DE60015564T2

DE60015564T2 - Berechnungsmethoden zur herstellung von molekularen mimetika

Info

Publication number: DE60015564T2
Application number: DE60015564T
Authority: DE
Inventors: Florence Casset; Claude Granier; Michel Kaczorek; Roger Lahana; Anthony Rees; Florence Roux
Original assignee: Synt EM SA
Current assignee: Synt EM SA
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2020-08-03
Also published as: AU6303900A; ATE281472T1; WO2001009191A1; DE60015564D1; AU776832B2; CA2377244A1; JP2003510672A; IL147031A0; EP1206494A1; EP1206494B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Entwerfen und die Synthese eines Moleküls, das die Aktivität eines Ausgangsmoleküls nachahmt. Solch ein Molekül wird im Allgemeinen als ein Mimetikum bezeichnet. Beispielsweise kann das Ausgangsmolekül ein Protein sein, das dafür bekannt ist, mit einem bestimmten "Ziel"-Molekül zu wechselwirken, und die Erfindung kann das Bilden eines Mimetikums betreffen, das sich vom Ausgangsmolekül unterscheidet, jedoch auch mit dem Zielmolekül wechselwirkt.
Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zum Entwerfen eines Mimetikums. Auch beschrieben werden Verfahren zum Identifizieren aktiver Abschnitte eines Ausgangsmoleküls zur Einbindung in ein Mimetikum, ein Verfahren zum Screenen von Mimetika auf die erwünschte Aktivität, eine Vorrichtung zur Durchführung der Verfahren, Verwendung des Mimetikums und pharmazeutische Zusammensetzungen, die das Mimetikum umfassen.
Hintergrund der Erfindung
Zahlreiche Reaktionen, die auf dem Gebiet der Biochemie untersucht werden, können als die Wechselwirkungen zwischen einem Protein und einem zweiten "Ziel"-Molekül (das häufig selbst ein Protein ist) bezeichnet werden. Solche Wechselwirkungen umfassen Wechselwirkungen zwischen Antigen und Antikörper, Enzym und Substrat und Hormon und Rezeptor. Bei zahlreichen dieser Reaktionen stellt der Abschnitt des Proteins, der für die Wechselwirkung verantwortlich ist, nur einen sehr geringen Anteil des gesamten Proteinmoleküls dar, und dieser Abschnitt wird üblicherweise als die "aktive Region" des Proteins bezeichnet.
Der Entwurf eines kleinen Oligopeptids oder Peptid-ähnlicher Mimetika, um die Aktivität großer natürlicher Proteine, basierend auf der Nachahmung der aktiven Region, zu reproduzieren, findet sowohl bei Therapeutika als auch bei Diagnostika zahl reiche Anwendungen. Für den Fall, dass die aktive Region von Interesse innerhalb einer kontinuierlichen Sequenz des Proteins angeordnet ist, wurden bereits Verfahren beschrieben, worin die Erfordernisse in Bezug auf die Konformation solcher Regionen mittels verschiedener chemischer Vernetzungen oder anderer Synthesestrategien erfüllt werden können. Besteht/Bestehen jedoch die Aktivitätsregion(en) eines Proteins aus diskontinuierlichen Segmenten der Polypeptidkette, tritt das Problem, ein Mimetikum zu entwerfen, besonders massiv auf.
Zahlreiche Forscher versuchten bereits, ein Molekül zu entwerfen, das ein bekanntes Protein nachahmt, in dem Sinne, als dass auch das Mimetikum in der Lage ist, mit dem Zielmolekül zu wechselwirken. Im Rahmen des Entwerfens eines Mimetikums wird/werden zuerst die aktive(n) Regionen) des bekannten Proteins identifiziert (beispielsweise im Fall einer Antikörper-Antigen-Wechselwirkung wird identifiziert, welche Regionen) des Antikörpers in der Lage sind, ein Antigen zu binden), wonach nach einem Mimetikum gesucht wird, das die aktive Region nachahmt. Da die aktive Region des bekannten Proteins relativ klein ist, wird gehofft, dass ein Mimetikum gefunden wird, das viel kleiner (z. B. in Bezug auf sein Molekulargewicht) als das Protein und dementsprechend leichter und billiger zu synthetisieren ist. Solch ein Mimetikum könnte als ein zweckmäßiger Ersatz für das Protein als ein Mittel zur Wechselwirkung mit dem Zielmolekül verwendet werden.
Reineke et al. ("A synthetic mimic of a discontinuous binding site on interleukin-10", Nature Biotechnology 17, 271–275 (1999)) schlugen das Entwerfen eines Mimetikum-Moleküls, das eine Bindungsstelle des Interleukin-10-Proteins nachahmt, durch die folgenden Schritte vor. In einem ersten Schritt wurde eine große Bibliothek an kurzen Peptiden synthetisiert, wobei jede einem kurzen Abschnitt von Interleukin 10 entsprach. Das Binden jedes dieser Peptide an das Target (in diesem Fall ein Antikörper gegen Interleukin-10) wurde einzeln durch ein Testverfahren getestet, um potentiell relevante Peptide zu identifizieren.
Nächster Schritt im Mimetikum-Verfahren war, weitere Peptide basierend auf den potentiell relevanten Peptiden zu synthetisieren. Das heißt, dass Reineke et. al eines der potentiell relevanten Peptide, die davor abgeleitet worden waren, auswählten und alle möglichen Peptide synthetisierten, worin jede Aminosäure des ausgewählten Peptids durch eine der anderen 19 L-Aminosäure ersetzt wurde (d.h. dass die Aminosäuren auf alle möglichen Arten durch jede andere mögliche Aminosäure ersetzt wurden). Die Bindungsaktivität jedes der resultierenden "Ersatzpeptide" wurde getestet. Dies verwies darauf, welche der Aminosäuren für die Aktivität des Proteins wichtig waren.
Manche der Aminosäure-Ersetzungen führten zu verstärkter Aktivität des Ersatzpeptids im Vergleich zum entsprechenden Peptid, auf dem das Ersatzpeptid basierte. Weitere Peptide wurden hergestellt, in denen Kombinationen dieser "Enhancer-Ersetzungen" eingebunden wurden. Peptide mit der besten Bindung an das Target wurden zur Verwendung als Mimetika ausgewählt.
Reineke et. al beschrieben, wie dieses Verfahren noch weiter fortgesetzt werden könnte. Sie versuchten hierbei, zwei der durch das obige Verfahren identifizierte Mimetika zu verbinden, um ein neues, kombiniertes Mimetikum zu schaffen.
Insbesondere schlugen sie vor, zwei der abgeleiteten Peptidstränge durch ein Linkerpeptid zu verbinden. Die Länge der Linkersequenz wurde so ausgewählt, dass die Distanz zwischen den zwei nachahmenden Peptiden gleich lang gehalten wurde wie jene im bekannten Protein. Die Distanz im bekannten Protein basierte auf einer bereits bestimmten kristallographischen Struktur.
Aminosäureersetzungen wurden auch in diesem kombinierten Peptid durchgeführt. Wie zuvor erfolgte dies durch das systematische Ersetzen von Aminosäuren. So wurde ein optimiertes Peptid auf Grundlage des kombinierten Peptids mit "verstärkenden Ersetzungen" hergestellt.
Reineke et. al stellten auch zyklische Moleküle durch das Einführen von zwei Cysteinresten in das optimierte Peptid her, um die Bildung einer Disulfidbrücke zu ermöglichen. Tatsächlich synthetisierten sie systematisch jedes mögliche zyklische Molekül (d. h. sie probierten jede mögliche Art und Weise aus, zwei Reste des optimierten Peptids durch zwei Cysteinreste zu ersetzen). Dies führte zu einer enorm großen Bibliothek zyklischer Peptide, die anschließend einzeln gescreent wurden, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, sich an das Target zu binden. Dies war wiederum ein äußerst arbeitsintensiver Vorgang.
