JPS6014171A - トランスホ−ミンググロスファクタ−の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトランスホーミンググロスファクター（Ｔ　ｒ
ａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ；
以下、ＴＧＦという）の定量方法に関する。

ＴＧＦは、ヒトおよびけつ歯動物のガン細１泡でつくら
れ、正常細胞に細胞形態学的に特異な変質（形質転換お
よび増殖）をきせるポリペプチドである。ヒトおよび動
物の正常わ１胞は、軟寒天培地にお゛いてはフロニーを
形成、しないか、これにＴＧＦを加えるとコロニー形成
能を有するようになる。

１９７８年ジ・ゼ・トダロら［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ７ｇ、
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、７５，４００］（］９７８））により、肉腫
細胞の培養上清から始めてＴＧＦの存在が報告されて以
来、多数のＴＧＦがヒトオゴよびげつ歯動物の培養ガン
細胞およびガン患者のガン組織からも発見きれている〔
ロバーツ・工・ビら；　ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７７　、３４
９４　（］　９８０）〕。最近、ディ・アル　ターシッ
クら［ＪＮＣＬ、６９，７９３（１９８２）Ｊおよびジ
・ゼ・ｌ・フロら（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｃｓ、、４３　、
４０３　（１９８３）〕は、ガン患者の尿から分子量約
３００００〜３５０００の高分子型ＴＧＦを抽出してい
るが詳しい物性は未だ明らかでない。

従ってまた、ＴＧＦを類似している種々のフロスフアク
クーと明瞭に識別する適切な手段がなく、ＴＧＦを判定
するに当って、ＴＧＦのイｊする正常細胞のコロニー形
成能にノルいて行なっていたにすぎず、かつ煩雑な操作
をも必要とし、定量性に欠けるものであった。さらにＴ
ＧＦの体液、例えば血液、尿などにおける存在、含有量
、さらにその消長などに・関してはあまり報告されてい
ないものであった。

本発明者らは、先に、高分子型のＴＧＦは正常人尿には
存在せず、ガン患者法のみ特異的に存在すること、しか
もこのものが正常細胞に対して前述のような生物学的活
性を有するもので極めて主要な物質と考えて研究した結
果、種々のガン患者の尿を透析して無機イオンその他の
低分子物質を除去し、さらに必要に応じてゲル濾過した
後、次いで陽イオン交換体を用いてクロマトグラフィー
または／および吸着クロマトグラフィーを行ない、極め
て高純度に精製されたヒ）ＴＧＦを得にものである（特
願昭５８−６１０２号明細書参照）。

さらに本発明者らは研究し続けた結果、このＴＧＦを用
いて、ヒト以外の醋乳動物に注Ｑ＝ｉ　Ｌで免疫せしめ
、その血液を採取し、このＴＧＦＫ対するヒトＴＧＦ抗
体が良好に得られることを知り、さらに研究の結果、免
疫させた哺乳動物の牌臓を摘出し、その抗体産生能を有
する単細胞とミエローマ細胞上を融合せしめることによ
りＴＧＦに対するヒトＴＧＦ抗体としてのモノクロナー
ル抗体産生細胞を得、これを培養してにｌ−Ｔ　Ｇ　Ｆ
抗体を良好にイ）Ｉることを完成した。さらに本発明者
らは、得られたヒトＴＧＦ抗体と免疫反応を良好に行々
い得るＴＧＦの放射性同位元素（以下Ｒ１という）標記
体を得、ＴＧＦを含有する被検液中のＴＧＦ定量におけ
る、−１−、述のヒ）ＴＧＦ抗体およびＲＩ標識ＴＧＦ
を用いるＲ１免疫測定法（以下ＲＩＡという）を確立し
た。

本発明は、上記の知見に基いて完成し／ともので、被検
液に、Ｒ１標識ＴＧＦと、”Ｉ’　Ｇ　Ｆ抗体とを反応
せしめ、次いでＲ１標識ＴＧＦ−ＴＧＦ抗体結合体と未
反応ＲＩ標識ＴＧＦとを分離し、その後分離したいずれ
か一方の放射性同位元素標識の匿を定１ｙすることを特
徴とする被検液中のＴＧＦの定電方法である。さらに本
発明において、そのＴＧＦ抗体として不溶性担体１て固
定化した同相体として用いる固相法による競争反応の定
量法を行なってもよく、また可溶性の＝！まのＴＧＦ抗
体を用いてその反応後の分離においてＴＧＦ抗体に対す
る特異的抗体を用いてなる２抗体法による競争反応の定
量法を行なえばよい。

１ず本発明のＲＩ標識ＴＧＦおよびヒ）ＴＧＦ抗体を得
るためのヒ）ＴＧＦは、例えば肺ガン、ｔＡ毛肺腫瘍胃
ガン、咽頭ガン、結腸カン、乳ガン、黒色肉腫、卵巣ガ
ンなどのガン患者の尿を原料として精製、回収すること
が簡便である。これらのガン患者法からのＴＧＦの精製
手段について例示すると、集められたガン患者法は、ま
ず低分子の不純物を除くため、水を透析外液として透析
膜の分子量カット約１００００以下の膜を用いて透析す
る。次いで得られた透析内液は、必要に応して、凍結、
融解を反復して不純物を析出させ、遠心分離や５ミクロ
ン程度の細孔を有するフィルターを通して微細な沈澱の
粒子を除去してもよい。さらに必要に応じて、透析内液
は、バイオゲル（１３ｉ。

ｇｅβ）Ｐ−６０，’Ｐ−１００（バイオラド社製八セ
ファデック７、　（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ　−５０
（ファルマンア社製）などのゲル）＝ｉ過剤にてゲル濾
過してＴ　Ｇ　Ｆ活Ｖ１°を示ず（ｉｊ＋ｉ分を集めれ
ばよい。この際、ＴＧＦ活性を示す両分と１−では、推
定分子量２８０００〜３５０００の位置に存在腰後述す
る試験法によって識別することかできる。次いで、前述
の尿の透析内湾またはゲルカーｉ過して集めた活性ＩＨ
ＩＨｉ分について、イオン交換クロマトグラフィーや分
子・篩１摸例えば分Ｊ、＋Ｌｉ上Ｉ　００００〜２００
００程度の限外〃ｊ過膜による分子篩処理や、吸着クロ
マトグラフィーの少なくとも１以上の操作１にはこれら
の操作を組み合せて精製されたＴＧＦ活性画分が採取さ
れる。イオン交換クロマトグラフィーは、例えばＣＭ−
セファテックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）（ファルマシア
６！二製）　、Ｓ　Ｐ−セファテックス（Ｓ　ｅ　Ｉ）
ｈ　ａ　ｄ　ｅ　ｘ　）　（ファルマシア社製）、ＣＭ
−５２（ワットマン社Ｍ）、バイオ・レックス（Ｂｉｏ
−Ｒｅｘ　）　７０　（バイオ・ラド社製）などの陽イ
オン交換体を基利としにカラムを用いて、上記のＴＧＦ
含有液を加えて吸着４」シめる。次いで遂次濃度を上昇
勾配させた中性塩、好捷しくは塩化ナトリウムの水溶液
を用いて傾斜溶出して、そのＴＧＦ活性画分を回収すれ
ばよい。次いで好ましくは分子量１．００００〜２００
００の限外濾過膜を用いて濃縮、脱塩を行なえばよい。

