PL169498B1 - Sposób wytwarzania nowych zwiazków polipeptydowych PL PL - Google Patents

Abstract

I Sposób wytwarzania nowych zwiazków polipeptydowych o wzorze I, X-A1 -A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8- psi-A9-Q, w którym Q oznacza grupe NH2 lub grupe OQ , gdzie Q oznacza wodór, grupe alkilowa o 1 - 10 atomach wegla, grupe fenylowa lub grupe C7-10-fenyloalkilowa, X oznacza atom wodoru, wiazanie pojedyncze wiazace grupe a -aminowa reszty A 1 z boczna grupa karboksylowa, jesli wystepuje, grupy A2, lub grupe o wzorze R 1CO gdzie R 1 jest wybrane z grup obejmujacych (a) atom wodoru, grupe alkilowa o 1-10 atomach wegla, grupe fenylowa lub grupe C7-10-fenyloalkilowa (b) gdzie oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1-10 atomach wegla, grupe fenylowa lub grupe C7-10-fenyloalkilowa. Y oznacza grupe -OR5 lub grupe o wzorze gdzie R 5 oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1-3 atomach wegla lub grupe fenylowa, R 6 oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa o 1 - 3 atomach wegla, R7 oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1 - 3 atomach wegla lub grupe o wzorze -NHCONH2, zas [ - ] oznacza wiazanie pojedyncze wiazace boczna grupe karboksylowa, jesli wystepuje, A9 oznacza D-, L-lub DL-Tpi oraz ich soli z farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami, przy czym gdy A1 oznacza Phe, A2 oznacza Glu, a gdy A oznacza D-pGlu - A2 oznacza G ln, znamienny tym, ze prowadzi sie czesciowa kondensacje fragmentów peptydow technikami wlasciwymi dla chemii peptydów lub stopniowa synteze wlasciwa dla chemii peptydów, a nastepnie ewentualnie otrzymane peptydy poddaje sie acylowaniu i/lub przeprowadza sie w farmaceutycznie dopuszczalne sole kwasowe PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych peptydów, mających wpływ na rozwój guzów rakowych u ludzi. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania antagonistów bombezyny, będących [ψ⁸’⁹ pseudo] nonapeptydami zawierającymi D- lub Ltryptofan lub analog tryptofanu, kwas 2,3,4,9-tetrahyęry-1H-piryęo[3,4-d]lnęolo-3-ksrdyksylowy (Tpi)jako aminokwas N- lub/i C-koncowy o właściwościach antagomstycznych względem bombezyny lub peptydów bombezyno-ąodobnych, ich soli oraz farmaceutycznych kompozycji i sposobów wykorzystania właściwych dla tych peptydów.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania związków polipetydowych mających właściwości antagonistyczne względem bombezyny i peptydów bombezyno-poęodnych, takich jak peptyd uwalniający gastrynę (GRP), Neuromedyna C i tym podobne, które dalej będą określane jako właściwości antagonistyczne względem bombezyny i przydatnych przykładowo w leczeniu chorób złośliwych u ciepłokrwistych zwierząt takich jak człowiek. Nowe związki polipeptydowe służą do wytwarzania nowych kompozycji farmaceutycznych zawierających takie związki polipetydowe do podawania w celu wywołania efektu antagonistycznego względem bombezyny u ciepłokrwistych zwierząt takich jak człowiek.

Bombezyna jest amidem tetradekapeptydu po raz pierwszy wyodrębnionym ze skóry zaby Bombina-bombina (Anastasi, Erspamer i Bucci, Experientia. 1971, 27, 166). Wiadomo, ze bombezyna jest silnym mitogenem dla komórek fibroblastowych myszy bwiss 3T3 (Rozengurt i bmnett-Smith, Proc.Natl.Acad.bci.UbA. 1983, 80, 2936) oraz ze stymuluje wydzielanie amylazy z gron trzustkowych świnek morskich (Jensen, Jones, Folkers i Gardner, Nature. 1984, 309. 61). Wiadomo także, że peptydy bombezyno-podobne są wytwarzane i wydzielane przez komórki małokomórkowego raka płuc u ludzie - dalej określane skrótem bCLC - (Moody, Pettgazdar, Carney i Minna, bcience. 1981, 214. 1246), ze podane egzogenicznie peptydy bombezyno-podobne mogą stymulować wzrost komórek bCLC u ludzi w warunkach in vitro (Carney, Cuttita, Moody i Minna, Cancer Research. 1987, 47, 821) oraz ze monoklonalne

169 498 przeciwciało specyficzne dla regionu C-końcowego bombezyny i GRP może zablokować przyłączenia gRp do jego receptorów i zapobiegać rozwojowi ludzkich komórek SCLC zarówno in vitro, jak i in vivo (Cuttita. Carney, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler i Minna, Nature, 1985,316, 823).

GRP, mający właściwości podobne do bombezyny, jest szeroko rozpowszechnionym amidem peptydu zawierającego 27 aminokwasów, wyodrębnionym z jelit świni (McDonald, Jomvall, Nilsson, Vagne, Ghatei, Bloom i Mutt, Blochem. Biophvs. Res. Commun., 1979, 90, 227), w którym C-końcowa sekwencja aminokwasowa jest niemal identyczna jak podobna sekwencja bombezyny. Neuromedyna C jest amidem dekapeptydu o strukturze identycznej jak struktura ostatnich dziesięciu aminokwasów w regionie C-końcowym peptydu uwalniającego gastrynę - GRP, który został wyizolowany z jelita cienkiego psa (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke i Shively, J.Biol.Chem.. 1983, 258. 5582). GRP stymuluje różnorodne odpowiedzi biologiczne, w tym uwalnianie gastryny do obiegu układowego. Działa także jako czynnik wzrostu fibroblastów mysich 3T3 i komórek małokomórkowego raka płuc (SCLC) Tak więc zaproponowano, aby GRP uznać za bezpośrednio patofizjologiczny czynnik w rozwoju SCLC poprzez autokrynny mechanizm wzrostu.

Struktury bombezyny, Neuromedyny C i nonapeptydu GRP od strony końcowej grupy karboksylowej podane są poniżej:

BombezynafDGlu-Gjn—Arg-Leu-Gjly-Asn-CjnT-Trp-Ala-Yal-Gly-His-Leu-Met-NH:

Neuromedyna C H-Gly-Asn-His-T^-Ala-yal-Gly-His-Leu-Met-Ni

C-końcowy nonapeptyd GRP -Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-H is-lLii-M.et-rNH'2

Badania nad innymi peptydami podobnymi do bombezyny pochodzącymi z organizmów płazów ziemno-wodnych doprowadziły do wyizolowania litoryny - nonapeptydu (pGlu-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2) ze skóry zaby z Papui w Nowej Gwinei, który okazał się najsilniejszą bombezyną (Yasukara i in., Chem Pharm Buli.. 1972, 27, 492). Badania nad analogami bombezyny wykazały, ze minimalny segment zbudowany z 9 reszt aminokwasowych występujący w pozycjach 6-14 sekwencji bombezyny ma pełen wachlarz aktywności bombezyny.

Znanych jest kilka rodzajów antagonistów bombezyny. Substancja P (Arg-Pro-Lys-Pro-GlnGln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-ML), w której występuje lekka homologia sekwencji aminokwasowej względem bombezyny nie hamuje wiązania bombezyny i peptydów bombezyno-podobnych, ale analogi Substancji P zmodyfikowane przez zastąpienie kilku aminokwasów L aminokwasami D, takimijak S ubstancj a P z(D-Arg’, D-Pro², D-Trp⁷ , Leu¹¹) i Substanc j a P z (D-Arg¹, D-Phe⁵, D-Trp⁷’9, Leu¹1 według Moody i in. Fed. Proceedings. 1987,46,2201 -jak stwierdzono - blokują wydzielanie bombezyny w komórkach gronowych trzustki i antagonizują efekt pobudzania wzrostu przez bombezynę w komórkach Swiss 3T3. Dwa typy antagonistów bombezyny - pochodne bombezyny, przykładowo (D-Phe⁶, D-Phe ¹ l)-bombezyra i (Leu¹³--py--L:u^|1)-bombezyna (Coy i in., J.Biol.Chem.. 1988,263.5056 i peptydy, 1989,10,587) - okazały się silnymi inhibitorami odpowiedzi bombezyny w próbach in vitro oraz in vivo.

Innym typem antagonisty bombezyny ujawnionym przez Heimbrook i in. (J.Biol Chem.. 1989, 254. 11258) jest N-acetylo-GRP(202-26) i jego analogi, w których C-końcowa reszta metiomonowa jest usunięta w analogach peptydu GRP(20-27). Ostatnio Coy [J.Biol Chem.. 1989, 264. 14691] doniósł, ze niektóre związki antagonistyczne bombezyny o krótkich łańcuchach, oparte na sekwencji litoryny, takie jak [D-Phe6, Leuⁿ - psi-Phe¹4^-bombezvra(6-14) i [D-Phe6, Leu^-psi-Leu¹⁴!-bombezyna(6-14). przejawiają znacznie silniejsze działanie niz odpowiadający im macierzysty peptyd [Leu1³--psi.-Leu14|-bombezyna.

Jak wiadomo toksyny komórek stosowane w standardowej chemioterapii zabijają szybko narastającą tkankę rakową wraz z wolniej narastającą zdrową tkanką ze względu na niespecyficzny charakter działania cytotoksyn oraz wymagane dawki w leczeniu nowotworów. Przez to chemioterapia nieuchronnie pociąga za sobą niepożądane skutki uboczne. Od dziesiątek lat poszukiwane były środki nie mające tego niepożądanego działania - od dawna istniało ogromne zapotrzebowanie na środki terapeutyczne działając wyłącznie i specyficznie na tkankę rakową, nieszkodliwe dla zdrowej tkanki. Naukowcy poszukiwali środków terapeutycznych o działaniu przeciwrakowym, zabijających tkanki raka i hamujących niezwykle szybki przyrost tej tkanki

169 498 bez ogólnej szkody dla zdrowych komórek. Poszukiwania te obejmowały również peptydy hormonalne, ale dotychczas wszelkie próby stworzenia skutecznego środka leczniczego zwalczającego raka na bazie peptydu hormonalnego, nastawionego na zwalczanie cytotoksyn, zakończyły się niepowodzeniem

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowych polipeptydów, będących silnymi antagonistami bombezyny oraz farmaceutycznych kompozycji zawierających te peptydy, wykorzystywanych jako środki aktywne farmaceutycznie.

W szczególności wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania pseudopeptydów zawierających resztę polipeptydową o wzorze'

X-A¹1 A²-A³-A⁴-A⁵-A⁶-A⁷-A⁸-psi-A⁹-Q, w którym:

Q oznacza grupę NH? lub grupę OQ', gdzie Q' oznacza wodór, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-u-fenyloalkilową;

X oznacza atom wodoru, wiązanie pojedyncze wiązące grupę a-aminową reszty A¹ z boczną grupą karboksylową, jeśli występuje, grupy A“, lub grupę o wzorze R'CO- gdzie R¹ jest wybrane z grup obejmujących:

(a) atom wodoru, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla,grupę fenylową lub grupę C7-ll-fenyloalkllową, (b) R² >NR³ gdzie

R? oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-ll-fenyloalkllową, r3 oznacza atom wodoru lub grupę alkilową o 1-10 atomach węgla oraz (c) R⁴-O-, gdzie.

r4 oznacza grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-io-fenyloalkilową,

A1 oznacza resztę wybraną z grupy obejmującej Mpp, D-Phe, L- lub D-Tpi, D-Trp, Trp, Phe lub D-pGlu, podstawioną przy pierścieniu benzenowym przez jeden lub kilka podstawników wybranych z grupy obejmującej atom chlorowca, grupę NO2, NH2, OH, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla i grupę alkoksylową o 1-3 atomach węgla, przy czym chlorowiec oznacza fluor, chlor 1 brom;

A? oznacza Asn, Dpa, Gln, His, MeHis, His(Bzl), His(Z) lub grupę Asp(Y), Gluf-] i Glu(Y), gdzie:

Y oznacza grupę -OR⁷ lub grupę o wzorze

R⁶

-N<

R⁷ gdzie:

R ⁵ oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla lub grupę fenylową, r6 oznacza atom wodoru lub grupę alkilową o 1-3 atomach węgla, r7 oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla lub grupę o wzorze NHCONH2, zaś [-] oznacza wiązanie pojedyncze wiązące boczną grupę karboksylową, jeśli występuje, grupy A? z grupą a-rioizrzą reszty A1 w której X oznacza wiązanie pojedyncze,

A³ oznacza Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) lub Trp podstawiony przy pierścieniu benzenowym jednym lub kilkoma podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej atom chlo8

169 498 rowca, grupę NO2, NH2, OH, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla i grupę alkoksylową o 1-3 atomach węgla, przy czym chlorowiec oznacza fluor, chlor i brom,

A⁴ oznacza Ala, MeAla, lub Cln,

A⁵ oznacza Val lub MeVal, a6 oznacza Cly, Phe lub D-Ala,

A⁷ oznacza His, MeHis, His(Bzl), His(Z), Lys(Z) lub Pal,

A⁸ oznacza zredukowany izoster Leu lub Phe, a9 oznacza D-, L- lub DL-Tpi oraz ich soli farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami, przy czym gdy a1 oznacza Phe, A² oznacza Clu, a gdy a1 oznacza D-pClu - A² oznacza Cln polegający na tym, ze prowadzi się częściową kondensację fragmentów peptydów technikami właściwymi dla chemii peptydów lub stopniową syntezę właściwą dla chemii peptydów, a następnie ewentualnie otrzymane peptydy poddaje się acylowaniu i/lub przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalne sole kwasowe.

