EP1084253A1 - Mimotopes du virus hiv - Google Patents

Mimotopes du virus hiv

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Publication number
EP1084253A1
EP1084253A1 EP99925080A EP99925080A EP1084253A1 EP 1084253 A1 EP1084253 A1 EP 1084253A1 EP 99925080 A EP99925080 A EP 99925080A EP 99925080 A EP99925080 A EP 99925080A EP 1084253 A1 EP1084253 A1 EP 1084253A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
seq
phe
thr
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99925080A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Véronique BARBAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Pasteur SA
Original Assignee
Aventis Pasteur SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pasteur SA filed Critical Aventis Pasteur SA
Publication of EP1084253A1 publication Critical patent/EP1084253A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to the treatment and prevention of the HIV virus and in particular to any peptide mimicking new conformational epitopes of antigens of the envelope of the HIV virus and to any polynucleotide integrated in a vector allowing the expression of said peptides and their use for therapeutic, prophylactic, in particular vaccine, and / or diagnostic purposes.
  • HIV is an RNA-enveloped virus and represents the etiological agent of acquired immunodeficiency syndrome or AIDS, the outcome of which is fatal in the long term, characterized by progressive destruction of the immune system and the concomitant development of micro-biological infections causing often due to opportunistic germs.
  • the envelope of the HIV virus derived from the expression product of the Env gene (envelope gene), is first synthesized in the form of a glycoprotein Gp160 which then cleaves into two glycoproteins Gp 120 and Gp 41 These 3 proteins are found on the surface of cells infected with HIV.
  • Gp 160 and Gp 120 have an affinity for the CD4 molecule present on the surface of certain T lymphocytes, a molecule CD4 which acts as a gateway for the HIV virus to enter the cell. So far, very few epitopes accessible to the immune system have been described on the envelope of the HIV virus (Burton DR, 1997 Proc.Natl. Acad. Sci. USA 94: 10018-10023).
  • envelope epitopes which are inducers of neutralizing antibodies, or in other words which are capable of reducing or suppressing viral spread.
  • the present invention aims to overcome these needs by identifying new peptide structures for the therapeutic or prophylactic treatment of HIV infection from the use of a combinatorial library of antibodies from HIV positive patients and belonging to the group.
  • "long term non progressor” the invention relates to any peptide structure capable of reacting with an antibody specific for an antigen of the HIV envelope originating, for example, from a combinatorial library of antibodies obtained from lymphocytes of HIV positive patients. and belonging to the group of "long term non progressors", comprising an amino acid sequence which mimics a conformational epitope of the envelope of said virus without however corresponding to a continuous amino acid sequence of this antigen.
  • the present invention also relates to any recombinant vector comprising a functional expression cassette allowing the expression of a polynucleotide coding for a peptide meeting the criteria defined above.
  • the present invention also relates to a therapeutic or prophylactic composition of the HIV virus, in particular intended for vaccine use, the active principle of which comprises a peptide meeting the criteria defined above and / or a recombinant vector coding for said peptide.
  • a peptide meeting the criteria defined above as a reagent for the diagnosis of the HIV virus making it possible in particular to identify subjects in contact with the virus more resistant to infection, said diagnosis comprising the evaluation, from a blood sample, the humoral and / or cell-mediated response specific for this peptide.
  • Peptide means a sequence of at least 6 amino acids linked together by a peptide bond obtained by chemical synthesis or by genetic recombination techniques, preferably between 6 and 100 amino acids and in particular between 20 and 80 amino acids .
  • Bostolic envelope antigen any molecular entity that binds to an antibody specific for any product derived from the env gene, comprising in particular gp 160 in natural or recombinant form, its derivatives constituted by gp41 and gp 120 may also be in natural or recombinant form and the products derived from the combination of said molecules.
  • “By conformational epitope” means a three-dimensional structure which allows its positioning in the specific binding site of an antibody, like a key in a lock, and which is represented by an amino acid sequence which does not correspond not a continuous amino acid sequence of the protein against which this antibody is raised.
  • this amino acid sequence of the conformational epitope is not homologous to a continuous amino acid sequence of the natural or recombinant protein, the homology being defined by the combination of two criteria:
  • the amino acid identity criterion determined by the ratio between the number of amino acids of a peptide according to the invention which are identical to those of a sequence of the same size carried by the natural or recombinant protein, and the total number of amino acids of said peptide.
  • the identity in amino acids will preferably not exceed 50%, even 60% or 70% or 80% or even 90%.
  • the linking criterion determined by the ratio between the number of amino acids of a peptide according to the invention which are both identical and are in the same linking position as those of a sequence of the same size carried by the natural or recombinant protein, and the total number of amino acids of said peptide.
  • the linking identity will not exceed 70 to 80%.
  • Long term non progressor means HIV positive subjects characterized on the clinical level, in that they do not develop AIDS since they are contaminated with a decline of at least ten years, on the biological level, in what they do not show signs of immunosuppression with in particular a rate of CD4 T lymphocytes higher than 600 / mm 3 and finally not receiving any particular antiviral treatment.
  • “By mimotope” means an epitope which mimics the three-dimensional structure of another epitope by binding to the specific binding site of the same antibody
  • “By CDR3” means the hypervariable amino acid chain region of the heavy and light chain of immunoglobulins and which is located at the site of specific interaction with the epitope.
  • Conjugate means the association of the peptide as defined in the invention with any other molecule, by physical or chemical methods, intended to induce or strengthen the immunogenicity of the starting peptide.
  • Immunogenicity means the ability of a molecular entity, after inoculation into a mammal, to induce production of antibodies specifically directed against this entity.
  • Polynucleotide means either an RNA sequence, or a DNA sequence, or a cDNA sequence resulting from the reverse transcription of a sequence of natural or synthetic origin, with or without modified bases.
  • “Mucosal route” means a mode of administration which brings the pharmaceutical composition directly into contact with the different types of mucous membranes in the body.
  • Parenter route means a mode of administration which puts the pharmaceutical composition directly in contact with the internal tissues or organs of the organism.
  • the invention therefore relates to any peptide which mimics a conformational epitope of an antigen of the HIV envelope and which is recognized by an antibody obtained from a "long term non progressor" patient and specific for this antigen.
  • a peptide according to the invention can be advantageously represented by one of the 11 sequences as follows
  • the selection from this bank of recombinant antibodies specific for antigens of the HIV envelope, in particular expressed by Gp160, Gp120, Gp41 can be in the form of natural or recombinant proteins, glycosylated or deglycosylated, monomeric or multimeric or finally combined or not.
  • the selection of specific recombinant antibodies preferably comprises an additional step consisting in measuring the neutralizing activity of these recombinant antibodies with respect to viral infection mediated in particular by one or more primary isolates of the HIV virus.
  • specific recombinant antibodies which neutralize several primary isolates of the HIV virus.
  • these peptides are mimotopes of conformational HIV epitopes in that there is no correspondence between the amino acid sequence of said peptide with any continuous amino acid sequence found in the proteins of l HIV envelope on the one hand and on the other hand in that this peptide is capable of inhibiting the interaction of the recombinant antibody with the product of the env gene which served for the selection of said recombinant antibody.
  • lymphocytes originating from a "long term non progressor" patient by using, for example the Epstein virus
  • EBV Epstein Barr
  • the lymphocyte transformation process is well known to those skilled in the art and results, after several cycles of selection against the antigen of interest, in obtaining the transformed and immortal lymphocyte clones, each clone producing a single type of monoclonal antibody .
  • These monoclonal antibodies like recombinant antibodies from the combinatorial library, can also be tested for their neutralizing activity against various primary HIV isolates before being used for the selection of mimotope peptides from the HIV envelope.
  • the present invention also relates to peptides comprising a repetition (2 or more) of the peptide according to the invention.
  • the coupling of the two identical peptides can be done if necessary by means of an intermediate spacer arm constituted by the chain of amino acids Gly Pro Gly.
  • the invention also relates to a combination of different peptides according to the invention, as well as to peptides comprising both repeats and combinations.
  • the peptides can be joined by covalent bonds or non-covalent bonds.
  • Posnett et al J. Biol. Chem. (1988) 263: 1719
  • Posnett et al J. Biol. Chem. (1988) 263: 1719
  • the peptides according to the invention can thus be conjugated to known immunogenic proteins such as serum albumin, thyroglobulin, ovalbulmine, gelatin, haemocyanin (eg Keyhole Limpet Haemocyanin KLH), seroglobulins, tetanus toxoid, diphtheria toxoid, proteins from external membranes of bacteria, etc, but it is also possible to prefer to conjugate the peptides with “T helper” epitopes among which the “T helper” epitopes of HIV are chosen, for example the T1 and p24E epitopes as described in WO 94/29339 (Connaught).
  • the conjugation reactions with said "T helper" epitopes of HIV allow us to obtain compounds whose sequential sequence is p24E-GPG-X-GPG-T1 where:
  • -p24E symbolizes the amino acid sequence of the p24E epitope, said sequence being placed on the N-terminal side of the peptide according to the invention;
  • -GPG symbolizes the glycine-proline-glycine sequence;
  • -X symbolizes the peptide of interest according to the invention which may be, if necessary, the product of the combination of several identical or different amino acid sequences in accordance with the invention;
  • -T1 symbolizes the amino acid sequence of the T1 epitope, said sequence being placed on the C-side of the peptide according to the invention
  • conjugates can themselves be grafted onto a branched lysine framework so as to obtain polymers of said conjugates in a branched form as described in WO 94/29339 (Connaught), the technical content of said patent being incorporated by reference into the subject matter of the invention.
  • Heterobifunctional agents such as SPDP, carbodiimide, glutaraldehyde, biotin / avidin system, etc. can be used, for example.
  • the peptides can also be coupled to lipopolysaccharides, polysaccharides, glycopeptides, muramyl peptide analogs, fatty acids, etc.
  • a peptide is coupled with a fatty acid of the palmitoyl-lysine type as described in EP 491628 (Biovector) or (Pam) 3
  • the peptides can also be formulated with alum, monophosphoryl Lipid A, pluronics, SAF1, Ribi, treha! Ose-6,6-dimycolate or other immunostimulatory compounds known to those skilled in the art to increase immunogenicity of the peptide to which these compounds are linked.
  • the present invention also relates to the DNA fragments coding for the peptides according to the invention and which can be used to produce the peptides by expression of the DNA sequence in an appropriate expression system.
  • the expression system is an in vitro expression system for the production of the peptides with a view to their subsequent use, eg as a diagnostic reagent, as an antigenic component or as a vaccine component.
  • Such systems or vectors for in vitro expression are perfectly known to those skilled in the art and mention may be made, for example, of bacteria such as E. coli, eukaryotic cells such as yeasts, in particular S. cerevisiae. , baculovirus, in particular spread on insect cells, etc.
  • the invention therefore also relates to an expression cassette comprising such a DNA fragment and regulatory sequences allowing the expression of this DNA fragment in an appropriate in vitro expression system.
  • the expression system is an in vivo expression system for generating an immune reaction, preferably protective, in the patient treated.
  • the expression system which may be replicative or non-replicative, will express the peptide in vivo. Those skilled in the art have at their disposal such systems.
  • plasmids in particular naked plasmids, eg according to WO-A-90 11092, WO-A-93 19813, WO-A-94 21797 and WO-A-95 20660, poxviruses, such as vaccinia virus and avian pox (fowlpox, pigeonpox, canarypox, etc.), adenoviruses, etc.
  • poxviruses such as vaccinia virus and avian pox (fowlpox, pigeonpox, canarypox, etc.), adenoviruses, etc.
  • the invention therefore also relates to expression cassettes comprising such a DNA fragment and the means for regulating expression in the chosen expression system. It also relates to the expression system or expression vector, comprising such an expression cassette, in particular plasmid, poxvirus, adenovirus, as seen above.
  • the subject of the invention is the use of phages expressing the peptide of interest or a combination of phages expressing the peptides of interest as a diagnostic reagent, as an antigenic component or vaccine.
  • the invention also relates to the use of at least one peptide in accordance with the invention in combination or not with at least one recombinant vector in accordance with the invention for the preparation of a pharmaceutical composition intended for preventing or curing a condition related to the HIV virus.
  • a composition according to the invention can comprise preparations which can be in the form of creams, lyophilized powders or not, solutions, suspensions, for administrations by mucous route such as oral, nasal, rectal, genital, cutaneous, for example.
  • parenteral administration such as intra dermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intra arterial, intra lymphatic or intra peritoneal, for example, sterile injectable preparations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions .
  • the preparations may contain excipients and / or stabilizing agents suitable for the mode of administration.
  • Preparations for vaccine use may also contain adjuvants or be incorporated into delivery systems compatible with use in human medicine.
  • adjuvants such as Alum (aluminum phosphate phosphate or aluminum hydroxide or the mixture of the two) incorporated in a conventional manner in vaccines, the incomplete Freund's adjuvant, monophosphorylated lipid A ( MPL), QS21, Polyphosphazene, muramyl dipeptide (MDP) or its derivatives, the use of antigen delivery systems such as emulsions (MF59, SAF1, RIBI, SB 62, SB 26), ISCOMS, liposomes, microspheres composed of PLGA polymers of well calibrated diameter, or possibly pseudo virions.
  • Alum aluminum phosphate phosphate or aluminum hydroxide or the mixture of the two
  • MPL monophosphorylated lipid A
  • QS21 QS21
  • Polyphosphazene muramyl dipeptide
  • MDP muramyl dipeptide
  • compositions will be determined taking into account the nature of the composition, the level of expression of the peptide of interest by the recombinant vector if it is included in the preparation, the age , sex and weight of the individual receiving the preparation.
  • the relative importance of the carrier molecule in the conjugate will also be taken into account if it is included. in the composition.
  • the doses of peptides administered may reach 1 to 5 mg but more generally will be between 5 ⁇ g and 1 mg per injection, preferably 50 to 500 ⁇ g.
  • the recombinant vector coding for the peptide of interest may be administered or used to transfect or infect the cells of interest at a minimum dose of 10 3 ′ 5 infecting units (pfu or plaque forming unit).
  • the recombinant vector will be used in a dose scale ranging from 10 4 to 10 10 pfu depending on the expression efficiency of the peptide by this vector and in particular in a dose scale ranging from 10 6 to 10 9 pfu, for example.
  • the pharmaceutical composition comprises several recombinant vectors coding for peptides of different interest
  • these same dose scales can be applied to these combinations.
  • Those skilled in the art will be able to refer to the protocols and clinical trials using preparations based on recombinant vectors, in particular recombinant pox viruses, recombinant adenoviruses, already produced in humans to agree on the appropriate number of pfu that must contain pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition comprises a plasmid containing the expression system of the peptide of interest
  • the level of immune response that this composition is capable of inducing which must be at least equal to that of. intact or modified peptide and / or the level of expression of the peptide induced by the plasmid in the cells of the organism which must approach as much as possible that obtained by the recombinant vectors already mentioned.
  • the quantities of plasmids contained in the pharmaceutical compositions may be in scales ranging from 1 ⁇ g to 100 mg, preferably between 0.1 mg to 10 mg.
  • the pharmaceutical composition may be administered at once or several times to achieve the desired level of response including in particular the level and quality of the specific antibody response and / or cell-specific mediation desired, and characterized in that it guarantees the protection of the individual against accidental contamination.
  • the chosen administration voice may be necessary, in addition to the composition of the preparation, the chosen administration voice, to respect the time limits set between each injection, which can preferably be 1 month, 2 months or 6 months and / or to make use, in a combined or alternating manner, during the duration of the medical protocol, in particular the vaccine protocol, of different pharmaceutical compositions relating to the peptide, to the recombinant vector, to the plasmid of interest or even to the phages expressing the peptide (s) of interest that the the skilled person is capable of mastering. To maintain the level of protection, it may also be necessary to give booster injections at regular intervals.
  • the pharmaceutical composition for the treatment of HIV-related infection, may be administered at once or several times and in a manner which may be very close together, in particular within periods of less than a week, in order to reach the level desired response, in particular that which makes it possible to ascertain the absence of the HIV virus in the blood by the PCR test.
  • the pharmaceutical composition comprising the peptide, the vector, the plasmid of interest.
  • phages expressing the peptide or peptides of interest may be combined or used alternately with conventional treatments for this condition, including in particular mono , bi or tri antiviral therapy.
  • a pharmaceutical composition comprising one or more peptides of interest, the corresponding recombinant vector (s) as well as the plasmid (s) of interest or even bacteriophages expressing the peptide (s) of interest to stimulate the cells of the patient's immune system in vitro or ex vivo and to then re-inject them into the body of the individual.
  • This methodology was notably developed in the immunotherapeutic treatment of cancer.
  • the subject of the invention is finally the use of the peptides of interest as a reagent for the diagnosis of HIV infection, making it possible in particular to identify subjects more resistant to infection also called “Long term non progressor” or conversely, to identify infected subjects more likely to develop AIDS quickly.
  • new conformational epitopes of the HIV envelope have been defined.
  • peptides can therefore be used, for diagnostic purposes, to preferentially search for neutralizing antibodies to primary isolates of HIV, which very often recognize conformational epitopes and thus make it possible to distinguish individuals "Long term non progressor” (possessing antibodies neutralizers) of those who are likely to progress quickly to AIDS if no treatment, in particular anti-viral, is put in place quickly (not having neutralizing antibodies).
  • the present invention therefore also relates to a method of diagnosing HIV infection and / or of the susceptibility of infected subjects to develop AIDS quickly, the said method being preferably based on the analysis of the humoral response.
  • immunoenzymatic, radioimmunological or western blotting methods well known to those skilled in the art may be used, such as, for example, the ELISA, RIA, RIPA or IRMA methods.
  • Figures 1 to 5 show, depending on their dilution, the phage binding curves expressing respectively the peptide sequences SEQ ID NO: 1;
  • SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NAME 1 to a recombinant antibody specific for Ggp 160 and derived from the combinatorial library of antibodies made from lymphocytes d 'a subject "long term non progressor" (B) and an IgG antibody not specific for HIV envelope antigen (•), these two antibodies being previously fixed on ELISA plates.
  • the intensity of the fixation is proportional to the value of the optical density (OD) obtained by ELISA.
  • sequences coding for the heavy and light chain parts of the selected Fab molecules can be isolated and synthesized, and cloned in any vector or replicon allowing their expression.
  • Any suitable expression system can be used, for example bacteria, yeasts, insect, amphibian and mammalian cells.
  • Expression systems in the bacteria include those described in Chang et al. (1978) Nature 275: 615, Goeddel et al. (1979) Nature 281: 544, Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057, EP-A-36,776, US-A-4,551, 433, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25, and Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269.
  • the expression systems in yeasts include those described in Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163, Kurtz et al.
  • heterologous genes in insects can be carried out as described in US-A-4,745,051, EP-A-127,839 and EP-A-155,476, Vlak et al.
  • Biochem. 102 255, US-A-4,767,704, 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; US patent
  • Peripheral blood lymphocytes from a subject infected with the HIV virus and belonging to the group of "long-term non progressors" are used to produce the combinatorial library of antibodies.
  • the lymphocyte cDNA is obtained from RNA using a methodology developed by Sodoyer R. et al. (1997) Human Antibodies 8: 37.
  • the library of heavy and light chains is constructed using the phagemids pVH (pM 831) and pVL (pM452). The two libraries are then associated in a "Random" fashion by sub-cloning of the VL genes in the heavy chain library.
  • the phagemid library obtained is then infected with the phage helper M13 VCS, thus allowing the expression of Fabs on the surface of the phages.
  • the nucleotide sequence of the recombinant Fabs expressed by the positive isolates and in particular the CDR3 sequences carried by the fragments of heavy and light chains is determined.
  • One of the recombinant antibodies specific for Gp 160 originating from this combinatorial library is then used to select the peptide sequences SEQ NOM to SEQ NOM 1 from a commercially available phage library expressing peptides randomly (pHD7, NEB). operating as follows: 1, 4 10 11 phages are incubated with 30 or 300 ng of the recombinant antibody according to example 1 in 200 ⁇ l of PBS-0.1% tween 20 for 20 min at 20 ° C. The mixture is transferred to a tube containing 50 ⁇ l of protein G coupled to sepharose beads previously balanced for 1 hour in 1 ml of PBS-0.1% tween 20 containing 5% skimmed milk. After a further 20 min incubation, the beads are centrifuged and washed 3 times with 1 ml of PBS-0.1% tween 20.
  • Au a commercially available phage library expressing peptides randomly
  • the beads are times with PBS-0.1% tween 20 containing 5% skimmed milk, incubated 10 min, centrifuged and rinsed again three times with PBS
  • the culture volume was made up to 100 ml with LB medium, and the incubation was continued for 4 h at 37 ° C.
  • the phages are precipitated by adding 25 ml of PEG 20% -NaCI 2.5M in the culture supernatant overnight at 4 ° C. After centrifugation (10,000 rpm, 20 min, 4 ° C), the phage residue is taken up in 1 ml of PBS-0.1% tween 20-1% skimmed milk, and titrated. Screening is complete when the whole process has been repeated 3 to 4 times.
  • phages expressing peptide sequences 1 to 11 they were also tested by ELISA as follows: 0.2 mg of recombinant antibody specific for Gp 160 or of an antibody which does not have specificity for an antigen of the envelope of HIV called "control Ig", diluted in 50 ⁇ l of PBS, is deposited in each well of an ELISA plate followed by an incubation overnight at 4 ° C.
  • the various dilutions made are distributed in the wells sensitized either by the specific recombinant antibody according to Example 1, or by the control Ig.
  • the phages are removed by aspiration of the dilutions then the wells washed 10 times with 0.2 ml of PBST.
  • the intensity of coloration of the OPD solution is then measured with a spectrophotometer, then the OD curves (optical density) are established as a function of the dilution of phages.
  • the curves in FIGS. 1 to 5 show, by way of example, that the phages expressing the peptide sequences, SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 11 bind well to the specific recombinant antibody (OD> 0.6 observed for at least one dilution of phages) while there is no significant fixation on the control Ig (OD ⁇ 0.3 whatever the dilution of phages tested in the dilution range going from 5 10 11 phages / well at 4.8 10 8 phages / well).
  • the positive phages ie those which bind specifically to the specific recombinant antibody, are amplified in E. Coli.
  • Mini phage DNA preparations are carried out according to the procedures described in the works of Maniatis, the DNA is sequenced using an automatic sequencer from which the sequence of the peptide expressed by the phage is deduced.
  • the ⁇ amino function of the amino acids is protected by the introduction of a t-butyloxycarbonyl (t-boc) group, thus allowing coupling, by the carboxylic function of the amino acid, to an active chloromethylee resin.
  • the amino function is "deprotected” by the action of trifluoroacetic acid followed by a neutralization step with triethylamine.
  • the amino function thus released then undergoes a coupling reaction with another amino acid in the form of a t-boc derivative via carbodiimides.
  • This process is implemented by the ABI automaton (Applied Biosystem Inc) 430A which thus performs the automatic synthesis of peptides.
  • the peptide is detached from the resin by the action of hydrofluoric acid.
  • the extract is then purified by reverse phase HPLC using a Vydac C4 type semi-preparative column and an acetonitrile gradient ranging from 15 to 55% in a 0.1% trifuoroacetic acid solution.
  • Liquid chromatography is programmed for a period of 40 min with a flow rate of 2 ml / min. The purity of the peptides is controlled by analytical chromatography and exceeds 95%.
  • the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 6, displayed on phage are injected into guinea pigs and rabbits: two injections of 100 microliters intravenously, 3 weeks apart followed by a final bleeding 15 days after the 2 ee injection.
  • the sera are tested in ELISA against gp160 and a reaction against the glycoprotein is observed. These peptides are therefore capable of inducing a response against gp160. 2) Induction of antibodies in mice
  • the various phage isolates expressing the peptides defined by SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NOM 1 are purified on a cesium chloride gradient. 5 groups of BaLB / c mice are then identified. Each group is immunized intraperitoneally, 3 times at 3 week intervals with a single type of purified isolate expressing either SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NOM0 or SEQ ID NOM 1 at the rate of 10 12 phages purified by injection.
  • mice To compare the antibody responses, we introduced 2 additional groups of mice, the first group receiving 3 injections of 10 12 phages expressing peptides not mimicking conformational epitopes of the HIV envelope (irrelevant phages), the second receiving 3 injections of 5 ⁇ g of Gp160 protein.
  • mice in this group as well as some of the mouse group immunized with the unrelated phages received 4th injection of 5 mcg Gp 160, 3 weeks after the 3 rd injection.
