JP4104671B2 - 潜在型ＴＧＦ―βの活性化を促進するペプチドおよびＴＧＦ―β活性調節化合物のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、細胞増殖の抑制、細胞分化の促進、免疫機能の抑制、線維芽細胞の走化性の亢進など多彩な生理活性を有している活性型トランスフォーミング・グロース・ファクター-β（以後、活性型ＴＧＦ-βまたは単にＴＧＦ-βと略記するときがある。）へ、通常の分泌型である潜在型ＴＧＦ-βから変換させることを促進し、癌、骨折、心筋梗塞、虚血再環流後の心筋障害、脳梗塞、網膜剥離などの、ＴＧＦ-βの作用欠乏が指摘されている疾患および外来性のＴＧＦ-β投与が有効と考えられている疾患の治療薬として有用な新規ペプチドに関する。
また、本発明は、潜在型トランスフォーミング・グロース・ファクター-β（以後、ＬＴＧＦ-βと略記するときがある。）の細胞への結合を調節する化合物または潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を調節する化合物の選択方法に関し、該方法により選択されるＴＧＦ-βの関与する疾病の治療または予防する化合物に関する。
背景技術
ヒトを含むほ乳類には、ＴＧＦ-β１、β２、β３等のＴＧＦ-βが存在しているが、いずれも不活性のＬＴＧＦ-βとして分泌されるため［Ａ・Ｂ・ロバート（Robert, A. B.）＆Ｍ・Ｂ・スポーン（Sporn, M. B.）、ペプチド・グロース・ファクターズ・アンド・ゼア・レセプターズ（Peptide Growth Factors and Their Receptors）、ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・ファーマコロジー、パート１（Handbook of Experimental Pharmacology, Part 1）、スプリンガー−ベアラッグ（SPRINGER-VERLAG）、ベルリン、419〜472頁、（1990）］、作用が発現するためには分泌後の活性化が必要である。ＬＴＧＦ-βには、ＴＧＦ-βにレイテンシー・アソシエイティド・ペプチド（latency associated peptide、以後、ＬＡＰと略するときがある。）が非共有結合した小分子量潜在型ＴＧＦ-β（以後ＳＬＴＧＦ-βと略す。）と、これにレイテント・ＴＧＦ-β結合蛋白質（latent ＴＧＦ-β binding protein、以後、ＬＴＢＰと略記するときがある。）がＬＡＰとの間でSS結合した大分子量潜在型ＴＧＦ-β（以後、ＬＬＴＧＦ-βと略記するときがある。）の２種類があるが、大部分はＬＬＴＧＦ-βの型で分泌される［エンボ・ジャーナル（EMBO Journal）, 10, 1091（1991）］。ＴＧＦ-βとＬＡＰはシグナルペプチドを有する同一の蛋白質分子（ＴＧＦ-βプレカーサー）として生合成され、そのアミノ酸配列が知られている［ネイチャー（Nature）, 316, 701（1985）］。
潜在型ＴＧＦ-βの活性化には、幾つかのプロテアーゼの関与が指摘されているが、最もよく解析されているのがプラスミンである。すなわち、プラスミンがＬＡＰを限定分解することで、非共有結合しているＴＧＦ-βが遊離する［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 110, 1361（1990）］。プラスミンによる活性化の細胞レベルでの解析から、プラスミンによる活性化は細胞膜表面で行われること［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 109, 309（1989）］、潜在型ＴＧＦ-βが細胞膜に結合することが活性化に必要であること［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 121, 439（1993）、同, 120, 995（1993）、同, 123, 1249（1993）］、潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合はＬＡＰを介していること［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）、トウホク・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Tohoku Journal of Experimental Medicine）, 179, 23（1996）］が明らかとなっている。しかし、潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合性の制御が、ＴＧＦ-βの活性制御にどのように係わっているかは明らかでない。
血管平滑筋細胞への潜在型ＴＧＦ-βの結合は知られているが、血管内皮細胞へは結合しないとされている［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）］。
ＴＧＦ-βは、細胞増殖の抑制、細胞分化の促進、免疫機能の抑制、線維芽細胞の走化性の亢進など多彩な生理活性を有している。ＴＧＦ-βはさまざまな病態と関連すると考えられており、ＴＧＦ-βの作用欠乏が関与するものとして糖尿病性網膜症［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 109, 309（1989）、アーチブズ・オブ・オフタルモロジー（Archieves of Ophthalmology）, 66, 366（1961）］、粥状動脈硬化の初期病変［ネイチャー・メディスン（Nature Medicine）, 1, 1067（1995）］があげられている。また、ＴＧＦ-β自身には、骨折、心筋梗塞、虚血再環流後の心筋障害、脳梗塞、網膜剥離などに対する治療効果が期待されている［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 119, 1017（1992）］。さらにＴＧＦ-βは種々の癌細胞の増殖を抑制することが知られており［エンドクリノロジー（Endocrinology）, 128, 1981（1991）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲーション（Journal of Clinical Investigation）, 87, 277（1991）、セル・グロース・アンド・ディファレンシエーション（Cell Growth & Differentiation）, 1, 549（1990）］、抗腫瘍剤としても期待される［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Science U.S.A.）, 92, 4254（1995）］。
生体内において、産生・分泌された潜在型ＴＧＦ-βのうち、活性化されて作用を発揮しているのは一部分である。このことから、生体内における潜在型ＴＧＦ-βの活性化効率を増すことによって、ＴＧＦ-βの作用増強が達成されるものと考えられる。従って、潜在型ＴＧＦ-βの活性化を促進する化合物は、ＴＧＦ-βの作用欠乏が指摘されている疾患あるいは外来性のＴＧＦ-β投与が有効と考えられている疾患、すなわち癌、糖尿病性網膜症、粥状動脈硬化、骨折、心筋梗塞、虚血再環流後の心筋障害、脳梗塞、網膜剥離などの治療薬として有効性が期待される。
また、逆にＴＧＦ-βの作用亢進により引き起こされる基本的に細胞外マトリックスの造成を伴う各種疾患が知られており、ＴＧＦ-βの活性化を抑制する物質は、例えば糸球体腎炎、糖尿病性腎症、移植腎拒絶、HIV腎症、特発性肺線維症、自己免疫性肺線維症、肝硬変、（癌療法後に好発の）静脈狭窄性肝障害、全身性硬化症、ケロイド、好酸球増加−筋肉痛症候群、血行再建術後再狭窄、眼内線維症、リウマチ性関節炎、鼻たけ等の各種線維症の治療薬として有効性が期待される［ボーダー（Border）W.A. & ノーベル（Nobel）N.A.,トランスフォーミング・グロース・ファクターβ・イン・ティシュー・フィブロシス（Transforming growth factor-β in tissue fibrosis），ニュー・イングリッシュ・ジャーナル・オブ・メジスン（New Engl.J.Med.）, 331, 1286，（1994）およびボーダー（Border）W.A. & ロウスラーティ（Rouslahti）E., トランスフォーミング・グロウス・ファクター-β・イン・ディジース（Transforming growth factor-β in disease）：ザ・ダーク・サイド・オブ・ティシュー・リペア（The dark side of tissue repair.），ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.Clin Invest.）, 90, 1, （1992）］。
発明の開示
本発明により、潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有するペプチドまたはその薬理的に許容される塩が提供される。その一態様としては、一般式（Ｉ）
Ｒ1-Ａ-Ｒ2 （Ｉ）
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ2はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、ＡはＴＧＦ-β前駆体配列の部分配列から選ばれ、該配列中、１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列を表し、配列内のＮ末端およびＣ末端アミノ酸残基を含む任意のアミノ酸残基から選ばれる２つのアミノ酸残基において、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、側鎖のアミノ基または側鎖のカルボキシル基においてＣＯ-ＮＨで表されるアミド結合、ＮＨ-ＣＯで表される逆アミド結合、または側鎖のチオール基でジスルフィド結合が形成されていてもよい。）で表わされ、かつ潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有するペプチドまたはその薬理的に許容される塩が提供される。
さらに一般式（Ｉ）において、ＡがヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列並びにヒトＴＧＦ-β１以外のＴＧＦ-β前駆体配列をヒトＴＧＦ-β１配列に整列化したときにヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列に相当する配列から選ばれるアミノ酸配列の部分配列から選ばれ、該配列中１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列であり、かつ潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有するペプチドまたはその薬理的に許容される塩が提供される。
さらに一般式（Ｉ）において、Ａが配列番号１〜１６のいずれかのアミノ酸配列から選ばれ、該配列中１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列であり、かつ潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有するペプチドまたはその薬理的に許容される塩が提供される。
また、本発明において潜在型ＴＧＦ-βを動物細胞に添加して該細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量を測定すること、潜在型ＴＧＦ-βと活性を評価すべき化合物を動物細胞に添加し該細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量を測定すること、該化合物による動物細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量の変化から該化合物の潜在型ＴＧＦ-βの細胞への結合阻害活性または促進活性を評価することからなるＴＧＦ−βが関与する疾病の治療または予防するための化合物を選択する方法が提供される。
さらに、動物細胞に一般式（Ｉ）で示されるペプチドまたはその薬理的に許容される塩を添加しＴＧＦ-β量を測定すること、評価すべき化合物および一般式（Ｉ）で示されるペプチドまたはその薬理的に許容される塩を動物細胞に添加しＴＧＦ-β量を測定すること、該化合物によるＴＧＦ-β量の変化から該化合物の潜在型ＴＧＦ-βのＴＧＦ-βへの変換反応の阻害活性または促進活性を評価することからなるＴＧＦ-βが関与する疾病の治療または予防するための化合物を選択する方法が提供される。
さらに、本発明によれば、前述の二つの方法のいずれかの方法により潜在型ＴＧＦ-βの細胞への結合を阻害する活性または促進する活性もしくは潜在型ＴＧＦ-βのＴＧＦ-βへの変換反応を阻害する活性または促進する活性を有する化合物が選択され、ＴＧＦ-βが関与する疾病の治療または予防するための化合物またはその薬理的に許容される塩提供される。
以下、一般式（Ｉ）で表わされるペプチドを化合物（Ｉ）と呼ぶ。
一般式（Ｉ）の各基の定義において、アルカノイルとしては、炭素数１〜２０の、例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、ラウロイル、イコサノイル等があげられる。
アロイルおよびアリールオキシカルボニルのアリール部分としては、フェニル、ナフチル等があげられる。
ヘテロアリールカルボニルおよびヘテロアリールオキシカルボニルのヘテロアリール部分は、フリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル等があげられる。
アルコキシカルボニルおよびアルコキシのアルキル部分としては、炭素数１〜２０の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、デシル、ドデシル、イコシル等があげられる。
置換アルカノイル、置換アルコキシカルボニル、および置換アルコキシにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えばヒドロキシ、カルボキシル、また、炭素数３〜８の、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等の脂環式アルキル、さらに置換もしくは非置換のフェニル、フルオレニル等があげられる。置換フェニルの置換基としては、同一または異なって置換数１〜３のアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、スルホ、シアノ、ハロゲン等があげられ、ハロゲンとしてはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられる。置換フェニルの置換基としてのアルキル、アルコキシのアルキル部分は上記のアルコキシカルボニルおよびアルコキシのアルキル部分と同義である。
置換アロイル、置換アリールオキシカルボニル、置換ヘテロアリールカルボニル、および置換ヘテロアリールオキシカルボニルの置換基は、同一または異なって置換数１〜３であり、上記の置換フェニルの置換基と同義である。
置換アミノの置換基としては、同一または異なって置換数１〜２の置換もしくは非置換のアルキルまたは置換もしくは非置換のアリールがあげられる。アルキルは置換基も含めて前記アルコキシ等のアルキル部分と同義である。アリール基は置換基も含めて前記アロイルまたはアリールオキシカルボニルのアリール部分と同義である。
ＴＧＦ-β前駆体配列としては、いかなる動物起源のいかなる種類のＴＧＦ-β配列でもよく、例えばヒトＴＧＦ-β１（J05114）［ネイチャー（Nature）, 316, 701（1985）］（配列番号１７）、ヒトＴＧＦ-β２（Y00083）［エンボ ジャーナル（EMBO. J.）, 6, 3673（1987）］（配列番号１８）、ヒトＴＧＦ-β３（J03241）［プロシーディング オブ ナショナル アカデミー サイエンス ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci., USA）, 85, 4715（1988）］（配列番号１９）、マウスＴＧＦ-β１（M13177）［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 261, 4377（1986）］（配列番号２０）、マウスＴＧＦ-β２（X57413）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）, 3, 1108（1989）］（配列番号２１）、マウスＴＧＦ-β３（M32745）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）, 3, 1926（1989）］（配列番号２２）、ラットＴＧＦ-β１（X52498）［ヌクレイック アシド リサーチ（Nucleic Acids Res.）, 18, 3059（1990）］（配列番号２３）、ラットＴＧＦ-β３（U03491）［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 270, 2722（1995）］（配列番号２４）、ウシＴＧＦ-β１（M36271）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.), 1, 693（1987）］（配列番号２５）、ブタＴＧＦ-β１（Y00111）［ヌクレイック アシド リサーチ（Nucleic Acids Res.）, 15, 3187（1987）］（配列番号２６）、ブタＴＧＦ-β３（X14150）［エンボ ジャーナル（EMBO J.）, 7, 3737（1988）］（配列番号２７）、イヌＴＧＦ-β１（L34956）［ジーン（Gene）, 155, 307（1995）］（配列番号２８）、ヒツジＴＧＦ-β１（X76916）［ジーン（Gene）, 150, 371（1994）］（配列番号２９）、ニワトリＴＧＦ-β２（X58071）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）, 7, 175（1991）］（配列番号３０）、ニワトリＴＧＦ-β３（M31154）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）, 2, 747（1988）］（配列番号３１）、ニワトリＴＧＦ-β４（M31160）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）, 6, 989（1992）］（配列番号３２）、サル（アフリカミドリザル）ＴＧＦ-β（M16658）［ディエヌエー（DNA）, 6, 239（1991）］（配列番号３３）、カエル（Xenopus laevis）ＴＧＦ-β５（J05180）［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 265, 1089（1990）］（配列番号３４）等があげられる。なおＴＧＦ-β前駆体配列名の次の括弧内に書いた数字はジンバンク（Genbank）の受け入れ番号（Accession Number）を示す。
Ａは、ＴＧＦ-β前駆体配列の部分配列から選ばれ、該配列中、１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列であれば特に制限はない。Ａは、ヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列並びにヒトＴＧＦ-β１以外のＴＧＦ-β前駆体配列をヒトＴＧＦ-β１配列に整列化したときにヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列から選ばれる配列の部分配列または該アミノ酸配列中、１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列であることが好ましい。
特にＡが、ヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列並びにヒトＴＧＦ-β１以外のＴＧＦ-β前駆体配列をヒトＴＧＦ-β１配列に整列化したときにヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列から選ばれる配列の部分配列であることが好ましい。
先に例示した各種動物起源の各種ＴＧＦ−β前駆体をヒトＴＧＦ−β１前駆体配列に整列化したものを第１表の１〜第１表の８に示す。配列の前後に示す数値はアミノ酸の位置番号示し、アミノ酸配列中の“−”は空位のアミノ酸位置を示す。
ヒトＴＧＦ−β１前駆体の３０〜６０番目、１４２〜１８６番目、２６９〜２９７番目のアミノ酸配列（第１表中、下線を付したヒトＴＧＦ−β１前駆体のアミノ酸配列）に相当する部分は、例えばヒトＴＧＦ−β２前駆体ではそれぞれ２１〜５１番目、１３７〜１８８番目、２９１〜３２０番目であり、ヒトＴＧＦ−β３前駆体ではそれぞれ２４〜５４番目、１３９〜１９０番目、２８８〜３１８番目である。こうした整列化は、バートン（Barton）とステーンベーグ（Sternberg）の方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）198, 327（1987））を用いておこなうことができる。
また、化合物（Ｉ）のうち、具体的に好ましい化合物としてはＡが配列番号１〜１６から選ばれ、該配列中１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列であるペプチドまたはその薬理的に許容される塩があげられる。特にＡが配列番号１〜１６から選ばれるアミノ酸配列が好ましい。
配列中１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいとは、一配列中の任意かつ単一もしくは複数個の位置における単一または複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加が全体で１〜５残基であることを意味し、欠失、置換、または付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型を問わない。
付加としては、例えば配列の両末端にシステイン、ホモシステインなど、チオール基を有するアミノ酸あるいは有機残基の付加をあげることができる。置換としては例えば配列内に存在するシステイン残基のセリンまたはアラニン残基への置換およびセリンまたはアラニン残基のシステイン残基への置換をあげることができる。また配列中に含まれる２つのチオール基間でジスルフィド結合を形成し環状化することもできる。さらにＮ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、側鎖のアミノ基または側鎖のカルボキシル基においてＣＯ-ＮＨで表されるアミド結合、ＮＨ-ＣＯで表される逆アミド結合を形成し環状化することもできる。
天然型アミノ酸としては、グリシン、L-アラニン、L-スレオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-バリン、L-ロイシン、L-セリン、L-メチオニン、L-イソロイシン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-プロリン、L-システイン、L-トリプトファンがあげられる。
潜在型ＴＧＦ-βとは、ＴＧＦ-βとその活性を抑制するＬＡＰからなる小分子量潜在型ＴＧＦ-β（ＳＬＴＧＦ-β）またはＴＧＦ-βとその活性を抑制するＬＡＰとＬＴＢＰからなる大分子量潜在型ＴＧＦ-β（ＬＬＴＧＦ-β）を示す。
本発明の選択方法で選択される化合物または化合物（Ｉ）の薬理的に許容される塩としては、酸付加塩、金属塩、有機塩基付加塩等があげられる。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩があげられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩およびアルミニウム塩、亜鉛塩等があげられる。有機塩基付加塩としては、メチルアミン、エチルアミン、アニリン等の一級アミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン等の二級アミンおよびトリメチルアミン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピリジン等の三級アミン等とで形成される塩並びにアンモニウム塩等があげられる。
以下に、本明細書中で用いられるアミノ酸およびその保護基に関する略号を説明する。
アミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するIUPAC-IUB委員会（IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature）の勧告［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）, 138, 9（1984）］に従った。
本明細書で使用する以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸および保護基を表す。
GlyまたはG; グリシン
AlaまたはA; L-アラニン
ThrまたはT; L-スレオニン
AspまたはD; L-アスパラギン酸
AsnまたはN; L-アスパラギン
Asx; L-アスパラギン酸またはL-アスパラギン
GluまたはE; L-グルタミン酸
GlnまたはQ; L-グルタミン
Glx; L-グルタミン酸またはL-グルタミン
ValまたはV; L-バリン
LeuまたはL; L-ロイシン
SerまたはS; L-セリン
MetまたはM; L-メチオニン
IleまたはI; L-イソロイシン
PheまたはF; L-フェニルアラニン
TyrまたはY; L-チロシン
LysまたはK; L-リジン
ArgまたはR; L-アルギニン
HisまたはH; L-ヒスチジン
ProまたはP; L-プロリン
CysまたはC; L-システイン
TrpまたはW; L-トリプトファン
Fmoc; 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
t-Bu; t-ブチル
Trt; トリチル
Pmc; 2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル
Boc; t-ブチルオキシカルボニル
以下の略号は、対応する下記の側鎖保護アミノ酸を表す。
Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-L-アスパラギン酸 β-t-ブチルエステル
Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-L-グルタミン酸 γ-t-ブチルエステル
Fmoc-Thr（t-Bu）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-スレオニン
Fmoc-Ser（t-Bu）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-セリン
Fmoc-Tyr（t-Bu）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-チロシン
Fmoc-Lys（Boc）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nε-t-ブチルオキシカルボニル-L-リジン
Fmoc-Asn（Trt）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nγ-トリチル-L-アスパラギン