W korzystnej postaci stopniową syntezę prowadzi się zabezpieczając grupę aminową w pozycji a grupą ochronną przy związaniu C-końcowej grupy karboksylowej kowalencyjnym wiązaniem z syntetycznym nośnikiem stosowanym w takim celu, a następnie usuwa się z pozycji a grupę ochronną, redukuje się grupę karboksylową następnego aminokwasu do grupy HC = 0, którą następnie przyłącza się do odblokowanej grupy α-aminowej, po czym odblokowuje się grupę (C-aminową tego następnego aminokwasu i podstawia się ją grupą karboksy kwvą kolejnego aminokwasu, prowadząc krok po kroku, kolejne etapy przyłączenia w prawidłowej kolejności dalszych aminokwasów stanowiących elementy syntetyzowanego peptydu, a po związaniu wszystkich aminokwasów w kompletny peptyd, który oddziela się od nośnika 1 ewentualnie usuwa się inne grupy ochronne bocznych grup funkcyjnych, jeśli są obecne

Korzystnie według wynalazku wytwarza się nowe związki polipeptydowe o wzorze D-Phe-Cln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu--psi-Tpi-NH2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.

Korzystnie według wynalazku wytwarza się nowe związki polipeptydowe o wzorze. D-TrpCln-Trp-Ala-Val-Cly-His-Leu-opsi-Tpl-IXH2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.

Korzystnie według wynalazku wytwarza się nowe związki polipeptydowe o wzorze. Tpi-Cln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu--psi-Tpi-NH2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.

Korzystnie według wynalazku wytwarza się nowe związki polipeptydowe o wzorze. ACY-Tpl-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hls-Leu-opsi-Tpl-NH2, gdzie ACY oznacza grupę oktanoilową, przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.

Korzystnie według wynalazku wytwarza się nowe związki polipeptydowe o wzorze: D-TpiCln-Trp-Ala-Val-Gly-HiS-Leu-fps.i-Tpi-fNH2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.

Korzystnie według wynalazku wytwarza się nowe związki polipeptydowe o wzorze: Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi.-Tpi-NH2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.

W przypadku wytwarzania związków polipeptydowych w formie farmaceutycznie dopuszczalnych nietoksycznych soli, zwłaszcza soli addycyjnych z kwasami, takich jak chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, fosforan, fumaran, glukonian, taniman, maleinian, octan, cytrynian, benzoesan, bursztynian, alginian, palmitynian, mleczan, askorbinian, winian, stosuje się odpowiednie kwasy.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania nowych związków polipeptydowych o wzorze:

X-A1-A2-A³-A4-A5-A6-A7- A⁸-psi-A9-Q, w którym:

Q oznacza grupę NH2 lub grupę OQ1, gdzie Q1 oznacza wodór, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-o-fenyloalkllową;

169 498

X oznacza atom wodoru, wiązanie pojedyncze wiążące grupę ('/-aminową reszty a1 z boczną grupą karboksylową, jeśli występuje, grupy A“, lub grupę o wzorze R^O-, gdzie r1 jest wybrane z grup obejmujących.

(a) atom wodoru, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-n-fenyloalkilową;

(b) R² >N

R³

Gdzie R oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-ll-fenyloalkllową, R³ oznacza atom wodoru lub grupę alkilową o 1-10 atomach węgla oraz (c) R⁴-O-, gdzie:

R⁴ oznacza grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7_1-fenyloalkiolową, a1 oznacza L-, D-, lub DL-Tpi;

A² oznacza Asn, Dpa, Gln, His, MeHis, His(Bzl), His(Z) lub grupę Asp(V), Glu--] i Glu(V), gdzie

V oznacza grupę -OR⁵ lub grupę o wzorze R⁶

-N<

R⁷ gdzie:

r5 oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla lub grupę fenylową,

R⁶ oznacza atom wodoru lub grupę alkilową o 1-3 atomach węgla,

R t oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla lub grupę o wzorze NHCONH, zaś [-] oznacza wiązanie pojedyncze wiążące boczną grupę karboksylową, jeśli występuje, grupy A z grupą α-aminową reszty A1 w której X oznacza wiązanie pojedyncze, a3 oznacza Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) lub Trp podstawiony przy pierścieniu benzenowym jednym lub kilkoma podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej atom chlorowca, grupę NO, NH, OH, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla i grupę alkoksylową o 1-3 atomach węgla, przy czym chlorowiec oznacza fluor, chlor 1 brom, a4 oznacza Ala, MeAla lub Gln, a5 oznacza Val lub MeVal, a6 oznacza Gly, Phe lub D-Ala,

A⁷ oznacza His, MeHis, His(Bzl), His(Z), Lys(Z) lub Pal,

A⁸ oznacza zredukowany izoster Leu lub Phe, a9 oznacza D-, L- lub DL- resztę aminokwasową wybraną z grupy obejmującej Leu, Phe, Trp lub Trp(For); jak również ich soli z farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami przez częściową kondensację fragmentów peptydów technikami właściwymi dla chemii peptydów lub stopniową syntezę właściwą dla chemii peptydów, a następnie ewentualnie otrzymane peptydy poddaje się acylowaniu i/lub przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalne sole kwasowe

W korzystnej postaci stopniową syntezę prowadzi się zabezpieczając grupę aminową w pozycji a grupą ochronną przy związaniu C-końcowej grupy karboksylowej kowalencyjnym wiązaniem z syntetycznym nośnikiem stosowanym w takim celu, a następnie usuwa się z pozycji

169 498 a grupę ochronną, redukuje się grupę karboksylową następnego aminokwasu do grupy HC=O, którą następnie przyłącza się do odblokowanej grupy cc-aminowej, po czym odblokowuje się grupę α-aminową tego następnego aminokwasu i podstawia się ją grupą karboksylową kolejnego aminokwasu, prowadząc krok po kroku, kolejne etapy przyłączenia w prawidłowej kolejności dalszych aminokwasów stanowiących elementy syntezowanego peptydu, a po związaniu wszystkich aminokwasów w kompletny peptyd, który oddziela się od nośnika i ewentualnie usuwa się inne grupy ochronne bocznych grup funkcyjnych, jeśli są obecne

Korzystnie według wynalazku wytwarza się nowe związki polipeptydowe o wzorze: D-Tpi-Gln-Tij>Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-.\Tl2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.

Korzystnie według wynalazku wytwarza się nowe związki polipeptydowe o wzorze' D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.

Korzystnie według wynalazku wytwarza się nowe związki polipeptydowe o wzorze: D-TpiGln-Trp-Ala-/ah-jly-His-l^eu-pu-Urp-NIl·! przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.

W przypadku wytwarzania związków polipeptydowych w formie farmaceutycznie dopuszczalnych metoksyczych soli, zwłaszcza soli addycyjnych z kwasami, takich jak chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, fosforan, fumaran, glukoman, taninian, maleinian, octan, cytrynian, benzoesan, bursztyman, alginian, palmityman, mleczan, askorbmian, winian, stosuje się odpowiednie kwasy.

Dla uproszczenia opisu wynalazku zastosowano konwencjonalne skróty nazw aminokwasów, peptydów i ich pochodnych, powszechnie stosowane i przyjęte w dziedzinie chemii białek i rekomendowane przez Komisję Nomenklatury Biochemicznej IUPAC-IUB w wersji opublikowanej w European J.Biochem.. 1984, 138. 9-37.

Skróty odpowiadające pojedynczym resztom aminokwasowym wyprowadzone są ze zwyczajowych nazw tych aminokwasów, jak przykładowo Trp od tryptofanu, Gln od glutaminy, His od histydyny, Ala od alaniny, Val od waliny, Gly od glicyny, Leu od leucyny Phe od fenyloalamny Gdy reszta aminokwasowa ma formy izomeryczne, skrót bez dodatkowej identyfikacji oznacza formę L; inne formy izomeryczne oznaczone są odpowiednio symbolem Dlub DL- poprzedzającym skrót.

Nazwy mało znanych aminokwasów skrócono w mniejszym opisie następująco:

Dpa oznacza kwas 2,3-^i^iu^mmopropionowy,

Nal oznacza 3--2-naftylo)alaninę,

Thi oznacza n-2n-ilenylralamnę,

Tpi oznacza kwas 2,3,4,9-tetrahydro-1 H-plrydo[3,4-b]lndolo-3-karboksylowy.

Sekwencje peptydowe zapisywane są zgodnie z konwencją, według której aminokwas

N-końcowy jest zapisany z lewej strony, a aminokwas C-końcowy jest zapisany z prawej strony.

Hca oznacza kwas hydrocynamonowy,

Hna oznacza kwas 3-hydroksy-2-naftoesowy,

Hpp oznacza kwas 3n4ylydro0sylenylo)piΌ{lloao'wy,

Mpp oznacza kwas 3n4m^nlo0syl'enayo)proploaow^,y,

Paa oznacza kwas fenylooctowy.

Ponadto w opisie stosowane są następujące skróty.

AC oznacza grupę acylową,

Ac oznacza grupę acetylową,

AcOH oznacza kwas octowy,

Boc oznacza grupę t-butoksykarbonylową, (Boc)2O oznacza dwu-t-butylo-dwuwęglan,

BHA oznacza benzbydryloaminę,

Bzl oznacza grupę benzylową,

BSA oznacza albuminę z surowicy bydlęcej,

DIC oznacza dwuimid kwasu 1,3-dwuizopropylokarboksylowego,

DMEM oznacza modyfikowaną pożywkę Eagle firmy Dulbecco,

169 498

ET oznacza grupę etylową,

EDTA oznacza kwas etylenodwuaminoczterooctowy,

FCBS oznacza surowicę cielęcą płodową,

Fmoc oznacza grupę ©fuioOnykoneLoksykarbonylową,

For oznacza grupę formylową,

HITES oznacza pożywkę RPMI 16 4D z dodatkiem hydrokortizonu w stężeniu 10‘⁸M, bydlęcej insuliny w stężeniu 5 μΐ/ml, ludzkiej transferyny w stężeniu 10 gg/ml, β-esttadiolu w stężeniu 10'⁸M i Na-SeO3 w stężeniu 3 x 10’4m,

HOBt oznacza 1 -hhlTr^o^<sybeⁿz.otrκlzol,

HPLC oznacza wysokowydajną chromatografię cieczową,

Me oznacza grupę metylową,

MeCN oznacza acetomtryl,

MeOH oznacza alkohol metylowy,

TEA oznacza trójetyloaminę,

PBS oznacza roztwór chlorku sodu zbuforowany buforem fosforanowym, pGlu oznacza kwas piroglutaminowy, psi oznacza wiązanie pseudopeptydowe o strukturze CH--NH z wyjątkiem sytuacji, w której następna reszta ma drugorzędowy N-końcowy atom azotu, kiedy to symbol psi oznacza strukturę o wzorze CH-N,

TFA oznacza kwas trójfluorooctowy,

Z oznacza grupę benzyloksykarbonylową.

Najkorzystniejsze polipeptydy otrzymywane sposobem według wynalazku obejmuje ponizsze zestawieniePeptyd Nr Wzór

2. D-T rp-Gln-Tpp-AJa-V^d-Gly-His-Leuptsi-Leu-NH2

5. D-Tpi-Gln-Tηp-Alp-Va1 - Gln-Hip-L·eu-psi-Leu-NH?

6. D-Tpi-Glu(OMp)-Trn-Alp-Va1-Gln-Hip-Len-rtsp-Leu-^H-2

7. D-Tpi-Hip-T rp-Ab-Va1-Gln-H tP-Len-rysp-Leu-NH2

8. D-Tpi-Hts(Bzl--TIrnAlp-Va1-Gln-Hip-Len-rts--Leu-NH2

9. NH₂CO-T rp-Gln-T p-Ak-Va1-Gln-Hip-Len-rssp-Phe-NH2

10. D-Tηp-Gln-Tηp-Λlp-Va1-Gln-Hip-Len-r?sp-Phe-NH2

11. D-Tq--Giu(MeNH)-T rn-Aln-Va1-Gln-Hip-Len-rssp-Phe-NH2

12. D-Tpi-Gln-Trp-Alp-Va1-Gly-Hts-Lsu-pgiP-Phe-NH^

13. D-Tpi-Glu(OMρ)-Trn-Alp-V in-Gln-Hip-Lenrpsi-Phe-NH?

17. D-Phρ-Gln-Tqp-Alp-VaP-Gly-HtP-Leu-rssp-Tpi-NH[2

18. D-Trp-Gln-TIrp-Ala-Va1-Glγ-Htp-Leu-rSϊi-Tpi-NH2

22. Tpi-Gln-Tηp-Λlp-Va1-Gly-ίitp-Leu-ps2p-Tpi-NH2

26. D-Tpi-Gln-TΓp-Alp-Va1-Gln-IIip-Len-rts--Tpi-NΉ2

27. Mpn-Gln-Trn-Alp-Va1-Gln-Hip-Len-J:ssp-Trp-NH2

28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-HtP-Len-rysp-Trp-Nl·L·

29. D-Trp-Glp-Trp-Alp-Va1-Gly-HtP·-Leu-rysp-Trp-Nl·l2

169 498

D-Tui-Gln-Tou-Ala-Val-Glv-His-Leg-usi-Top-NH2

31. Muu-Gln-Tou-Ala-Val-Gly-His-Leg-Jusi-TIo^(For)-ΪNH2

32. D-Phe-Glo-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leg--uSi-TΓp(Too)-NH2 3 3. D-Top-GIo-Tou-Ala-Val-Glv-His-Leg-psi-T10u(Foo)-NH2 34. D-Tpi-Gln-Tou-Ala-Val-Gly-His-Leg-]usi-Tηu(For)-NH2

Do szczególnie korzystnych uoliueutydów według wynalazku należą peptydy oznaczone wyżej numerami 5,7,12,17,18,22 i 26

Sposobem według wynalazku wytworzyć można także peptydy o następujących wzorach:

1. NN2-CC-TτoGln-Tτ}-AA-Val-Gly-HΊs-Leu-r-U-Leu-NN2

3. D-Trp-G^MeNH-Tιρ-ΑΑ-νa1-Gly-His-L,eg-psi-Leg-1NH2

19. D-Tru-His(Bz))-TIu>Ala-Yal-Gly-His-Leu-Ed-Tpi-NH2

20. D-Top-Glg(MeNH))-TIp-Ala-Val-Gly-His-Leg-psi-Tpi-NH2

21. D-Tou-Glg-(OMe)-Tou-lA[a-Val-Gly-His-Leg-lU3i-Tpi-NH2

23. Aa-Tui-Glrl-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-usi-Tpi-NH2

24. NH iCO-Tpi-Gln-Tip- Ala-Val-Gly-His-Leg-_usi-Tpi-NH2 3 5. Tui-Glo-TIou-Ala-Val-Gly-HissL_eu-—U-Tui-OMe

36. D-Tui-Gln-Tou-Ala-Val-Gly-His-Leg-uA-Tpi-OMe

37. NH2CO-Tui-GOl-TIu>Ala-Val-Gly-His-Leu-usi-Tpi-OMe 3 8. D-Tui-Glrl-Tou-Ala-Val-Gly-His-Leg--usi-Tpi-NHMe

39. D-Tui-Gln-Tou-Ala-Val-Gly-His-Leg-usi-Tpi-OH

Podobnie wytworzyć można następujące nowe peptydy, należące do tej samej klasy związków chemicznych, lecz nie objęte wyżej zdefiniowanym wzorem ogólnym I.

