FI104253B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidibombesiiniantagonistien valmistamiseksi - Google Patents

Description

104253

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidi-bombesiiniantagonistien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uusia peptidejä, jotka vaikuttavat ih-5 misten syöpäkasvainten kasvuun. Etenkin tämä keksintö koskee bombesiiniantagonisteja, jotka ovat [^-pseudo] -nonapeptide-jä, jotka sisältävät D- tai L-tryptofaanin tai tryptofaani-analogin, 2,3,4,8-tetrahydro-lH-pyrido[3,4-b]indoli-3-karbok-syylihapon (Tpi) N- tai/ja C-päässä ja joilla on antagonisti-10 ominaisuuksia bombesiinin tai bombesiinin kaltaisten pepti dien suhteen, niiden suoloja ja farmaseuttisia koostumuksia ja käyttömenetelmiä, joissa käytetään näitä peptidejä.

Tämä keksintö koskee polypeptidiyhdisteitä, joilla on anta-15 gonistiominaisuuksia bombesiinin tai bombesiinin kaltaisten peptidien, kuten gastriinia vapauttavan peptidin (GRP), neu-romediini C:n ja vastaavien suhteen, joita ominaisuuksia kutsutaan tämän jälkeen bombesiiniantagonistiominaisuuksiksi ja jotka ovat arvokkaita, esimerkiksi hoidettaessa lämminve-20 risten, kuten ihmisen pahanlaatuista sairautta. Keksintö käsittää uudet polypeptidiyhdisteet ja menetelmät niiden valmistamiseksi, näitä polypeptidiyhdisteitä sisältävät uudet farmaseuttiset valmisteet ja menetelmät niitä sisältävien «Il : ,·. lääkeaineiden valmistamiseksi bombesiiniantagonistivaikutuk- "V 25 sen aikaansaamiseksi lämminverisissä eläimissä, kuten ihmi- sessä.

• · · • · • · · • · · • ;1 Bombesiini on tetradekapeptidiamidi, joka on eristetty ensik- • · · *·1 1 si Bombina-bombina-sammakon ihosta (Anastasi, Erspamer ja 30 Bucci, Experientia. 1971, J27, 166) . On tunnettua, että bom- • · .·,·,· besiini on hiiren Swiss 3T3-fibroblastisolujen merkittävä mitogeeni (Rozengurt ja Sinnett-Smith, Proc. Natl. Acad. Sei.

. \-m USA, 1983, .80, 2936) ja että se stimuloi amylaasin erittymis- « · · *!!.1 tä marsun haiman rauhasrakkuloista (Jensen, Jones, Folkers ja I · 35 Gardner, Nature, 1984, 309. 61). Samoin on tunnettua, että « · *·,:/· ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC) solut tuottavat ja ·;··: erittävät bombesiinin kaltaisia peptidejä (Moody, Pert, Gaz- dar, Carney ja Minna, Science. 1981, 214. 1246), että ulkoisesti lisätyt bombesiinin kaltaiset peptidit voivat stimuloi- 104253 2 da ihmisen SCLC-solujen kasvua in vitro (Carney, Cuttita, Moody ja Minna, Cancer Research, 1987, 47, 821) ja että bom-besiinin C-pääalueen ja GRP:n suhteen spesifinen monoklonaa-linen vasta-aine voi estää GRP:n sitoutumisen sen reseptorei-5 hin ja estää ihmisen SCLC-solujen kasvun sekä in vitro että in vivo (Cuttita, Carney, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler ja Minna, Nature. 1985, 316. 823) .

GRP, jolla on bombesiinin kaltaisia ominaisuuksia, on sian 10 suolesta eristetty laajalti jakautunut peptidiamidi, joka sisältää 27 aminohappoa (McDonald, Jornvall, Nilsson, Vagne, Ghatei, Bloom ja Mutt, Biochem. Bioohvs. Res. Commun.. 1979, 90, 227) ja jossa C-pään aminohapposekvenssi on lähes identtinen bombesiinin vastaavan sekvenssin kanssa. Neuromediini C 15 on dekapeptidiamidi, jonka rakenne on identtinen GRP:n C-pään alueen kymmenen viimeisen aminohapon kanssa ja joka on eristetty kaniinin ohutsuolesta (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke ja Shively, J. Biol. Chem.. 1983, 258. 5582). GRP stimuloi useita biologisia reaktioita, kuten gastriinin vapautumista 20 systeemisessä kierrossa. Se toimii myös kasvutekijänä hiiren 3T3-fibroblasteissa ja pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC) soluissa. Siten on ehdotettu, että GRP:llä on suora patofysi-ologinen merkitys SCLC:n kehityksessä autokriinisessä kasvu- mekanismissa.

.:.25 .·. : Bombesiinin, neuromediini C:n ja GRP:n karboksyylipään nona- • · · ··,/ peptidin rakenteet on esitetty alla: • · • · • « m • · « • bombesiini: pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- 30 Leu-Met-NH2, ·· · ' ·* neuromediini C: H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met- « GRP:n C-pään nonapeptidi: -Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- ."·! Met-NH2.

Λ 35 • · · *·’·* Muiden sammakkoeläinten bombesiinin kaltaisten peptidien 4 4 tutkimus on johtanut litoriinin, nonapeptidin (pGlu-Gln-Trp- 3 104253

Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2) eristämiseen Papuasta, Uudesta-Guineasta peräisin olevan sammakon ihosta, joka peptidi osoittautuu tehokkaimmaksi bombesiiniksi (Yasukara et ai., Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, 492). Bombesiinianalogeilla 5 suoritetut tutkimukset ovat osoittaneet, että 9 aminohappo tähteen vähimmäissegmentillä bombesiinin 6-14-asemassa on bombesiiniaktiivisuuden täysi kirjo.

Nykyisin tunnetaan useita bombesiiniantagonistityyppejä. Aine 10 P (Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2) , jolla on vähäinen aminohapposekvenssihomologia bombesiinin kanssa, ei inhiboi bombesiinin ja bombesiinin kaltaisten peptidien sitoutumista, mutta aine P-analogien, jotka on muunnettu korvaamalla useita L-aminohappoja D-aminohapoilla, kuten (D-15 Arg1, D - Pro2, D-Trp7·9, Leu11) -aine P ja (D-Arg1, D-Phes,D-

Trp7·9,Leu11)-aine P (Moody et ai., Fed. Proceedings, 1987, 46. 2201), on todettu estävän bombesiinin erittymisen haiman rakkulasoluissa ja antagonisoivan bombesiinin kasvua edistäviä vaikutuksia Swiss 3T3-soluissa. Kaksi bombesiinista joh-20 dettua bombesiiniantagonistityyppiä, esimerkiksi (D-Phe6,D-

Phe12)-bombesiini ja rLeu13-psi-Leu141 -bombesiini (Coy et ai., J. Biol. Chem. . 1988, 263. 5056 ja Peptides, 1989, 10i, 587) • · : '·· ovat osoittautuneet tehokkaiksi bombesiinireaktion in vitro- • · : ·' : ia in vivo-inhibiittoreiksi .

• ( « w 1 1 " ••25 · · « :*·.· Eräs toinen bombesiiniantagonistin tyyppi, jonka ovat esittä- • · ;·.·. neet Heimbrook et ai. (J. Biol. Chem. . 1989, 264. 11258), on • « N-asetyyli-GRP(20-26) ja sen analogit, joissa C-pään me- * « · tioniinitähde on jätetty pois GRP(20-27)-analogeista. Hiljat- .. . 30 tain on esitetty (Coy, J. Biol. Chem.. 1989, 264. 14691), • · · *<t;’ että joillakin lyhytketjuisilla bombesiiniantagonisteilla, • · · ’·" ’ jotka perustuvat litoriinisekvenssiin, kuten [D-Phe6, Leu13- : psi-Phe14] -bombesiini- (6-14) ja fD-Phe6.Leu13-psi-Leu141 -bom- • · · · besiini-(6-14), on paljon enemmän tehoa kuin niiden vastaa-35 valla kantapeptidillä, [Leu13-psj.-Leu14]-bombesiinilla.

φ · · 104253 4

Esillä oleva keksintö saa aikaan patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosan mukaisen menetelmän terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttvien happojen kanssa muodostettujen suolojen 5 valmistamiseksi.

Seuraavassa tarkastellaan lähemmin pseudopeptidejä ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happojen kanssa muodostettuja suoloja, jotka käsittävät kaavan I

10 X-A1-A2-A3-A4-A5 - A6-A7-A8-PS i-A9-O mukaisen nonapeptidiosan, jossa Q on NH2 tai OQ1, jossa Q1 on vety, CM0-alkyyli, fenyyli tai 15 C7.1Q-fenyylialkyyli, X on vety tai yksinkertainen sidos, joka yhdistää A* :n alfa-aminoryhmän A2:n mahdolliseen sivuketjukarboksyyliin, tai kaavan R!CO- mukainen ryhmä, jossa Rl on (a) vety, Cj.^-alkyyli, fenyyli tai C7_I0-fenyylialkyyli, 20 (b) R2 >N-CO- R3 jossa R2 on vety, Cj.10-alkyyli, fenyyli tai C7_10-f enyylialkyy-; , li, R3 on vety tai CM0-alkyyli, tai '*/ 25 (c) R4-0- , jossa R4 on C[.I0-alkyyli, fenyyli tai C7-10-fenyyli- ·' ··· alkyyli, • · A1 on D-, L- tai DL-pGlu, -Nai, -Phe, -Thi, -Tyr, -Tpi, -Hca, i · · • V -Hpp, -Mpp, -Trp tai -Trp, joka on substituoitu bentseeniren- • · · \'i : kaassa yhdellä tai useammalla jäsenellä, joita ovat halogee- 30 ni, N02, NH2, OH, C^-alkyyli tai C^-alkoksi, jolloin halo- ;*;‘j geeninä on fluori, kloori tai bromi, A2 on Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) tai kaavan « · · ^ • t Asp(Y), Glu[-] tai Glu(Y) mukainen ryhmä, jossa 35 R6 « Y on -OR5 tai -N< , jossa .···. R7 • · i 5 104253 R5 on vety, C,.3-alkyyli tai fenyyli, R6 on vety tai C^-alkyyli, R7 on vety, C,.3-alkyyli tai -NHCONH2, ja [-] on yksinkertainen sidos, joka liittää sivukarboksyyli-5 ryhmän tähteen A1 alfa-aminoryhmään, jolloin X on yksinker tainen sidos, A3 on Nai, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) tai Trp, joka on substituoitu bentseenirenkaassa yhdellä tai useammalla jäsenellä, joita ovat halogeeni, N02, NH2, OH, C,.3-alkyyli tai C,.3-10 alkoksi, jolloin halogeenina on fluori, kloori tai bromi, A4 on Ala, MeAla tai Gin, A5 on Vai tai MeVal, A6 on Gly, Phe tai D-Ala, A7 on His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) tai Pal, 15 A8 on tähteen Leu tai Phe pelkistetty isosteeri, A9 on Leu, Phe, Tpi, Trp tai Trp, joka on substituoitu bentseenirenkaassa yhdellä tai useammalla jäsenellä, joita ovat halogeeni, N02, NH2, OH, C1.3-alkyyli tai C,.3-alkoksi, jolloin halogeenina on fluori, kloori tai bromi, edellyttäen kuiten-20 kin, että A1 tai A9 on D-, L- tai DL-Tpi,

Keksinnön mukaan valmistetaan tällöin kaavan I mukaisia polypeptidejä, joissa A1 merkitsee tähdettä Mpp, D-Phe, L-tai D-Tpi, D-Trp tai Trp, joka on substituoitu bentseeni-* 25 renkaassa yhdellä tai useammalla substituentilla, joka on halogeeni, N02, NH2, OH, Cj-a-alkyyli tai C^-alkoksi, jolloin halogeeni on fluori, kloori tai bromi, ja A9 on D-, L- tai » · *.· DL-Tpi-tähde.