In ähnlichen Arbeiten verwendeten Falcioni et. al ("Peptidomimetic compounds that inhibit antigen presentation by autoimmune disease-associated class II major histocompatibility molecules", Nature Biotechnology 17, 562–567 (1999)) Peptidbibliotheken, um ein Heptapeptid mit hoher Affinität zu Gelenkrheumatismus-assoziierten Haupthistokompatibilitäts- (MHC-) Molekülen der Klasse II zu identifizieren. Zahlreiche Substitutionen wurden anschließend im Hauptheptapeptid vorgenommen, und die Bindungsaffinitäten der resultierenden Peptide wurden getestet, um Mimetika des Hauptheptapeptids zu finden, das vergleichbare oder verstärkte Bindungsaffinitäten aufwies. Die ausgewählten Mimetika wurden dann auf ihre Fähigkeit getestet, T-Zell-Reaktionen auf prozessierte Protein-Antigene zu hemmen, die durch MHC-Moleküle dargeboten werden.
Laune et. al (Systematic Exploration of the Antigen Binding Activity of Synthetic Peptides Isolated from the Variable Regions of Immunoglobulins, The Journal of the Biochemistry Society 272, 30937–30944 (1997)) beschreiben das "Alanin-Scanning-Verfahren" zur Identifizierung wichtiger Aminosäuren. In diesem Ansatz wurde eine Peptidbibliothek synthetisiert, worin jedes Peptid einem kurzen Abschnitt der aktiven Region eines bekannten Proteins entsprach und die Aktivität mittels eines Bindungstests getestet wurde. Peptidsequenzen, die das Target binden, wurden auf diese Weise identifiziert.
Weiters wurden Hexapeptide synthetisiert, die den identifizierten Peptid-Bindungssequenzen entsprachen, und anschließend wurden weitere Hexapeptide basierend auf diesen Bindungs-Hexapeptiden, synthetisiert. Jedes weitere Hexapeptid unterschied sich vom entsprechenden Bindungs-Hexapeptid durch die Ersetzung einer einzelnen Aminosäure durch eine andere Aminosäure, in diesem Fall Alanin. Die Aktivität jedes der weiteren Hexapeptide wurde dann gemessen. Immer wenn die Ersetzung einer Aminosäure durch Alanin zu einem drastischen Rückgang der Aktivität des Peptids führte, wurde diese Aminosäure als eine wichtige identifiziert. Laune et. al identifizierten weiters auch die Anordnung der wichtigen Aminosäuren in der 3D-Röntgen-Kristallstruktur.
In Anbetracht der sehr hohen Anzahl an erforderlichen Synthesen und der Notwendigkeit, dass die Bindungsfähigkeit jedes synthetisierten Peptids gemessen wird, sind die obigen Verfahren äußerst arbeitsintensiv. Natürlich ist es daher sehr wichtig, die gewonnenen Informationen als ein Resultat solcher Verfahren auf vernünftige und effiziente Weise zu nutzen.
Ein damit verbundener Ansatz ist das "TASP-Verfahren" (Tuchscherer, "Template Assembled Synthetic Proteins: Condensation of a Multifunctional Peptide to Topological Template via Chemioselective Ligation", Tetrahedron Letters, Bd. 34, Nr. 52, 8419–8422 (1993); Tuchscherer et al., "The Tasp Concept: Mimetics of Peptide Ligands, Protein Surfaces and Folding units", Tetrahedron, Bd. 49, Nr. 17, 3559–3575 (1993); Tuchscherer et al., "Protein design: On the Threshold of Functional Properties", Bd. 47, 63–73 (1998)). Tuchscherer et. al ("The Tasp Concept: Mimetics of Peptide Ligands, Protein Surfaces and Folding units") fusionierten helikale Peptide aus dem MHC-Molekül HLA-A2 an eine Peptid-Matrize-Basis, um die Faltungstopologie von HLA-A2 nachzuahmen. Weitere Änderungen wurden an den Helices vorgenommen, umfassend (i) die Mutation von Resten, von denen nicht angenommen wurde, dass sie an der Bindung an den Rezeptor für Reste, die Helixbildung bevorzugen, beteiligt sind, und (ii) Mutationen, um die amphiphatische Eigenschaft zu ver bessern. Die Strukturen wurden mittels Zirkulardichroismus auf Helixbildung getestet. Antikörper gegen das TASP-Molekül waren für das native MHC-Molekül spezifisch.
Im TASP-Ansatz werden einzelne strukturelle Motive durch ihre Enden an ein externes Gerüst angebunden, wobei jedoch der strukturelle Kontext aller Motive untereinander nicht notwendigerweise aufrechterhalten wird. In den nachahmenden Molekülen werden Mutationen durchgeführt, um die Topologie zu verbessern, und die Wirkung dieser Mutationen wird durch strukturelle Bestimmung oder durch die biologische Aktivität getestet. Dies ist wiederum ein arbeitsaufwendiges Verfahren. Darüber hinaus sind TASP-Moleküle technisch gesehen schwierig herzustellen.
Grassy et. al (Nature Biotechnology, Bd. 16, 748–752 (1998)) bilden eine "In-silico-Bibliothek" aus 279.936 Peptiden, die aus der Schwerkette von HLA, Klasse I, abgeleitet sind. Die Peptide werden mittels statischer und dynamischer Filter filtriert, um fünf Hauptverbindungen zu bilden, die in vivo synthetisiert und getestet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Verfahren bereitzustellen, die zum Entwerfen eines Moleküls, das die Aktivität eines Ausgangsmoleküls nachahmt, nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung zielt weiters darauf ab, Moleküldynamik-Computersimulationen einzusetzen, um die Suche nach Mimetika rationell zu gestalten.
Wurde eine Reihe potentiell aktiver chemischer Gruppen (z. B. Aminosäurereste) in einem Ausgangsmolekül experimentell bestimmt (z. B. Identifizieren experimentell von aktiven chemischen Gruppen innerhalb aktiver (Peptid-) Fragmente eines Ausgangsmoleküls wie eines Antikörpers durch das Alanin-Scanning-Verfahren), so wird diese Reihe chemischer Gruppen am Computer gescreent, um im Voraus zu bestimmen, ob sie im Ausgangsmolekül zugänglich sind oder nicht. Eine chemische Gruppe, die zugänglich ist, ist eher mit Aktivität des Ausgangsmolekül verbunden.
Jene chemischen Gruppen, für die vorhergesagt wird, dass sie zugänglich sind, können dann in ein Mimetikum eingebunden werden. Die Erfindung bringt ein Niveau an strukturellem Verständnis zum Einsatz, um die Identifikation der zuvor beschriebenen, aktiven chemischen Gruppen über die Trial-and-Error-Methode zu verkürzen.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zum Entwerfen eines Mimetikums bereit, das mit einem Ausgangsmolekül verbundene Aktivität aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
Identifizieren mehrerer chemischer Gruppen des Ausgangsmoleküls, die mit Aktivität verbunden sind;
Bilden eines Mimetikums, das die chemischen Gruppen, die mit Aktivität verbunden sind, und eine Struktur umfasst, welche die chemischen Gruppen verbindet;
Durchführen einer Moleküldynamik-Simulation des gebildeten Mimetikums am Computer;
Bestimmen aus der Simulation, ob das Mimetikum einem vorgegebenen Kriterium folgt;
Variieren der Bindungsstruktur, um ein zweites Mimetikum herzustellen, das dem vorgegebenen Kriterium besser folgt.
Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Entwerfen eines Mimetikums einer Antikörperbindungsregion bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
Bereitstellen der dreidimensionalen Struktur zumindest der Zielbindungsregion der variablen Antikörperdomäne;
Identifizieren von Aminosäureresten innerhalb der Region, die möglicherweise mit der Zielbindung zusammenhängen, auf Basis von experimentellen Daten;
Bestimmen des jeweiligen Zugänglichkeitsgrades der einzelnen identifizierten Aminosäurereste innerhalb der dreidimensionalen Struktur am Computer;
Auswählen mehrerer Aminosäurereste, denen Zielbindungsaktivität zugeordnet wird, aus den identifizierten Aminosäuren;
Bilden eines Mimetikums, das die Vielzahl an Aminosäuren umfasst, wobei die Aminosäuregruppen innerhalb des Mimetikums eine relative geometrische Anordnung aufweisen, die ihrer ermittelten relativen geometrischen Anordnung im Ausgangsantikörper entspricht;
Durchführen einer Moleküldynamik-Simulation des gebildeten Mimetikums am Computer;
Bestimmen aus der Simulation, ob das Mimetikum einem vorgegebenen Kriterium folgt;
Variieren der Bindungsstruktur, um ein zweites Mimetikum herzustellen, das dem vorgegebenen Kriterium besser folgt.