  • the analysis of the specific antibody response is carried out on the serum of the mice of each group taken 15 days after each injection. Analysis of the specific antibody response includes the detection of anti gp 160 antibodies by ELISA using plates sensitized with the Gp 160 protein using a procedure similar to that described in example 1 and the search for antibodies. neutralizers. For the search for neutralizing antibodies, the dilution of serum is determined which prevents the formation of syncytia in 50% of the microwells infected with
  • 10 CCID50 of a strain of HIV virus After decomplementation of the sera and production of a dilution range of reason 2 in RPMI medium, 500 ⁇ l of the suspension of HIV virus titrating 10 2.5 CCID 50 / ml is mixed with 500 ⁇ l of the various dilutions of sera. After an incubation of 2 hours at 37 ° C, the mixture is deposited in a volume of 100 ⁇ l on CEMss cells previously fixed in microwells (6 microwells / dilution of serum). After 1 hour of contact at 37 ° C. with the CEMss cells, the mixture is aspirated and replaced with culture medium.
  • Water-in-oil emulsions are then prepared using squalene as a constituent of the organic phase, tween 80 or a mixture of tween 80 and SPAN as a surfactant, the aqueous phase containing the peptide solution.
  • a vaccine formulation based on liposomes comprising a peptide having one of the sequences SEQ ID NOM to SEQ ID NO: 11 described in the example
  • a vaccine formulation based on ISCOMs is prepared containing a peptide having one of the sequences SEQ ID NOM to SEQ ID NOM 1 described in Example 1 and produced by chemical synthesis according to Example 2 with reference to B Morein et al, 1984, Nature 308: 457 or B Morein et al Immunoiogy toDay, 1987, 8 (11): 333.
  • a formulation based on micro particles comprising a peptide having one of the sequences SEQ ID NOM to SEQ ID NOM 1 described in the example
  • micro particles or nanoparticles many synthetic or natural polymers are used such as the polymer of methyl metacrylate (Troster SD et al, 1992, J. Microencaps. 9:19) but often poly (d, 1 -lactide- co-glycolide) also called PLGA is the referent because of its biodegradability, its safety and its applications already old in the medical field.
  • the PLGA micro particles loaded with peptides are prepared in particular by double water-in-oil-in-water emulsion.
  • the peptide is dissolved in the aqueous phase and then emulsified in a solution of PLGA in the organic phase such as dichloromethane.
  • a solution of PLGA in the organic phase such as dichloromethane.
  • the water in oil emulsion is obtained by high speed stirring of the peptide solution in the organic solution of PLGA.
  • a second aqueous phase containing an appropriate concentration of surfactant such as polyvinyl alcohol is added to the first emulsion to thereby produce the double emulsion.
  • surfactants are also used such as bile salts or poly (oxyethylene glycerol monoleate) to stabilize the double emulsion (Rafati H et al., 1997, Vaccine 15: 1888).
  • This formulation is used for the preparation of a vaccine composition intended for the prevention or treatment of HIV virus infection.
  • Example 8 Vaccine composition
  • Peptides with fewer than 20 amino acids can be weakly immunogenic.
  • a vaccine formulation is prepared based on polymers of the same peptide or different peptides, in the form of octamers comprising a branched poly-lysine structure with 8 lateral arms on which the same peptide or different peptides are fixed according to Example 1 by implementing the method developed by Posnett DN et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 1719.
  • This formulation is used for the preparation of a vaccine composition for the prevention or treatment of HIV virus infection.
  • Example 9 Vaccine composition
  • a vaccine composition comprising a peptide having one of the sequences SEQ ID NAME, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 described in Example 1 and produced by chemical synthesis according to Example 2, according to Example 2 framed by the 2 T helper P24E and T epitopes of the HIV virus, these 2 epitopes playing the role of carrier molecule and thus strengthening the immunogenicity of the peptide.
  • the coupling reaction of the peptide with these 2 T helper epitopes is carried out in 2 stages according to conventional methods well known to those skilled in the art.
  • the N-terminal part of the peptide is coupled with the C-terminal part of the peptide sequence representing the p24E epitope by intercalating a space consisting of the glycine-praline-glycine sequence.
  • the terminal C part of the intermediate product is coupled with the N terminal part of the peptide sequence representing the T1 epitope by intercalating the same glycine-proline-glycine sequence to obtain the final product.
  • This formulation is used for the preparation of a vaccine composition intended for the prevention or treatment of HIV virus infection.
  • Example 10 Vaccine composition comprising a lipopeptide
  • a vaccine formulation comprising a peptide having one of the sequences SEQ ID NOM to SEQ ID NOM 1 described in Example 1 and produced by chemical synthesis according to Example 2 coupled to one or more chains derived from fatty acids, including N ⁇ palmitoyl-lysine, N, N-dipalmitoyl-lysine, pimelautide, trimexautide or to a steroid group, including N ⁇ [(cholest-5-enyl-3-oxy) -acetyl)] - iysine or (cholest-5-enyl-3-oxy) acetic acid according to the process described in patent EP0491628 (INSERM) so as to obtain a lipopeptide.
  • This formulation is used for the preparation of a vaccine composition intended for the prevention or treatment of HIV virus infection.
  • a vaccine composition comprising a recombinant poxvirus encoding a peptide having one of the sequences SEQ ID NOM to SEQ ID NOM 1 described in Example 1 mimicking a conformational epitope of the envelope of HIV.
  • Recombinant poxviruses are obtained by homologous recombination from embryonic chicken cells infected with poxviruses and co-transfected with plasmids containing an expression cassette, flanked at the ends of DNA sequences homologous to those of nonessential regions of l Poxvirus DNA, and containing, under the dependence of poxvirus promoters (H6, 13L), the poly nucleotide which codes for the peptide according to Example 2 using the methods described in US Patents 4,769,330, 4,772,848, 4,603,112, 5,100,587 ,
  • a vaccine composition comprising a recombinant poxvirus encoding several peptides having one of the sequences SEQ ID NOM to SEQ ID NOM 1 described in Example 1 mimicking several conformational epitopes of the envelope of HIV.
  • the use and preparation of recombinant vectors coding for several epitopes is well known to those skilled in the art (Toes RE et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14660, Thomson SA et al. (1996) J. Immunol. 157: 822) and is also applicable to the preparation of recombinant poxviruses encoding multiple mimotopes.
  • a vaccine composition comprising a recombinant canaripox (recombinant ALVAC) encoding multiple mimotopes of the HIV envelope.
  • recombinant poxviruses are used for the preparation of a vaccine composition intended for the prevention or treatment of HIV virus infection.
  • a vaccine composition comprising several peptides having one of the sequences SEQ ID NOM to SEQ ID NOM 1 described in example 1 using the different preparation methods described in examples 2 to 12 mimicking several conformational epitopes of the envelope of HIV. These different compositions are used for the preparation of a vaccine composition intended for the prevention or treatment of HIV virus infection.
  • HIV specific antibody detection is carried out by ELISA using one or more peptides having one of the sequences SEQ ID NOM to SEQ ID NOM 1 described in Example 1 and produced by chemical synthesis according to Example 2 for the diagnosis of HIV infection from a biological sample
  • a sample of physiological fluid blood, plasma, serum
  • a sample which is then reacted in the presence of a peptide according to the invention is taken, a sample which is then reacted in the presence of a peptide according to the invention.
  • the peptide itself is used as a diagnostic reagent.
  • an indirect diagnostic test of the ELISA type, in which the peptide fixed on a support (well) is placed in the presence of the sample to be tested, while the revelation of the antigen-antibody binding is ensured by a labeled anti-Ig, either by a competition or displacement test, in which a peptide according to the invention is used, and a labeled antibody specific for the peptide.
  • the peptide is there also fixed to a solid support such as well, strips.
  • the competition test the peptide is placed simultaneously in the presence of the sample
  • sample antibody and a labeled antibody specific for the peptide.
  • Antibodies labeled with peroxidase are generally used.
  • monoclonal and polyclonal antibodies or recombinant antibodies specific for the peptide according to the invention are generally used, which are sometimes Fab or F (ab) 2 fragments and in particular those described in the invention.
  • HIV specific antibody detection is implemented by immunochromatography using one or more peptides according to the invention for the diagnosis of HIV infection from a biological sample
  • the peptide according to the invention is fixed on a strip-type support and reference is made to the article by Robert FN Zurk et al., Clin. Chem. 7/31, 1144-1150 (1985) and in patents or patent applications WO-A-88/08 534, WO-A-
  • EP-A-291 176 91/12528, EP-A-291 176, EP-A-299428, EP-A-291 194, EP-A-284 232, US-A-5 120 643, US-A-5 030 558, US-A -5 266 497, US-A-4 740 468, US-A-5 266 497, US-A-4 855 240, US-A-5 451 504, US-A-5 141 850, US-A-5 232 835 and US-A-5 238 652 for implementing the method.
  • the patient's blood is collected on a heparin tube.
  • the lymphocytes are then separated by centrifugation on hypaque Ficoll and then distributed in 96-well sterile microplates at the rate of 2 ⁇ 10 5 cells per round-bottom well under a final volume of 200 ⁇ l of complete culture medium (RPMI 1640 supplemented with 25 mM HEPES, 2 mM L -glutamine, 50U / ml of penicillin, 50 ⁇ g / ml of streptomycin and 5% serum AB decomplemented) and placed in the presence of variable concentrations of one or more peptides having one of the sequences SEQ ID NOM to SEQ ID NOM 1 described in Example 1 and produced by chemical synthesis according to Example 2 (concentrations ranging from 1ng / ml to 50 ⁇ g / ml).
  • Each concentration of peptide is tested in triplicate to overcome biological variations as well as possible. Multiple combinations of peptides can also be tested in the indicated concentration range, for example a combination resulting from the association of an envelope mimotope with a nucleocapsid mimotope in the indicated concentration range.
  • 0.5 ⁇ ci of tritiated thymidine is added to each well.
  • the cellular DNA is collected from each culture well on filters after precipitation with ethanol and the incorporation rate of tritiated thymidine is measured using a liquid scintillation counter. which reflects the intensity of the lymphoproliferative response.
  • the results are expressed in the form of stimulation index (average of the cpm of the lymphocyte culture wells containing a given concentration of peptide / average of the cpm of the lymphocyte culture wells without peptide).
  • the lymphoproliferative response is considered positive when the stimulation index is greater than 3.

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Abstract

Peptide pour le traitement thérapeutique ou prophylactique de l'infection à HIV, capable de réagir avec un anticorps spécifique de l'enveloppe du virus HIV et provenant d'un patient HIV positif appartenant au groupe des "long term non progressor", comprenant une séquence en acides aminés qui mime un épitope conformationnel d'un antigène de l'enveloppe dudit virus sans toutefois correspondre à une séquence continue d'acides aminés de cet antigène et pouvant contenir au choix l'une des 11 séquences en acides aminés telles que spécifiées dans l'invention. Conjugué du peptide selon l'invention résultant de l'association du peptide à une molécule porteuse pour renforcer l'immunogénicité dudit peptide. Vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression fonctionnelle permettant l'expression d'un poly nucléotide codant pour un peptide selon l'invention. Composition thérapeutique ou prophylactique de l'infection à HIV, notamment destiné à un usage vaccinal, dont le principe comprend un peptide selon l'invention, le cas échéant un conjugué de ce peptide et/ou un vecteur recombinant codant pour ledit peptide. Utilisation d'un peptide selon l'invention en tant que réactif pour le diagnostic de l'infection à HIV et/ou de la susceptibilité des sujets en contact avec le virus à développer rapidement un SIDA.

Description

Mimotopes du Virus HIV
Objet de l'invention
La présente invention se rapporte au traitement et à la prévention du virus HIV et notamment à tout peptide mimant de nouveaux épitopes conformationnels d'antigènes de l'enveloppe du virus HIV et à tout polynucléotide intégré dans un vecteur permettant l'expression desdit peptides et leur utilisation à des fins thérapeutiques, prophylactiques, notamment vaccinales, et/ou diagnostiques.
Domaine de l'invention
Le HIV est un virus enveloppé à ARN et représente l'agent étiologique du syndrome d'immunodéficience acquise ou SIDA, dont l'issue est fatale à terme, caractérisé par une destruction progressive du système immunitaire et le développement concomittant d'infections micro biologiques mettant souvent en cause des germes opportunistes.