»·· « · • · 30 Tämän keksinnön selityksen helpottamiseksi käytetään amino- .*·*: happojen, peptidien ja niiden johdannaisten tavanomaisia lyhenteitä, jotka ovat yleisesti peptidikemiassa hyväksyttyjä • · ja joita on suositellut IUPAC-IUB Commission on Biochemical

Nomenclature [European J. Biochem.. 1984, 138. 9-37].

35 ιΥ; Yksittäisten aminohappotähteiden lyhenteet perustuvat amino- » hapon triviaalinimeen, esim. Trp on tryptofaani, Gin on glu- * ( a 104253 6 tamiini, His on histidiini, Ala on alaniini, Vai on väliini, Gly on glysiini, Leu on leusiini, Phe on fenyylialaniini. Silloin, kun aminohappotähteellä on isomeerinen muoto, se on aminohapon L-muoto, joka esitetään, mikäli toisin ei ole 5 esitetty, laittamalla aminohapposymbolin eteen D- tai DL-.

Tässä keksinnössä käytettyjen epätavallisten aminohappojen lyhenteet ovat seuraavat: 10 Dpa on 2,3-diaminopropionihappo,

Nai on 3-(2-naftyyli)-alaniini,

Thi on j8-2'-tienyylialaniini,

Tpi on 2,3,4,9-tetrahydro-lH-pyrido[3,4-b]indoli-3-karboksyy-lihappo.

15

Peptidisekvenssit kirjoitetaan yleisen tavan mukaisesti, jolloin N-pään aminohappo on vasemmalla ja C-pään aminohappo on oikealla.

20 Hca on hydrokanelihappo,

Hna on 3-hydroksi-2-naftoehappo,

Hpp on 3-(4-hydroksifenyyli)propionihappo,

Mpp on 3-(4-metoksifenyyli) propionihappo, I ;'; Paa on fenyylietikkahappo.

• :25 t * · · · .·. ; Muita käytettyjä lyhenteitä ovat: • · · • · • · · • · · • · AC = asyyli • · « **’ * Ac = asetyyli 30 AcOH = etikkahappo • · · : V BOC = tert-butoksikarbonyyli ♦ ·· : (B0C)20 = di-tert-butwlidikarbonaatti ♦ : BHA = bentshydryyliamiini .···. Bzl = bentsyyli ^35 BSA = naudan seerumialbumiini V.· DIC = 1,3-di-isopropyylikarbodi-imidi DMEM = Dulbecco's modified Eagle's medium 7 104253

Et = etyyli EDTA = etyleenidiamiini-tetraetikkahappo FCBS = fetaalisen vasikan seerumi FMOC = 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli 5 For = formyyli HITES RPMI 16 4D-alusta plus 10'8 M hydrokortisonia, 5 μΐ/ml naudan insuliinia, 10 ^g/ml ihmisen transferriiniä, ΙΟ"8 M β-estradiolia ja 3 x 10'8 M Na2Se03:a HOBt = 1-hydroksibentsotriatsoli 10 HPLC = korkeapainenestekromatografia

Me = metyyli MeCN = asetonitriili MeOH = metyylialkoholi TEA = trietyyliamiini 15 PBS = fosfaattipuskuroitu suolaliuos PGlu = pyroglutamiinihappo psi = CH2-NH-pseudopeptidisidos paitsi silloin, kun seuraa-vassa tähteessä on sekundaarinen N-pää, jolloin se on CH2N TFA = trifluorietikkahappo 20 Z = bentsyylioksikarbonyyli

Edullisia polypeptidejä ovat seuraavat (eräitä peptidejä käytetään vertailuesimerkkeinä aktiivisuuskokeissa): :··/ 25 Pep- Rakenne ·'··· tidi *: n:o < · · ; 1. NH-)-CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH7 · 2. D-Trp-Gln-TrP-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Leu-NH, 30 3. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH7 ·/·*; 4. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH7 5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Leu-NH7 * . 6. D-Tpi-Glu(MeOH)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH7 a a a a a 7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH7 '··” 35 8. D-Tpi-His (Bz) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH7 9. NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Esi-Phe-NH2 10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH, «· 104253 8 11. D-Trp-Glu (MeNH) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH-> 12. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Phe-Ntk 13. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Phe-NH? 14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NH·, 5 15. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpj-NH·, 16. Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH·' 17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH-; 18. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-PSi-Tpi-NH7 19 . D-Trp-His (Bz) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH·, 10 20. D-Trp-Glu (MeNH) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH·) 21. D-Trp-Glu (OMe) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH·, 22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH-> 23. Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpj-NH, 24. NHnCO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH-.

15 25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH7 26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH-, 27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH; 28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Trp-NH7 29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2 20 30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH7 31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 32. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 33. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-ΝΗ7 . 34. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp (For) -NH7 ,:, 25 35. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-OMe 36. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe I.* 37. NH:CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-OMe « · l#>*’ 38. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHMe • · 39. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OH 30 40. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpj-N7H7CONH7 • · · • · • · * * * '/· : Erityisen edullisia keksinnön mukaisia polypeptidejä ovat ____: peptidit 17, 18, 22, 26 ja 38.

35 PQLYPEPTIDIEN SYNTEESI

9 104253 Tämän keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan valmistaa millä tahansa peptidialan ammattihenkilön tuntemalla tekniikalla. Käytettävissä olevien tekniikkojen tiivistelmä on esitetty julkaisussa M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, 5 Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.

Yksinomaan kiinteäfaasisen synteesin tekniikkoja on esitetty oppikirjassa J. M. Stewart ja J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2. pai-10 nos) ja yleiskatsauksessa, jonka ovat esittäneet G. Barany, et ai. julkaisussa Int. J. Peptide Protein Res., 3£, 705 -739, 1987.

Eräs erityisen edullinen menetelmä tämän keksinnön mukaisten 15 polypeptidien ja niiden välituotepeptidien valmistamiseksi on kiinteäfaasinen synteesi. Alustana, jota käytetään tämän keksinnön mukaisten polypeptidien kiinteäfaasisessa synteesissä, on kaupallisesti saatavat bentshydryyliamiini- (BHA) hartsi tai kloorimetyloitu polystyreenihartsi, joka on 1 20 %:sesti silloitettu divinyylibentseenillä. a-aminoryhmän suojaryhmänä oli tert-butoksikarbonyyli- (Boc) ryhmä, joka poistettiin synteesin jokaisessa vaiheessa. Suojattua amino-: '«· happoa sisältävä lähtöaine valmistettiin Boc-aminohaposta, : : : joka oli kytketty BHA-hartsiin tai kiinnitetty kloorimetyloi- ••25 tuun polystyreenihartsiin KF:llä. Synteesi alkoi polypeptidin C-päässä ja suoritettiin käyttämällä käsikäyttöistä laitetta, • · toistamalla alfa-aminoryhmän vaiheittaista suojanpoistomene- • · * · telmää ja kytkemällä seuraavaan aminohappoon.

• · «

.. .30 POLYPEPTIDIEN PUHDISTAMINEN

• · « • · • · • · · V * Polypeptidit puhdistettiin yleensä suurtehonestekromatogra- • fialla (HPLC) käänteisfaasipylväällä Rainin HPLC-järjestel-

«Il I

,*··. mässä (Rainin Inc., Co., Woburn, MA), joka koostui kolmesta /.35 Rainin Rabbit HP HPLC-pumpusta, joita valvottiin Apple Macin- tosh Plus-tietokoneella, Rheodyne-injektorista ja säädettävän aallonpituuden omaavasta Knauer Model 87 UV-monitorista.

4 * 104253 10

Raa'at peptidit (10 - 40 mg) laitettiin Dynamax Macro-pylvää-seen (21,2 x 250 nm), joka oli pakattu pallomaisella C18-pii-happogeelillä (huokoskoko: 300 A, hiukkaskoko: 12 μιτι) (Rainin Inc. Co.), ja eluoitiin li-neaarisella gradientilla käyttä-5 mällä liuotinjärjestelmää, jossa oli (A) 0,1 %:sta TFA:ta ja (B) 0,1 %:sta TFA.-ta 70 %:sessa vesipitoisessa asetonitrii-lissä, virtausnopeudella 2,0 ml/min. Kaikki fraktiot analysoitiin puhtauden ja retentioajan suhteen alla esitetyllä tavalla analyyttisellä HPLC:llä.

10

Raa'an ja puhdistetun peptidin laatu- ja eluutio-ominaisuudet määritettiin analyyttisellä HPLC:llä Hewlett-Packard Model 1090-nestekromatografiällä, joka oli varustettu diodirivide-tektoriryhmällä, 220 ja 280 nm:ssa ja 4,6 x 240 nm:n W-porex 15 C18-käänteisfaasipylväällä (huokoskoko: 300 A, hiukkaskoko: 5 μτη) . Yllä esitetyn liuotinjärjestelmän (A) ja (B) virtausnopeutena pidettiin 1,2 ml/min. ja erotukset suoritettiin huoneen lämpötilassa.

20 Useimmissa tapauksissa polypeptidit puhdistettiin edelleen uudelleenkromatografoimalla samalla pylväällä muuntamalla hieman gradienttiolosuhteita. Puhdistettujen peptidien homo-: '· geenisyydeksi osoittautui yli 97 % analyyttisessä HPLCzssä.

« « c

• « 4 I

••25 Aminohappoanalvvsit ««Il « « • · « • ·« « · Tämän keksinnön mukaisten polypeptidien aminohappoanalyysit • « suoritettiin Beckman 6300-aminohappoanalysointilaitteessa • · · näytteillä, joita hydrolysoitiin 110 °C:ssa 20 tunnin ajan .30 suljetuissa, evakuoiduissa putkissa 4 M metaanisulfonihapol- # « « la, joka sisälsi 0,2 % 3-(2-aminoetyyli)indolia. Aminohapon • 1 · '·' 1 suhteet vastasivat odotetuttuja. Leu-Psi-Leu:n ja Leu-psi- • ;1: Phe:n tähteet omaavat absorptiopiikit retentioajoilla 39,93 • · · « ja vast. 44,56 min. Tpi:tä ei havaittu 50-minuuttisen uutta- • · · /.35 misen jälkeen analyysimenetelmässä.

« · · * · 1 · • « · 104253 11

Analyysimenetelmät (A) Reseptorin sitomisanalyysi 5 125I-GRP (14-27) sidottiin ja syrjäytettiin bombesiiniantago- nisteilla 24-koloisilla kudosviljelylevyillä (GIBCO) käyttämällä Swiss 3T3-soluja. Hiiren Swiss 3T3-fibroblasteja säilytettiin käyttämällä viikottain DMEM:ssä, joka sisälsi 10 % FCBSrää ja antimykootteja. Viljelmiä inkuboitiin 5 %:sessa 10 C02:ssa ilmassa 37 °C:ssa. Kolot ympättiin 105 solulla/kolo (elinvoimaisuus > 95 %) , kasvatettiin yhtymään ja lepotilaan. Sitomistoimenpide suoritettiin 7 päivän kuluttua ymppäämises-tä. Solut pestiin 2 kertaa 0,5 ml :11a sitomispuskuria (Dul-becco's modified Eagle's medium, joka sisälsi 20 nM HEPES-15 NaOHrta (pH 7,4), 0,2 % BSA:ta ja 100 μg/ml basitrasiinia).