Ein Verfahren zur Identifizierung innerhalb eines Ausgangsmoleküls, das dafür bekannt ist, die vorgegebene Aktivität aufzuweisen, von zumindest einer chemischen Gruppe des Ausgangsmoleküls, das mit dieser Aktivität verbunden ist, kann folgende Schritte umfassen:
Bestimmen der dreidimensionalen Struktur zumindest eines Abschnitts des Ausgangsmoleküls am Computer, wobei der Abschnitt eine aktive Region des Ausgangsmoleküls umfasst;
Auswählen mehrerer chemischer Gruppen innerhalb der aktiven Region, die potentiell mit Aktivität verbunden ist, auf Basis von experimentellen Daten;
Bestimmen des jeweiligen Zugänglichkeitsgrades der einzelnen ausgewählten chemischen Gruppen innerhalb der dreidimensionalen Struktur am Computer; und
Identifizieren zumindest einer chemischen Gruppe, die mit Aktivität verbunden ist, aus den ausgewählten chemischen Gruppen, basierend auf ihrem jeweiligen Zugänglichkeitsgrad.
In den Anweisungen zu den Verfahren gemäß der Erfindung ist die Reihenfolge der Schritte nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung zu betrachten. Beispielsweise kann das 3D-Modell gebildet werden, nachdem die chemischen Gruppen ausgewählt wurden.
Die experimentelle Auswahl potentiell aktiver chemischer Gruppen kann die folgenden Schritte umfassen: Auswahl mehrerer Abschnitte der aktiven Region des Ausgangsmoleküls, wobei jeder Abschnitt eine Reihe chemischer Gruppen darstellt; experimentelles Bestimmen von Aktivität, die mit jeder Reihe verbunden ist; wiederholtes Auswählen einer chemischen Gruppe innerhalb jeder einzelnen Reihe und Modifizieren dieser chemischen Gruppe (z. B. durch Entfernen oder Ersetzen dieser Gruppe, beispielsweise durch chemische oder genetische Verfahren) und Bestimmen der durch diese Modifikation verursachten Aktivitätsveränderung; und Auswählen chemischer Gruppen aus der Reihe auf Grundlage der Aktivitätsveränderung.
Der Zugänglichkeitsgrad einer bestimmten chemischen Gruppe kann ein Maß für das Aussetzen dieser chemischen Gruppe im Ausgangsmolekül gegenüber einem Lösungsmolekül (wie etwa Wasser mit oder ohne Ionen) oder einem Zielmolekül, an das Ausgangsmolekül bindet, sein.
Das Verfahren kann einen weiteren Schritt zum Entwerten, oder gegebenenfalls chemischen Synthetisieren, eines Moleküls, einschließlich der identifizierte(n) chemische(n) Gruppe(n), umfassen, um als Mimetikum zu agieren.
Ein Mimetikum kann durch die vorliegende Erfindung so entworfen werden, dass es die Faltungsstruktur des Ausgangsmoleküls (d. h. wie die aktive Region des Moleküls dreidimensional gefaltet ist) in Betracht zieht. Umfasst das Ausgangsmolekül eine Schleife, an der zumindest eine erste aktive chemische Gruppe angeordnet ist, und zumindest eine zweite aktive chemische Gruppe, die nicht auf der Schleife angeordnet ist, so ist das Mimetikum so beschaffen, dass es einen zyklischen Abschnitt, der die erste(n) chemische(n) Gruppe(n) umfasst, und außerhalb des zyklischen Abschnitts die zweite(n) chemische(n) Gruppe(n) umfasst.
Vorzugsweise umfassen im Verfahren zum Entwerfen eines Mimetikums einer Antikörperbindungsregion die Aminosäurereste, die mit Zielbindung verbunden sind, zumindest einen ersten Rest, der auf einer ersten Schleife der variablen Antikörperdomäne angeordnet ist, und zumindest einen zweiten Rest, der nicht auf der ersten Schleife der variablen Antikörperdomäne angeordnet ist; und es wird ein Mimetikum entworfen, das einen ersten zyklischen, den ersten Rest umfassenden Abschnitt und außerhalb des ersten zyklischen Abschnitts den zweiten Rest umfasst.
Vorzugsweise umfasst zumindest ein bestimmter Teil des inaktiven Teils des Mimetikums (d. h. zumindest ein bestimmter Teil des Mimetikums, der nicht zu den aktiven chemischen Gruppen gehört) eine oder mehrere chemische Gruppen ("chemische Gerüstgruppen"), die im Ausgangsmolekül proximal zu den aktiven chemischen Gruppen vorhanden sind, von denen selbst jedoch nicht bekannt ist, dass sie aktiv sind. Beispielsweise können die chemischen Gerüstgruppen chemische Gruppen sein, von denen nicht angenommen wird, dass sie potentiell aktiv sind (beispielsweise wurden diese Gruppen während des experimentellen Auswahlvorgangs nicht als aktiv identifiziert), oder von denen angenommen wird, dass sie für das Target im Ausgangsmolekül nicht zugänglich sind, oder sie können eine Kombination daraus sein.
Sind die aktiven chemischen Gruppen im Ausgangsmolekül so angeordnet, dass auf jeder ersten Schleife und zweiten Schleife des Ausgangsmoleküls eine oder mehrere aktive chemische Gruppen vorhanden sind, dann kann das Mimetikum so entworfen sein, dass es zwei zyklische Abschnitte umfasst, wovon jeder einzelne die aktiven chemischen Gruppen der jeweiligen Schleife umfasst. Vorzugsweise besteht die Bindungsstruktur innerhalb des Mimetikums zwischen den zyklischen Abschnitten aus strukturellen Elementen, die die relative Ausrichtung der zyklischen Abschnitte aufrechterhalten, um der relative Ausrichtung der Schleifen innerhalb des Ausgangsmoleküls zu gleichen.
Ist beispielsweise zumindest ein zweiter Rest auf einer zweiten Schleife der variablen Antikörperdomäne angeordnet, kann das Mimetikum einen ersten, den Rest einschließenden, zyklischen Abschnitt und außerhalb des ersten zyklischen Abschnitts einen zweiten, zumindest den zweiten Rest einschließenden, zyklischen Abschnitt umfassen.
Dieses Schema kann auf jene Fälle ausgedehnt werden, in denen die in das Mimetikum einzubindenden, aktiven chemischen Gruppen chemische Gruppe(n) einbinden, die auf drei, vier oder sogar mehr Schleifen des Ausgangsmoleküls angeordnet sind. Das Mimetikum kann zahlreiche zyklische Abschnitte, die der Anzahl dieser Schleifen entsprechen, enthalten, worin jeder zyklische Abschnitt die jeweilige(n) aktive(n) Gruppe(n) umfasst.
Beispielsweise können die Verfahren der Erfindung zweimal oder öfter durchgeführt werden, wobei bei jeder Gelegenheit ein erstes Molekül entworfen wird, das zumindest einen zyklischen Abschnitt, der (eine) aktive Gruppe(n) enthält, und (eine) weitere aktive Gruppe(n) außerhalb des zyklischen Abschnitts aufweist. Anschließend kann ein zweites Molekül basierend auf den zwei (oder mehreren) ersten Molekülen abgeleitet werden, das im Wesentlichen die gesamte Struktur der ersten beiden Moleküle enthält. Ist beispielsweise das Ausgangsmolekül ein Antikörper, so kann das erste Molekül auf den aktiven Gruppen der CDR3 der Schwerkette und der CDR 3 der Leichtkette basieren, während ein anderes erstes Molekül auf den aktiven Gruppen der CDR2 der Schwerkette und der CDR 2 der Leichtkette basieren kann. Die zwei ersten Moleküle könnten verbunden werden, um ein Mimetikum zu bilden, das solche Strukturen aufweist, die sowohl die CDR2 als auch die CDR3 der Schwer- und der Leichtketten nachahmen können.