4. 5F-D-Trp-Glo-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-u£i-Leg-NH2

14. Haa-Gln-Tou-Ala-Val-Gly-His-Leg-J^si-Tpi-N H2

15. D-pG^-Gln-Tou-Ala-Val-Glv-His-Leg-usi-Tpi-NH2

16. Phe-Glu-Tip-Ala-Val-Gly-His-L,eu-uS!i-Tlu-NH2

25. Hna-Tui-Gln-Top-Ala-Val-Gly-His-Leg-lps_i-Tpi-NH2

40. D-Tui-Gln-Tou-Ala-Val-Gly-His-Leu-u>si-Tui-N2H2CON^τH2

SYNTEZA POLIPEPTYDÓW.

PoliueutyOy według wynalazku można otrzymywać dowolnymi technikami znanymi specjalistom z dziedziny peptydów. Przegląd znanych technik znalezć można w publikacji M.Bc^^anszky ut.Princiules of Peptide Synthesis (Zasady syntezy pe^y^lów) wyd. Spoinge,·Verlag, Heidelberg, 1984.

W podręczniku J.M. Stewarta i J. D. Yogoęaut. Solid Phase Peptide Synthesis (Synteza peptydów w fazie stałej) wyd. Pieoce Chem Co., Rockfood, IL, 1984 (wydanie 2-gie) oraz w

169 498 przeglądzie G Barany i in nt Int. J Peptide Protein Res., 30, 705-739, 1987 opisano techniki syntezy peptydów prowadzone wyłącznie w fazie stałej

Synteza w fazie stałej jest szczególnie korzystnym sposobem wytwarzania polipeptydów według wynalazku i peptydów pośrednich do ich wytwarzania. W syntezie w fazie stałej polipeptydów według wynalazku jako nośnik wykorzystuje się dostępną w handlu żywicę benzhydiyedlwuninową (żywica BHA) lub chlorometylowaną żywicę polistyrenową sieciowaną 1% dwuwinylobenzenem. Jako grupę blokującą grupę α-aminową wybrano grupę t-butoksykarbonylową (Boc), którą usuwano w każdym etapie syntezy Jako materiał wyjściowy zawierający zablokowany aminokwas, zastosowano aminokwas z grupą aminową zablokowaną grupą t-butoksykar-bonylową, sprzęzony z żywicą BHA lub przyłączony do chlorometylowanej żywicy polistyrenowej za pomocą KF Syntezę rozpoczęto od C-końcowego aminokwasu polipeptydu i prowadzono ją stosując ręczne urządzenie i powtarzając w każdym etapie odblokowanie grupy a-aminowej oraz sprzęganie z następnym aminokwasem.

OCZYSZCZANIE POLIPEPTYDÓW.

Generalnie polipeptydy oczyszczano techniką wysokowydajnej chromatografu cieczowej (HPLC), stosując kolumnę z odwróconą fazą w systemie Rainin HPLC (firmy Rainin Inc ,Co., Woburn, MA, USA) z trzema pompami do HPLC typu Ramin Rabbit HP, sterowanymi za pomocą komputera Apple Mackintosh Plus, z injektorem typu Rheodyne Injector i monitorem o zmiennej długości fali światła UV typu Knauer Model 87. Surowe peptydy w ilości 10-40 mg wprowadzano na kolumnę Dynamax Macro o wymiarach 21,2 x 250 mm, wypełnioną sferycznym żelem krzemionkowym C« o wielkości cząstek 12 pm i wielkości porów 300 A (firmy Rainin Inc Co.), a następnie kolumnę eluowano, stosując gradient linearny oraz układ rozpuszczalników składający się z(A) 0,1 % TFA i (B) 0,1 % TFA w 70% wodnym roztworze acetonitrylu przy szybkości przepływu 2,0 ml/min. Wszystkie zebrane frakcje oznaczano na czystość oraz czas retencji, stosując analityczną HPLC opisaną poniżej.

Jakość oraz charakterystyki wymywania surowego i oczyszczonego peptydu ustalano, posługując się analityczną HPLC na aparacie do chromatografii cieczowej Hewlett-Packard Model 1090 wyposażonym w detektor diodowy nastawiony na 220 i 280 nm, kolumnę o wymiarach 4,6 x 250 nm W-porex Cis (cząstki wielkości 5 pm, wielkość porów 300 A) z fazą odwróconą Szybkość przepływu utrzymywano na poziomie 1,2 ml/min Stosowano układ rozpuszczalników (A) i (B) opisanych wyżej. Rozdział prowadzono w temperaturze pokojowej

W większości przypadków polipeptydy poddawano dalszemu oczyszczaniu na drodze rechromatografn na tej samej kolumnie z lekko zmienionymi gradientami. Homogemczność oczyszczonych peptydów oznaczona metodą analitycznej chromatografii HPLC była powyżej 97%

ANALIZA AMINOKWASÓW

Analizę polipeptydów według wynalazku pod kątem oznaczenia aminokwasów prowadzono stosując analizator aminokwasów Beckman 6300, biorąc próbki hydrolizowane w temperaturze 110°C przez 20 godzin w zatopionych rurkach próżniowych za pomocą 4M kwasu metanosulfonowego zawierającego 0,2% 3--2-aminoetylo)-indolu. Zawartość poszczególnych aminokwasów była zgodna z oczekiwaniami. Reszty Leu-psi-Leu i Leu-psi-Phe wykazują piki absorpcji o czasie retencji odpowiednio 39,93 i 44,56 mm. Prowadząc analizę nie znaleziono Tpi po 50 minutach trawienia.

OZNACZENIA (A) Próba na wiązanie receptora

Wiązanie peptydu ⁿ⁵I4jRP( 14-27) i wyparcie przez antagonistów bombezyny prowadzono na płytkach do hodowli tkankowej o 24 zagłębieniach (GIBCO) stosując komórki Swiss 3T3 Fibroblasty myszy Swiss 3T3 utrzymywano przez cotygodniowy pasaż w DMEM z dodatkiem 10% FCBS i substancji przeciwgrzybowych Hodowle inkubowano w atmosferze powietrza z zawartością 5% CO2 w temperaturze 37°C Każde zagłębienie zaszczepiono komórkami w ilości 105 komórek/dołek (żywotność >95%) hodowanymi do zlania się 1 bezruchu. Proces wiązania przeprowadzono 7 dni po zaszczepieniu. Komórki przemyto dwukrotnie 0,5 ml buforu wiążącego (modyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco zawierająca 20 nM HEPES-NaOH - pH 7,4, 0,2% BSA 1 100 mcg/ml bacytracyny) Następnie komórki inkubowano z 0,2 nM 1²⁵I-GPR

169 498 (14-27) w obecności lub bez dodatku różnych stężeń antagonistów (6x10^H - 6x10- M przy całkowitej objętości 0,4 ml).

Zgodnie z informacjami Zachary & Rozengurd (Press Natl. Acad Sci, UbA, 1985, 85 3636-3(670) oraz Layton i inni (Cancer Res.. 1988, 43, 4783-4789) wiązanie 1l-GRP w 37°C osiąga wartość maksymalną po 30 minutach, a następnie obniża się, dlatego komórki inkubowano przez 30 min w 37°C. Następnie komórki przemywano dwukrotnie lodowato zimnym (4°C) buforem wiążącym i dwukrotnie lodowato zimnym roztworem solanki buforowanej buforem fosforanowym (PBb, mM): NaCl 138, KCl 2,8, NsHPO4 8, KH2PO4 1,45 CaCl 0,91, MgCl 0,49. Przemyte hodowle ekstrahowano 0,5 ml 0,5 M NaOH i przenoszono do probówek do zliczenia. Zagłębienia przemyto raz 0,5 ml wody destylowanej (sterylnej) i przepłucz dodano do odpowiednich probówek. Następnie zmierzono radioaktywność próbek dokonując zliczenia w automatycznym czytniku gamma (Micromedic bystem, Inc. Huntsville, Ala).

Do ustalenia rodzajów wiązania z receptorem, stałej dysocjacji (Kd), stałej asocjacji (Ka), maksymalnej zdolności wiązania receptorów (Bk) i wartości 50% maksymalnego hamowania (IC50) wykorzystano program Ligand do komputerowej analizy krzywych Munson’ a i Rodbard’ a (Anal.Biochem.. 1987, 107. 220-239).

Wartości IC50 oznaczają stężenia antagonistów powodujące zahamowanie w 50% wzrostu stymulowanego 0,2 nM GRP( 14-27). btała dysocjacji 1 maksymalna zdolność wiązania ^IGRP(14-27) w przeprowadzonych doświadczeniach wynosiły odpowiednio 1,32 nm oraz 0,769 pm/mg białka, podobnie do wartości literaturowych dla ^i-GRP i (²⁵I-Tyr4-bomdezyny . Charakterystyki wiązania receptorów GRP w komórkach 3T3 w tych doświadczeniach zgadzają się dobrze z wartościami otrzymanymi dla domdezyny wiązanej przez komórki gron trzustkowych przez Jensena i innych. (Proc Natl.Acad. bci.UbA 1978, 25, 6139^^143) 1 komórki przysadki mózgowej przez Westendorfa i bchonbrunna (J.Biyl.Chem. 1983, 258. 7527-7535).

GRP( 14-27) inhibituje wiązanie l2I-GRP(04-27), a wartość IC50 wynosi 2,32 nM, co zgadza się z podaną przez Laytona i innych (Cancer Res.. 1988 , 48, 4783-789) wartością 2,2 nM. Dane dotyczące wiązania dla polipeptydów według wynalazku podane są w tabeli 1.

Tabela 1

WIĄZANIE PRZEZ KOMÓRKI SWISS 3T3

Kod	Ka(nM-)	Kd(nM)	IC 50(nM)
7	ND		-
5	0,129	8	9,2
12	0,014	71	81,65
26	0,045	22	25,3
17	0,955	1	1,2
2	0,095	10,6	12,19
34	0,0006	1667	1917,05
11	0,217	5	5,75
27	0,013	74,5	85,66
29	0,0019	526,3	604,9
30	0,254	4	5,15
28	0,125	8	9,16
33	0,002	556	639,4
18	0 257	4	4,6
10	1	1	1,15
22	1,012	0,9	1.14
8	0,014	71	82,14

GRP( 14-27) 0,758±0,23 1,32±0,43 1,52±0,7 Bmax = 7,12 x 10-², tj 0,354 x H)-² M/mg białka N D = BRAK PODSTAWIENIA

IC 50 oznacza stężenie nieznaczonego ligandu, który wypiera połowę znaczonego radioaktywnie ligandu wiążącego Oblicza się je według równania Chenga i Prusoffa (13 , 1973, 22, 3099) IC50 = Kc

169 498 (1+L/Kh), w którym Kc i Kh oznaczają stałe dysocjacji dla ligandów, odpowiednio nieznaczonego (zimnego) i znaczonego radioaktywnie (gorącego), zaś L oznacza stężenie użytego ligandu radioaktywnego (B) Uwalnianie amylazy

Wyizolowane grona trzustkowe otrzymano przez trawienie kolagenazą trzustek wypreparowanych ze szczurów Wisrat płci męskiej (150-180g), którym przez noc nie podawano pożywienia Zwierzęta uśmiercano przez skręcenie karku, następnie usuwano trzustkę, którą z kolei trawiono wysokiej czystości kolagenazą (CLSPA, 540 U/mg, Cooper Biomedical, Freehold, N.J., USA) metodą opisaną przez Amsterdam, Solomon i Jamieson (1978).

Z rozproszonych gron przygotowywano zawiesinę w pożywce do inkubacji, zawierającej 24,5 mM HEPES, 98 mM NaCl, 4,0 mM KCl, 11,7 mM KH2PO4,1,0 mM MgCli, 0,3 mM CaCh, 5,0 mM glukozy, 1% (wag./objętościowy) mieszaniny istotnych i nieistotnych aminokwasów (Serva Feinbiochemica, Heidelberg, FRÓ), 2 mM glutaminy, 0,2% BSA i 0,01% (wag./objętościowy) inhibitora trypsynowego. Roztwór do inkubacji był nasycony tlenem i utrzymywany w temperaturze 37°C w kąpieli z jednoczesnym wytrząsaniem (60 drgań/min) Zawiesinę inkubowano w obecności różnych stężeń CRP lub antagonistów CRP.

Po inkubacji probówki poddawano odwirowaniu przy 1000 g przez 5 min, po czym oddzielano części stałe od roztworu zebrano ponad nimi Oznaczano stężenie amylazy w supernatancie oraz rozpuszczonych częściach stałych, jak opisał Bernfeld (1955). Wydzielanie amylazy wyrażono jako procent przyrostu w stosunku do wartości podstawowej. Inkubację prowadzono dwukrotnie. Niestymulowane uwalnianie amylazy w czasie całego okresu prób ustalono jako wartość podstawową.

Przy podawaniu do pożywki inkubacyjnej stopniowo zwiększających się stężeń zaobserwowano zalezne od stężenia zahamowanie uwalniania amylazy symulowane przez submaksymalne stężenie CRP (10-M).

(C) Hamowanie wchłaniania ³H-Tymidyny przez komórki 3T3.

