CZ281533B6 - Nonapeptidičtí antagonisté bembesinu - Google Patents

Nonapeptidičtí antagonisté bembesinu Download PDF

Info

Publication number
CZ281533B6
CZ281533B6 CS931006A CS100693A CZ281533B6 CZ 281533 B6 CZ281533 B6 CZ 281533B6 CS 931006 A CS931006 A CS 931006A CS 100693 A CS100693 A CS 100693A CZ 281533 B6 CZ281533 B6 CZ 281533B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
trp
leu
tpi
ala
gly
Prior art date
Application number
CS931006A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew V. Schally
Ren Zhi Cai
Original Assignee
The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Administrators Of The Tulane Educational Fund filed Critical The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Publication of CZ100693A3 publication Critical patent/CZ100693A3/cs
Publication of CZ281533B6 publication Critical patent/CZ281533B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/086—Bombesin; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Novépseudopolypeptidy, které jsou účinnými antagonisty bombesinu, způsob jejich výroby a farmaceutické prostředky s jejich použitím. Jedná se o pseudopeptidy s nonapeptidickou sekvencí X-A.sup.1.n.-A.sup.2.n.-A.sup.3.n.-A.sup.4.n.-A.sup.5.n.-A.sup.6.n.-A.sup.7.n.-A.sup.á.n.-psí-A.sup.9.n.-Q, kde Q je NH.sub.2 .n.nebo oQ.sup.1 .n.je vodík, C.sub.1-10.n.alkyl, fenyl nebo fenyl-C.sub.7-10.n.alkyl, X je vodík nebo jedno- duchá vazba k A.sup.2.n., acylový zbytek organické kyse- liny nebo skupina vzorce R.sup.1.n.CO-, kde 1. R.sup.1 .n.je vodík, C.sub.1-10.n.alkyl, fenyl nebo fenyl-C.sub.7-10.n.alkyl, 2. R.sup.1.n.CO- je a) R.sup.2.n..N(R.sup.3.n.)-CO-, kde R.sup.2 .n.je vodík, C.sub.1-10.n.alkyl, fenyl nebo C.sub.7-10.n.fenyl-C.sub.7-10.n.alkyl, R.sup.3 .sup..n.je vodík nebo C.sub.1-10 .n.alkyl, b) R.sup.4.n.-O-CO-, kde R.sup.4 .sup..n.je C.sub.1-10.n., fenyl nebo fenyl -C.sub.7-10.n.alkyl, A.sup.1 .n.je D-, L- nebo DL-pGlu, Nal, Phe, Thi, Tyr, Tpi, Hca, Hpp, Mpp, Trp neboŕ

Description

Nonapeptidové antagonisty bomběsinu, farmaceutický prostředek a použití
Oblast techniky
Vynález je zaměřen na nové peptidy, které ovlivňují růst rakovinných nádorů u člověka. Konkrétně se týká antagonistů bomQ «Q besinu, tvořených [ pseudojnonapeptidy, obsahujícími na Nnebo/a C-konci D- nebo L-tryptofan nebo analog tryptofanu 2,3,4,9-tetrahydro-lH-pyrido[3,4-b]indol-3-karboxylovou kyselinu (Tpi), který má antagonistické vlastnosti vůči bombesinu nebo peptidům typu bombesinu a jejich solím, dále farmaceutických prostředků a použití těchto sloučenin jako látek účinných proti rakovině.
Dosavadní stav techniky
Vynález se týká polypeptidických sloučenin, které mají antagonistické vlastnosti vůči bombesinu nebo peptidům typu bombesinu, jako je peptid uvolňující gastrin (GRP), Neuromedin C a podobně, označované dále pouze jako antagonistické vlastnosti vůči bombesinu, a jsou účinné například při léčbě maligních chorob teplokrevných živočichů, jako je člověk. Vynález zahrnuje nové polypeptidické sloučeniny a způsoby jejich výroby, nové farmaceutické prostředky, obsahující tyto polypeptidické sloučeniny, a způsoby výroby léčiv s jejich obsahem pro použití k vyvolání antagonistického účinku vůči bombesinu u teplokrevných živočichů, jako je člověk.
Bombesin je tetradekapeptidamid, který byl původně izolován z kůže žáby Bombina bombina (Anastasi, Erspamer a Bucci, Experientia, 1971, 27, 166). Je známo, že bombesin je potentnim mitogenem pro fibroblastové buňky myši Swiss 3T3 (Rozengurt a SinnettSmith, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 2936) a že stimuluje sekreci amylasy z morčecích pankreatických acinů (Jensen, Jones, Folkers a Gardner, Nátuře, 1984, 309, 61). Je dále známo, že peptidy typu bombesinu jsou produkovány a vyměšovány lidskými plicnimi rakovinnými buňkami (SCLC) (Moody, Pert, Gazdar, Carney a Minna, Science, 1981, 214, 1246), že exogenně přidané peptidy typu bombesinu mohou stimulovat růst lidských buněk SCLC in vitro (Carney, Cuttita, Moody a Minna, Cancer Research, 1987, 47, 821) a že monoklonální protilátka, specifická pro C-terminální oblast bombesinu a GRP, může blokovat vazbu GRP k jeho receptorům a zabraňovat růstu lidských buněk SCLC in vitro i in vivo (Cuttita, Carney, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler a Minna, Nátuře, 1985, 316, 823).
GRP, který má vlastnosti, podobné bombesinu, je široce rozšířený peptidamid, obsahující 27 aminokyselin, izolovaný z vepřového střeva (McDonald, Jornvall, Nilsson, Vagne, Ghatei, Bloom a Mutt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, 90, 227), jehož C-terminálni sekvence aminokyselin je téměř identická jako u bombesinu. Neuromedin C je dekapeptidamid, jehož struktura je identická s posledními deseti aminokyselinami C-terminální oblasti GRP, který byl izolován ze psího tenkého střeva (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke a Shively, J. Biol. Chem., 1983, 258, 5582).
-1CZ 281533 B6
GRP stimuluje různé biologické odpovědi včetně uvolňování gastrinu v systemickém oběhu. Funguje také jako růstový faktor ve fibroblastech myši 3T3 a buňkách plicní rakoviny (SCLC). Bylo tedy navrženo, že GRP hraje přímou patofyziologickou roli ve vývoji SCLC autokrinním růstovým mechanismem.
Struktury bombesinu, Neuromedinu C a karboxyl-terminálního nonapeptidu GRP jsou tyto:
bombesin: pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
Neuromedin C:
H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
C-terminální nonapeptid GRP:
-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met~NH2
Výzkum dalších peptidů typu bombesinu z obojživelníků vedl k izolaci Litorinu jako nonapeptidu pGln-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 z kůže žab z Papuy, Nové Guineje, který se projevil jako nejúčinnějši bombesin (Yasukara a d., Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, 492). Studie bombesinových analogů ukázaly, že minimální segment 9 aminokyselinových zbytků v polohách 6-14 bombesinu má plné spektrum bombesinové aktivity.
Nyní je známo několik typů antagonistů bombesinu. Substance P (Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2), která vykazuje mírnou homologii aminokyselinové sekvence s bombesinem, neinhibuje vazbu bombesinu a peptidů typu bombesinu, ale analogy substance P, modifikované náhradou několika L-aminokyselin D-aminokyselinami, jako je (D-Arg1, D-Pro2, D-Trp7'9, Leu11)substance P a (D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7'9, Leu11)substance P (Moody a d., Fed. Proceedings, 1987, 46, 2201), jak bylo zjištěno, blokuji sekreci bombesinu v pankreatických acinárních buňkách a antagonizují růst podporující účinky bombesinu v buňkách Swiss 3T3. Například dva typy antagonistů bombesinu, odvozených od bombesinu, (D-Phe6, D-Phe12)bombesin a [Leu13-psí-Leu14]bombesin (Coy a d., J. Biol. Chem., 1988, 263, 5056, a Peptides, 1989,
10, 587) se projevily jako účinné inhibitory bombesinové odpovědi in vitro i in vivo.
Dalším typem antagonisty bombesinu, odhaleným Heimbrookem a kol. (J. Biol. Chem., 1989, 264, 11258), je N-acetyl-GRP(20-26) a jeho analogy, kde je z analogů GRP(20-27) vypuštěn C-terminálni methioninový zbytek. Nedávno uvedl Coy (J. Biol. Chem., 1989, 264, 14691), že určití antagonisté bombesinu s krátkým řetězcem, založeni na sekvenci Litorinu, jako je [D-Phe6, Leu13-psi-Phe14Jbombesin- (6-14) a [D-Phe6, Leu13-psí-Leu14]bombesin- (6-14), vykázali 13 mnohem více účinnosti než odpovídající mateřský peptid [LeuXJ-psi-Leu14]bombesin.
-2CZ 281533 B6
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje nové polypeptidy, konkrétně nonapeptidové sloučeniny, a soli těchto sloučenin s farmaceuticky přijatelnými kyselinami, které jsou účinnými antagonisty bombesinu, farmaceutické prostředky obsahující tyto nonapeptidové antagonisty bombesinu nebo terapeuticky přijatelné adiční soli s kyselinou a použiti těchto látek pro léčení rakoviny.
