FR2806912A1 - UTILISATION DE PROTEINES gp120 ET gp160 MODIFIEES DANS LA BOUCLE V3 DU VIH-1 POUR LA PREPARATION DE COMPOSITIONS VACCINALES ET FORMULATIONS LES CONTENANT - Google Patents

UTILISATION DE PROTEINES gp120 ET gp160 MODIFIEES DANS LA BOUCLE V3 DU VIH-1 POUR LA PREPARATION DE COMPOSITIONS VACCINALES ET FORMULATIONS LES CONTENANT Download PDF

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Abstract

Utilisation de protéines gp120 et gp160 modifiées dans la boucle V3 du VIH-1 pour la préparation de compositions vaccinales et formulations les contenant induisant une immunité systémique et mucosale.Utilisation d'une protéine Env recombinante de VIH-1, dans laquelle la boucle V3 est partiellement ou complètement délétée, pour la préparation d'une composition vaccinale, apte à induire une immunité à la fois humorale, cellulaire et mucosale vis-à-vis du VIH-1. La composition vaccinale comprend :- une protéine Env recombinante telle que définie ci-dessus,- éventuellement au moins un composé sélectionné dans le groupe constitué par : (1) les adjuvants de vaccination sélectionnés dans le groupe constitué par des dérivés comportant des ions divalents ou trivalents : hydroxyde d'aluminium ou phosphate de calcium et les dérivés du muramyl-peptide et (2) des liposomes et- éventuellement au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Description

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La présente invention est relative à l'utilisation de protéines gpl20 et gpl60 modifiées dans la boucle V3 du VIH-1 pour la préparation de compositions vaccinales et ainsi qu'à des formulations les contenant, aptes à pro- duire une réponse immunitaire humorale, cellulaire et mucosale.
Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est l'agent étiologique du SIDA. Le VIH-1 induit une infection persistante chez l'humain, qui entraîne une immunodéficience sévère. L'enveloppe du VIH est composée de deux glycoprotéines, la gpl20 et la gp41, qui dérivent d'un précurseur, la gpl60, par clivage protéolytique. Cinq régions conservées, Cl à C5 et cinq régions variables, V1 à V5, ont été mises en évidence au sein de la glycoprotéine de l'enveloppe. Trois régions fonctionnelles jouent un rôle essentiel dans les premières étapes de l'infection et ont été identifiées : le site de liaison au CD4 (dans la région C4), la région V3, essentielle à l'infectivité et finalement une région très hydrophobe, située à l'extrémité N-terminale de la gp41, qui participe à la fusion entre la membrane de la cellule cible et l'enveloppe virale. La boucle V3 est hypervariable, immunodominante et correspond au déterminant principal inducteur d'anticorps neutralisants (PND).
Il est généralement admis que les anticorps neutralisants jouent un rôle important dans la protection contre l'infection virale (1, 2).
Cependant, dans le cas du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), les anticorps neutralisants qui se développent à un stade précoce de l'infection, n'empêchent pas la progression de la maladie.
En effet, chez les personnes infectées, les anticorps neutralisants, lorsqu'ils existent, présentent un spectre de neutralisation très étroit et souvent ne neutralisent pas la/les souches qui infectent le patient (3,4). De la même façon, les anticorps neutralisants induits par la vaccination avec la gpl60/120 en solution sont généralement spécifiques de la souche utilisée pour la préparation
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vaccinale et sont dirigés contre un ou des déterminants dans la boucle V3 de la gpl20 (5).
Bien que la boucle V3 soit hypervariable, un tétrapeptide, Gly-
Pro-Gly-Arg (GPGR), situé au sommet de la boucle ainsi que deux cystéines à sa base sont présents chez presque la totalité des isolats connus de VIH-1, ce qui indique que cette séquence est essentielle à une étape du cycle vital du virus (6).
Les rôles de la boucle V3 (tropisme cellulaire, infectivité, induc- tion d'anticorps neutralisants de spectre restreint et rôle dans la pathogenèse) ont été mis en évidence (6).
Les Inventeurs ont modifié le gène env du VIH-1 en effectuant des délétions éliminant ou réduisant les épitopes hypervariables de la boucle V3.