Soluja inkuboitiin sitten 0,2 nM 125I-GRP (14-27) :n kanssa antagonistien eri konsentraatioiden (6 x 10‘u - 6 x 10-6 M, kokonaismäärä 0,4 ml) läsnäollessa tai puuttuessa.

20 Zacharyn & Rozengurdin (Pres. Natl. Acad. Sei.. USA, 1985, 85. 3636 - 3670) ja Laytonin et ai.: in (Cancer Res.. 1988, 43. 4783 - 4789) mukaisesti 125I-GRP:n sitoutuminen 37 °C:ssa « « ' saavutti maksimiarvon 30 minuutissa ja väheni tämän jälkeen; :,i j siten soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Tämän t.;:25 jälkeen solut pestiin 2 kertaa jääkylmällä (4 °C) sitomispus- :\j kurilla ja 2 kertaa jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suola- liuoksella (PBS, mM) : NaCl 138, KCl 2,8, Na2HP04 8, KH2P04 • 9 1,45, CaCl2 0,91, MgClj 0,49. Pestyt viljelmät uutettiin 0,5 ml:ssa 0,5 M NaOH:ta ja siirrettiin putkiin laskemista var- • •,.30 ten. Kolot pestiin kerran 0,5 ml :11a tislattua vettä (sterii- • · ‘..I liä) ja huuhdontajätteet lisättiin sopiviin putkiin. Sitten • · · 419 \ näytteiden radioaktiivisuus laskettiin automaattisessa gamma- • · laskimessa (Micromedic System, Inc., Huntsville, Ala.).

* · • « »« · ,Λ35 Munsonin ja Rodbardin ligandi-PC-tietokoneistettua käyränso- < I i ! vitusohjelmaa (Anal. Biochem.. 1987, 107. 220 - 239) käytet- • · · 1 tiin reseptorisitomisen, dissosiaatiovakion (Kd), assosiaa- 104253 12 tiovakion (Ka), reseptoreiden maksimaalisen sitomiskapasitee-tin (Bmax) ja puolimaksimaalisen inhibiition (ICg,) tyyppien määrittämiseksi .

5 IC50-arvot merkitsevät antagonistien konsentraatioita, jotka saavat aikaan 0,2 nM GRP(14-27)-stimuloidun kasvun inhibiition. 125I-GRP (14-27) :n dissosiaatiovakio ja maksimaalinen sitoutuminen olivat kokeissamme 1,32 nm ja vast. 0,769 pm/mg proteiinia, jotka vastasivat 125I-GRP:lle ja l25I-Tyr4-bom- 10 besiinille esitettyjä arvoja. Näissä kokeissamme saadut GRP- reseptoreiden sitoutumisominaisuudet 3T3-soluissa ovat täysin yhtäpitäviä arvojen kanssa, jotka saatiin bombesiinin sitoutumiselle haiman rakkulasoluihin (Jensen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1978, 75, 6139 - 6143) ja aivolisäkesoluihin 15 (Westendorf ja Schonbrunn, J. Biol. Chem.. 1983, 258. 7527 - 7535).

GRP (14-27) inhiboi ,25I-GRP (14-27) :n sitoutumista ICjo-arvolla 2,32 nM, joka on yhtäpitävä Laytonin et al.:in (Cancer Res..

20 1988, 4.8, 4783 - 4789) arvon kanssa, joka on 2,2 nM. Tämän keksinnön mukaisten polypeptidien sitomisarvot on esitetty oheisessa taulukossa I.

I I

I 1 «

< I

k « < < I I « k « a % a a 1*14 * · m · · • #· • · i · : • · • · · • · ·

• · I

« M · • t · • · «•4 • · t • * * * • » « t « «41 II· · « · · « «

« I

«aa * a * i < « a · · • # a · « a · • «a * · 104253 13

SITOMISARVOT 3T3 SWISS-SOLUISSA

Koodi K, (nM-1) K„ (nM) IC50 (nM) 7. N.D.

5 5. 0,129 8 9,2 12. 0,014 71 81,65 26. 0,045 22 25,3 17. 0,955 1 1,2 2. 0,095 10,6 12,9 10 34. 0,0006 1667 1917,05 11. 0,217 5 5,75 27. 0,013 74,5 85,66 29. 0,0019 526,3 604,9 30. 0,254 4 5,15 15 28. 0,125 8 9,16 33. 0,002 556 639,4 18. 0,257 4 4,6 10. 1 1 1,15 22. 1,012 0,9 1,14 20 8. 0,014 71 82,14 GRP(14-27) 0,758±0,23 1,32±0,43 1,52±0,7 i j B,^ = 7,2 x 10'12, s.o. 0,354 x 10'12 M/mg proteiinia ,/25 N.D. = ei syrjäytystä IC50 on leimaamattoman ligandin konsentraatio, joka syrjäytti Γ·’: puolet spesifisestä radioligandisidoksesta. Se lasketaan • · ;’j1. Chengin ja Prusoffin yhtälön mukaisesti (Biochem-Pharmacol. .

1973, 22, 3099): IC50 = Ke (1 + L/Kh) , jossa Ke ja Kh ovat :v30 leimaamattoman (kylmän) ja vast, leimatun (kuuman) ligandin » · dissosiaatiovakioita ja L on käytetyn radioligandin konsent- • · · *. raatio.

• · * · · · · · (B) Amylaasin vapautuminen /.35 • · · /1. Eristetyt haiman rauhasrakkulat valmistettiin koiraspuolisis- ’ ta, yön yli paastonneista Wistar-rotista (150 - 180 g) saatu- 104253 14 jen haimojen kollagenaasiuuton avulla. Eläimet tapettiin nyrjäyttämällä niskat ja haima poistettiin ja uutettiin sitten erittäin puhtaalla kollagenaasilla (CLSPA, 540 U/mg, Cooper Biomedical, Freehold, N. J., USA) Amsterdamin, Solomo-5 nin ja Jamiesonin menetelmän mukaisesti (1978).

Dispergoidut rauhasrakkulat suspendoitiin inkubaatioalustaan, joka sisälsi 24,5 mM HEPES:tä, 98 mM NaCl:ää, 4,0 mM KCl:ää, 11,7 mM KH2P04:ää, 1,0 mM MgCl2:ta, 0,3 mM CaCl2:ta, 5,0 mM 10 glukoosia, 1 % (w/v) välttämättömien ja ei-välttämättömien aminohappojen seosta (Serva Feinbio- chemica, Heidelberg, BRD), 2 mM glutamiinia, 0,2 % BSA:ta ja 0,01 % (w/v) tryp-siini-inhibiittoria. Inkubaatioliuos kyllästettiin hapella ja se säilytettiin 37 °C:ssa ravisteluhauteessa (60 värähte-15 lyä/min.). Rauhasrakkulasuspensiota inkuboitiin GRP:n tai GRP-antagonistien eri konsentraatioiden läsnäollessa.

Inkuboinnin jälkeen putkia sentrifugoitiin 1000 g:ssa 5 minuutin ajan ja supernatantti erotettiin pelletistä. Superna-20 tantin ja liuotetun pelletin amylaasipitoisuus määritettiin erikseen Bernfieldin (1955) esittämällä tavalla. Amylaasieri-tys esitettiin prosentuaalisena kasvuna perusarvon suhteen.

: '·· Inkubaatiot monistettiin. Stimuloimattoman amylaasin vapautu- : minen koko koejakson aikana määritettiin perusarvoksi.

••25

Lisättynä inkubaatioalustaan asteittain kasvavina konsentraa- • · tioina sai aikaan GRP:n submaksimaalisella konsentraatiolla • · • · (10'9 M) stimuloidun amylaasin vapautumisen konsentraatiosta • I · riippuvaisen inhibiition.

.. .30 • · · (C) 3H-tymidiinin assimiloitumisen inhibiitio 3T3-soluilla • · · • · · f SCLC-soluja käytettiin 2-4 päivää läpikulun jälkeen. Yksit- täisiä solususpensioita valmistettiin pesemällä solut (kah-.1.35 desti PBS:llä), sitten pipetoimalla niitä 37 °C:ssa PBS:ssä,

joka sisälsi 0,2 g/1 glukoosia, 0,2 g/1 EDTA:ta ja 14 mM

• « · *· lidokaiinihydrokloridia, kunnes suspensio näytti yhdenmukai- 104253 15 seita (2-4 min.). Solut pestiin kolme kertaa ja suspendoi-tiin uudelleen HITES:iin ilman FCSB:tä. Viljelmät saatettiin arvoon 1,34 x 105 solua, jotka oli päällystetty 0. päivänä ja kaikki peptidit lisättiin samanikaisesti 1 ml:ssa RPMI-1640-5 alustaa plus HITES:tä ja 0,125 % albumiinia. 48 tunnin kulut tua jokaiseen koloon lisättiin 1 uc. tritioitua tymidiiniä ja inkubointia jatkettiin vielä 24 tunnin ajan. Sitten solut pestiin ja saostettiin lasisuodatuspaperille ja pestiin jääkylmällä 5 %:sella trikloorietikkahapolla. Suodatuspaperit 10 sijoitettiin pienpulloihin, jotka sisälsivät tuikenestettä, ja laskettiin 1 minuutin ajan.

• t « I

• · · • · · • · • · · • · « • · • · ··» • · o • » » ·« · * · • · • · · • · · • · · 1 · < « « t « I · « • · · 104253 16

TAULUKKO II

GASTRIINIA VAPAUTTAVAN PEPTIDIN (GRP) ANTAGONISTISTEN ANALOGIEN ANALYYSI 3T3-SOLUILLA 3H-TYMIDIININ ASSIMILAATION INHIBOINTI 5

Peptidi- ng/ml GRP DPM ± S.E. Inhibiitio-% analogi 3 ng/ml vs. GRP f n:o 207000±4200 10 348000±15300 (**) 26 50 + 233000+8800 82 500 + 205000±12500 > 100 (-1*) 100 + 222000±3900 89 15 0 17 50 + 277000±9800 50 500 + 207000+3800 100 100 + 223000±1200 89 0 20 5 50 + 283000±5400 46 500 + 280000±21900 48 100 + 199000±7100 > 100 (-4*) : 0 i.j · 10 50 + 261000±19500 62 _ ;:25 500 + 242000±8300 75 100 + 255000±26200 66 • · :**··; 0 22 50 + 269000±14000 56 • · · 500 + 280000±14000 48 ...30 100 + 198000±18800 > 100 (-4*) : 0 ** t·» v • · · • · · **P < 0,01; (-*) inhibiitio alle stimuloimat toman perustason; t 348.000 - 207.000 = 141.000 katsottiin stimulaatioksi.

.'.35 • · « • · · 104253 17 (D) Erilaisten pienisoluisten keuhkokarsinoomien (S.C.L.C.) kasvun inhibointi H-69- ja H-345-S.C.L.C.-solujen varastoviljelmää, jonka toi-5 mitti National Cancer Institute (NCI), säilytettiin suspen- sioviljelmässä. GRP-indusoidun DNA-synteesin inhibointi bom-besiiniantagonisteilla suoritettiin mittaamalla (3H)-tymidii-nin assimiloituminen. GRP-indusoidun DNA-synteesin inhibointi bombesiiniantagonisteilla osoitettiin merkittäväksi ja kon-10 sentraatiosta riippuvaiseksi.