さらに吸着クロマトグラフィーとしては、例えばシンク
ロパック（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ　）　Ｐ’　Ｒシリー
ズ（ジンクローム社製）の炭素数３〜２０のアルキル基
のような疎水性基で修飾されたシリカゲルやＭＣＩ　Ｇ
ｅｌ　ＣＨ２ＯＰシリース（三菱化成工業社製）、アン
バーライ）　（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　）Ｘ　ＡＤシリー
ズ（アンバーライト社製）のようなポリスチレン系ハイ
ポーラス成層樹脂などの基材のカラムを用いて、−１−
記のＴＧＦ含有液を加えて吸着せしめる。次いで遂次濃
度を上昇勾配させた親水性中性有機溶媒、例えばエタノ
ール、プロピルアルコールのような低級脂肪族アルコー
ルまたはアセトン、アセトニトリルのような低級脂肪族
ケトンなどの水溶液を用いて傾斜溶出して、そのＴＧＦ
活性画分を回収すればよい。このようにして得られるＴ
ＧＦ活性画分は、必四゛に応じて凍結乾燥などの乾燥手
段にて乾燥粉末としてイ（ｌて４）よく、この乾燥粉末
は白色で、ニンヒドリン反応陽性、分子）〒Ｊ：２８０
．ＯＯ〜３５０００（ゲルｒ過法）、５ＤＳ−電気泳動
において一１１′Ｉ−であり、酸および熱に対して安定
で、トリプシンおよびジチオスレイト−ル処ｒ！１！に
より失活される理ｆヒ学的性質を有しており、極めて高
度に精製きれたヒｌ−Ｔ　Ｇ　Ｆである。

次いでこのようなＴＧＦを用いて、Ｒ１標識ＴＧＦＸＴ
ＧＦ抗体を得るのであるが、用いられるＴＧＦは何んら
前述の精製手段に限ガｌされるものではない。

４−１’ヒトＴＧＦ抗体を得るに当っては、前述のヒ）
ＴＧＦを抗原として、ヒＩ・以外の曲名動物、例えばモ
ルモット、ウサギ、ラット、マウスやヤギなどの抗体産
生能のある動物を用い、通常の方法に従って免疫した後
採血して抗血清を得、さらに抗体を分離する。この際抗
ｆｆＪｉｌして用いるＴＧＦは、上述の如く捷で高度に
精製した単一の蛋白標品であることが望ましいが、必ず
しもこれに限定されるものではない。−１：た抗体を得
るに当って、例えば前述のヒ）ＴＧＦ粉末０．１〜］　
ｍｇを生理食塩水０．１〜５−に溶解し、これに同尉の
コンプリー１゛・フロイント・アジュバント（Ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）を加え
、充分乳化した移用いる哺乳動物、例えばウサギやマウ
スなどの皮下、皮内に注射し、１〜３週間毎に数回注射
して免疫せしめる。その後、最終免疫の日より一定期間
後採血し、これを放置し、凝固せしめて遠心分離し、ヒ
）ＴＧＦ抗体を含有する抗ＩＩＩ［清を得る。

またこの場合に用いる動物としては抗体産生能のある動
物であれば何れを用いてもよく、大計の抗体を得るには
大型動物を用いるのが好ましく、通常はウサギ、マウス
やヤギを用いるが、何んら限定されるものではない。さ
らにこれらの動物から得られたヒ）ＴＧＦ抗体を含有す
る抗血清からヒ１−　Ｔ　Ｇ　Ｆ抗体を得るには、通常
用いられる抗体の精製手段の方法によって行なえるもの
で、例えば抗血清を硫安分画し、次いでイオン交換クロ
マトグラフィーあるいはゲル濾過によって精製、採取す
ればよい。さらに高純度に精製するにはヒ）ＴＧＦを固
定化した不溶性（１，１体を基材として用いるアフィニ
ティークロマトグラフィーにて吸着し、次いで溶出を杓
なって得ればよい。さらにヒｌ−ＴＧＦＪ：ｌ″Ｌ体を
得る別法としては、ヒトＴＧＦを抗原上して免疫させに
ヒト以外のＩｌ＋Ｉ＋　′：２Ｌ動物の肺細胞とミエロ
ーマ細胞とを用いて融合せしめ、この融合細胞からヒト
ＴＧＦに対するモノクロナール抗体産生細胞を分厚Ｙ７
、この融合細胞を用いるヒｌ−ＴＧＦモノクＩｆｆナー
ル抗体を製造する方法で、特に１１７１ｉ乳動物として
マウスを用いる方法がよく利用されているｌ：Ｎａｔｕ
ｒｅ、２５６　、４９５〜４９７　（１９７５）、Ｎａ
ｔｕｒｅ　、　２７６　、３９．７〜３９９（１９７８
）、Ｃｅ１ｌ、　１４　、９〜２０　（ｊ　９７８）、
Ｎａｔｕｒｅ、２６６．５５０　５５２（１！Ｊ７７　
ン　、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　６　、５　１
　］　〜　５　］　９（７９７６）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　ａｎｄ　ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮｅｗｓ、Ｊａｎ、
　］　、　１９７９　、１５〜］　７″Ｊｏ例えばＢａ
１ｌ）／Ｃ？ウスの皮下に、ＴＧＦ含イ＃！：Ｐ、即食
塩水トコンブリート・フロイン）・・アシコバントの乳
化液を注射り、］〜３週間後複数回追加免疫を行ない、
最終免疫の３〜５Ｆ］後（（マウスのｔ］１７臓を摘出
し、適当庁媒体中でＩｌ’ｉ’細胞の単−細胞化した懸
濁液を調製する。次いでこのＩＩ！、ＩＩ＋細胞３〜１
０撹に対して、マウス由来のミエローマ細胞、例ｔげＰ
Ｓ−ＮＳ　１／１−Ａｇ４−１の１量を用いて、３７℃
、４０〜５０％ポリエチレングリコール１０００〜Ｊ５
００の存在下適当な培地、例えばＲＰＭＩ培地［Ｊ、Ａ
、Ｍ、Ａ、、月１９，５］９（１９６７）、Ｊ、Ｎａｔ
、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　、　３６　、４０５（
１９６６）、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、６　、８９　（］　９
７０）〕で融合せしめ、次いで洗浄後分離し、ウシ胎児
＋ｎ＋清含有ＲＰＭＩ培地に加え、さらにこのＩＩＩ　
Ｕ３懸濁液の機微づつを、ヒポ°キサンチン、アミ／プ
テリン、チミジン、ウシ胎児＋ｍ清を含有するＲＰＭＩ
培地（ＨＡＴ培地）にて選択培養し、各培養液の上清を
採取し、その抗体価の高い培養細胞を選択し、ざらに用
Ｖ′−たマウスＢａ１ｂ／ｃの胸腺細胞をフィダーセル
として用いる限界希釈方法にヨリクローニングを行ない
、ヒｌ−Ｔ　Ｇ　Ｆモノクロナール抗体産生細胞を分取
する。さらにこの細胞を、ウシ胎児面’／＋Ｉｊ含有Ｒ
ＰＭＩ培地やゲルベ・ノコ変法イーグル培地にて培養し
、その−上清を取得し、これを硫安分画、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ケル’／ｊ−ｊｉ昂へ−）アフィニ
ティークロマトグラフィーを行なって精製されにヒ）Ｔ
ＧＦモノクロナール抗体をイ；する。まブこは、ヒトＴ
ＧＦモノクロナール抗体産生細胞を、組！適合動物や無
胸腺のヌードマウスの体内で腫瘍として生育せしめ、こ
れから採取、Ａ′古製してもよい。さらにこのヒトＴＧ
Ｆモノクロナール抗体産牛細胞は、ジメチルスルホキサ
イドやグリ七ロールかどの凍結保護剤を用いて血清含イ
シ増殖培地にて液体窒素約−１９６°Ｃで凍結保存すれ
ばよい。