Les résultats, obtenus avec une délétion partielle dans la boucle V3 de la gpl60, en respectant la couronne de la boucle V3, c'est-à-dire la séquence GPGRAF ainsi que les deux cystéines à sa base, montrent que la protéine modifiée #V3- GPGRAF est exprimée au même titre que la protéine non modifiée et qu'elle réagit avec un sérum de référence humain anti-VIH, à un niveau similaire à la gpl60 recombinante non modifiée (7).
Une protéine, dans laquelle la boucle V3 est complètement délétée, a également été produite ; il s'agit de la protéine AV3+, qui est également exprimée et dont la masse moléculaire est compatible avec la délétion.
L'ensemble de ces éléments a conduit les Inventeurs à formuler l'hypothèse que la boucle V3 représenterait un leurre pour le système immunitaire et que la modification ou l'élimination de cette boucle pourrait induire un changement conformationnel de la molécule, qui se traduirait par l'induction d'une activité neutralisante dirigée contre d'autres épitopes plus conservés, mais qui montrent une faible immunogénicité au cours de l'infection naturelle ou suite à une vaccination avec la protéine native.
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Face à l'épidémie de SIDA, la mise au point d'un vaccin anti-
SIDA capable d'enrayer la propagation de la maladie est impérative ; en effet, l'Organisation Mondiale de la Santé estime qu'en 2002, il pourrait y avoir entre
50 et 75 millions de personnes infectées par le VIH, dans le monde.
Les Inventeurs se sont, en conséquence, donné pour but de pro- duire une composition vaccinale, qui réponde mieux aux besoins de la pratique en ce qu'elle est apte à induire une réponse immunitaire humorale, cellulaire et mucosale présentant un spectre de neutralisation large, du fait de l'induction d'anticorps aptes à neutraliser différents types de souches de VIH-1 et notamment aussi bien des souches de laboratoire que des souches cliniques (isolats primaires).
La présente invention a pour objet l'utilisation d'une protéine Env recombinante de VIH-1, dans laquelle la boucle V3 est partiellement ou complètement délétée, pour la préparation d'une composition vaccinale, apte à induire une immunité à la fois humorale, cellulaire et mucosale vis-à-vis de souches divergentes du VIH-1.
Les Inventeurs ont maintenant trouvé, de manière surprenante, que les protéines, dans lesquelles la boucle V3 est partiellement ou complètement délétée, sont effectivement aptes à induire une immunité protectrice à large spectre à la fois humorale (anticorps neutralisants), cellulaire (lymphocytes T cytotoxiques) et mucosale (productions d'IgA secrétoires neutralisantes).
On entend par immunité ou réponse immunitaire à large spectre, l'ensemble des facteurs humoraux et cellulaires qui protègent l'organisme contre une infection à VIH-1, conformément à la définition de J. F. Bach (Traité d'Immunologie, Flammarion, 1993).
Conformément à ladite utilisation, ladite protéine Env recombinante est sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines Env dans
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lesquelles la boucle V3 est partiellement délétée : protéines gpl60 et gpl20 recombinantes AV3-GPGRAF et les protéines Env dans lesquelles la boucle V3 est complètement délétée : protéinesEnv gpl60 et gpl20 recombinantes AV3+.
La présente invention a également pour objet une composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend : - une protéine Env recombinante, telle que définie ci-dessus, - éventuellement au moins un composé sélectionné dans le groupe constitué par : (1) les adjuvants de vaccination sélectionnés dans le groupe constitué par des dérivés comportant des ions divalents ou trivalents : hydroxyde d'aluminium ou phosphate de calcium et les dérivés du muramylpeptide et (2) des liposomes et - éventuellement au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition vaccinale, elle comprend une protéine Env recombinante, telle que définie cidessus, ancrée sur des vésicules lipidiques synthétiques unilamellaires ou liposomes (immunosomes) comprenant un rapport molaire phosphatidylcho- line:cholestérol de l'ordre de 8 :1 de taille comprise entre 70 et 150 nm, de préférence 90 nm, tels que décrits dans le brevet EP 47480.