Předmětem vynálezu jsou tedy nonapeptidové antagonisty bombesinu obecného vzorce I:
X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-psí-A9-Q (I) ve kterém znamená:
Q je NH2 nebo OQ1, kde Q1 je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina nebo fenylalkylová skupina obsahující 7 až 10 atomů uhlíku,
X je vodík nebo jednoduchá vazba α-aminoskupiny A1 k postranní karboxylové skupině A2, je-li přítomna, nebo skupina vzorce RXCO-, kde R1 je zbytek zvolený ze souboru zahrnujícího:
a) atom vodíku, alkylové skupiny obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylové skupiny obsahující 7 až 10 atomů uhlíku,
b) skupinu:
kde R‘ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina nebo fenylalkylová skupina obsahující 7 až 10 atomů uhlíku, a R3 je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, a
c) skupinu R4-0-, kde R4 je alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina nebo fenylalkylová skupina obsahující 7 až 10 atomů uhlíku,
A1 je zbytek, zvolený ze skupiny zahrnující Mpp, D-Phe, Lnebo D-Tpi, D-Trp nebo Trp, substituovaný na benzenovém kruhu jedním nebo více členy vybranými ze skupiny zahrnující halogen, N02, NH2, OH, alkylové skupiny obsahující 1 až 3 atomy uhlíku a alkoxyskupiny obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, kde halogenem je fluor, chlor a brom,
A2 je Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) nebo skupina vzorce Asp(Y), Glu[-] a Glu(Y),
-3CZ 281533 B6 kde
Y je -OR5 nebo skupina:
/
kde
R je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo fenylová skupina,
R6 je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku,
R je atom vodíku, alkylova skupina obsahující 1 az 3 atomy uhlíku nebo -NHCONH2, a [“] j® jednoduchá vazba, spojující postranní karboxylovou 2 Ί skupinu A , je-li přítomna, s α-aminoskupinou A , přičemž X je jednoduchá vazba,
A3 je Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) nebo Trp, substituovaný na benzenovém kruhu jedním nebo více členy vybranými ze skupiny zahrnující halogen, N02, NH2, OH, alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 atomy uhlíku a alkoxyskupinu obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, kde halogenem je fluor, chlor a brom,
A4 je Ala, MeAla nebo Gin,
A5 je Val nebo MeVal,
A6 je Gly, Phe nebo D-Ala,
A7 je His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) nebo Pal,
Q
A je redukovaný isoster Leu nebo Phe,
A9 je D-, L- nebo DL-Tpi, a soli těchto sloučenin s farmaceuticky přijatelnými kyselinami.
Ve výhodném provedení podle uvedeného vynálezu jsou nonapeptidovými antagonisty bombesinu:
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2, D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2, nebo Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2.
Další výhodné nonapeptidové antagonisty bombesinu jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 a ACY-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2, kde ACY je acetyl, oktanoyl nebo 3-hydroxy-2-naftoyl.
-4CZ 281533 B6
Nejvýhodnějším nonapeptidovým antagonistou vynálezu je:
bomběsinu podle
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2.
Výhodnými nonapeptidovými antagonisty bombesinu podle vynálezu jsou farmaceuticky přijatelné soli s kyselinou odvozená od sloučeniny obecného vzorce I.
Do rozsahu vynálezu také náleží farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje nonapeptidový antagonist bombesinu obecného vzorce I nebo terapeuticky přijatelnou adiční sůl s kyselinou odvozenou od tohoto polypeptidu nebo komplex tohoto polypeptidu a farmaceuticky přijatelnou kapalnou nebo pevnou nosičovou látku.
Do rozsahu predmetneho vynalezu také naleží použiti nonapeptidového antagonisty bombesinu obecného vzorce I nebo terapeuticky přijatelné adiční soli s kyselinou odvozené od tohoto polypeplečem rakoviny.
vynálezu se používají konvenční jejich derivátů, které jsou užíjsou doporučeny komisí IUPAC-IUB European J. Biochem., 1984, 138, tidu pro pripravu prostředku pro
Pro účely popisu tohoto zkratky aminokyselin, peptidú a vány obecné v chemii peptidú a pro biochemickou nomenklaturu ( 9 až 37).
Zkratky pro jednotlivé zbytky aminokyselin jsou založeny na triviálním názvu aminokyseliny, například Trp je tryptofan, Gin je glutamin, His je histidin, Ala je alanin, Val je valin, Gly je glycin, Leu je leucin, Phe je fenylalanin. Má-li aminokyselinový zbytek isomerní formy, označuje zkratka L-formu aminokyseliny, není-li před symbolem aminokyseliny uvedeno D- nebo DL-.
Význam neobvyklých zkratek aminokyselin, použitých v této přihlášce:
Dpa 2,3-diaminopropionová kyselina
Nal 3-(2-naftyl)-alanin
Thi β-2'-thienylalanin
Tpi 2,3,4,9-tetrahydro-lH-pyrido-[3,4-b]indol-3karboxylová kyselina
Pal 3-pyridylalanin.
Peptidické sekvence jsou zapisovány v souladu s konvencí, přičemž N-terminální aminokyselina je nalevo a C-terminálni aminokyselina napravo.
Hca hydroskořicová kyselina
Hna 3-hydroxy-2-naftoová kyselina
Hpp 3-(4-hydroxyfenyl)propionová kyselina
Mpp 3-(4-methoxyfenyl)propionová kyselina Paa fenyloctová kyselina
-5CZ 281533 B6
Další použité zkratky:
AC Ac AcOH Boc acyl acetyl octová kyselina terč·butoxykarbonyl
(Boc)20 diterc.butyldikarbonát
BHA Bz BSA DIC DMEM Et EDTA FCBS Fmoc For HITES benzhydrylamin benzyl albumin hovězího séra 1,3-diisopropylkarbodiimid Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium ethyl ethylendiamintetraoctová kyselina sérum telecího plodu 9-fluorenylmethyloxykarbony1 formy1 médium RPMI 16 4D plus 10~8 M hydrokortisonu 5 μΐ/ml hovězího insulinu, 10 μg/ml lidského transferrinu, 108 M β-estradiolu a 3xl0-8 M Na2SeO3
HOBt HPLC Me MeCN MeOH TEA PBS pGlU psí 1-hydroxybenzotriazol vysokoúčinná kapalinová chromatografie methyl acetonitril methylalkohol triethylamin fosfátem tlumený solný roztok pyroglutamová kyselina pseudopeptidická vazba struktury CH2~NH kromě případů, kdy následující zbytek má sekundární N-konec, kdy znamená ch2n
TFA Z trifluoroctová kyselina benzyloxykarbony1
Nejvýhodnějšími polypeptidy podle vynálezu jsou: č. struktura
NH2-CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
-6CZ 281533 B6
D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-His (Bz) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-Glu-(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HiS“Leu-psí-Tpi-NH2
Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OMe
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OMe
D-Tpi-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NHMe
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OH
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-N2H2CONH2
Zvlášť výhodné polypeptidy podle vynálezu zahrnují peptidy Č. 5, 7, 12, 17, 18, 22, 26 a 38.
Syntéza polypeptidů:
Polypeptidy podle vynálezu je možno připravit jakoukoli známou metodou. Souhrn těchto metod lze nalézt v M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.
Metody syntézy výlučné v pevné fázi jsou uvedeny v učebnici J. M. Stewarta a J. D. Younga, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2. vyd.), a v přehledu G. Baranyho a d., Int., J. Peptide Protein Res., 30, 705 až 739, 1987.
-7CZ 281533 B6
Zvlášť výhodnou metodou přípravy polypeptidů a jejich meziproduktů podle vynálezu je syntéza v pevné fázi. Jako nosič se při syntéze polypeptidů podle vynálezu v pevné fázi používá benzhydrylaminová (BHA) pryskyřice nebo chlormethylovaná polystyrénová pryskyřice, síťovaná 1 % divinylbenzenu, které jsou obchodně dostupné. Jako chránící skupina pro α-aminoskupinu se volí terc.butoxykarbonylová (Boc-) skupina, která se odstraňuje po každém stupni syntézy. Výchozí látka, obsahující chráněnou aminokyselinu, se připraví kondenzací Boc-aminokyseliny s pryskyřicí BHA nebo jejím navázáním na chlormethylovanou polystyrénovou pryskyřici pomocí KF. Syntéza začíná na C-konci polypeptidů a provádí se pomocí manuálního zařízení postupně krok za krokem s odstraňováním chránící skupiny α-aminoskupiny a kondenzací s následující aminokyselinou.
Čištění polypeptidů:
Polypeptidy se obecné čistí vysokoúčinnou kapalinovou chromatograf ií (HPLC) na sloupci s reverzními fázemi, prováděnou na zařízení Rainin HPLC Systém (Rainin lne., Co., Woburn, ΜΑ), tvořeném třemi pumpami Rainin Rabbit HP HPLC, ovládanými počítačem Apple Macintosh Plus, vstřikovacím zařízením Rheodyne a UV monitorem Knauer model 87 s proměnnou vlnovou délkou. Surové peptidy (10 až 40 mg) se nanesou na kolonu Dynamax Macro (21,2 x 250 mm), plněnou kulovým silikagelem C18 (velikost pórů 300.10“10m, velikost částic 12 um, Rainin lne. Co.), a eluují lineárním gradientem s použitím rozpouštédlového systému, tvořeného a) 0,1% TFA a b) 0,1% TFA v 70% vodném acetonitrilu, s průtokem 2,0 ml/min. U všech frakcí se hodnotí čistota a retenční doba analytickou HPLC dále popsaným způsobem.
Kvalita a eluční charakteristiky surového a čištěného peptidu se stanoví analytickou HPLC na kapalinovém chromatografu Hewlett-Packard model 1090, vybaveném diodovou detekční soustavou při 220 a 280 nm a kolonou W-porex C18 4,6 x 250 nm s reverzními fázemi (velikost pórů 300.10“10m, velikost částic 5 um). Udržuje se průtok 1,2 ml/min shora uvedeného rozpouštédlového systému a),
b) a separace se provádějí při teplotě místnosti.
Ve většině případů se polypeptidy dále čistí rechromatografií na stejné koloně s mírnou úpravou gradientových podmínek. Homogenita čištěných peptidů v analytické HPLC prokázala čistotu nad 97 %.