さらにこのヒトＴＧＦ抗体またはヒトＴＧＦモノクロナ
ール抗体は、不溶性担体に固定化した同相体として用い
てもよい。さらにそれらの抗体をパパイン処理して得ら
れるそのＦ（ａｂ’）２．さらにこ］１を３！’ｉ４　
）α処Ｊ３１ｉ　して得られるＦａｂ’、抗体をペプシ
ン処理して得られるそのＦ（ａｌ））２なとのフラグメ
ントとして不溶性担体に結合せしめた同相体として用い
てもよい。

このような固相体としては、不溶性担体と上記の抗体と
を、前述の多官能性試薬を用いて結合せしめたＴＧＦに
対する免疫結合活性を保持しているものであればよい。

また両者の結合において、不溶性担体および抗体のいず
れか一方または両方にあらかじめ任意のスペーサー導入
を行なってもよく、例えばスクシンアルデヒド、グルタ
ルアルデヒド、アジボアルデヒドなとのジアルデヒド化
合物、Ｗ−アミノ酪酸、Ｃ−アミノグルタミン酸の酸ク
ロライド、スクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニ
ルエステルなどの反応性誘導体、マロン酸、コハク酸、
グルタル酸、アジピン酸などのジカルボン酸化合物また
はその反応性誘導体、ヘキサメチレンジアミン、デカメ
チレンジアミンなどのジアミン化合物、３−（２’−ピ
リジル−ジチオ）プロピオン酸、３−＜２７−ベンゾチ
アゾリル−ジチオ）プロピオン酸などのチオカルボン酸
化合物またはその反応性誘導体、Ｓ−アセチルメルカブ
トザクシニノク・アンハライド、２−アミ／エタンチオ
ールなとのチオール化合物などのスペーザー導入試」ト
の１種または２種以トを用いて新たにアルデヒド基、カ
ルボキシル基、アミノ基、ヂオールノよなどの官能Ｊｉ
（を導入してもよく、次いでこの不溶性Ｊ１」体や抗体
の有するアミ７基、水酸基、カルボキシル基、チオール
ノ、ｔなどや、さらに導入された官能、！１ｔに基いて
、両者を結合し得る架橋試薬を用いて不溶性担体と抗体
の結合体が得られる。−ｉだ用いられる架橋試薬々して
は、アミ７基、水酸基、カルボキシル基、チオール基な
どの官能基と反応し得る基を二以」−有する多官能性試
薬であればよく、例えばスクシンアルデヒド、グルタル
アルデヒド、アジボアルテヒドなどのジアルデヒド化合
物、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸など
のジカルボン酸ｔたはその反応性誘導体、ヘギャメチレ
ンジイソシアナート、２　、４−１−ルエンジイソシア
ナートなどのジイソシアナート化合物、ヘギザメチレン
ジインチオシアナートなどのジイソチオシアナート化合
物、マレイミド安息香酸、マレイミドフェニル酢酸など
のマレイミドカルボン酸またはその反応性誘導体、Ｎ、
Ｎ−エチレンビスマレイミド、Ｎ、＊−ｏ−フェニレン
ジマレイミドなどのシマレイミド化合物、ビスジアゾベ
ンジジン、ジェヂルマロンイミデート、ジメチルアジピ
ンイミデート、Ｎ、＊−ポリメチレンビスヨードアセト
アミドや３−（２′〜ペンゾチアゾリルージヂオ）プロ
ピオン酸、３−（２′−ピリジル−ジチオ）プロピオン
酸などのチオカルボン酸化合物またはその反応性誘導体
、Ｎ−［２’−（２’−ピリジル−ジチオ）エチル〕−
３−（２’−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオンア
ミド、］−（］２’−ベンゾチアゾリルージチオ−２−
（２′−ビリジルージチオ）エタンなどのジチオ化合物
などが挙げられ、これらの多官能性試薬は、用いる不溶
性担体と抗体の結合に関与するアミン基、カルボキシル
基、アルデヒド基、水酸基、チオール基などの官能基を
考慮して選択使用すればよい。

さらに用いられる不溶性担体としては、用いる抗体１に
は多官能性試薬の官能基と反応し得る基を有していれば
よく、寸たは必要に応して前述の如くのスペーサー導入
試薬を用いて反応し得る基を導入せしめたものであれば
よく、例えばアルブミンやゼラチンなどの蛋白質の不溶
化したもの、アガロース、セルロースやデギストリンな
どの多糖１！ｉ　ノエピクロルヒドリン処理による不溶
化したものや臭化シアン処理およびアミ７基導入のため
のスペーサー導入試薬処理やチオール基導入のためのス
ペーサー導入試薬処理した不溶化したものなどの不溶性
半合成高分子系押体、アクリロニトリル、アクリル酸、
アクリル酸エステル、メタアクリル酸、メタアクリル酸
エステノペヒニルアルコール、酢酸ビニル、スチレン、
アミノスチレン、クロルスチレン、スルホスチレン、マ
レイン酸、フマル酸などのｉＲ合体捷たは共重合体など
の不溶性合成高分子系担体やケイ素やアルミニウムなど
の無機化合物のアミ７基を導入した不溶性無機糸１１」
体が挙げられる。これらの不溶性担体は、通常少なくと
もｌＴｉ過斤どの手段により容易に単離できる粒径のも
のがよく、例えば径１１ｔｍ以」−１好ましくは５ｍｍ
以上のものがよく、ビーズ状のものが繁用される。また
ビーズ状の代りに、免疫反応管の管底部の形状と相似し
た紡錘形の形状のものとして用いてもよい。このような
形状の不溶性担体としては、第５図、第６図、第７図、
第８図に例示される（特開昭５８−５６５７号公報参照
）。