Fmoc-Gln（Trt）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nδ-トリチル-L-グルタミン
Fmoc-Arg（Pmc）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Ng-2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル-L-アルギニン
Fmoc-His（Trt）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nim-トリチル-L-グルタミン
Fmoc-Cys（Trt）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-S-トリチル-L-システイン
Fmoc-TrP（Boc）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nind-t-ブチルオキシカルボニル-L-トリプトファン
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
PyBOP; ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリスピロリジノフォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート
HOBt; N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DCC; ジシクロヘキシルカルボジイミド
NMM; N-メチルモルホリン
DMF; N,N-ジメチルホルムアミド
NMP; N-メチルピロリドン
TFA; トリフルオロ酢酸
DTT; ジチオスレイトール
HBTU; 2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1, 1, 3, 3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート
DIPC; N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA; N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DCM; ジクロロメタン
次に、化合物（Ｉ）の製造法について説明する。
化合物（Ｉ）は、一般的な液相あるいは固相ペプチド合成法〔ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫ら、丸善（1985年）〕またはそれらを適宜組み合わせることで合成することができる。また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アプライドバイオシステム社〔Applied Biosystems Inc., U.S.A（ABI社）〕製ペプチド合成機、アドバンスドケムテック社〔Advanced ChemTech Inc., U.S.A（ACT社）〕製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖保護したNα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸またはNα-t-ブチルオキシカルボニルアミノ酸を用い、それぞれの合成プログラムに従い、実施することができる。
化合物（Ｉ）の原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ABI社、島津製作所、国産化学（株）、ノバ・バイオケム社（Nova Biochem）、渡辺化学（株）、ACT社またはペプチド研究所（株）から入手することができる。
環状化反応は液相法、固相法、またはそれらの組み合わせにより必要なアミノ酸残基と有機基を全て組み込み終わってから行う場合とペプチド鎖伸長の途中に行う場合がある。後者においては環状構造の完成後にさらにアミノ酸残基または有機基を伸長して化合物（Ｉ）を完成する。また、一般式（Ｉ）中の環状構造を形成するジスルフィド結合、アミド結合、または逆アミド結合を製造の最終段階で完成する場合だけでなく、まずこれらの結合が形成された後、環状構造の一部をなすアミノ酸残基とその隣に相当するアミノ酸残基の間で通常の配列におけるアミド結合が形成されることによって環状構造が完成してもよい。以下、詳しく環状化の工程を説明する。
１．ジスルフィド結合による環状化工程
適当な保護基により保護されたチオール基を有するアミノ酸残基を配列中の２個所に有するペプチドを、固相法、液相法、またはそれらの組み合わせによって得た後に、チオール保護基以外の保護基をまず除去し、続いて該チオール保護基を除去することによって得られる前駆体ペプチドを酸化反応に付し、有機化学反応工程における一般的精製方法を経て目的のジスルフィド結合を含む環状ペプチドを製造することができる。
１−１ 液相法におけるジスルフィド結合による環状化工程
該前駆体ペプチドを反応に不活性な溶媒中空気酸化に付すか、酸化剤と反応させることによりジスルフィド結合をもつ環状ペプチドを製造することができる。反応は0.5〜5000μmol/l、好ましくは50〜500μmol/lのペプチド濃度で行う。溶媒はpH4〜9、好ましくはpH6〜8に調整した50mM〜1Mのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸（Tris-HCl）等の緩衝液、5〜50%酸−水溶液、水、またDMF、DMSO、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール等の有機溶媒を単独もしくは混合して用いる。酸化剤としては該前駆体ペプチドに対する重量比0.1〜1倍量のフェリシアン化カリウム、同重量比0.5〜5倍量、好ましくは等重量のよう素、溶媒量として10〜50%のDMSO等が用いられる。反応は通常0〜40℃で、１時間〜１週間で終了する。本酸化反応に際しグルタチオンを加えると収率の向上が図られることがあり、該前駆体ペプチドに対し重量比0.5〜5倍量の酸化型グルタチオンとその1/2量の還元型グルタチオンを共存させて反応させてもよい［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Journal of American Chemical Society）, 103, 5867（1981）；続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、239頁、矢島治明監修、廣川書店（1991）］。酸化剤としてよう素を用いる場合は反応終了後、亜鉛粉末を溶液からよう素の色が消えるまで加え、そのままで、あるいは減圧下に濃縮後、各種クロマトグラフィーによって精製する。酸化剤としてフェリシアン化カリウムを用いる場合は酢酸を加えて溶液を微酸性とした後、そのままで、あるいは減圧下に濃縮後、各種クロマトグラフィーによって精製してもよく、またDowex 1X2（AcO-）（ダウ・ケミカル社）等の陰イオン交換樹脂を加えて過剰のフェリシアン化カリウム（フェリシアンイオン、フェロシアンイオン）を吸着除去した後にそのままで、あるいは減圧下に濃縮後、各種クロマトグラフィーによって精製してもよい。
また、所望の一個所のチオール基をピリジルスルフェニル化または2-ニトロピリジルスルフェニル化しておき、もう一方のチオール基を選択的に除去させると同時に一気に環化反応を進行させることもできる［インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（International Journal of Peptide and Protein Research）, 29, 162（1987）参照］。環化反応に用いられる溶媒、反応温度、および反応時間等は概ね上記と同様である。さらに二個所のチオール基をフリー化した後、ピリジルスルフェニル化試薬または2-ニトロピリジルスルフェニル化試薬を１当量分導入してもよい。ピリジルスルフェニル化反応には例えば2,2’-ジチオジピリジンを用い、1〜3当量をペプチドを含む溶媒に加えて攪拌すればよい。2-ニトロピリジルスルフェニル化もこれに準じて行うことができる。反応に用いられる溶媒、反応温度、および反応時間等は概ね上記と同様である［ペプチド・ケミストリー（Peptide Chemistry）, 1991, 125（1992）］。
１−２ 固相法におけるジスルフィド結合による環状化工程
適当な保護基により保護されたチオール基を有するアミノ酸残基を配列中の２個所に有するペプチドを、固相法によって伸長し、樹脂よりペプチドを切り出す前に、チオール保護基を選択的に除去し、酸化反応に付すことによって目的の環状ペプチド部分を製造することができる。その後樹脂よりペプチドを切り出しさらに残る保護基を除去すれば、目的の環状ペプチドが得られる。
チオール保護基には例えばアセトアミドメチル（Acm）基またはトリチル基（Trt）を用いることができる。樹脂上の保護ペプチドを例えばDMF、DCMなどの適当な溶媒中、よう素を反応させるとAcm基やTrt基が除去されると同時に分子内ジスルフィド結合が形成される。樹脂50mgに対し、0.5〜2mlの溶媒を用い、樹脂上の該ペプチドの計算重量に対する重量比0.5〜5倍量、好ましくは等重量のよう素と反応させる。反応は通常0〜40℃で行い、１時間〜１週間で終了する。反応終了後は、固相法の通常の処理、即ち、少量のDMF、DCM等の溶媒で樹脂を洗浄し、次の反応に用いることができる。
また、上記１−１で述べた一個所のチオール基をピリジルスルフェニル化または2-ニトロピリジルスルフェニル化する方法を固相法で行うこともでき、反応の条件は概ね環化反応に用いられる溶媒、反応温度、および反応時間等は概ね上記と同様である。さらに液相法と同様に二個所のチオール基をフリー化した後、ピリジルスルフェニル化試薬または2-ニトロピリジルスルフェニル化試薬を１当量分導入してもよい。反応には例えば2,2’-ジチオジピリジンを用い、1〜3当量を樹脂を膨潤させた溶媒に加えて攪拌すればよい。2-ニトロピリジルスルフェニル化も同様である。反応に用いられる溶媒、反応温度、および反応時間等は概ね上記固相反応における環化反応と同様である
２．アミド結合および逆アミド結合による環状化工程
適当な保護基により保護されたアミノ基を有するアミノ酸残基および適当な保護基により保護されたカルボキシル基を有するアミノ酸残基を配列中の２個所に有する、側鎖、N末端、およびC末端の保護されたペプチドを、固相法、液相法、またはそれらの組み合わせによって製造する。その後、該アミノ基および該カルボキシル基の保護基を選択的に除去することによって得られるペプチドを分子内縮合反応に付し、有機化学反応工程における一般的精製方法を経て、側鎖、N末端、およびC末端の保護された環状ペプチドを得、さらに残る保護基の脱保護反応を行うことにより目的のペプチドを製造することができる。また、環状ペプチド部分構造を得た後にペプチド鎖を伸長して目的のペプチドへと導いてもよい。
２−１ 液相法におけるアミド結合および逆アミド結合による環状化工程
適当な保護基により保護されたアミノ基を有するアミノ酸残基および適当な保護基により保護されたカルボキシル基を有するアミノ酸残基を配列中の２個所に有するペプチドを固相法によって得、樹脂よりペプチドを切り出す前に、該アミノ基および該カルボキシル基の保護基を選択的に除去することによって得られるフリーのアミノ基およびカルボキシル基を縮合反応に付し目的の環状ペプチド部分を形成することができる。その後、樹脂よりペプチドを切り出すと同時に他のアミノ酸残基の側鎖保護基を除去すれば、目的の環状ペプチドが製造される。
アミノ基の保護基として4-メチルトリチル基を用いる場合、該脱保護反応は酢酸／トリフルオロエタノール／DCM（1/2/7）を用いて行うことができる。反応は通常0〜40℃で行い、0.5〜6時間で終了する。反応終了後、ジエチルエーテル等を加えてペプチドを沈殿させ、溶媒を除くか、減圧下に溶媒を除く。必要に応じこうした操作を含む有機化学反応工程における一般的精製方法を用いることができる。
アミノ基の保護基としてアリルオキシカルボニル基を用い、カルボキシル基の保護基としてアリルエステル基を用いる場合、パラジウム触媒の存在下、還元剤を反応させれば一挙に所望の脱保護反応を進行させることができる。カルボキシル基のみの保護基にアリルエステル基を用いてもよい。パラジウム触媒は０価の均一系触媒であればいずれでもよく、テトラキス（トリフェニルフォスフィン）パラジウム（０）、または酢酸パラジウム（II）−トリフェニルフォスフィン等が例示される。添加量は上記保護基に対して0.01〜1当量、好ましくは0.1〜0.5当量を用いる。さらに添加剤として上記保護基に対して１当量から過剰量のぎ酸、ぎ酸−トリエチルアンモニウム、水素化トリブチルスズ、水素化トリフェニルスズ、トリメチルヒドロシラン、水素化ホウ素ナトリウム、酢酸、酢酸−NMM等を加える。溶媒としては、エーテル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、DMF、クロロホルム等を単独もしくは混合して用いることができる。アリルオキシカルボニル基またはアリルエステル基1mMに対し上記の試薬と溶媒3〜10mlを加え、反応は-20〜80℃、好ましくは0〜30℃で行い、10分〜６時間で終了する。反応終了後、有機化学反応工程における一般的精製方法を用いることができる。
得られたペプチドのフリーのアミノ基とカルボキシル基の間で分子間アミド結合を次に形成する。用いることができる環状アミド化反応には種々のものがあるが、代表的なものを以下にあげる。各反応に共通な条件として、反応溶媒はDMF、NMP、塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等を単独もしくは混合して用いる。ペプチドの濃度は0.5〜5000μmol/l、好ましくは50〜500μmol/lで行う。反応は通常0〜40℃、好ましくは4〜25℃で攪拌し、通常３時間から１週間間で終了する。反応終了後、有機化学反応工程における一般的精製方法を用いることができる。
カルボキシル基に対して1〜10当量のジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）または水溶性カルボジイミド（WSC）等のカルボジイミドを用いることができる。さらにカルボジイミドの1.5〜2当量のNMM、DIEA、または炭酸水素ナトリウムを加える。必要に応じカルボジイミドに対し添加剤として等モル量のHOBtまたはHONSuを加えてもよい。
カルボキシル基に対して1〜10当量のジフェニルホスホリルアジド（DPPA）またはジエチルホスホロシアニデート（DEPC）を用いることもできる。さらにカルボジイミドの1.5〜2当量のNMM、DIEA、または炭酸水素ナトリウムを加える。
カルボキシル基に対して1〜10当量、好ましくは2〜5当量のPyBOPと等モルのHOBtまたはHBTUと等モルのHOBtを用いることもできる。さらにPyBOPまたはHBTUの1.5〜2当量のNMM、DIEA、または炭酸水素ナトリウムを加える。
また、一旦カルボキシル基を活性化エステルへと導いた後、所望のアミノ基の保護基を選択的に脱離し、続いてアミド結合を形成してもよい。活性化エステルとしてはp-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、N-オキシコハク酸イミドエステル等があげられる。活性化エステルの導入の方法は種々あるが、例えばDCCをカルボキシル基に対して1〜10当量用い、等モルのp-ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはHONSuを加えて0〜5℃で１時間〜１日攪拌後、生成するジシクロヘキシルウレア（DCUrea）を濾去後、有機化学反応工程における一般的精製方法を用いて精製することができる。本活性エステル形成反応に用いられる溶媒、反応温度、反応時間等は上記のアミド形成反応と同様である。
２−２ 固相法におけるアミド結合および逆アミド結合による環状化工程
適当な保護基により保護されたアミノ基を有するアミノ酸残基もしくは有機基および適当な保護基により保護されたカルボキシル基を有するアミノ酸残基もしくは有機基を配列中の２個所に有するペプチドを固相法によって得、樹脂よりペプチドを切り出す前に、該アミノ基および該カルボキシル基の保護基を選択的に除去することによって得られるフリーのアミノ基およびカルボキシル基を縮合反応に付し目的の環状ペプチド部分を形成することができる。その後、樹脂よりペプチドを切り出すと同時に他のアミノ酸残基の側鎖保護基を除去すれば、目的の環状ペプチドが製造される。
アミノ基の保護基として4-メチルトリチル基を用いる場合、該脱保護反応には樹脂50mgに対し、酢酸／トリフルオロエタノール／DCM（1/2/7）を0.5〜2mlの割合で用いることができる。反応は通常0〜40℃で行い、0.5〜6時間で終了する。反応終了後は、固相法の通常の処理、即ち、少量のDMF等の溶媒で樹脂を洗浄し、次の反応に用いることができる。
アミノ基の保護基としてアリルオキシカルボニル基を用い、カルボキシル基の保護基としてアリルエステル基を用いる場合、脱保護反応には通常0.1〜0.2Mのテトラキス（トリフェニルフォスフィン）パラジウム（0）、5% 酢酸、2.5%NMMを含むクロロホルム等の溶液を用いることができる。アリルオキシカルボニル基およびアリルエステル基1mMに対し上記クロロホルム溶液を3〜10ml加え、反応は通常0〜40℃で行い0.5〜6時間で終了する。反応終了後は、固相法の通常の処理、即ち、少量のDMF等の溶媒で樹脂を洗浄し、次の反応に用いることができる。
次に樹脂上の計算上のカルボキシル基量に対して1〜10当量、好ましくは2〜5当量のPyBOPまたはHBTU、PyBOPまたはHBTUと等モルのHOBt、およびPyBOPまたはHBTUの1.5〜2当量のNMMまたはDIEAを含むDMF、DCM、またはNMPなどの有機溶媒の溶液を樹脂50mgに対し1mlの割合で用いる。反応は通常0〜40℃、好ましくは4〜25℃で攪拌し、通常３時間から１週間で終了する。反応終了後は、固相法の通常の処理、即ち、少量のDMF等の溶媒で樹脂を洗浄し、次の反応に用いることができる。
このようにして得られた化合物（Ｉ）は、C-4、C-8、またはC-18タイプ等の逆相シリカゲルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、HPLCという）、分配樹脂、吸着樹脂、イオン交換樹脂、シリカゲル、化学修飾シリカゲル、逆相シリカゲル、アルミナ、珪藻土、または珪酸マグネシウム等を用いたゲル濾過等のカラムクロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィー等により精製することができる。
化合物（Ｉ）の薬理的に許容される塩を取得するときは常法に従う。すなわち、化合物（Ｉ）の酸付加塩または有機塩基付加塩は、対応する酸あるいは有機塩基の水溶液に化合物（Ｉ）を溶解し、凍結乾燥することによって得られる。また、化合物（Ｉ）の金属塩は、対応する金属イオンを含む水溶液に化合物（Ｉ）を溶解し、ゲル濾過またはHPLCで精製することによって得られる。
次に、化合物（Ｉ）の具体例を第２表に示す。
次に、潜在型ＴＧＦ-βを動物細胞に添加して該細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量を測定すること、潜在型ＴＧＦ-βと活性を評価すべき化合物を動物細胞に添加し該細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量を測定すること、該化合物による動物細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量の変化から該化合物の潜在型ＴＧＦ-βの細胞への結合阻害活性または促進活性を評価することからなるＴＧＦ-βが関与する疾病の治療または予防するための化合物を選択する方法について述べる。
本発明で選択の対象となる化合物は、合成化合物でも天然物質でも特に制限なく用いることができる。例えば天然もしくは合成のペプチドまたは天然蛋白質を酵素等で加水分解して得たペプチド等を評価することができる。
潜在型ＴＧＦ-βは、各種動物細胞から、例えば岡田らの方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）, 106, 304（1989）］等で抽出・精製したもの、遺伝子組換法を用いて製造したもの［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）, 271, 29891（1996）］等を用いることができる。本発明で使用する動物細胞としては、潜在型ＴＧＦ-βが結合できる細胞があげられる。該細胞としては、例えば血小板、血管平滑筋細胞、毛細血管内皮細胞、頚動脈内皮細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、マクロファージ等の細胞があげられる。細胞は、ヒト、ウシ、ブタ、ネズミ等の動物から、単離・精製したものあるいは、それら細胞由来の培養細胞が用いうる。単離・精製方法としては、例えば、オカダ（Okada）らの方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）, 106, 304（1989）］等があげられる。細胞への潜在型ＴＧＦ-βの結合は、例えば細胞を培地で培養し潜在型ＴＧＦ-βを添加しインキュベートした後、細胞を洗浄し、細胞に結合している潜在型ＴＧＦ-βを測定することにより行うことができる。
潜在型ＴＧＦ-βは、例えばクロラミンＴ法［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular & Cellular Biology）, 2, 599（1982）］により125Ｉ標識したものを用いるのが好ましい。これにより、細胞に結合した潜在型ＴＧＦ-βは、放射活性を測定することにより求めることができる。
また、潜在型ＴＧＦ-βが細胞に結合し活性化されるので、細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量の測定は、活性型ＴＧＦ-β量を測定することにより行うこともできる。活性型ＴＧＦ-βの定量は、いかなる方法で測定しても良い。直接抗ＴＧＦ-β抗体を用いた酵素免疫測定方法［メソッヅ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）, 198, 303（1991）］または安部らのルシフェラーゼ・アッセイ・システム［アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）, 216, 276（1994）］等で測定することができる。また、血管内皮細胞の遊走度［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）］、血管平滑筋細胞の増殖［トウホク・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Tohoku Journal of Experimental Medicine）, 179, 23（1996）］、各種癌細胞の増殖阻害［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal of Clinical Investigation）, 87, 277（1991），エンドクリノロジー（Endocrinology）, 128, 1981（1991）］、ミンク肺上皮細胞の増殖阻害［メソッヅ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）, 198, 317（1991）］等の方法で測定できる。
活性を評価すべき化合物を添加しないときの、細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量または活性型ＴＧＦ-β量と活性を評価すべき化合物を添加したときの細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量または活性型ＴＧＦ-β量を比較し、その差異から該化合物が、ＴＧＦ-βが関与する疾病の治療または予防するための化合物として有望か否かが判断される。目的化合物の選択は、例えば、添加濃度1mMで評価すべき化合物を添加しない場合の活性型ＴＧＦ-β量に対し、添加した場合の活性型ＴＧＦ-β量が１０％以上増加または減少の認められる化合物を選択することが好ましい。
また、動物細胞に化合物（Ｉ）で示されるペプチドまたはその薬理的に許容される塩を添加しＴＧＦ-β量を測定すること、評価すべき化合物および化合物（Ｉ）で示されるペプチドまたはその薬理的に許容される塩を動物細胞に添加しＴＧＦ-β量を測定すること、該化合物によるＴＧＦ-β量の変化から該化合物の潜在型ＴＧＦ-βのＴＧＦ-βへの変換反応の阻害活性または促進活性を評価することからなるＴＧＦ-βが関与する疾病の治療または予防するための化合物を選択する方法について述べる。
本発明で選択の対象となる化合物は、合成化合物でも天然物質でも特に制限なく用いることができる。例えば天然もしくは合成のペプチドまたは天然蛋白質を酵素等で加水分解して得たペプチド等を評価することができる。
本発明の方法に使用する細胞は、細胞自身が潜在型ＴＧＦ-βを分泌する細胞である。この細胞系では、試験系に潜在型ＴＧＦ-βを添加することなく目的化合物を選択することができるので好ましい。潜在型ＴＧＦ-βを分泌する細胞としては例えば、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、マクロファージ等およびこれらに由来する培養細胞があげられる。
活性型ＴＧＦ-βの定量は、いかなる方法で測定しても良く、例えば前述の定量方法が用いうる。
本発明で選択される化合物は、上述で規定するペプチドだけでなく潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有する化合物すべてを含有する。
本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくは薬理的に許容される塩は、癌、糖尿病性網膜症、粥状動脈硬化、骨折、心筋梗塞、虚血再環流後の心筋障害、脳梗塞、網膜剥離、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、移植腎拒絶、HIV腎症、特発性肺線維症、自己免疫性肺線維症、肝硬変、（癌療法後に好発の）静脈狭窄性肝障害、全身性硬化症、ケロイド、好酸球増加−筋肉痛症候群、血行再建術後再狭窄、眼内線維症、リウマチ性関節炎、鼻たけ等の治療または予防剤として用いることができ、特に各種抗線維症剤、抗腫瘍剤または抗動脈硬化剤として好ましく用いられる。本化合物はそのままでまたは各種の投与形態で用いることができる。例えば、本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩を生理食塩水、グルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して注射液として適当な医薬組成物とすることができる。また、例えば本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩を凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることにより粉末注射剤を作成することができる。本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば製剤上許容される塩を含有することができる。