(E) Vaikutus haiman eritykseen in vivo

Eritystutkimuksia suoritettiin 6 tajuissaan olevalla kissalla 15 (2-3 kg), jotka oli valmisteltu pitkäaikaisilla maha- ja haimafistuloilla, kuten on esitetty aikaisemmin (Konturek et ai., J. Physiology, Lontoo. 1976, 257. 663 - 672). Lyhyesti mahafistulassa käytetty kanyyli oli sen tyyppinen, jonka on esittänyt Emäs (Gastroenterlocrv. 1960, 39, 886 - 782) . Tämä 20 kanyyli sovitettiin mahanportin rauhasalueelle suuremman kaarevuuden lähelle. Haimafistula tehtiin käyttämällä erityistä T-muotoista metallikanyyliä, jossa oli sivu- ja pää-: '·· osat, jotka oli sovitettu kissoissa tapahtuvaa käyttöä var- : : ; ten. Yhteinen sappijohdin jaettiin juuri ennen haimajohtimen ;25 liittämistä ja siirrettiin ylempään pohjukaissuoleen sappi- ·'.: virtauksen erottamiseksi haimanesteen virtauksesta. Valmis- • · · • · tettiin pieni pohjukaissuolipussi, joka sisälsi päähaimajoh- • · timen sisääntulon, ja haimakanyylin sivuosa sovitettiin tähän • · * taskuun. Kanyylin pääosa sijoitettiin distaaliseen pohjukais- .. „30 suoleen n. 3 cm duodenostomian (pohjukaissuolen avantaan) • * * •>#·* toiselle puolelle.

• · · • · « • Eritystutkimukset aloitettiin n. 3 kuukauden kuluttua kirur- «ai · giasta. Ruoka jätettiin pois häkeistä vähintään 18 tuntia • a · .*.35 ennen jokaista testiä. Jokaisessa testissä (paitsi ruokinnan • · a kanssa) mahafistula jätettiin avoimeksi mahanesteen poistumi- a · « ’· ” sen mahdollistamiseksi ulkopuolelle.

104253 18

Haimafistuian eritys kerättiin keskeytymättä ja jaettiin 15 min. näytteiksi. Määrä rekisteröitiin ja proteiini- ja bikar-bonaattikonsentraatiot ja -tuotot määritettiin, kuten aikaisemmin on esitetty (Konturek et ai., 1976).

5

Useita testisarjoja suoritettiin jokaisella eläimellä eritys-tehojen vertailua varten. GRP:tä infusoitiin i.v. asteittaisina annoksina (1250 pmoolia/kg-h GRP:tä) 1 päivän testissä lisäämättä tai lisäämällä peptidiä 5. Testeissä, joissa oli 10 ruokinta, mahafistula pidettiin suljettuna ja jokaiselle kissalle tarjottiin n. 50 g keitettyä homogenoitua jauhelihaa, joka kulutettiin tavallisesti kokonaan. Suolaliuoksen intravenoosista infuusiota (n. 10 ml/h) ylläpidettiin koko aterian jälkeisen ajan ja kun haiman eritysreaktio saavutti 15 hyvin säilyvän tason, annettiin peptidiä 5 ja eritystä tut kittiin vielä 2 tunnin ajan. Erillisissä paastonneilla kissoilla suoritetuissa testeissä (ilman peptidi-infuusiota tai lihan antamista) perushaimaeritys (mahafistuian ollessa avoinna) mitattiin 2 tunnin ajan ja sitten infuusioon lisättiin 20 peptidiä 5 (10 nmoolia/kg-h) annoksena, joka kumosi täysin GRPrllä indusoidun haimaerityksen. Tulokset on esitetty alla.

Bombesiinianalogeja, peptidejä (5), (10) ja (2) testattiin in ; ,·. vivo seerumin gastriini-inhiboinnissa GRP-stimuloinnin jäl- ,£>5 keen. Kahdeksan minuutin kuluttua GRP:llä suoritetun stimu- ‘1“. loinnin jälkeen (3 μΙ/lOO g BW:tä) seerumin gastriinitasot • · · kasvoivat 16,7 pg.-sta/ml (kontrolli) 105 pg:aan/ml. Rotissa, • · · l joita oli injektoitu 10 minuutin ennen GRP-stimulointia pep- tidiantagonisteilla (5), (10) ja (2) (30 μg/100 g BW:tä), 30 esiintyi gastriinierityksen tason lasku (8 minuutin kuluttua

• · A

• V 36,8 pg/ml peptidille (2), 24,2 pg/ml peptidille (10) ja 39,2 pg/ml peptidille (5)) .

• * · • · « Tämän keksinnön mukaisia bombesiini/GRP-antagonisteja voidaan *;*35 käyttää hypergastrinemian tilojen, esim. perni-siöösisen anemian, kroonisen atrooppisen gastriitin, Zollinger-Ellison-syndrooman ja vitiligon hoitamiseksi, joihin liittyy mahan 104253 19 enterokromaffiinityyppisten solujen diffuusia hyperplasiaa ja monialkuisten mahan syöpäkasvainten lisääntynyttä vaaraa. Edelleen enterokromaffii-nityyppinen soluhyperplasia muodostuu helposti eläimissä, jotka on tehty hypergastrineemisiksi. 5 Tällainen käsittely on edullista verrattuna nykyisiin lääkeaineisiin, koska Hj-antagonistit, kuten simetidiini, aiheuttavat hypergastrinemiaa ja voivat johtaa ihmisissä syöpäkasvaimiin. Lisäksi terapian päättäminen H2-antagonisteilla saa 10 aikaan haavaumien välittömän uusiutumisen olemassa olevan hypergastrinemian johdosta.

Koska nämä tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat bombesii-ni/GRP-reseptoreiden antagonisteja, niitä voidaan käyttää 15 hoidettaessa keuhkosyöpää, paksunsuolensyöpää ja mahasyöpää.

Näiden yllä esitettyjen tulosten ja rotilla saatujen arvojen perusteella keksinnön mukaisia peptidejä voidaan antaa farmaseuttisesti hyväksyttävien, ei-toksisten suolojen, kuten 20 happoadditiosuolojen muodossa, joista esimerkkeinä mainitta koon kloorivety, bromivety, sulfaatti, fosfaatti, fumaraatti, glukonaatti, tannaatti, maleaatti, asetaatti, sitraatti, : bentsoaatti, sukkinaatti, alginaatti, pamoaatti, malaatti, ·, askorbaatti, tartraatti ja vastaavat.

ti; 25

Edullisia, pitkäaikaisen vaikutuksen omaavia järjestelmiä • · ·'·*; ovat näiden peptidien mikrokapselit tai mikrohiukkaset, jotka • · on valmistettu poly(DL-laktidi-koglykolidi) :sta. Samoin voi- daan käyttää intravenoosisia, intramuskulaarisia tai subku- .. .3 0 taanisia valmisteita isotonisessa suola- liuoksessa, fosfaat- « · • · tipuskuriliuoksissa tai vastaavissa. Samoin voidaan käyttää

• · I

·* * aerosoleja keuhkoja varten.

• · Nämä farmaseuttiset koostumukset sisältävät peptidiä yhdessä .*.35 tavanomaisen, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen « · t ; *t kanssa. Annostus on n. 1 - 1000 mikrogrammaa peptidiä/kg • · « *·parenteraalisesti annettaessa. Hoito näillä peptideillä voi- 104253 20 daan suorittaa samalla tavalla kuin kliininen hoito käytettäessä muita LHR:n agonisteja ja antagonisteja, somatosta-tiinianalogeja tai muita peptidejä.

5 Näitä peptidejä voidaan antaa nisäkkäille intravenoosisesti, subkutaanisesti, intramuskulaarisesti, intranasaalisesti tai keuhkoaerosoleilla gastrisen inhibitorisen tai antituumori-vaikutuksen aikaansaamiseksi. Vaikuttavat annokset vaihtele-vat riippuen antotavasta ja hoidettavan nisäkkään erityisestä 10 lajista. Esimerkkinä tyypillisestä annostusmuodosta on fysio loginen suolaliuos, joka sisältää peptidiä ja jota annetaan annoksen aikaansaamiseksi, joka on n. 0,01 - 0,20 mg/kg. Pitkävaikutteisia valmisteita voidaan antaa ainoastaan kerran kuukaudessa ja hoidon kesto on useita kuukausia.

15

Vaikkakin keksintöä on selitetty viitaten sen edullisiin suoritusmuotoihin, alan ammattihenkilölle lienee selvää, että voidaan tehdä muutoksia ja muunnelmia poikkamatta keksinnön piiristä, joka on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

20 Keksinnössä voidaan käyttää alalla tunnettuja korvikkeita, jotka eivät vähennä merkittävästi sen tehokkuutta.

YLEISET TYÖVAIHEET POLYPEPTIDISYNTEESIÄ VARTEN ALOITTAMALLA i BOC-AMINOHAPPO-HARTSI-YKSIKÖSTÄ «tl l «25 : Työvaihe I: ;·.·. (1) pesu CH,Cl,:lla (3x1 min.); ♦ « - « .♦;·. (2) suojan poisto 50 %: sella TFA:lla CH2Cl2:ssa kahdesti 5 « · ·« minuutin kuluessa ja vastaavasti 25 minuutin kuluessa; ...30 D- tai L-Trp:tä tai Tpi:tä sisältävillä peptidihartseilla « · « *.,** suojan poisto 50 %:sella TFA:lal CH2Cl2:ssa, joka sisältää 5 % « « · *·* * merkaptoetanolia ja 5 % anisolia; * (3) pesu CH2Cl2:lla (6x1 min.); I 4 « « (4) neutralointi 10 %:sella trietyyliamiinilla CH2Cl2:ssa (2 x .*.35 3 min.) ; »ti (5) pesu CH2C12: ssa (6x1 min.); » t » • · · • · 104253 21 (6) kytkentä: i) Boc-aminohapon (3 ekviv.) ja HOBt:n (3,3 ekviv.) lisäys DMF:ssä (3 min.), ii) 20 %:sen di-isopropyylikarbodi-imidin (3 ekviv.) lisäys CH2Cl2:ssa ja ravistelu 60 - 90 min., 5 (7) pesu CH2Cl2:lla (2x1 min.), etanolilla (2 x 1 min.) ja CH2Cl2:lla (5x1 min.) .

Työvaihe II:

Pelkistetyn peptidisidoksen: -CH2NH- liitäntää varten työvai-10 heen (I) vaihetta (6) muunnettiin seuraavasti: (1) pesu DMF:llä (2x1 min.), (2) Boc-leusiinialdehydin (3 ekviv.) lisäys DMF:ssä, joka sisälsi 1 % AcOH:ta (3) NaBH3CN:n (3,5 ekviv.) lisäys DMF:ssä ja ravistelu 60 15 min.; (4) pesu 50 %:sella MeOH:lla (3x1 min.), 100 %:sella MeOH:lla (3x1 min.) ja CH2Cl2:lla (3x1 min.).

Työvaihe III: 20 Boc-Asn:n, Boc-Gln:n ja Boc-Gly:n liittämiseksi työvaiheen (I) vaihetta (6) muunnetaan seuraavasti: ·' " 20 %:sta di-isopropyylikarbodi-imidiä (3 ekviv.) CH2Cl2:ssa : lisättiin DMF-liuoksen seokseen, jossa oli Boc-aminohappoa |25 (3,0 ekviv.) ja HOBt:tä (3,3 ekviv.), 0 °C:ssa 15 minuutin ajan ja huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan, liukenematto- :***: mat poistettiin suodattamalla, suodos lisättiin peptidihart- • · .1.**. siin ja ravisteltiin Boc-Gln:n tai Boc-Asn:n kanssa 2-4 tunnin ajan tai Boc-Gly:n kanssa 1 tunnin ajan.