Das Verfahren kann einen weiteren Schritt chemischer Synthese umfassen, in dem ein durch das Verfahren der Erfindung entworfenes Molekül chemisch synthetisiert wird.
Während das Mimetikum in seiner Topologie die Faltungsstruktur des Ausgangsmoleküls nachahmen (wenn nicht notwendigerweise replizieren) kann, könnte eine Alternative auch sein, sich auf das Herstellen eines Mimetikum zu konzentrieren, in dem die aktiven chemischen Gruppen die relative geometrische Beziehung zueinander aufweisen, die sie im Ausgangsmolekül haben, wenn sich auch die Struktur, die sie verbindet, topologisch von jener des Ausgangsmoleküls unterscheidet.
Es kann ein Mimetikum entworfen werden, in dem die geometrische Beziehung zwischen aktiven chemischen Gruppen der geometrischen Beziehung zwischen den entsprechenden chemischen Gruppen im Ausgangsmolekül, wie sie vom Ausgangspunkt des Zielmoleküls gesehen wird, entspricht, z. B. wie sie von der Vorderseite des Ausgangsmoleküls aus, mit dem das Zielmolekül wechselwirkt, gesehen wird.
Ein Verfahren zum Entwerfen einem Mimetikums, das mit einem Ausgangsmolekül verbundene Aktivität aufweist, kann Folgendes umfassen:
das Identifizieren zahlreicher chemischer Gruppen des Ausgangsmoleküls, die mit Aktivität verbunden sind;
das Bestimmen der relativen geometrischen Beziehung zwischen den chemischen Gruppen innerhalb des Ausgangsmoleküls, wie es aus einer Richtung gesehen wird;
das Bilden eines Mimetikums, umfassend eine Vielzahl an chemischen Gruppen, wobei die chemischen Gruppen innerhalb des Mimetikums eine relative geometrische Anordnung aufweisen, die ihrer ermittelten relativen geometrischen Anordnung im Ausgangsmolekül entspricht.
Neben den aktiven chemischen Gruppen umfasst das Mimetikum eine Bindungsstruktur, die aus chemischen Bindungsgruppen besteht, die die aktiven Gruppen so verbinden, dass sie im Wesentlichen der Geometrie jener aktiven chemischen Gruppen im bekannten Molekül entsprechen. Solche chemischen Bindungsgruppen können chemische Gruppen desselben Typs wie jene sein, aus denen das Ausgangsmolekül besteht. Sie können sogar Abschnitte des Ausgangsmoleküls sein. Ist das Ausgangsmolekül beispielsweise ein Protein, so könnten die chemischen Bindungsgruppen Aminosäuren sein, wobei jedoch auch eine Bindungsstruktur verwendet werden könnte, die nicht peptidischer Natur ist.
Vorzugsweise werden chemische Bindungsgruppen unter Bezugnahme auf die dreidimensionale Struktur des Ausgangsmoleküls oder Abschnitte davon ausgewählt. Die Bindungsstruktur ist vorzugsweise so entworfen, dass die geometrische Anordnung der aktiven Gruppen jene dieser Gruppen im Ausgangsmolekül nachahmen, wenn sie aus einer Richtung betrachtet werden. Die aktiven Gruppen des Ausgangsmoleküls weisen, aus einer Richtung betrachtet, eine bestimmte geometrische Anordnung auf. Wird ein Ausgangsmolekül aus einer Richtung betrachtet, so kann von den aktiven Gruppen angenommen werden, dass sie in einem Abschnitt gemäß dieser Ansicht angeordnet sind.
Die Bindungsgruppen werden vorzugsweise so ausgewählt, dass sie die Anordnung der aktiven Gruppen innerhalb dieses Abschnitts aufrechterhalten. Es kann weitere chemische Gruppen oder Atome geben, d. h. andere neben den aktiven Gruppen, die innerhalb dieses Abschnitts im Ausgangsmolekül zu finden sind. In diesem Fall ist die Bindungsstruktur vorzugsweise so angeordnet, dass diese weiteren Gruppen oder Atome innerhalb der Bindungsstruktur gehalten werden und dass die Anordnung der Atome in diesem Abschnitt aufrechterhalten wird. So kann ein Mimetikum entworfen werden, in dem aktive Gruppen und weitere chemische Gruppen, die im Abschnitt liegen, miteinander verbunden sind. Gruppen (oder die Gruppierungen der Hauptkette, an die diese Gruppen gebunden sind), die im Ausgangsmolekül nicht zusammenhängend sind, werden durch die Bindungsstruktur zu einer zusammenhängenden Struktur zusammengefügt.
Ist beispielsweise das Ausgangsmolekül ein Protein, so können Aminosäure-Seitenketten vorhanden sein, die in dieselbe Richtung vorstehen wie die aktiven Aminosäuren. Das Mimetikum ist vorzugsweise so entworfen, dass diese Seitenketten im Mimetikum vorhanden sind. So können Aminosäuren-Seitenketten, die in der Primärsequenz nicht nebeneinander liegen, im Mimetikum zusammengebracht werden. Vorzugsweise wird die Bindungsstruktur so ausgewählt, dass diese Seitenketten im Mimetikum dieselbe Ausrichtung wie im Ausgangsmolekül aufweisen. Die Bindungsstruktur kann peptidisch oder nicht peptidisch sein, sodass für geeignete Ausrichtung der Seitenketten gesorgt werden kann.
Die Erfindung schlägt ganz allgemein vor, dass ein Mimetikum so ausgewählt wird, dass es zahlreiche aktive chemische Gruppen aufweist, die über eine Bindungsstruktur verbunden sind, und dass Moleküldynamik-Simulation zum Einsatz gebracht wird, um die Bindungsstruktur auszuwählen.
Im Verfahrensschritt des Veränderns des ersten Mimetikums, um das zweite Mimetikum herzustellen, kann die Bindungsstruktur durch Hinzufügen zu oder Ersatz von den Aminosäuren, die in die Bindung im ersten Mimetikum eingebunden sind, durch eine oder mehrere Aminosäuren variiert werden, wenn das Ausgangsmolekül beispielsweise ein Protein ist. Beispielsweise könnten Aminosäuregruppen unterschiedlicher chemischer Beschaffenheit verwendet werden, beispielsweise könnten hydro phile Gruppen durch hydrophobe Gruppen wie Valin oder Leucin ersetzt werden. Prolin könnte verwendet werden, um "Knickstellen" bereitzustellen, die charakteristischerweise durch das Einführen von Prolin in Peptide hergestellt werden. Auf diese Weise können weitere Mimetika entworfen werden, in denen die aktiven Gruppen über verschiedene chemische Verbindungsgruppen verbunden sind. Das Variieren der chemischen Bindungsgruppen kann zu einer Variation der Geometrie der chemischen Bindungsgruppen und somit der Geometrie des Mimetikums führen, z. B. zu einer Form, die der Faltungsstruktur des Ausgangsmoleküls ähnlich ist. Durch Einführen chemischer Bindungsgruppen, die im Ausgangsmolekül vorhanden sind, kann beispielsweise die Stabilität oder Konformation des Mimetikums verbessert werden.
Gegebenenfalls kann das zweite Mimetikum auch selbst variiert werden, um ein drittes Mimetikum zu bilden, das demselben (oder einem anderen) Kriterium besser folgt als das zweite Mimetikum. In anderen Worten wäre es möglich, dieses Verfahren zu wiederholen.