また、本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩と適当な賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等を混合成形して、錠剤、粒剤、粉剤、シロップ剤等とすることにより経口剤として用いることができる。さらには、本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩と常用される担体とを混合形成して座剤とし、直腸投与することも可能である。
投与量は投与方法、本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩の種類、患者の年齢、症状等によって異なり、また投与方法も症状や投与量によって変えることができる。例えば、本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩は１日あたり0.00001〜100mg/kg、好ましくは0.01〜10mg/kgを投与することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ブタ血管平滑筋細胞（ＰＳＭＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの結合度を放射活性により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」レーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合の放射活性、その他のレーンは各試験化合物を１００μｇ／ｍｌの濃度になるように加えた場合の放射活性をそれぞれ表す。
図２は、ウシ血管平滑筋細胞（ＢＳＭＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの結合度を放射活性により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、「ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ」のレーンは細胞の存在しないプレートに125Ｉ−ＬＬＴＧＦ-βのみを加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を１００μｇ／ｍｌになるように加えた場合の放射活性をそれぞれ表す。
図３は、ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの遊走阻害活性を、顕微鏡下の視野中に遊走してきた細胞数により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を５０μｇ／ｍｌになるように加えた場合の視野中の細胞数をそれぞれ表す。
図４は、ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの遊走阻害活性を、顕微鏡下の視野中に遊走してきた細胞数により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を１００μｇ／ｍｌになるように加えた場合の視野中の細胞数をそれぞれ表す。
図５は、ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの遊走阻害活性を、顕微鏡下の視野中に遊走してきた細胞数により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を併せて示した濃度になるように加えた場合の視野中の細胞数をそれぞれ表す。
図６は、ルシフェラーゼ・アッセイ・システムにより活性化ＴＧＦ-β量を測定したときの実際の発光強度の測定結果である。「ＳＴＤ」のレーンは定常状態、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を併せて示した濃度になるように加えた場合の発光強度をそれぞれ表す。
図７は、図６で示した発光強度から換算して活性化ＴＧＦ-β量を求めた結果である。各レーンの意味は図６に同じである。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例において、化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。質量分析は、日本電子JMS-SX102Aを用いFAB法により行った。アミノ酸分析は、ビドリングメイヤー（Bidlingmeyer B. A.）らの方法［ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography), 336, 93（1984）］により行った。加水分解は塩酸蒸気中110℃で22時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はPico Tagアミノ酸分析計（Waters社製）を用い分析した。
実施例１ 化合物１ （配列番号１）（H-Leu-Gln-Ser-Ser-Arg-His-Arg-Arg-Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Phe-Ser-Ser-Thr-Glu-Lys-Asn-Cys-OH）の合成Fmoc-Cys（Trt）、62.5μmmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、123mgをABI社自動合成機model 430Aの反応器に入れ、ABI社のFmoc法による合成プログラムに従い次の操作を行った。
（ａ）20% ピペリジン-NMP溶液を加えて混合物を20分間攪拌し、該溶液を排出した。
（ｂ）担体樹脂をNMPで５分間洗浄し、該溶液を排出した。
こうして、Fmoc基を除去したCys（Trt）の結合した担体樹脂を得た。
（ｃ）Fmoc-Asn（Trt）-OH 250μmol（樹脂上のアミノ酸に対し４当量）をNMP中あらかじめDCCおよびHOBtと50分間攪拌した溶液を樹脂に加えて混合物を60分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｄ）担体樹脂をNMPで３分間洗浄した。こうして、Fmoc-Asn（Trt）-Cys（Trt）が担体上に合成された。
次に、（ａ）、（ｂ）の脱保護、洗浄工程を行った後、（ｃ）の工程でFmoc-Lys（Boc）-OHを用いて縮合反応を行い、次いで（ｄ）の洗浄工程を経て、Fmoc-Lys（Boc）-Asn（Trt）-Cys（Trt）が担体上に合成された。以下、工程（ｃ）において、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc−Tyr（t-Bu）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-His（Trt）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返し、保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。さらに、（ａ）〜（ｂ）の脱保護、洗浄工程を行った後、担体樹脂をメタノール、ブチルエーテルで順次洗浄後、減圧下12時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂310.3mgを得た。これに、TFA（82.5%）、チオアニソール（5%）、水（5%）、エチルメチルスルフィド（3%）、1,2-エタンジチオール（2.5%）およびチオフェノール（2%）からなる混合溶液10mlを加えて室温で８時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液を2ml程度まで減圧下濃縮した後にエーテル約10mlを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして145mgを取得した。この粗生成物のうち70mgを2M酢酸に溶解後、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 25mm）を用いたHPLCで精製した。0.1%TFA水溶液に、TFA0.1%を含む90%アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nmで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物１を25.5mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2701.1（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 3.1（3）, Glx 2.1（2）, Ser 5.0（5）, His 1.0（1）, Arg 2.9（3）, Thr 2.0（2）, Ala 1.0（1）, Tyr 1.0（1）, Leu 1.9（2）, Phe 1.0（1）, Lys 1.1（1）, Cys 1.1（1）
実施例２ 化合物２ （配列番号２）（H-Pro-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Cys-OH）の合成
Fmoc-Cys（Trt）、100μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、181.8mgを出発物質とし、実施例１と同様にして、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、をFmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂、568.4mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、320mgを取得し、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm)を用いたHPLCで精製し、化合物２を26.4mg得た。
質量分析［FABMS］：m/z=2870.4（M+H+）
アミノ酸分析：Glx 3.0（3）, Ser 1.1（1）, His 1.0（1）, Arg 3.8（4）, Ala 1.1（1）, Pro 0.9（1）, Val 2.6（3）, Leu 7.3（7）, Lys 2.1（2）, Cys 1.2（1）
実施例３ 化合物３ （配列番号３）（H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys-OH）の合成
Fmoc-Cys（Trt）、33μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、60mgを島津製作所製自動合成機PSSM-8の反応器に入れ、合成プログラムに従い次の操作を行った。（ａ）担体樹脂を500μｌのDMFにより３分間洗浄し、該溶液を排出した。 （ｂ）30%ピペリジン-DMF溶液500μｌを加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返した。
（ｃ）担体樹脂を500μｌのDMFで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返した。
こうして、Fmoc基を除去したCys（Trt）の結合した担体樹脂を得た。
（ｄ）Fmoc-Gly-OH、330μmol、PyBOP、330μmol、HOBt １水和物、330μmolおよびNMM、495μmolをDMF 1155μｌ中で３分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を30分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｅ）担体樹脂を500μｌのDMFで１分間洗浄し、これを５回繰り返した。こうして、Fmoc-Gly-Cys（Trt）が担体上に合成された。
次に、（ａ）〜（ｃ）の洗浄、脱保護工程を行った後、（ｄ）の工程でFmoc-Arg（Pmc）-OHを用いて縮合反応を行い、次いで（ｅ）の洗浄工程を経て、Fmoc-Arg（Pmc）-Gly-Cys（Trt）が担体上に合成された。以下、工程（ｄ）において、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次用いて、（ａ）〜（ｅ）を繰り返し、保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。さらに、（ａ）〜（ｃ）の洗浄、脱保護工程を行った後、担体樹脂を500μｌのDMFで１分間洗浄し、これを５回繰り返した後、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄後、減圧下12時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、103.2mgを取得し、逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物３を25.4mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2648.1（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.1（1）, Glx 2.1（2）, Ser 1.9(2）Gly 1.1（1）, Arg 2.5（3）, Thr 1.8（2）, Ala 1.1（1）, Val 0.9（1）, Met 1.0（1）,Ile 3.0（3）, Leu 2.1（2）, Lys 3.1（3）, Cys 1.2（1）
実施例４ 化合物４ （配列番号４）（H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH)の合成
Fmoc-Gly、33μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、60mgを出発物質とし、実施例１と同様にして、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、115.3mgを取得し、逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物４を63.3mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z：2545.1（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.1（1）, Glx 2.1（2）, Ser 1.9（2）, Gly 1.1（1）, Arg 2.6（3）, Thr 1.9（2）, Ala 1.1（1）, Val 0.9（1）, Met O.9（1）, Ile 3.0（3）, Leu 2.1（2）, Lys 3.0（3）
実施例５ 化合物５ （配列番号５）（H-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH）の合成
Fmoc-Gly、25μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、51.0mgを出発物質とし、ACT社のペプチド合成機ACT357を用いて、次の操作を行った。
（ａ）担体樹脂をDMF、1mlにより30秒間洗浄し、該溶液を排出した。
（ｂ）25% ピペリジン-DMF溶液1mlを加えて混合物を２分間攪拌し、該溶液を排出し、さらに25%ピペリジン-DMF溶液1mlを加えて混合物を10分間攪拌し、該溶液を排出した。
（ｃ）担体樹脂をDMFで12秒間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を７回繰り返した。
こうして、Fmoc基を除去したGlyの結合した担体樹脂を得た。
（ｄ）DMF、125μｌ、Fmoc-Arg（Pmc）-OHとHOBt 1水和物とをそれぞれ0.25Mの濃度で含むNMP溶液500μｌ、PyBOPを0.25Mの濃度で含むDMF溶液500μｌ、およびNMMを2.0Mの濃度で含むDMF溶液、125μｌを樹脂に加えて60分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｅ）反応容器を500μｌのDMFで洗浄後、1mlのDMFで30秒間攪拌洗浄し、さらに再度500μｌのDMFで洗浄した。こうして、Fmoc-Arg（Pmc）-Glyが担体上に合成された。
次に、（ａ）〜（ｃ）の洗浄、脱保護工程を行った後、（ｄ）の工程でFmoc-Arg（Pmc）-OHに代わりFmoc-Ile-OHを含む溶液を用いて縮合反応を行い、次いで（ｅ）の洗浄工程を経て、Fmoc-Ile-Arg（Pmc）-Glyが担体上に合成された。以下、工程（ｄ）において、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂（Wangレジン）、132.5mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、58.3mgを取得した。これを、実施例１と同様に逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物５を22.6mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2029.2（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.0（1）, Glx 2.0（2）, Gly 1.0（1）, Arg 3.0（3）, Thr 1.0（1）, Ala 1.1（1）, Val 0.9（1）, Met 1.1（1）, Ile 2.9（3）, Leu 1.1（1）, Lys 2.0（2）
実施例６ 化合物６ （配列番号６）（H-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH）の合成
Fmoc-Gly、25.0μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、51.0mgを出発物質とし、実施例５と同様にして、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂、112.2mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、48.7mgを取得した。これを再度1mlのTFAに溶解し、50mlのエーテル中に滴下後生成した沈殿を濾別回収し乾燥させ、化合物６を35.5mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=1439.0（M+H+）
アミノ酸分析；Glx 1.1（1）, Gly 1.0（1）, Arg 3.0（3）, Ala 1.1（1）, Val 0.8（1）, Ile 1.9（2）, Leu 1.0（1）, Lys 2.0（2）
実施例７ 化合物７ （配列番号７）（H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-OH）の合成
Fmoc-Ile、25.0μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、56.8mgを出発物質とし、実施例５と同様にして、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂、280.9mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、123.1mgを取得した。これを、実施例１と同様に逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物７を26.7mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2019.2（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.1（1）, Glx 1.1（1）, Ser 1.7（2）, Arg 2.2（2）, Thr 1.7（2）, Val 1.0（1）, Met 1.0（1）, Ile 2.1（2）, Leu 2.1（2）, Lys 3.1（3）
実施例８ 化合物８ （配列番号８）（H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-OH）の合成
Fmoc-Arg（Pmc）、25.0μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、48.1mgを出発物質とし、実施例５と同様にして、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂、79.3mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、18.3mgを取得した。これを、実施例１と同様に逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物８を4.7mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=1621.0（N+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.0（1）, Glx 1.1（1）, Ser 1.8（2）, Arg 1.1（1）, Thr 1.9（2）, Val 0.9（1）, Met 1.0（1）, Ile 1.0（1）, Leu 2.1（2）, Lys 2.0（2）
実施例９ 化合物９ （配列番号９）（H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-OH）の合成
Fmoc-Val、25.0μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、48.1mgを出発物質とし、実施例５と同様にして、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂、120.3mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、49.0mgを取得した。ただし、切り出しに用いた混合溶液は90%TFA、5% 1,2-エタンジチオール、5% チオアニソールよりなり、これを加えた後の放置時間は２時間とした。これを、実施例１と同様に逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物９を20.2mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=1336.7（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.1（1）, Glx 1.1（1）, Ser 1.8（2）, Thr 1.8（2）, Val 1.0（1）, Met 1.0（1）, Ile 1.0（1）, Leu 2.1（2）, Lys 1.0（1）
実施例１０ 化合物１０ （配列番号１０）〔H-cyclo（Cys-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys）-OH〕の合成
Fmoc-Cys（Trt）、16.5μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、30mgを出発物質とし、実施例３と同様にして、Fmoc-Gly、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc−Cys（Trt）-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、アミノ酸の縮合時間は６０分間とした。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、54.5mgを取得した。これを、実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm)を用いたHPLCで精製し、化合物１０の未環化体を14.0mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2751.7（M+H+）
これを10mlのDMSOに溶解し、アンモニア水を加えてpH 7.1とし、室温で29時間攪拌した。溶液を凍結乾燥後、再度2M酢酸水溶液に溶解し凍結乾燥して、化合物１０を13.5mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2749.5（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.2（1）, Glx 2.2（2）, Ser 2.0（2）, Gly 1.1（1）, Arg 3.0（3）, Thr 2.0（2）, Ala 1.1（1）, Val 1.0（1）, Met 1.1（1）, Ile 3.1（3）, Leu 2.2（2）, Lys 3.1（3）, Cys 1.8（2）
実施例１１ 化合物１１ （配列番号１１）〔H-Leu-Ser-Thr-cyclo（Cys-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys）-OH〕の合成
Fmoc-Cys（Trt）、16.5μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、30mgを出発物質とし、実施例３と同様にして、Fmoc-Gly、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、アミノ酸の縮合時間は60分間とした。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、55.2mgを取得した。これを、実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物１１の未環化体を9.7mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2664.5（M+H+）
これを10mlのDMSOに溶解し、アンモニア水を加えてpH 7.3とし、室温で20時間攪拌した。溶液を凍結乾燥後、再度2M酢酸水溶液に溶解し凍結乾燥して、化合物１１を9.9mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2662.5（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 0.9（1）, Glx 2.0（2）, Ser O.9（1）, Gly 1.1（1）, Arg 3.0（3）, Thr 1.9（2）, Ala 1.1（1）, Val 0.9（1）, Met 1.0（1）, Ile 3.2（3）, Leu 2.1（2）, Lys 2.9（3）, Cys 1.5（2）
実施例12 化合物12（配列番号12）〔H-cyclo（Cys-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Cys）-OH〕の合成
H-Cys（Trt）、140μmolが結合した担体樹脂（Cl-Trtレジン）、250mgを出発物質とし、ACT社のペプチド合成機ACT357を用いて、次の操作を行った。
（ａ）担体樹脂をDMF2.5mlにより３分間洗浄し、該溶液を排出する操作を２回繰り返した。