Une telle composition vaccinale peut avantageusement être administrée soit par voie générale ou systémique : voie orale, voie parentérale, soit par voie locale (rectale, vaginale, par exemple) ; elle est de préférence administrée par une voie qui implique un contact direct avec une muqueuse, et qui permet ainsi d'obtenir une stimulation de la réponse immunitaire mucosale.
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La composition vaccinale selon l'invention peut avantageuse- ment être présentée sous différentes formulations galéniques, particulièrement bien adaptées à la voie d'administration et à l'effet recherché, à savoir l'obtention d'une réponse immunitaire humorale, cellulaire et/ou mucosale.
La présente invention a donc également pour objet une formula- tion galénique destinée à une administration orale, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par : - un noyau constitué par une composition vaccinale, telle que définie ci-dessus, incluse dans une gélatine et - un enrobage sélectionné dans le groupe constitué par un polymère filmogène, soluble ou gonflable dans l'eau et soluble dans les solvants, sélectionné dans le groupe constitué par les dérivés de la cellulose, la polyvinylpyrrolidone, les esters acryliques et méthacryliques, des polyéthylène-glycols, les alcools polyvinyliques, le copolymère vinylpyrrolidone-acétate de vinyle, le copolymère vinylpyrrolidone-alcool polyvinylique et des matières protéiques telles que la zéine ou la gliadine.
De préférence, ledit agent filmogène est sélectionné dans le groupe constitué par les esters et les éthers de cellulose, tels que l'acétate de cellulose, l'acétate phtalate de cellulose, le butyrate de cellulose, l'éthylcellulose et la méthylcellulose.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite formulation, ledit polymère filmogène est associé à au moins un agent plastifiant, choisi parmi la glycérine et ses esters, les polyéthylènes glycols de haut poids moléculaire, l'huile de ricin, les esters des acides citrique, phtalique, adipique et sébacique.
Une telle formulation, destinée à une administration orale, protège la protéine Env recombinante (antigène) de la dégradation par les protéases gastriques et du pH acide de l'estomac. L'enrobage se solubilise au pH alcalin de
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l'intestin ce qui libère l'antigène au voisinage des plaques de Peyer, qui sont les sites majeurs de l'induction d'une immunité mucosale.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite formu- lation, ladite composition vaccinale est constituée par un mélange lyophilisé d'immunosomes sur lesquels est ancrée une protéine gp120/160 et de tréhalose.
Une formulation préférée destinée à être administrée par voie orale comprend : - un noyau constitué par un mélange lyophilisé d'immunosomes sur lesquels est ancrée une protéine gp120/160 et de tréhalose, inclus dans de la gélatine et - un enrobage constitué par un dérivé cellulosique, de préférence, de la cellulose acétate phtalate.
La présente invention a donc également pour objet une formulation galénique destinée à une administration locale au niveau d'une muqueuse (vaginale ou rectale), caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par une composition vaccinale, telle que définie ci-dessus, incluse dans de la glycérine ou un mélange à base de glycérol/glycérine.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite formulation, ladite composition vaccinale est constituée par un mélange lyophilisé d'immunosomes sur lesquels est ancrée une protéine gpl20/160 et de tréhalose.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
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Exemple 1: Préparation de la protéine recombinante envAV3-GPGRAF
Délétion partielle de la boucle V3
Le gène env du VIH-1LAI est cloné dans un système baculoviral ; les séquences variables de la boucle V3 ont été éliminées en introduisant une modification dans le gène env de pNL4-3, ne conservant que les nucléotides codant pour l'hexapeptide GPGRAF et les deux cystéines à la base de la boucle.
Cette modification de la boucle V3 a été réalisée à l'aide de 4 oligonucléotides. Ceux-ci ont été hybridés pour reconstituer la boucle V3 modifiée et clonés directement entre les sites de restriction Asel et Nhel d'un vecteur intermédiaire, comportant les 1. 035 premiers nucléotides du gène env, de façon à ne conserver que le motif GPGRAF et les deux cystéines de la région V3.
La modification introduite dans le gène a été confirmée par séquençage de la région V3 et cloné dans le vecteur de transfert pBacPAK env, précédemment construit (7), afin d'obtenir le vecteur de transfert BacPAK env#V3-GPGRAF. Ce dernier a permis de générer le baculovirus recombinant env#V3-GPGRAF (7).