Obwohl im Verfahren der Erfindung die Molekülsimulation verwendet wird, um ein verbessertes zweites Mimetikum herzustellen (d. h. als Teil des Entwurfverfahrens), hat das Screenen potentieller Mimetika auf Grundlage eines Kriteriums, das auf Moleküldynamik-Modellierung basiert, einen breiteren Anwendungsbereich. Beispielsweise kann es nach einem Schritt des Entwerfens zahlreicher potentieller Mimetika als Möglichkeit zur Bestimmung verwendet werden, welche der Molekülserien wert sind, synthetisiert zu werden.
Moleküldynamik wird zur Modellierung verwendet, um potentielle Mimetika zu screenen, die "virtuelle Moleküle" sind (d. h. die nicht notwendigerweise physisch existent sind, jedoch als Repräsentationen innerhalb eines Computers bestehen oder auf einem Aufzeichnungsmedium gespeichert sind), um zu identifizieren, welche der potentiellen Mimetika wert sind, synthetisiert zu werden.
Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Mimetikum die Aktivität eines Ausgangsmoleküls aufweist, wird mittels Durchführung einer Moleküldynamik-Simulation des gesamten Mimetikums oder eines Teils davon (wie nachstehend erläutert wird) und Bewertung durch ein Kriterium, das auf der Moleküldynamik-Simulation basiert, bewertet. Ein Molekül, dessen Bewertung zeigt, dass es wahrscheinlich die Aktivität aufweist, kann dann synthetisiert und seine Aktivität experimentell, in vitro und/oder in vivo, getestet werden.
Die Bewertung eines Mimetikum kann die Durchführung einzelner Moleküldynamik-Simulationen an Teilen des Mimetikums einbinden. Auf diese Weise kann ein Mimetikum, das synthetisiert wird, aus einer Serie von Bewertungen von Moleküldynamik-Simulationen von Teilen des Mimetikums entstehen. Umfasst beispielsweise das Mimetikum eine oder mehrere Schleife(n), kann es durch Moleküldynamik-Simulationen jeder einzelnen Schleife bewertet werden.
Nach dem Entwerfen eines Mimetikums kann das Mimetikum mittels Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, synthetisiert werden. Solche Verfahren sind hierin an anderer Stelle erläutert.
Die Mimetika weisen vorzugsweise eine Anordnung aktiver chemischer Gruppen auf, die der Anordnung jener aktiven chemischen Gruppen des Ausgangsmoleküls ähnlich sind.
Ein durch die Erfindung bereitgestelltes Mimetikum kann zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden.
Die Anwendbarkeit der Erfindung wird nachstehend unter Verweis auf eine pharmazeutische Anwendung beschrieben, wobei jedoch die Erfindung prinzipiell in anderen chemischen Bereichen anwendbar ist, beispielsweise zur Bildung von Pestiziden oder anderer landwirtschaftlich eingesetzter Chemikalien.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Sequenzanogleichung von ST40. Die CDR-Schleifen sind unterstrichen. Die wichtigen (fettgedruckt) und weniger wichtigen (fettgedruckt, kursiv) Aminosäurereste sind dargestellt. Die Reste, die ausgewählt wurden, um in das Mimetikum eingebunden zu werden, sind in Kästchen abgebildet.
2 ist eine Banddarstellung der 3D-Struktur von ST40 und eine Lokalisierung der wichtigen (schwarz) und weniger wichtigen (dunkelgrau) Aminosäurereste, bestimmt mittels Alanin-Scanning. Der Cut-off für Reste mit oder ohne Zugänglichkeit zum Antigen ist durch die strichlierte Linie angegeben. Über der Linie befindet sich die Bindungsoberfläche der CDR, und unter der Linie befindet sich die Oberfläche, die mit der konstanten Domäne des Antikörpers wechselwirkt. Die Regionen, in denen aktive Aminosäuren ausgewählt und ausgeschlossen werden, sind also als über bzw. unter der Linie situiert definiert.
3 zeigt eine Banddarstellung der CDR von ST40 (von oben). Die dafür ausgewählten Aminosäuren, im Mimetikum eingeschlossen zu sein, sind in Schwarz dargestellt.
4 zeigt eine raumfüllende Darstellung der Mimetikum-3D-Struktur mit einem Lys, verlängert durch eine 3-Mercaptopropionsäure- (3MP-) Gruppe. Die Struktur ist die mittlere Struktur der 100 letzten ps einer Moleküldynamik von 300 ps (vor Mutation). Die Aminosäure Ile wurde zu einem Lys, verlängert durch 3-MP, in Schwarz dargestellt, mutiert.
5 zeigt (A) ein Sensorgramm von CD4 und irrelevante Proteine (8A6, 9E8, TnC), wenn das Mimetikum auf dem Sensorchip immobilisiert ist; und (B) ein Sensorgramm der Bindungskonkurrenz durch Injektion von prä-inkubiertem CD4 + ST40 und CD4 + 9E8, wenn das Mimetikum auf dem Sensorchip immobilisiert ist.
6 zeigt die Fragmente von ST40 (grau), die für die Dynamik-Simulation in Wasser eingesetzt werden.
7 ist eine Darstellung von H3-, L1- und L3-CDR während der MD-Simulation von ST40, wenn alle Aminosäuren außer H3, L1 und L3 fixiert sind (schwarz: anfängliches Konformer, grau: Konformer bei 50, 100, 150, 200, 250 und 300 ps der MD-Simulation).
8 ist eine Darstellung von H3-, L1- und L3-CDR während der MD-Simulation von ST40 mit Ionen (schwarz. anfängliches Konformer, grau: Konformer bei 50, 100, 150, 200, 250 und 300 ps).
9 zeigt eine PCA-Darstellung (cp1, cp2) der zwei MD-Simulationen von ST40. Das Autokorrelogramm wurde nur für die Hauptkette der Aminosäuren berechnet, die sich während der MD bewegen durften (grau: ohne Ionen; schwarz: mit Ionen).
10 ist eine Darstellung der H3-Mimetika R und E. Die anfänglichen Konformationen sind in Grau und die Konformationen nach 100 ps in Schwarz dargestellt.
11 ist eine Darstellung des H3L1-Mimetikums RM. Die anfängliche Konformation ist in Grau und die Konformation nach 100 ps MD in Schwarz dargestellt.
12 ist eine Darstellung des H3L1-Mimetikums EC. Die anfängliche Konformation ist in Grau und die Konformation nach 100 ps MD in Schwarz dargestellt.
13 ist eine Darstellung von Cα-Atomen von EC2. Die anfängliche Konformation ist in Schwarz und die Konformationen bei 50, 80, 100, 120 und 150 ps sind in Grau dargestellt.
14 zeigt die PCA-Darstellung (cp1, cp2) der MD-Simulation von ST40 (schwarz) und EC2 (grau).
15 ist eine Darstellung des H3L1 L3-Mimetikums E[WFK]2.
16 ist eine Darstellung der H3L1 L3-Mimetika a) E[WFK]2 und b) E[WFK]3. Die anfänglichen Konformationen sind in Schwarz und die Konformationen nach 300 ps in Grau dargestellt.
17 zeigt eine PCA-Darstellung (cp1, cp2) der MD-Simulation von ST40 (schwarz), E[WFK]2 (dunkelgrau) und E[WFK]3 (hellgrau).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Molekül
Die Bezeichnung "Molekül" wird hierin verwendet, um chemische Verbindung mit hohem Molekulargewicht (sogar bis hin zu "Makromolekülen"), umfassend Proteine, einzubinden. Bei sehr großen Proteinen, z. B. Faktor XIII (Molekulargewicht etwa 300 kDa) oder große Proteine, z. B. Antikörper (Molekulargwicht 100–200 kDa), kann ein geringer Anteil des Proteins modelliert werden, wenn geeignet. Beispielsweise kann die variable Region eines Antikörpers modelliert werden, in diesem Fall würde das Modell von einer Region mit etwa 50–400 Aminosäuren sein. Für ein mittelgroßes Protein, z. B. Lysozym (Molekulargewicht 15 kDa), kann das Modell auf der gesamten Struktur aufbauen, könnte jedoch auch auf einem Teil der Struktur basieren, z. B. auf aktiven Stellen. Kleine Moleküle können auch modelliert werden, beispielsweise könnten Epitope modelliert werden (kleine Regionen von Antigenen, die bekannt sind, Antikörper zu binden), die eine Größe im Bereich von 5 bis 10 Aminosäuren aufweisen.