Stosowano komórki SCLC 2-4 dni po pasażu Zawiesiny pojedynczych komórek przygotowywano przez przemycie komórek (dwukrotnie PBS), a następnie odpipetowame ich do PBS z dodatkiem 0,2 g/l glukozy, 0,2 g/l EDTA i 14 mM chlorowodorku lignokamy w temperaturze 37°C az do momentu, gdy zawiesina stawała się jednolita (2-4 minut). Komórki przemywano trzykrotnie i ponownie przekształcano w zawiesinę w HTTES bez dodatku FCBS. Hodowle ustawiano na 1,34 x 105 komórek wysianych w dniu 0, wszystkie peptydy dodawano w tym samym czasie w 1 ml pożywki RPMI1640 z dodatkiem HITES 10,125% albuminy W 48 godzin później do każdego dołka dodano 1 uc. znaczonej trytem tymidyny i kontynuowano inkubację przez dodatkowe 24 godziny. Następnie komórki odmyto, zebrano na papierowym sączku na filtrze szklanym i przemyto lodowato zimnym 5% kwasem trójchlorooctowym. Sączek z osadem umieszczono w fiolkach zawierających płyn scyntylacyjny i zliczano przez 1 minutę.

Tabela 2

OZNACZENIE ANTACONISTYCZNYCH ANALOCÓW PEPTYDU UWALNIAJĄCECO CASTRYNĘ(CRP) - KOMÓRKI 3T3 HAMOWANIE WCHŁANIANIA ³H-TYMIDYNY

Numer analoga peptydu	ng/ml	CRP 3 ng/ml	DPM+S.E 207000+4200 348000115300^)	% hamowania vs CRP+
1	2	3	4	5
26	50	+	23300018800	82
	500	+	205000112500	>100(-1 *)
	100	+	22200013900	89
	0
17	50	+	27700019800	50
	500	+	20700013800	100
	100	+	22300011200	89

169 498 cd tabeli 2

1	2	3	4	5
5	0 50	+	283000±5400	46
	500	+	280000±21900	48
	100	+	199000±7100	>100(-4*)
10	0 50	+	261000119500	62
	500	+	242000±8300	75
	100	+	255000±26200	66
	0

* ** P<0,01,(- ) Hamowanie poniżej podstawowego poziomu przy braku stymulacji + 348 000-207 000 = 141 000 przyjęto jako stymulację (D) Hamowanie wzrostu różnorodnych małokomórkowych raków płuc (S.C L.C.)

Hodowle podstawowe komórek H-69 i H-345 S.C.L.C. otrzymane z National Cancer

Institute (Narodowego Instytutu Rakowego) utrzymywano w postaci hodowli zawiesinowych. Hamowanie syntezy DNA indukowanej przez GRP przez antagonistów bombezyny monitorowano, mierząc wchłanianie ³H-tymidyny. Hamowanie przez antagonistów bombezyny syntezy DNA indukowanej przez GRP okazało się wyraźne i zależne od stężenia.

(E) Wpływ na wydzielanie soku trzustkowego in vivo.

Prace eksperymentalne nad wydzielaniem prowadzono na 6 przytomnych kotach (2-3 kg) z chronicznymi przetokami żołądkowymi i trzustkowymi, jak opisane uprzednio (Konturek i inni, J. Physiology. London. 1976, 257. 663-672). To znaczy kaniula stosowana jako przetoka żołądkowa przygotowana była według Emasa (Gastroenterology. 1960, 39, 886-782). Kaniulę tę wprowadzono do rejonu gruczołu odźwiernikowego w pobliżu krzywizny większej żołądka. Przetokę trzustkową wykonano stosując specjalną metalową kaniulę w kształcie litery T z bocznymi i głównym ramieniem przystosowanym przez nas do kotów. Przewód żółciowy oddzielono tuz przed połączeniem z przewodem trzustkowym i przetransplatowano do górnego odcinka dwunastnicy, aby oddzielić spływ żółci od soku trzustkowego. Wykonano mały uchyłek dwunastnicy w rejonie, w którym znajduje się ujście głównego przewodu trzustkowego i do tej kieszonki wprowadzono boczne ramię kaniuli trzustkowej. Główną gałąź kaniuli umieszczono w końcowym odcinku dwunastnicy około 3 cm powyżej zespolenia dwunastniczo-dwunastnczego.

Badania nad wydzielaniem rozpoczęto około 3 miesięcy po zabiegu chirurgicznym. Z klatek zabierano pożywienie co najmniej na 18 godzin przed każdym testem. W czasie trwania każdego testu (z wyjątkiem testów z podawaniem pożywienia) przetoka żołądkowa była otwarta, aby umożliwić odpływ soku żołądkowego na zewnątrz.

Soki spływające z przetoki trzustkowej zbierano przez cały czas w 15 minutowych próbkach. Odnotowywano objętość i oznaczano stężenia kwaśnego węglanu oraz białka, a wyniki opracowywano w sposób wcześniej opisany (Konturek i mm, 1976).

Na każdym zwierzęciu przeprowadzono serię doświadczeń dla porównania zdolności wydzielania. GRP podawano dożylnie w zróżnicowanych dawkach (1250 pmol GRP/kg-godz.) w jednodniowym teście z dodatkiem lub bez peptydu nr 5. W testach z podawaniem pożywienia przetokę żołądkową zamykano i każdemu zwierzęciu podawano około 50 g gotowanej, homogenizowanej, mielonej wołowiny; porcja taka była zazwyczaj zjadana w całości. Przez cały czas po posiłku oraz po osiągnięciu dobrze ustabilizowanego plateau odpowiedzi wydzielniczej trzustki utrzymywano dożylne podawanie infuzyjne roztworu soli (około 10 ml/godz.). Podawano peptyd (5) i badano wydzielanie przez dalsze dwie godziny. W odrębnych próbach na poszczących kotach (bez podawania peptydu oraz bez podawania mięsa) mierzono podstawowy poziom wydzielania soku trzustkowego (przy otwartej przetoce żołądkowej) przez 2 godziny, a następnie do płynu infuzyjnego dodawano peptyd nr 5 (10 nmol/kg-godz.) w dawce, która

169 498 całkowicie zatrzymywała wydzielanie soku trzustkowego indukowane przez GRP. Otrzymane wyniki podano nizej

Peptydy nr (5), (10) i (2), będące analogami bombezyny, poddano badaniom in vivo na zahamowanie gastryny w surowicy po stymulacji GRP Osiem minut po stymulacji GRP (3 pg/100 g masy ciała) poziom gastryny w surowicy podnosił się z 16,7 pg/ml (kontrola) do 105 pg/ml. Szczury, którym na 10 minut przed stymulacją GRP wstrzyknięto porcję antagonistów peptydów nr (5), (10) i (2) (30 pg/100 g masy ciała), wykazywały obniżenie poziomu wydzielania gastryny - po 8 minutach 36,8 pg/ml w wypadku peptydu nr (2), 4,2 pg/ml dla peptydu nr (10) i 39,2 pg/ml dla peptydu nr (5).

Związki antagomstyczne bombezyny/GRP według wynalazku są przydatne w leczeniu stanów hipergastrinemiu takich jak przykładowo anemia złośliwa, chroniczny nieżyt zanikowy żołądka, syndrom Zollingera-Ellisona i bielactwo związane z dyfuzyjnym rozrostem żołądkowym komórek podobnych do srebrochłonnych komórek jelita, ze zwiększonym ryzykiem rozwinięcia się wieloogniskowych rakowatych guzów żołądkowych. Ponadto rozrost komórek podobnych do srebrochłonnych komórekjelitowych z łatwościąjest osiągany u zwierząt w stanie hipergastianemii.

Nowe metody terapeutyczne mają przewagę nad dotychczasowwmi lekami, ponieważ H.2-antagoniści, jak cimetydyna, które powodują hipergastrinemię, mogą prowadzić do rozwoju rakowatych guzów u ludzi. Dodatkowo zaprzestanie terapii z zastosowaniem ^-antagonistów powoduje natychmiastowy nawrót wrzodów z powodu istniejącej hipergastrinemii.

Ponieważ związki według wynalazku są antagonistami receptorów bombezyny/GRP, mogą być stosowane w leczeniu raka płuc, raka okręznicy i raka żołądka.

Na podstawie powyzszych wyników i danych uzyskanych na szczurach stwaerdzono, ze peptydy według wynalazku mogą być podawane w formie farmaceutycznie dopuszczalnych nietoksycznych soli, takich jak sole addycyjne z kwasami, których przykładem mogą być chlorowodorek, bromowoęorek, siarczan, fosforan, fumaran, glukonian, taninian, maleiman, octan, cytrynian, benzoesan, bursztyman, alginian, palmityman, mleczan, askorbmian, winian i tym podobne

Mikrokapsułki lub mikrocząsteczki tych peptydów sformułowane z poliOH-— akyy ζΙο^Ιkolidu) mogą być korzystną formą podawania leku. Lek może być także podawany dożylnie, śr<eęmięśniowo lub podskórnie w izotonicznym roztworze soli, buforu fosforanowego i tym podobnych. Mogą być także stosowane aerozole do podawania do płuc.

Kompozycje farmaceutyczne zawierać będą peptyd w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Dawki będą od około 1 do 1000 mikrogramów peptydu na kilogram masy ciała gospodarza przy podawaniu pozajelitowym. Leczenie peptydami według wynalazku może być prowadzone tak jak leczenie kliniczne innymi agonistami i antagonistami LHRH, analogami somatostatyny lub innymi peptydami.

Ssakom podawać można peptydy według wynalazku dożylnie, podskórnie, śródmięśniowo, donosowo lub w formie aerozolu do wdychania, aby osiągnąć efekt hamowania gastrycznego lub przeciwnowotworowy. Dawki skuteczne zależne będą zarówno od formy podawania, jak i własności osobniczych leczonego pacjenta. Przykładem jednej z form dawkowania jest roztwór soli fizjologicznej z dodatkiem peptydu, który to roztwór podaje się w ilości odpowiadającej dawce około 0,01 0,20 mg/kg masy ciała. Preparaty o przedłużonym działaniu mogą być podawane tylko raz w miesiącu, a czas trwania kuracji może dochodzić do kilku miesięcy.

Chociaż wynalazek został szczegółowo opisany w odniesieniu do korzystnego przykładu realizacji, należy rozumieć, ze zmiany i modyfikacje oczywiste dla specjalisty z tej dziedziny mogą być wprowadzone i nie stanowi to odejścia od zakresu wynalazku określonego w zastrzezeniach patentowych zamieszczonych na końcu opisu. Formy zastępcze, przy których skuteczność wynalazku nie doznaje upośledzenia, mogą być także stosowane.

SCHEMAT POSTĘPOWANIA PRZY PROWADZENIU SYNTEZY POLIPEPTYDÓW

Z UKŁADU ŻYWICA-AMINOKWAS Z GRUPĄ AMINOWĄ ZABEZPIECZONĄ RESZTĄ BOC JAKO MATERIAŁEM WYJŚCIOWYM

Postępowanie I (1) przemycie CHCl2(3 x 1 min);

169 498 (2) odblokowanie przy użyciu 50% TFA w CH2O2 dwukrotnie odpowiednio przez 5 1 25 minut W przypadku żywic ze związanymi z nimi peptydami, zawierających D - lub L-Trp lub Tpi, odblokowanie prowadzone 50% TFA w CH2O2 z dodatkiem 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu;

(3) przemycie CH2Ch(6 x 1 min), (4) neutralizacja trójetyloaminą w CH2Ck(2 x 3 min);

(5) przemycie CH2Cb(6 x 1 min);

(6) sprzęganie.

(I) dodanie aminokwasu z grupą aminową zablokowaną resztą Boc (3 równoważniki) 1 HOBt(3,3 równoważniki) w DMF (3 min), (II) dodanie 20% dwuizopropylokarbo^łwuimidu (3 równoważniki) w CH2Cl2 1 wytrząsanie przez 60-90 minut;

(7) przemycie CH2Cb(2 x 1 min), etanolem(2 x 1 min) 1 CH2Cb(5 x 1 min)

Postępowanie II. Dla wprowadzenia zredukowanego wiązania peptydowego -CH2NHetap (6) w postępowaniu I został zmodyfikowany w następujący sposób' (1) przemycie DMF (2 x 1 min);

(2) dodanie aldehydu Boc-leucynowego (3 równoważniki) w DMF z dodatkiem 1% AcOH;

(3) dodanie NaBH/iCN (3,5 równoważnika) w DMF 1 wytrząsanie przez 60 mm, (4) przemycie 50% MeOH (3 x 1 min), 100% MeOH(3 x 1 min) i CH2Cb(3 x 1 min);

Postępowanie III. W celu sprzężenia z Boc-Asn, Boc-Gln 1 Boc-Gly etap (6) w postępowaniu I został zmodyfikowany następująco:

20% dwuizopropylokarbodwuimid (3 równoważniki) w CH2Cl2 dodano do mieszaniny roztworów w DMF aminokwasu z grupą aminową zablokowaną resztą Boc (3,0 równoważniki) 1 HOBt (3,3 równoważniki) w temperaturze 0°C przez 15 minut i w temperaturze pokojowej także przez 15 minut, części stałe usunięto przez odsączenie, przesącz dodano do żywicy ze związanym z mą peptydem i wytrząsano z Boc-Gln lub Boc-Asn przez 2-4 godzin, zaś z Boc-Gly przez 1 godzinę.

Postępowanie IV. Następujące etapy trzeba zrealizować w celu wprowadzenia aminokwasu Fmoc:

(1) po odblokowaniu 1 zobojętnieniu przemycie CH2Cb(3 x 1 min) oraz DMF (3 x 1 mm), (2) sprzęganie.

(i) dodanie aminokwasuFmoc (3 równowarnikii 1 HOBt (^,,3 równowarnikii w DMF (3 min);

(11) dodanto dn% dw%z^w^rczopro^^t)oka^r^io^^wu m rów3 owwziowOw CH2CI2 1 wytrzwsat nie przez 60 min;

(3) przemycie etanolem (3 x 1 min) 1 DMF (3 x 1 mm);

(4) odblokowanie grupy Fmoc przy użyciu 50% piperydyny w DMF przez 30 min, (5) przemycie DMF (6 x 1 min);

(6) dalsze sprzęgania według etapu (2).