Expression du gène env recombinant
Des cellules d'insectes Sf21 ont été infectées avec le virus de la polyédrie nucléaire de Autographa californica (AcNPV), ainsi qu'avec le baculovirus recombinant env#V3-GPGRAF. Trois à quatre jours post-infection, les cellules ont été récoltées, lysées en présence de détergent et analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 % ainsi que par immuno-empreinte (Western blot). Les résultats ont montré que les cellules infectées avec le baculovirus recombinant env#V3-GPGRAF expriment une protéine dont la masse moléculaire est compatible avec la délétion. Cette protéine est reconnue par un sérum de référence humain positif pour les antigènes de HIV-1 (7).
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Purification de la gpl60 recombinante AV3-GPGRAF
La gpl60 recombinante EnvAV3-GPGRAF a été purifiée par chromatographie sur une colonne de DEAE-cellulose, suivie d'une purification sur une colonne de lectine Lens culinaris, à partir de 2 X 109 cellules Sf21 infectées avec le baculovirus recombinant envAV3-GPGRAF. L'analyse par électrophorèse a montré que la protéine était pure à plus de 80%.
Exemple 2 : Préparation d'une formulation galénique selon l'invention. a. Préparation d'Immunosomes avec gpl60 recombinante AV3-
GPGRAF
Les Immunosomes ont été préparés par ancrage de la gpl60 recombinante AV3-GPGRAF sur des liposomes préformés, conformément à la méthode décrite dans le brevet EP 47 480. Les Immunosomes-AV3-GPGRAF se présentent comme des particules d'environ 90 nm, recouvertes de gpl60-AV3- GPGRAF. b. Formulations de la composition obtenue en a.
Pour les immunisations orales, les immunosomes-AV3-GPGRAF sont lyophilisés en présence de thréalose et l'antigène est introduit dans une capsule de gélatine. La capsule est enrobée d'un mélange contenant de la cellulose acétate phtalate, qui protège l'antigène de la dégradation par les protéases gastriques et du pH acide de l'estomac. L'enrobage se solubilise au pH alcalin de l'intestin ce qui libère l'antigène au voisinage des plaques de Peyer, qui sont les sites majeurs de l'induction d'une immunité mucosale.
Pour les immunisations par la voie vaginale ou rectale, l'antigène est formulé dans un mélange à base de glycérol/glycérine, qui est solide à la température ambiante, mais qui fond à la température physiologique du corps, libérant ainsi graduellement l'antigène.
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Exemple 3: Mise en évidence de l'activité immunogène et vaccinale d'une formulation selon l'exemple 2.
Protocole d'immunisation de souris C57/BL
Dans ce protocole d'hyperimmunisation, 12 souris ont reçu quatre injections d'Immunosomes contenant 25 g de gpl60-AV3-GPGRAF, par la voie intrapéritonéale à trois semaines d'intervalle, suivis d'un rappel par la voie intraveineuse. Aucun adjuvant n'a été utilisé. Six souris témoins ont été soumises au même protocole en utilisant du PBS.
Évaluation de la réponse immunitaire par ELISA contre les souches LAI, IIIB, MN, et RF
Deux semaines après le rappel par la voie intra-veineuse, les souris ont été saignées par une ponction intra-cardiaque et les sérums ont été évalués pour la présence d'anticorps IgM, IgG et IgA, réagissant avec les souches LAI, IIIB, MN, et RF.
Toutes les souris ont développé des titres d'anticorps de type IgG très élevés contre chacune des quatre souches testées, se situant entre 1/65. 536 à 1/524.288. Les Tableaux I, II, III et IV, montrent que les souris ont également développé des anticorps des trois isotypes contre quatre souches de laboratoire testées.