詳しくは、第５図の符号ＩＫ不溶性担体が総括的に示し
である。不溶性担体１は、通常高分子樹脂材料からなり
、不溶性担体の本体２と該本体２の上面部２ａの中央部
に突出して設けられた取伺脚３とから構成されている。

取付脚３には、他の操作棒（図示せず）が取付けられる
。該本体２は紡錘形（弾丸状）に成型されていて、その
外径は反応管４の内径とわずか々隙間を保つ様な径に形
成される。また該本体２の下周面の頂部には突起５、好
ましくはクサビ状の突起が設けてあり、この突起５によ
り、該本体２の弧状外周面２　ｂと免疫反応管４との弧
状内周面４ａとの間に一定の間隙部６が保持されるもの
である。この突起部の高さとしては、該本体２と免疫反
応管４の管内壁面との幅七が同一となればよい。さらに
該本体２の上面部２ａには、第６図の如くの、取イ」脚
３を中心にした切り込み満８がイ」設しである。切り込
み溝８の終端は、該本体２の周縁部に開口させ、上面部
２ａの延長線上での反応液の表Ｗｉ張力を弱めるように
考慮しである。捷だ反応管の形状が異なる場合の変形例
として第７図を挙げるが、その構造を第５図と同Ｕくす
る部分には同じ番号を（＝Ｊしたもので、説明は省略す
る、つまん例示すれば、免疫反応に使用込れる試験管か
＋５Ｘ１０５ｍｍ（内径１２．８ｍｍ±Ｑ、　ｌ　ｍｍ
　）の場合、用イラレル不溶・〆ｌ（Ｊ：ｊＪ体として
は第８図に符号ＡないＬｌで示す各邪神法のものが使用
できる。すなわち、Ａ、半径５ｍｍの半球部、Ｂ：円柱
部の高さ］Ｑｍｍ、Ｃ：円錐状突起部の高さＱ、　４　
ｍ、ｒ＋＋、Ｄ°円錐状突起部の円錐の半径Ｑ、５　ｎ
１ｍ　、　Ｅ　：半径０．７５ｍｍの半円状溝、Ｆ　対
向する借問の中心部距離７．５ｍｍ、Ｇ・操作棒を挿着
するための凸部の１α径４ｍｍ、■＝操作棒挿着孔の直
径２ｍｍ、■：操作棒挿着のための凸部の高さ３ｍｍの
寸法にて示される円柱部、からなる高さ１０ｍｍ、直径
１２ｍｍ、半径６ｍｍの半球部からなる不溶性担体の本
体である。さらに免疫反応管の材質、例えば方ラスや合
成高分子材自体を不溶性担体として利用してもよいもの
である。次いでこのような不溶性Ｊｊ７体の反応し得る
基に基いてヒ）ＴＧＦ抗体を直接または多官能性試薬を
用いて結合せしめるのであるが、結合においては、通常
ＰＨ６〜８．５の緩衝液、有機溶媒またはこれらの混合
媒体中、０℃〜４０℃にて各々を反応せしめればよい。

また別の固相体を製造する方法としては、用いる不溶性
担体の多孔性の吸着能を利用して吸着固定化せしめても
よい。

さらに、このＴＧＦ抗体に対する特異的抗体、即ちこの
ＴＧＦ抗体産生の哺乳動物の免疫グロブリン分画を用い
て他種の哺乳動物、特に大型動物に免疫せしめて得られ
た第２抗体を用い、この第２抗体を不溶性担体に固定化
せしめ、次いでこれにとのＴＧＦ抗体を免疫的手段にて
結合せしめることによるＴＧＦ抗体の活性をほとんど失
活せしめることのない固定化手段によって同相体を得て
もよい。さらにこのようにして得られた両相体は、洗浄
、保存すればよい。

さらにまた］二記の同相体を用いる代りに、ＴＧＦ抗体
を可溶性の１寸で用いる場合には、被検液中のＴ　Ｇ　
Ｆの定１１）４反応におけるＴＧＦｊたはＲＩ標識ＴＧ
Ｆ七Ｔ　Ｇ　Ｆ抗体との結合体と未反応物とを分離する
に、ＴＧＦ抗体に対する特異的抗体が用いられる。この
特異的抗体は第２抗体とも呼ばれ、即ちＴＧＦ抗体産生
の哺乳動物の免疫グロブリン分画を抗原として用い、こ
れを公知の免疫手段に基いて、他種の１ｌｔｌｆ乳動物
、特に大型動物に皮下、皮肉に注射せしめて免疫し、そ
の血液から抗血清を得、さらに公知の精製手段により抗
体を得ればよく、この際通常抗血清の状態にて利用する
ことが簡便である。しかしまた、この第２抗体を常法に
より精製し、これを不溶性担体１テ固定化して第２抗体
の固相体として用いてもよい。

寸た本発明に用いられるＲＩ標識ＴＧＦにおいて、放射
性物質としては通常１２５■や１３１１が用いられ、一
般的には１２５Ｉが用いられる。またこれらのヨウ素を
ＴＧＦに結合せしめるには、例えば田つ素をＴＧＦの分
子内に直接的に結合せしめるクロラミン−Ｔ法による方
法や、ＴＧＦ分子にヨウ素付加したフェニル基を結合せ
しめる間接的なヨウ素の結合であるポルトン・ハンター
（Ｂｏｌｔｏｎ＆　Ｈｕｎｔｅｒ）法などの手段がよく
用いられる。特にクロラミン−Ｔ法ではヨウ素はヨウ化
すトリウムの形で用いられ、またポルトン・ハンター法
ではポルトン・ハンター試薬、例えば３−（４−ヒドロ
キシ−５−１：１２５Ｉ：ｌヨードフェニル）プロピオ
ン酸スクシンイミドエステルの形でよく用いられるもの
である。このようなＲ１を用いてＴＧＦを標識するに当
っては、上記のクロラミン−Ｔ法やポルトン・ハンター
法に基いて常法により行なえばよく、また反応終了後は
ゲル濾過などの精製手段によりＲＩ標識Ｔ　Ｇ　Ｆの精
製物を回収すればよい。さらにＲＩの標識手段としては
上記方法に限られず、公知の種々の方法によって標識し
てもよいものである。