（ｂ）DMF 250μｌ、Fmoc-Lys（Boc）-OHとHOBt・１水和物とをそれぞれ0.5Mの濃度で含むNMP溶液1.4ml、DIPCを0.5Mの濃度で含むNMP溶液1.4mlを樹脂に加えて40分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｃ）DMF 2.5mlにより１分間洗浄し、該溶液を排出する操作を２回繰り返した。
（ｄ）DMF 250μｌ、Fmoc-Lys（Boc）-OHとHOBt・１水和物とをそれぞれ0.5Mの濃度で含むNMP溶液1.4ml、HBTUを0.5Mの濃度で含むDMF溶液1.4ml、及びDIEAを2.0Mの濃度で含むNMP溶液0.7mlを樹脂に加えて20分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｅ）（ｃ）と同一の操作を行った。
こうして、Fmoc-Lys（Boc）-Cys（Trt）が担体上に合成された。次に、
（ｆ）ピペリジンを25%の濃度で含むDMF溶液2.5mlを加えて混合物を２分間攪拌し、該溶液を排出し、さらに同溶液2.5mlを加えて混合物を10分間攪拌し、該溶液を排出した。
（ｇ）担体樹脂を2.5mlのDMFで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を７回繰り返した。
こうして、Fmoc基を除去したLys（Boc）-Cys（Trt）の結合した担体樹脂を得た。
次に、（ａ）〜（ｅ）の工程でFmoc-Lys（Boc）-OHに代わりFmoc-Leu-OHを含む溶液を用いて縮合反応を行い、次いで（ｆ）、（ｇ）の脱保護、洗浄工程を経て、Leu-Lys（Boc）-Cys（Trt）が担体上に合成された。以下、工程（ａ）〜（ｅ）において、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc−Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OHを用いて各工程を繰り返し、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。
得られた樹脂のうち4/5量を用い、実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド137.2mgを取得した。100mgのDTTとともに2mlのDMFに溶解し、50℃で１時間放置した後、実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D. x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、２つのSH基が遊離した状態のペプチドを12.2mg得た。
質量分析（FABMS）；m/z=2284.3（M+H+）
これを、5mlの2M酢酸水溶液に溶解し、水で50mlに希釈した後、希アンモニア水を加えてpH5.7にした。ここに0.1MのK3Fe（CN）6水溶液0.5mlを加えて室温で2.5時間攪拌した後、反応溶液に1mlの酢酸を加えた。実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D. x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、化合物12を7.3mg得た。
質量分析（FABMS）；m/z=2282.5（M+H+）
アミノ酸分析：Glx 1.0（1）, Ser 1.0（1）, Arg 3.9（4）, Ala 1.1（1）, Val 0.7（1）, Leu 7.2（7), Lys 2.1（2）, Cys 2.7（2）
実施例13 化合物13（配列番号13）〔Biotinyl-cyclo（Cys-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Cys）-OH〕の合成
実施例12で得られた、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂のうちの1/5量を1mlのDMFで洗浄した後、68.4mgのD-ビオチン（ナカライテスク）を含む440μｌのDMF懸濁液およびDIPCを0.5Mの濃度で含むNMP溶液を加えて室温で２日間攪拌した。溶液を排出した後、洗浄、乾燥を経て、N末がビオチン化された側鎖保護ペプチドの結合した樹脂を得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド47.3mgを取得した。50mgのDTTとともに1mlのDMFに溶解し、50℃で１時間放置した後、実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D.x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、２つのSH基が遊離した状態のペプチドを11.8mg得た。
質量分析（FAB-MS）；m/z=2510.8（M+H+）
これを、5mlの2M酢酸水溶液に溶解し、水で50mlに希釈した後、希アンモニア水を加えてpH5.5にした。ここに0.1MのK3Fe（CN）6水溶液0.5mlを加えて室温で３時間攪拌した後、反応溶液に1mlの酢酸を加えた。実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D.x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、化合物13を3.8mg得た。
質量分析（FABMS）；m/z=2508.8（M+H+）
アミノ酸分析：Glx 1.1（1）, Ser 1.0（1）, Arg 3.8（4）, Ala 1.1（1）, Val 0.8（1）, Leu 6.8（7）, Lys 2.0（2）, Cys 2.1（2）
実施例14 化合物14（配列番号14）〔H-Leu-Ser-Thr-Cys-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-OH〕の合成
Fmoc-Arg（Pmc）、23μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、50mgを出発物質とし、実施例３と同様にして、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、アミノ酸の縮合時間は60分間とした。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド59.8mgを取得した。これを実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D.x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、化合物14を7.7mgを得た。
質量分析（FABMS）；m/z：1921.7（M+H+）
アミノ酸分析：Asx 1.0（1）, Glx 1.1（1）, Ser 0.9（1）, Arg 2.2（2）, Thr 1.6（2）, Val 0.9（1）, Met 1.1（1）, Ile 1.0（1）, Leu 2.1（2）, Lys 3.1（3）, Cys 1.3（1）
実施例15 化合物15（配列番号15）〔H-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Ser-Asn-Asn-Ser-Trp-Arg-OH〕の合成
Fmoc-Arg（Pmc）、23μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、50mgを出発物質とし、実施例３と同様にして、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc−Lys（Boc）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、アミノ酸の縮合時間は60分間とした。側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しは、用いる混合液として、実施例１の組成のものに5mg/mlの割合で2-メチルインドールを加えたものを用い、放置時間を６時間とする以外は実施例１と同様に行い、粗ペプチド20.9mgを取得した。これを実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D.x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、化合物15を7.8mgを得た。
質量分析（FABMS）；m/z=2663.5（M+H+）
アミノ酸分析：Asx 2.0（2）, Glx 3.9（4）, Ser 2.0（2）, His 1.1（1）, Arg 1.1（1）, Tyr 2.2（2）, Val 1.8（2）, Leu 3.0（3）, Lys 3.0（3）
実施例16 化合物16（配列番号16）〔Biotinyl-Gly-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Ser-Asn-Asn-Ser-Trp-Arg-OH〕の合成
Fmoc-Arg（Pmc）、13.8μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、30mgを出発物質とし、実施例３と同様にして、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Gly-OHを順次縮合した後に、樹脂に対して、61.9mgのD-ビオチン（ナカライテスク）に、0.5Mの濃度でHBTUおよびHOBt・１水和物を含むDMF溶液562μｌとDIEAを1Mの濃度で含むDMF溶液562μｌを加えて室温で５分間攪拌した溶液を加えて、４時間攪拌した。溶液を排出した後、洗浄、乾燥を経て、N末がビオチン化された側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、アミノ酸の縮合反応工程（ｄ）において、PyBOPの代わりにHBTUを、NMMの代わりにDIEAを使用した。側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しは、用いる混合液として、実施例１の組成のものに5mg/mlの割合で2-メチルインドールを加えたものを用い、放置時間を６時間とする以外は実施例１と同様に行い、粗ペプチド44.2mgを取得した。これを実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D.x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、化合物16を10.3mgを得た。
質量分析（FABMS）；m/z=3260.0（M+H+）
アミノ酸分析：Asx 2.1（2）, Glx 4.1（4）, Ser 2.0（2）, Gly 1.0（1）, His 1.0（1）, Arg 2.8（3）, Tyr 2.1（2）, Val 1.9（2）, Leu 3.0（3）, Lys 2.9（3）
実施例17 化合物10の酢酸塩への変換
実施例10のようにして得られた化合物10、22.1mgを1%酢酸水溶液5mlに溶解し、陰イオン交換カラム（旭化成 Asahi Pack ES-502N 21.5mmI.D.×100mm）を通すことで、TFAを除去し酢酸塩に変換した。ペプチドは1%酢酸水溶液にて溶出させ、220nmで検出した。溶出液を凍結乾燥し、化合物10の酢酸塩20.0mgを得た。
実施例18 化合物12の酢酸塩への変換
実施例12のようにして得られた化合物12、17.5mgを1%酢酸水溶液5mlに溶解し、陰イオン交換カラム（旭化成 Asahi Pack ES-502N 21.5mmI.D.×100mm）を通すことで、TFAを除去し酢酸塩に変換した。ペプチドは1%酢酸水溶液にて溶出させ、220nmで検出した。溶出液を凍結乾燥し、化合物12の酢酸塩13.0mgを得た。
次に、化合物（Ｉ）の生物活性およびスクリーニング方法について実施例を示す。
実施例１９ ウシ血管平滑筋細胞、ブタ血管平滑筋細胞、ウシ毛細血管内皮細胞又はウシ頚動脈内皮細胞に対するＴＧＦ-βの結合度測定による、潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-β遊離活性
（１−１）ＬＬＴＧＦ-β125Ｉ-標識
オカダ（Okada）らの方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）, 106, 304（1989）］に従いヒト血小板から精製したＬＬＴＧＦ-βを用い、クロラミンＴ法［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular & Cellular Biology）, 2, 599（1982）］により125Ｉ標識した。具体的には以下の操作を行った。
２μｇのＬＬＴＧＦ-βに1M K-phopsphate Buffer（pH 7.5）を25μｌ、Na-125Ｉ（DuPont NEN）を37MBq、クロラミン-Ｔ（0.5mg/100μｌ in 0.05M K-phos. buffer、和光純薬）を10μｌ加え、40秒間室温で撹拌した。Na2S2O5（1mg/100μｌ in 0.05M K-phos. buffer）を15μｌ加え、５秒間室温で撹拌した後、チロシン水溶液（1mg/ml）100μｌを添加した。反応液をSephadex G25カラムにアプライし、500μｌずつフラクションを分取し、γ-カウンター（ARC-2000、アロカ）にてカウントし、ラベル化蛋白を含む画分を選択し、実験に用いた。
（１−２）細胞の調製
実験に用いた細胞はサトウ（Sato）らの方法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）］に従い取得した。ウシ血管平滑筋細胞（BSMC）はウシ大動脈から、ブタ血管平滑筋細胞（PSMC）はブタ大動脈から、エクスプラント（explant）法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 50, 172（1971）］により単離、培養した。ウシ毛細血管内皮細胞（BCEC）は、ウシ副腎毛細血管から単離、培養した。ウシ頚動脈内皮細胞（BAEC）は、ウシ頚動脈から単離、培養した。
（１−３）ＴＧＦ-β結合度の測定
サトウ（Sato）らの方法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）］に従い以下の通りの操作を行った。
上述の通り単離、培養したBSMC、PSMCまたはBCECを4×104 cells/dishの割合で35mm dishに蒔き、翌日培地を0.1%ウシ血清アルブミン（BSA）を含むダルベッコズ・モディファイド・イーグル・メディウム（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM, Nissui Pharmaceutical Co.）に変更し、５時間インキュベートした。0.1g/lのMgCl2・6H2OとCaCl2を含むリン酸緩衝生理食塩水（以下、単にPBS（+）と記載し、MgCl2・6H2OとCaCl2を含まないリン酸緩衝生理食塩水を単にPBS（-）と記載することもある）2mlで細胞を洗浄した後、2mg/ml125Ｉ-ＬＬＴＧＦ-βおよび試験化合物を含む氷冷0.1% BSA含有DMEM 1mlに培地を変え、４℃で３時間インキュベートした。試験化合物はジメチルスルホキシド（DMSO）溶液として加え、系中の最終DMSO濃度が0.1%となるようにした。氷冷PBS（+）2mlで３回細胞を洗浄した後、0.5% Triton X-100 900μｌで細胞を溶解した（室温、0.5-1時間）。溶解液のうち800μｌを分取し、γ-カウンターで放射活性を測定した。
結果を図１、２並びに第３表〜第６表に示す。
第３表の結果は、ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの結合度を放射活性により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、「Ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ」のレーンは細胞の存在しないプレートに125Ｉ−ＬＬＴＧＦ-βのみを加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を３０μｇ／ｍｌになるように加えた場合の放射活性をそれぞれ表す。
第４表の結果は、ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの結合度を放射活性により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、「Ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ」のレーンは細胞の存在しないプレートに125Ｉ−ＬＬＴＧＦ-βのみを加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を１００μｇ／ｍｌになるように加えた場合の放射活性をそれぞれ表す。
第５表の結果は、ウシ頚動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの結合度を放射活性により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、「Ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ」のレーンは細胞の存在しないプレートに125Ｉ−ＬＬＴＧＦ-βのみを加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を１００μｇ／ｍｌになるように加えた場合の放射活性をそれぞれ表す。
第６表の結果は、ウシ頚動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの結合度を放射活性により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、「Ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ」のレーンは細胞の存在しないプレートに125Ｉ−ＬＬＴＧＦ-βのみを加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を１００μｇ／ｍｌになるように加えた場合の放射活性をそれぞれ表す。
以上、図１および２並びに第３表〜第６表に示すように、化合物１〜３、５〜９及び１３〜１６は100μg／mlの濃度で化合物１２は３０μg／mlの濃度で、細胞に対する結合度が増大し、潜在型ＴＧＰ-βからの活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進した。
また、本発明の方法で、潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進し細胞に対する結合度が増大させる化合物を選択することができる。
実施例２０ ウシ血管内皮細胞の遊走度測定による潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-β遊離活性
サトウ（Sato）らの方法〔ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）〕に従い以下の通りの操作を行った。
35mm dishにBCECをコンフルエントにした後、培地を0.1% BSA含有DMEMに変更し、５時間インキュベートした。剃刀で一部細胞を斯き取り、PBS（-）で洗浄した後、試験化合物を含む0.1% BSA含有DMEMでインキュベートし、24時間後に４視野の遊走細胞数を顕微鏡（IX70, Olympus）下、各dish毎にカウントした。試験化合物は試験例１と同様にして加えた。結果を図３〜５に示す。化合物３、５〜９は50μg/mlの濃度で、細胞の遊走を阻害し、潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進した。化合物４は100μg/mlの濃度で細胞の遊走を阻害した。化合物１０は10μg/mlの濃度でも細胞の遊走を阻害した。
本発明の方法で、潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進し細胞に対する結合度が増大させる化合物を選択することができる。
実施例２１ ルシフェラーゼアッセイによる活性型ＴＧＦ-β存在量の測定
活性型ＴＧＦ-β量は、アベ（Abe）らの方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）, 216, 276（1994）］に基づき、PAI-1プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を導入したミンク肺上皮細胞（MLEC）の発光をルシフェラーゼ・アッセイ・システム（Promega）で測定することにより行った。具体的には以下の操作を行った。
24 well plateにBCECをコンフルエントになるように細胞を蒔き、培地を0.1% BSA含有DMEMに変更してから６時間後、コームで細胞を網目状に斯き取りPBS（-）で洗浄した後、試験化合物を含む0.1% BSA含有DMEMで24時間インキュベートし、培養上清をサンプルとした。この培養上清を採取する６時間前に96well plateに上記MLECを2.8×104 cells/wellの割合で蒔いておき、６時間10%ウシ胎児血清（FCS）含有DMEMで培養後、サンプルとした上記培養上清に培地を置換し、16時間培養した。細胞をPBS（-）で２回洗浄した後ルシフェラーゼ・アッセイ・システムを用い活性化ＴＧＦ-β濃度を測定した。結果を図６に示す。化合物３および１０の添加により活性型ＴＧＦ-βが遊離した。特に化合物１０では10μg/mlでも顕著な効果が見られた。
本発明の方法で、潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進し細胞に対する結合度が増大させる化合物を選択することができる。
産業上の利用可能性
本発明により、潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜結合の増強によって、潜在型ＴＧＦ-βの活性化を促進する活性を有する新規ペプチドまたはその薬理的に許容される塩を提供することができる。
また、本発明の化合物の選択方法によれば潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有する化合物が選択される。
本発明の選択方法で得られる化合物または化合物（Ｉ）もしくはそれらの薬理的に許容される塩は、潜在型ＴＧＦ-βの細胞への結合を阻害する活性または促進する活性もしくは潜在型ＴＧＦ-βのＴＧＦ-βへの変換反応を阻害する活性または促進する活性を有するので、癌、糖尿病性網膜症、粥状動脈硬化、骨折、心筋梗塞、虚血再環流後の心筋障害、脳梗塞、網膜剥離、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、移植腎拒絶、HIV腎症、特発性肺線維症、自己免疫性肺線維症、肝硬変、（癌療法後に好発の）静脈狭窄性肝障害、全身性硬化症、ケロイド、好酸球増加−筋肉痛症候群、血行再建術後再狭窄、眼内線維症、リウマチ性関節炎、鼻たけ等の治療または予防剤として有用である。
（１）書誌的項目
出願人氏名又は名称
協和醗酵工業株式会社
発明の名称
潜在型ＴＧＦ-βの活性化を促進するペプチドおよびＴＧＦ-β活性調節化合物のスクリーニング方法
整理番号
１０６０
出願日
１９９８年５月１２日
優先権番号
平成９年特許出願第１２０６８３号
優先日
平成９年５月１２日
配列の数
３４
（２）配列に関する技術的項目
配列番号：１
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：２
配列の長さ：２４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：３
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：４
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：５
配列の長さ：１７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：６
配列の長さ１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：７
配列の長さ：１７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：８
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：９
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：１０
配列の長さ：２４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：disulfide-bonds
存在位置：１および２４
配列
配列番号：１１
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：disulfide-bonds
存在位置：４および２３
配列
配列番号：12
配列の長さ：19
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：disulfide-bond
存在位置：１および19
配列
配列番号：13
配列の長さ：19
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：disulfide-bond
存在位置：１および19
特徴を表す記号：modified site
存在位置：１
他の情報：XaaはNα-ビオチニル-L-システインを表す
配列
配列番号：14
配列の長さ：16
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：15
配列の長さ：21
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：16
配列の長さ：24
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：modified site
存在位置：１
他の情報：XaaはNα-ビオチニル-グリシンを表す
配列
配列番号：17
配列の長さ：391
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：18
配列の長さ：414
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：19
配列の長さ：412
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：20
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：21
配列の長さ：414
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：22
配列の長さ：410
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：23
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：24