Dreidimensionale Modelle
In dieser Anmeldung ist unter der Bezeichnung 3D-Modell eine dreidimensionale Struktur zu verstehen, die mittels eines Computers dargestellt wird. Die Darstellung kann von ersten Grundlagen unter Verwendung von Molekülmodellierungsverfahren abgeleitet sein oder können, alternativ dazu, jegliche erhältliche Daten aus Kristallo graphie oder magnetischer Kernresonanz oder strukturellen Vorhersagen basierend auf Homologie-Datenbanken einbauen.
Faltungsstrukturen
Die Faltungsstrukturen eines Moleküls beziehen sich auf die dreidimensionale Anordnung der chemischen Gruppen dieses Moleküls. Ist das Molekül ein Protein, umfasst die Faltungsstruktur die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur der Peptidketten. Ähnliche RNA-Faltungsstrukturen sind entweder ein Ergebnis von RNA-Sekundärstruktur, z. B. T-RNA-ähnliche Strukturen, die in die Replikation mancher RNA-Viren eingebunden sind, oder von Tertiärstrukturen, z. B. Pseudoknoten, oder einer Kombination daraus.
Bilden eines Mimetikums
Das Bilden eines Mimetikums bezieht sich sowohl auf das Bilden im Sinne physischer Synthese des Moleküls als auch auf das Bilden eines virtuellen Moleküls am Computer.
Aminosäuren
Aminosäuren können jegliche natürlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende Aminosäuren sein, umfassend saure, basische, hydrophobe, hydrophile, polare, große, kleine oder exotische α-Aminosäuren und jegliche andere Aminosäurenverbindungen. Dies umfasst D-Aminosäuren, und Aminosäurederivate, wie alkylierte (z. B. methylierte oder acetylierte), hydroxylierte, phosphorylierte oder glykosylierte Aminosäuren, sind auch inbegriffen.
Ausgangsmolekül
Ein Ausgangsmolekül ist ein Molekül, das nachgeahmt werden soll. Das Ausgangsmolekül hat eine Funktion, die nachgeahmt werden soll, und das Mimetikum soll diese Funktion übernehmen. Üblicherweise weist das Ausgangsmolekül eine Aktivität auf, die es nachzuahmen gilt, und kann als ein "aktives Ausgangsmolekül" bekannt sein. Typischerweise Wechselwirken Ausgangsmoleküle mit einem zweiten Molekül, das als das "Zielmolekül" bezeichnet wird, und die Aktivität oder Funktion des Ausgangsmolekül kann sich auf das Binden an das Target oder eine nachgeordnete Wirkung dieser Bindung, z. B. biologische Aktivität, beziehen. Die Erfindung ist allenfalls nicht auf den Fall eingeschränkt, in dem das Ausgangsmolekül mit einem Target wechselwirkt.
Die Erfindung ist besonders gut an oligomeren oder polymeren Molekülen anwendbar, die eine inhärente dreidimensionale Struktur aufweisen.
Das Ausgangsmolekül kann ein Protein sein, beispielsweise ein Antikörper, wobei jedoch die Bezeichnung "Ausgangsmolekül" in dieser Hinsicht nicht eingeschränkt ist (wie nachstehend erläutert wird) und auch andere Proteinmoleküle (umfassend Glykoproteine), z. B. Enzyme, Rezeptoren, Antigene und Hormone, umfasst. Andere bioaktive Moleküle, die nachgeahmt werden könnten, umfassen Kohlenhydrate und Nucleinsäuren (z. B. das Nachahmen von RNA-Sekundär- und/oder -Tertiärstrukturen). Die Erfindung umfasst das Nachahmen der aktiven Oberflächen anorganischer Moleküle, wie anorganische polymere Moleküle oder die aktiven Stellen von Katalysatoren.
Die Ausgangsmoleküle der Erfindung können ein natürlich vorkommendes Molekül, z. B. natürlich vorkommende Antikörper, oder Teile von Molekülen sein. Sie können auch synthetische Ausgangsmoleküle, z. B. synthetische Antikörperfragmente (siehe unten), sein. Die Erfindung kann verwendet werden, um Mimetikum-Peptide aus Peptiddisplay-Bibliotheken, z. B. Peptide, die aus einer Phagendisplay-Bibliothek aufgrund ihrer Bindung an ein bestimmtes Target ausgewählt wurden, nachzuahmen, in diesem Fall wäre es möglich, ein Peptid mit einer bestimmten Bindungsaktivität, aus der Bibliothek ausgewählt, nachzuahmen.
Die Ausgangsmoleküle bestehen aus zahlreichen chemischen Gruppen, z. B. sind in einem Protein die konstituierenden, chemischen Gruppen Aminosäuren, in einer Nucleinsäure sind die Konstituenten Nucleotide.
Bindungsmoleküle
Die Erfindung ist besonders relevant für Moleküle, die ein Target binden (Bindungsmolekül). Auf diese Weise könnten Mimetika des Bindungsmoleküls das Target binden; ist das Target beispielsweise ein Zelloberflächenrezeptor, so könnten Mimetika für Antikörper gegen die Zelloberflächenrezeptoren hergestellt werden, und diese Mimetika könnten den Rezeptor hemmen.
Mimetika können entweder für das Ausgangsmolekül oder sein Target hergestellt werden, in anderen Worten kann ein Mimetikum für jedes Element einer Bindungswechselwirkung hergestellt werden. Mimetika könnten entweder für den Antikörper oder das Antigen in einer Antigen-Antikörper-Wechselwirkung hergestellt werden. Daher könnten antigene Epitope nachgeahmt werden, wobei dies die Epitope in Schleifen, die üblicherweise auf viralen Oberflächen zu finden sind, z. B. bestimmte Epitope von Rhinoviren, menschliches Immunschwächevirus und Polioviren, einbinden würde.
Mitglieder der Immunglobulin-Oberfamilie
Die vorliegende Erfindung ist zur Herstellung von Mimetika für die Mitglieder der Immunglobulin-Oberfamilie, umfassend Antikörper, T-Zell-Rezeptoren, MHC-Moleküle (HLA bei Menschen) und andere Zelloberflächen-Rezeptoren wie insbesondere N-CAM-Antikörpermoleküle, geeignet. Die Erfindung ist für das Nachahmen von Antikörpern besonders relevant.
Die Bezeichnung "Antikörper" sollte so verstanden werden, dass sie jegliche Bindungssubstanz umfasst, die eine Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität aufweist. So umfassen die Ausgangsmoleküle der Erfindung Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, umfassend synthetische Moleküle und Moleküle, deren Form jene eines Antikörpers nachahmt, was sie in die Lage versetzt, ein Antigen oder Epitop zu binden.
Beispiele für Antikörperfragmente, die in der Lage sind, ein Antigen oder einen anderen Bindungspartner zu binden, sind die Fab-Fragmente, bestehend aus VL-, VH-, C1- und CH1-Domänen; die Fd-Fragmente, bestehend aus den VH- und CH1-Domänen; die Fv-Fragmente, bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers; die dAb-Fragmente, die aus einer VH-Domäne bestehen; isolierte CDR-Regionen und F(ab')2-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, umfassend zwei Fab-Fragmente, die über eine Disulfidbrücke an der Gelenkregion verbunden sind. Einkettige Fv-Fragmente sind ebenfalls eingebunden.
Zelloberflächenrezeptoren
Wie zuvor erwähnt umfasst die Erfindung Mimetika für Zelloberflächenrezeptoren der Immunglobulin-Oberfamilie, z. B. T-Zell-Rezeptoren und N-CAM. Die Erfindung umfasst auch andere Zelloberflächenrezeptoren, z. B. die Mitglieder der Familie der Integrine von Zelloberflächenrezeptoren.