La majorité des individus développent un syndrome d'immunodéficience acquise dans les 10 années qui suivent la contamination. En effet, les réactions immunitaires en réponse à l'infection sont très souvent inadaptées et notamment celles qui sont dirigées contre les protéines d'enveloppe en raison même de la très grande variabilité du virus résultant de sa grande capacité à se multiplier, à muter et à se recombiner ( Bangham C.R.M et al 1997 Lancet 350:1617-1621). La très grande variabilité du virus HIV permet d'échapper au contrôle par le système immunitaire et favorise ainsi la dissémination du virus. Cependant, des études épidémiologiques récentes ont montré que certaines personnes infectées pouvaient contenir leur infection, sans manifestations cliniques apparentes et sans signes biologiques d'immunosuppression pendant des périodes de temps supérieures à.10 années ( Pilgrim A.K et al., 1997, J. Infect. Dis. 176: 924-932). Le sérum de ces personnes encore appelées "long-term non progressors" révèle la présence d'anticorps neutralisants contre des isolats primaires de virus HIV ( Piigrim A.K et al., 1997, J. Infect. Dis. 176: 924-932).
L'enveloppe du virus HIV, issue du produit d'expression du gène Env (gène de l'enveloppe), est synthétisée tout d'abord sous la forme d'une glycoprotéine Gp160 qui se clive ensuite en deux glycoprotéines Gp 120 et Gp 41. On retrouve ces 3 protéines à la surface des cellules infectées par le HIV. De plus, la Gp 160 et la Gp 120 possèdent une affinité pour la molécule CD4 présente à la surface de certains lymphocytes T, molécule CD4 qui sert de porte d'entrée du virus HIV vers l'intérieur de la cellule. Jusqu'à présent, très peu d'épitopes accessibles au système immunitaire ont été décrits sur l'enveloppe du virus HIV (Burton D.R , 1997 Proc.Natl. Acad. Sci. USA 94: 10018-10023).
II existe donc un besoin dans la caractérisation de nouveaux épitopes de l'enveloppe du HIV.
Il existe aussi un besoin à identifier des épitopes de l'enveloppe qui soient inducteurs d'anticorps neutralisants, ou en d'autres termes qui soient capables de réduire ou de supprimer la dissémination virale.
Il existe également un besoin d'identifier une composition pharmaceutique permettant de traiter efficacement ou de prévenir l'infection à virus HIV.
Enfin il existe aussi un besoin de développer des réactifs rentrant notamment dans la composition de kits immunologiques qui permettent de distinguer notamment parmi les personnes infectées celles qui sont le plus résistantes à l'infection ou "long-term non progressor" et de tester, par exemple l'efficacité de nouveaux vaccins par leur capacité à induire des anticorps neutralisants.
Résumé de l'invention
La présente invention vise à pallier ces besoins en identifiant de nouvelles structures peptidiques pour le traitement thérapeutique ou prophylactique de l'infection à virus HIV à partir de l'utilisation d'une banque combinatoire d'anticorps provenant de patients HIV positif et appartenant au groupe des "long term non progressor". A cet effet, l'invention concerne toute structure peptidique capable de réagir avec un anticorps spécifique d'un antigène de l'enveloppe du HIV provenant, par exemple, d'un banque combinatoire d'anticorps obtenu à partir de lymphocytes de patients HIV positif et appartenant au groupe des "long term non progressor", comprenant une séquence en acides aminés qui mime un épitope conformationnel de l'enveloppe dudit virus sans toutefois correspondre à une séquence continue d'acides aminés de cet antigène.
La sélection de mimotopes au moyen d'anticorps recombinants provenant de patients HIV positif et appartenant au groupe des "long term non progressor" présente l'avantage d'identifier de nouveaux épitopes inducteurs d'anticorps neutralisants qui soient efficaces dans la protection contre des isolats primaires de virus HIV
La présente invention concerne également tout vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression fonctionnelle permettant l'expression d'un polynucléotide codant pour un peptide répondant aux critères définis ci dessus.
La présente invention concerne aussi une composition thérapeutique ou prophylactique du virus HIV, notamment destiné à un usage vaccinal, dont le principe actif comprend un peptide répondant aux critères définis ci dessus et/ou un vecteur recombinant codant pour ledit peptide.
Enfin la présente invention concerne aussi
- l'utilisation d'un peptide répondant aux critères définis ci dessus en tant que réactif pour le diagnostic du virus HIV permettant notamment d'identifier les sujets en contact avec le virus plus résistants à l'infection, ledit diagnostic comprenant l'évaluation, à partir d'un échantillon de sang, de la réponse humorale et/ou à médiation cellulaire spécifique de ce peptide.
- l'utilisation d'un peptide répondant aux critères définis ci dessus et/ou d'un vecteur recombinant codant pour ledit peptide pour la préparation d'une composition thérapeutique ou prophylactique destinée au traitement ou a la prévention de l'infection par le virus HIV.
Description de l'invention
Dans le contexte de la présente invention, différents termes employés sont ci-après définis:
"Par peptide" on entend une séquence d'au moins 6 acides aminés liés entre eux par une liaison peptidique obtenu par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique, de préférence entre 6 et 100 acides aminés et notamment entre 20 et 80 acides aminés.
"Par antigène de l'enveloppe du HIV on entend toute entité moléculaire qui se lie à un anticorps spécifique de tout produit issu du gène env, comprenant notamment la gp 160 sous forme naturelle ou recombinante, ses dérivés constitués par la gp41 et la gp 120 pouvant également être sous forme naturelle ou recombinante et les produits issus de la combinaison desdites molécules.
"Par épitope conformationnel" on entend une structure tridimensionnelle qui permet son positionnement dans le site de liaison spécifique d'un anticorps, à la façon d'une clef dans une serrure, et qui est représentée par une séquence d'acides aminés qui ne correspond pas à une séquence continue en acides aminées de la protéine contre laquelle est dirigé cet anticorps. De préférence, cette séquence en acides aminés de l'épitope conformationnel n'est pas homologue à une séquence continue en acides aminés de la protéine naturelle ou recombinante, l'homologie étant définie par la combinaison de deux critères:
- le critère d'identité des acides aminés déterminé par le rapport entre le nombre d'acides aminés d'un peptide selon l'invention qui sont identiques à ceux d'une séquence de même taille portée par la protéine naturelle ou recombinante, et le nombre total d'acides aminés dudit peptide. De préférence l'identité en acides aminés ne dépassera pas de préférence 50%, voire 60% ou 70% ou 80% ou même 90%. - Le critère d'enchaînement déterminé par le rapport entre le nombre d'acides aminés d'un peptide selon l'invention qui sont à la fois identiques et se trouvent à la même position d'enchaînement que ceux d'une séquence de même taille portée par la protéine naturelle ou recombinante, et le nombre total d'acides aminés dudit peptide. De préférence l'identité d'enchaînement ne dépassera pas 70 à 80%.
" Par long term non progressor" on entend des sujets HIV positifs caractérisés sur le plan clinique, en ce qu'ils ne développent de SIDA depuis qu'ils sont contaminés avec un recul d'au moins dix années, sur le plan biologique, en ce qu'ils ne montrent pas de signes d'immunosuppression avec notamment un taux de lymphocytes T CD4 supérieurs à 600/mm3 et enfin ne recevant pas de traitement antiviral particulier.
"Par mimotope" on entend un épitope qui mime la structure tridimensionnelle d'un autre épitope en se fixant sur le site de liaison spécifique du même anticorps
"Par CDR3" on entend la région hypervariable d'enchaînement en acides aminés de la chaîne lourde et légère des immunoglobulines et qui se situe au niveau du site d'interaction spécifique avec l'épitope.
"Par conjugué" on entend l'association du peptide tel que défini dans l'invention à toute autre molécule, par des procédés physiques ou chimiques, ayant pour vocation d'induire ou de renforcer l'immunogénicité du peptide de départ.
"Par immunogénicité" on entend la capacité d'une entité moléculaire, après inoculation à un mammifère, à induire une production d'anticorps spécifiquement dirigé contre cette entité.
"Par polynucléotide" on entend soit une séquence d'ARN, soit une séquence d'ADN, soit une séquence d'ADNc résultant de la transcription inverse d'une séquence d'origine naturelle ou de synthèse, avec ou sans bases modifiées.
"Par voie muqueuse", on entend un mode d'administration qui met en contact directement la composition pharmaceutique avec les différents types de muqueuses de l'organisme.
"Par voie parentérale", on entend un mode d'administration qui met directement en contact la composition pharmaceutique avec les tissus ou organes interne de l'organisme.
L'invention vise donc tout peptide qui mime un épitope conformationnel d'un antigène de l'enveloppe du HIV et qui est reconnu par un anticorps obtenu à partir d'un patient "long term non progressor" et spécifique de cet antigène. Un peptide selon l'invention peut être représenté avantageusement par l'une des 11 séquences telle que suit
SEQ ID NO : 1 Phe Asn Leu Thr His Phe Leu SEQ ID NO : 2 Glu Gly Trp His Ala His Thr
SEQ ID NO : 3 Lys Leu Asn Trp Met Phe Thr
SEQ ID NO : 4 Ser Thr Asn Trp Met Phe Thr
SEQ ID NO : 5 Ala Met Pro Leu Pro Tyr Thr Phe
SEQ ID NO : 6 Asp Ser His Thr Pro Gin Arg SEQ ID NO : 7 Val Ser Phe Thr Pro Ser Phe SEQ ID NO : 8 His Ala Ala Leu Ser Met Asn Thr His Ala Leu Met
SEQ ID NO : 9 Ala Trp His Glu Ser Arg Ala
SEQ ID NO : 10 Phe Lys Thr Ala Tyr Pro Thr
SEQ ID NO : 11 Ser His Ala Leu Pro Leu Thr Trp Ser Thr Ala Ala
A partir d'une banque combinatoire d'anticorps obtenue notamment à partir du sang périphérique d'un sujet ayant été infecté par le virus HIV et appartenant au groupe des "long-term non progressors", caractérisé en ce que ledit sujet appartenant à ce groupe est asymptomatique sur le plan clinique depuis au moins 10 ans et ne montre pas de signes biologiques d'immunosuppression avec notamment un taux de lymphocytes T CD4 supérieur à 600/mm3, et d'une librairie synthétique de peptides, on peut identifier, par le biais de mimotopes, de nouveaux épitopes conformationnels présents sur l'enveloppe du HIV, notamment des épitopes qui peuvent se situer en dehors de la boucle V3, comme par exemple des épitopes se situant dans la région du site de liaison au récepteur CD4 , des épitopes chevauchant la boucle V2 et le site de liaison au récepteur CD4 ou même des épitopes chevauchant les régions C2, C3 et V4 de la Gp120 ou des épitopes se situant dans les régions non immunodominantes de la Gp 41 (clusters I et II).
L'identification de ces mimotopes nécessite pour leur mise en œuvre un processus technologique sophistiqué, à savoir:
-la constitution d'une librairie combinatoire d'anticorps suffisamment complexe pour refléter au mieux le répertoire naturel en anticorps d'un individu, et de façon avantageuse le répertoire en anticorps d'un individu infecté par le HIV et appartenant au groupe des "long-term non progressors";
-la sélection au sein de cette banque, d'anticorps recombinants spécifiques d'antigènes de l'enveloppe du HIV, notamment exprimés par la Gp160, la Gp120, la Gp41 pouvant être sous forme de protéines naturelles ou recombinantes, glycosylées ou déglycosylées, monomériques ou multimériques ou enfin combinées entre elles ou non. La sélection des anticorps recombinants spécifiques comprend de façon préférentielle une étape supplémentaire consistant en la mesure de l'activité neutralisante de ces anticorps recombinants vis à vis de l'infection virale médiée notamment par un ou plusieurs isolats primaires du virus HIV. On retiendra de façon préférentielle les anticorps recombinants spécifiques et neutralisants de plusieurs isolats primaires du virus HIV.
-la sélection de peptides spécifiques des anticorps recombinants, à partir d'une librairie synthétique aléatoire de peptides obtenue par recombinaison moléculaire, la dite sélection pouvant se faire par ELISA ;
-la caractérisation de ces peptides comme étant des mimotopes d'épitopes conformationnels du HIV en ce qu'il n'y a pas de correspondance entre la séquence en acides aminés dudit peptide avec une quelconque séquence continue en acides aminés retrouvée dans les protéines de l'enveloppe du HIV d'une part et d'autre part en ce que ce peptide est capable d'inhiber l'interaction de l'anticorps recombinant avec le produit du gène env qui à servi à la sélection dudit anticorps recombinant.