配列の長さ：412
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：25
配列の長さ：315
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：26
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：27
配列の長さ：409
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：28
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：29
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：30
配列の長さ：412
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：31
配列の長さ：412
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：32
配列の長さ：373
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：33
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：34
配列の長さ：382
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
本発明は、細胞増殖の抑制、細胞分化の促進、免疫機能の抑制、線維芽細胞の走化性の亢進など多彩な生理活性を有している活性型トランスフォーミング・グロース・ファクター-β（以後、活性型ＴＧＦ-βまたは単にＴＧＦ-βと略記するときがある。）へ、通常の分泌型である潜在型ＴＧＦ-βから変換させることを促進し、癌、骨折、心筋梗塞、虚血再環流後の心筋障害、脳梗塞、網膜剥離などの、ＴＧＦ-βの作用欠乏が指摘されている疾患および外来性のＴＧＦ-β投与が有効と考えられている疾患の治療薬として有用な新規ペプチドに関する。
また、本発明は、潜在型トランスフォーミング・グロース・ファクター-β（以後、ＬＴＧＦ-βと略記するときがある。）の細胞への結合を調節する化合物または潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を調節する化合物の選択方法に関し、該方法により選択されるＴＧＦ-βの関与する疾病の治療または予防する化合物に関する。
背景技術
ヒトを含むほ乳類には、ＴＧＦ-β１、β２、β３等のＴＧＦ-βが存在しているが、いずれも不活性のＬＴＧＦ-βとして分泌されるため［Ａ・Ｂ・ロバート（Robert, A. B.）＆Ｍ・Ｂ・スポーン（Sporn, M. B.）、ペプチド・グロース・ファクターズ・アンド・ゼア・レセプターズ（Peptide Growth Factors and Their Receptors）、ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・ファーマコロジー、パート１（Handbook of Experimental Pharmacology, Part 1）、スプリンガー−ベアラッグ（SPRINGER-VERLAG）、ベルリン、419〜472頁、（1990）］、作用が発現するためには分泌後の活性化が必要である。ＬＴＧＦ-βには、ＴＧＦ-βにレイテンシー・アソシエイティド・ペプチド（latency associated peptide、以後、ＬＡＰと略するときがある。）が非共有結合した小分子量潜在型ＴＧＦ-β（以後ＳＬＴＧＦ-βと略す。）と、これにレイテント・ＴＧＦ-β結合蛋白質（latent ＴＧＦ-β binding protein、以後、ＬＴＢＰと略記するときがある。）がＬＡＰとの間でSS結合した大分子量潜在型ＴＧＦ-β（以後、ＬＬＴＧＦ-βと略記するときがある。）の２種類があるが、大部分はＬＬＴＧＦ-βの型で分泌される［エンボ・ジャーナル（EMBO Journal）, 10, 1091（1991）］。ＴＧＦ-βとＬＡＰはシグナルペプチドを有する同一の蛋白質分子（ＴＧＦ-βプレカーサー）として生合成され、そのアミノ酸配列が知られている［ネイチャー（Nature）, 316, 701（1985）］。
潜在型ＴＧＦ-βの活性化には、幾つかのプロテアーゼの関与が指摘されているが、最もよく解析されているのがプラスミンである。すなわち、プラスミンがＬＡＰを限定分解することで、非共有結合しているＴＧＦ-βが遊離する［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 110, 1361（1990）］。プラスミンによる活性化の細胞レベルでの解析から、プラスミンによる活性化は細胞膜表面で行われること［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 109, 309（1989）］、潜在型ＴＧＦ-βが細胞膜に結合することが活性化に必要であること［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 121, 439（1993）、同, 120, 995（1993）、同, 123, 1249（1993）］、潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合はＬＡＰを介していること［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）、トウホク・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Tohoku Journal of Experimental Medicine）, 179, 23（1996）］が明らかとなっている。しかし、潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合性の制御が、ＴＧＦ-βの活性制御にどのように係わっているかは明らかでない。
血管平滑筋細胞への潜在型ＴＧＦ-βの結合は知られているが、血管内皮細胞へは結合しないとされている［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）］。
ＴＧＦ-βは、細胞増殖の抑制、細胞分化の促進、免疫機能の抑制、線維芽細胞の走化性の亢進など多彩な生理活性を有している。ＴＧＦ-βはさまざまな病態と関連すると考えられており、ＴＧＦ-βの作用欠乏が関与するものとして糖尿病性網膜症［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 109, 309（1989）、アーチブズ・オブ・オフタルモロジー（Archieves of Ophthalmology）, 66, 366（1961）］、粥状動脈硬化の初期病変［ネイチャー・メディスン（Nature Medicine）, 1, 1067（1995）］があげられている。また、ＴＧＦ-β自身には、骨折、心筋梗塞、虚血再環流後の心筋障害、脳梗塞、網膜剥離などに対する治療効果が期待されている［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 119, 1017（1992）］。さらにＴＧＦ-βは種々の癌細胞の増殖を抑制することが知られており［エンドクリノロジー（Endocrinology）, 128, 1981（1991）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲーション（Journal of Clinical Investigation）, 87, 277（1991）、セル・グロース・アンド・ディファレンシエーション（Cell Growth & Differentiation）, 1, 549（1990）］、抗腫瘍剤としても期待される［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Science U.S.A.）, 92, 4254（1995）］。
生体内において、産生・分泌された潜在型ＴＧＦ-βのうち、活性化されて作用を発揮しているのは一部分である。このことから、生体内における潜在型ＴＧＦ-βの活性化効率を増すことによって、ＴＧＦ-βの作用増強が達成されるものと考えられる。従って、潜在型ＴＧＦ-βの活性化を促進する化合物は、ＴＧＦ-βの作用欠乏が指摘されている疾患あるいは外来性のＴＧＦ-β投与が有効と考えられている疾患、すなわち癌、糖尿病性網膜症、粥状動脈硬化、骨折、心筋梗塞、虚血再環流後の心筋障害、脳梗塞、網膜剥離などの治療薬として有効性が期待される。
また、逆にＴＧＦ-βの作用亢進により引き起こされる基本的に細胞外マトリックスの造成を伴う各種疾患が知られており、ＴＧＦ-βの活性化を抑制する物質は、例えば糸球体腎炎、糖尿病性腎症、移植腎拒絶、HIV腎症、特発性肺線維症、自己免疫性肺線維症、肝硬変、（癌療法後に好発の）静脈狭窄性肝障害、全身性硬化症、ケロイド、好酸球増加−筋肉痛症候群、血行再建術後再狭窄、眼内線維症、リウマチ性関節炎、鼻たけ等の各種線維症の治療薬として有効性が期待される［ボーダー（Border）W.A. & ノーベル（Nobel）N.A.,トランスフォーミング・グロース・ファクターβ・イン・ティシュー・フィブロシス（Transforming growth factor-β in tissue fibrosis），ニュー・イングリッシュ・ジャーナル・オブ・メジスン（New Engl.J.Med.）, 331, 1286，（1994）およびボーダー（Border）W.A. & ロウスラーティ（Rouslahti）E., トランスフォーミング・グロウス・ファクター-β・イン・ディジース（Transforming growth factor-β in disease）：ザ・ダーク・サイド・オブ・ティシュー・リペア（The dark side of tissue repair.），ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.Clin Invest.）, 90, 1, （1992）］。
発明の開示
本発明により、潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有するペプチドまたはその薬理的に許容される塩が提供される。その一態様としては、一般式（Ｉ）
Ｒ1-Ａ-Ｒ2 （Ｉ）
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ2はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、ＡはＴＧＦ-β前駆体配列の部分配列から選ばれ、該配列中、１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列を表し、配列内のＮ末端およびＣ末端アミノ酸残基を含む任意のアミノ酸残基から選ばれる２つのアミノ酸残基において、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、側鎖のアミノ基または側鎖のカルボキシル基においてＣＯ-ＮＨで表されるアミド結合、ＮＨ-ＣＯで表される逆アミド結合、または側鎖のチオール基でジスルフィド結合が形成されていてもよい。）で表わされ、かつ潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有するペプチドまたはその薬理的に許容される塩が提供される。
さらに一般式（Ｉ）において、ＡがヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列並びにヒトＴＧＦ-β１以外のＴＧＦ-β前駆体配列をヒトＴＧＦ-β１配列に整列化したときにヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列に相当する配列から選ばれるアミノ酸配列の部分配列から選ばれ、該配列中１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列であり、かつ潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有するペプチドまたはその薬理的に許容される塩が提供される。
さらに一般式（Ｉ）において、Ａが配列番号１〜１６のいずれかのアミノ酸配列から選ばれ、該配列中１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列であり、かつ潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有するペプチドまたはその薬理的に許容される塩が提供される。
また、本発明において潜在型ＴＧＦ-βを動物細胞に添加して該細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量を測定すること、潜在型ＴＧＦ-βと活性を評価すべき化合物を動物細胞に添加し該細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量を測定すること、該化合物による動物細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量の変化から該化合物の潜在型ＴＧＦ-βの細胞への結合阻害活性または促進活性を評価することからなるＴＧＦ−βが関与する疾病の治療または予防するための化合物を選択する方法が提供される。
さらに、動物細胞に一般式（Ｉ）で示されるペプチドまたはその薬理的に許容される塩を添加しＴＧＦ-β量を測定すること、評価すべき化合物および一般式（Ｉ）で示されるペプチドまたはその薬理的に許容される塩を動物細胞に添加しＴＧＦ-β量を測定すること、該化合物によるＴＧＦ-β量の変化から該化合物の潜在型ＴＧＦ-βのＴＧＦ-βへの変換反応の阻害活性または促進活性を評価することからなるＴＧＦ-βが関与する疾病の治療または予防するための化合物を選択する方法が提供される。
さらに、本発明によれば、前述の二つの方法のいずれかの方法により潜在型ＴＧＦ-βの細胞への結合を阻害する活性または促進する活性もしくは潜在型ＴＧＦ-βのＴＧＦ-βへの変換反応を阻害する活性または促進する活性を有する化合物が選択され、ＴＧＦ-βが関与する疾病の治療または予防するための化合物またはその薬理的に許容される塩提供される。
以下、一般式（Ｉ）で表わされるペプチドを化合物（Ｉ）と呼ぶ。
一般式（Ｉ）の各基の定義において、アルカノイルとしては、炭素数１〜２０の、例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、ラウロイル、イコサノイル等があげられる。
アロイルおよびアリールオキシカルボニルのアリール部分としては、フェニル、ナフチル等があげられる。
ヘテロアリールカルボニルおよびヘテロアリールオキシカルボニルのヘテロアリール部分は、フリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル等があげられる。
アルコキシカルボニルおよびアルコキシのアルキル部分としては、炭素数１〜２０の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、デシル、ドデシル、イコシル等があげられる。
置換アルカノイル、置換アルコキシカルボニル、および置換アルコキシにおける置換基としては、同一または異なって置換数１〜３の、例えばヒドロキシ、カルボキシル、また、炭素数３〜８の、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等の脂環式アルキル、さらに置換もしくは非置換のフェニル、フルオレニル等があげられる。置換フェニルの置換基としては、同一または異なって置換数１〜３のアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、スルホ、シアノ、ハロゲン等があげられ、ハロゲンとしてはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられる。置換フェニルの置換基としてのアルキル、アルコキシのアルキル部分は上記のアルコキシカルボニルおよびアルコキシのアルキル部分と同義である。
置換アロイル、置換アリールオキシカルボニル、置換ヘテロアリールカルボニル、および置換ヘテロアリールオキシカルボニルの置換基は、同一または異なって置換数１〜３であり、上記の置換フェニルの置換基と同義である。
置換アミノの置換基としては、同一または異なって置換数１〜２の置換もしくは非置換のアルキルまたは置換もしくは非置換のアリールがあげられる。アルキルは置換基も含めて前記アルコキシ等のアルキル部分と同義である。アリール基は置換基も含めて前記アロイルまたはアリールオキシカルボニルのアリール部分と同義である。
ＴＧＦ-β前駆体配列としては、いかなる動物起源のいかなる種類のＴＧＦ-β配列でもよく、例えばヒトＴＧＦ-β１（J05114）［ネイチャー（Nature）, 316, 701（1985）］（配列番号１７）、ヒトＴＧＦ-β２（Y00083）［エンボ ジャーナル（EMBO. J.）, 6, 3673（1987）］（配列番号１８）、ヒトＴＧＦ-β３（J03241）［プロシーディング オブ ナショナル アカデミー サイエンス ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci., USA）, 85, 4715（1988）］（配列番号１９）、マウスＴＧＦ-β１（M13177）［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 261, 4377（1986）］（配列番号２０）、マウスＴＧＦ-β２（X57413）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）, 3, 1108（1989）］（配列番号２１）、マウスＴＧＦ-β３（M32745）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）, 3, 1926（1989）］（配列番号２２）、ラットＴＧＦ-β１（X52498）［ヌクレイック アシド リサーチ（Nucleic Acids Res.）, 18, 3059（1990）］（配列番号２３）、ラットＴＧＦ-β３（U03491）［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 270, 2722（1995）］（配列番号２４）、ウシＴＧＦ-β１（M36271）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.), 1, 693（1987）］（配列番号２５）、ブタＴＧＦ-β１（Y00111）［ヌクレイック アシド リサーチ（Nucleic Acids Res.）, 15, 3187（1987）］（配列番号２６）、ブタＴＧＦ-β３（X14150）［エンボ ジャーナル（EMBO J.）, 7, 3737（1988）］（配列番号２７）、イヌＴＧＦ-β１（L34956）［ジーン（Gene）, 155, 307（1995）］（配列番号２８）、ヒツジＴＧＦ-β１（X76916）［ジーン（Gene）, 150, 371（1994）］（配列番号２９）、ニワトリＴＧＦ-β２（X58071）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）, 7, 175（1991）］（配列番号３０）、ニワトリＴＧＦ-β３（M31154）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）, 2, 747（1988）］（配列番号３１）、ニワトリＴＧＦ-β４（M31160）［モレキュラー エンドクリノロジー（Mol. Endocrinol.）, 6, 989（1992）］（配列番号３２）、サル（アフリカミドリザル）ＴＧＦ-β（M16658）［ディエヌエー（DNA）, 6, 239（1991）］（配列番号３３）、カエル（Xenopus laevis）ＴＧＦ-β５（J05180）［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）, 265, 1089（1990）］（配列番号３４）等があげられる。なおＴＧＦ-β前駆体配列名の次の括弧内に書いた数字はジンバンク（Genbank）の受け入れ番号（Accession Number）を示す。
Ａは、ＴＧＦ-β前駆体配列の部分配列から選ばれ、該配列中、１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列であれば特に制限はない。Ａは、ヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列並びにヒトＴＧＦ-β１以外のＴＧＦ-β前駆体配列をヒトＴＧＦ-β１配列に整列化したときにヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列から選ばれる配列の部分配列または該アミノ酸配列中、１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列であることが好ましい。
特にＡが、ヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列並びにヒトＴＧＦ-β１以外のＴＧＦ-β前駆体配列をヒトＴＧＦ-β１配列に整列化したときにヒトＴＧＦ-β１前駆体配列の３０〜６０番目のアミノ酸配列、１４２〜１８６番目のアミノ酸配列および２６９〜２９７番目のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列から選ばれる配列の部分配列であることが好ましい。
先に例示した各種動物起源の各種ＴＧＦ−β前駆体をヒトＴＧＦ−β１前駆体配列に整列化したものを第１表の１〜第１表の８に示す。配列の前後に示す数値はアミノ酸の位置番号示し、アミノ酸配列中の“−”は空位のアミノ酸位置を示す。
また、化合物（Ｉ）のうち、具体的に好ましい化合物としてはＡが配列番号１〜１６から選ばれ、該配列中１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいアミノ酸配列であるペプチドまたはその薬理的に許容される塩があげられる。特にＡが配列番号１〜１６から選ばれるアミノ酸配列が好ましい。
配列中１〜５残基のアミノ酸が欠失、置換、付加されていてもよいとは、一配列中の任意かつ単一もしくは複数個の位置における単一または複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加が全体で１〜５残基であることを意味し、欠失、置換、または付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型を問わない。
付加としては、例えば配列の両末端にシステイン、ホモシステインなど、チオール基を有するアミノ酸あるいは有機残基の付加をあげることができる。置換としては例えば配列内に存在するシステイン残基のセリンまたはアラニン残基への置換およびセリンまたはアラニン残基のシステイン残基への置換をあげることができる。また配列中に含まれる２つのチオール基間でジスルフィド結合を形成し環状化することもできる。さらにＮ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、側鎖のアミノ基または側鎖のカルボキシル基においてＣＯ-ＮＨで表されるアミド結合、ＮＨ-ＣＯで表される逆アミド結合を形成し環状化することもできる。
天然型アミノ酸としては、グリシン、L-アラニン、L-スレオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-バリン、L-ロイシン、L-セリン、L-メチオニン、L-イソロイシン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-プロリン、L-システイン、L-トリプトファンがあげられる。
潜在型ＴＧＦ-βとは、ＴＧＦ-βとその活性を抑制するＬＡＰからなる小分子量潜在型ＴＧＦ-β（ＳＬＴＧＦ-β）またはＴＧＦ-βとその活性を抑制するＬＡＰとＬＴＢＰからなる大分子量潜在型ＴＧＦ-β（ＬＬＴＧＦ-β）を示す。
本発明の選択方法で選択される化合物または化合物（Ｉ）の薬理的に許容される塩としては、酸付加塩、金属塩、有機塩基付加塩等があげられる。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩があげられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩およびアルミニウム塩、亜鉛塩等があげられる。有機塩基付加塩としては、メチルアミン、エチルアミン、アニリン等の一級アミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン等の二級アミンおよびトリメチルアミン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピリジン等の三級アミン等とで形成される塩並びにアンモニウム塩等があげられる。
以下に、本明細書中で用いられるアミノ酸およびその保護基に関する略号を説明する。
アミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するIUPAC-IUB委員会（IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature）の勧告［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）, 138, 9（1984）］に従った。
本明細書で使用する以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸および保護基を表す。
GlyまたはG; グリシン
AlaまたはA; L-アラニン
ThrまたはT; L-スレオニン
AspまたはD; L-アスパラギン酸
AsnまたはN; L-アスパラギン
Asx; L-アスパラギン酸またはL-アスパラギン
GluまたはE; L-グルタミン酸
GlnまたはQ; L-グルタミン
Glx; L-グルタミン酸またはL-グルタミン
ValまたはV; L-バリン
LeuまたはL; L-ロイシン
SerまたはS; L-セリン
MetまたはM; L-メチオニン
IleまたはI; L-イソロイシン
PheまたはF; L-フェニルアラニン
TyrまたはY; L-チロシン
LysまたはK; L-リジン
ArgまたはR; L-アルギニン
HisまたはH; L-ヒスチジン
ProまたはP; L-プロリン
CysまたはC; L-システイン
TrpまたはW; L-トリプトファン
Fmoc; 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
t-Bu; t-ブチル
Trt; トリチル
Pmc; 2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル
Boc; t-ブチルオキシカルボニル
以下の略号は、対応する下記の側鎖保護アミノ酸を表す。
Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-L-アスパラギン酸 β-t-ブチルエステル
Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-L-グルタミン酸 γ-t-ブチルエステル
Fmoc-Thr（t-Bu）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-スレオニン