Analýza aminokyselin:
Analýza aminokyselin polypeptidů podle vynálezu se provádí v analyzátoru aminokyselin Beckman 6300 na vzorcích, které byly 20 h při 110 ’C hydrolyzovány v zatavených evakuovaných zkumavkách se 4 M methansulfonovou kyselinou, obsahující 0,2 % 3-(2-aminoethyl)-indolu. Byly zjištěny očekávané poměry aminokyselin. Zbytky Leu-psí-Leu a Leu-psí-Phe vykazují absorpční píky s retenčními dobami 39,93, respektive 44,56 min. Po 50 min digesce nebyl při analýze nalezen Tpi.
-8CZ 281533 B6
Zkušební postupy:
a) test vazby receptorů
Navázání 125I-GRP(14-27) a jeho odštěpení antagonisty bomběsinu se provádí na 24-jamkových destičkách pro tkáňovou kultivaci (GIBCO) s použitím buněk Swiss 3T3. Myší fibroblasty Swiss 3T3 se udržují týdenním průchodem DMEM, obsahujícím 10 % FCBS a antimykotika. Kultury se inkubují v 5% CO2 ve vzduchu při 37 ’C. Jamky se osadí 105 bunék/jamku (životnost > 95 %), pěstovanými do souvislého nárůstu. Vazební postup se provádí 7 dní po naočkování. Buňky se promyjí dvakrát 0,5 ml vazebního pufru (Dulbeccovo modifikované Eagleho médium obsahující 20 nM HEPES-NaOH (pH 7,4), 0,2 % BSA a 100 ug/ml bacitracinu). Potom se buňky inkubují 0,2 nM 125I-GRP(14-27) v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých koncentrací antagonistů (6X10“11 až 6xl0-6 M, celkový objem 0,4 ml).
Podle Zacharyho & Rozengurda (Pres. Nati. Acad. Sci., USA, 1985, 85, 3636-3670) a Laytona a d. (Cancer Res., 1988, 43, 4783 až 4789) dosáhne vazba 125I-GRP při 37 °C maximální hodnoty ve 30 min a potom klesá; buňky se tedy inkubují 30 min při 37 ’C. Potom se dvakrát promyjí ledové chladným (4 °C) vazebním pufrem a dvakrát ledové chladným fosfátem tlumeným solným roztokem (PBS, NaCl 138, KC1 2,8, Na2HPO4 8, KH2PO4 1,45, CaCl2 0,91, MgCl2 0,49 mM). Promyté kultury se extrahují v 0,5 ml 0,5M NaOH a přenesou se do zkumavek. Jamky se promyjí jednou 0,5 ml destilované vody (sterilní), která s přidá do příslušných zkumavek. Radioaktivita vzorků se zjišťuje automatickým počítačem gamma (Micromedic Systém, lne., Huntsville, Ala.).
Ke stanovení typů vazby receptorů, disociační konstanty (Kd), asociační konstanty (Ka), maximální vazebné kapacity receptorů a poloviční maximální inhibice (IC50) se použije počítačový program aproximace křivky Ligand-PC podle Munsona a Rodbarda (Anal. Biochem., 1987, 107, 220 až 239).
Hodnoty IC50 reprezentují koncentrace antagonistů, vyvolávající polovinu maximální inhibice růstu stimulovaného 0,2 nM GRP(14-27). Disociační konstanta v našich pokusech je 1,32 nm a maximální vazebná kapacita 125I-GRP(14-27) 0,769 pm/mg protei, 12 5 nu, což jsou podobné hodnoty, jaké byly zaznamenaný u I-GRP a 125I-Tyr4-bombesinu. Vazebné charakteristiky receptorů GRP na buňky 3T3 v těchto pokusech dobře souhlasí s hodnotami, získanými pro vazbu bombesinu na pankreatické acinární (Jensen a d., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 6139-6143) a hypofyzární (Westendorf a Schonbrunn, J. Biol. Chem., 1983, 258, 7527-7535) buňky.
GRP(14-27) inhibuje vazbu 125I-GRP(14-27) s IC5Q 2>32 nMr což souhlasí s daty Laytona a d. (Cancer Res., 1988, 48, 4783 až 4789), který uvádí 2,2 nM. Údaje o vazbě polypeptidů podle vynálezu jsou uvedeny v tabulce I.
-9CZ 281533 B6
Tabulka I vazba na Swiss 3T3 kód Ka (nM-1) Kd (nM) IC50 (nM)
7 neodštěpuje - -
5 0,129 8 9,2
12 0,014 71 81,65
26 0,045 22 25,3
17 0,955 1 1,2
2 0,095 10,6 12,19
34 0,0006 1 667 1 917,05
11 0,217 5 5,75
27 0,013 74,5 85,66
29 0,0019 526,3 604,9
30 0,254 4 5,15
28 0,125 8 9,16
33 0,002 556 639,4
18 0,257 4 4,6
10 1 1 1,15
22 1,012 0,9 1,14
8 0,014 71 82,14
GRP(14-27) 0,758±0,23 l,32±0,43 l,52±0,7
Binax ~ 7/12xl0~12, t j . 0,35xl0”12 M/mg proteinu IC5Q je koncentrace neznačeného ligandu, který odštěpuje poloviční množství specifické vazby radioligandu. Počítá se podle rovnice Chenga a Prusoffa (Biochem-Pharmacol. 1973, 22, 3099): IC50 = Kc (1 + L/Kh), kde Kc a Kh jsou disociační konstanty neznačeného (Kc) a značeného (Kb) ligandu a L je koncentrace použitého radioligandu.
b) uvolňování amylasy
Izolované pankreatické aciny se připraví kolagenasovou digescí pankreatu, odebraného samcům krys Wistar (150 až 180 g), ponechaným přes noc bez potravy). Zvířata se usmrtí vyvrácením krčních obratlů, odebere se pankreas a digeruje vysoce čištěnou kolagenasou (CLSPA, 540 U/mg, Cooper Biomedical, Freehold, N. J., USA) postupem podle Amsterdama, Solomona a Jamiesona (1978).
Jednotlivé aciny se suspendují v inkubačním médiu, obsahujícím 24,5 mM HEPES, 98 mM NaCl, 4,0 mM KC1, 11,7 mM KH2PO4, 1,0 mM MgCl2, 0,3 mM CaCl2, 5,0 mM glukosy, 1 % (hmotn./obj.) směsi esenciálních a neesenciálních aminokyselin (Serva Feinbiochemica, Heidelberg, SRN), 2 mM glutaminu, 0,2 % BSA a 0,01 %(hmotn./obj.) trypsinového inhibitoru. Inkubační roztok se nasytí kyslíkem a udržuje při 37 ’C ve třepací lázni (60 oscilací/min). Acinární suspenze se inkubuje v přítomnosti různých koncentrací GRP nebo antagonistů GRP.
Po inkubaci se zkumavky 5 min odstředují při 1 000 g a supernatant se oddělí od pevného podílu. V supernatantu a rozpuštěném pevném podílu se oddělené stanoví obsah amylasy podle Bernfelda
-10CZ 281533 B6 (1955). Sekrece amylasy je dána procentem přírůstku nad základní hodnotu. Inkubace jsou zdvojené. Jako základní hodnota se stanoví nestimulované uvolňování amylasy během celé doby experimentu.
Přídavek k inkubačnímu médiu v postupné vzrůstající koncentraci způsobuje koncentračně závislou inhibici uvolňování amylasy, stimulovanou submaximální koncentrací GRP (10~9 M).
c) inhibice začlenění 3H-thymidinu do buněk 3T3
Použijí se buňky SCLC 2 až 4 dny po pasáži. Připraví se jednobuněčné suspenze promytím buněk (dvakrát PBS) a potom pípětovánim do PBS obsahujícího 0,2 g/1 glukosy, 0,2 g/1 EDTA a 14 mM lignokainhydrochloridu o teplotě 37 ’C do vytvoření uniformní suspenze (2 až 4 min). Buňky se potom třikrát promyjí a resuspendují v HITES bez FCSB. Ve dni 0 se vytvoří na destičkách po l,34xl05 buněk kultury, k nimž se přidají všechny peptidy současně v 1 ml média RPMI-1640 plus HITES a 0,125 % albuminu. Po 48 h se ke každé jamce přidá 1 μα tritiovaného thymidinu a v inkubaci se pokračuje ještě 24 h. Potom se buňky promyjí, přenesou na filtrační papír a promyjí ledově chladnou 5% trichloroctovou kyselinou. Filtrační papír se vloží do nádobek se scintilační tekutinou a 1 min se provádí čítáni.
Tabulka II testování antagonistických analogů gastrin uvolňujícího peptidu (GRP) na buňkách 3T3 inhibice začlenění 3H-thymidinu peptidický GRP % inhibice analog_____nq/ml 3 ng/ml_________DPM±S.E.________proti GRP §
20700014200
348000115300 (**)
26 50 + 23300018800 82
500 + 205000112500 >100 (-1*)
100 n + 22200013900 89
17 u 50 + 27700019800 50
500 + 20700013800 100
100 n + 22300011200 89
5 u 50 + 28300015400 46
500 + 280000121900 48 *
100 + 19900017100 >100 (-4 )
10 u 50 + 261000119500 62
500 + 24200018300 75
100 A + 255000126200 66
22 U 50 + 269000114000 56
500 + 280000114000 48
100 + 198000118800 >100 (-4*)
-11CZ 281533 B6 «Α·
P < 0,01 (-*) inhibice pod základní nestimulovanou hodnotou
§) 348000 - 207000 = 141000 vzato jako stimulovaná hodnota
d) inhibice růstu různých plicních (SCLC) karcinomů
Zásobní kultura buněk SCLC H-69 a H-345, získaná z National Cancer Institute (NCI), se udržuje v suspenzní kultuře. Inhibice GRP vyvolané syntézy antagonisty bombesinu se zjišťuje měřením včlenění 3H-thymidinu. Inhibice GRP vyvolané syntézy antagonisty bombesinu se ukazuje jako signifikantní a závislá na koncentraci.
e) účinek pankreatické sekrece in vivo
Výzkum sekrece se provádí při vědomí na 6 kočkách (2 až 3 kg), preparovaných s chronickými žaludečními a pankreatickými fistulemi (Konturek ad., J. Physiology London, 1976, 257, 663 až 672). V žaludeční fistuli se použije kanyla popsaná Emasem (Gastroenterology, 1960, 39, 886 až 782). Kanyla se zavede do oblasti vrátníku v blízkosti velkého zakřivení. Pankreatická fistule se vytvoří pomocí kovové kanyly tvaru T s bočním a hlavním ramenem, kterou jsme upravili pro kočky. Normální žlučovod se před spojením s vývodem slinivky rozdělí a transplantuje do horního dvanáctniku k oddělení žluči od pankreatické šťávy. Vytvoří se malý dvanáctníkový váček, obsahující vstup hlavního vývodu slinivky, a do tohoto váčku se zavede boční rameno pankreatické kanyly. Hlavní rameno této kanyly se umísti do distálního dvanáctniku asi 3 cm, za duodeno-duodenostomii.