Po otrzymaniu pożądanych peptydów pośrednich o wzorze I na żywicę ze związanym z mą peptydem oddziaływano ciekłym HF w obecności amzolu, otrzymując polipeptyd w postaci wolnej, przy czym X we wzorze I oznacza w takim przypadku wodór, a Y oznacza grupę -NH2, OH lub w postaci zablokowanej 1 wówczas A² we wzorze I oznacza Glu(OMe) lub His(Bzl).

Przekształcenie grupy funkcyjnej przy grupie N, C-końcowej lub w bocznym łańcuchu polipeptydu z postaci wolnej lub zablokowanej w inną grupę funkcyjną N- lub C-końcową lub w łańcuchu bocznym prowadzono stosując odpowiedni reagent w roztworze. Dla przykładu zabezpieczony polipeptyd zawierający resztę Glu w pozycji A² poddano reakcji z metyloaminą w obecności DIC, aby otrzymać polipeptyd zawierający w pozycji A2 resztę Glu(MeNH) Polipeptyd z niezabezpieczoną N-końcową resztą poddawano reakcji z KOCN, aby otrzymać polipeptyd zawierający resztę NH2CO- w pozycji X.

W ponizszych przykładach następujące kody liczbowe są wykorzystane dla identyfikacji związków pośrednich. Oznaczenia a/b/Res oznacza wyjściową żywicę stosowaną w przykładzie

169 498 a etap b. Kod a/b/c oznacza prekursor peptydu c otrzymanego w etapie b przykładu a, przy czym a, b i c, powyżej oznaczają liczby całkowite

Przykład I.

(1) A: Przykład L-1 D- Tpi.

2,04 g (10 mM) L-Trp rozpuszczono w 25 ml gotującej wody z dodatkiem 2,1 g kwasu cytrynowego. Następnie dodano 0,5 ml 40% formaldehydu, co spowodowało natychmiastowe wydzielanie osadu. Mieszaninę ochłodzono w kąpieli lodowej, zebrano wytrącony osad, przemyto go zimną wodą, a następnie wysuszono na powietrzu w temperaturze pokojowej, otrzymując 2,14 g substancji stałej o temperaturze topnienia (z rozkładem) około 310°C (wydajność 99%). Izomer D otrzymuje się w taki sam sposób i ma on także temperaturę topnienia (z rozkładem) około 310°C.

B Przykład L-1 D- Boc-Tpi.

Do zawiesiny 10,8 g (50 mM) D-Tpi w 250 ml 0,2 N NaOH i 7,5 ml trójetyloaminy podczas mieszania dodano 10 g dwuwęglanu dwu-t-lmut^yto^eego i całość mieszano przez 4 godziny, po czym dodano następne 10 g dwuwęglanu i jeszcze kolejne 10 g po 3 godzinach mieszania. Mieszanie kontynuowano przez całą noc, po czym mieszaninę wyekstrahowano eterem (2 x 100 ml) i ekstrakt odrzucono. Warstwę wodną zadano kwasem cytrynowym do osiągnięcia odczynu kwaśnego (pH 3-5). Wytrącony osad przemyto wodą i wysuszono na powietrzu przez noc Wydzieloną substancję stalą zawieszono w 100 ml te^irayydrofuranu. Niemal całość stałej substancji uległa rozpuszczeniu. Części nierozpuszczone usunięto przez odsączenie, po czym odpędzono THF pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość roztarto z eterem, otrzymując 9,20 g substancji (wydajność 58%). Otrzymany materiał miał taka samą temperaturę topnienia jak substancja wyjściowa, a różnica polega tylko na innej rozpuszczalności i charakterystyce w chromatografu cienkowarstowej TLC przy użyciu układu rozpuszczalników 85· 15'0,5 CHCl3:MEOH HOAc.

Z porcji 2,55 g L-Tpi otrzymuje się 2,22 g (wydajność 59%) Boc-Tpi, postępując w wyżej opisany sposób (2) Przykład Boc-Leu-CHO.

Ester metylowy Boc-leucyny (35 g, 134 mM) w bezwodnym toluenie (250 ml) w atmosferze azotu oziębiono za pomocą mieszaniny aceton-suchy lód, a następnie przez 30 minut dodawano 150 ml 25% roztworu wodorku dwuizobutyloglinowego w toluenie. Całość mieszano przez 20 minut w kąpieli aceton-suchy lód po dodaniu wodorku dwuizobutyloglinowego, po czym ostrożnie dodano 15 ml metanolu. Mieszaninę wylano do 1000 ml lodowato zimnej wody, wytrzęsiono i przesączono. Oddzielono toluen, a fazę wodną reekstrahowano eterem (3 x 300 ml). Połączono ekstrakty toluenowy i eterowe i wysuszono (Na2SO4). Otrzymany olej szybko przepuszczono przez kolumnę z żelem krzemionkowym (3 x 50 cm) w 1500 ml 15% octanu etylu w nafcie. Aldehyd Boc-Leu otrzymano w postaci oleju w ilości 27,6 g.

Przykład II

Peptyd Nr Wzór

1. NH₂

2. D-T rp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NR.

3. D-TrI:aGluMNHaΓφA^laVZla-GlaH^ia-Leu··JS--Leu-NH^

4. 5FaD-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hia-Leu-IS3a-Leu-NH₂

5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hia-Leu-psla-Leu-NH₂

6. D-TplaGlu(OMe--Trp-Ala-Val-Gly-Hia-Leu-psli-Leu-NH7. D-TplaHlsaTrpaAlaaYal-GlyaHis-Leuapsj-Leu-NH₂

169 498

8. D-Tpi-His(Bz1)-TpfA4lf-Va1-Gly-IΊif-Leu-pslf-Leu-NH₂

Polipeptydy z obecnego przykładu zawierające ten sam fragment Trp-Ala-Val-Gly-HisLeu-psi-Leu-NH2, lecz dwie różne reszty N-końcowe, zsyntezowano krok po kroku na żywicy benzhydryloaminowej (BHA) zgodnie ze standardową procedurą syntezy w fazie stałej

0,50 g żywicy BHA (0,9 mM NH2/g) zadano 10% TEA w CH2Cl2 (zobojętnianie) dwukrotnie za każdym razem przez 3 minuty i przemyto CH2Cl2 sześć razy. Żywicę mieszano z 1,35 mM Boc-Leu 1 150 mM 1-hyylroksybenzotirazolu (HOBt) w DMF przez 3 minuty. Dodano 20% 1,3-dwriιζορ^ΓΟΡΥIook^lrB^odwiuimiciu (DIC) z 1,3 mM w CH2Cl2. Mieszaninę wytrząsano w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Otrzymaną żywicę Boc-Leu-BHA przemyto CH2C12 i metanolem dwukrotnie oraz CH2O2 trzykrotnie, a następnie poddano testowi Kaisera (Anal Blochem , 1970, 34, 595). Jeżeli sprzęganie nie jest kompletne, powtarza się procedurę

Usunięcie ochronnej grupy Boc (odblokowanie) z żywicy Boc-Leu-BHA prowadzono, stosując roztwór 50% TFA w DCM przez 5 minut, następnie sączono i poddawano ponownie takiemu postępowaniu przez 25 minut, a na koniec przemywano DCM sześć razy.

Zobojętnianie przeprowadzono, jak podano wyżej, w odniesieniu do żywicy BHA.

Sprzęganie Boc-Leu-CHO prowadzono zgodnie z wyżej opisanym postępowaniem II:

(1) dwukrotne przemycie DMF, (2) dodanie 1,5 mM Boc-Leu-CHO w DMF z dodatkiem 1% AcOH, (3) dodanie 2,0 mM NaBHsCN w DMF i wytrząsanie przez 60 min;

(4) dwukrotne przemycie 50% metanolem w wodzie, dwukrotne przemycie 100% metanolem 1 trzykrotne przemycie CH2CU

Po usunięciu ochronnej grupy Boc z żywicy Boc-Leu-po^-o; i zobojętnieniu przeprowadzono sprzęganie z Boc-His(Z) w sposób opisany wyżej jako postępowanie I

Sprzęganie z Boc-Cly prowadzono zgodnie z omówionym wyżej postępowaniem El

Roztwór 20% 1, 3-dwruz opropytokarbodwuimidu (1,5 mM) w CH2Cb dodano do roztworu w DMF 1,5 mM Boc-Cly 11,65 mM HOBt w temperaturze 0°C, całość mieszano z jednoczesnym chłodzeniem przez 15 minut 1 w temperaturze pokojowej także przez 15 minut Wytrącony osad odsączono 1 dodano do żywicy, po czym wytrącano przez 60 minut Następnie przyłączono kolejne reszty aminokwasowe Boc-Val, Boc-Ala i Boc-Trp na drodze sprzęgania w sposób omówiony wyżej jako postępowanie I, otrzymując 0,90 g zabezpieczonego peptydu o budowie Boc-Trp-Ala-Val-Cly-His(Z)-Leu-psi-Leu-zywica BHA (2/1/ Res).

Po przyłączeniu Boc-Trp przeprowadzono odblokowanie Boc-reszty aminokwasowej, stosując 50% TFA w DCM z dodatkiem 5% merkaptoetanolu 1 5% amzolu, otrzymując TFA Trp-Ala-Val-ClyoHls(Z)-Leu-psl.-Leu-zywlca BHA (2/2/Res).

0,91 g TFA Trp-Ala-Val-Clv-His(Z)-Leu-psj.-Leu-zywica BHA (2/2/Res) podzielono na osiem porcji (około 100 mg każda), które następnie wykorzystano do przeprowadzenia syntezy pożądanych zabezpieczonych peptydów połączonych z żywicą, zgodnie z opisanym wyżej postępowaniem I w wypadku grup Boc-D-Trp, Boc-5F-D-Trp, Boc-D-Tpi 1 Boc-His(Z) oraz zgodnie z postępowaniem III w wypadku grupy Boc-Cln.

Kolejne przyłączenie grup Boc-Cln 1 Boc-Trp do wskazanej wyżej struktury heptapeptydowej połączonej z żywicą (2/2/Res) dało związek o budowie: 2/2/01 Boc-Trp-Cln-Trp-AlaVal-Cly-His(Z)-Leu-psi-Leu-zywica BHA.

Kolejno sprzęgając Boc-Gln i Boc-D-Trp z określonym wyżej heptapeptydem związanym z żywicą (2/2/Res), otrzymano związek o budowie. 2/2/02 Boc-D-Trp-Cln-Trp-Ala-Val-GlyHis^l-Leu-psi-Leu-zywica BHA.

Kolejno sprzęgając grupy Boc-Cln i Boc-5F-D-Trp z określonym wyżej heptapeptydem związanym z żywicą (2/2/Res), otrzymano związek o budowie: 2/2/04 Boc-5FF^-Tip--Gn^-Ti^p^Ala-Val-Gly-HisiZLLeu-psi--..eu-zy wica BHA.

Podobnie przez kolejne sprzęganie z Boc-Cln i Boc-D-Tpi otrzymano 2/2/05 Boc-D-TpGln-Trp-AlaoVal-Cly-Hls(Z)-Leu-psl.-Leu-zywlca BHA.

Podobnie przez kolejne sprzęganie z Boc-Glu(OMe) i Boc-D-Tpi otrzymano 2/2/06 B(χfIl)oTlu—ldu(Όλeeo-Trp-Aa--Va-Gly-Hls(Z-Lww^si--eu-zy waca BHA.

069 498

Przez kolejne sprzęganie z Boc-His(Z) i Boc-D-Tpi otrzymano 2/2/07 Boc-D-Tpi- His(Z)Top-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leg-uίy.-Leu-ży wica BHA

Przez kolejne sprzęganie z Boc-His(Bzl) i Boc-D-Tui otrzymano 2/2/08 Boc-D-TpiHis(Bzl)-Tru-Val-Gly-His(Z)-Leg-uSLi-Leg-żywlcaBHA.

Po usunięciu grupy ochronnej Boc za pomocą 50% TFA w DCM z dodatkiem 5% merkautoetaoolg i 5% ηο^^ niezabezpieczony uoliueutyO związany z żywicą przemyto DCM, metanolem i DCM, stosując każdy z układów odmywających trzykrotnie i zadano świeżo pIoeOestylowaoym HF (5 ml) i aoizolem (0,25 ml) w temperaturze 0°C przez 1 godzinę. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, pozemyto eterem lub octanem etylu, po czym ekstrahowano 70-80% kwasem octowym i poddano liofilizacji, otrzymując surowy 2/3/01 TIu-Gln-TouAla-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NH-2

Peptyd oo Wzóo

2. D-Top-Glo-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leg--u^-Leu-ίNH2

4. 5F-D-Trp-Glo-T]ou-Ala-Val-Gly-Hls-Leg--usi-Leg-NH2

5. D-Tpi-Glo-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leg-_usi-Leg-NHo

6. D-Tpi-Glg(OMe)-TIp>-Ala-Val-Gly-His-Leg-usi-Leg-NH2

7. D-Tpl-His-TIou-Ala-Val-Gly-Hls-Leg--psi-Leu-NH2

8. D-Tpi-His(BoJ)-Tou-Ala-Val-Gly-His-Leg--usi-Leu-NIΊ2

Mieszaninę 40 mg Tru-Gln-TIu-Ala-Val-Gly-HiS-Leg-uSί-Leu-NH2 (2/3/1) i 20pl TEA w 0,5 ml DMF i 20 mg KOCN w 100 μl wody mieszano w temperaturze 0°C, po czym dodano po kropli 100 μ, AcOH i całość mieszano przez: dalszą godzinę , Mieszaninę reakcyjną poddano oczyszczeniu, otrzymując:

Peptyd no Wzór

1. NH2CO_-Trp-Gl_0-TIou--Aa-V2al·Glv-His-Leu--ui-Leu-NH2.

Peptyd (3) otrzymano przez kolejne sprzęganie Fmoa-Glg--OBgt) i Fmwa-D-Top sposobem opisanym wyżej jako postępowanie IV z Tφ-Akl-Val-^lv-Pίis(Z)-Leu-psl-Leg- żywica BHA (2/2/Res), otrzymując Fm(J-D-TIp-Glg(OBgt)-Tφ-Ala-Val-Gly-Hi.s(Z)-Leg-usl-Leu-zy'hlca BHA (2/4/3). Peptyd połączony z żywicą zadano 10% TFA w DCM z dodatkiem 5% dwumeokaptoetanolu przez 30 minut w celu odłączenia grupy But od grupy karboksylowej Glu. Po sześciokrotnym przemyciu DCM przepuszczono strnmień MeNH2 przez z.łoze Fmoc-D-TIu-Glg-Trp-Ala-Val-Hls(Z)-Leg-psl-Leg- żywica BHA (2/5/Res) w 5 ml DMF w temperaturze 0°C przez 5 minut, dodano 0,25 ml 20% DIC w DCM i reakcję prowa0oooo przez 2 godziny w temperaturze 0°C. Żywica została następnie przemyta DCM, po czym usunięto goipę Fioc za pomocą piperydyny.