Fmoc-Ser（t-Bu）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-セリン
Fmoc-Tyr（t-Bu）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-チロシン
Fmoc-Lys（Boc）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nε-t-ブチルオキシカルボニル-L-リジン
Fmoc-Asn（Trt）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nγ-トリチル-L-アスパラギン
Fmoc-Gln（Trt）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nδ-トリチル-L-グルタミン
Fmoc-Arg（Pmc）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Ng-2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル-L-アルギニン
Fmoc-His（Trt）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nim-トリチル-L-グルタミン
Fmoc-Cys（Trt）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-S-トリチル-L-システイン
Fmoc-TrP（Boc）-OH; Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nind-t-ブチルオキシカルボニル-L-トリプトファン
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
PyBOP; ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリスピロリジノフォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート
HOBt; N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DCC; ジシクロヘキシルカルボジイミド
NMM; N-メチルモルホリン
DMF; N,N-ジメチルホルムアミド
NMP; N-メチルピロリドン
TFA; トリフルオロ酢酸
DTT; ジチオスレイトール
HBTU; 2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1, 1, 3, 3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート
DIPC; N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA; N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DCM; ジクロロメタン
次に、化合物（Ｉ）の製造法について説明する。
化合物（Ｉ）は、一般的な液相あるいは固相ペプチド合成法〔ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫ら、丸善（1985年）〕またはそれらを適宜組み合わせることで合成することができる。また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アプライドバイオシステム社〔Applied Biosystems Inc., U.S.A（ABI社）〕製ペプチド合成機、アドバンスドケムテック社〔Advanced ChemTech Inc., U.S.A（ACT社）〕製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖保護したNα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸またはNα-t-ブチルオキシカルボニルアミノ酸を用い、それぞれの合成プログラムに従い、実施することができる。
化合物（Ｉ）の原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ABI社、島津製作所、国産化学（株）、ノバ・バイオケム社（Nova Biochem）、渡辺化学（株）、ACT社またはペプチド研究所（株）から入手することができる。
環状化反応は液相法、固相法、またはそれらの組み合わせにより必要なアミノ酸残基と有機基を全て組み込み終わってから行う場合とペプチド鎖伸長の途中に行う場合がある。後者においては環状構造の完成後にさらにアミノ酸残基または有機基を伸長して化合物（Ｉ）を完成する。また、一般式（Ｉ）中の環状構造を形成するジスルフィド結合、アミド結合、または逆アミド結合を製造の最終段階で完成する場合だけでなく、まずこれらの結合が形成された後、環状構造の一部をなすアミノ酸残基とその隣に相当するアミノ酸残基の間で通常の配列におけるアミド結合が形成されることによって環状構造が完成してもよい。以下、詳しく環状化の工程を説明する。
１．ジスルフィド結合による環状化工程
適当な保護基により保護されたチオール基を有するアミノ酸残基を配列中の２個所に有するペプチドを、固相法、液相法、またはそれらの組み合わせによって得た後に、チオール保護基以外の保護基をまず除去し、続いて該チオール保護基を除去することによって得られる前駆体ペプチドを酸化反応に付し、有機化学反応工程における一般的精製方法を経て目的のジスルフィド結合を含む環状ペプチドを製造することができる。
１−１ 液相法におけるジスルフィド結合による環状化工程
該前駆体ペプチドを反応に不活性な溶媒中空気酸化に付すか、酸化剤と反応させることによりジスルフィド結合をもつ環状ペプチドを製造することができる。反応は0.5〜5000μmol/l、好ましくは50〜500μmol/lのペプチド濃度で行う。溶媒はpH4〜9、好ましくはpH6〜8に調整した50mM〜1Mのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸（Tris-HCl）等の緩衝液、5〜50%酸−水溶液、水、またDMF、DMSO、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール等の有機溶媒を単独もしくは混合して用いる。酸化剤としては該前駆体ペプチドに対する重量比0.1〜1倍量のフェリシアン化カリウム、同重量比0.5〜5倍量、好ましくは等重量のよう素、溶媒量として10〜50%のDMSO等が用いられる。反応は通常0〜40℃で、１時間〜１週間で終了する。本酸化反応に際しグルタチオンを加えると収率の向上が図られることがあり、該前駆体ペプチドに対し重量比0.5〜5倍量の酸化型グルタチオンとその1/2量の還元型グルタチオンを共存させて反応させてもよい［ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Journal of American Chemical Society）, 103, 5867（1981）；続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、239頁、矢島治明監修、廣川書店（1991）］。酸化剤としてよう素を用いる場合は反応終了後、亜鉛粉末を溶液からよう素の色が消えるまで加え、そのままで、あるいは減圧下に濃縮後、各種クロマトグラフィーによって精製する。酸化剤としてフェリシアン化カリウムを用いる場合は酢酸を加えて溶液を微酸性とした後、そのままで、あるいは減圧下に濃縮後、各種クロマトグラフィーによって精製してもよく、またDowex 1X2（AcO-）（ダウ・ケミカル社）等の陰イオン交換樹脂を加えて過剰のフェリシアン化カリウム（フェリシアンイオン、フェロシアンイオン）を吸着除去した後にそのままで、あるいは減圧下に濃縮後、各種クロマトグラフィーによって精製してもよい。
また、所望の一個所のチオール基をピリジルスルフェニル化または2-ニトロピリジルスルフェニル化しておき、もう一方のチオール基を選択的に除去させると同時に一気に環化反応を進行させることもできる［インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（International Journal of Peptide and Protein Research）, 29, 162（1987）参照］。環化反応に用いられる溶媒、反応温度、および反応時間等は概ね上記と同様である。さらに二個所のチオール基をフリー化した後、ピリジルスルフェニル化試薬または2-ニトロピリジルスルフェニル化試薬を１当量分導入してもよい。ピリジルスルフェニル化反応には例えば2,2’-ジチオジピリジンを用い、1〜3当量をペプチドを含む溶媒に加えて攪拌すればよい。2-ニトロピリジルスルフェニル化もこれに準じて行うことができる。反応に用いられる溶媒、反応温度、および反応時間等は概ね上記と同様である［ペプチド・ケミストリー（Peptide Chemistry）, 1991, 125（1992）］。
１−２ 固相法におけるジスルフィド結合による環状化工程
適当な保護基により保護されたチオール基を有するアミノ酸残基を配列中の２個所に有するペプチドを、固相法によって伸長し、樹脂よりペプチドを切り出す前に、チオール保護基を選択的に除去し、酸化反応に付すことによって目的の環状ペプチド部分を製造することができる。その後樹脂よりペプチドを切り出しさらに残る保護基を除去すれば、目的の環状ペプチドが得られる。
チオール保護基には例えばアセトアミドメチル（Acm）基またはトリチル基（Trt）を用いることができる。樹脂上の保護ペプチドを例えばDMF、DCMなどの適当な溶媒中、よう素を反応させるとAcm基やTrt基が除去されると同時に分子内ジスルフィド結合が形成される。樹脂50mgに対し、0.5〜2mlの溶媒を用い、樹脂上の該ペプチドの計算重量に対する重量比0.5〜5倍量、好ましくは等重量のよう素と反応させる。反応は通常0〜40℃で行い、１時間〜１週間で終了する。反応終了後は、固相法の通常の処理、即ち、少量のDMF、DCM等の溶媒で樹脂を洗浄し、次の反応に用いることができる。
また、上記１−１で述べた一個所のチオール基をピリジルスルフェニル化または2-ニトロピリジルスルフェニル化する方法を固相法で行うこともでき、反応の条件は概ね環化反応に用いられる溶媒、反応温度、および反応時間等は概ね上記と同様である。さらに液相法と同様に二個所のチオール基をフリー化した後、ピリジルスルフェニル化試薬または2-ニトロピリジルスルフェニル化試薬を１当量分導入してもよい。反応には例えば2,2’-ジチオジピリジンを用い、1〜3当量を樹脂を膨潤させた溶媒に加えて攪拌すればよい。2-ニトロピリジルスルフェニル化も同様である。反応に用いられる溶媒、反応温度、および反応時間等は概ね上記固相反応における環化反応と同様である
２．アミド結合および逆アミド結合による環状化工程
適当な保護基により保護されたアミノ基を有するアミノ酸残基および適当な保護基により保護されたカルボキシル基を有するアミノ酸残基を配列中の２個所に有する、側鎖、N末端、およびC末端の保護されたペプチドを、固相法、液相法、またはそれらの組み合わせによって製造する。その後、該アミノ基および該カルボキシル基の保護基を選択的に除去することによって得られるペプチドを分子内縮合反応に付し、有機化学反応工程における一般的精製方法を経て、側鎖、N末端、およびC末端の保護された環状ペプチドを得、さらに残る保護基の脱保護反応を行うことにより目的のペプチドを製造することができる。また、環状ペプチド部分構造を得た後にペプチド鎖を伸長して目的のペプチドへと導いてもよい。
２−１ 液相法におけるアミド結合および逆アミド結合による環状化工程
適当な保護基により保護されたアミノ基を有するアミノ酸残基および適当な保護基により保護されたカルボキシル基を有するアミノ酸残基を配列中の２個所に有するペプチドを固相法によって得、樹脂よりペプチドを切り出す前に、該アミノ基および該カルボキシル基の保護基を選択的に除去することによって得られるフリーのアミノ基およびカルボキシル基を縮合反応に付し目的の環状ペプチド部分を形成することができる。その後、樹脂よりペプチドを切り出すと同時に他のアミノ酸残基の側鎖保護基を除去すれば、目的の環状ペプチドが製造される。
アミノ基の保護基として4-メチルトリチル基を用いる場合、該脱保護反応は酢酸／トリフルオロエタノール／DCM（1/2/7）を用いて行うことができる。反応は通常0〜40℃で行い、0.5〜6時間で終了する。反応終了後、ジエチルエーテル等を加えてペプチドを沈殿させ、溶媒を除くか、減圧下に溶媒を除く。必要に応じこうした操作を含む有機化学反応工程における一般的精製方法を用いることができる。
アミノ基の保護基としてアリルオキシカルボニル基を用い、カルボキシル基の保護基としてアリルエステル基を用いる場合、パラジウム触媒の存在下、還元剤を反応させれば一挙に所望の脱保護反応を進行させることができる。カルボキシル基のみの保護基にアリルエステル基を用いてもよい。パラジウム触媒は０価の均一系触媒であればいずれでもよく、テトラキス（トリフェニルフォスフィン）パラジウム（０）、または酢酸パラジウム（II）−トリフェニルフォスフィン等が例示される。添加量は上記保護基に対して0.01〜1当量、好ましくは0.1〜0.5当量を用いる。さらに添加剤として上記保護基に対して１当量から過剰量のぎ酸、ぎ酸−トリエチルアンモニウム、水素化トリブチルスズ、水素化トリフェニルスズ、トリメチルヒドロシラン、水素化ホウ素ナトリウム、酢酸、酢酸−NMM等を加える。溶媒としては、エーテル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、DMF、クロロホルム等を単独もしくは混合して用いることができる。アリルオキシカルボニル基またはアリルエステル基1mMに対し上記の試薬と溶媒3〜10mlを加え、反応は-20〜80℃、好ましくは0〜30℃で行い、10分〜６時間で終了する。反応終了後、有機化学反応工程における一般的精製方法を用いることができる。
得られたペプチドのフリーのアミノ基とカルボキシル基の間で分子間アミド結合を次に形成する。用いることができる環状アミド化反応には種々のものがあるが、代表的なものを以下にあげる。各反応に共通な条件として、反応溶媒はDMF、NMP、塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等を単独もしくは混合して用いる。ペプチドの濃度は0.5〜5000μmol/l、好ましくは50〜500μmol/lで行う。反応は通常0〜40℃、好ましくは4〜25℃で攪拌し、通常３時間から１週間間で終了する。反応終了後、有機化学反応工程における一般的精製方法を用いることができる。
カルボキシル基に対して1〜10当量のジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）または水溶性カルボジイミド（WSC）等のカルボジイミドを用いることができる。さらにカルボジイミドの1.5〜2当量のNMM、DIEA、または炭酸水素ナトリウムを加える。必要に応じカルボジイミドに対し添加剤として等モル量のHOBtまたはHONSuを加えてもよい。
カルボキシル基に対して1〜10当量のジフェニルホスホリルアジド（DPPA）またはジエチルホスホロシアニデート（DEPC）を用いることもできる。さらにカルボジイミドの1.5〜2当量のNMM、DIEA、または炭酸水素ナトリウムを加える。
カルボキシル基に対して1〜10当量、好ましくは2〜5当量のPyBOPと等モルのHOBtまたはHBTUと等モルのHOBtを用いることもできる。さらにPyBOPまたはHBTUの1.5〜2当量のNMM、DIEA、または炭酸水素ナトリウムを加える。
また、一旦カルボキシル基を活性化エステルへと導いた後、所望のアミノ基の保護基を選択的に脱離し、続いてアミド結合を形成してもよい。活性化エステルとしてはp-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、N-オキシコハク酸イミドエステル等があげられる。活性化エステルの導入の方法は種々あるが、例えばDCCをカルボキシル基に対して1〜10当量用い、等モルのp-ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、またはHONSuを加えて0〜5℃で１時間〜１日攪拌後、生成するジシクロヘキシルウレア（DCUrea）を濾去後、有機化学反応工程における一般的精製方法を用いて精製することができる。本活性エステル形成反応に用いられる溶媒、反応温度、反応時間等は上記のアミド形成反応と同様である。
２−２ 固相法におけるアミド結合および逆アミド結合による環状化工程
適当な保護基により保護されたアミノ基を有するアミノ酸残基もしくは有機基および適当な保護基により保護されたカルボキシル基を有するアミノ酸残基もしくは有機基を配列中の２個所に有するペプチドを固相法によって得、樹脂よりペプチドを切り出す前に、該アミノ基および該カルボキシル基の保護基を選択的に除去することによって得られるフリーのアミノ基およびカルボキシル基を縮合反応に付し目的の環状ペプチド部分を形成することができる。その後、樹脂よりペプチドを切り出すと同時に他のアミノ酸残基の側鎖保護基を除去すれば、目的の環状ペプチドが製造される。
アミノ基の保護基として4-メチルトリチル基を用いる場合、該脱保護反応には樹脂50mgに対し、酢酸／トリフルオロエタノール／DCM（1/2/7）を0.5〜2mlの割合で用いることができる。反応は通常0〜40℃で行い、0.5〜6時間で終了する。反応終了後は、固相法の通常の処理、即ち、少量のDMF等の溶媒で樹脂を洗浄し、次の反応に用いることができる。
アミノ基の保護基としてアリルオキシカルボニル基を用い、カルボキシル基の保護基としてアリルエステル基を用いる場合、脱保護反応には通常0.1〜0.2Mのテトラキス（トリフェニルフォスフィン）パラジウム（0）、5% 酢酸、2.5%NMMを含むクロロホルム等の溶液を用いることができる。アリルオキシカルボニル基およびアリルエステル基1mMに対し上記クロロホルム溶液を3〜10ml加え、反応は通常0〜40℃で行い0.5〜6時間で終了する。反応終了後は、固相法の通常の処理、即ち、少量のDMF等の溶媒で樹脂を洗浄し、次の反応に用いることができる。
次に樹脂上の計算上のカルボキシル基量に対して1〜10当量、好ましくは2〜5当量のPyBOPまたはHBTU、PyBOPまたはHBTUと等モルのHOBt、およびPyBOPまたはHBTUの1.5〜2当量のNMMまたはDIEAを含むDMF、DCM、またはNMPなどの有機溶媒の溶液を樹脂50mgに対し1mlの割合で用いる。反応は通常0〜40℃、好ましくは4〜25℃で攪拌し、通常３時間から１週間で終了する。反応終了後は、固相法の通常の処理、即ち、少量のDMF等の溶媒で樹脂を洗浄し、次の反応に用いることができる。
このようにして得られた化合物（Ｉ）は、C-4、C-8、またはC-18タイプ等の逆相シリカゲルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、HPLCという）、分配樹脂、吸着樹脂、イオン交換樹脂、シリカゲル、化学修飾シリカゲル、逆相シリカゲル、アルミナ、珪藻土、または珪酸マグネシウム等を用いたゲル濾過等のカラムクロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィー等により精製することができる。
化合物（Ｉ）の薬理的に許容される塩を取得するときは常法に従う。すなわち、化合物（Ｉ）の酸付加塩または有機塩基付加塩は、対応する酸あるいは有機塩基の水溶液に化合物（Ｉ）を溶解し、凍結乾燥することによって得られる。また、化合物（Ｉ）の金属塩は、対応する金属イオンを含む水溶液に化合物（Ｉ）を溶解し、ゲル濾過またはHPLCで精製することによって得られる。
次に、化合物（Ｉ）の具体例を第２表に示す。
本発明で選択の対象となる化合物は、合成化合物でも天然物質でも特に制限なく用いることができる。例えば天然もしくは合成のペプチドまたは天然蛋白質を酵素等で加水分解して得たペプチド等を評価することができる。
潜在型ＴＧＦ-βは、各種動物細胞から、例えば岡田らの方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）, 106, 304（1989）］等で抽出・精製したもの、遺伝子組換法を用いて製造したもの［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）, 271, 29891（1996）］等を用いることができる。本発明で使用する動物細胞としては、潜在型ＴＧＦ-βが結合できる細胞があげられる。該細胞としては、例えば血小板、血管平滑筋細胞、毛細血管内皮細胞、頚動脈内皮細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、マクロファージ等の細胞があげられる。細胞は、ヒト、ウシ、ブタ、ネズミ等の動物から、単離・精製したものあるいは、それら細胞由来の培養細胞が用いうる。単離・精製方法としては、例えば、オカダ（Okada）らの方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）, 106, 304（1989）］等があげられる。細胞への潜在型ＴＧＦ-βの結合は、例えば細胞を培地で培養し潜在型ＴＧＦ-βを添加しインキュベートした後、細胞を洗浄し、細胞に結合している潜在型ＴＧＦ-βを測定することにより行うことができる。
潜在型ＴＧＦ-βは、例えばクロラミンＴ法［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular & Cellular Biology）, 2, 599（1982）］により125Ｉ標識したものを用いるのが好ましい。これにより、細胞に結合した潜在型ＴＧＦ-βは、放射活性を測定することにより求めることができる。
また、潜在型ＴＧＦ-βが細胞に結合し活性化されるので、細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量の測定は、活性型ＴＧＦ-β量を測定することにより行うこともできる。活性型ＴＧＦ-βの定量は、いかなる方法で測定しても良い。直接抗ＴＧＦ-β抗体を用いた酵素免疫測定方法［メソッヅ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）, 198, 303（1991）］または安部らのルシフェラーゼ・アッセイ・システム［アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）, 216, 276（1994）］等で測定することができる。また、血管内皮細胞の遊走度［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）］、血管平滑筋細胞の増殖［トウホク・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Tohoku Journal of Experimental Medicine）, 179, 23（1996）］、各種癌細胞の増殖阻害［ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal of Clinical Investigation）, 87, 277（1991），エンドクリノロジー（Endocrinology）, 128, 1981（1991）］、ミンク肺上皮細胞の増殖阻害［メソッヅ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）, 198, 317（1991）］等の方法で測定できる。
活性を評価すべき化合物を添加しないときの、細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量または活性型ＴＧＦ-β量と活性を評価すべき化合物を添加したときの細胞に結合する潜在型ＴＧＦ-β量または活性型ＴＧＦ-β量を比較し、その差異から該化合物が、ＴＧＦ-βが関与する疾病の治療または予防するための化合物として有望か否かが判断される。目的化合物の選択は、例えば、添加濃度1mMで評価すべき化合物を添加しない場合の活性型ＴＧＦ-β量に対し、添加した場合の活性型ＴＧＦ-β量が１０％以上増加または減少の認められる化合物を選択することが好ましい。
また、動物細胞に化合物（Ｉ）で示されるペプチドまたはその薬理的に許容される塩を添加しＴＧＦ-β量を測定すること、評価すべき化合物および化合物（Ｉ）で示されるペプチドまたはその薬理的に許容される塩を動物細胞に添加しＴＧＦ-β量を測定すること、該化合物によるＴＧＦ-β量の変化から該化合物の潜在型ＴＧＦ-βのＴＧＦ-βへの変換反応の阻害活性または促進活性を評価することからなるＴＧＦ-βが関与する疾病の治療または予防するための化合物を選択する方法について述べる。
本発明で選択の対象となる化合物は、合成化合物でも天然物質でも特に制限なく用いることができる。例えば天然もしくは合成のペプチドまたは天然蛋白質を酵素等で加水分解して得たペプチド等を評価することができる。
本発明の方法に使用する細胞は、細胞自身が潜在型ＴＧＦ-βを分泌する細胞である。この細胞系では、試験系に潜在型ＴＧＦ-βを添加することなく目的化合物を選択することができるので好ましい。潜在型ＴＧＦ-βを分泌する細胞としては例えば、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、マクロファージ等およびこれらに由来する培養細胞があげられる。
活性型ＴＧＦ-βの定量は、いかなる方法で測定しても良く、例えば前述の定量方法が用いうる。
本発明で選択される化合物は、上述で規定するペプチドだけでなく潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有する化合物すべてを含有する。
本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくは薬理的に許容される塩は、癌、糖尿病性網膜症、粥状動脈硬化、骨折、心筋梗塞、虚血再環流後の心筋障害、脳梗塞、網膜剥離、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、移植腎拒絶、HIV腎症、特発性肺線維症、自己免疫性肺線維症、肝硬変、（癌療法後に好発の）静脈狭窄性肝障害、全身性硬化症、ケロイド、好酸球増加−筋肉痛症候群、血行再建術後再狭窄、眼内線維症、リウマチ性関節炎、鼻たけ等の治療または予防剤として用いることができ、特に各種抗線維症剤、抗腫瘍剤または抗動脈硬化剤として好ましく用いられる。本化合物はそのままでまたは各種の投与形態で用いることができる。例えば、本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩を生理食塩水、グルコース、ラクトース、マンニトール等の水溶液に溶解して注射液として適当な医薬組成物とすることができる。また、例えば本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩を凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることにより粉末注射剤を作成することができる。本医薬組成物は必要に応じ、製剤分野で周知の添加剤、例えば製剤上許容される塩を含有することができる。