Výzkum sekrece se zahájí asi 3 měsíce po chirurgickém zákroku. Alespoň 18 h před každým testem se z kleci odebere potrava. Během celého testu (kromě krmení) se žaludeční fistule ponechá otevřená k odtoku žaludečních šťáv.
Sekrece z pankreatické fistule se nepřetržité sbírá a dělí se do vzorků po 15 min. Zaznamená se objem a stanoví se koncentrace a výstup proteinu a bikarbonátu (Konturek a d., 1876).
Na každém zvířeti se provede řada testů pro srovnání sekreční potence. Při jednodenním testu se intravenózně podává GRP v odstupňovaných dávkách (1 250 pmol/kgh GRP) s přídavkem nebo bez přídavku peptidu 5. Při testech s krmením se žaludeční fistule udržuje uzavřená a každé kočce se podá asi 50 g vařeného homogenizovaného mletého hovězího masa, které je obvykle zcela zkonzumováno. Po krmení se udržuje intravenózní infuse solného roztoku (asi 10 ml/h) a když pankreatická sekrečni odpovéd’ dosáhne dobře ustálené prodlevy, podá se peptid 5 a další 2 h se zkoumá sekrece. Ve zvláštních testech na hladovějících kočkách (bez infuse peptidu nebo krmení masem) se 2 h měří základní pankreatická sekrece (s otevřenou žaludeční fistulí) a potom se k infusi přidá peptid 5 (10 nmol/kgh) v dávce, která zcela zruší pankreatickou sekreci, vyvolanou GRP. Výsledky jsou uvedeny dále.
Analogy bombesinu peptidy 5, 10 a 2 se testují in vivo na inhibici sérového gastrinu po stimulaci GRP. 8 min po stimulaci GRP (3 ug/100 g BW) se hladina sérového gastrinu zvýší z 16,7 pg/ml (kontrola) na 105 pg/ml. Krysa po injekci bolusu antagon
-12CZ 281533 B6 nich peptidů 5, 10 a 2 (30 ug/100 g BW) 10 min před stimulací GRP vykazuje pokles hladiny sekrece gastrinu (po 8 min 36,8 pg/ml pro peptid 2, 24,2 pg/ml pro peptid 10 a 39,2 pg/ml pro peptid 5).
Antagonisté bombesinu/GRP podle vynálezu jsou vhodní pro léčbu hypergastrinemických stavů, například preniciální anemie, chronické atrofické gastritidy, Zollinger-Ellisonova syndromu a vitiligo, spojených s difusní hyperplasií žaludečních enterochromaffinických buněk a se zvýšeným rizikem vývinu multifokálnich gastrických karcinoidnich tumorů. Hyperplasie enterochromaffinických buněk se navíc snadno dostavuje u hypergastrinemických zvířat.
Uvedená léčba je oproti dosavadním léčivům výhodná, protože H2-antagonisté, jako je cimetidin, kteří způsobují hypergastrinemii, mohou vést u člověka ke karcinoidním tumorům. Navíc vynecháni terapie s H2-antagonisty způsobuje v důsledku existující hypergastrinemie okamžité obnovení vředů.
Protože sloučeniny podle vynálezu jsou antagonisty receptorů bombesinu/GRP, mohou být používány při léčbě rakoviny plic, rakoviny tlustého střeva a rakoviny žaludku.
Na základě uvedených výsledků a dat získaných u krys mohou být peptidy podle vynálezu podávány ve formě farmaceuticky přijatelných netoxických solí, jako jsou adiční soli, jako jejichž příklady je možno pro ilustraci uvést hydrochlorid, hydrobromid, sulfát, fosfát, fumarát, glukonát, tanát, maleát, acetát, citrát, benzoát, sukcinát, alginát, pamoát, malát, askorbát, tartrát a podobné.
Výhodným prostředkem stálého uvolňování mohou být mikrokapsle nebo mikročástice těchto peptidů, formulované z poly(DL-laktid-koglykolidu). Je také možno používat intravenózní, intramuskulární nebo subkutánní aplikaci v isotonickém solném roztoku a podobně. Pro aplikaci v plicích je možno používat i aerosoly.
Tyto farmaceutické směsi obsahují peptid ve spojení s běžným farmaceuticky přijatelným nosičem. Dávkování se pohybuje od asi 1 do 1 000 μ-g peptidů na kg tělesné hmotnosti pacienta při parenterálním podání. Léčba subjektů těmito peptidy může být prováděna stejným způsobem jako klinická léčba s použitím jiných agonistů a antagonistů LHRH, analogů somatostatinu nebo jiných peptidů.
Tyto peptidy nalézají použití v intravenózní, subkutánní, intramuskulární, intranasálni formě nebo ve formě pulmonárních aerosolů k vyvoláni gastrického inhibičniho nebo antitumorového účinku. Účinné dávky se mění s formou aplikace a konkrétním druhem léčeného savce. Příkladem typické dávkové formy je fyziologický solný roztok, obsahující peptid, podávaný tak, aby zajišťoval dávku v rozmezí asi 0,01 až 0,20 mg/kg tělesné hmotnosti. Formulace s trvalým uvolňováním mohou být podávány pouze jednou měsíčné a doba léčby může činit několik měsíců.
Příklady provedeni vynálezu
Ačkoli je vynález popsán s ohledem na svá výhodná provedení, je pochopitelné, že bez překročení rozsahu vynálezu, uvedeného
-13CZ 281533 B6 v patentových nárocích, je možno v nich provádět obměny a modifikace, zřejmé odborníkovi. U vynálezu je také možno provádět známé substituce, pokud významné nesnižují jeho účinnost.
Obecné operace syntézy peptidů vycházející z jednotky Boc-aminokyselina-pryskyřice
Operace I:
(1) promytí CH2C12 (3x1 min) (2) odštěpení chránící skupiny - 5 min a potom 25 min s 50% TFA v CH2C12; u pryskyřic s navázaným peptidem obsahujících D~ nebo L-Trp nebo Tpi 50% TFA v CH2C12 s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu (3) promytí CH2C12 (6x1 min) (4) neutralizace 10% triethylaminem v CH2C12 (2x3 min) (5) promytí CH2C12 (6x1 min) (6) kondenzace: i) přídavek Boc-aminokyseliny (3 ekv.) a HOBt (3,3 ekv.) v DMF (3 min) ií) přídavek 20 % diisopropylkarbodiimidu v CH2C12 a třepání po dobu 60 až 90 min (7) promytí CH2C12 (2 x 1 min), ethanolem (2 x 1 min) a CH2C12 (5x1 min)
Operace II:
K zavedení redukované peptidické vazby -CH2NH- je stupeň (6) operace I modifikován takto:
(1) promytí DMF (2x1 min) (2) přídavek Boc-leucinaldehydu (3 ekv.) v DMF, obsahujícím 1% AcOH (3) přídavek NaBH3CN (3,5 ekv.) v DMF a třepání po dobu 60 min (4) promytí 50% MeOH (3x1 min)
100% MeOH (3x1 min) CH2C12 (3x1 min)
Operace III:
Ke kondenzaci Boc-Asn, Boc-Gln a Boc-Gly je stupeň (6) operace I modifikován takto:
20% diisopropylkarbodiimid (3 ekv.) v CH2C12 se přidá ke směsi DMF roztoku Boc-aminokyseliny (3,0 ekv.) a HOBt (3,3 ekv.), ponechá se 15 min při 0 °C a 15 min při teplotě místnosti, odfiltruje se nerozpustný podíl, filtrát se přidá k pryskyřici s navázaným peptidem a třepe se 2 až 4 h s Boc-Gln nebo Boc-Asn nebo 1 h s Boc-Gly.
Operace IV:
K zavedení Fmoc-aminokyseliny se provede tento postup:
-14CZ 281533 B6 (1) po odštěpení chránící skupiny a neutralizaci promytí CH2C12 (3x1 min) a DMF (3x1 min) (2) kondenzace i) přídavek Fmoc-aminokyseliny (3 ekv.) a HOBt (3,3 ekv.) v DMF (3 min) ií) přídavek 20% diisopropylkarbodiimidu v CH2C12 a třepáni po dobu 60 min (3) promytí ethanolem (3x1 min)
DMF (3x1 min) (4) odštěpeni skupiny Fmoc 50% piperidinem v DMF po dobu 30 min (5) promytí DMF (6x1 min) (6) další kondenzace jako ve stupni (2)
Potom, co se připraví požadované intermediární peptidy vzorce I, působí se na pryskyřici s navázaným peptidem kapalným HF v přítomnosti anisolu za vzniku polypeptidů ve volné formě, kde X ve vzorci I je vodík a Y ve vzorci I je -NH2 nebo OH, nebo v chráněné formě, kde A2 ve vzorci I je Glu(OMe) nebo His(Bz).