Peptyd (3) D-Tφ-Glg(Me^H))-TIp-Ala-Val-Gly-Hls-Leg--)Sl-Leu-NH2 (RC-3490) otrzymano po zadaniu HF. Oczyszczanie prowadzono metodą HPLC, stosując układ rozpuszczalników składający się z (A) 0,1 % TFA i (B) 1 % TFA w 70% acetonitrvlg. Oczyszczone peptydy okazały się czyste w 97%, co ustalono za pomocą analitycznej HPLC. Czasy retencji polipeptydów opisanych w obecnym przykładzie podano w tabeli

169 498

WYNIKI ANALITYCZNEJ HPLC

Peptyd nr	Gradient % B/minutę	Czas retencji na kolumnie
2	25-65%B/40	11,84
4	25 -65%B/40	14,85
5	25-65 %/40	14,32
6	25-65%/40	19,21
7	30-70%/40	9,11

Wyniki analiz pylipetydów otrzymanych w obecnym przykładzie okazały się zbiezne z przewidywanymi. Przykładowo stosunek aminokwasów w peptydzie () o budowie D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly1 lis-Iest-psl-Leu-Ni 1 wynosił 10(:2,09:0,90 1,03:0,95:0,92 (Gln.Trp.AJa^OLGlyHis) Reszta Leu-psiTleu wykazywała pik absorpcji przy czasie retencji 39,95 minut. Nie wykryto Tpi w peptydach (5), (6),(7) i (8).

Przykład III.

Peptyd nr Wzór

9. NH2CO-TrrąGln-Trp-Ala-V^d-Gly-His-Leu-AsS-Ahe-AΉ 2

10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-'VaAGly-His-LeuAps_l-Phe-NH2

11. D-Tφ-Glu(MeNH)-TηA-Ala-Va--Gly-His-Leu-ąsi-Phe-NH2

12. D-Tpi-Glu-Trp-Ala-VaAGly-His-Les--ąsl-Phe-NH2

13. D-Tpi-Glu(OMeZ-Tηz-Alz-Va--Gly-His-Leu-pιsl-Phe-NH2

Polipeptyd w obecnym przykładzie zawierają fragment Trp-AlazYal-Glv-Hls-Leu-ps-Phe-NH Związek Boc-Tφ~Alα-Val-Oly-HIs(Z)łLes--2si-Phe-żywlcα BHA (3/1/Res) zbudowano krok po kroku, wychodząc z 0,5 g żywicy BHA (0,9 mmola NH/g) na drodze syntezy w fazie stałej w sposób opisany w odpowiedniej części przykładu (2) z tąjeęnak różnicą, ze zamiast Boc-Leu w pierwszym etapie sprzęgania zastosowany Boc-Phe.

Porcje żywicy połączonej z peptydem, zawierające około 150 mg Boc-Trp-Ala-Val-GlyHis(2)--^^^-psi4^1ie-^;y’wica BHA (3/1/Res) poddano sprzęganiu z dwoma innymi resztami w sposób opisany powyżej jako postępowanie I w przypadku Boc-Trp, Boc-D-Trp, Boc-D-Tpi i Boc-Glu(OMe) oraz w sposób opisany jako postępowanie III w przypadku Boc-Gln, otrzymując końcowy peptyd połączony z żywicą.

Łącząc kolejno Boc-Gln i Boc-Trp ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z żywicą (3/1/Res), otrzymano związek o budowie 3/2/09 Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)Leu-psi-Phe-zywica BHA.

Łącząc kolejno Boc-Gln i Boc-D-Trp ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z żywicą (3/1/Res), otrzymano związek o budowie: 3/2/10 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala^al-GlyHIs(Z)-Leu-ps1-Phe-zywicα BHA.

Łącząc kolejno Boc-Gln i Boc-D-Tpi ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z żywicą (3/1/Res), otrzymano związek o budowie: 3/2/12 Boc-D-Tpi-Gln-TrpzAlα-Val-Glyz His(Z--Leu-ąsI-Phe-żywicα BHA.

Łącząc kolejno Boc-Glu(OMe) i Bzc-D-Tpi ze wskazanym wyżej heptepeptydem związanym z żywicą (3/1/Res), otrzymano związek o budowie: 3/2/13 BoczD-TąI-Glu(OMe)-TrpAla-Val-Gly-HIs(Z)-Leu--ąs.-Phe-zywlca BHA.

Po usunięciu grupy ochronnej Boc za pomocą 50% merkaptoetanolu i 5% amzolu pwliąeątyę związany z żywicą przemyto DCM, metanolem 1 DCM, stosując każdy z układów odmywających trzykrotnie 1 zadano świeżo przeęestylowanym HF (5 ml) 1 amzolem (0,25 ml)

169 498 w temperaturze 0°C przez 1 godzinę. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, przemyto eterem lub octanem etylu, po czym ekstrahowano 70-80% kwasem octowym i poddano liofilizacji. Otrzymano następujące polipeptydy: 3/3/09 Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2

Peptydnr Wzór

10. D-Trp-Gln-TrrρAla-Val-Gly-His-Leu--py-Phe-NH2

12. D-Tpi-Glm-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2

13. Dl^pi^lu(C^^^e^T^Alj^^V^al^G^^^H^^u-p^-Phe-NH2

Peptyd mający N-końcową resztę NH2CO otrzymano, postępując w następujący sposób:

Mieszaninę 40 mg surowego peptydu (3/3/9) Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-jsi-PheNH2 i 20 Ltl TEA w 0,5 ml DMF i 20 mg kOcN w 100 pl wody mieszano w temperaturze 0°C, po czym dodano po kropli 100 pl AcOH i całość mieszano przez dalszą godzinę w temperaturze 0°C. Mieszaninę reakcyjną zawierającą pożądany peptyd (9) NH2CO-Trp-G!n-Trp-Ala-ValGly-His-Leu-psi-Phe-NH? poddano oczyszczaniu metodą HPLC.

Peptyd (11) otrzymano przez kolejne sprzęganie dwóch Fmoc-aminokwasów sposobem opisanym wyżej przy omawianiu syntezy w fazie stałej jako postępowanie IV.

150 mg TFA Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-gsί-Phe-lywica bHa (3/1/Res) zneutralizowano 10% TEA, przemyto C^Ch i DMF i sprzęzono z Fmoc-Glu(OBut), otrzymując Fmoc-Glu(OBut-Trp-Ala-VaFGly-FFs( Z)-psiTPte-iy yy ica BHA (3/5/11). Związek Fmoc-D-Trp-Glu(OBu)l-Trp-AljaVal-Gly-Hls(Zt-Leu-gsl-Phe-iywica BHA otrzymano po odblokowaniu za pomocą 50% piperydyny sprzęzeniu z Fnuc-D-Trp. Grupę But usunięto z peptydu związanego z żywicą zabezpieczonego grupą Fmoc, działając 10% TFA w DCM z dodatkiem 2% merkaptoetaiolu przez 30 minut. Następnie przez złoze 200 g FmocTlTrp-Glu-Trp-Άkl-VaFGly-His(Z)-Leu-lPS-Pl^e-ży waeaBFFA (3/6/11) w 5 ml DMF przepuszczono strumień MeNH2 w temperaturze 0°C przez 5 minut, po czym dodano 0,2 ml 20%? DIC w DCM i całość mieszano w temperaturze 0°C przez 2 godziny. Następnie żywicę przemyto DCM i usunięto grupę Fmoc za pomocą piperydyny. Po zadaniu HF i anizolem peptyd (11) D-Trp-Glu(MeNH)Tφ-Ala-Val-Gly-Hls-Leu-gSl-Phe-NH2 poddano oczyszczeniu metodą HPLC

Czasy retencji peptydów według obecnego przykładu podano w poniższej tabeli.

WYNIKI ANALITYCZNE HPLC

Peptyd nr	Gradient % B/minutę	Czas retencji na kolumnie D
9	25-65	16,38
10	25-65	14,62
12	25-65	14,72
13	25-65	19,20

Stosunki aminokwasów ustalone na podstawie wyników analizy na aminokwasy okazały się zbiezne z przewidywaniami. Przykładowo stosunek aminokwasów w peptydzie (10) o budowie D-TIplGln-Tr[:lAlaVjl-GlJ^-Hts-Leu-β§llPle-lNH2 wynosił 115:0,96:0,95:1,01.0,94:1,97 (Glu:Gly:AlaVal:His:Trp). Peptyd miał pik absorpcji przy czasie net^ntci 44,56 minut. Stosunek aminokwasów w peptydzie (13) wynosił 1,04:0,98:1,02:1,00:1,03:0,94 (Glu:Gly:AlaVal:Htf:Trp). Peptyd miał pik absorpcji przy czasie retencji 44,56 minut odpowiadający reszcie Leu-psi-Phe. Nie wykryto Tpi w peptydzie (13).

Przykład IV

Peptyd nr Wzór

14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-GJy-His-Leu-psi-Tpi-NH2

15. DlpGlu-Gln-TIpl-Ala-Val-GJy-Hls-Leu-_psLilTpi-NH2

169 498

16. Phs-Glu-TrppAlα-Val-GlypHts-Lsu-_psipTpi-NH2

17. D-Phs-GlnpTrp-AlαpVαl-GlypHis-Lsu--^sipTpi-NH2

18. D-Trp-Gln-TrppAlapVal-GlypH.ls-Leu-p2sipTpi-NH2

19. D-Trp-His(BzlP-Trp-Ala-Val-ClypHis-Leu-prsi-Tpi-NH2

20. DpTrp-Glu(MeNHP-T]rp-Ala-Va1-Gly-Hts-Lsu-psipTpi-NH2

21. DpTrp-Glu(OMeP-TlrnAla-Va1-Gly-Hts-Lsu-£sjpTpi-NH2

22. Tpi-Gln-TrppAla-VanGly-His-Leu-p2sipTpi-NH2

23. Ac-Tpi-Gln-Trp-AIa-Yal-GlypHts-Lsu-p>sipTpi-NH2

24. NΉ2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-VanGlynHis-LeUppsipTpi-NH2

25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Lsu-psi-Tpi-NH2

Otrzymano związek Leιl-pti-Tpi-zvwlca BHA, poddając związek Boc-Leu-ptnTrp-zywlcaBHA reakcji z formaldehydem według niżej przedstawionej procedury:

Boc-Leu-psi-Trp-zywica BHA otrzymana została z 1,0 g żywicy bHa (0,9 mmola NH;/g) na drodze kolejnego sprzęgania Boc-Trp i Boc-Leu-CHO w sposób opisany wyżej jako postępowanie 11 postępowanie II.

Do wskazanej żywicy z przyłączonym peptydem dodano 10 ml DMF z dodatkiem 1% kwasu octowego oraz z 1 ml 10% formaldehydu i reakcję prowadzono przez 60 minut, po czym przemyto DMF, MeOH i DCM.

Wszystkie polipeptydy zawierały wspólny fragment Trp-Ala-yal-Gly-His-Leu-psi-TpiNH- Związek o budowie Boc-Trp-Ala-Yal-Gly-His/ZELeu-psi-Tpi-zywica BHA (4/1/Res) zsyntetyzowano krok po kroku z wyjściowego związku Leu-psi-Tpi-zywica BHA, sprzęgając go kolejno z Boc-His(Z) według postępowania I, Boc-Gly według postępowania III, Boc-Val; Boc-Ala i Boc-Trp według postępowania I

Porcje po 150 mg wskazanego wyżej pośredniego peptydu poddawano dwu dalszym etapom sprzęgania według postępowania I w celu przyłączeniu Hca, D-pGlu, Boc-Glu(OMe), Boc-Glu(OBzl), Boc-D-Phe, BOc-D-Trp, Boc-His(Bzl), Boc-Tpi, Boc-D-Tpi, AC-Tpi i HnaTpi albo według postępowania III w celu przyłączenia Boc-Gln dla otrzymania finalnych peptydów związanych z żywicą.

Łącząc kolejno Boc-Gln i Hca ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z zywcą (4/1/Res), otrzymano związek o budowie: 4/2/14 Hca-GlmTrp-AlapVal-GlypHls(ZP-Leu-JSITpi-zywaca BHA.

Łącząc kolejno Boc-Gln i D-pGlu ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z zywcą (4/1/Res), otrzymano związek o budowie: 4/2/15 D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-Hts(ZP-Leu-rt:inTplzywica BHA.

Łącząc kolejno Boc-Glu(OBzl) i Boc-Phe ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z zywcą (4/1/Res), otrzymano związek o budowie 4/2/16 BocpPhe-Ghl(OBl)-TI'p-Άla-Van Cly-HltfZnLeu-psi-Tpl-zywlca BHA

Łącząc kolejno Boc-Gln i Boc-D-Phe ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z zywcą (4/1/Res), otrzymano związek o budowie: 4/2/17 Boc-D-Phe-Gln-TrpnAla-Val-Cil\n 11^(//)-1^11-^1-421--2-wica BHA.

169 498

Łącząc kolejno Boc-Gln i Boc-D-Trp ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z żywną (4/1/Res), otrzymano związek o budowie: 4/2/18 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-GlaHis(Z)-Leu-psl-Tpi-zywlcr BHA.

Łącząc kolejno Boc-His(Bzl) i Boc-D-Trp ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z zywcą (4/1/Res), otrzymano związek o budowie: 4/2/19 Boc-D-Trp-His(Bzl)-Trp-AlaVal-Gla-His(Z)-Leu-)pS-TpiinywlzaBHA.