On peut également procéder à la transformation des lymphocytes provenant d'un patient "long term non progressor" en utilisant, par exemple le virus d'Epstein
Barr (EBV) pour la sélection de nouveaux anticorps monoclonaux spécifiques de l'enveloppe du HIV. Le procédé de transformation lymphocytaire est bien connu de l'homme de métier et aboutit, après plusieurs cycles de sélection contre l'antigène d'intérêt à l'obtention des clones lymphocytaires transformés et immortels, chaque clone produisant un seul type d'anticorps monoclonal. Ces anticorps monoclonaux, comme les anticorps recombinants issus de la banque combinatoire peuvent être également testés pour leur activité neutralisante contre différents isolats primaires du HIV avant d'être utilisés pour la sélection de peptides mimotopes de l'enveloppe du HIV.
Pour induire ou plutôt renforcer l'immunogénicité du peptide mimant un épitope conformationnel du HIV, la présente invention a également pour objet des peptides comprenant une répétition (2 ou plus) du peptide conforme à l'invention. Notamment, l'accouplement des deux peptides identiques peut se faire au besoin par le biais d'un bras espaceur intercalaire constituée par l'enchaînement en acides aminés Gly Pro Gly.
L'invention concerne également une combinaison de différents peptides conformes à l'invention, ainsi qu'à des peptides comprenant à la fois des répétitions et des combinaisons. Dans de tels cas, les peptides peuvent être joints par des liaisons covalentes ou des liaisons non covalentes. Par exemple, on peut citer avantageusement la méthode développée par Posnett et al ( J. Biol. Chem. (1988) 263: 1719) qui n'altère pas la structure tridimensionnelle de l'épitope ou des épitopes porté par le peptide et aboutit à la formation de multimères du même peptide ou de peptides différents.
Dans le cadre notamment des préparations antigéniques et des formulations vaccinales qui sont décrites ci-après, on peut aussi préférer conjuguer par liaison covalente les peptides de l'invention à des molécules immunogènes usuellement utilisées pour rendre immunogène les peptides de petite taille.
Les peptides selon l'invention peuvent ainsi être conjugués aux protéines immunogènes connues telles que les sérum albumines, thyroglobuline, ovalbulmine, gélatine, haemocyanine (e.g. Keyhole Limpet Haemocyanin KLH), séroglobulines, anatoxine tétanique, anatoxine diphtérique, protéines de membranes externes de bactéries, etc, mais on peut aussi préférer conjuguer les peptides à des épitopes 'T helper" parmi lesquels on choisit notamment les épitopes "T helper" du HIV , par exemple les épitopes T1 et p24E tels que décrits dans WO 94/29339 (Connaught). Les réactions de conjugaison avec lesdits épitopes "T helper" du HIV nous permettent d'obtenir des composés dont l'enchaînement séquentiel est p24E-GPG- X-GPG-T1 où:
-p24E symbolise la séquence d' acides aminés de l'épitope p24E, ladite séquence étant placée du côté N terminale du peptide selon l'invention; -GPG symbolise l'enchaînement glycine-proline-glycine;
-X symbolise le peptide d'intérêt selon l'invention qui peut-être au besoin le produit de la combinaison de plusieurs séquences d'acides aminés identiques ou différentes conformes à l'invention;
-T1 symbolise la séquence d'acides aminés de l'épitope T1 , ladite séquence étant placée du côté C terminale du peptide selon l'invention;
Parmi ces composés on peut citer les composés comprenant les séquences 12 à 14
SEQ ID NO : 12 Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Gly Pro Gly Lys Leu Asn Trp Met Phe Thr Gly Pro Gly Lys Leu Asn Trp Met Phe Thr Gly Pro Gly lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Glu Lys Ala Met Tyr Ala
SEQ ID NO : 13 Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg
Phe Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Thr Asn Trp Met Phe Thr Gly Pro Gly Ser Thr Asn Trp Met Phe Thr Gly Pro Gly lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Glu Lys Ala Met Tyr Ala
SEQ ID NO : 14 Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg
Phe Tyr Lys Gly Pro Gly Phe Asn Leu Thr His Phe Leu Gly Pro Gly Phe Asn Leu Thr His Phe Leu Gly Pro Gly Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Glu Lys Ala Met Tyr Ala
Ces conjugués peuvent eux-mêmes être greffés sur une ossature ramifiée de lysine de façon à obtenir des polymères desdit conjugués sous une forme ramifiée telle que décrite dans WO 94/29339 (Connaught) le contenu technique dudit brevet étant incorporé par référence dans l'objet de l'invention.
Les techniques de conjugaison sont aussi parfaitement connues de l'homme de l'art. On peut recourir par exemple aux agents hétérobifonctionnels tels que SPDP, carbodiimide, glutaraldéhyde, système biotine/avidine, etc.
On peut aussi coupler les peptides à des lipopolysaccharides, polysaccharides, glycopeptides, analogues du muramyl peptide, acides gras, etc. De préférence, on effectue le couplage d'un peptide avec un acide gras du type palmitoyl-lysine tel que décrit dans EP 491628 (Biovector) ou (Pam)3
Cys-Ser tel que décrit dans EP547681 (Merck), par exemple, le contenu technique desdits brevets étant incorporé par référence dans l'objet de l'invention.
Les méthodes pour lier de manière opérationnelle des peptides individuels par des chaînes latérales portant des résidus d'acide aminé, afin de former un conjugué immunogène, par exemple un polymère polypeptidique ramifié, sont aussi bien connues de l'homme de l'art. Par ces méthodes, on cherche à établir des liaisons sur différentes chaînes latérales par un ou plusieurs types de groupes fonctionnels afin d'obtenir une structure dans laquelle les structures peptidiques sont liées par covalence tout en étant séparées par au moins une chaîne latérale. Comme groupes fonctionnels, on peut citer les groupes aminés epsilon, les groupes bêta- ou gamma-carboxyliques, les groupes thiol (-SH) et les cycles aromatiques (par exemple tyrosine et histidine). Des méthodes pour lier des polypeptides à l'aide de ces groupes fonctionnels sont décrits dans Erlanger (1980 Method of Enzymology, 70 : 85), Aurameas et al., (1978 Scand. J. Immunol., Vol.8, suppl. 7, 7-23) et US-A-4 193 795. En outre, il est également possible de mettre en oeuvre une réaction de couplage dirigée telle que décrite dans Rodwell et al., (1985 Biotech 3, 889-894). Les peptides peuvent également être modifiés pour incorporer des bras d'espacement tels que hexaméthylène diamine ou d'autres molécules bi-fonctionnelles de tailles similaires.
Les peptides peuvent être également formulés avec de l'alum, du monophosphoryl Lipid A, pluronics, SAF1 , Ribi, treha!ose-6,6-dimycolate ou autres composés immunostimulants connus de l'homme de l'art pour accroître l'immunogénicité du peptide auquel ces composés sont liés.
Néanmoins toutes ces méthodes de conjugaison, de modification , de répétition ou de combinaison de peptides conformes à l'invention doivent respecter au mieux la conformation originelle du peptide.
La présente invention a aussi pour objet les fragments d'ADN codant pour les peptides selon l'invention et pouvant être utilisés pour produire les peptides par expression de la séquence d'ADN dans un système d'expression approprié. En tenant compte de la dégénérescence du code, l'homme de l'art est parfaitement à même de déterminer les différentes séquences d'ADN aptes à coder pour les différents peptides conformes à l'invention. Selon un premier aspect de l'invention, le système d'expression est un système d'expression in vitro pour la production des peptides en vue de leur utilisation ultérieure, e.g. comme réactif de diagnostic, comme composant antigénique ou comme composant vaccinal. De tels systèmes ou vecteurs d'expression in vitro sont parfaitement connus de l'homme du métier et l'on peut citer à titre d'exemple les bactéries telles que E. coli, les cellules eucaryotes telles que les levures, notamment S. cerevisiae, le baculovirus, notamment propagé sur cellules d'insectes, etc.
L'invention a donc aussi pour objet une cassette d'expression comprenant un tel fragment d'ADN et des séquences régulatrices permettant l'expression de ce fragment d'ADN dans un système d'expression in vitro approprié.
Selon un deuxième aspect de l'invention le système d'expression est un système d'expression in vivo pour générer chez le patient traité une réaction immunitaire, de préférence protectrice. En d'autres termes, le système d'expression, qui peut être réplicatif ou non réplicatif, va exprimer le peptide in vivo. L'homme du métier a à sa disposition de tels systèmes. A titre d'exemples préférés, on peut citer les plasmides, notamment plasmides nus, e.g. selon WO-A-90 11092, WO-A-93 19813, WO-A-94 21797 et WO- A-95 20660, les poxvirus , tels que le virus de la vaccine et les pox aviaires (fowlpox, pigeonpox, canarypox, etc.), les adénovirus, etc.
L'invention a donc aussi pour objet des cassettes d'expression comprenant un tel fragment d'ADN et les moyens de régulation de l'expression dans le système d'expression choisi. Elle a aussi pour objet le système d'expression ou vecteur d'expression, comprenant une telle cassette d'expression, en particulier plasmide, poxvirus, adénovirus, comme vu ci-dessus.
L'invention enfin a pour objet l'utilisation des phages exprimant le peptide d'intérêt ou une combinaison de phages exprimant les peptides d'intérêt comme réactif de diagnostic, comme composant antigénique ou vaccinal.
L'invention se rapporte également à l'utilisation d'au moins un peptide conforme à l'invention en association ou non avec au moins un vecteur recombinant conforme à l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à guérir d'une affection liée au virus HIV. Une composition selon l'invention peut comprendre des préparations pouvant être sous forme de crèmes, de poudres lyophilisées ou non, de solutions, de suspensions, pour des administrations par voie muqueuse telle que oral, nasal, rectal, génital, cutanée, par exemple. Pour des administrations parentérales telle que intra dermique, sous cutanée, intra musculaire, intra veineuse, intra artériel, intra lymphatique ou intra péritonéale, par exemple, les préparations injectables stériles pourront être selon les cas sous forme de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Outre le ou les principes actifs, conforme à l'objet de l'invention, les préparations pourront contenir des excipients et/ou des agents stabilisants adaptés au mode d'administration.
Les préparations destinées à un usage vaccinal pourront également contenir des adjuvants ou être incorporées dans des systèmes de délivrance compatibles avec un usage en médecine humaine. On peut rapporter notamment l'usage des adjuvants comme l'Alum ( phosphate d'aluminium phosphate ou hydroxyde d'aluminium ou le mélange des deux) incorporé de façon classique dans les vaccins, l'adjuvant incomplet de Freund, le lipide A monophosphorylé (MPL), QS21 , Polyphosphazène, muramyl dipeptide (MDP) ou ses dérivés, l'usage de système de délivrance de l'antigène comme les émulsions (MF59, SAF1, RIBI, SB 62, SB 26 ), les ISCOMS, les liposomes, les microsphères composées de polymères de PLGA de diamètre bien calibré, ou éventuellement les pseudo virions.
Les doses et voies d'administration de ces compositions pharmaceutiques seront déterminées en prenant en compte la nature de la composition, le niveau d'expression du peptide d'intérêt par le vecteur recombinant s'il est inclus dans la préparation, de l'âge, du sexe et du poids de l'individu recevant la préparation. Il sera également tenu compte de l'importance relative de la molécule porteuse dans le conjugué s'il est inclus dans la composition .
Compte tenu de tous ces facteurs qui sont connus et appréciés par l'homme du métier, les doses de peptides administrées pourront atteindre 1 à 5 mg mais plus généralement se situeront entre 5μg et 1 mg par injection, de préférence 50 à 500μg. Le vecteur recombinant codant pour le peptide d'intérêt pourra être administré ou utilisé pour transfecter ou infecter les cellules d'intérêt à une dose minimale de 103'5 unités infectantes (pfu ou plaque forming unit). De façon préférentielle, le vecteur recombinant sera utilisé dans une échelle de dose allant de 104 à 1010 pfu en fonction de l'efficacité d'expression du peptide par ce vecteur et notamment dans une échelle de dose allant de 106 à 109 pfu, par exemple. Lorsque la composition pharmaceutique comprend plusieurs vecteurs recombinants codant pour des peptides d'intérêt différents, il est bien entendu que ces mêmes échelles de doses pourront être appliquées à ces combinaisons. L'homme de l'art pourra se référer aux protocoles et essais cliniques utilisant des préparations à base de vecteurs recombinants, notamment les pox virus recombinants, les adénovirus recombinants, déjà réalisés chez l'homme pour convenir du nombre approprié de pfu que doit renfermer la composition pharmaceutique.