Přeměna funkční skupiny na N- nebo C-konci nebo v postranním řetězci polypeptidů z volné nebo chráněné formy na jinou formu se provádí reakcí s vhodným činidlem v roztoku. Například chráněný polypeptid, mající v poloze A2 Glu, se nechá reagovat s methylaminem v přítomnosti DIC za vzniku polypeptidů, majícího v poloze A Glu (MeNH). Polypeptid s volným N-koncem se nechá reagovat s KOCN za vzniku polypeptidů, majícího v poloze X skupinu NH2CO-.
V příkladech se k označování meziproduktů používá takovéhoto kódování: a/b/Res je původní pryskyřice, použitá v příkladu a, stupeň b, a/b/c je prekursor peptidu c, vyrobený ve stupni b příkladu a;, a, b a c jsou celá čísla.
Přiklad 1
1. a) L- a D-Tpi
2,04 g (10 mM) L-Trp se rozpustí ve 25 ml vroucí vody, obsahující 2,1 g citrónové kyseliny. Přidá se 0,5 ml 40% formaldehydu a okamžité se začíná tvořit pevná látka. Směs se vychladí na ledové lázni, pevný podíl se odebere, promyje studenou vodou a suší na vzduchu při teplotě místnosti; získá se tak 2,14 g, tj. 99 % pevné látky o teplotě tání (za rozkladu) cca 310 ’C. D-isomer, získaný stejným způsobem, má také teplotu táni (za rozkladu) cca 310 ’C.
b) L- a D-Boc-Tpi
K míchané suspenzi 10,8 g (50 mM) D-Tpi ve 250 ml 0,2N NaOH a 7,5 ml triethylaminu se přidá 10 g diterc.butyldikarbonátu, směs se míchá 4 h, potom se přidá dalších 10 g dikarbonátu a dalších 10 g po 3 h mícháni. Potom se směs míchá přes noc a extrahuje (2 x 100 ml) etherem, který se kanalizuje. K vodné vrstvě se přidá citrónová kyselina do kyselé reakce (pH 3-5). Pevný podíl se shromáždí, promyje vodou a přes noc suší na vzduchu.
-15CZ 281533 B6
Pevná látka se resuspenduje ve 100 ml tetrahydrofuranu. Rozpustí se téměř veškerý pevný podíl. Nerozpustný podíl se odfiltruje a tetrahydrofuran se odpaří ve vakuu. Zbytek se trituruje s etherem a získá se 9,20 g, respektive 58 %. Tato látka má stejnou teplotu tání jako výchozí látka, ale liší se rozpustností a při TLC na silice s použitím 85 : 15 : 0,5 CHCl-j : MeOH : HOAc.
Stejným způsobem se z 2,55 g L-Tpi získá 2,22 g, tj. 59 % Boc-Tpi.
2. Boc-Leu-CHO
Methylester Boc-leucinu (35 g, 134 mmol) v suchém toluenu (250 ml) pod dusíkem se vychladí suchým ledem a acetonem a během 30 min se přidá 150 ml 25% diisobutylaluminiumhydridu v toluenu. Po přídavku diisobutylaluminiumhydridu se směs míchá 20 min na lázni suchý led/aceton. Potom se opatrně přidá methanol (15 ml). Směs se vlije do 1 000 ml ledově chladné vody, protřepe a přefiltruje. Oddělí se toluen a vodná fáze se reextrahuje etherem (3 x 300 ml). Toluen se spoji s etherickými extrakty a suší (Na2SO4). Získaný olej se nechá rychle projít sloupcem silikagelu (3 x 50 cm) v 1 500 ml 15% EtOAc/benzín. Boc-Leu-aldehyd se získá ve formě oleje (27,6 g).
Příklad 2 peptid č.
NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2 · D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
Polypeptidy v tomto příkladu, obsahující stejný fragment Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2, ale dva různé zbytky na N-konci, se připraví postupnou syntézou na benzhydrylaminové (BHA) pryskyřici standardní metodou syntézy v pevné fázi.
Na 0,50 g pryskyřice BHA (0,9 mmol NH2/g) se působí dvakrát po dobu 3 min 10% TEA v CH2C12 (neutralizace) a šestkrát se promyje CH2C12. Pryskyřice se 3 min míchá s 1,35 mmol Boc-Leu a 1,50 mmol 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) v DMF. Přidá se 20% 1,3-diisopropylkarbodiimid (DIC) s 1,3 mmol v CH2C12. Směs se 60 min třepe při teplotě místnosti. Získaná pryskyřice Boc-Leu-BHA se promyje CH2C12, dvakrát methanolem a třikrát CH2C12 a potom se
-16CZ 281533 B6 podrobí Kaiserovu testu (Anal. Biochem. 34, 595 (1970). Pokud dojde k neúplné kondenzaci, kondenzační postup se opakuje.
Odštěpení skupiny Boc z Boc-Leu-BHA se provádí po dobu 5 min v roztoku 50% TFA v DCM, potom se provede filtrace a působení se opakuje, potom se provede šestinásobné promytí v DCM.
Neutralizace se provádí shora uvedeným postupem pro pryskyřici BHA.
Kondenzace s Boc-Leu-CHO odpovídá operaci II:
(1) promytí DMF 2 x (2) přídavek 1,5 mmol Boc-Leu-CHO v DMF s obsahem 1 % AcOH (3) přídavek 2,0 mmol NaBH3CN v DMF a třepání po dobu 60 min (4) promytí 50% methanolem v H2O 2 x, 100% MeOH 2 x a CH2C12 3 x
Po odštěpení skupiny Boc z Boc-Leu-psí-Leu-BHA a neutralizaci se provede kondenzace s Boc-His(Z) podle operace I. Kondenzace s Boc-Gly se provede podle operace III.
20% 1,3-diisopropylkarbodiimid (1,5 mmol) v CH2C12 se přidá k DMF roztoku 1,5 mmol Boc-Gly a 1,65 mmol HOBt o teplotě 0 ’C, za chlazeni se míchá 15 min a potom 15 min při teplotě místnosti, sraženina se odfiltruje a přidá k pryskyřici a třepe se 60 min.
Potom se způsobem, uvedeným v operaci I, postupně naváží následující aminokyselinové zbytky Boc-Val, Boc-Ala a Boc-Trp za vzniku 0,90 g chráněného polypeptidu, navázaného na pryskyřici, struktury Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/1/Res).
Po zavedení Boc-Trp se skupina Boc odštěpí 50% TFA v DCM s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu za vzniku TFA. Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/2/Res).
0,91 g TFA.Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/2/Res) se rozdělí na 8 dílů (po asi 100 mg), které se použijí k syntéze označených chráněných polypeptidů, navázaných na pryskyřici, podle postupů, uvedených v operaci I pro kondenzaci s Boc-D-Trp, Boc-5F-D-Trp, Boc-D-Tpi a Boc-His(Z) a v operaci III pro Boc-Gln.
Postupným navázáním Boc-Gln a Boc-Trp k uvedenému heptapeptidu na pryskyřici (2/2/Res) se získá:
2/2/01 Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA
Postupným navázáním Boc-Gln a Boc-D-Trp k heptapeptidu (2/2/Res) se získá:
2/2/02 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA
Navázání Boc-Gln a Boc-5F-D-Trp k heptapeptidu (2/2/Res) vede k:
2/2/04 Boc-5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA
-17CZ 281533 B6
2/2/05 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Bal-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA se získá postupným navázáním Boc-Gln a Boc-D-Tpi.
2/2/06 Boc-D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA se získá postupným navázáním Boc-Glu(OMe) a Boc-D-Tpi.
2/2/07 Boc-D-Tpi-His(Z)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA se získá postupným navázáním Boc-His(Z) a Boc-D-Tpi.
2/2/08 Boc-D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA se získá postupným navázáním Boc-His(Bz) a Boc-D-Tpi.
Po odštěpení skupiny Boc 50% TFA v DCM s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu se polypeptid navázaný na pryskyřici promyje vždy třikrát DCM, methanolem a DCM a na 1 h podrobí působení čerstvě předestilované HF (5 ml) a anisolu (0,25 ml) při teplotě 0 “C. Ve vakuu se odpaří rozpouštědlo, zbytek se promyje etherem nebo ethylacetátem a potom extrahuje 70 až 80% octovou kyselinou a lyofilizuje na surový
2/3/01 Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2 peptid č.
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
Směs 40 mg Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2 (2/3/1) a 20 μΐ TEA v 0,5 ml DMF a 20 mg KOCN ve 100 μΐ H2O se míchá při 0 °C, potom se do směsi přikape 100 μΐ AcOH a 1 h se míchá při 0 ’C. Reakční směs se podrobí čištění a získá se: peptid č.
NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2
Peptid (3) se připraví postupným navázáním Fmoc-Glu(OBut) a Fmoc-D-Trp metodou, uvedenou v operaci IV, na Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/2/Res) za vzniku Fmoc-D-Trp-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/4/3). Na pryskyřici s navázaným peptidem se 30 min působí 10% TFA v DCM s obsahem 5 % 2-merkaptoethanolu k odštěpení skupiny But z karboxylové skupiny Glu. Po šestinásobném promytí DCM se skrze lože Fmoc-D-Trp-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Leu-BHA (2/5/Res) v 5 ml DMF po dobu 5 min při 0 ’C probublává MeNH2, přidá se 0,25 ml 20% DIC v DCM a směs se nechá reagovat 2 h při 0 °C. Pryskyřice se potom promyje DCM a skupina Fmoc se odštěpí piperidinem. Peptid (3) D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH2 (RC-3490) se získá působením HF.