:-.-30 • « ‘..I Työvaihe IV: • t « *. Seuraavat toimenpiteet suoritettiin Fmoc-aminohapon liittämi- • · seksi: ; (1) Suojan poistamisen ja neutraloinnin jälkeen pesu .1.35 CH2Cl2:11a (3x1 min.) ja DMF: llä (3x1 min.), ! 1. (2) kytkentä i) Fmoc-aminohapon (3 ekviv.) ja HOBt:n (3,3 • · · 1 ekviv.) lisäys DMF:ssä (3 min.), 104253 22 ii) 20 %:sen di-isopropyylikarbodi-iraidin (3 ekviv.) lisäys CH2Cl2:ssa ja ravistelu 60 min., (3) pesu etanolilla (3x1 min.), DMF:llä (3x1 min.), (4) Fmoc-ryhmän suojan poisto 50 %:sella piperidiinillä 5 DMF:ssä 30 minuutin kuluessa, (5) pesu DMF:llä (6x1 min.), (6) toinen kytkentä suoritetaan vaiheessa (2) esitetyllä tavalla.

10 Sen jälkeen, kun halutut kaavan I mukaiset välituotepeptidit oli valmistettu, peptidihartsi käsiteltiin nestemäisellä HF:llä anisolin läsnäollessa, jolloin saatiin polypeptidi vapaassa muodossa, jossa kaavan I X oli vety ja kaavan I Y oli -NH2 tai OH, tai suojatussa muodossa, jossa kaavan I A2 on 15 Glu(OMe) tai His(Bz).

Vapaassa tai suojatussa muodossa esiintyvän polypeptidin N,C-pään tai sivuketjuryhmän funktionaalisen ryhmän muuntaminen polypeptidin joksikin toiseksi N- tai C-pääksi tai sivuryhmän 20 funktionaaliseksi ryhmäksi suoritettiin sopivalla reagenssil- la liuoksessa. Esimerkiksi suojattu polypeptidi, joka sisälsi Glu:n asemassa A2, saatettiin reagoimaan metyyliamiinin kans-: sa DIC:n läsnäollessa, jolloin saatiin polypeptidi, joka ;,· sisälsi Glu(MeNH) :n A2-asemassa. Vapaa N-pään polypeptidi ^'25 saatettiin reagoimaan KOCN:n kanssa, jolloin saatiin polypep- tidi, joka sisälsi ryhmän NH2CO- X-asemassa.

t 1 «· · * · · • · • ·

Seuraavissa esimerkeissä käytettiin seuraavaa numerokoodi tus- ta välituotteiden identifioimiseksi. Uudelleenkooditus ...30 a/b/Res on esimerkin "a" vaiheessa "b" käytetty alkuperäinen * ♦ *..1 hartsi. Koodi a/b/c on peptidin "c" esimerkin "a" vaiheessa « « « * ”b" valmistettu esiaste, a, b ja c merkitsevät kaikki koko- • # ‘J naislukuja.

f « « « · « 4 « • t » · * · · • · 23 1 0 4 2 5 3 ESIMERKKI (1) (1) A: L- ja D-Tpi:n esimerkki 2,04 g (10 mM) L-Trp:tä liuotettiin 25 ml:aan kiehuvaa vettä, 5 joka sisälsi 2,1 g sitruunahappoa. Lisättiin 0,5 ml 40 %:sta formaldehydiä ja välittömästi alkoi muodostua kuiva-ainetta. Seos äkkijäähdytettiin jäähauteessa ja kuiva-aine kerättiin ja pestiin kylmällä vedellä ja kuiva-aine ilmakuivatettiin huoneen lämpötilassa, jolloin saatiin 2,14 g tai 99 % kuiva-10 ainetta, sp. (haj.) n. 310 °C. D-isomeeri muodostetaan samal la tavalla ja sen sp. on samoin n. 310 °C (haj.).

B: L- ja D-Boc-Tpi:n esimerkki 15 Sekoitettuun suspensioon, jossa oli 10,8 g (50 mM) D-Tpi:tä 250 ml:ssa cf 0,2 N NaOH:ta ja 7,5 ml.-ssa trietyyliamiinia, lisättiin 10 g di-tert-butyyli-dikarbonaattia. sitten seosta sekoitettiin 4 tunnin ajan ja lisättiin lisää 10 g dikarbo-naattia ja edelleen 10 g sen jälkeen, kun oli sekoitettu 3 20 tunnin ajan. Seosta sekoitettiin yön ajan ja se uutettiin (2 x 100 ml) eetterillä, joka heitettiin pois. Vesikerrokseen lisättiin sitruunahappoa, kunnes se oli hapan (pH 3 - 5).

♦ I

• '·> Kuiva-aine kerättiin ja pestiin vedellä ja ilmakuivatettiin : yön ajan.

1(1 | •25

* I « I

Kuiva-aine suspendoitiin 100 mitään tetrahydrofuraania. Lähes « « kaikki kuiva-aine liukeni. Liukenemattomat aineet poistettiin • · suodattamalla ja THF poistettiin tyhjössä. Jäännös trituroi- • * m tiin eetterillä, jolloin saatiin 9,20 g tai 58 %. Tämän ai- u30 neen sp. oli sama kuin lähtöaineen, mutta se poikkesi liu- « « < ; ·* kenevuudessa ja TLCtssä piihapossa käyttämällä CHCl3:MeOH: V* HOActn 85:15:0,5-seosta.

« · r t ^ 2,55 g L-Tpi:tä tuottaa 2,22 g tai 59 % Boc-Tpi:tä käytettä- < « 4 • 35 essä samaa menetelmää.

• · * · a • * « • · aa· * · a a « 104253 24 (2) Boc-Leu-CHO:n esimerkki

Boc-leusiini-metyyliesteri (35 g, 134 mmoolia), joka oli kuivassa tolueenissa (250 ml) N2:n atmosfäärissä, jäähdytet-5 tiin kuivajää/asetonilla ja sitten lisättiin (150 ml) 25 %:sta di-isobutyyli-aluminiumhydridiä tolueenissa 30 minuutin kuluessa. Seosta sekoitettiin 20 minuutin ajan kuivajää/ase-toni-hauteessa di-isobutyyli-aluminiumhydridin lisäyksen jälkeen, sitten lisättiin varovasti metanolia (15 ml). Seos 10 kaadettiin 1000 ml:aan jääkylmää vettä, ravisteltiin ja suo datettiin. Tolueeni erotettiin ja vesifaasi uutettiin uudelleen eetterillä (3 x 300 ml). Tolueeni- ja eetteriuutteet yhdistettiin ja kuivatettiin (Na2S04) . Saatava öljy ohjattiin nopeasti piihappogeelipylvään (3 x 50 cm) läpi 1500 ml:ssa 15 15 %:sta EtOAc:n/petrolin seosta. Boc-Leu-aldehydi saatiin öljy nä (27,6 g).

ESIMERKKI (2) (vertailuesimerkki)

Peptidi # 20 1. NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 2. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 3. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Leu-NH-, 4. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi.-Leu-NH2 , 5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH; •"Z 25 6. D-Tpi-Glu (OMe) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH·, • « i :··: 7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Leu-NH2 . *i 8. D-Tpi-His (Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 « · · • · • · · · Esimerkin polypeptidit, jotka sisälsivät saman fragmentin 30 Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Leu-NH-,. mutta kaksi erilaista tähdettä N-päässä, muodostettiin vaiheittain bentshydryyli-amiini- (BHA) hartsilla kiinteäfaasisen synteesin va-* , kiomenetelmillä. 1 0,50 g BHA-hartsia (0,9 mmoolia NH2:ta/g) käsiteltiin 10 %:sella TEA: 11a CH2Cl2:ssa (neutralointi) kahdesti kulloinkin .··*. kolmen minuutin ajan ja pestiin CH2Cl2:lla kuusi kertaa. Hart- 104253 25 siin sekoitettiin 1,35 mmoolia Boc-Leu:ta ja 1,50 mmoolia 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBt) DMFtssä kolmen minuutin kuluessa. Lisättiin 20 %:sta 1,3-di-isopropyylikarbodi-imidiä (DIC) (1,3 mmoolia) CH2Cl2:ssa. Seosta ravisteltiin huoneen 5 lämpötilassa 60 minuutin ajan. Saatava Boc-Leu-BHA-hartsi pestiin CH2Cl2:lla, metanolilla kaksi kertaa kulloinkin ja CH2Cl2:lla kolme kertaa ja sitten se alistettiin Kaiser-tes-tiin (Anal. Biochem. 34., 595 (1970)) . Silloin, kun tapahtuu epätäydellinen kytkentä, kytkentätoimenpide toistetaan.

10

Boc-ryhmän poisto (suojan poisto) Boc-Leu-BHA-hartsista suoritettiin liuoksessa, jossa oli 50 %:sta TFA:ta DCM:ssä, 5 minuutin kuluessa, suodatettiin ja käsiteltiin uudelleen 25 minuutin ajan ja sitten pestiin DCM.-llä kuusi kertaa.

15

Neutralointi suoritettiin samalla tavalla kuin yllä BHA-hart-sin yhteydessä.

Boc-Leu-CHO:n kytkentä suoritetaan työvaiheen (II) mukaises-20 ti: (1) pesu DMFrllä 2 kertaa, (2) lisätään 1,5 mmoolia Boc-Leu-CHO:ta DMF:ssä, joka sisäl- ; _ tää 1 % AcOH:ta, : (3) lisätään 2,0 mmoolia NaBH3CN:ää DMF:ssä ja ravistellaan ...:25 60 minuutin ajan, ·.'·· (4) pesu 50 %:sella metanolilla H20:ssa 2 kertaa ja 100 • %-.sella MeOH:lla 2 kertaa, CH2Cl2:lla 3 kertaa.

a » · • · » aa»

Boc-ryhmän poiston jälkeen Boc-Leu-psi-Leu-BHA-hartsista ja •‘.*30 neutraloinnin jälkeen Boc-His(Z):n kytkentä suoritettiin • · työvaiheessa (I) esitetyllä tavalla.

aa» a a a a % « '·' : Boc-Gly:n kytkentä suoritetaan työvaiheessa (III) esitetyllä ·’...· tavalla.

; *3 5 .·„ : 20 %:sta 1,3-di-isopropyylikarbodi-imidiä (1,5 mmoolia) CH- 2Cl2:ssa lisättiin 0 °C:ssa DMF-liuokseen, jossa oli 1,5 mmoo- 104253 26 lia Boc-Gly.-tä ja 1,65 mmoolia HOBtrtä, sekoitettiin jäähdyttäen 15 minuutin ajan ja huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan, sakka suodatettiin pois ja lisättiin hartsiin ja ravisteltiin 60 minuutin ajan.

5

Seuraavat aminohappotähteet Boc-Val, Boc-Ala ja Boc-Trp liitettiin sitten peräkkäin kytkemällä samalla tavalla kuin työvaiheessa (I), jolloin saatiin 0,90 g suojattua peptidi-hartsia, jonka rakenne oli Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-10 psi-Leu-BHA-hartsi (2/l/Res).

Boc-Trp:n liittämisen jälkeen Boc-ryhmä vapautettiin suojasta 50 %:sella TFA:lla DCM:ssä, joka sisälsi 5 % merkaptoetanolia ja 5 % anisolia, jolloin saatiin TFA-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-15 Leu-psi-Leu-BHA-hartsi (2/2/Res).

0,91 g TFA-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsia (2/2/Res) jaettiin kahdeksaan osaan (n. 100 mg kulloinkin), joita käytettiin haluttujen suojattujen polypeptidihartsien 20 synteesin suorittamiseksi työvaiheessa I Boc-D-Trp:n, Boc-5F- D-Trp:n, Boc-D-Tpi:n ja Boc-His(Z):n ja työvaiheessa III Boc-Gln:n liittämiseksi esitettyjen toimenpiteiden mukaisesti.