次いで本発明を実施するに当って、１ず’１１’　Ｇ　
Ｆの含イＪ″！７；；　ｆ　ｌ′１ｉｌｌ定しようとす
る被検液、例えばヒトの尿４１Ｃハｌｎｌ？ｉ’７ノ５
０μｅ〜］、　ｍｌ、ＲＩ　標、ｉｌ’＆Ｔ　Ｇ　Ｆお
よびＴ　ＧＦ　Ｊ’ｔ’＋：休とを免疫反応媒体、例え
ばリン１ν甥饋？を粂やヘロナール緩術液］００ｚＪ〜
５１１ｆ中にて７１〜５℃にて約１５時間〜７２時間イ
ンキュベイトシて競争反１＋ｊ：ぜしめる。次いでこの
反応により免疫的に結合した部分、特にＲＩ標識ＴＧＦ
’−ＴＧＦ抗体の結合部（Ｂｏｎｄ　：　Ｂ　）と結合
していない未反応のｉｌ！ｆ離部分、Ｑ’、’Ｉ′に未
反応のＲ１標識ＴＧＦの遊離部（Ｆｒｅｅ：Ｆ）とを分
難するｋめにＢ−Ｆ分離を行なう。このＢ−Ｆ分離に当
って、用いるＴＧＦ抗体が固相体である同相法の場合に
は競争反ＩＩＬ、後円（・１旧本と反応液層とを′／ｉ
ｊ過などの手段にて分別し、洗浄後、同相体またはｆ１
液層のいずれか一力のＲ１標識ＴＧＦの放射能を測定す
ればよい。１ｋＢ−Ｆ分離に当っては、用いる抗体が可
溶性の１捷で第２抗体を用いる２抗体法の場合には競浄
反応後第２抗体、さらに好ましくはその第２抗体を含有
する抗＋ｎｔ清、必要に応じてＴＧＦ抗体作成に用いた
哺乳動物と同一種の動物の正常血清を加えて１〜１２時
間インキュベイトし、その後３０００　ｒｐｍ、１０〜
３０分間程度遠心分離して免疫反応によって結合し、沈
澱Ｌｒ＝部分（Ｂ）と上清（Ｆ）とを分別し、洗浄後沈
澱物寸たは上清のいずれか一方の放射能を測定すればよ
い。さらに」二記の免疫反応の結合部である固相体や沈
澱物、または未反応物を含む加液や上清の放射能の測定
に当っては、ガイガーミュラー計数管やシンチレーショ
ンカウンターなどの放射能カウンターにて行なえばよい
。

このようにして、ヒトＴ　Ｇ　、Ｆを用いて得られるＲ
１標識ＴＧＦ、およびＴＧＦ抗体を用いることにより、
極めて正確かつ簡便に被検液中のＴＧＦの定量をなし得
たもので、ガンの判定に有用に利用されるものである。

次いで本発明の実施例および参考例を挙げて具体的に述
べるが、本発明は何んらこれによって限定されるもので
はない。

実施例１ （１）抗ヒ）　Ｔ　Ｇ　Ｆ　Ｉｌ’ｌｌ　清ノ作ｆｆ１
ＴＧＦ（後述参考例」によって製造しなヒ）ＴＧＦ）０
．５”ｌ！？を生理食塩水ＣＬ５ｍｌに溶解し、これに
同１ｊＸのコンプリート・フロイント・アジュバントを
加え、充分に乳化混合した後、家ウサギの四肢指の戊申
および背中の皮下数ケ所に注射した。

２週問おきに同圧ｉの乳剤を６回皮下注射し、最終の免
疫より１０１１後にその全面を採取し、６０分間室温に
放置し凝ｆｉ！ＪＴせしめた後、３　’０００　ｒｐｍ
で１０分間遠心分離を行ないヒ）ＴＧＦ抗体含有抗血清
を得た。

（２）１２５■標識’１’　Ｇ　Ｆのクロラミントーチ
法による調製 ２ｍＣ１の放射ＦＷｉ性を右する１２５Ｉ−Ｎａ■を含
’４ｉ　スル０．５　Ｍ　’Ｊ　ン酸緩街液（ＰＨ７，
５）５０７ＪｉＣ１ＴＧＦを２μｇ含有する水溶液１０
パ１．」６よび０．３５％クロラミンＴ液２０μｅを加
えて３０秒間眠拌反応セＬ　メｌｔ後、０．４５％重亜
硫酸すトリウム液５゜ｔｔｅを加えて反応を停止させた
。次いで反応液に５％人１１’ｌｌＷ’５７　ル’７”
　ミン（ＨＳ　Ａ　）含有すル０．］Ｎ酢酸溶液５００
μｅを加えた後、セファテックスＧ−２５（１，ＯＸ５
０ｃｍ）のカラムに添加し、０．５％Ｈ５Ａを含有する
Ｏ、ＩＮ酢酸溶液で溶出せしめ、その素通り画分に１２
５Ｉ標識ＴＧＦを得た。

（３）　ヒ）ＴＧＦ抗血清の抗体価測定（１）で得られ
た抗血清を１０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液（、、Ｈ７，４）　
（０，２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％
アジ化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ。

０．９％ＮａＣｌ含有）−免疫反応用緩衝液−で、Ｊｏ
ｏ、１０００，１００００，１’０Ｏ０００倍に希釈し
、それぞれ１００μｅをＲＩＡ用ジオツギデユープに分
注し、これに１２５■標識ＴＧＦ液１００Ｉを加えて５
℃で１６時間反応せしめた。次いでラビット　１ｇ６１
２μゾ、抗ラビット　ＩｇＧヤギ血清を加えて３７℃で
２時間反応せしめ、生成する沈澱物を生理食塩水３ｒｎ
ｌを加えた後、３０００　ｒｐｍで１０分間遠心分離を
行ない回収し、沈澱物の放射活性を測定した。抗血清の
各希釈濃度における１２５１標識ＴＧＦとの免疫反応に
よる結合率を測定し、結果を第１図に宗した。

（４）　液相ＲＩＡによるＴＧＦの測定ＴＧＦを免疫反
応用緩衝液を用いて、１ｎ、１．あたり　１．２５，５
．０，２０，８０，３２０．　１２８０ｎｊ９の各濃度
に溶ｊγｒさせたものを標準ＴＧＦ液とした。ＲＩＡ用
シオノギチコーブに各ＴＧＦ標準液１００μｅ　、　＋
２Ｊ標識ＴＧＦ液１００μｌ、およびヒ１−ＴＧＦ抗１
１］［渭（７）　３０．０００倍希釈液１００ｄを加え
て５℃で１６１１ｊ間反応せしめた。次いで、ラビット
　Ｉ！／ＧＩ２μｙ１抗ラビッｌｉｇＧヤギ血清を加え
３７℃で２時間反応せしめ、生成する沈澱物を生理食塩
水３　ｍｌを加えた後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心
分離を行ない回収し沈ｊ９物の放射ｎ旨を４川シｆし／
こ。