Lorsque la composition pharmaceutique comprend un plasmide contenant le système d'expression du peptide d'intérêt, il sera pris en compte dans le dosage de cette composition le niveau de réponse immune que cette composition est capable d'induire qui doit être au moins égale à celle du. peptide intact ou modifié et/ou du niveau d'expression du peptide induit par le plasmide dans les cellules de l'organisme qui doit approcher le plus possible celui obtenu par les vecteurs recombinants déjà cités. Par exemple, les quantités de plasmides contenus dans les compositions pharmaceutiques pourront se situer dans des échelles allant de 1μg à 100mg, de façon préférentielle entre 0,1 mg à 10mg . L'homme de l'art pourra se référer aux protocoles et essais cliniques déjà réalisés chez l'homme, utilisant des préparations d'ADN plasmidique pour convenir de la dose de plasmide que doit renfermer la composition pharmaceutique. Pour la prévention de l'infection à HIV, la composition pharmaceutique pourra être administrée en une seule fois ou à plusieurs reprises pour atteindre le niveau de réponse désirée comprenant notamment le niveau et la qualité de la réponse anticorps spécifique et/ou à médiation cellulaire spécifique désirée, et caractérisée en ce qu'elle garantie la protection de l'individu vis à vis d' une contamination accidentelle. Pour atteindre cet objectif il pourra être nécessaire, outre la composition de la préparation, la voix d'administration choisie, de respecter les délais impartis entre chaque injection, qui peuvent être de façon préférentielle de 1 mois, 2 mois ou 6 mois et/ou de faire usage de façon combinée ou alternée pendant la durée du protocole médical, notamment vaccinal, de compositions pharmaceutiques différentes se rapportant au peptide, au vecteur recombinant, au plasmide d'intérêt ou même aux phages exprimant le ou les peptides d'intérêt que l'homme de l'art est capable de maîtriser. Il pourra être également nécessaire pour maintenir le niveau de protection de pratiquer des injections de rappel à intervalles réguliers.
Pour le traitement de l'infection liée au HIV, la composition pharmaceutique, notamment vaccinale, pourra être administrée en une seule fois ou à plusieurs reprises et de façon pouvant être très rapprochées, notamment dans des délais inférieurs à une semaine, pour atteindre le niveau de réponse désirée, notamment celui qui permet de constater l'absence du virus HIV dans le sang par le test PCR. Au besoin, la composition pharmaceutique comprenant le peptide, le vecteur, le plasmide d'intérêt.ou même aux phages exprimant le ou les peptides d'intérêt pourra être associé ou utilisé en alternance avec les traitements conventionnels de cette affection, comprenant notamment les mono, bi ou tri thérapie antivirale.
Que ce soit pour la prévention ou le traitement de l'infection à HIV il pourra être également utile de recourir à une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs peptides d'intérêt, le ou les vecteurs recombinants d'intérêt correspondants ainsi que le ou les plasmides d'intérêt ou même les bactériophages exprimant le ou les peptides d'intérêt pour stimuler les cellules du système immunitaire du patient in vitro ou ex vivo et de les ré-injecter ensuite dans l'organisme de l'individu. Cette méthodologie a notamment été développé dans le traitement immunothérapeutique du cancer.
L'invention a pour objet enfin l'utilisation des peptides d'intérêt en tant que réactif pour le diagnostic de l'infection à HIV permettant notamment d'identifier les sujets plus résistants à l'infection encore appelés "Long term non progressor" ou à l'inverse d'identifier les sujets infectés plus susceptibles de développer un SIDA rapidement.. Pour la première fois des nouveaux épitopes conformationels de l'enveloppe du HIV ont été définis.
On peut donc utiliser ces peptides, à des fins diagnostiques, pour rechercher préférentiellement des anticorps neutralisants d'isolats primaires du HIV, qui, très souvent reconnaissent des épitopes conformationnels et permettre ainsi de distinguer les individus "Long term non progressor" ( possédant des anticorps neutralisants) de ceux qui sont susceptibles d'évoluer rapidement vers un SIDA si aucun traitement, notamment anti-viral, n'est mis en place rapidement ( ne possédant pas d'anticorps neutralisants).
La présente invention a donc aussi pour objet une méthode de diagnostique de l'infection à HIV et/ou de susceptibilité des sujets infectés à développer un SIDA rapidement, la dite méthode étant basée préférentiellement sur l'analyse de la réponse humorale. Pour l'analyse de la réponse humorale on pourra utilisée des méthodes immunoenzymatiques, radioimmunologiques, ou de western blotting bien connues de l'homme du métier, comme par exemple les méthodes ELISA, RIA, RIPA ou IRMA.
Description des figures
Les figures 1 à 5 représentent, en fonction de leur dilution, les courbes de fixation des phages exprimant respectivement les séquences peptidiques SEQ ID
NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NOM 1 à un anticorps recombinant spécifique de la Ggp 160 et issu de la librairie combinatoire d'anticorps fabriqué à partir de lymphocytes d'un sujet "long term non progressor" (B) et à un anticorps IgG non spécifique d'antigène d'enveloppe du HIV (•), ces deux anticorps étant préalablement fixés sur des plaques ELISA. L'intensité de la fixation est proportionnelle à la valeur de la densité optique (D.O.) obtenue par ELISA.
La présente invention est décrite plus en détail ci après à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de sélection d'anticorps dirigés contre l'enveloppe du HIV, de sélection de peptides selon l'invention, de synthèse de peptides selon l'invention, d'induction d'anticorps spécifiques de peptides selon l'invention, de compositions vaccinales selon l'invention et d'utilisation de peptides selon l'invention pour le diagnostic de l'infection à HIV. Il va de soi, toutefois que ces exemples sont donnés à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune matière une limitation.
Exemple 1 : Sélection de peptides
La fabrication d'anticorps recombinants utilisant des méthodes de biologie moléculaire se sont largement développées depuis les dix dernières années et sont maintenant bien connues de l'homme du métier. Il est aussi connu que la spécificité d'un anticorps recombinant est portée essentiellement par les CDR3 des chaînes légères et lourdes . La connaissance de I' enchaînement en acides aminés qui représente le CDR3 et de la structure du squelette des chaînes lourdes et légères d'un anticorps donné est suffisante pour que l'homme de métier puisse reproduire et reconstituer un anticorps recombinant équivalent ayant les mêmes caractéristiques de reconnaissance dudit anticorps.
Les séquences codant pour les parties de chaînes lourdes et légère des molécules Fab sélectionnées peuvent être isolées et synthétisées, et cionées dans tout vecteur ou réplicon permettant leur expression.
Tout système d'expression approprié peut être utilisé, par exemple bactéries, levures, cellules d'insecte, d'amphibien et de mammifère. Les systèmes d'expression dans la bactérie incluent ceux décrits dans Chang et al. (1978) Nature 275 : 615, Goeddel et al. (1979) Nature 281 : 544, Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8 : 4057, EP-A-36,776, US-A-4,551 ,433, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 21-25, and Siebenlist et al. (1980) Cell 20 : 269. Les système d'expression dans les levures incluent ceux décrit dans Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 : 1929, Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153 : 163, Kurtz et al.
(1986) Mol. Cell. Biol. 6 : 142, Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25 : 141 ,
Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132 : 3459, Roggenkamp et al. (1986) Mol.
Gen. Genêt. 202 : 302, Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158 : 1165, De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154 : 737, Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8 :
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91/00357.. L'expression de gènes hétérologues dans les insectes peut être réalisée comme décrit dans US-A-4,745,051 , EP-A-127,839 et EP-A-155,476, Vlak et al.
(1988) J. Gen. Virol. 69 : 765-776, Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42 : 177, Carbonell et al. (1988) Gène 73 : 409, Maeda et al. (1985) Nature 315 : 592-594,
Lebacq-Verheyden et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8 : 3129, Smith et al. (1985) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82 : 8404, Miyajima et al. (1987) Gène 58 : 273, et Martin et al.
(1988) DNA 7 : 99.. De nombreux souches et variants de baculovirus et cellules d'insectes permissives sont décrits dans Luckow et al. (1988) Bio/Technology 6 : 47- 55, Miller et al. (1986) GENERIC ENGINEERING , Setlow, J.K. et al. Eds. Vol. 8,
Plénum Publishing, pp. 277-279, and Maeda et al. (1985) Nature 315 : 592-594..
L'expression en cellules de mammifère peut être réalisée comme décrit dans
Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4 : 761 , Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 79 : 6777, Boshart et al. (1985) Cell 41 : 521 , et US-A-4,399,216. On peut aussi se reporter à Ham et al. (1979) Meth. Enz. 58 : 44, Barnes et al. (1980) Anal.
Biochem. 102 : 255, US-A-4,767,704, 4,657,866 ; 4,927,762 ; 4,560,655 ; brevet US
RE 30,985, WO-A-90/103430 et WO-A-87/00195.
Les lymphocytes du sang périphérique provenant d'un sujet ayant été infecté par le virus HIV et appartenant au groupe des "long-term non progressors", sont utilisés pour produire la librairie combinatoire d'anticorps. L'ADNc des lymphocytes est obtenu à partir de l'ARN en utilisant une méthodologie développée par Sodoyer R. et al. (1997) Human Antibodies 8: 37. La librairie de chaînes lourdes et légères est construite en utilisant les phagemides pVH (pM 831) et pVL (pM452). Les deux librairies sont ensuite associées de façon "Random" par sous clonage des gènes VL dans la librairie de chaînes lourdes. La librairie de phagemides obtenue est ensuite infectée par le phage helper M13 VCS permettant ainsi l'expressi n des Fab à la surface des phages. Après sélection des phages exprimant les Fab à leur surface par "panning" contre la protéine Gp 160, on détermine la séquence nucléotidique des Fab recombinants exprimés par les isolats positifs et notamment les séquences CDR3 portées par les fragments de chaînes lourdes et légères.
Un des anticorps recombinants spécifiques de la Gp 160 provenant de cette banque combinatoire est ensuite utilisé pour sélectionner les séquences peptidiques SEQ NOM à SEQ NOM 1 à partir d'une banque de phages commercialement disponible exprimant des peptides de façon random (pHD7, NEB) en opérant de la façon suivante: 1 ,4 1011 phages sont incubés avec 30 ou 300ng de l'anticorps recombinant selon l'exemple 1 dans 200 μl de PBS-0,1% tween 20 pendant 20 min à 20°C. Le mélange est transféré dans un tube contenant 50μl de protéine G couplée à des billes de sépharose préalablement équilibrées pendant 1 heure dans 1 ml de PBS- 0,1% tween 20 contenant 5% de lait écrémé. Après une nouvelle incubation de 20 min, les billes sont centrifugées et lavées 3 fois par 1ml de PBS-0,1% tween 20. Au
4eme lavage, les billes sont reprises par du PBS-0,1% tween 20 contenant 5% de lait écrémé, incubées 10 min, centrifugées et rincées à nouveau 3 fois par du PBS-
0,1% tween 20. Après la dernière centrifugation les billes sont reprises dans 1 ml de glycine-HCI 0,2 M, pH=2,2, incubées 10min à 20°C et centrifugées. Le surnageant est transféré dans un tube contenant 60 μl de Tris base 2M pH=7,5, de façon à neutraliser la solution puis incubé avec 2 ml de bactéries E. Coli 7118 en phase exponentielle de croissance pendant 15 min. Le volume de la culture a été complété à 100 ml avec du milieu LB, et l'incubation a été poursuivie 4h à 37°C. Après une centrifugation destinée à éliminer les bactéries, les phages sont précipités par addition de 25 ml de PEG 20%-NaCI 2.5M dans le surnageant de culture pendant une nuit à 4°C. Après centrifugation (10 000 rpm, 20 mn, 4°C) le culot de phages est repris dans 1 ml de PBS-0,1% tween 20-1% lait écrémé, et titré. Le criblage est complet lorsque l'ensemble du processus a été répété 3 à 4 fois. Pour compléter la sélection des phages exprimant les séquences peptidiques 1 à 11 on les a également testés par ELISA comme suit: 0,2 mg d'anticorps recombinant spécifique de la Gp 160 ou d'anticorps qui n'a pas de spécificité pour un antigène de l'enveloppe du HIV nommé "témoin Ig", dilués dans 50 μl de PBS, est déposé dans chaque puits d'une plaque ELISA suivi d'une incubation pendant 1 nuit à 4°C. Après remplacement de la solution d'anticorps par 0,1 ml de PBS-0.1% tween 20 (PBST) contenant 5 % de lait écrémé et incubation pendant 1h à 37°C,et réalisation d'une gamme de dilution de raison 2 sur les phages exprimant les séquences peptidiques, SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 en PBST-1% lait écrémé, les différentes dilutions réalisées sont distribués dans les puits sensibilisés soit par l'anticorps recombinant spécifique selon l'exemple 1 , soit par le témoin Ig. Au bout de 2 h à 37°C, les phages sont retirés par aspiration des dilutions puis les puits lavés 10 fois avec 0,2 ml de PBST. Les puits sont ensuite incubés 1h à 37°C avec une solution au 1 M 000 en PBST-1% lait d'un anticorps biotinylé dirigé contre le phage fd (SIGMA). Après une nouvelle série de lavages en PBST-1% lait, un complexe streptavidine-peroxydase (SIGMA) dilué au 1 :2000 en PBST est ajouté dans chaque puits suivi par une incubation d' 1 h à température ambiante et de lavages en PBST-1% lait. L'activité enzymatique de la peroxydase est révélée, classiquement, par addition d'une solution d'OPD diluée à 1mg/ml en tampon citrate de sodium. L'intensité de coloration de la solution d'OPD est ensuite mesurée au spectrophotomètre, puis les courbes de D.O. (densité optique) sont établis en fonction de la dilution de phages. Les courbes des figures 1 à 5 montrent, à titre d'exemple, que les phages exprimant les séquences peptidiques, SEQ ID NO: 7 à SEQ ID NO: 11 se fixent bien sur l'anticorps recombinant spécifique ( D.O. > 0,6 observée pour au moins une dilution de phages) tandis qu'il n'y a pas de fixation significative sur le témoin Ig ( D.O. < 0,3 quelque soit la dilution de phages testée dans la gamme de dilution allant de 5 10 11 phages/puits à 4,8 10 8 phages/puits). Les phages positifs, c'est à dire ceux qui se fixent spécifiquement à l'anticorps recombinant spécifique sont amplifiés dans E. Coli . Des mini préparations d'ADN phagiques sont réalisées selon les procédures décrites dans les ouvrages de Maniatis , l'ADN est séquence à l'aide d'un séquenceur automatique à partir duquel on en déduit la séquence du peptide exprimé par le phage. Exemple 2: Synthèse de peptides
Les peptides des SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 , sont synthétisés en phase solide en se référant aux méthodologies développées dans les ouvrages Solid phase peptide synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford, 1989 et Solid phase peptide synthesis, second édition, publié par Pierce Chemical Company,
1984.