Andere Ausgangsmoleküle
Ausgangsmolekül kann jegliches Molekül sein, für welches ein 3D-Modell von zumindest einem Teil des Moleküls besteht oder angefertigt werden kann. Beispielsweise kann das Ausgangsmolekül ein Enzym sein. Dies umfasst Proteasen, wie die Serin-Proteasen (z. B. Chymotrypsin), Polymerasen, Replikasen, Telomerasen, Transkriptasen, Ribonucleasen und zahlreiche andere Enzyme, die Fachleuten bekannt sind. Andere mögliche Ausgangsmoleküle umfassen Insulin, Tumornekrose-Faktor, Gewebe-Plasminogen aktivierender Faktor.
Zielmolekül
Das Zielmolekül ist ein Molekül, das mit dem Ausgangsmolekül über Wechselwirkung mit den aktiven chemischen Gruppen der aktiven Region dieses Ausgangsmoleküls wechselwirkt. Ist das Molekül ein Katalysator, könnte das Target der Reaktant oder das Produkt oder das Zwischenprodukt Reaktant-Produkt-Komplex sein. Ist das Molekül ein Enzym, könnte das Target das Substrat oder die Substrat-Produkt-Intermediate oder das Produkt sein. Ist das Molekül ein Antikörper, würde das Target das Antigen oder Epitope dieses Antigens sein. Wie zuvor erwähnt könnten Moleküle, die herkömmlich als Targets angenommen wurden, z. B. Epitope, auch durch die Verfahren dieser Erfindung nachgeahmt werden, wobei hierbei ein Epitop das "Ausgangsmolekül" wäre.
Aktive Region
Im Allgemeinen ist eine aktive Region jene Region des Ausgangsmoleküls, die für die Aktivität des Moleküls verantwortlich ist. Oft stellt die aktive Region nur einen geringen Anteil des gesamten Moleküls dar. Aktive Regionen umfassen die aktiven Stellen katalytischer Moleküle und Enzyme und Bindungsstellen von Antikörpern usw. Typischerweise ist die aktive Region in die Wechselwirkung mit einem Zielmolekül eingebunden.
Sofern das Ausgangsmolekül ein Protein ist, kann die aktive Region einen oder mehrere Schleifenabschnitte ("Schleifen") einschließen, und jede Schleife kann mehrere Dutzend Aminosäurereste enthalten. Diese Schleifen entstehen durch die Faltungsstruktur des Proteins. Schleifen können auch in Nucleinsäure-Ausgangsmolekülen, umfassend Nucleoproteine, gefunden werden.
Aktive chemische Gruppen
Aktive chemische Gruppen sind jene chemischen Gruppen des Ausgangsmoleküls, die mit der Aktivität dieses Moleküls verbunden sind. Diese aktiven chemischen Gruppen stellen typischerweise einen relativ geringen Anteil der Gesamtzahl chemischer Gruppen in der aktiven Region dar.
Ist das Ausgangsmolekül beispielsweise ein Protein, so würden diese aktiven chemischen Gruppen individuelle Aminosäuren innerhalb der aktiven Region sein, die eine direkte Rolle bei der Aktivität dieses Proteins spielen. Ist das Protein ein Enzym, würden die aktiven chemischen Gruppen jenen Aminosäureresten aus der aktiven Region entsprechen, die direkt in die mit dem Enzym verbundenen Reaktionen eingebunden sind, z. B. in die Wechselwirkung mit dem Substrat oder den Atomtransfer innerhalb des Enzym-Substrat-Komplexes. Ist das Protein ein Antikörper, würden die aktiven chemischen Gruppen die Aminosäuren sein, die in Antigenbindung eingebunden sind.
In dem Fall, in dem das bekannte Molekül ein Protein ist, kann dieser Aspekt der aktiven chemischen Gruppen (Aminosäuren) getrennt in der Primärsequenz des Ausgangsproteins angeordnet sein. Beispielsweise können eine oder mehrere für die Simulation identifizierte Aminosäuren an verschiedenen Strängen des Ausgangsproteins gemäß der bekannten Struktur angeordnet sein.
Insbesondere wenn das Ausgangsmolekül ein Antikörper ist, ist es wünschenswert, dass das Mimetikum aktive chemische Gruppen umfasst, die sich sowohl von den Leicht- als auch der Schwerketten dieses Antikörpers ableiten, insbesondere von den komplementaritätsbestimmenden Regionen sowohl der Leicht- als auch der Schwerketten des Antikörpers. Vorzugsweise umfasst das Mimetikum die aktivste aller CDR, üblicherweise ist dies CDR 3 der Schwerkette. Aktive chemische Gruppen können auch in der Gerüstregion des Antikörpers gefunden werden. Sofern Gruppen als "aktiv" identifiziert werden, werden sie in das Mimetikum eingebunden.
Chemische Gerüstgruppen
Wie bereits zuvor erwähnt stellen die aktiven chemischen Gruppen üblicherweise nur einen geringen Anteil der aktiven Region dar. Die aktive Region umfasst auch chemische Gruppen, von denen der Großteil nicht direkt in die Wechselwirkung mit einem Target eingebunden sind. Diese Gruppen werden hierin als nicht aktive chemische Gerüstgruppen bezeichnet. Chemische Gerüstgruppen halten im Allgemeinen die aktiven chemischen Gruppen in korrekter Ausrichtung, um die Aktivität des Moleküls auszuführen.
Identifikation chemischer Gruppen, die mit Aktivität verbunden sind
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden aktive chemische Gruppen mittels einer Kombination aus i) experimenteller Auswahl potentiell aktiver chemischer Grup pen und ii) Bestimmung der Zugänglichkeit der potentiell aktiven chemischen Gruppen in ihren Anordnungen im Ausgangsmolekül am Computer identifiziert. Ein dreidimensionales Modell oder eine Röntgenstruktur des Ausgangsmoleküls ist erforderlich, um die Zugänglichkeit der chemischen Gruppen zu bestimmen.
i) Auswahl potentiell aktiver chemischer Gruppen auf Basis von experimentellen Daten
Die Auswahl aktiver Gruppen auf Basis von experimentellen Daten kann das Hervorbringen experimenteller Daten oder die Verwendung bekannter experimenteller Daten einbinden. Im ersten Fall kann dies die Schritte der Auswahl einer Region des Ausgangsmoleküls, des Änderns der chemischen Gruppen dieser Region und der Untersuchung der Auswirkungen dieser Änderungen auf die Aktivität des Moleküls umfassen. Insbesondere kann dies das Herstellen einer Bibliothek, die sich aus Abschnitten der aktiven Region zusammensetzt, umfassen, wobei jede Sektion eine Reihe chemischer Gruppen umfasst. Weiters werden die einzelnen chemischen Gruppen entweder durch Ersetzung, Deletion oder Modifikation geändert. Dies kann durch Herstellen einer weiteren Bibliothek von Abschnitten der aktiven Region erreicht werden, in der einzelne chemische Gruppen geändert worden sind.
Ist das Ausgangsmolekül ein Protein, kann dieser Ansatz die Herstellung einer Peptidbibliothek einbinden, die zumindest die aktive Region des Proteins umfasst. Diese Bibliothek kann mittels herkömmlicher chemischer Synthese oder durch rekombinante Mittel hergestellt werden. Die Modifikationen der Aminosäuren könnten entweder mittels chemischer Modifikation an den Aminosäureseitenketten oder mittels Substitution, Ersetzung oder Deletion der Aminosäuren durch chemische oder genetische Mittel erfolgen.
Substitutionen können konservative Substitutionen, worin Aminosäuren durch Aminosäuren ähnlicher chemischer Beschaffenheit ersetzt werden, und nicht konservative Substitutionen umfassen, worin Aminosäuren durch Aminosäuren unterschiedli cher Beschaffenheit ersetzt werden, wie es Fachleuten bekannt sein wird (nachstehend auch erläutert}. Alternativ dazu kann jede Aminosäure durch eine kleine aliphatische Aminosäure ersetzt werden, vorzugsweise Glycin oder Alanin. Beispielsweise kann das Alanin-Scanning-Verfahren zur experimentellen Bestimmung der potentiell aktiven chemischen Gruppen verwendet werden, worin Aminosäuren durch Alanin ersetzt werden.