結果は第２図に示す通りでル・す、本Ａｌ１Ｊ定系はき
わめて良好な定（１−）曲線を示すものであった。なお
被検液（血’ｈ′ｆ　＋尿等）中のＴ　Ｇ　Ｆ　：ｒ辻
を測定する場合は、標準ＴＧＦ液の代りに被検液］　０
０　ｌｉｌを加え、前記と同様の操作を行ない、定Ｅｔ
曲線と対照することにより被検液中のＴＧＦ濃度をめれ
ばよい。

実施例２ （１１ヒｌ−Ｔ　ＧＦ　Ｋ７Ｊするモノクロナール抗体
の作成 Ｔ　Ｇ　Ｆ　Ｉ　ｍ９を生理食塩水１　ｍｌに溶解し、
これに同量のコンプリート・フロイント・アジュバント
を加え充分に乳化混合した。乳化剤０．２ｍ１．をＢａ
１ｌ）／Ｃマウスの背中皮下数ケ所に注射した。１０目
隔に同様の方法で２回追加免疫を行ない、さらに２週間
後Ｔ　Ｇ　Ｆ　１００μｇを溶解させた生理食塩水０．
２−を静脈内投与を行なった。最終免疫後３１７１目に
マウスの肺臓を無菌的に取り出１．　、−ｊｊｉ細胞化
させ、混入した赤血球細胞は、０．８３％塩化アンモニ
ウム液で融解させた。この牌細胞の懸濁液を冷却したハ
ンクス液で数回洗滌後、別に培養調製したマウスミエロ
ーマ細胞（ｐｓ＝ＮＳ］／］−Ａｇ４−１）と３対１の
細胞量比で混合させた。遠心分離を行ない、得られた１
１す１細胞とミエローマ細胞のペレソｌ−に、予め３７
℃に加湿させた５０％ポリエチレングリコール］　００
０含ＭＲＰＭ　Ｉ培地】ｄを遠心管を回転させながら１
分かけてゆっくりと加えた。次いで３７℃で９０秒加湿
後、冷却Ｉしたハンクス液５ｄをゆっくり加え、さらに
冷ハンクス液を５　ｎｌｌ＋及び３０ｍ１とそれぞれお
だやかに加えた後、遠心分離を行ない得られたペレット
を］Ｏ％ウシ胎県ｌ］′Ｉ［清（Ｆｅ２）を含むＲＭＭ
Ｉ培地３　／Ｉ　ｍｌを加え細胞懸濁液としな。細胞懸
濁液を９６穴プレート（ムンク社製）に】００μｅづつ
分注し炭酸カスふらん器（９５％空気、５％ＣＯ２；湿
度３７℃、湿度１００％）に入れて培養を開！７Ａ　Ｌ
、Ｊ　Ｅｌ　後２倍濃度の１１ＡＴ培地（１００μＭヒ
ボキサンチン、］０４μＭアミノプテリン、１６、（Ｉ
　Ｍチミジン、１０％ＦＣ８を含有するＲＰＭＩ培地）
を１００濯添加しＨＡＴ選択培養を開始し、その後１〜
３［］間隔で培地の半分量をＨＡ　Ｔ培地と交換した。

７〜１４日後にハイブリドーマの生育してき／こウェル
の培養」１清を採取し、抗体価の高いものを５コ選ん／
こ。次にフィーダーセルとしてＢａ１ｂ／ｃの胸腺細胞
を用い、限界格釈法によりクローニングを行ない、２５
コのモノクナール抗体産生細胞を分取した。その中で最
も高い抗体価を示したＮｏ、　］　５のハイブリドーマ
を用い、９６穴ウエルから２４穴ウエル、それから５０
ｍ１の培養とスケールアップしていき、約１０００ｎｚ
ｌの”ｉｒ養上清を取得し、これをヒ）ＴＧＦモノクロ
ナール抗体溶液として用いた。

（２）　ヒ）ＴＧＦモノクロナール抗体の抗体価測定培
養上液を免疫反応用緩衝液で、１．０　、１００．１０
００，１０，０００倍に希釈した液１００μｅを反応小
試験管に加え、次いで１２５Ｉ標識ＴＧＦ液を加えて、
５℃で１６時間反応させた。これに正常マウス血清の１
００倍希釈液１００μ４、および抗マウスＩｇＧラビッ
ト血清１００μ４を加えて、３７℃で１時間反応せしめ
、生成する沈澱物を３−の生理食塩水を加えた後、３０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行ない回収し、沈澱物
の放射能を測定した。Ｎｏ、　１５のハイブリドーマの
培養」１清は、約４０００倍の希釈濃度で＋５１標識Ｔ
ＧＦの５０６と結合した。

（３）固相ＲＴＡによるＴＧＦの測定 １）ヒトＴＧＦ抗体固定化担体の作製 前記（２）で得られたヒトＴＧＦモノクロナール抗体を
含有する培養１−渭より、硫安分画、ＤＥＡ　Ｅ　−セ
ルＩＪ−スクロマトグラフイーヲ行ナイ精製したモノク
［ｊナール抗体０．　］　７ｎ９を１００ｍＭ　１１ン
酸緩衝液（、、Ｈ８，Ｏ）に溶解させた液２０、ｎＡに
、ポリスチレン糸ビーズ（漬水化学社製。

オＩソ径５．３５　ｎｕｎ　）　］　００粒を加え、５
℃で１６１１．５間、３７℃で１時間反１ｉｉｊ＋　ａ
ぜ抗体をビーズに固定化せしめた。ビーズは生理食塩水
で充分洗滌後、免疫反１＋ｕ：川緩種Ｊ液中に浸漬し、
５℃で保存し固相体とした。

２　）　Ｍｉｔｌ　’ｊニン去 反に；用小試ｉ：／ｉ：　（ジオツギチューブ）に免疫
反応用緩衝液２００μＣ７標準ＴＧＦ液（１，２５〜＋
２８Ｏｎ！ｉ’／ｙ＋＋Ａ　）１００μ６　、及び１２
５Ｉ標識ＴＧＦ？ｆ’ｉ、　］　００　ｐ（！を加え、
これに手記の固相体を１わＩＩＪｌｌえ、５°Ｃで４０
０時間反応しめた。反応路ｒ後、生理食塩水２　ｍｌを
加え攪拌洗滌後、洗液をアスピレータ−で吸引除却した
。この操作を２回くり返し行なつ／こ後、ビーズを新し
いチューブに移しその放射能を測定した。

結果は第３図に示す通りであり、本測定系はきわめて良
好な定量曲線を示すものであった。

なお、被検液（血清・尿等）中のＴＧＦ量を測定する場
合は、標準ＴＧＦ液の代りに被検液１００μｅを加え、
前記と同様の操作を行ない定量曲線と対照することによ
り被検液中のＴＧＦ濃度をめられる。