また、本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩と適当な賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等を混合成形して、錠剤、粒剤、粉剤、シロップ剤等とすることにより経口剤として用いることができる。さらには、本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩と常用される担体とを混合形成して座剤とし、直腸投与することも可能である。
投与量は投与方法、本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩の種類、患者の年齢、症状等によって異なり、また投与方法も症状や投与量によって変えることができる。例えば、本発明の選択方法により得られる化合物および化合物（Ｉ）もしくはその薬理的に許容される塩は１日あたり0.00001〜100mg/kg、好ましくは0.01〜10mg/kgを投与することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ブタ血管平滑筋細胞（ＰＳＭＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの結合度を放射活性により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」レーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合の放射活性、その他のレーンは各試験化合物を１００μｇ／ｍｌの濃度になるように加えた場合の放射活性をそれぞれ表す。
図２は、ウシ血管平滑筋細胞（ＢＳＭＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの結合度を放射活性により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、「ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ」のレーンは細胞の存在しないプレートに125Ｉ−ＬＬＴＧＦ-βのみを加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を１００μｇ／ｍｌになるように加えた場合の放射活性をそれぞれ表す。
図３は、ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの遊走阻害活性を、顕微鏡下の視野中に遊走してきた細胞数により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を５０μｇ／ｍｌになるように加えた場合の視野中の細胞数をそれぞれ表す。
図４は、ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの遊走阻害活性を、顕微鏡下の視野中に遊走してきた細胞数により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を１００μｇ／ｍｌになるように加えた場合の視野中の細胞数をそれぞれ表す。
図５は、ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）に対する活性型ＴＧＦ-βの遊走阻害活性を、顕微鏡下の視野中に遊走してきた細胞数により測定した結果である。「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を併せて示した濃度になるように加えた場合の視野中の細胞数をそれぞれ表す。
図６は、ルシフェラーゼ・アッセイ・システムにより活性化ＴＧＦ-β量を測定したときの実際の発光強度の測定結果である。「ＳＴＤ」のレーンは定常状態、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」のレーンは試験化合物を含まない溶液を加えた場合、その他のレーンは各レーンに示す試験化合物を併せて示した濃度になるように加えた場合の発光強度をそれぞれ表す。
図７は、図６で示した発光強度から換算して活性化ＴＧＦ-β量を求めた結果である。各レーンの意味は図６に同じである。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例において、化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。質量分析は、日本電子JMS-SX102Aを用いFAB法により行った。アミノ酸分析は、ビドリングメイヤー（Bidlingmeyer B. A.）らの方法［ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography), 336, 93（1984）］により行った。加水分解は塩酸蒸気中110℃で22時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はPico Tagアミノ酸分析計（Waters社製）を用い分析した。
実施例１ 化合物１ （配列番号１）（H-Leu-Gln-Ser-Ser-Arg-His-Arg-Arg-Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Phe-Ser-Ser-Thr-Glu-Lys-Asn-Cys-OH）の合成Fmoc-Cys（Trt）、62.5μmmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、123mgをABI社自動合成機model 430Aの反応器に入れ、ABI社のFmoc法による合成プログラムに従い次の操作を行った。
（ａ）20% ピペリジン-NMP溶液を加えて混合物を20分間攪拌し、該溶液を排出した。
（ｂ）担体樹脂をNMPで５分間洗浄し、該溶液を排出した。
こうして、Fmoc基を除去したCys（Trt）の結合した担体樹脂を得た。
（ｃ）Fmoc-Asn（Trt）-OH 250μmol（樹脂上のアミノ酸に対し４当量）をNMP中あらかじめDCCおよびHOBtと50分間攪拌した溶液を樹脂に加えて混合物を60分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｄ）担体樹脂をNMPで３分間洗浄した。こうして、Fmoc-Asn（Trt）-Cys（Trt）が担体上に合成された。
次に、（ａ）、（ｂ）の脱保護、洗浄工程を行った後、（ｃ）の工程でFmoc-Lys（Boc）-OHを用いて縮合反応を行い、次いで（ｄ）の洗浄工程を経て、Fmoc-Lys（Boc）-Asn（Trt）-Cys（Trt）が担体上に合成された。以下、工程（ｃ）において、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc−Tyr（t-Bu）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-His（Trt）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返し、保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。さらに、（ａ）〜（ｂ）の脱保護、洗浄工程を行った後、担体樹脂をメタノール、ブチルエーテルで順次洗浄後、減圧下12時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂310.3mgを得た。これに、TFA（82.5%）、チオアニソール（5%）、水（5%）、エチルメチルスルフィド（3%）、1,2-エタンジチオール（2.5%）およびチオフェノール（2%）からなる混合溶液10mlを加えて室温で８時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液を2ml程度まで減圧下濃縮した後にエーテル約10mlを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして145mgを取得した。この粗生成物のうち70mgを2M酢酸に溶解後、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 25mm）を用いたHPLCで精製した。0.1%TFA水溶液に、TFA0.1%を含む90%アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nmで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物１を25.5mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2701.1（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 3.1（3）, Glx 2.1（2）, Ser 5.0（5）, His 1.0（1）, Arg 2.9（3）, Thr 2.0（2）, Ala 1.0（1）, Tyr 1.0（1）, Leu 1.9（2）, Phe 1.0（1）, Lys 1.1（1）, Cys 1.1（1）
実施例２ 化合物２ （配列番号２）（H-Pro-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Cys-OH）の合成
Fmoc-Cys（Trt）、100μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、181.8mgを出発物質とし、実施例１と同様にして、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、をFmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂、568.4mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、320mgを取得し、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm)を用いたHPLCで精製し、化合物２を26.4mg得た。
質量分析［FABMS］：m/z=2870.4（M+H+）
アミノ酸分析：Glx 3.0（3）, Ser 1.1（1）, His 1.0（1）, Arg 3.8（4）, Ala 1.1（1）, Pro 0.9（1）, Val 2.6（3）, Leu 7.3（7）, Lys 2.1（2）, Cys 1.2（1）
実施例３ 化合物３ （配列番号３）（H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys-OH）の合成
Fmoc-Cys（Trt）、33μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、60mgを島津製作所製自動合成機PSSM-8の反応器に入れ、合成プログラムに従い次の操作を行った。（ａ）担体樹脂を500μｌのDMFにより３分間洗浄し、該溶液を排出した。 （ｂ）30%ピペリジン-DMF溶液500μｌを加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返した。
（ｃ）担体樹脂を500μｌのDMFで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返した。
こうして、Fmoc基を除去したCys（Trt）の結合した担体樹脂を得た。
（ｄ）Fmoc-Gly-OH、330μmol、PyBOP、330μmol、HOBt １水和物、330μmolおよびNMM、495μmolをDMF 1155μｌ中で３分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を30分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｅ）担体樹脂を500μｌのDMFで１分間洗浄し、これを５回繰り返した。こうして、Fmoc-Gly-Cys（Trt）が担体上に合成された。
次に、（ａ）〜（ｃ）の洗浄、脱保護工程を行った後、（ｄ）の工程でFmoc-Arg（Pmc）-OHを用いて縮合反応を行い、次いで（ｅ）の洗浄工程を経て、Fmoc-Arg（Pmc）-Gly-Cys（Trt）が担体上に合成された。以下、工程（ｄ）において、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次用いて、（ａ）〜（ｅ）を繰り返し、保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。さらに、（ａ）〜（ｃ）の洗浄、脱保護工程を行った後、担体樹脂を500μｌのDMFで１分間洗浄し、これを５回繰り返した後、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄後、減圧下12時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、103.2mgを取得し、逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物３を25.4mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2648.1（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.1（1）, Glx 2.1（2）, Ser 1.9(2）Gly 1.1（1）, Arg 2.5（3）, Thr 1.8（2）, Ala 1.1（1）, Val 0.9（1）, Met 1.0（1）,Ile 3.0（3）, Leu 2.1（2）, Lys 3.1（3）, Cys 1.2（1）
実施例４ 化合物４ （配列番号４）（H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH)の合成
Fmoc-Gly、33μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、60mgを出発物質とし、実施例１と同様にして、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、115.3mgを取得し、逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物４を63.3mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z：2545.1（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.1（1）, Glx 2.1（2）, Ser 1.9（2）, Gly 1.1（1）, Arg 2.6（3）, Thr 1.9（2）, Ala 1.1（1）, Val 0.9（1）, Met O.9（1）, Ile 3.0（3）, Leu 2.1（2）, Lys 3.0（3）
実施例５ 化合物５ （配列番号５）（H-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH）の合成
Fmoc-Gly、25μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、51.0mgを出発物質とし、ACT社のペプチド合成機ACT357を用いて、次の操作を行った。
（ａ）担体樹脂をDMF、1mlにより30秒間洗浄し、該溶液を排出した。
（ｂ）25% ピペリジン-DMF溶液1mlを加えて混合物を２分間攪拌し、該溶液を排出し、さらに25%ピペリジン-DMF溶液1mlを加えて混合物を10分間攪拌し、該溶液を排出した。
（ｃ）担体樹脂をDMFで12秒間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を７回繰り返した。
こうして、Fmoc基を除去したGlyの結合した担体樹脂を得た。
（ｄ）DMF、125μｌ、Fmoc-Arg（Pmc）-OHとHOBt 1水和物とをそれぞれ0.25Mの濃度で含むNMP溶液500μｌ、PyBOPを0.25Mの濃度で含むDMF溶液500μｌ、およびNMMを2.0Mの濃度で含むDMF溶液、125μｌを樹脂に加えて60分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｅ）反応容器を500μｌのDMFで洗浄後、1mlのDMFで30秒間攪拌洗浄し、さらに再度500μｌのDMFで洗浄した。こうして、Fmoc-Arg（Pmc）-Glyが担体上に合成された。
次に、（ａ）〜（ｃ）の洗浄、脱保護工程を行った後、（ｄ）の工程でFmoc-Arg（Pmc）-OHに代わりFmoc-Ile-OHを含む溶液を用いて縮合反応を行い、次いで（ｅ）の洗浄工程を経て、Fmoc-Ile-Arg（Pmc）-Glyが担体上に合成された。以下、工程（ｄ）において、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂（Wangレジン）、132.5mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、58.3mgを取得した。これを、実施例１と同様に逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物５を22.6mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2029.2（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.0（1）, Glx 2.0（2）, Gly 1.0（1）, Arg 3.0（3）, Thr 1.0（1）, Ala 1.1（1）, Val 0.9（1）, Met 1.1（1）, Ile 2.9（3）, Leu 1.1（1）, Lys 2.0（2）
実施例６ 化合物６ （配列番号６）（H-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH）の合成
Fmoc-Gly、25.0μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、51.0mgを出発物質とし、実施例５と同様にして、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂、112.2mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、48.7mgを取得した。これを再度1mlのTFAに溶解し、50mlのエーテル中に滴下後生成した沈殿を濾別回収し乾燥させ、化合物６を35.5mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=1439.0（M+H+）
アミノ酸分析；Glx 1.1（1）, Gly 1.0（1）, Arg 3.0（3）, Ala 1.1（1）, Val 0.8（1）, Ile 1.9（2）, Leu 1.0（1）, Lys 2.0（2）
実施例７ 化合物７ （配列番号７）（H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-OH）の合成
Fmoc-Ile、25.0μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、56.8mgを出発物質とし、実施例５と同様にして、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂、280.9mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、123.1mgを取得した。これを、実施例１と同様に逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物７を26.7mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2019.2（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.1（1）, Glx 1.1（1）, Ser 1.7（2）, Arg 2.2（2）, Thr 1.7（2）, Val 1.0（1）, Met 1.0（1）, Ile 2.1（2）, Leu 2.1（2）, Lys 3.1（3）
実施例８ 化合物８ （配列番号８）（H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-OH）の合成
Fmoc-Arg（Pmc）、25.0μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、48.1mgを出発物質とし、実施例５と同様にして、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂、79.3mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、18.3mgを取得した。これを、実施例１と同様に逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物８を4.7mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=1621.0（N+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.0（1）, Glx 1.1（1）, Ser 1.8（2）, Arg 1.1（1）, Thr 1.9（2）, Val 0.9（1）, Met 1.0（1）, Ile 1.0（1）, Leu 2.1（2）, Lys 2.0（2）
実施例９ 化合物９ （配列番号９）（H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-OH）の合成
Fmoc-Val、25.0μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、48.1mgを出発物質とし、実施例５と同様にして、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂、120.3mgを得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、49.0mgを取得した。ただし、切り出しに用いた混合溶液は90%TFA、5% 1,2-エタンジチオール、5% チオアニソールよりなり、これを加えた後の放置時間は２時間とした。これを、実施例１と同様に逆相カラム（YMC製、YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物９を20.2mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=1336.7（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.1（1）, Glx 1.1（1）, Ser 1.8（2）, Thr 1.8（2）, Val 1.0（1）, Met 1.0（1）, Ile 1.0（1）, Leu 2.1（2）, Lys 1.0（1）
実施例１０ 化合物１０ （配列番号１０）〔H-cyclo（Cys-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys）-OH〕の合成
Fmoc-Cys（Trt）、16.5μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、30mgを出発物質とし、実施例３と同様にして、Fmoc-Gly、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc−Cys（Trt）-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、アミノ酸の縮合時間は６０分間とした。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、54.5mgを取得した。これを、実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm)を用いたHPLCで精製し、化合物１０の未環化体を14.0mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2751.7（M+H+）
これを10mlのDMSOに溶解し、アンモニア水を加えてpH 7.1とし、室温で29時間攪拌した。溶液を凍結乾燥後、再度2M酢酸水溶液に溶解し凍結乾燥して、化合物１０を13.5mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2749.5（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 1.2（1）, Glx 2.2（2）, Ser 2.0（2）, Gly 1.1（1）, Arg 3.0（3）, Thr 2.0（2）, Ala 1.1（1）, Val 1.0（1）, Met 1.1（1）, Ile 3.1（3）, Leu 2.2（2）, Lys 3.1（3）, Cys 1.8（2）
実施例１１ 化合物１１ （配列番号１１）〔H-Leu-Ser-Thr-cyclo（Cys-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys）-OH〕の合成
Fmoc-Cys（Trt）、16.5μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、30mgを出発物質とし、実施例３と同様にして、Fmoc-Gly、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（Ot-Bu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Thr（t-Bu）-OH、Fmoc-Ser（t-Bu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、アミノ酸の縮合時間は60分間とした。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、55.2mgを取得した。これを、実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製し、化合物１１の未環化体を9.7mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2664.5（M+H+）
これを10mlのDMSOに溶解し、アンモニア水を加えてpH 7.3とし、室温で20時間攪拌した。溶液を凍結乾燥後、再度2M酢酸水溶液に溶解し凍結乾燥して、化合物１１を9.9mg得た。
質量分析［FABMS］；m/z=2662.5（M+H+）
アミノ酸分析；Asx 0.9（1）, Glx 2.0（2）, Ser O.9（1）, Gly 1.1（1）, Arg 3.0（3）, Thr 1.9（2）, Ala 1.1（1）, Val 0.9（1）, Met 1.0（1）, Ile 3.2（3）, Leu 2.1（2）, Lys 2.9（3）, Cys 1.5（2）
実施例12 化合物12（配列番号12）〔H-cyclo（Cys-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Cys）-OH〕の合成
H-Cys（Trt）、140μmolが結合した担体樹脂（Cl-Trtレジン）、250mgを出発物質とし、ACT社のペプチド合成機ACT357を用いて、次の操作を行った。