• i ♦ :·: ·' Boc-Gln:n ja Boc-Trp:n peräkkäinen lisäys yllä olevaan hepta- ..!:25 peptidihartsiin (2/2/Res) tuottaa: :.'*i 2/2/01 Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-psi-Leu-BHA- : * : hartsin.

• · «M « I » • « ·

Boc-Gln:n ja Boc-D-Trp:n peräkkäinen kytkentä heptapeptidi- :\·30 hartsiin (2/2/res) tuottaa: « · 2/2/02 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-psi-Leu-BHA- i « » hartsin.

• · • * · cc • It < « · ·

Boc-Gln:n ja Boc-5F-D-Trp:n kytkeminen heptapeptidihartsiin .•.*35 (2/2/res) tuottaa: /·/; 2/2/04 Boc-5F-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-psi-Leu- BHA-hartsin.

104253 27 2/2/05 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsi saadaan kytkemällä peräkkäin Boc-Gln ja Boc-D-Tpi.

2/2/06 Boc-D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-5 Leu-BHA-hartsi saadaan kytkemällä peräkkäin Boc-Glu(OMe) ja

Boc-D-Tpi.

2/2/07 Boc-D-Tpi-His(Z)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsi saadaan kytkemällä peräkkäin Boc-His(Z) ja Boc-D-10 Tpi.

2/2/08 Boc-D-Tpi-His(Bz)Trp-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsi saadaan kytkemällä peräkkäin Boc-His(Bz) ja Boc-D-Tpi.

15 Boc-ryhmän poistamisen jälkeen 50 %:sella TFArlla DCM:ssä, joka sisältää 5 % merkaptoetanolia ja 5 % anisolia, Boc-ryhmästä vapautettu polypeptidihartsi pestään DCM:llä, me-tanolilla ja DCMrllä kolme kertaa kulloinkin ja käsitellään vastatislatulla HF:llä (5 ml) ja anisolilla (0,25 ml) 0 20 °C:ssa 1 tunnin ajan. Liuotin haihdutetaan tyhjössä ja pes tään eetterillä tai etyyliasetaatilla ja sitten uutetaan 70 -80 %:sella etikkahapolla ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan ! . raaka: "V 2/3/01 Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH; *; * '2 5 '· “ Peptidi # • · · i *.· 2. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Leu-NH, • · · V: 4. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi.-Leu-NH2 5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH-; :’·°30 6. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH, 7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NIl·.

. 8. D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 ·; Seosta, jossa oli 40 mg Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi- ::35 Leu-NH2:ta (2/3/1) ja 20 μΐ TEA:ta 0,5 ml:ssa DMF:ää ja 20 mg KOCNrää 100 ^l:ssa H20:ta, sekoitettiin 0 °C:ssa, sitten seokseen lisättiin tipoittain 100 μΐ AcOH:ta ja sekoitettiin 0 104253 28 °C:ssa 1 tunnin ajan. Reaktioseos alistettiin puhdistukseen, jolloin saatiin:

Peptidi # 5 1. NH-,CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH?.

Peptidi (3) valmistettiin kytkemällä peräkkäin Fmoc-Glu(OBut) ja Fmoc-D-Trp työvaiheessa IV esitetyllä menetelmällä Trp-Ala-Val-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsiin (2/2/Res) , jolloin 10 saatiin Fmoc-D-Trp-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-

Leu-BHA-hartsi (2/4/3). Peptidihartsi käsiteltiin 10 %:sella TFA:11a DCM:ssä, joka sisälsi 5 % 2-merkaptoetanolia, 30 minuutin ajan But-ryhmän poistamiseksi Glu:n karboksyyliryhmästä. Pestiin kuusi kertaa DCM:llä, MeNH2:ta kuplitettiin 15 Fmoc-D-Trp-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-BHA-hartsi- kerroksen läpi (2/5/Res) 5 ml:ssa DMF:ää 0 °C:ssa 5 minuutin ajan, sitten lisättiin 0,25 ml 20 %:sta DIC:tä DCMrssä ja annettiin reagoida 0 °C:ssa 2 tunnin ajan. Sitten hartsi pestiin DCM:llä ja Fmoc-ryhmä poistettiin piperidiinillä.

20

Peptidi (3) D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 (RC-3490) saatiin HF:llä suoritetun käsittelyn jälkeen.

··! : Puhdistaminen suoritettiin HPLC:llä liuotinjärjestelmällä, .,,:25 jossa oli (A) 0,1 %:sta TFA:ta ja (B) 1 %:sta TFA:ta 70 %:ssa V*: asetonitriiliä. Puhdistetut peptidit olivat yli 97 %:sesti j * puhtaita analyyttisessä HPLC:ssä. Tämän esimerkin polypepti- :*·*„ dien retentioajat on esitetty seuraavassa taulukossa.

;·.·30 Analyyttisen HPLC:n arvot \.I# Peptidi n:o Gradientti pyi- Retentioaika • · · % B/min. väällä 2. 25 - 65 % B/40 11,84 4. 25 - 65 %/40 14,85 .•'•35 5. 25 - 65 %/40 14,32 ! \ 6. 25 - 65 %/40 19,21 7. 30 - 70 %/40 9,11 104253 29 Tämän esimerkin polypeptidien aminohappoanalyysien tulokset vastasivat odotettuja. Esimerkiksi peptidin (2) aminohap-posuhteet, jonka rakenne on D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2, olivat 1,11:2,09:0,90:1,03:0,95:0,92 (Gin: 5 Trp:Ala:Vai:Gly:His). Leu-psi-Leu:n tähteellä oli absorp- tiopiikki retentioajalla 39,95 min. Peptidien (5), (6), (7) ja (8) tähdettä Tpi ei havaittu.

ESIMERKKI (3) (vertailuesimerkki) 10

Peptidi # 9. NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Phe-NH: 11. D-Trp-Glu (MeNH) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH·» 15 12. D-Tpi-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Phe-NH·.

13. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Glv-Leu-psi-Phe-NH? Tämän esimerkin polypeptidit sisältävät saman fragmentin Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH·,. Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His (Z) -20 Leu-PSi-Phe-BHA-hartsi (3/l/res) muodostettiin vaiheittain 0,5 g:ssa BHA-hartsia (0,9 mmoolia NH2:ta/g) esimerkin (2) osassa esitetyn kiinteäfaasisynteesin mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-Phe oli Boc-Leu:n sijasta ensimmäisessä ' , kytkennässä.

: 25 -·· Osittainen peptidihartsi, joka sisälsi n. 150 mg Boc-Trp-Ala-

Val-Gly-His (Z) -Leu-Psi-Phe-BHA-hartsia (3/l/Res) , kytkettiin « · · kahden muun tähteen kanssa työvaiheessa I Boc-Trp:n, Boc-D-

Trp:n, Boc-D-Tpi:n ja Boc-Glu (OMe) :n ja työvaiheessa III Boc- 30 Gin:n kytkemiseksi esitettyjen toimenpiteiden mukaisesti, *:*. jolloin saatiin lopullinen polypeptidihartsi.

• · · • · • ·

Boc-Gln:n ja Boc-Trp:n peräkkäinen kytkentä yllä mainittuun heptapeptidihartsiin (3/l/res) tuottaa: 35 3/2/09. Boc-Trp-Gln-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-Psi-Phe-BHA-hart- sin.

104253 30

Boc-Gln:n ja Boc-D-Trp:n peräkkäinen lisäys heptapeptidihart-siin (3/1/res) tuottaa: 3/2/10. Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-hartsin.

5

Boc-Gln.-n ja Boc-D-Tpi:n kytkentä heptapeptidihartsiin (3/1/-res) tuottaa: 3/2/12. Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-Psi-Phe-BHA-hartsin.

10 3/2/13. Boc-D-Tpi-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Glu(OMe) ja Boc-D-Tpi heptapeptidihartsiin (3/l/res).

15 Boc-ryhmän poistamisen jälkeen 50 %:sella TFA:lla DCM:ssä, joka sisältää 5 % merkaptoetanolia ja 5 % anisolia, polypep-tidihartsi pestään DCM:llä, metanolilla ja DCM:llä kulloinkin kolme kertaa ja käsitellään vastatislatulla HF:llä (5 ml) ja anisolilla (0,25 ml) 0 °C:ssa 1 tunnin ajan. Liuotin haihdu-20 tetaan tyhjössä ja pestään etyyliasetaatilla, uutetaan 70 - 80 %:sella etikkahapolla ja lyofilisoidaan. Saadaan seuraavat polypeptidit: 3/3/09. Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NIh 25 . Peptidi # • V 10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH? ·1,·' 12. D-Toi-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Phe-NH; 13. D-Tpi-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH7 •2’30 • « .‘j1. Peptidi, jossa on NH2CO N-päässä, valmistettiin seuraavasti: · • · ·

Seosta, jossa oli 40 mg raakaa polypeptidiä (3/3/9) Trp-Gln- *···' Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH-, ja 20 μΐ TEA: ta 0,5 ml : - 2 • 1;";35 ssa DMF:ää ja 20 mg KOCN:ää 100 μΐ H20:ta, sekoitettiin 0 • ♦ ;1. j °C:ssa, sitten tähän seokseen lisättiin tipoittain 100 μΐ

AcOH:ta ja reaktiota sekoitettiin 0 °C:ssa 1 tunnin ajan.

104253 31

Reaktioseos, joka sisälsi halutun peptidin (9) NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Phe-NHi. alistettiin HPLC-puhdis-tukseen.

5 Peptidi (11) valmistettiin kytkemällä peräkkäin kaksi Fmoc- aminohappoa kiinteäfaasisynteesin työvaiheessa IV esitetyllä menetelmällä.

150 mg TFA-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-osi-Phe-BHA-hartsia 10 (3/1/Res) neutraloitiin 10 %:sella TEA:11a, pestiin CH2Cl2:lla ja DMFsllä ja kytkettiin Fmoc-Glu(OBut):n kanssa, jolloin saatiin Fmoc-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-osi-Phe-BHA-hartsi (3/5/11). Fmoc-D-Trp-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-Psi-Phe-BHA-hartsi saatiin poistamalla suoja 50 15 %:sella piperidiinillä ja kytkemällä Fmoc-D-Trp:n kanssa.

But-ryhmä poistettiin Fmoc-suojatusta peptidihartsista käsittelemällä 30 minuutin ajan 10 %:sella TFA:lla DCM:ssä, joka sisälsi 2 % merkaptoetanolia. MeNH2:ta kuplitettiin 0 °C:ssa 5 minuutin ajan kerroksen läpi, jossa oli 200 mg Fmoc-D-Trp-20 Glu-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-psi-Phe-BHA-hartsia (3/6/11) 5 ml:ssa DMF:ää, sitten lisättiin 0,2 ml 20 %:sta DIC:tä DMC:-ssä ja seosta sekoitettiin 0 °C:ssa 2 tunnin ajan. Sitten " hartsi pestiin DMC:llä ja Fmoc-ryhmä poistettiin piperidii- nillä. Käsiteltiin HF:llä ja anisolilla, minkä jälkeen pepti-,/25 di (11) D-Trp-Glu (MeNH) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Phe-NH·.

puhdistettiin HPLC:llä.

• · · • · · • · • · :’·*· Tämän esimerkin retentioajat on esitetty seuraavassa taulu- kossa.