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TABLEAU I Réponse immune humorale de souris immunisées avec une composition gpl60
AV3-GPGRAF ancrée dans un immunosome
Figure img00100001
<tb>
<tb> Titre <SEP> en <SEP> ELISA <SEP> des <SEP> anticorps
<tb> dirigés <SEP> contre <SEP> la <SEP> souche <SEP> LAI
<tb> Souris <SEP> Immunisations <SEP> Antigène <SEP> IgM <SEP> IgG <SEP> IgA
<tb> 1 <SEP> SIX <SEP> IMS-AGPGRAF <SEP> (25 <SEP> g) <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 2 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 3 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/524288 <SEP> 1/512
<tb> 4 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/512 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/256
<tb> 5 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/128
<tb> 6 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 7 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 8 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/65536 <SEP> 1/128
<tb> 9 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/4 <SEP> 096 <SEP> 1/524 <SEP> 288 <SEP> 1/1024
<tb> 10 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/4 <SEP> 096 <SEP> 1/524288 <SEP> 1/1024
<tb> 11 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 12 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2048 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 13 <SEP> SIX <SEP> PBS <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 14 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 15 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 16 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 17 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 18 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
TABLEAU II Réponse immune humorale de souris immunisées avec une composition gpl60 AV3-GPGRAF ancrée dans un immunosome
Figure img00110001
<tb>
<tb> Titre <SEP> en <SEP> ELISA <SEP> des <SEP> anticorps
<tb> dirigés <SEP> contre <SEP> la <SEP> souche <SEP> IIIB
<tb> Souris <SEP> Immunisations <SEP> Antigène <SEP> IgM <SEP> IgG <SEP> IgA
<tb> 1 <SEP> SIX <SEP> IMS-#GPGRAF <SEP> (25 <SEP> g) <SEP> 1/2048 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 2 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 3 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/512
<tb> 4 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/256
<tb> 5 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/128
<tb> 6 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2048 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/256
<tb> 7 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 8 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/65536 <SEP> 1/128
<tb> 9 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/4 <SEP> 096 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/1024
<tb> 10 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/4 <SEP> 096 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/1024
<tb> 11 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 12 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2048 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/256
<tb> 13 <SEP> SIX <SEP> PBS <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 14 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 15 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 16 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 17 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 18 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
TABLEAU III Réponse immune humorale de souris immunisées avec une composition gpl60 AV3-GPGRAF ancrée dans un immunosome
Figure img00120001
<tb>
<tb> Titre <SEP> en <SEP> ELISA <SEP> des <SEP> anticorps
<tb> dirigés <SEP> contre <SEP> la <SEP> souche <SEP> MN
<tb> Souris <SEP> Immunisations <SEP> Antigène <SEP> IgM <SEP> IgG <SEP> IgA
<tb> 1 <SEP> SIX <SEP> IMS-AGPGRAF <SEP> (25 <SEP> g) <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/256
<tb> 2 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/256
<tb> 3 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/512
<tb> 4 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/65 <SEP> 536 <SEP> 1/256
<tb> 5 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/65 <SEP> 536 <SEP> 1/128
<tb> 6 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/65 <SEP> 536 <SEP> 1/256
<tb> 7 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/256
<tb> 8 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/65 <SEP> 536 <SEP> 1/128
<tb> 9 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/4096 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/1 <SEP> 024
<tb> 10 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/4 <SEP> 096 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/1024
<tb> 11 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/256
<tb> 12 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/131 <SEP> 072 <SEP> 1/256
<tb> 13 <SEP> SIX <SEP> PBS <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 14 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 15 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 16 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 17 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 18 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
TABLEAU IV Réponse immune humorale de souris immunisées avec une composition gpl60 AV3-GPGRAF ancrée dans un immunosome
Figure img00130001
<tb>
<tb> Titre <SEP> en <SEP> ELISA <SEP> des <SEP> anticorps
<tb> dirigés <SEP> contre <SEP> la <SEP> souche <SEP> RF
<tb> Souris <SEP> Immunisations <SEP> Antigène <SEP> IgM <SEP> IgG <SEP> IgA
<tb> 1 <SEP> SIX <SEP> IMS-AGPGRAF <SEP> (25 <SEP> g) <SEP> 1/1 <SEP> 024 <SEP> 1/131 <SEP> 072 <SEP> 1/128
<tb> 2 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/128
<tb> 3 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/131 <SEP> 072 <SEP> 1/256
<tb> 4 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/65 <SEP> 536 <SEP> 1/128
<tb> 5 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/65 <SEP> 536 <SEP> 1/64
<tb> 6 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/65 <SEP> 536 <SEP> 1/126
<tb> 7 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/126
<tb> 8 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/65 <SEP> 536 <SEP> 1/64
<tb> 9 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/256
<tb> 10 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/131 <SEP> 072 <SEP> 1/256
<tb> 11 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/2 <SEP> 048 <SEP> 1/262144 <SEP> 1/128
<tb> 12 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/131072 <SEP> 1/128
<tb> 13 <SEP> SIX <SEP> PBS <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 14 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 15 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 16 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 17 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 18 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb>
Détermination de la présence d'anticorps capables de neutraliser l'infectivité de souches de laboratoire différentes
Les sérums des souris immunisées avec l'Immunosome gp160- AV3-GPGRAF ont ensuite été évalués pour leur potentiel de neutraliser l'infectivité des souches LAI, IIIB, MN, RF LAV 43. 01 et BAL. Les essais de neutralisation ont été effectués en utilisant des cellules CEM. Toutes les souris ont développé des anticorps neutralisants allant de 1/1. 024 à 1/126, comme illustré aux Tableaux V et VI.