実施例３ （１）　ヒ）ＴＧＦに対するモノクロナール抗体の作成 実施例２と同様の方法で作成した。

（２）　ヒトＴＧＦモノクロナール抗体の抗体価測定実
施例２と同じ方法で測定した。

（３）　抗マウスＩｇＧ血清の作成 りａｌｂ／ｃマウス１００匹より採血調製した血清５０
ｒｎｌより、通常の硫安分画、およびＤＥＡＥ−セルロ
ースクロマトグラフを行ないマウスＩｇＧ両分を調製し
た。マウスガンマＩｇＧ５ｍｙを含む生理食塩水１．ｎ
ｌに、同量のコンプリート・フロイント・アジュバント
を加え、充分に乳化混合しに後、家つ−リ゛ギの四肢指
の戊申、および背中の皮下数ケ所にｌ）：射した。２週
問おきに同）１）の乳剤を６回度丁ｔ］：射し、最終の
免疫より１０［１後にその全＋ｎｔを採１１ｖＬ−１６
０分間室温に放置し凝固せＬ？ｈた後、３０００ｒｐｍ
て１０分間遠心分郊を行ないマウスＩｇＧ抗体含有抗血
清を？！Ｊｉｃ　。

（４）固相ＲＩＡによるＴＧＦの測定 １）ヒｌ−Ｔ　Ｇ　Ｆ抗体固定化１「１体の作製ポリス
チレン系不溶性担体（第８図記載の形状を示す）をスギ
ットＸＮで洗滌後、抗マウス１９　Ｇ　ウサキ、ｌｌ’
ｌｌ清ノＩ　ＱＧ　１ｉｊｊｉ分３２　Ｉｔ！　ヲ含イ
ｉスる］００ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ８，０）　０．４
　ｍｌを含む小試験管１５×１０５ｍｍ（内径１２．８
ｍｍ十０．４　ｍｍ　）に−１−記の不溶性担体を挿入
し、５℃にて１６時間反応式ぜ、この不溶性Ｊ１・１体
１個あたり８．６／ｌ！９のＩｇＧを固定化せしめた同
相体を７ＩＩた。次いで固相体を生理食塩水で充分洗滌
後、ヒトＴＧＦモノクロナール抗体０．０８μ９を含イ
ｆする免疫反１ノＬ、用緩衝液０．４　ｍｌを含む小試
験管（前述）に挿入し、５℃で４００時間反応せ、不溶
性担体−マウスＩｇＧ抗体−ヒ）ＴＧＧモノクロナール
抗体結合物を作製し、との固相体は生理食塩水で充分に
洗滌後免疫反応用緩衝液中に浸漬し、５℃で保存しヒ）
ＴＧＦ抗体固定化担体の固相体とした。

２）測定法 小試験管（前述）Ｋ免疫反応用緩衝、液１００Ｉ、標準
ＴＧＦ液（Ｌ２５〜１２８０　ｎｇ　／ｍｌ　）１００
、Ｊ、および　Ｉ標識ＴＧＦ液］　００４　ヲ加え、３
７℃で４時間反応せしめた。反応終了後、生理食塩水５
ｍｌを加え、同相体を洗滌しなから引き抜き、この同相
体を新しい小試験管に加えて放射活性を測定した。

結果は第４図に示す通りであり、本測定系はきわめて良
好な定量曲線を示すものであった。

なお、被検液（血清・尿等）中のＴＧＦ計を測定する場
合は、標準ＴＧＦ液の代りに被検液１００μｅを加え、
前記と同様の操作を行ない定量曲線と対照することによ
り被検液中のＴＧＦ濃度がめられる。

Ｊ、に以下ｆｆＴＧＦの製造例を拳げるか、何んらこれ
に限定されるものではなく、例えば特願昭５８−６１　
］　０２　チ明細ｄ）に記載の方法によってＴＧＦを製
造１−１これを用いてもよい。

参考例１ 肺カン患者尿１．ＪＯＯｍｌを０．０］Ｍリン酸緩衝’
ｌ（１（ＰＨ８，０）　ＶＣ対し分子ｆ１カ’７ト１０
，０００の透析膜（三光純檗佳製）を用いて４℃で２昼
夜透析を１」″なった。透析内液は１２，０００Ｘｇに
て６０分間遠心分陣し、沈澱を除く。ｓｐ−セファデッ
クス（ファルマシャ、ジャパン社製）をカラム（容ｉ”
Ｊ　４．５ｃｍＸ　３３ｃｍ　）に詰め、０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液（ＰＨ８，０）で平衡化した後、上記透析内
液を流ドし、有効成分を吸着させた後、同緩衝液で充分
洗浄し、ついで同緩衝液中、塩化す）　ＩＪウム０゜０
１Ｍ〜１．５Ｍの傾針溶出を行なった。（流速２２．５
ｍ１１時、ン湿度４℃、塩化すトリウム傾斜濃度緩衝液
４．８ｅ使用）。ＴＧＦは同緩衝液中、塩化すトリウム
濃度０．６〜１、ＯＭの位置に溶出され、活性分画６２
．０ｍＡを得た。本活性分画は後記のＴＧＦ活性試験法
において、５μｌで正常細胞は変質されコロニーを形成
した。本活性分画全量をダイヤフロー分子篩膜ｐ　Ｍ−
１０（アミコン、ファーイースト、リミテッド社製（日
本））を用いて脱塩、濃縮をくり返し、１．２ｒｎｌと
し、これにトリフロロ酢酸を加えて０．０５％トリフロ
ロ酢酸溶液とした。

アルキルＭ（Ｃ１８）を結合させたシリカゲルを担体と
するシンクロパックＲＰ−Ｐ（ジンクローム社製）をカ
ラム（容量４．１　ｍｍＸ　２５０　ｍｍ）に詰め０，
０５％トリフロロ酢酸で平衡化し、とのカラム１本に上
記ＴＧＦ、トリフロロ酢酸溶液の１／３を流し吸着後０
．０５％トリフロロ酢酸水テ洗浄した後、同液中０〜９
０％アセトニトリルの傾斜溶出を行ないアセトニトリル
濃度５５〜７５％位置に溶出される活性分画をとる。以
」二の操作を３回行ない前記の分子篩膜による濃縮調整
液全量を処理しＴＧＦ活性分画７．９ｒｎｌを分取した
。本分画を凍結乾燥後、再び３゜０献の生理食塩水に溶
解し、この溶液をＴＧＦ試験法にかけ０．４□ｌで正常
細胞は変質されコロニー形成能を示した。

第　１　表 材料 ＋１．ｌ　Ｎ　ＲＫ−細胞（株４９Ｆ）（２）５％牛脂
児血清及び１％非不ｒ、ｉｌ’欠アミノ酸添加タルベソ
コ変法イーグル培地 （３）精製寒天（Ａｇａｒ　Ｎｏｂｌｅ、　Ｄｉｆｃｏ
礼製）（４）　直径（３Ｑｍｍのべ１・り皿 操作 ０．５％寒天含有の（１）の培地をぺ１・り皿一枚に５
ｍ、ｅずつ注加して下層培地にする。