La fonction α aminée des acides aminés est protégée par introduction d'un groupement t-butyloxycarbonyl (t-boc) permettant ainsi un accouplement par la fonction carboxylique de l'acide aminé à une résine chloromethylee active. Après fixation sur la résine, la fonction aminé est "déprotégée" par action de l'acide trifluoroacétique suivi d'une étape de neutralisation par la triethylamine. La fonction aminé ainsi libérée subit ensuite une réaction d'accouplement avec un autre acide aminé sous forme de dérivé t-boc par l'intermédiaire de carbodiimides. Ce procédé est mis en oeuvre par l'automate ABI (Applied Biosystem Inc) 430A qui réalise ainsi la synthèse automatique de peptides. A la fin de la synthèse, le peptide est décroché de la résine par action de l'acide fluorhydrique. L'extrait est ensuite purifié par HPLC en phase réverse en utilisant une colonne semi préparative de type Vydac C4 et un gradient d'acétonitrile allant de 15 à 55% dans une solution d'acide trifuoroacétique à 0,1%. La chromatographie liquide est programmée pour une période de 40 min avec un débit de 2 ml/min. Le taux de pureté des peptides est contrôlé par chromatographie analytique et dépasse 95%.
Exemple 3: Induction d'anticorps spécifiques
1 ) Induction d'anticorps chez les cobayes et lapins
Les peptides des SEQ ID NO : 1 à 6, présentés sur des phages sont injectés à des cobayes et lapins : 2 injections de 100 microlitres par voie intraveineuse, à 3 semaines d'intervalle suivie d'une saignée finale 15 jours après la 2e e injection. Les sérums sont testés en ELISA contre la gp160 et l'on observe une réaction contre la glycoprotéine. Ces peptides sont donc susceptibles d'induire une réponse contre la gp160. 2) Induction d'anticorps chez la souris
Les différents isolats de phages exprimant les peptides définis par les SEQ ID NO:7 à SEQ ID NOM 1 sont purifiés sur gradient de chlorure de césium. On identifie ensuite 5 groupes de souris BaLB/c. Chaque groupe est immunisé par voie intra- péritonéale, 3 fois à 3 semaines d'intervalle avec un seul type d'isolat purifié exprimant soit la SEQ ID NO:7, soit la SEQ ID NO:8 soit la SEQ ID NO:9 soit la SEQ ID NOM0 soit la SEQ ID NOM 1 à raison de 1012 phages purifiés par injection. Pour comparer les réponses anticorps, nous avons introduits 2 groupes de souris supplémentaires, le premier groupe recevant 3 injections de 1012 phages exprimant des peptides ne mimant pas d'épitopes conformationnels de l'enveloppe du HIV (phages irrelevants), le deuxième recevant 3 injections de 5 μg de protéine Gp160. Nous avons aussi introduit un 8eme groupe de souris qui a reçu un mélange d'isolats de phages, comprenant à parties égales des phages exprimant les SEQ ID NO:7,
SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NOM0 et SEQ ID NOM 1. Quelques souris de ce groupe ainsi que quelques souris du groupe immunisé avec les phages irrelevants ont reçu une 4ème injection de 5 μg de Gp 160, 3 semaines après la 3ème injection. L'analyse de la réponse anticorps spécifique est réalisé sur le sérum des souris de chaque groupe prélevés 15 jours après chaque injection. L'analyse de la réponse anticorps spécifique comprend la détection d'anticorps anti gp 160 par ELISA à l'aide de plaques sensibilisées avec la protéine Gp 160 en utilisant une procédure similaire à celle décrite dans l'exemple 1 et la recherche d'anticorps neutralisants. Pour la recherche d'anticorps neutralisants on détermine la dilution de sérum qui empêche la formation de syncytia dans 50% des micropuits infectés par
10 CCID50 d'une souche de virus HIV. Après décomplémentation des sérums et réalisation d'une gamme de dilution de raison 2 en milieu RPMI, on mélange 500μl de la suspension de virus HIV titrant 102,5 CCID50/ml avec 500μl des différentes dilutions de serums. Après une incubation de 2 heures à 37°C, le mélange est déposé sous un volume de 100μl sur des cellules CEMss préalablement fixées dans des micropuits (6 micropuits /dilution de sérum). Après 1 heure de contact à 37°C avec les cellules CEMss, le mélange est aspiré et remplacé par du milieu de culture. Après 7 et 14 jours d'incubation, les cultures sont examinées au microscope pour le dénombrement des syncytia. Le titre neutralisant de 50% est déterminé selon la méthode de Spearman et Kârber. On observe une bonne production d'anticorps chez les souris du 8ème groupe qui a été immunisée avec le mélange d'isolats de phages exprimant les différentes séquences peptidiques (SEQ ID NO:7 à SEQ ID NOM 1)
Exemple 4: formulations vaccinales
Un peptide ayant l'une des séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 décrites dans l'exemple 1 et produit par synthèse chimique selon l'exemple 2 ou obtenu à partir du produit d'expression d'un vecteur recombinant et notamment d'un baculovirus recombinant en utilisant les techniques développées par Smith et al (USA 4,745,051). Des émulsions eau dans huile sont ensuite préparées en utilisant le squalène comme constituant de la phase organique, le tween 80 ou un mélange de tween 80 et de SPAN comme surfactant, la phase aqueuse contenant la solution de peptide. Lorsque l'hydophobicité du peptide est très importante, on procède à la réalisation d' émulsions huile dans eau dans lesquelles le peptide sera associé à la phase organique. Au besoin des immunostimulants comme le QS 21, des dérivés du MPL, ou tout autre adjuvant sont incorporés dans la préparation de ces émulsions. On utilise cette formulation pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention ou au traitement de l'infection à virus HIV.
Exemple 5: Formulations vaccinales
On prépare une formulation vaccinale à base de liposomes comprenant un peptide ayant l'une des .séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NO: 11 décrites dans l'exemple
1 et produit par synthèse chimique selon l'exemple 2 en se référant aux ouvrages tels que " Liposomes as Drug Carriers " édité par G. Gregoriadis, 1988, ou aux volumes 1 à 3 de "Liposome Technology édité par G. Gregoriadis, 1984. On utilise cette formulation pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention ou au traitement de l'infection à virus HIV.
Exemple 6: Formulations vaccinales
On prépare une formulation vaccinale à base d'ISCOMs contenant un peptide ayant l'une des séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 décrites dans l'exemple 1 et produit par synthèse chimique selon l'exemple 2 en se référant à B Morein et al , 1984, Nature 308:457 ou B Morein et al Immunoiogy toDay, 1987, 8(11):333.
Exemple 7: Formulations vaccinales
On prépare une formulation à base de micro particules comprenant un peptide ayant l'une des séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 décrites dans l'exemple
1 et produit par synthèse chimique selon l'exemple 2 mimant un épitope conformationnel de l'enveloppe du HIV. Pour la préparation de micro particules ou de nanoparticules, de nombreux polymères synthétiques ou naturels sont utilisés comme le polymère de methyl métacrylate (Troster S.D. et al, 1992, J. Micro- encaps. 9:19) mais souvent le poly (d, 1-lactide- co-glycolide) encore appelé PLGA est le réfèrent du fait de sa biodégradabilité, de son innocuité et de ses applications déjà ancienne dans le domaine médical. Les micro particules de PLGA chargées en peptides sont préparées notamment par double émulsion eau dans huile dans eau. Le peptide est solubilisé en phase aqueuse puis émulsionné dans une solution de PLGA en phase organique comme le dichlorométhane. L'émulsion eau dans huile est obtenue par agitation à haute vitesse de la solution de peptide dans la solution organique de PLGA. Puis une seconde phase aqueuse contenant une concentration appropriée de surfactant tel que l'alcool polyvinylique est ajoutée à la première émulsion pour réaliser ainsi la double émulsion. D'autres surfactants sont également utilisés comme .les sels biliaires ou le poly (oxyéthylène glycerol monoleate ) pour stabiliser la double émulsion (Rafati H et al., 1997, Vaccine 15: 1888). Après agitation pendant une nuit pour permettre l'évaporation du solvant , les micro particules de PLGA sont lavées plusieurs fois dans l'eau distillée puis lyophilisée et gardées à 5°C. On utilise cette formulation pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention ou au traitement de l'infection à virus HIV.
Exemple 8: Composition vaccinale
Les peptides qui comportent moins de 20 acides aminés peuvent être faiblement immunogéniques . Pour augmenter l' immunogénicité des peptides ayant l'une des séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 décrites dans l'exemple 1 et produit par synthèse chimique selon l'exemple 2, on prépare une formulation vaccinale à base de polymères du même peptide ou de peptides différents, sous forme d'octamères comprenant une structure poly-lysine ramifiée à 8 bras latéraux sur lesquels sont fixés le même peptide ou des peptides différents selon l'exemple 1 en mettant en œuvre le procédé développé par Posnett D.N et al. (1988) J. Biol. Chem. 263 : 1719. On utilise cette formulation pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention ou au traitement de l'infection à virus HIV.
Exemple 9: Composition vaccinale
On réalise une composition vaccinale comprenant un peptide ayant l'une des séquences SEQ ID NOM, SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 décrites dans l'exemple 1 et produit par synthèse chimique selon l'exemple 2, selon l'exemple 2 encadré par les 2 épitopes T helper P24E et T du virus HIV, ces 2 épitopes jouant le rôle de molécule porteuse et renforçant ainsi l'immunogénicité du peptide. La réaction d'accouplement du peptide à ces 2 épitopes T helper se fait en 2 temps selon des procédés classiques bien connus de l'homme de métier. Dans un premier temps on réalise l'accouplement de la partie N terminale du peptide avec la partie C terminale de la séquence peptidique représentant l'épitope p24E en intercalant un espacement constitué de la séquence glycine- praline- glycine. Puis dans un deuxième temps on réalise l'accouplement de la partie C terminale du produit intermédiaire avec la partie N terminale de la séquence peptidique représentant l'épitope T1 en intercalant la même séquence glycine- proline- glycine pour obtenir le produit final. On utilise cette formulation pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention ou au traitement de l'infection à virus HIV.