<Desc/Clms Page number 14>
TABLEAU V
Titre en anticorps neutralisants dirigés contre des souches divergentes de VIH-1 chez des souris immunisées avec la composition vaccinale gpl60 #V3-
GPGRAF ancrée dans un immunosome
Figure img00140001
<tb>
<tb> Titre <SEP> en <SEP> anticorps <SEP> neutralisants <SEP> contre <SEP> 100 <SEP> TCID50 <SEP> de <SEP> : <SEP>
<tb> Souris <SEP> Immunisations <SEP> Antigène <SEP> LAI <SEP> IIIB <SEP> RF
<tb> 1 <SEP> SIX <SEP> IMS-AGPGRAF <SEP> (25 <SEP> g) <SEP> 1/256 <SEP> 1/256 <SEP> 1/256
<tb> 2 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/256 <SEP> 1/256
<tb> 3 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/512 <SEP> 1/256 <SEP> 1/512
<tb> 4 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/128 <SEP> 1/256
<tb> 5 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/256 <SEP> 1/128
<tb> 6 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/256
<tb> 7 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/256 <SEP> 1/256
<tb> 8 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/64 <SEP> 1/32 <SEP> 1/128
<tb> 9 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/256 <SEP> 1/1024
<tb> 10 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/1024
<tb> 11 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/512 <SEP> 1/512 <SEP> 1/256
<tb> 12 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/256
<tb> 13 <SEP> SIX <SEP> PBS <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 14 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 15 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 16 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 17 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 18 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
TABLEAU VI
Titre en anticorps neutralisants dirigés contre des souches divergentes de VIH-1 chez des souris immunisées avec la composition vaccinale gpl60 AV3-
GPGRAF ancrée dans un immunosome
Figure img00150001
<tb>
<tb> Titre <SEP> en <SEP> anticorps <SEP> neutralisants <SEP> contre <SEP> 100 <SEP> TCIDso <SEP> de <SEP> : <SEP>
<tb> Souris <SEP> Immunisations <SEP> Antigène <SEP> LAV4 <SEP> 3. <SEP> 01 <SEP> MN <SEP> BAL
<tb> 1 <SEP> SIX <SEP> IMS-AGPGRAF <SEP> (25 <SEP> g) <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/126
<tb> 2 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/64
<tb> 3 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/256 <SEP> 1/256
<tb> 4 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/128 <SEP> 1/126
<tb> 5 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/256 <SEP> 1/128
<tb> 6 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/256
<tb> 7 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/256 <SEP> 1/256
<tb> 8 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/32 <SEP> 1/32 <SEP> 1/64
<tb> 9 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/256 <SEP> 1/256
<tb> 10 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/126
<tb> 11 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/1024 <SEP> 1/512 <SEP> 1/256
<tb> 12 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/126
<tb> 13 <SEP> SIX <SEP> PBS <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 14 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 15 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 16 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 17 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 18 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb>
Évaluation du pouvoir neutralisant des sérums contre six isolats primaires.
