結合することを特徴とする抗体。
5. 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４に記載の抗体。
6. 前記抗体が検出可能な標識、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識もしくは治療薬に接合または結合されていることを特徴とする請求項５に記載の抗体。

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