:-.-3 0 • ·

Analyyttisen HPLC:n arvot • · ·

Peptidi n:o Gradientti Retentioaika • ·

·,’ * % B/min. pylväällä D

.'•35 9. 25 - 65 16,38 « « ' 10. 25 - 65 14,62 • · i '· " 12. 25 - 65 14,72 104253 32 13. 25 - 65 19,20

Aminohappoanalyysin osoittamat aminohapon suhteet vastasivat odotettuja. Esimerkiksi peptidin (10) D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-5 Glv-His-Leu-Psi-Phe-NH? suhteet olivat 1,15:0,96:0,95:1,01:0,94:1,97 (Glu:Gly:Ala:Vai:His:Trp) ja sillä oli piikki retentioajalla 44,56 min. Peptidin (13) suhteet olivat 1,04:0,98:1,02:1,00:1,03:0,94 (Glu:Gly:Ala:-Val:His:Trp) ja sen absorptiopiikki oli retentioajalla 44,56 10 Leu-psi-Phe. Tpi:tä ei havaittu peptidissä (13).

ESIMERKKI (4)

Peptidi n:o 14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH, 15 15. D-p-Glu-Gin-Trp-Ala-Vai-Gly-His-Leu-Psi-Tpi-NH·, 16 . Phe-Glu-Trp-Ala-Vai -Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH-, 17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH; 18. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH; 19 . D-Trp-His (Bz) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 20 20. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Toi-NH; 21. D-Trp-Glu (OMe) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NH; _ 22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Vai-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH; : 23. Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Vai-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH; 24. NHoCO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NH·, T'?5 25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH; « t /. 26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH; • * z ♦ · • ·· • · · *·* ’ Leu-psi-Tpj-BHA-hartsi valmistetaan saattamalla Boc-Leu-Psi-

Trp-BHA-hartsi reagoimaan formaldehydin kanssa seuraavien • · · : *.S0 menetelmien mukaisesti.

• · * • · hl • · · : Boc-Leu-Psi-Trp-BHA-hartsi saadaan 1,0 g:sta BHA-hartsia (0,9 • · · mmoolia NH2:ta/g) kytkemällä Boc-Trp ja Boc-Leu-CHO peräkkäin työvaiheessa I ja työvaiheessa II esitetyllä menetelmällä. •'.•'.35 Yllä olevaan peptidihartsiin lisätään 10 ml DMF:ää, joka 4 4 !,*«; sisältää 1 % etikkahappoa, ja saatetaan sitten reagoimaan 10 104253 33 %:sen formaldehydin (1 ml) kanssa huoneen lämpötilassa 60 minuutin ajaksi ja pestään DMF:llä, MeOH-.lla ja DCM-.llä.

Kaikki tämän esimerkin polypeptidit sisältävät yhteisen frag-5 mentin Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2. Boc-Trp-Ala-Val-

Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-hartsi (4/1/Res) muodostettiin vaiheittain Leu-Psi-Tpi-BHA-hartsilla kytkemällä peräkkäin Boc-His(Z) (työvaihe I), Boc-Gly (työvaihe III), Boc-Val, Boc-Ala ja Boc-Trp (työvaihe I).

10 150 mg:n osa yllä esitettyä välituotepeptidihartsia alistetaan kahteen lisäkytkentään lopullisten peptidihartsien valmistamiseksi menetelmillä, joita on esitetty työvaiheessa I Hca:n, D-pGlu:n, Boc-Glu(OMe):n, Boc-Glu(OBz):n, Boc-D-Phe:n, 15 Boc-D-Trp:n, Boc-His(Bz):n, Boc-Tpi:n, Boc-D-Tpi:n, AC-Tpi:n ja Hna-Tpi:n ja työvaiheessa III Boc-Gln:n kytkemiseksi.

Boc-Gln:n ja Hca:n kytkeminen peräkkäin yllä mainittuun hep-tapeptidihartsiin (4/1/res) tuottaa: 20 4/2/14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-osi-Tpi-BHA-hart- sin.

: " Boc-Gln:n ja D-pGlu:n lisääminen peräkkäin heptapeptidihart- ·,; siin (4/1/res) tuottaa: ti‘25 4/2/15. D-P-Glu-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(z)-Leu-Psi-Tpi-BHA- hartsin.

• ·

• « I

4 · · • · « «

Boc-Glu (OBz) :n ja Boc-Phe:n kytkeminen peräkkäin yllä esitet-tyyn välituotepeptidihartsiin (4/l/res) tuottaa: ...30 4/2/16. Boc-Phe-Glu(OBz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi- 4 « BHA-hartsin.

* · · 34 104253 4/2/18 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Gln ja Boc-D-Trp heptapep-tidihartsiin (4/l/res).

5 4/2/19. Boc-D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi- BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-His(Bz) ja Boc-D-Trp heptapeptidihartsiin (4/l/res).

4/2/21. Boc-D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-10 Tpi-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Gln(MeO) ja Boc-

Tpi heptapeptidihartsiin (4/l/res).

4/2/22 . Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Gln ja Boc-Tpi heptapepti-15 dihartsiin (4/l/res).

4/2/23. Ac-Tpi-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-Psi-Toi-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Gln ja Ac-Tpi heptapeptidihartsiin (4/l/res).

20 4/2/25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Gln ja Hna-Tpi heptapepti-

• II

( . dihartsiin (4/l/res).

"'• 25 4/2/26 . Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His (Z) -Leu-psi-Tpi-BHA- < « *. hartsi muodostetaan kytkemällä Boc-Glu ja Boc-D-Tpi heptapep- • · · : *.· tidihartsiin (4/l/res) .

• · · # · « * · «

Boc-ryhmän poistamisen jälkeen ja käsittelemällä yllä oleva |*·*$0 HF:llä ja anisolilla esimerkissä (2) ja (3) esitetyllä taval- ,*:* la saadaan vastaavasti seuraavat peptidit: • · ♦ · ♦ "" Peptidi n:o 14. Hca - Gin - Trp - Ala - Vai-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH·.

35 15. D-pGlu-Gin-Trp - Ala-Vai-Glv-His-Leu-psi-Tpi-ΝΗί 4/3/16 . Phe-Glu-Trp-Ala-Vai-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH? 104253 35

Peptidi n:o 17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH; 18. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH2 19. D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NH, 5 21. D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH? 22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHj 23 . Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH-; 25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH-.

26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH, 10 20 mg Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH2: ta (4/3/16), 5 mg difenyylifosforyyliatsidia ja 10 mg KHC03:a 0,5 ml:ssa DMF:ää sekoitetaan 0 °C:ssa 24 tunnin ajan. Reak-tioseos puhdistetaan HPLC:lla käyttämällä liuotinjärjestelmää 15 40 - 70 % B 60 minuutin ajan, jolloin saadaan:

Peptidi (16). Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHj. n. 4,5 mg. Tämä oli puhdas (> 95 %) analyyttisen HPLC:n mukaisesti käytettäessä liuotinjärjestelmää 25 - 65 % 40 minuutin ajan.

20

Seosta, jossa oli 40 mg raakaa polypeptidiä 22 Tpi-Gln-Trp- ., Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH·,. 20 μΐ TEA:ta 0,5 ml:ssa DMF- I . :ää ja 20 mg K0CN:ää 100 μΐ-.ssa H20:ta, sekoitettiin 0 °C:- » « ssa. Muutaman minuutin kuluttua tähän seokseen lisättiin % 1 ••>'25 tipoittain 100 μΐ AcOH:ta ja reaktiota sekoitettiin 0 °C:ssa 1 tunnin ajan. Reaktioseos, joka sisälsi halutun (oligo)pep- • *,·* tidin: t peptidi (24). NHiCO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi- NH2, • ***30 alistettiin puhdistukseen HPLC:llä.

• * « « · \ « · ·

Fmoc-D-Trp-Gln(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA- * · · • hartsi (4/2/Res) valmistettiin kytkemällä peräkkäin Fmoc- ' Glu(OBut) ja Fmoc-D-Trp Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-Psi-Tpi- 35 BHA-hartsiin (4/l/Res) työvaiheessa IV esitetyn menetelmän mukaisesti. But-ryhmä poistetaan 10 %:sella TFA:11a DMC:ssä, joka sisältää 2 % 2-merkaptoetanolia, 30 minuutin kuluessa ja 104253 36 sitten peptidihartsi saatetaan reagoimaan MeNH2:n ja DIC:n kanssa esimerkissä (3) peptidihartsille (3/6/11) esitettyjen menetelmien mukaisesti, jolloin saadaan Fmoc-D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-BHA-hartsi (4/3/Res).

5 Fmoc-ryhmän poistamisen jälkeen piperidiinillä peptidihartsia käsiteltiin HF:llä (5 ml) ja anisolilla (0,25 ml) 0 °C:ssa 1 tunnin ajan, jolloin saatiin peptidi (20). D-Trp-Glu-(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHj.

10 Tämän esimerkin peptidien retentioaika on esitetty seuraavas-sa taulukossa.

Analyyttisen HPLC;n arvot 15 Peptidi n:o Gradientti Retentioaika

% B/min. pylväällä D

17. 25 - 65/40 17,13 18. 25 - 65/40 19,34 20 22. 25 - 65/40 21,32 26. 30 - 70/40 16,76 Tämän esimerkin peptidien aminohappoanalyysi tuotti odotetut : *· koostumukset. Esimerkiksi D-Phe-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-psi- · 25 Tpi-NH2:n (17) suhteet olivat 1,04:0,99:0,96:1,00:0,94:0,99:1,06 (Glu : Gly: Ala : Vai: Phe : His : - :*·.· Trp) . Tpi: tä ei havaittu peptidissä n:o 17, 24 ja 26 amino- ·*·*; happoanalyysissä.

* · • · · • · · « · · 30 ESIMERKKI (5) (vertailuesimerkki)

Peptidi n:o 27. Mpp-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NHi • · · '·* 28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Psi-Trp-NHi 29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH·» 35 30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Trp-NH? 31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi -Trp (For) -NH-, !,! 32. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp (For) -NH-, • « « 37 104253 33. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 34. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 Tämän esimerkin peptidit sisältävät yhteisen fragmentin Gln-5 Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH-; tai Gln-Trp-Ala-Val-Gly-

His(Z)-Leu-psi-Trp(For)-NH2. Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-BHA-hartsi (5/l/Res) muodostetaan 1,0 g:lle BHA-hartsia (0,9 mmoolia NH2:ta/g) kytkemällä peräkkäin esimerkissä (2) esitettyjen kiinteäfaa-sisynteesin työvaiheiden 10 mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-Trp(For):ia käytetään

Boc-Leu:n sijasta ensimmäisessä kytkennässä. 250 mg:n annoksia yllä esitettyjä peptidihartseja käytetään seuraavan neljän suojatun peptidihartsin synteesin suorittamiseksi kytkemällä lopuksi MPP:n, Boc-D-Phe:n, Boc-D-Trp:n tai vast. Boc-15 D-Tpi:n kanssa työvaiheessa I esitetyn menetelmän mukaisesti.

5/2/27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(2)-Leu-psi-Trp(For)-BHA-hartsi 5/2/28. Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-p(For)-20 BHA-hartsi 5/2/29 . Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-/·., Trp (For) -BHA-hartsi < 5/2/30. Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-psi-

‘Il I

Trp (For)-BHA-hartsi.

>•11 • 25 i · I i

Boc-ryhmän poistamisen jälkeen 50 %:sella TFArlla DCM:ssä,

• S

\.I joka sisälsi 5 % merkaptoetanolia ja 5 % anisolia, puolet • « o ·* * jokaisesta yllä esitetystä peptidihartsista käsiteltiin HF:- llä (5 ml) ja anisolilla (0,25 ml) 0 °C:ssa 1 tunnin ajan, ·» · J ‘Jo jolloin saatiin seuraavat peptidit: • «« r · - • · t « » ; .*, Peptidi n:o « · » ,- 31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 32. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2 35 33. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp (For) -NH-.