-18CZ 281533 B6
Čištění se provádí pomocí HPLC s rozpouštědlovým systémem, tvořeným (a) 0,1% TFA a (b) 1% TFA v 70% acetonitrilu. Čištěné peptidy ukazují při analytické HPLC čistotu přes 97 %. Retenční doby polypeptidů v tomto příkladu:
analytická HPLC gradient retenční doba peptid č. % B/min na koloně
2 25 až 65 % B/40 11,84
4 25 až 65 %/40 14,85
5 25 až 65 %/40 14,32
6 25 až 65 %/40 19,21
7 30 až 70 %/40 9,11
Výsledky aminokyselinové analýzy polypeptidů v tomto příkladu jsou podle očekávání. Například poměry aminokyselin v peptidu (2) struktury D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Leu-NH, jsou 1,11 : 2,09 : 0,90 : 1,03 : 0,95 : 0,92 (Gin : Trp : Ala : Val: Gly : His). Zbytek Leu-psí-Leu vykazuje absorpční pík s retenční dobou 39,95 min. Tpi v peptidech (5), (6), (7) a (8) nebyl detekován .
Příklad 3 peptid č.
NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2
D-Tpi-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
Polypeptidy v tomto příkladu obsahují stejný fragment Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2. Pryskyřice Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA (3/1/Res) se vybuduje postupně na 0,5 g pryskyřice BHA (0,9 mmol NH2/g) v souladu se syntézou v pevné fázi, popsanou v příslušné části příkladu 2, avšak první kondenzace se místo s Boc-Leu provádí s Boc-Phe.
Pryskyřice s částečným peptidem (3/1/Res) se vždy v množství asi 150 mg Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA kondenzuje se zbývajícími dvěma zbytky metodami, popsanými v operaci I pro kondenzaci s Boc-Trp, Boc-D-Trp, Boc-D-Tpi a Boc-Glu(OMe) a v operaci III pro Boc-Gln, na konečný polypeptid, navázaný na pryskyřici.
Postupným navázáním Boc-Gln a Boc-Trp na uvedený heptapeptid na pryskyřici (3/1/Res) se získá:
3/2/09 Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA
Postupným navázáním Boc-Gln a Boc-D-Trp na heptapeptid (3/1/Res) se získá:
-19CZ 281533 B6
3/2/10 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA
Navázáním Boc-Gln a Boc-D-Tpi na heptapeptid (3/1/Res) se získá:
3/2/12 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA
3/2/13 Boc-D-Tpi-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA se vybuduje kondenzací heptapeptidu (3/1/Res) s Boc-Glu(OMe) a Boc-D-Tpi.
Po odštěpení skupiny Boc pomocí 50% TFA v DCM s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu se polypeptid na pryskyřici promyje vždy třikrát DCM, methanolem a DCM a 1 h se podrobuje působení čerstvě předestilované HF (5 ml) a anisolu (0,25 ml) při 0 °C. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a zbytek se promyje ethylacetátem, extrahuje 70 až 80% octovou kyselinou a lyofilizuje. Získají se tak tyto peptidy:
3/3/09 Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 peptid č.
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
D-Tpi-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2
Peptid mající na N-konci skupinu NH2CO se připraví tímto postupem:
Směs 40 mg surového polypeptidu (3/3/9) Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2 a 20 μΐ TEA v 0,5 ml DMF a 20 mg KOCN ve 100 μΐ H2O se míchá při 0 °C, potom se do směsi přikape 100 μΐ AcOH a reakční směs se 1 h míchá při 0 ’C. Reakční směs obsahující požadovaný peptid (9) NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2 se podrobí čištění pomoci HPLC.
Peptid (11) se připraví postupnou kondenzací se dvěma Fmoc-aminokyselinami metodou uvedenou pro syntézu v pevné fázi v operaci IV.
150 mg TFA.Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA pryskyřice (3/1/Res) se neutralizuje 10% TEA, promyje CH2C12 a DMF a kondenzuje s Fmoc-Glu(OBut) za vzniku Fmoc-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA (3/5/11). Fmoc-D-Trp-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA se získá po odštěpení chránící skupiny 50% piperidinem a kondenzaci s Fmoc-D-Trp. Skupina But se od Fmoc-chránéného peptidu odštěpí působením 10% TFA v DCM s obsahem 2 % merkaptoethanolu po dobu 30 min. Ložem 200 mg Fmoc-D-Trp-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Phe-BHA (3/6/11) v 5 ml DMF se při 0 ’C po dobu 5 min probublává MeNH2, přidá se 0,2 ml 20% DIC v DCM a směs se míchá 2 h při 0 °C. Potom se pryskyřice promyje DCM a skupina Fmoc se odštěpí piperidinem. Po
-20CZ 281533 B6 působení HF a anisolu se peptid (11) D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2 se podrobí čištění HPLC.
Retenční doby peptidů v tomto příkladu:
analytická HPLC gradient retenční doba peptid č. % B/min na koloně D
9 25 až 65 16,38
10 25 až 65 14,62
12 25 až 65 14,72
13 25 až 65 19,20
Poměry aminokyselin se při aminokyselinové analýze projevily podle očekávání. Například poměry v peptidu (10) D-Trp-Gln-Trp“Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Phe-NH2 jsou 1,15 : 0,96 : 0,95 : 1,01 : 0,94 : 1,97 (Glu : Gly : Ala : Val : His : Trp) a tento peptid má pík s retenční dobou 44,56 min. Poměry v peptidu (13) jsou 1,04 : 0,98 : 1,02 : 1,00 : 1,03 : 0,94 (Glu : Gly : Ala : Val : His : Trp) a tento peptid má absorpční pík Leu-psí~Phe s retenční dobou 44,56. Tpi v peptidu (13) nebyl detekován.
Přiklad 4 peptid č.
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
I I
-Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Tpí-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Pryskyřice Leu-psi-Tpi-BHA se připraví reakcí pryskyřice Boc-Leu-psí-Trp-BHA s formaldehydem tímto postupem:
Boc-Leu-psí-Trp-BHA se získá z 1,0 g pryskyřice BHA (0,9 mmol NH2/g) postupnou kondenzací s Boc-Trp a Boc-Leu-CHO způsobem, uvedeným v operaci I a operaci II. K získané pryskyřici s navázaným peptidem se přidá 10 ml DMF s obsahem 1 % octové kyseliny, potom se provede reakce po dobu 60 min s 1 ml 10% formaldehydu při teplotě místnosti a promytí DMF, MeOH a DCM.
-21CZ 281533 B6
Všechny polypeptidy v tomto příkladu obsahují společný fragment Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2. Pryskyřice Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA (4/1/Res) se vybuduje na pryskyřici Leu-psí-Tpi-BHA postupnou kondenzací s Boc-His(Z) (operace I), Boc-Gly (operace III), Boc-Val, Boc-Ala a Boc-Trp (operace I).
150 mg část uvedeného meziproduktu se podrobí dvěma dalším kondenzacím postupem podle operace I k navázání Hca, D-pGlu, Boc-Glu(OMe), Boc-Glu(OBz), Boc-D-Phe, Boc-D-Trp, Boc-His(Bz), Boc-Tpi, Boc-D-Tpi, Ac-Tpi a Hna-Tpi a podle operace III k navázání Boc-Gln za vzniku konečných peptidů navázaných na pryskyřici .
Postupnou kondenzací uvedeného heptapeptidu na pryskyřici (4/1/Res) s Boc-Gln a Hca se získá
4/2/14 Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA
Postupným přídavkem Boc-Glu a D-pGlu k heptapeptidu (4/1/Res) se získá
4/2/15 D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA
Postupnou kondenzací uvedeného meziproduktu (4/1/Res) s Boc-Glu(OBz) a Boc-Phe se získá
4/2/16 Boc-Phe-Glu(OBz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA
Kondenzací Boc-Gln a Boc-D-Phe s heptapeptidem na pryskyřici (4/1/Res) se získá
4/2/17 Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA
4/2/18 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA se vybuduje kondenzací Boc-Gln a Boc-D-Trp s heptapeptidem na pryskyřici (4/1/Res).
4/2/19 Boc-D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA se vybuduje kondenzací Boc-His(Bz) a Boc-D-Trp s heptapeptidem na pryskyřici (4/1/Res).
4/2/21 Boc-D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA se vybuduje kondenzací Boc-Glu(MeO) a Boc-Tpi s heptapeptidem na pryskyřici (4/1/Res).
4/2/22 Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA se vybuduje kondenzací Boc-Gln a Boc-Tpi s heptapeptidem na pryskyřici (4/1/Res).
4/2/23 Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA se vybuduje kondenzací Boc-Gln a Ac-Tpi s heptapeptidem na pryskyřici (4/1/Res).
4/2/25 Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA se vybuduje kondenzací Boc-Gln a Hna-Tpi s heptapeptidem na pryskyřici (4/1/Res).
-22CZ 281533 B6
4/2/26 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA se vybuduje kondenzací Boc-Gln a Boc-D-Tpi s heptapeptidem na pryskyřici (4/1/Res).
Po odštěpení skupiny Boc a působení HF a anisolu jako v příkladech 2 a 3 se získají tyto peptidy:
peptid č.
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 peptid č.
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NHj
Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 mg Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 (4/3/16), 5 mg difenylfosforylazidu a 10 mg KHCO3 v 0,5 ml DMF se 24 h míchá při 0 ’C. Reakční směs se podrobí čištění pomocí HPLC s použitím rozpouštědlového systému 40 až 70 % B/60 min a získá se
I-----------------------------------------1 peptid (16) -Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2, asi
4,5 mg. Podle analytické HPLC s rozpouštědlovým systémem 25 až 65 %/40 min je čistý (> 95 %). Retenční doba je min.