Finalement, le pouvoir neutralisant des sérums de souris a été déterminé contre six isolats primaires : 03908, 65869, 65965, 65870, 65871 et 3929, générés à partir de co-culture de lymphocytes de patients à différents stades de la maladie, avec des lymphocytes de donneurs séronégatifs. Les essais de neutralisation ont été effectués en utilisant des PBL non-stimulés. Toutes les souris ont développé des anticorps capables de neutraliser l'infectivité d'isolats primaires.
<Desc/Clms Page number 16>
A titre d'exemple, voir les tableaux VII et VIII. Les titres étaient généralement très élevés, se situant entre 1/512 et 1/256 contre cinq des six isolats primaires testés.
L'isolat 65869 s'est montré plus résistant à la neutralisation. Les titres étaient de 1/64 et de 1/32 et < 1/32 dans quatre des sérums. Cet isolat venait d'un patient en phase terminale de la maladie et le virus a induit de gigantesques syncytia dans les cultures cellulaires.
TABLEAU VII
Titre en anticorps neutralisants dirigés contre des souches divergentes de
VIH-1 chez des souris immunisées avec la composition vaccinale gpl60 AV3-
GPGRAF ancrée dans un immunosome
Figure img00160001
<tb>
<tb> Titre <SEP> en <SEP> anticorps <SEP> neutralisants <SEP> contre <SEP> 100 <SEP> TCIDso <SEP> de <SEP> : <SEP>
<tb> Souris <SEP> Immunisations <SEP> Antigène <SEP> # <SEP> 03908 <SEP> # <SEP> 65869 <SEP> # <SEP> 65965 <SEP>
<tb> 1 <SEP> SIX <SEP> IMS-AGPGRAF <SEP> (25 <SEP> g) <SEP> 1/126 <SEP> <1/32 <SEP> 1/64
<tb> 2 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/64 <SEP> 1/32 <SEP> 1/126
<tb> 3 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/32 <SEP> 1/126
<tb> 4 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/126 <SEP> <1/32 <SEP> 1/256
<tb> 5 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/64 <SEP> 1/126
<tb> 6 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/512 <SEP> 1/32 <SEP> 1/512
<tb> 7 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/64 <SEP> 1/256
<tb> 8 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 9 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/512 <SEP> <1/32 <SEP> 1/256
<tb> 10 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/32 <SEP> 1/126
<tb> 11 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/512 <SEP> 1/32 <SEP> 1/256
<tb> 12 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/32 <SEP> 1/126
<tb> 13 <SEP> SIX <SEP> PBS <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 14 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 15 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 16 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 17 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 18 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
TABLEAU VIII
Titre en anticorps neutralisants dirigés contre des souches divergentes de VIH-1 chez des souris immunisées avec la composition vaccinale gpl60 AV3-
GPGRAF ancrée dans un immunosome
Figure img00170001
<tb>
<tb> Titre <SEP> en <SEP> anticorps <SEP> neutralisants <SEP> contre <SEP> 100 <SEP> TCIDsode <SEP> : <SEP>
<tb> Souris <SEP> Immunisations <SEP> Antigène <SEP> # <SEP> 65870 <SEP> # <SEP> 65871 <SEP> # <SEP> 3929
<tb> 1 <SEP> SIX <SEP> IMS-AGPGRAF <SEP> (25 <SEP> g) <SEP> 1/64 <SEP> 1/126 <SEP> 1/64
<tb> 2 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/126 <SEP> 1/126 <SEP> 1/126
<tb> 3 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/126 <SEP> 1/256 <SEP> 1/256
<tb> 4 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/128 <SEP> 1/126
<tb> 5 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/126
<tb> 6 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/64 <SEP> 1/256
<tb> 7 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/126 <SEP> 1/256 <SEP> 1/256
<tb> 8 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 9 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/256 <SEP> 1/256
<tb> 10 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/126
<tb> 11 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/512 <SEP> 1/512 <SEP> 1/256
<tb> 12 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> 1/256 <SEP> 1/126 <SEP> 1/126
<tb> 13 <SEP> SIX <SEP> PBS <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 14 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 15 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 16 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 17 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb> 18 <SEP> idem <SEP> idem <SEP> <1/32 <SEP> <1/32 <SEP> <1/32
<tb>
Ces résultats montrent que la délétion partielle de la boucle V3, en conservant la séquence conservée, GPGRAF, favorise l'induction d'anticorps de large spectre, capables de neutraliser différentes souches de laboratoire, mais aussi différents isolats primaires.