, 34. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp (For) -NH^ 38 104253 Näiden peptidihartsien loppuosa käsiteltiin HF:llä, joka sisälsi 5 % anisolia ja 5 % dimerkaptoetanolia, 0 °C:ssa 1 tunnin ajan, jolloin saatiin seuraavat peptidit: 5 Peptidi n:o 27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH-; 28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH·.

29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH-; 30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Trp-NH-, 10 Nämä peptidit puhdistettiin HPLCillä ja retentioajat on esitetty seuraavassa taulukossa:

Analyyttisen HPLC:n arvot 15 Peptidi n:o Gradientti Retentioaika

% B/min. pylväällä D

27. 25 - 65 27,89 28. 25 - 65 18,70 20 29. 25 - 65 19,70 30. 25 - 65 20,26 31. 25 - 65 28,00 : '·· 32. 25 - 65 19,10 :.i ; 33. 25 - 65 19,01 (<;:25 34. 25 - 65 17,70 • · · • ♦ ♦ • ♦ ·*·*: Tämän esimerkin peptidien aminohappoanalyysin arvot olivat • · odotettuja. Esimerkiksi peptidin (28) aminohapposuhteet olivat 0,98:0,92:1,03:0,97:0,98,-1,09 (Gly: Ala: Vai: Phe : His : Trp) .

...30 Peptideissä (30) ja (34) ei esiintynyt Tpi:tä.

• » • · • ♦ » • · · ESIMERKKI (6) \ Peptidi n:o 35. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe .‘.35 36. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpj-QMe ; \ 37. NH,CQ-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-OMe * " 38. D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHMe 104253 39

39. D-Tpi-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-OH

40 . D-Tpi-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-N-JkCONHi Lähtöaineena käytetään Boc-Trp-OCH2-hartsia, joka valmiste-5 taan seuraavalla menetelmällä: Seosta, jossa CICH2-hartsia (1,0 g, 0,7 mmoolia CI:tä/g), Boc-Trp:tä (2,0 mmoolia Trp:tä) ja KF:ää (4 mmoolia) 20 mlrssa DMF:ää, sekoitettiin 70 - 80 °C:ssa 4 tunnin ajan. Boc-Trp-OCH2-hartsi pestiin sitten kaksi kertaa kulloinkin MeOH:lla, H20:lla, MeOH:lla, DMF:llä ja 10 DCM:llä. Boc-Leu-psi-Trp-OCH-.-hartsi saadaan kytkemällä Boc-

Leu-CHO Trp-OCH2-hartsiin työvaiheen II mukaisesti. Boc-Leu-psi-Tpi-OCHi-hartsi saadaan saattamalla Boc-Leu-psi-Trp-OCth-hartsi reagoimaan formaldehydin kanssa esimerkissä (4) esitetyn menetelmän mukaisesti. Kytkemällä peräkkäin Boc-His(Z), 15 Boc-Gly-Boc, Val-Boc-Ala-Boc-Trp ja Boc-Gln edellä esitetty jen kiinteäfaasisynteesin työvaiheiden avulla saadaan 1,60 g Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-Psi-Tpi-OCH?-hartsia (6/1/Res). Osaa yllä mainitusta välituotepeptidihartsista käytettiin Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-20 OCH2-hartsin (6/2/35) tuottamiseksi kytkemällä Boc-Tpi. Tois ta peptidihartsin määräerää käytettiin Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His (Z) -Leu-Psi-Tpi-QCH-.-hartsin 6/2/32 tuottamiseksi : '· kytkemällä Boc-D-Tpi.

- 25 Boc-ryhmän poistamisen jälkeen 50 %:sella TFArlla DEMrssä, : joka sisälsi 5 % merkaptoetanolia ja 5 % anisolia, suoritet- • · tiin transesteröinti seuraavasti: 0,5 g:aan Tpi-Gln-Trp-Ala- • t \.!t Val-Glv-His (Z) -Leu-psi-Tpi-OCH^-hartsia (6/3/35) lisättiin • * · metanolia (15 ml), DMFrää (15 ml) ja di-isopropyylietyyli-g30 amiinia (3 ml) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 3

• · I

; ·* päivän ajan. Hartsi pestiin DMF:llä (3 kertaa) ja metanolilla • · · *.* * (3 kertaa) . Suodos ja pesuvesi yhdistettiin ja haihdutettiin kiertohaihduttimessa tyhjössä liuottimien poistamiseksi.

Käsiteltiin HF:llä ja anisolilla, jolloin saatiin 123 mg 35 raakaa peptidiä (35): Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-

Tpi-OCH3.

104253 40

Peptidi (36) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(z)-Leu-psi-Tpj-OCH3 saatiin samalla menetelmällä, mutta käyttämällä hartsia (6/2/36) .

5 Seosta, jossa oli Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi- 0CH3:a (35) (40 mg), 20 μΐ TEA:ta 0,5 ml:ssa DMF:ää ja 50 mg KOCN:ää 100 μΐ-.ssa H20:ta, sekoitettiin 0 °C:ssa, muutaman minuutin kuluttua seokseen lisättiin 50 μΐ AcOHrta ja annettiin reagoida 0 °C:ssa 1 tunnin ajan. Sitten seos puhdistet-10 tiin, jolloin saatiin peptidi (37) NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-His-Leu-psi-Tpi-OCH3.

Seosta, jossa oli D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-psi-TpiOCH3:a (36) ja metyyliamiinin l:2-liuosta (w/w) metanolis-15 sa (2 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan.

Haihdutettiin kiertohaihduttimessa tyhjössä ja sitten jäännös jäädytyskuivatettiin ja käsiteltiin HF:llä ja anisolilla. Tuote oli peptidi (38) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NHCH». 20 joka puhdistettiin HPLC:llä.

Toinen osa D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-Psi-Tpi-OCH?-! , hartsia (6/2/35) käsiteltiin HF:llä ja anisolilla, jolloin saatiin: 25 peptidi (39) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-OH.

* t » • · • · « I ’.· Seosta, jossa oli peptidiä 39 (40 mg), (Boc)20:ta (20 mg) ja ϊ.ϊ ' TEA:ta (20 μΐ) 0,5 ml:ssa DMF:ää, sekoitettiin 0 °C:ssa 4 tunnin ajan ja lyofilisoitiin. Pestiin eetterillä ja sitten ’•’30 jäännös, HOBt (10 mg) ja N2H3CONH2 (20 mg) saatettiin reagoi- maan DCI:n (100 μΐ 20 %: sta DCI:tä DCM:ssä) kanssa 0 °C:ssa • · · ' yön ajaksi, DMF haihdutettiin, pestiin eetterillä ja Boc- i i · ·*·: ; ryhmä poistettiin 50 %: sella TFA: 11a, joka sisälsi 5 % mer- « kaptoetanolia ja anisolia, jolloin saatiin raaka ;:*B5 peptidi (40) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi- N2H2CONH2.

Claims (8)

104253 41

1. Menetelmä kaavan I

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheittainen synteesi suoritetaan suojaamalla a-aseman aminoryhmä ja karboksipää liitetään kovalenttisesti 20 tähän tarkoitukseen käytettyyn synteettiseen kantoaineeseen, sitten α-suojaryhmä lohkaistaan, seuraavan aminohapon karbok- '· siryhmä pelkistetään HC=0-ryhmäksi, joka liitetään sitten : edellä mainittuun vapautettuun α-aminoryhmään, sitten tämän ··· toisen aminohapon α-aminosuojaryhmä vapautetaan suojasta ja 25 seuraavan aminohapon karboksiryhmä liitetään sitten edellä • · :v. vapautettuun toiseen α-aminoryhmään, minkä jälkeen muut syn- • · [·.·. tetisoitavan peptidin aminohapot liitetään vaiheittain oi- • · · keassa sekvenssissä ja liittäen patenttivaatimuksen 1 mukaisen täydellisen peptidin kaikki aminohapot, peptidi lohkais- • · · *·’·' 30 taan kantoaineesta ja tarvittaessa lohkaistaan muut sivufunk-• · · *.· * tion suojaryhmät, mikäli niitä on läsnä.

• · • · · • · * • « · « .··*. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- • · « *·*·' 35 His-Leu-psi-Tpi-NH? mukainen polypeptidi. « ·

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- 104253 43 His-Leu-psi-Tpi-NH, mukainen polypeptidi.

5 Leu-psi-Tpi-NH-, mukainen polypeptidi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-

5 A6 on Gly, Phe tai D-Ala; A7 on His, MeHis, His(Bz), His(Z) tai Pal; A8 on tähteen Leu tai Phe pelkistetty isosteeri ja A9 on D-, L- tai DL-Tpi, tunnettu siitä, että 10 vastaavat peptidifragmentit fragmenttikondensoidaan peptidi-kemiassa sinänsä tunnetulla tavalla, tai peptidi syntetisoidaan vaiheittaisen, peptidikemiassa tavanomaisen synteesin avulla ja tarvittaessa näin saadut peptidit asyloidaan ja/tai muunne-15 taan farmaseuttisesti hyväksyttäviksi happosuoloiksi.

5 X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-Ae-Bfii-A9-Q mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidiosien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happojen kanssa muodostettujen suolojen valmistamiseksi, jossa kaavassa 10 Q on NH2 tai OQ1, jossa Q1 on vety, C^o-alkyyli, fenyyli tai C7_10 fenyylialkyyli; X on vety, yksinkertainen sidos, joka yhdistää AL:n alfa-aminoryhmän A2:n mahdolliseen sivuketju-karboksyyli-ryhmään tai kaavan RkZO- mukainen ryhmä, jossa R1 on 15 (a) vety, C^o-alkyyli, fenyyli tai C7_10-fenyylialkyyli, (b) R2 ^ N-CO-R1^ 20 jossa R2 on vety, C^o-alkyyli, fenyyli tai C7.10- fenyylialkyyli,R3 on vety tai Ci.xo-alkyyli, tai c) R4-0-, jossa R4 on C^.m-alkyyli, fenyyli tai C7.10-1 . fenyylialkyyli; "V A1 on Mpp, D-Phe, L- tai D-Tpi, D-Trp tai Trp, joka on 25 substituoitu bentseenirenkaassa yhdellä tai useam- • · · *· " maila jäsenellä, joita ovat halogeeni, N02, NH2, OH, • Ci^-alkyyli tai C^-alkoksi, jolloin halogeeni on · fluori, kloori tai bromi; A2 on Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) tai kaa-30 van Asp(Y), Glu(-) tai Glu(Y) mukainen ryhmä, jossa • · • · · • · · • · · r6 • ♦ : Y on -OR5 tai -N , jossa O R’ «

35 R5 on vety, C^-alkyyli tai fenyyli; R6 on vety tai C^-alkyyli; R7 on vety C^-alkyyli tai -NHCONH2; ja (-) on yksinkertainen sidos, joka liittää A2:n mahdolli- 104253 42 seen sivukarboksyyliryhraän A1:n alfa-aminoryhmään, jolloin X on yksinkertainen sidos, A4 on Ala, MeAla tai Gin; A5 on Vai tai MeVal;

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan NH2cO“Tpi"Gln_TrP"Ala~Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHo tai ACY-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-

10 Leu-psi-Tpi-NH?. jossa ACY on asetyyli, hydrokinnamoyyli tai 3-hydroksi-2-naftoyyli.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Oly-His-Leu- 15 psi-Tpi-NH·,

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan polypeptidin farmaseuttisesti hyväksyttävä happoadditiosuola. • « • · · • · · ♦ · • · ♦ • · · • · • · • · · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • ♦ « • 1 1 · « · r i · I lii I • ( • • · « • « < • t 104253 44