Směs 40 mg surového polypeptidu 22 Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 20 μΐ TEA v 0,5 ml DMF a 20 mg KOCN ve 100 μΐ H20 se míchá při 0 ’C. Po několika min se do směsi přikape 100 μΐ AcOH a směs se míchá 1 h při 0 ’C. Reakční směs, obsahující požadovaný (oligo)peptid peptid (24) NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 se podrobí čištění pomocí HPLC.
Fmoc-D-Trp-Gln(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA (4/2/Res) se připraví postupnou kondenzací Fmoc-Glu(OBut) a Fmoc-D-Trp s pryskyřicí Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA (4/1/Res) způsobem podle operace IV. Po odštěpeni skupiny But působením 10% TFA v DCM s obsahem 2 % 2-merkaptoethanolu po dobu min se pryskyřice nechá reagovat s MeNH2 a DIC postupem, uvedeným v přikladu 3 pro pryskyřici (3/6/11), a získá se Fmoc-D-Trp-23CZ 281533 B6
-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-BHA (4/3/Res). Po odštěpení skupiny Fmoc piperidinem se na peptid na pryskyřici 1 h při 0 °C působí HF (5 ml) a anisolem (0,25 ml) a získá se peptid (20) D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2
Retenční doba peptidů v tomto příkladu:
analytická HPLC gradient retenční doba peptid č. % B/min na koloně D
17 25 až 65/40 17,13
18 25 až 65/40 19,34
22 25 až 65/40 21,32
26 30 až 70/40 16,76
Aminokyselinová analýza peptidů v tomto příkladu poskytuje očekávané složení. Například D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 (17) má poměry 1,04 : 0,99 : 0,96 : 1,00 : 0,94 : 0,99 : 1,06 (Glu : Gly : Ala : Val : Phe : His : Trp). Tpi v peptidech č. 17, 24 a 26 se v analýze aminokyselin neprojevuje.
Přiklad 5 peptid č.
Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
2 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
3 D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
Peptidy v tomto příkladu obsahují společný fragment Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2 nebo Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Trp(For)-NH2. Pryskyřice Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-BHA (5/1/Res) se vybuduje na 0,1 g pryskyřice BHA (0,9 mmol NH2/g) postupnou kondenzaci operacemi syntézy v pevné fázi, popsanými v příkladu 2, avšak při první kondenzaci se použije Boc-Trp(For) místo Boc-Leu. Podíly uvedeného peptidů po 250 mg se použijí k provedení syntézy těchto čtyř chráněných peptidů, kde se poslední kondenzace provádí postupem podle operace I s Mpp, respektive Boc-D-Phe, respektive Boc-D-Trp, respektive Boc-D-Tpi:
5/2/27 Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Trp(For)-BHA 5/2/28 Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Trp(For)-BHA 5/2/29 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Trp(For)-BHA 5/2/30 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Trp(For)-BHA
-24CZ 281533 B6
Po odštěpeni skupiny Boc 50% TFA v DCM s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu se polovina množství každého z uvedených peptidú na pryskyřici podrobí na 1 h při 0 ’C působeni HF (5 ml) a anisolu (0,25 ml) za vzniku těchto peptidú:
peptid č.
Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
2 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
4 D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp(For)-NH2
Zbylá polovina množství každého peptidú na pryskyřici se na 1 h při 0 ’C podrobí působení HF s obsahem 5 % anisolu a 5 % dimerkaptoethanolu za vzniku těchto peptidú:
Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Trp-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu“psí-Trp-NH2
Tyto peptidy mají při čištění HPLC tyto retenční doby:
analytická HPLC
gradient retenční doba
peptid č. % 1 3/min na koloně D
27 25 až 65 27,89
28 25 až 65 18,70
29 25 až 65 19,70
30 25 až 65 20,26
31 25 až 65 28,00
32 25 až 65 19,10
33 25 až 65 19,01
34 25 až 65 17,70
Výsledky analýzy aminokyselin u těchto peptidú jsou podle
očekávání. Například peptid (28) má poměry aminokyselin 0,98 : 0,92 : 1,03 : 0,97 : 0,98 : 1,09 (Gly : Ala : Val : Phe : His : Trp). Tpi ve (30) a (34) se neprojevuje.
Příklad 6 peptid č.
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OMe
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OMe
NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OMe
D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NHMe
D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OH
D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-N2H2CONH2
-25CZ 281533 B6
Jako výchozí materiál se použije Boc-Tep-OCH2-pryskyřice získaná tímto způsobem: Směs ClCH2-pryskyřice (1,0 g, 0,7 mmol Cl/g), Boc-Trp (2,0 mmol Trp) a KF (4 mmol) ve 20 ml DMF se 4 h míchá při 40 až 80 °C. Boc-Trp-OCH2-pryskyřice se potom promyje dvakrát MeOH, H2O, MeOH, DMF a DCM. Boc-Leu-psí-Trp-OCH2-pryskyřice se získá kondenzací Boc-Leu-CHO s Trp-OCH2-pryskyřicí podle operace II. Boc-Leu-psí-Tpi-OCH2-pryskyřice se získá reakcí Boc-Leu-psí-Trp-OCH2-pryskyřice s formaldehydem postupem, popsaným v příkladu 4. Postupnou kondenzací s Boc-His(Z), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp a Boc-Gln shora popsanými operacemi syntézy v pevné fázi se získá 1,60 g Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-OCH2-pryskyřice (6/1/Res). Část uvedeného meziproduktu se použije k získání Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí~Tpi-OCH2-pryskyřice (6/2/35) kondenzací s Boc-Tpi. Další alikvot meziproduktu se použije k získání Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-0CH9-pryskyřice (6/2/36) kondenzací s Boc-D-Tpi.
Po odštěpení skupiny Boc pomocí 50% TFA v DEM s obsahem 5 % merkaptoethanolu a 5 % anisolu se provede transesterifikace tímto postupem: 0,5 g Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-OCH2-pryskyřice (6/3/35), methanol (15 ml), DMF (15 ml) a diisopropylethylamin (3 ml) se smísí a směs se míchá 3 dny při teplotě místnosti. Pryskyřice se promyje DMF (3krát) a methanolem (3krát). Filtráty se spoji a odpařením ve vakuové rotační odparce se odstraní rozpouštědla. Po reakci s HF a anisolem se získá 123 mg surového peptidu
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OCH3
Peptid
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-OCH3 se získá stejným postupem s výchozí látkou (6/2/36).
Smés Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OCH3 (35) (40 mg). 20 μΐ TEA v 0,5 ml DMF a 50 mg KOCN ve 100 μΐ H20 se míchá při 0 ’C, po několika min se ke směsi přidá 50 μΐ AcOH a nechá se reagovat 1 h při 0 °C. Smés se potom podrobí čištěni a získá se peptid
NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OCH3
Směs D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OCH3 (36) a roztoku methylaminu v methanolu 1 : 2 hmotnostně (2 ml) se 16 h míchá při teplotě místnosti. Po odpařeni ve vakuové rotační odparce se zbytek lyofilizuje a podrobí působení HF a anisolu. Produktem je peptid
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NHCH3, který se podrobí čištění pomoci HPLC.
-26CZ 281533 B6
Na další podíl D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psí-Tpi-OCH2-pryskyřice (6/2/35) se působí HF a anisolem za vzniku peptidu
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-OH
Směs peptidu 39 (40 mg), (Boc)20 (20 mg) a TEA (20 μΐ) v 0,5 ml DMF se 4 h míchá při 0 °C a lyofilizuje. Po promytí etherem se zbytek, HOBt (10 mg) a N2H3CONH2 (20 mg) nechá reagovat přes noc při 0 °C s DCI (100 μΐ 20% DCI v DCM, DMF se odpaří, zbytek se promyje etherem a skupina Boc se odštěpí 50% TFA s 5 % merkaptoethanolu a anisolu za vzniku surového peptidu

Claims (7)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Nonapeptidové antagonisty bombesinu obecného vzorce I:
    X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-ps í-A9-Q (I) ve kterém znamená:
    Q je NH2 nebo OQ1, kde Q1 je vodík, alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina nebo fenylalkylová skupina obsahující 7 až 10 atomů uhlíku,
    X je vodík nebo jednoduchá vazba α-aminoskupiny A1 k postranní karboxylové skupině A2, je-li přítomna, nebo skupina vzorce RXCO-, kde R1 je zbytek zvolený ze souboru zahrnujícího:
    a) atom vodíku, alkylové skupiny obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylové skupiny obsahující 7 až 10 atomů uhlíku,
    b) skupinu: R2 \ N- / R3 kde R2 je atom vodíku, atomů uhlíku, fenylová obsahující 7 až 10 atomů alkylová skupina obsahující 1 až 10 skupina nebo fenylalkylová skupina uhlíku, a R3 je atom vodíku 10 atomů uhlíku, a nebo alkylová skupina obsahující 1 až
    -27CZ 281533 B6
    c) skupinu R4-0~, kde R4 je alkylová skupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, fenylová skupina nebo fenylalkylová skupina obsahující 7 až 10 atomů uhlíku, i
    A je zbytek, zvoleny ze skupiny zahrnující Mpp, D-Phe, Lnebo D-Tpi, D-Trp nebo Trp, substituovaný na benzenovém kruhu jedním nebo více členy vybranými ze skupiny zahrnující halogen, NO2, NH2, OH, alkylové skupiny obsahující 1 až 3 atomy uhlíku a alkoxyskupiny obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, kde halogenem je fluor, chlor a brom,
    A2 je Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) nebo skupina vzorce Asp(Y), Glu[-] a Glu(Y), kde
    Y je -OR5 nebo skupina:
    / kde c
    R je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo fenylová skupina,
    R6 je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku,
    R7 je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo -NHCONH2, a [“] je jednoduchá vazba, spojující postranní karboxylovou skupinu A2, je-li přítomna, s α-aminoskupinou A1, přičemž X je jednoduchá vazba,
    A3 je Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) nebo Trp, substituovaný na benzenovém kruhu jedním nebo více členy vybranými ze skupiny zahrnující halogen, NO2, NH2, OH, alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 atomy uhlíku a alkoxyskupinu obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, kde halogenem je fluor, chlor a brom,
    A4 je Ala, MeAla nebo Gin,
    A5 je Val nebo MeVal,
    A6 je Gly, Phe nebo D-Ala,
    A7 je His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) nebo Pal,
    A8 je redukovaný isoster Leu nebo Phe,
    A9 je D-, L- nebo DL-Tpi, a soli těchto sloučenin s farmaceuticky přijatelnými kyselinami .