Des résultats analogues sont obtenus avec la protéine qui contient une délétion totale de la boucle V3.
<Desc/Clms Page number 18>
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Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims (12)

REVENDICATIONS
1 ) Utilisation d'une protéine Env recombinante de VIH-1, dans laquelle la boucle V3 est partiellement ou complètement délétée, pour la prépa- ration d'une composition vaccinale, apte à induire une immunité à la fois humorale, cellulaire et mucosale vis-à-vis du VIH-1.
2 ) Utilisation d'une protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines Env gpl60 et gpl20 recombinantes dans lesquelles la boucle V3 est partiellement délétée et les protéines Env gp160 et gpl20 recombinantes dans lesquelles la boucle V3 est complètement délétée.
3 ) Composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend : - une protéine Env recombinante selon la revendication 1 ou la revendication 2, - éventuellement au moins un composé sélectionné dans le groupe constitué par : (1) les adjuvants de vaccination sélectionnés dans le groupe constitué par des dérivés comportant des ions divalents ou trivalents : hydroxyde d'aluminium ou phosphate de calcium et les dérivés du muramylpeptide et (2) des liposomes et - éventuellement au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
4 ) Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine Env recombinante, selon la revendication 1 ou la revendication 2, ancrée sur des vésicules lipidiques synthétiques unilamellaires comprenant un rapport molaire phosphatidylcholine:cholestérol de l'ordre de 8:1 et de taille comprise entre 70 et 150 nm, de préférence 90 nm.
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5 ) Composition selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle peut avantageusement être administrée par voie géné- rale ou voie locale.
6 ) Formulation galénique destinée à une administration orale, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par : - un noyau constitué par une composition vaccinale, selon la revendication 3 ou la revendication 4, incluse dans une gélatine et - un enrobage sélectionné dans le groupe constitué par un polymère filmogène, soluble ou gonflable dans l'eau et soluble dans les solvants, sélectionné dans le groupe constitué par les dérivés de la cellulose, la polyvinylpyrrolidone, les esters acryliques et méthacryliques, des polyéthylène-glycols, les alcools polyvinyliques, le copolymère vinylpyrrolidone-acétate de vinyle, le copolymère vinylpyrrolidone-alcool polyvinylique et des matières protéiques telles que la zéine ou la gliadine.
7 ) Formulation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit agent filmogène est sélectionné dans le groupe constitué par les esters et les éthers de cellulose, tels que l'acétate de cellulose, l'acétate phtalate de cellulose, le butyrate de cellulose, l'éthylcellulose et la méthylcellulose.
8 ) Formulation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit polymère filmogène est associé à au moins un agent plastifiant, choisi parmi la glycérine et ses esters, les polyéthylènes glycols de haut poids moléculaire, l'huile de ricin, les esters des acides citrique, phtalique, adipique et sébacique.
9 ) Formulation selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que la composition vaccinale est constituée par un mélange lyophilisé d'immunosomes sur lesquels est ancrée une protéine gpl20/160 et de tréhalose.
<Desc/Clms Page number 21>
10 ) Formulation selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend : - un noyau constitué par un mélange lyophilisé d'immunosomes sur lesquels est ancrée une protéine gpl20/160 et de tréhalose, inclus dans de la gélatine et - un enrobage constitué par un dérivé cellulosique, de préférence, de la cellulose acétate phtalate.
11 ) Formulation galénique destinée à une administration locale au niveau d'une muqueuse, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée par une composition vaccinale, selon la revendication 3 ou la revendication 4, incluse dans de la glycérine ou un mélange à base de glycérol/glycérine.
12 ) Formulation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite composition vaccinale est constituée par un mélange lyophilisé d'immunosomes sur lesquels est ancrée une protéine gp120/160 et de tréhalose.
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