Łącząc kolejno Boc-Gln(OMe) i Boc-Tpi ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z zywcą (4/1/Res), otrzymano związek o budowie: 4/2/21 Boc-D)Trp-Glu^OMe)-Trp-AlaVr^GlynHsίZl-Leunρs-Tplin\avicaBH.A.

Łącząc kolejno Boc-Gln i Boc-Tpi ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z zywcą (4/1 /Res), otrzymano związek o budowie: 4/2/22 Boc-Tpi-Gln-Tip-Ala-Yal-Gly-His^)Leu-psi-Tpi-zywica BHA.

Łącząc kolejno Boc-Gln i Ac-Tpi ze wskazanym wyżej beptrpeptydem związanym z zywcą (4/1/Res), otrzymano związek o budowie: 4/2/23 Ac-Tpi-Gln-Tip-Ala-Val-Gly-His(Z)Leu-psi-Tpi-nvavlca BHA.

Łącząc kolejno Boc-Gln i Hna-Tpi ze wskazanym wyżej heptapeptydem związanym z zywcą (4/1 /Res), otrzymano związek o budowie. 4/2/25 Har.-Tpl-Gln-Tó^-Ala-Val-Gla-His(Z)LeιI-psi-Tpl-zvavica BHA

Łącząc kolejno Boc-Glu i Boc-D-Tpi ze wskazanym wyżej heptapejpt^dem związanym z zywcą (4/1/Res), otrzymano związek o budowie: 4/2/26 Boc-D-Tpi-Gla-Tóp-Ala-Val-GlyHis(2mL^e^-psi-T]pi-^j^ iwica BHA.

Po usunięciu zabezpieczającej grupy Boc przez działanie HF i anizolem, jak opisano w przykładach (2) i (3), otrzymano następujące peptydy:

Peptyd nr ^Wzór

14. Hcr-Gla-Trp)Alr)Val)Gly)His-LeunpsinTpi-NH2

15. D-pGlu-Gln-Trp-Alr-Vrl-Gly)HiS)Leu-npy-Tpi-NH2 4/3/16 Phe-Glu-Tóp-Alr-Vrl-GlanHis-Leu-psi-Tpi-NH2

17. D-Phe-Gln-T rpnAlr)V rl-GlynHis-Leu-psi-Tpi-NH2

18. D-Trp-Gla-TrpnAlr-Va)-Gly-Hin-Leu-psńTp)-NH2

19. D-Tóp-His(Bzl)-Trp-Alr-Vrl-Gla-His-Leu--)si-Tpi-NH2

21. Dn^^-^ll^^(^]Me)-Trp)\la-Val^lanffisnLeu^^^—pi^-NH2

22. T pi-Gln-T rp-Ala^-y rίl-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH2

23. Ac-Tpi-Gla-Trp-Alr.-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2

25. Hna-T pi-Gln-T rp-Ala-V al-Gla-His-Leu-psi-Tpi-NH7

26. D-Tpi-Gln-Tóp-Alr-Val-Gla-His-Leu-.psi)Tpi-NH2 mg Pbe-Glu-Trp-AIa-Val-Gla)Hls-Leu-psi-Tpi-NH2 (4/3/16), 5 mg azydku dwufenylofosforylowego i 10 mg KHCO3 w 0,5 ml DMF mieszano w temperaturze 0°C przez 24 godziny. Mieszaninę reakcyiną poddano oczyszczeniu metodą HPLC, stosując układ rozpuszczalników 40-70% B przez 60 minut, otrzymując: Peptyd (16) Phe-Glu-Tóp-Alr-Val-Gly-HisΙαιι-^ί-Τρί-ΝΙ-Τ w ilości około 4,5 mg. Produkt miał czystość > 95%, co ustalono metodą analitycznej HPLC, stosując układ rozpuszczalników 25-65% przez 40 minut. Czas retencji wynosił minutę

169 498

Mieszaninę surowego polipeptydu 22 o wzorze Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psiTpi-NH2, 20 μ TEA w 0,5 ml dMF i 20 mg KOCN w 100 pl wody mieszano w temperaturze 0°C Parę minut później dodano po kropli 100 pl AcOH i całość mieszano przez dalszą godzinę w temperaturę 0°C Mieszanina reakcyjną zawierała pożądany oligopeptyd Peptyd (24) NH2COTpl-Gln-Trp-Ala-Val-GlyaHlS-Leu-psl-Tpl-NH-, który poddano oczyszczaniu metodą HPLC.

Związek Fmoc-D-Trp-Gln(OButi-Trp-AlaiVal-Gly-His(Z)-LeuapsiTpi-żywica BHA (4/2/Res) otrzymano przez kolejne sprzęganie Fmoc-Glu(OBut) i Fmoc-D-Trp z Trp-AlaWal-GlyHis(Z)-Leu-psi-Tpi-zywica BHA (4/1/Res) sposobem opisanym powyżej jako postępowanie IV. Po usunięciu grupy But za pomocą 10% TFA w DCM z dodatkiem 2% dwumerkaptoetanolu, przez 30 minut żywicę ze związanym z nią peptydem poddano reakcji z MeNH21 DIC, postępując jak opisano w przykładzie (3) w odniesieniu do podobnej żywicy (3/6/11) w celu otrzymania związku o wzorze Fmoc-D-Trp-Glu-(Me^EΓ)-Trp-Ala-Val-Gly-Hls(Za-Leu-i2si-Tpl-żywlca BHA (4/3/Res) Po usunięciu grupy Fmoc za pomocą piperydyny żywicę ze związanym z nią peptydem zadawano HF (5 ml) i anizolem (0,25 ml) w temperaturze 0°C przez 1 godzinę, otrzymując' Peptyd (20) D-Trp-Glu(MeNHi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-p:Sl-Tpi--NH-.

Czasy reakcji peptydów według obecnego przykładu podano w tabeli.

WYNIKI ANALITYCZNEJ HPLC

Peptyd nr	Gradient % B/minutę	Czas retencji na kolumnie D
17	25-65/40	17,13
18	25-65/40	19,34
22	25-65/40	21,32
26	30-70/40	16,76

Wyniki analizy na aminokwasy peptydów według obecnego przykładu okazały się zgodne z przewidywanymi Dla przykładu w peptydzie (17) o wzorze D-Phe-a3ln-Trp-Ala-Val-Gly-IHis-I.,eu-psl-Tpl-aTH2 stosunek aminokwasów wynosił 1(04:(^,,^19.(^,,^(6:1,(00.0,94 0,99:1,06 (Glu Gly Ala:Val:Phe His:Trp). Nie odnotowano Tpi w analizach dotyczących stosiuiku aminokwasów w przypadku peptydów nr( 17), (24), (26).

Przykład V

Peptyd nr Wzór

27. Mpp-Gia-Tpa-Ala-Val-Gla'-Hia-Lea-Jai--Tη:--^HI2

8. D -Ρ1+6-Ο1 a-T ^p:)-A.la-Val-Gla-Hia-Leu-psi-T rp-NHp

29. D-Trp-Gln-Tη:)-Ala-Val-Gly-Hia-Leu-Jsa-Tlp)-NH2

0. D-Tpi-Gla-Tp--Ala-Val-Gla-Hi--Leu--s--T rpaNH2

31. Mpa-Gla-Tηa-Ala-Vai-Gly-Hia-Leu-r>si-TrpfFor)-NH9

2. D-Phe-Gin-Trp-.Λda-Vai-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2

33. D-Tφ-Gln-TΓp-Ala-Va--Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2

34. Di-Tpi - GLa-Tip-Ad a-V ai-da-H rp(For)-NH2

Peptydy objęte niniejszym przykładem mają wspólny fragment Cdn-Trp-Ala-Val-Gyal isLeu-psi-Trp-NH2 lub Glrl-Tφ-AJa-Val-Gly-HlS-Leu-i)si-Trp-For)-att^2· Związek o wzorze Boc-GlnTφ-Ala-Val-Gly-HlS-Leu--lsi-Trp(For)-aywlca BHA (5/1/Res) zsyntetyzowano, wychodząc z 1,0 g żywicy BHA (0,9 mmola NH2/g) na drodze kolejnego sprzęgania metodą syntezy w fazie stałej, postępując jak opisano wyżej w przykładzie (2), z tąjedynie różnicą, ze w pierwszej reakcji sprzęgania użyto Boc-Trp(For) zamiast Boc-Leu. Zastosowano porcje po 250 mg wskazanej wyżej żywicy ze związanym z mą peptydem, w celu otrzymania następujących czterech związków peptydowych

169 498 związanych z wyjściową żywicą, poddając związek pośredni sprzęganiu odpowiednio z Mpp, Boc-D-Phe, Boc-D-Trp lub Boc-D-Tpi, w ostatnim etapie sprzęgania stosując sposób opisany wyżej jako postępowanie 1.:5/2/27 Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-psi-Tirp(For)-zywica BHA 5/2/28 Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Les-£SI-p(For)-zywlca BHA 5/2/29 Boc-D-Trp-GlnzTrp-Ala-Val-Gly-Hls(Z)-Leu--ąs.-Trp(For)-zywica BHA. 5/2/30 Boc-D-Tp-Gln-Tη>-Aa-VαlAί ly-Hzs(—)-Lesl--psi.-Trp(For)-zy wica bHa.

Po usunięciu grupy ochronnej Boc z zastosowaniem 50% TFA w DCM z dodatkiem 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu. połowę każdego z otrzymanych peątyęów związanych z żywicą poddano reakcji z HF (5 ml) i amzolem (0,25 ml) w temperaturze 0°C przez 1 godzinę, otrzymując następujące peptydy:

Peptyd Nr Wzór

31. MpAAIlr--Trp-Ala-V al-Gly-HSs-Leu-ą>si-Trp(F'or)-NH2

32. D-Phe-GL·z-Tηz-Ala-VaZ-Gly-Hiz-Leu-JssZ-Trp(For)-NΉ2

3. D-T η-θ^-Ι lpAAla-V al-Gly-His-Leu-psi-T rp(For)-NH2

34. D-Tpi-Grn-TIp--Ala-V a--Glv-H1s-Leu-psi-Trp>(For)-NH2

Pozostałe ilości (połowę) peptydów związanych z żywicą zadano HF z dodatkiem 5% anizolu i 5% ęwumerkaptoetanolu, prowadząc reakcję w temperaturze 0°C przez 1 godzinę i otrzymując następujące peptydy:

Peptyd Nr Wzór

27. MpA-GrA-TrA-ASz-V^A-GlA-Hiz-LsA-]SlZ-T]pANH2

8. k^^F^l^c^-Gh^^T ]φ-Ala-Va--GlA-Hiz-LsA-ąs3Ż-T rp-NH2

29. D-TIp--Grn-T I^AAla-ValAJlA-Hiz-LsA-psż-T rp-NH2

30. D-Tpi-Grn-T]ąAAla-Val-GlA-Hiz-LsA-JsZ-Trp-NH2

Otrzymane peptydy oczyszczono metodą HPLC i ustalone czasy retencji przedstawiono w poniższej tabeli:

WYNIKI ANALITYCZNEJ HPLC

Peptyd numer	Gradient % B/minutę	Czas retencji na kolumnie D
27	27,89	25-65
28	25-65	18,70
29	25-65	19,70
30	25-65	20,26
31	25-65	28,00
32	25-65	19,10
33.	25-65	19,01
34.	25-65	17,70

Wyniki analizy na aminokwasy peptydów według obecnego przykładu okazały się zgodne z przewidywaniami. Dla przykładu w peptydzie (28) stosunek aminokwasów wynosił

169 498

0,98 0,92:1,03:0,97 0,98:1,09 (Cly:Ala:Val Phe:His.Trp) Nie odnotowano Tpi w analizach dotyczących stosunków aminokwasów w przypadku peptydów nr (30) i (34).

Przykład VI

Peptyd nr Wzór

36. D-Tp--G1--T p-Alf-Vaf-Glf^-Hio-Leu-ps--T pó-OMe

37. NH2CO-Tp---Gln-TIpf-Ala-Va--Gly-Hio-Leu-p>si-TpioOMe

38. D-Tp--Gln-TIpf-Ala-Va--Gly-Hio-Leu-psi-Tpi-NHMe

39. D-Tp--Gln-TrpτAla-Va--Gly-His-Leu-psii-TpτOH

40. D-Tp--Glτ-Tpo-Alτ-Vaf-Glτ-Hio-Leτ--is--T-:)--N9H-;>CONH^;>

Związek o budowie Boc-TrrρOXΉ2 wykorzystany jako materiał wyjściowy przygotowano w nast^j^ujący sposób - mieszaninę żywicy z przyłączoną grupą CICH2 (1,0 g, 0,7 mmola Cl/g), Boc-Trp (2,0 mmola Trp) 1 KF (4 mmole) w 20 ml DMF mieszano przez 4 godziny w temperaturze 70-80°C. Następnie otrzymany związek Boc-TIrpfXΉ2-^^Ίwica przemyto dwukrotnie każdym z następujących rozpuszczalników MeOH, H2O, MeOH, DMF i DCM. Związek o wzorze Boc-Leu--pil-Trp-fOC^2-fywica otrzymano w wyniku sprzęgania Boc-Leu-CHO ze związkiem Trp-O(7H2-fyyvlca w sposób opisany wyżej jako postępowanie II. Związek o wzorze Boc-Leu-psj-Tpi-OCHa-^wica otrzymano w reakcji związku o wzorze Bck-I .eu--psi^Trp-OCH?-zywica z formaldehydem prowadzonej w sposób opisany wyżej w przykładzie (4) Dodając następnie do tej struktury w kolejnych reakcjach sprzęgania Boc-His(Z), Boc-Cly-Boc, Val-Boc-Ala-Boc-Trp i Boc-Cln, posługując się techniką syntezy w fazie stałej opisaną wyżej, otrzymano 1,60 g związku o wzorze Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hls(Z)-0-eufps-Tpl-OCH2-fywica (6/1/Res). Część tego pośredniego peptydu związanego z żywicą wykorzystano do otrzymani Boc-TpiCτlu-Trp-Ala-Val-Gly-01ls(Z)-L·eu-psl-Tpl-TXOH7-oywica (6/2/35) na drodze sprzęgania z Boc-Tpi Inną próbkę wymienionego peptydu pośredniego wykorzystano do otrzymania Bc£-D-Tp--Gln-TIpfAla-ValGly-Hls(Z)-Leu-psl-Tpl-fXCI:H.-zywlca(6/2/36) przez sprzęganie z Boc-D-Tpi.