    -28CZ 281533 B6
  2. 2. Nonapeptidové antagonisty bombesinu podle nároku 1, kterými jsou:
    D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2> D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2, nebo Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2.
  3. 3. Nonapeptidové antagonisty bombesinu podle nároku 1, který jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
    NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val”Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2 a ACY-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2, kde ACY je acetyl, oktanoyl nebo 3-hydroxy-2-naftoyl.
  4. 4. Nonapeptidové antagonisty bombesinu podle nároku 1, kterými jsou:
    D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psí-Tpi-NH2.
  5. 5. Nonapeptidové antagonisty bombesinu podle nároku 1, kterými jsou farmaceuticky přijatelné soli s kyselinou odvozené od sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1.
  6. 6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje nonapeptidový antagonist bombesinu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo terapeuticky přijatelnou adični sůl s kyselinou odvozenou od tohoto polypeptidu nebo komplex tohoto polypeptidu a farmaceuticky přijatelnou kapalnou nebo pevnou nosičovou látku.
  7. 7. Použití nonapeptidového antagonisty bombesinu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo terapeuticky přijatelné adični soli s kyselinou odvozené od tohoto polypeptidu pro přípravu prostředku pro léčeni rakoviny.
CS931006A 1990-11-29 1991-11-15 Nonapeptidičtí antagonisté bembesinu CZ281533B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/619,747 US5244883A (en) 1990-11-29 1990-11-29 Nonapeptide bombesin antagonists
PCT/US1991/008534 WO1992009626A1 (en) 1990-11-29 1991-11-15 Nonapeptide bombesin antagonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ100693A3 CZ100693A3 (en) 1994-03-16
CZ281533B6 true CZ281533B6 (cs) 1996-10-16

Family

ID=24483142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS931006A CZ281533B6 (cs) 1990-11-29 1991-11-15 Nonapeptidičtí antagonisté bembesinu

Country Status (26)

Country Link
US (1) US5244883A (cs)
EP (1) EP0559756B1 (cs)
JP (1) JPH06503090A (cs)
KR (1) KR100225679B1 (cs)
AT (1) ATE120760T1 (cs)
AU (1) AU657723B2 (cs)
CA (1) CA2097192C (cs)
CZ (1) CZ281533B6 (cs)
DE (1) DE69108738T2 (cs)
DK (1) DK0559756T3 (cs)
ES (1) ES2072137T3 (cs)
FI (1) FI104253B (cs)
GR (1) GR3015866T3 (cs)
HU (2) HU213114B (cs)
IE (1) IE62722B1 (cs)
LV (1) LV5794B4 (cs)
MC (1) MC2326A1 (cs)
NO (1) NO311362B1 (cs)
NZ (1) NZ240628A (cs)
PL (1) PL169498B1 (cs)
PT (1) PT99667B (cs)
RU (1) RU2115659C1 (cs)
SK (1) SK283541B6 (cs)
WO (1) WO1992009626A1 (cs)
YU (1) YU48751B (cs)
ZA (1) ZA919387B (cs)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5877277A (en) * 1987-09-24 1999-03-02 Biomeasure, Inc. Octapeptide bombesin analogs
US5723578A (en) * 1987-09-24 1998-03-03 The Administrators Of Tulane Educational Fund Peptide analogs of bombesin
WO1991004040A1 (en) * 1989-09-15 1991-04-04 Biomeasure, Inc. Treatment of colon cancer
US5162336A (en) * 1990-06-21 1992-11-10 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Tetrahydro-pyrido-indoles as cholecystokinin and gastrin antagonists
US5834433A (en) * 1990-07-26 1998-11-10 Merrell Pharmaceuticals Inc. Compounds and pharmaceutical uses of peptides of bombesin and GRP
US5369094A (en) * 1990-11-29 1994-11-29 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Polypeptide bombesin antagonists
HUT71585A (en) * 1992-02-07 1995-12-28 Merrell Dow Pharma Process for producing bombesin phenylalanine analogue peptides
DE4320201A1 (de) * 1993-06-18 1995-01-12 Asta Medica Ag Verwendung von Cetrorelix und weiteren Nona- und Dekapeptiden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Aids und zur Wachstumsstimulation
US5620955A (en) * 1993-06-18 1997-04-15 Peptide Technologies Corporation Bombesin receptor antagonists and uses thereof
US5997870A (en) * 1994-06-03 1999-12-07 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated peptides which bind to HLA-B44 Molecules
US5650395A (en) * 1995-03-13 1997-07-22 Hurel; Steven Treatment of pulmonary hypertension
US5972895A (en) * 1996-12-11 1999-10-26 A. Glenn Braswell Composition and method for increasing growth hormone levels
WO1998047524A1 (en) * 1997-04-22 1998-10-29 Curators Of The University Of Missouri Gastrin receptor-avid peptide conjugates
US7611692B2 (en) 2003-01-13 2009-11-03 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7922998B2 (en) * 2003-01-13 2011-04-12 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
ATE435035T1 (de) * 2003-01-13 2009-07-15 Bracco Imaging Spa Verbesserte linker für radiopharmazeutische verbindungen
US8420050B2 (en) * 2003-01-13 2013-04-16 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US20060239923A1 (en) * 2003-01-13 2006-10-26 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7850947B2 (en) * 2003-01-13 2010-12-14 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7226577B2 (en) * 2003-01-13 2007-06-05 Bracco Imaging, S. P. A. Gastrin releasing peptide compounds
US7795385B2 (en) * 2004-12-17 2010-09-14 Bexar Global, Inc. Use of bombesin/gastrin-releasing peptide antagonists for the treatment of inflammatory conditions, acute lung injury and bipolar disorder
US8101580B2 (en) 2005-04-21 2012-01-24 Astellas Pharma Inc. Therapeutic agent for irritable bowel syndrome
WO2008028688A2 (en) * 2006-09-08 2008-03-13 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Compounds and methods for 18f labeled agents

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4839465A (en) * 1987-01-20 1989-06-13 Sterling Drug Inc. Di-(D-tryptophyl and/or tetrahydropyridoindolylcarbonyl)-containing peptide amides and process for preparation thereof
WO1989002897A1 (en) * 1987-09-24 1989-04-06 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Therapeutic peptides
GB8808768D0 (en) * 1988-04-14 1988-05-18 Erba Carlo Spa Peptide ligands for bombesin receptors
GR1000608B (el) * 1988-07-21 1992-08-31 Erba Carlo Spa Μεθοδος για την παρασκευη ανταγωνιστων bombesin.
JP2919889B2 (ja) * 1988-10-14 1999-07-19 アドミニストレイターズ オブ ザ テューレイン エデュケイショナル ファンド 治療用ペプチド

Also Published As

Publication number Publication date
CA2097192C (en) 2002-01-01
YU48751B (sh) 1999-09-27
MC2326A1 (fr) 1994-01-18
SK55193A3 (en) 1993-10-06
NZ240628A (en) 1994-07-26
EP0559756A1 (en) 1993-09-15
HU211603A9 (en) 1995-12-28
SK283541B6 (sk) 2003-09-11
EP0559756B1 (en) 1995-04-05
JPH06503090A (ja) 1994-04-07
NO931977L (no) 1993-05-28
US5244883A (en) 1993-09-14
LV5794B4 (lv) 1997-08-20
CA2097192A1 (en) 1992-05-30
RU2115659C1 (ru) 1998-07-20
KR930702386A (ko) 1993-09-08
ZA919387B (en) 1992-09-30
DE69108738T2 (de) 1995-08-17
HU9301567D0 (en) 1993-09-28
FI932457A0 (fi) 1993-05-28
ES2072137T3 (es) 1995-07-01
IE914140A1 (en) 1992-06-03
AU9064591A (en) 1992-06-25
PL169498B1 (pl) 1996-07-31
CZ100693A3 (en) 1994-03-16
PT99667B (pt) 1999-05-31
DE69108738D1 (de) 1995-05-11
FI104253B1 (fi) 1999-12-15
HU213114B (en) 1997-02-28
PT99667A (pt) 1992-10-30
IE62722B1 (en) 1995-02-22
AU657723B2 (en) 1995-03-23
FI104253B (fi) 1999-12-15
HUT64566A (en) 1994-01-28
NO931977D0 (no) 1993-05-28
YU183491A (sh) 1994-11-15
ATE120760T1 (de) 1995-04-15
GR3015866T3 (en) 1995-07-31
KR100225679B1 (ko) 1999-10-15
FI932457A (fi) 1993-05-28
NO311362B1 (no) 2001-11-19
DK0559756T3 (da) 1995-06-19
WO1992009626A1 (en) 1992-06-11
LV5794A4 (lv) 1997-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ281533B6 (cs) Nonapeptidičtí antagonisté bembesinu
JP3838656B2 (ja) ポリペプチドのボンベシン拮抗物質
WO1995000542A1 (en) Bombesin receptor antagonists and uses thereof
WO1994021674A9 (en) Polypeptide bombesin antagonists
WO1992002545A1 (en) Bombesin antagonists
EP2198878A1 (en) Polypeptide bombesin antagonists
JP3040166B2 (ja) ノナペプチドのボンベシン拮抗薬
HRP921277A2 (en) Nonapeptide bombestin antagonists

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20081115