（ａ）担体樹脂をDMF2.5mlにより３分間洗浄し、該溶液を排出する操作を２回繰り返した。
（ｂ）DMF 250μｌ、Fmoc-Lys（Boc）-OHとHOBt・１水和物とをそれぞれ0.5Mの濃度で含むNMP溶液1.4ml、DIPCを0.5Mの濃度で含むNMP溶液1.4mlを樹脂に加えて40分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｃ）DMF 2.5mlにより１分間洗浄し、該溶液を排出する操作を２回繰り返した。
（ｄ）DMF 250μｌ、Fmoc-Lys（Boc）-OHとHOBt・１水和物とをそれぞれ0.5Mの濃度で含むNMP溶液1.4ml、HBTUを0.5Mの濃度で含むDMF溶液1.4ml、及びDIEAを2.0Mの濃度で含むNMP溶液0.7mlを樹脂に加えて20分間攪拌し、溶液を排出した。
（ｅ）（ｃ）と同一の操作を行った。
こうして、Fmoc-Lys（Boc）-Cys（Trt）が担体上に合成された。次に、
（ｆ）ピペリジンを25%の濃度で含むDMF溶液2.5mlを加えて混合物を２分間攪拌し、該溶液を排出し、さらに同溶液2.5mlを加えて混合物を10分間攪拌し、該溶液を排出した。
（ｇ）担体樹脂を2.5mlのDMFで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を７回繰り返した。
こうして、Fmoc基を除去したLys（Boc）-Cys（Trt）の結合した担体樹脂を得た。
次に、（ａ）〜（ｅ）の工程でFmoc-Lys（Boc）-OHに代わりFmoc-Leu-OHを含む溶液を用いて縮合反応を行い、次いで（ｆ）、（ｇ）の脱保護、洗浄工程を経て、Leu-Lys（Boc）-Cys（Trt）が担体上に合成された。以下、工程（ａ）〜（ｅ）において、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc−Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OHを用いて各工程を繰り返し、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。
得られた樹脂のうち4/5量を用い、実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド137.2mgを取得した。100mgのDTTとともに2mlのDMFに溶解し、50℃で１時間放置した後、実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D. x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、２つのSH基が遊離した状態のペプチドを12.2mg得た。
質量分析（FABMS）；m/z=2284.3（M+H+）
これを、5mlの2M酢酸水溶液に溶解し、水で50mlに希釈した後、希アンモニア水を加えてpH5.7にした。ここに0.1MのK3Fe（CN）6水溶液0.5mlを加えて室温で2.5時間攪拌した後、反応溶液に1mlの酢酸を加えた。実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D. x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、化合物12を7.3mg得た。
質量分析（FABMS）；m/z=2282.5（M+H+）
アミノ酸分析：Glx 1.0（1）, Ser 1.0（1）, Arg 3.9（4）, Ala 1.1（1）, Val 0.7（1）, Leu 7.2（7), Lys 2.1（2）, Cys 2.7（2）
実施例13 化合物13（配列番号13）〔Biotinyl-cyclo（Cys-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Cys）-OH〕の合成
実施例12で得られた、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂のうちの1/5量を1mlのDMFで洗浄した後、68.4mgのD-ビオチン（ナカライテスク）を含む440μｌのDMF懸濁液およびDIPCを0.5Mの濃度で含むNMP溶液を加えて室温で２日間攪拌した。溶液を排出した後、洗浄、乾燥を経て、N末がビオチン化された側鎖保護ペプチドの結合した樹脂を得た。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド47.3mgを取得した。50mgのDTTとともに1mlのDMFに溶解し、50℃で１時間放置した後、実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D.x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、２つのSH基が遊離した状態のペプチドを11.8mg得た。
質量分析（FAB-MS）；m/z=2510.8（M+H+）
これを、5mlの2M酢酸水溶液に溶解し、水で50mlに希釈した後、希アンモニア水を加えてpH5.5にした。ここに0.1MのK3Fe（CN）6水溶液0.5mlを加えて室温で３時間攪拌した後、反応溶液に1mlの酢酸を加えた。実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D.x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、化合物13を3.8mg得た。
質量分析（FABMS）；m/z=2508.8（M+H+）
アミノ酸分析：Glx 1.1（1）, Ser 1.0（1）, Arg 3.8（4）, Ala 1.1（1）, Val 0.8（1）, Leu 6.8（7）, Lys 2.0（2）, Cys 2.1（2）
実施例14 化合物14（配列番号14）〔H-Leu-Ser-Thr-Cys-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-OH〕の合成
Fmoc-Arg（Pmc）、23μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、50mgを出発物質とし、実施例３と同様にして、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、アミノ酸の縮合時間は60分間とした。実施例１と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド59.8mgを取得した。これを実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D.x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、化合物14を7.7mgを得た。
質量分析（FABMS）；m/z：1921.7（M+H+）
アミノ酸分析：Asx 1.0（1）, Glx 1.1（1）, Ser 0.9（1）, Arg 2.2（2）, Thr 1.6（2）, Val 0.9（1）, Met 1.1（1）, Ile 1.0（1）, Leu 2.1（2）, Lys 3.1（3）, Cys 1.3（1）
実施例15 化合物15（配列番号15）〔H-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Ser-Asn-Asn-Ser-Trp-Arg-OH〕の合成
Fmoc-Arg（Pmc）、23μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、50mgを出発物質とし、実施例３と同様にして、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc−Lys（Boc）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OHを順次縮合した後に、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、アミノ酸の縮合時間は60分間とした。側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しは、用いる混合液として、実施例１の組成のものに5mg/mlの割合で2-メチルインドールを加えたものを用い、放置時間を６時間とする以外は実施例１と同様に行い、粗ペプチド20.9mgを取得した。これを実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D.x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、化合物15を7.8mgを得た。
質量分析（FABMS）；m/z=2663.5（M+H+）
アミノ酸分析：Asx 2.0（2）, Glx 3.9（4）, Ser 2.0（2）, His 1.1（1）, Arg 1.1（1）, Tyr 2.2（2）, Val 1.8（2）, Leu 3.0（3）, Lys 3.0（3）
実施例16 化合物16（配列番号16）〔Biotinyl-Gly-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Ser-Asn-Asn-Ser-Trp-Arg-OH〕の合成
Fmoc-Arg（Pmc）、13.8μmolが結合した担体樹脂（Wangレジン）、30mgを出発物質とし、実施例３と同様にして、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Gly-OHを順次縮合した後に、樹脂に対して、61.9mgのD-ビオチン（ナカライテスク）に、0.5Mの濃度でHBTUおよびHOBt・１水和物を含むDMF溶液562μｌとDIEAを1Mの濃度で含むDMF溶液562μｌを加えて室温で５分間攪拌した溶液を加えて、４時間攪拌した。溶液を排出した後、洗浄、乾燥を経て、N末がビオチン化された側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。ただし、アミノ酸の縮合反応工程（ｄ）において、PyBOPの代わりにHBTUを、NMMの代わりにDIEAを使用した。側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しは、用いる混合液として、実施例１の組成のものに5mg/mlの割合で2-メチルインドールを加えたものを用い、放置時間を６時間とする以外は実施例１と同様に行い、粗ペプチド44.2mgを取得した。これを実施例１と同様に逆相カラム（資生堂製 CAPCELL PAK C18 30 mm I.D.x 250 mm）を用いたHPLCで精製し、化合物16を10.3mgを得た。
質量分析（FABMS）；m/z=3260.0（M+H+）
アミノ酸分析：Asx 2.1（2）, Glx 4.1（4）, Ser 2.0（2）, Gly 1.0（1）, His 1.0（1）, Arg 2.8（3）, Tyr 2.1（2）, Val 1.9（2）, Leu 3.0（3）, Lys 2.9（3）
実施例17 化合物10の酢酸塩への変換
実施例10のようにして得られた化合物10、22.1mgを1%酢酸水溶液5mlに溶解し、陰イオン交換カラム（旭化成 Asahi Pack ES-502N 21.5mmI.D.×100mm）を通すことで、TFAを除去し酢酸塩に変換した。ペプチドは1%酢酸水溶液にて溶出させ、220nmで検出した。溶出液を凍結乾燥し、化合物10の酢酸塩20.0mgを得た。
実施例18 化合物12の酢酸塩への変換
実施例12のようにして得られた化合物12、17.5mgを1%酢酸水溶液5mlに溶解し、陰イオン交換カラム（旭化成 Asahi Pack ES-502N 21.5mmI.D.×100mm）を通すことで、TFAを除去し酢酸塩に変換した。ペプチドは1%酢酸水溶液にて溶出させ、220nmで検出した。溶出液を凍結乾燥し、化合物12の酢酸塩13.0mgを得た。
次に、化合物（Ｉ）の生物活性およびスクリーニング方法について実施例を示す。
実施例１９ ウシ血管平滑筋細胞、ブタ血管平滑筋細胞、ウシ毛細血管内皮細胞又はウシ頚動脈内皮細胞に対するＴＧＦ-βの結合度測定による、潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-β遊離活性
（１−１）ＬＬＴＧＦ-β125Ｉ-標識
オカダ（Okada）らの方法［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）, 106, 304（1989）］に従いヒト血小板から精製したＬＬＴＧＦ-βを用い、クロラミンＴ法［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular & Cellular Biology）, 2, 599（1982）］により125Ｉ標識した。具体的には以下の操作を行った。
２μｇのＬＬＴＧＦ-βに1M K-phopsphate Buffer（pH 7.5）を25μｌ、Na-125Ｉ（DuPont NEN）を37MBq、クロラミン-Ｔ（0.5mg/100μｌ in 0.05M K-phos. buffer、和光純薬）を10μｌ加え、40秒間室温で撹拌した。Na2S2O5（1mg/100μｌ in 0.05M K-phos. buffer）を15μｌ加え、５秒間室温で撹拌した後、チロシン水溶液（1mg/ml）100μｌを添加した。反応液をSephadex G25カラムにアプライし、500μｌずつフラクションを分取し、γ-カウンター（ARC-2000、アロカ）にてカウントし、ラベル化蛋白を含む画分を選択し、実験に用いた。
（１−２）細胞の調製
実験に用いた細胞はサトウ（Sato）らの方法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）］に従い取得した。ウシ血管平滑筋細胞（BSMC）はウシ大動脈から、ブタ血管平滑筋細胞（PSMC）はブタ大動脈から、エクスプラント（explant）法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 50, 172（1971）］により単離、培養した。ウシ毛細血管内皮細胞（BCEC）は、ウシ副腎毛細血管から単離、培養した。ウシ頚動脈内皮細胞（BAEC）は、ウシ頚動脈から単離、培養した。
（１−３）ＴＧＦ-β結合度の測定
サトウ（Sato）らの方法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）］に従い以下の通りの操作を行った。
上述の通り単離、培養したBSMC、PSMCまたはBCECを4×104 cells/dishの割合で35mm dishに蒔き、翌日培地を0.1%ウシ血清アルブミン（BSA）を含むダルベッコズ・モディファイド・イーグル・メディウム（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM, Nissui Pharmaceutical Co.）に変更し、５時間インキュベートした。0.1g/lのMgCl2・6H2OとCaCl2を含むリン酸緩衝生理食塩水（以下、単にPBS（+）と記載し、MgCl2・6H2OとCaCl2を含まないリン酸緩衝生理食塩水を単にPBS（-）と記載することもある）2mlで細胞を洗浄した後、2mg/ml125Ｉ-ＬＬＴＧＦ-βおよび試験化合物を含む氷冷0.1% BSA含有DMEM 1mlに培地を変え、４℃で３時間インキュベートした。試験化合物はジメチルスルホキシド（DMSO）溶液として加え、系中の最終DMSO濃度が0.1%となるようにした。氷冷PBS（+）2mlで３回細胞を洗浄した後、0.5% Triton X-100 900μｌで細胞を溶解した（室温、0.5-1時間）。溶解液のうち800μｌを分取し、γ-カウンターで放射活性を測定した。
結果を図１、２並びに第３表〜第６表に示す。
以上、図１および２並びに第３表〜第６表に示すように、化合物１〜３、５〜９及び１３〜１６は100μg／mlの濃度で化合物１２は３０μg／mlの濃度で、細胞に対する結合度が増大し、潜在型ＴＧＰ-βからの活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進した。
また、本発明の方法で、潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進し細胞に対する結合度が増大させる化合物を選択することができる。
実施例２０ ウシ血管内皮細胞の遊走度測定による潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-β遊離活性
サトウ（Sato）らの方法〔ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Journal of Cell Biology）, 123, 1249（1993）〕に従い以下の通りの操作を行った。
35mm dishにBCECをコンフルエントにした後、培地を0.1% BSA含有DMEMに変更し、５時間インキュベートした。剃刀で一部細胞を斯き取り、PBS（-）で洗浄した後、試験化合物を含む0.1% BSA含有DMEMでインキュベートし、24時間後に４視野の遊走細胞数を顕微鏡（IX70, Olympus）下、各dish毎にカウントした。試験化合物は試験例１と同様にして加えた。結果を図３〜５に示す。化合物３、５〜９は50μg/mlの濃度で、細胞の遊走を阻害し、潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進した。化合物４は100μg/mlの濃度で細胞の遊走を阻害した。化合物１０は10μg/mlの濃度でも細胞の遊走を阻害した。
本発明の方法で、潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進し細胞に対する結合度が増大させる化合物を選択することができる。
実施例２１ ルシフェラーゼアッセイによる活性型ＴＧＦ-β存在量の測定
活性型ＴＧＦ-β量は、アベ（Abe）らの方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）, 216, 276（1994）］に基づき、PAI-1プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を導入したミンク肺上皮細胞（MLEC）の発光をルシフェラーゼ・アッセイ・システム（Promega）で測定することにより行った。具体的には以下の操作を行った。
24 well plateにBCECをコンフルエントになるように細胞を蒔き、培地を0.1% BSA含有DMEMに変更してから６時間後、コームで細胞を網目状に斯き取りPBS（-）で洗浄した後、試験化合物を含む0.1% BSA含有DMEMで24時間インキュベートし、培養上清をサンプルとした。この培養上清を採取する６時間前に96well plateに上記MLECを2.8×104 cells/wellの割合で蒔いておき、６時間10%ウシ胎児血清（FCS）含有DMEMで培養後、サンプルとした上記培養上清に培地を置換し、16時間培養した。細胞をPBS（-）で２回洗浄した後ルシフェラーゼ・アッセイ・システムを用い活性化ＴＧＦ-β濃度を測定した。結果を図６に示す。化合物３および１０の添加により活性型ＴＧＦ-βが遊離した。特に化合物１０では10μg/mlでも顕著な効果が見られた。
本発明の方法で、潜在型ＴＧＦ-βからの活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進し細胞に対する結合度が増大させる化合物を選択することができる。
産業上の利用可能性
本発明により、潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜結合の増強によって、潜在型ＴＧＦ-βの活性化を促進する活性を有する新規ペプチドまたはその薬理的に許容される塩を提供することができる。
また、本発明の化合物の選択方法によれば潜在型ＴＧＦ-βから活性型ＴＧＦ-βの遊離を促進する活性または潜在型ＴＧＦ-βの細胞膜への結合を促進する活性を有する化合物が選択される。
本発明の選択方法で得られる化合物または化合物（Ｉ）もしくはそれらの薬理的に許容される塩は、潜在型ＴＧＦ-βの細胞への結合を阻害する活性または促進する活性もしくは潜在型ＴＧＦ-βのＴＧＦ-βへの変換反応を阻害する活性または促進する活性を有するので、癌、糖尿病性網膜症、粥状動脈硬化、骨折、心筋梗塞、虚血再環流後の心筋障害、脳梗塞、網膜剥離、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、移植腎拒絶、HIV腎症、特発性肺線維症、自己免疫性肺線維症、肝硬変、（癌療法後に好発の）静脈狭窄性肝障害、全身性硬化症、ケロイド、好酸球増加−筋肉痛症候群、血行再建術後再狭窄、眼内線維症、リウマチ性関節炎、鼻たけ等の治療または予防剤として有用である。
（１）書誌的項目
出願人氏名又は名称
協和醗酵工業株式会社
発明の名称
潜在型ＴＧＦ-βの活性化を促進するペプチドおよびＴＧＦ-β活性調節化合物のスクリーニング方法
整理番号
１０６０
出願日
１９９８年５月１２日
優先権番号
平成９年特許出願第１２０６８３号
優先日
平成９年５月１２日
配列の数
３４
（２）配列に関する技術的項目
配列番号：１
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：２４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：１７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：１７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：２４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：disulfide-bonds
存在位置：１および２４
配列
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：disulfide-bonds
存在位置：４および２３
配列
配列の長さ：19
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：disulfide-bond
存在位置：１および19
配列
配列の長さ：19
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：disulfide-bond
存在位置：１および19
特徴を表す記号：modified site
存在位置：１
他の情報：XaaはNα-ビオチニル-L-システインを表す
配列
配列の長さ：16
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：21
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：24
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号：modified site
存在位置：１
他の情報：XaaはNα-ビオチニル-グリシンを表す
配列
配列の長さ：391
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：414
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：412
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：414
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：410
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：412
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：315
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：409
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：412
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：412
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：373
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：390
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：382
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Claims (6)
- 一般式（Ｉ）：
R1-A-R2（Ｉ）
（式中、
R1は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、
R2はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、
Aは、
（a）ヒトTGF-β1前駆体配列の30〜60番目のアミノ酸配列、142〜186番目のアミノ酸配列および269〜297番目のアミノ酸配列並びにヒトTGF-β1以外のTGF-β前駆体配列をヒトTGF-β1配列に整列化したときにヒトTGF-β1前駆体配列の30〜60番目のアミノ酸配列、142〜186番目のアミノ酸配列および269〜297番目のアミノ酸配列に相当する配列から選ばれるアミノ酸配列の12残基以上の部分配列；
または
（b）配列番号1〜16の配列のいずれかの配列から選ばれるアミノ酸配列を表し、該部分配列または該アミノ酸配列中、
配列内のN末端およびC末端アミノ酸残基を含む任意のアミノ酸残基から選ばれる2つのアミノ酸残基において、N末端アミノ基または側鎖のアミノ基、およびC末端カルボキシル基または側鎖のカルボキシル基が、CO-NHで表されるアミド結合、NH-COで表される逆アミド結合、または側鎖のチオール基でジスルフィド結合が形成されていてもよい。）で表される、
潜在型TGF-βから活性型TGF-βの遊離を促進する活性または潜在型TGF-βの細胞膜への結合を促進する活性を有するペプチドまたはその薬理的に許容される塩。 - 請求の範囲第１項記載のペプチドまたはその薬理的に許容される塩（該ペプチドまたはその薬理的に許容される塩は薬理的に許容される担体と一緒であってもよい）を含有する医薬組成物。
- 請求の範囲第１項記載のペプチドまたはその薬理的に許容される塩を含有するTGF-βに関連する疾患の治療または予防剤。
- （a）動物細胞に請求の範囲第１項記載のペプチドまたはその薬理的に許容される塩を添加した後にTGF-β量を測定すること、
（b）評価すべき化合物および請求の範囲第１項記載のペプチドまたはその薬理的に許容される塩を動物細胞に添加した後にTGF-β量を測定すること、および
（c）該化合物によるTGF-β量の変化から該化合物の潜在型TGF-βからTGF-βへの変換反応の阻害活性または促進活性を評価すること、
からなるTGF-βが関与する疾病の治療または予防に使用される化合物をインビトロでスクリーニングする方法。 - 該動物細胞が血管内皮細胞である請求の範囲第４項記載の方法。
- 化合物の潜在型TGF-βのTGF-βへの変換反応の阻害活性を評価する請求の範囲第４項または第５項記載の方法。
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