Exemple 10: Composition vaccinale comprenant un lipopeptide
On prépare une formulation vaccinale comprenant un peptide ayant l'une des séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 décrites dans l'exemple 1 et produit par synthèse chimique selon l'exemple 2 couplé à une ou plusieurs chaînes dérivés d'acides gras parmi lesquels la Nε palmitoyl-lysine, la N,N-dipalmitoyl-lysine, le pimélautide, le trimexautide ou à un groupement stéroïdien parmi lesquels le Nε[(cholest-5-ényl-3-oxy)-acétyl)]-iysine ou l'acide (cholest-5-ényl-3-oxy) acétique selon le procédé décrit dans le brevet EP0491628 (INSERM) de façon à obtenir un lipopeptide. On utilise cette formulation pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention ou au traitement de l'infection à virus HIV.
Exemple 11 : Expression des peptides par des poxvirus
On prépare une composition vaccinale comprenant un poxvirus recombinant codant pour un peptide ayant l'une des séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 décrites dans l'exemple 1 mimant un épitope conformationnel de l'enveloppe du HIV. Les poxvirus recombinants sont obtenus par recombinaison homologue à partir de cellules embryonnaires de poulet infectées par les poxvirus et co-transfectées avec des plasmides contenant une cassette d'expression, flanquée aux extrémités de séquences d'ADN homologues à celles de régions non essentielles de l'ADN des poxvirus, et renfermant, sous la dépendance de promotteurs des poxvirus ( H6, 13L), le poly nucléotide qui code pour le peptide selon l'exemple 2 en utilisant les procédés décrits dans les brevets US 4,769,330, 4,772,848, 4,603,112, 5,100,587,
5,179,993 et 5,863,542. On utilise ces poxvirus recombinants pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention ou au traitement de l'infection à virus HIV.
Exemple 12: Expression de plusieurs peptides par un poxvirus
On prépare une composition vaccinale comprenant un poxvirus recombinant codant pour plusieurs peptides ayant l'une des séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 décrites dans l'exemple 1 mimant plusieurs épitopes conformationnels de l'enveloppe du HIV. L'utilisation et la préparation de vecteurs recombinants codant pour plusieurs épitopes est bien connu de l'homme de métier ( Toes RE et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14660 , Thomson SA et al. (1996) J. Immunol. 157: 822) et est applicable aussi à la préparation de poxvirus recombinants codant pour des mimotopes multiples . On prépare notamment une composition vaccinale comprenant un canaripox recombinant ( ALVAC recombinant) codant pour des mimotopes multiples de l'enveloppe du HIV. On utilise ces poxvirus recombinants pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention ou au traitement de l'infection à virus HIV.
Exemple 13: Combinaisons de peptides
On prépare une composition vaccinale comprenant plusieurs peptides ayant l'une des séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 décrites dans l'exemple 1 en utilisant les différents modes de préparation décrits dans les exemples 2 à 12 mimant plusieurs épitopes conformationnels de l'enveloppe du HIV. On utilise ces différentes compositions pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention ou au traitement de l'infection à virus HIV.
Exemple 13: Diagnostic
On met en œuvre une détection d'anticorps spécifiques du HIV par ELISA en utilisant un ou plusieurs peptides ayant l'une des séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 décrites dans l'exemple 1 et produit par synthèse chimique selon l'exemple 2 pour le diagnostic de l'infection à HIV à partir d'un échantillon biologique De manière générale, on prélève un échantillon de fluide physiologique (sang, plasma, sérum), échantillon que l'on fait ensuite réagir en présence d'un peptide selon l'invention.
Pour ce faire, on utilise le peptide lui-même comme réactif de diagnostic. On recourt généralement -soit à un test de diagnostic indirect, de type ELISA dans lequel le peptide fixé sur un support ( puits) est mis en présence de l'échantillon à tester, tandis que la révélation de la fixation antigène-anticorps est assurée par un anti-lg marqué, -soit à un test par compétition ou de déplacement, dans lequel on utilise un peptide selon l'invention, et un anticorps marqué spécifique du peptide. Le peptide est là aussi fixé à un support solide tel que puits, bandelettes. Dans le test de compétition, on met le peptide simultanément en présence de l'échantillon
(anticorps de l'échantillon) et d'un anticorps marqué spécifique du peptide. Les anticorps marqués à la peroxydase sont généralement utilisés. Dans le test de compétition ou de déplacement on utilise généralement des anticorps monoclonaux et polyclonaux ou anticorps recombinants spécifiques du peptide selon l'invention, qui sont parfois des fragments Fab ou F(ab)2 et en particulier ceux décrits dans l'invention.
Exemple 14: Diagnostic
On met en œuvre une détection d'anticorps spécifiques du HIV par immunochromatographie en utilisant un ou plusieurs peptides selon l'invention pour le diagnostic de l'infection à HIV à partir d'un échantillon biologique Dans ce cas le peptide selon l'invention est fixé sur un support de type bandelette et on se réfère à l'article de Robert F.N Zurk et al., Clin. Chem. 31/7, 1144-1150 (1985) ainsi qu'aux brevets ou demandes de brevet WO-A-88/08 534, WO-A-
91/12528, EP-A-291 176, EP-A-299428, EP-A-291 194, EP-A-284 232, US-A-5 120 643, US-A-5 030 558, US-A-5 266 497, US-A-4 740 468, US-A-5 266 497, US-A-4 855 240, US-A-5 451 504, US-A-5 141 850, US-A-5 232 835 et US-A-5 238 652 pour mettre en œuvre le procédé.
Exemple 15 : Diagnostic
Etude de la réponse lymphoproliférative spécifique à un ou plusieurs peptides selon l'invention pour le diagnostic de l'infection à virus HIV à partir d'un échantillon biologique.
Le sang du patient est recueilli sur tube héparine . Les lymphocytes sont ensuite séparés par centifugation sur Ficoll hypaque puis distribués en microplaques 96 puits stériles à raison de 2 105 cellules par puits à fond rond sous un volume final de 200μl de milieu de culture complet ( RPMI 1640 supplémenté par 25mM HEPES, 2mM L-glutamine , 50U/ml de pénicilline, 50μg/ml de streptomycine et 5% de sérum AB décomplementé) et mis en présence de concentrations variables d' un ou plusieurs peptides ayant l'une des séquences SEQ ID NOM à SEQ ID NOM 1 décrites dans l'exemple 1 et produit par synthèse chimique selon l'exemple 2 (concentrations allant de 1ng/ml à 50μg/ml). Chaque concentration de peptide est testé en triplicatte pour s'affranchir au mieux des variations biologiques. Des combinaisons multiples de peptides peuvent être également testés dans la gamme de concentration indiquée, par exemple une combinaison résultant de l'association d'un mimotope de l'enveloppe avec un mimotope de la nucléocapside dans la gamme de concentration indiquée. Après 5 jours de culture à 37 °c sous 5% CO2, 0,5μci de thymidine tritiée est ajouté à chaque puits. Après une nouvelle incubation de 16 heures, on recueille l'ADN cellulaire de chaque puits de culture sur des filtres après précipitation à l'éthanol et on mesure le taux d'incorporation de thymidine tritiée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide qui reflète l'intensité de la réponse lymphoproliférative. Les résultats sont exprimés sous la forme d'index de stimulation (moyenne des cpm des puits de culture lymphocytaire contenant une concentration donné en peptide/ moyenne des cpm des puits de culture lymphocytaire sans peptide). La réponse lymphoproliférative est considérée comme positive lorsque l'index de stimulation est supérieur à 3.

Claims

Revendications
1) Peptide pour la prévention ou le traitement thérapeutique de l'infection à virus HIV capable d'interagir avec un anticorps spécifique d'un antigène de l'enveloppe dudit virus et provenant d'un patient HIV positif et appartenant au groupe des "long term non progressor" , comprenant une séquence en acides aminés qui mime un épitope conformationnel d'un antigène de ladite enveloppe sans toutefois correspondre à une séquence continue d'acides aminés de cet antigène.
2) Peptide selon la revendication 1 , selon laquelle l'antigène de l'enveloppe est représenté par la protéine d'enveloppe gp160.
3) Peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ce peptide peut comprendre les séquences 1 à 11 SEQ ID NO : 1 Phe Asn Leu Thr His Phe Leu
SEQ ID NO : 2 Glu Gly Trp His Ala His Thr
SEQ ID NO : 3 Lys Leu Asn Trp Met Phe Thr
SEQ ID NO : 4 Ser Thr Asn Trp Met Phe Thr
SEQ ID NO : 5 Ala Met Pro Leu Pro Tyr Thr Phe SEQ ID NO : 6 Asp Ser His Thr Pro Gin Arg
SEQ ID NO : 7 Val Ser Phe Thr Pro Ser Phe
SEQ ID NO : 8 His Ala Ala Leu Ser Met Asn Thr His Ala Leu Met
SEQ ID NO : 9 Ala Trp His Glu Ser Arg Ala
SEQ ID NO : 10 Phe Lys Thr Ala Tyr Pro Thr SEQ ID NO : 11 Ser His Ala Leu Pro Leu Thr Trp Ser Thr Ala Ala
4) Peptide comprenant l'enchaînement d'au moins deux peptides selon l'une des revendications 1 à 3.
5) Peptide selon la revendication 4 comprenant la duplication de peptides identiques.
6) Peptide selon la revendication 5 dans laquelle l'accouplement des deux peptides se fait au moyen d'un bras "espaceur" constitué de la séquence en acides aminés Gly Pro Gly 7) Conjugué comprenant au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 6 lié à une molécule porteuse pour induire ou renforcer l'immunogénicité dudit peptide.
8) Conjugué selon la revendication 7 selon laquelle la molécule porteuse comprend au moins un épitope T helper du virus HIV.
9) Conjugué selon la revendication 8 dont la molécule porteuse comprend l'épitope p24E et T1 du virus HIV
10) Conjugué selon la revendication 9, comprenant un peptide résultant de la duplication des séquences NOM , NO:3 ou NO:4 selon la revendication 6, ledit peptide étant lié du coté N terminal à l'épitope p24E et du côté C terminal à l'épitope T1 par l'intermédiaire de 2 bras "espaceurs".
11) Conjugué selon la revendication 10, caractérisé en ce que les 2 bras espaceurs sont identiques et sont constitués de l'enchaînement Gly Pro Gly et qu'il comprend au choix l'une des séquences 12 à 14
SEQ ID NO : 12 Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Gly Pro Gly Lys Leu Asn Trp Met Phe Thr Gly Pro Gly Lys Leu Asn
Trp Met Phe Thr Gly Pro Gly lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Glu Lys Ala Met Tyr Ala
SEQ ID NO : 13 Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Thr Asn Trp Met Phe Thr Gly Pro Gly Ser Thr Asn
Trp Met Phe Thr Gly Pro Gly lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Glu Lys Ala Met Tyr Ala
SEQ ID NO : 14 Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Gly Pro Gly Phe Asn Leu Thr His Phe Leu Gly Pro Gly Phe Asn Leu
Thr His Phe Leu Gly Pro Gly Lys Gin Ile Ile Asn Met Trp Gin Glu Val Glu Lys Ala Met Tyr Ala 12) Vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression fonctionnelle permettant l'expression d'un poly nucléotide codant pour un peptide selon l'une des revendications 1 à 11
13) Vecteur recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est un adénovirus, un poxvirus, un baculovirus, un bactériophage ou un plasmide.
14) Composition thérapeutique ou prophylactique pour l'infection à HIV, notamment destiné à un usage vaccinal, dont le principe actif comprend un peptide selon l'une des revendications 1 à 11 et/ou un vecteur recombinant codant pour ledit peptide selon l'une des revendications 12 et 13.
15) Composition selon la revendication 14 dont le principe actif est sous la forme d'une formulation associée à un adjuvant compatible pour I' administration d'une dose efficace par voie muqueuse ou parentérale.
16) Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 11 et/ou d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 12 et 13 en tant que réactif pour le diagnostic du HIV, ledit diagnostic comprenant l'évaluation, à partir d'un échantillon de sang, de la réponse humorale et/ou à médiation cellulaire spécifique de ce peptide.
77,) Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 11 et/ou d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 12 et 13 en tant que réactif pour le diagnostic de la susceptibilité de sujets infectés par le virus HIV, à développer rapidement un SIDA.
18) Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 11 et/ou d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 12 et 13 pour la préparation d'une composition thérapeutique ou prophylactique, destinée au traitement ou à la prévention de l'infection à HIV.
19) Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 11 et/ou d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 12et 13 pour stimuler in vitro les cellules du système immunitaire d'un individu, les dites cellules étant ensuite destinées à être réinjectées dans l'organisme de l'individu après stimulation.
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