この−トにＮ　ＲＫ細胞Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ”個／　ｍｌを
含む０．３％寒天含有培地をぺ）　ＩＪ皿一枚に２ｍｌ
ずつ層積し上層培地とし、この上に龜５ｒｎｌの生理食
塩水に溶解した試料を加え、炭酸ガスインキュベーク−
中に３７℃で培養する、１４日後に培養器から取り出し
、４０倍のケンビ鏡でぺ１・り皿上の２ｍｍ×２ｍ　ｎ
＋視野を１０ケ所を無作為にえらび、細胞数１０個以上
よりなるコロニーの数をかぞえその総数を成績とする。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたＴＧＦ抗血清の抗体力価測
定曲線を示し、第２図は液相ＲＩＡによるＴＧＦの定量
曲線を示し、第３図および第４図は固相ＲＩＡによるＴ
ＧＦの定量曲線を示し、第５図は固相ＲＩＡに用いられ
る不溶性担体の拡大部分断面図、第６図はその平面図、
第７図は不溶性担体の変形例の拡大部分断面図、第８図
は実施例３で用いる不溶性担体の実測図を示す。 第１図 Ａｎｔｉ−ＴＧＦ　（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ）第２図 ＴＧＦ　（ｎｇ／ｍｌ） 第３図 ＴＧＦ　（ｎｇ／ｍｌ　） 第４図 Ｔ　Ｇ　Ｆ　（ｎｇ／ｍｌ　） 第５図 第６ＦｉＩ 第７図 第８図 手続補正Ｔｌ４（自発） 昭和５８年８月’７　Ｅｌ １、事件の表示 昭和５８年特許願第１２２８８８−リ ２、発明の名称 トランスホーミンググロスファクターの定量方法 ３、補正をする者 事件との関係　１゛Ｊ「許出願人 ３丁目４番２０−じ・ 名　称　１」本ケミカルリサーチ株式会社４、代理人 氏名　（６２４９）行内　卓−ぐ−、・−パ狸１ 電話大阪（０６）２０２−５８５８番（代表）５、補正
命令の１：１イｑ　（自発） ６、Ｍｌｉ＋Ｅにより増加する発明の数　０７、補正の
対象 ｔす１細書の「特許請求の範囲の欄−１および［発明の
詳細な説明の檜（」 ８、補正の内容 （１）１寺言１言青求の範囲　別刑Ｅ　ａ）とおり（２
）明細書第４頁第９行末尾の「主」を「重−１に訂正す
る。 同第５百下から４行目の「放射性同位元素標品の畢」を
ＪＲＩ標識ｌりに訂正する。 同第］２頁第６行の［、ＰＳＪをＦ　Ｐ　３　Ｊ　Ｋ３
丁１１：、する。 同第２１頁末行の「放射性物質」を［Ｒｒｊ　Ｋ訂正す
る。 同第２５頁第１２行の１−フロラミント−す」をＬクロ
ラミン−Ｔ雪にニア１正する。 同第２６頁下カ・ら３行「１のＵ対油ｔ４１Ｆ、Ｊを１
射能ＪＫε汀正する。 同第２８頁第６行末のｌ−１Ｏｒ；１〜（の次に１間」
を仲人し、同頁−１匂・ら７行１］の（”　Ｐ　Ｓ　Ｊ
をｒｐ３ゴに訂正する。 同第２９貫第４行末尾の１’　ＲＭ　Ｍ　Ｊを１ＲＰＭ
Ｊに訂正する。 同第３２頁下から３行１」の１カンマ−１を削除する。 同第３４頁下から８行目、「加えて」の次に１−その」
を挿入し、［活性」を［−能」Ｋン）１正する。 以　七 １°＋Ｉ′ｉｔ’１３１−ｉ求−の範囲（（］）被検液
に、放射性同位元素標識トランスホーミンググロスファ
クターと、トランスフォーミンググロスファクター抗体
とを反応せしめ、次いで放射性同位元素標識トランスホ
ーミンググロスファクター−トランスホーミンググロス
ファクター抗体結合体と未反応放射性同位元素標識トラ
ンスホーミンググロスファクターとを分離し１その後分
離１−だいずれか一方の放射性同位元素標識体を定」ｊ
ｊすることを特徴とする被検液中のトランスホーミング
グロスファクターの定量方法。 （２）トランスホーミンググロスファクター抗体が、不
溶性担体に固定化されたトランスホーミンググロスファ
クター抗体である特許請求の範囲第１項記・１＆の定’
ｍ方法。 （３）トランスホーミンググロスファクター抗体カ１月
溶性であり、分離においてトランスホーミンググロスフ
ァクター抗体に対する特異的抗体を用いてなる１４ｊ、
ｌｊ当請求の範囲第１項記戦の定量方法。 （４）トランスホーミンググロスファクターが、ヒトト
ランスホーミンググロスファクターである１１３１：請
求の範囲第１項記載の定量方法。 （５）トランスホーミンググロスファクター抗体か、モ
ノクロナール抗体である特許請求の範囲第１項記載の定
量方法。 （６）放射性同位元素がｔ２ｓＩ（及び１３１１）であ
る’ｌ’ｓｉ許請求の範囲第１項記載の定ｌｉｔ方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）被検液に、放射性同位元素標識トランスホーミン
   ググロスファクターと、トランスフォーミンググロスフ
   ァクター抗体とを反応せしめ、次いで放射性同位元素標
   識トランスポーミンググロスファクターートランスポー
   ミンググロスファクター抗体結合体と未反応放射性同位
   元素標１熾トランスホーミンググロスファクターとを分
   離し、その後分離したいずれか一方の放射性同位元素標
   識の量を定置することを特徴とする被検液中のトランス
   ホーミンググロスファクターの定置方法。 ＋２＋　１−ランスホーミンググロスファクター抗体が
   、不溶性担体に固定化されたトランスホーミンググロス
   ファクター抗体である特許請求の範囲第１項記載の定１
   ｉ１方法。 （３）　）ランスホーミンググロスファクター抗体が可
   溶性であり、分離においてトランスホーミンググロスフ
   ァクター抗体に対する特異的抗体を用いてなる特許請求
   の範囲第１項記載の定量方法。 （４）トランスホーミンググロスファクターが、ヒトト
   ランスホーミンググロスファクターである特許請求の範
   囲第１項記載の定置方法。 （５）トランスフーミンググロスファクター抗体が、モ
   ノクロナール抗体である特許請求の範囲第１項記載の定
   置方法。 （６）放射性同位元素が＋２５Ｉ（及び＋３＋１）であ
   る特許請求の範囲第１項記載の定量方法。