Po usunięciu grupy ochronnej Boc za pomocą 50% TFA w DEM z dodatkiem 5% merkaptoetanolu 1 5% anizolu przeprowadzono reakcję w następujący sposób

- 0,5 g Tpi-Cln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-OCH2-żywica (6/3/35), metanol (15 ml), DMF (15 ml) i dwuizopropyloetyloamina (3 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Żywicę przemyto DMF (3 razy) i metanolem (3 razy). Przesącz 1 płyny po przemywaniu połączono 1 odparowano pod obniżonym ciśnieniem w wyparce obrotowej w celu usunięcia rozpuszczalników. Pozostałość zadano HF i anizolem otrzymują 123 mg surowego peptydu (35) Tpi-Gln-Trp-Ala-VaTGll-His-Leu-psi-Tpl-OCH3. Peptyd (36) D-Tpl-Glu-Trp-Ala-Val-ClyHls(ZTLeu-psloTpl-OCH3 otrzymano w taki sam sposób, stosując w ostatniej fazie związek (6/2/36).

MieszanlnrTpi-Glτ-Tpf-Alτ-Va--Glτ-Hlo-Leu-ps.τTpi-OCH3 peptydu (35) (40 mg), 20 ąg TEA w 0,5 ml DMF i 50 mg KOCN w 100 μΐ H2O mieszano w temperaturze 0°C, a parę minut później do mieszaniny dodano 50 ąl AcOH i reakcję prowadzono w temperaturze 0°C przez 1 godzinę. Następnie całość poddano oczyszczaniu, otrzymując: Peptyd (37) NH2CO-Tp-ClnTrpoAla-Val-Cly-Hls-Leu-psl.-Tpi-OCH3.

Mieszaninę D-Tpl-Cln-Trp-Ala-Val-Gly-His(ZTLeu-psJfTpl-OCH3 peptydu (36) i 2 ml roztworu metyloaminy w metanolu w stosunku wagowym 1:2 mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Po odparowaniu na wyparce obrotowej pod obniżonym ciśnieniem pozostałość wysuszono przez wymrożenie i zadano HF 1 anizolem. Otrzymany produkt stanowił Peptyd (38) D-Tpl-Cln-Trp-Ala-Val-GlyτHiS-Leu-psl-Tpi-NHCH3. który poddano oczyszczaniu metodą HPLC.

069 498

Dalszą poocję D-Tpi-Gln-Tou-Ala-Va1-Gly-Hls(Z)-Leg-Iuy.-Tpl-OCH2-żywica (6/2/35) zadano HF i anizolem, otrzymując: Peptyd (39) D-Tul-Glo-TI^,u-Ala-Val-Gly-HlS-Leu-usi-TplOH.

Mieszaninę peptydu (39) (40 mg), (Boc^O (20 mg) i TEA (20μ^ w 0,5 ml DMF mieszano w temperaturze 0°C przez 4 godziny, a następnie zliofilizowano. Po przemyciu eterem pozostałość HOBt (10 mg) i N2H3CONH2 (20 mg) poddano reakcji z DCl (100 μ1 20% DCI w DCM) w temperaturze 0°C przez noc, po czym usunięto DMF przez odpaoowanie, pozemyto eterem 1 usunięto grupę zabezpieczającą Boc za pomocą 50% tFa z dodatkiem 5% merkaptoetaoolg 1 anloolg, otrzymując surowy: Peptyd (40) D-Tui-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-usl-TpiN2H2CONH2.

169 498

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena 4,00 zł

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowych związków polipeptydowych o wzorze I;

   w którym:

   Q oznacza grupę NH 2 lub grupę OQ', gdzie Q' oznacza wodór, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-1 o-fenyloalkilową;

   X oznacza atom wodoru, wiązanie pojedyncze wiązące grupę CC-aminowa reszty A¹ z boczną grupą karboksylową, jeśli występuje, grupy A², lub grupę o wzorze R ¹ CO gdzie R¹ jest wybrane z grup obejmujących:

   (a) atom wodoru, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7fo-fenyloalkllową:

   (b) R² >NR³ gdzie:

   r2 oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-11- atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7f0-fenyloalkllową, R³ oznacza atom wodoru lub grupę alkilową o 1-10 atomach węgla oraz (c) R⁴-O-, gdzie:

   R oznacza grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-o-fenyloalkilową:

   A¹ oznacza resztę wybraną z grupy obejmującej Mpp, D-Phe, L-lub D-Tpi, D-Trp, Trp, Phe lub D-pClu, podstawioną przy pierścieniu benzenowym przez jeden lub kilka podstawników wybranych z grupy obejmującej atom chlorowca, grupę NO2, NH2, OH, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla i grupę alkoksylową o 1-3 atomach węgla, przy czym chlorowiec oznacza fluor, chlor i brom;

   a2 oznacza Asn, Dpa, Cln, His, Me,His, His(Bzl), His(Z) lub grupę Asp(Y), Clu[-] i Clu(Y), gdzie:

   Y oznacza grupę -OR⁵ lub grupę o wzorze R⁶

   -N<

   R⁷ gdzie:

   r5 oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla lub grupę fenylową,

   Ri oznacza atom wodoru lub grupę alkilową o 1-3 atomach węgla,

   R 1 oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla lub grupę o wzorze -NHCONH2, zaś [-] oznacza wiązanie pojedyncze wiążące boczną grupę karboksylową, jeśli występuje, grupy a2 z grupą CC-aminową reszty a1 w której X oznacza wiązanie pojedyncze,

   A³ oznacza Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) lub Trp podstawiony przy pierścieniu benzenowym jednym lub kilkoma podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej atom chlo169 498 rowca, grupę NO2, NH2, OH, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla 1 grupę alkoksylową o 1-3 atomach węgla, przy czym chlorowiec oznacza fluor, chlor 1 brom, a4 oznacza Ala, MeAla lub Gln,

   A⁵ oznacza Val lub MeVal, a6 oznacza Gly, Phe lub D-Ala,

   A⁷ oznacza His, MeHis, His(Bzl), His(Z), Lys(Z) lub Pal,

   A⁸ oznacza zredukowany izoster Leu lub Phe, a9 oznacza D-, L- lub DL-Tpi oraz ich soli z farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami, przy czym gdy A1 oznacza Phe, a2 oznacza Glu, a gdy A1 oznacza D-pGlu - a2 oznacza Gln, znamienny tym, ze prowadzi się częściową kondensację fragmentów' peptydów technikami właściwymi dla chemii peptydów lub stopniową syntezę właściwą dla chemii peptydów, a następnie ewentualnie otrzymane peptydy poddaje się acylowaniu i/lub przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalne sole kwasowe.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stopniową syntezę prowadzi się zabezpieczając grupę aminową w pozycji a grupą ochronną przy związaniu C- końcowej grupy karboksylowej kowalencyjnym wiązaniem z syntetycznym nośnikiem stosowanym w takim celu, a następnie usuwa się z pozycji a grupę ochronną, redukuje się grupę karboksylową nasurpnego aminokwasu do grupy HC = 0, którą następnie przyłącza się do odblokowanej grupy α-aminowej, po czym odblokowuje się grupę α-aminową tego następnego aminokwasu 1 podstawia się ją grupą karboksylową kolejnego aminokwasu, prowadząc krok po kroku, kolejne etapy przyłączenia w prawidłowej kolejności dalszych aminokwasów stanowiących elementy syntezowanego peptydu, a po związaniu wszystkich aminokwasów w kompletny peptyd zdefiniowany w zastrz. 1, peptyd ten oddziela się od nośnika 1 ewentualnie usuwa się inne grupy ochronne bocznych grup funkcyjnych, jeśli są obecne.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wytwarza się polipeptyd o wzorze:

   D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-gsi-Tpi-NH2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze wytwarza się polipeptyd o wzorze:

   D-TigwGlmTrp-Ala-Val-Gly-Hśs-Imu--as-Tpi-\H2 przez odpowiednie sprzęgnie właściwych aminokwasów i peptydów.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wytwarza się polipeptyd o wzorzeTpi-Gjln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leugwn-T(a^?^^H'2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wytwarza się polipeptyd o wzorze:

   ACY-Tpi-Gln-Tip-Ala^al-Gly-His-Leu-psi-Tpi-N^. gdzie ACY oznacza grupę oktanoilową, przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze wytwarza się polipeptyd o wzorze:

   D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-pis-Tpi-NH2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.
8. 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze wytwarza się polipeptyd o wzorze:

   Phe-Glu-Trp--\la-Val-(śily-H'is-Leu-pn^3T'a^>^i^l2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związków polipeptydowych w formie farmaceutycznie dopuszczalnych nietoksycznych soli, zwłaszcza soli addycyjnych z kwasami, takich jak chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, fosforan, fumaran, glukonian, tamman, maleinian, octan, cytrynian, benzoesan, bursztynian, alginian, palmitynian, mleczan, askrobinian, winian, stosuje się odpowiednie kwasy.

   169 498
10. 10 Sposób wytwarzania nowych związków polipeptydowych o wzorze I:

    X-A¹ iA^ź-a³-a⁴-a⁵-a⁶-a⁷-aWa⁹-q, w którym

    Q oznacza grupę NH₂ lub grupę OQ', gdzie Q' oznacza wodór, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-io-fenyloakilową;

    X oznacza atom wodoru, wiązanie pojedyncze wiązące grupę «-aminową reszty A z boczną grupą karboksylową, jeśli występuje, grupy A², lub grupę o wzorze R CO-, gdzie R jest wybrane z grup obejmujących.

    (a) atom wodoru, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-1 o-feny yoalkilową:

    (b) R² >N

    R³ gdzie

    R- oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-10 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-^o-fenyloalkllową, R³ oznacza atom wodoru lub grupę alkilową o 1-1(0 atomach węgla oraz (c) R4-O-, gdzie R ⁴ oznacza grupę alkilową o 1-110 atomach węgla, grupę fenylową lub grupę C7-ll-fenyloalkllową;

    A¹ oznacza L-, D-, lub DL-Tpi;

    A² oznacza Asn, Dpa, Gln, His, MeHis, His(Bzl), His(Z) lub grupę Asp(Y), Glu[-] 1 Glu(Y), gdzie

    Y oznacza grupę -OR⁵ lub grupę o wzorze R⁶

    -N<

    R⁷ gdzie:

    R⁵ oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla lub grupę fenylową, r6 oznacza atom wodoru lub grupę alkilową o 1-3 atomach węgla, r7 oznacza atom wodoru, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla lub grupę o wzorze

    -NHCONH2, zaś [-] oznacza wiązanie pojedyncze wiązące boczną grupę karboksylową, jeśli występuje, grupy A- z grupą reszty A1 w której X oznacza wiązanie pojedyncze, a3 oznacza Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) lub Trp podstawiony przy pierścieniu benzenowym jednym lub kilkoma podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej atom chlorowca, grupę NO2, NH2, OH, grupę alkilową o 1-3 atomach węgla 1 grupę alkoksylową o 1-3 atomach węgla, przy czym chlorowiec oznacza fluor, chlor 1 brom, a4 oznacza Ala, MeAla lub Gln, a5 oznacza Val lub MeVal, a6 oznacza Gly, Phe lub D-Ala,

    A oznacza His, MeHis, His(Bzl), His(Z), Lys(Z) lub Pal,

    A⁸ oznacza zredukowany izoster Leu lub Phe, a9 oznacza D-, L- lub DL- resztę aminokwasową wybraną z grupy obejmującej Leu, Phe, Trp lub Trp(For);jak również ich soli z farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami, znamienny tym, ze prowadzi się częściową kondensację fragmentów peptydów technikami właściwymi dla chemii peptydów lub stopniową syntezę właściwą dla chemii peptydów, a następnie ewentualnie otrzymane peptydy poddaje się acylowamu i/lub przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalne sole kwasowe

    169 498
11. 11 Sposóbwedług zastrz. 10, znamienny tym, ze stopniową syntezę prowadzi się zabezpieczając grupę sminzwą w ązoycji a grupą ochronną ąroy owiąosniu C-kzńczwrj gruąy ksrdzksylzwrj kowalencyjnym wiązaniem z syntetycznym nośnikiem stosowanym w takim celu, a następnie usuwa się z pozycji a grupę ochronną, redukuje się grupę karboksylową następnego aminokwasu do grupy HC=O, którą następnie przyłącza się do odblokowanej grupy α-aminowej, po czym odblokowuje się grupę α-ammową tego następnego aminokwasu i podstawia się ją grupą karboksylową kolejnego aminokwasu, prowadząc krok po kroku, kolejne etapy przyłączenia w prawidłowej kolejności dalszych aminokwasów stanowiących elementy syntezowanego peptydu, a po związaniu wszystkich aminokwasów w kompletny peptyd zdefiniowany w zastrz. 14, peptyd ten oddziela się od nośnika i ewentualnie usuwa się inne grupy ochronne bocznych grup funkcyjnych, jeśli są obecne.
12. 12. Sposób według zastrz 1(0 albo 11, znamienny tymi, ze wytwarza się peptyd o wzorze D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Yal-Gly-His-Leu-pis-Leu-NHa przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.
13. 13 Sposób według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że wytwarza się peptyd o wzorze

    D-Tlw-Gln-Tφ-?\lα-Vαl -Gly-I lss-Lesl-ąsl-Phe-\[l przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów
14. 14 Sposób według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, ze wytwarza się peptyd o wzorze

    D-Tpi-Glr^-Trp-Ala-Val-Glj/-H[^^-I.^i--psi-Tir3-INlH2 przez odpowiednie sprzęganie właściwych aminokwasów i peptydów.
15. 15 Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania związków polipeptydowych w formie farmaceutycznie dopuszczalnych nietoksycznych soli, zwłaszcza stoli addycyjnych z kwasami, takich jak chlorowodorek, dromowodorek, siarczan, fosforan, fumaran, glukonian, tanmian, malemian, octan, cytrynian, benzoesan, bursztyman, algmian, palmitynian, mleczan, askorbinian, winian, stosuje się odpowiednie kwasy