Wie bereits erwähnt können die aktiven Gruppen, die in ein Mimetikum einzubinden sind, entweder durch die zuvor beschriebenen Selektionsverfahren oder auf Basis bestehender Daten ausgewählt werden. Tatsächlich kann ein Mimetikum Reste umfassen, die mittels beider der zwei Ansätze ausgewählt werden.
Beispiele für bestehende Daten, auf Grundlage derer die aktiven Gruppen ausgewählt werden können, umfassen Folgendes: aktive Gruppen können zur Einbindung in ein Mimetikum auf Basis struktureller Daten ausgewählt werden, z. B. Röntgenkristallographie oder NMR; Reste können gemäß Informationen aus genetischen Datenbanken ausgewählt werden, z. B. in Bezug auf den grundlegenden Konservierungsgrad chemischer Gruppen.
Bei bestimmten Enzymen ist beispielsweise (aus struktureller oder genetischer Analyse) bekannt, welche Aminosäuren bei der Bindung des Substrats eingebunden sind. Diese Reste können in ein Mimetikum eingebunden werden.
ii) Bestimmung der Zugänglichkeit potentiell aktiver chemischer Gruppen im Ausgangsmolekül mittels eines Computers
Der Zugänglichkeitsgrad kann ein numerisches Maß der Zugänglichkeit der chemischen Gruppe innerhalb des Ausgangsmoleküls sein. In diesem Fall kann/können die mit Aktivität verbundene(n) chemische(n) Gruppe(n) als jene unter den ausgewählten, potentiell aktiven chemischen Gruppen identifiziert werden, für die das numerische Maß über einem vorgegebenen Wert liegt.
Beispielsweise ist ein geeignetes numerisches Maß für den Zugänglichkeitsgrad die Oberfläche der chemischen Gruppe, die für das Lösungsmittel zugänglich ist.
Alternativ dazu kann der Zugänglichkeitsgrad als eine "Oberfläche" der aktiven Region des Ausgangsmoleküls definiert werden. Beispielsweise kann diese Oberfläche als eine Hülle der Molekülbewegungen der aktiven Region (bestimmt durch eine Moleküldynamik-Simulation) oder als ein Schnitt definiert sein, der durch die dreidimensionale Struktur des Ausgangsmoleküls gezogen wird, um die am besten zugänglichen Abschnitte des Ausgangsmoleküls vom Rest zu trennen. Der Zugänglichkeitsgrad einer chemischen Gruppen kann dann in Bezug auf diese Oberfläche bemessen werden, z. B. als eine Distanz zu dieser Oberfläche, oder hinsichtlich der Tatsache, ob die chemische Gruppe (z. B. hauptsächlich) auf der einen oder der anderen Seite der Oberfläche liegt.
Kriterien der Moleküldynamik
Kriterien der Moleküldynamik können verwendet werden, um zu bestimmen, welche aus einer Reihe virtueller Mimetika (d. h. Mimetika, die durch Computer hergestellt und nicht physisch synthetisiert wurden) eine Anordnung aktiver Gruppen aufweisen, die den aktiven chemischen Gruppen im Ausgangsmolekül am ähnlichsten sind.
Um die Faltungsstruktur der Mimetika mit der Struktur des Ausgangsmoleküls zu vergleichen, können Moleküldynamik-Simulationen von Regionen des Ausgangsmoleküls durchgeführt werden. Diese Moleküldynamik-Simulationen können dann zum Vergleich mit den Moleküldynamik-Simulationen der Mimetika verwendet werden. Beispielsweise können Simulationen von ausgewählten Schleifen durchgeführt werden, die aktive chemische Gruppen enthalten.
Mimetika können auf Basis eines vorgegebenen Kriteriums bestimmt und verändert werden, um das Ausmaß zu verbessern, mit dem das vorgegebene Kriterium befolgt wird.
Für ein vorgegebenes Kriterium ist eine erste Möglichkeit, dass das Kriterium die Flexibilität des Mimetikums (oder eines Teils von ihm) angibt, wie sie durch die Moleküldynamik-Simulation bestimmt ist. Vorzugsweise sollten die Mimetika Flexibilitätseigenschaften aufweisen, die den Flexibilitätseigenschaften der entsprechenden Region im Ausgangsmolekül ähnlich sind.
Alternativ, oder zusätzlich, dazu kann das Kriterium sein, dass die Ähnlichkeit zwischen der Zeitänderung der Konformation des potentiellen Mimetikums und jener des Ausgangsmoleküls über einem vorgegebenen Niveau liegt. Beispielsweise kann eine Analyse der grundlegenden Komponente der Bewegung in Bezug auf Zeit eines Abschnitts des Ausgangsmoleküls (erhalten durch eine Moleküldynamik-Simulation) und zumindest eines Teils des Mimetikums durchgeführt werden. Ähnlichkeit zwischen diesen beiden Zeitänderungen (die die Analyse der grundlegenden Komponente aufzeigt) würde darauf schließen lassen, dass die Anordnung der chemischen Gruppen im Mimetikum- der Anordnung der entsprechenden aktiven chemischen Gruppen im bekannten Molekül ähnlich ist und/oder würden darauf schließen lassen, dass das Mimetikum sehr wahrscheinlich die Aktivität des Ausgangsmoleküls aufweist.
In beiden Fällen ist es möglich, dass die potentiellen Mimetika zur Gänze simuliert werden. Alternativ dazu kann die Dynamik-Simulation für einen Teil des Mimetikums, umfassend zahlreiche Reste, die als Teil der aktiven Region identifiziert wurden, erfolgen.
Mimetikum
Die hierin verwendete Bezeichnung Mimetikum umfasst sowohl physisch bestehende Mimetika (z. B. synthetische Mimetika) und Mimetika, die nur virtuell in einer Computersimulation bestehen.
In diesem Dokument wird die Bezeichnung "Mimetikum" verwendet, um die Möglichkeit einzubinden, in der das Mimetikum die Aktivität des Ausgangsmoleküls, jedoch nur zu einem geringeren Ausmaß, aufweist (sofern beispielsweise der Aktivitätsgrad durch einen numerischen Index dargestellt ist, würde sich der Indexwert für das Mimetikum nur auf 50% des Indexwertes für das Ausgangsmolekül belaufen). Darüber hinaus würde die Bezeichnung "Mimetikum" sogar den Fall umfassen, in dem das Mimetikum tatsächlich höhere Aktivität als das Ausgangsmolekül aufweist.
Die Mimetika dieser Erfindung können jeglicher chemischer Beschaffenheit sein, die geeignet ist, die Aktivität des Ausgangsmoleküls nachzuahmen. Ist das Ausgangsmolekül ein Protein, dann könnte das Mimetikum aktive Aminosäuregruppen umfassen. Peptidmimetika werden nachstehend ausführlicher besprochen. Vorzugsweise ist das Mimetikum im Vergleich zum Ausgangsmolekül kurz oder klein. Es wird bevorzugt, dass die Mimetika der Erfindung 5 bis 50 Aminosäuren, noch bevorzugter 8 bis 40, und noch bevorzugter 10 bis 30 Aminosäuren, aufweisen.
Bei Nicht-Peptidmimetika kann die Größe (z. B. als eine Anzahl an Atomen definiert) ähnlich sein. Beispielsweise kann sie im Bereich von 5 bis 60 oder 8 bis 50 oder 10 bis 40 Aminosäuren liegen. Der Bereich kann sich von 500 bis 6.000 Da, vorzugsweise 800 bis 5.000 Da, noch bevorzugter 1.000 bis 4.000 Da, erstrecken.
Ein Mimetikum kann die Form einer oder mehrerer Schleifen, aktive chemische Gruppen umfassend, annehmen. Umfasst die Struktur des Mimetikums eine Schleife, wird bevorzugt, dass das Mimetikum mit einer chemischen Bindung, die innerhalb des Mimetikums gebildet wird, beispielsweise eine chemische Bindung, die von den chemischen Gruppen innerhalb des Mimetikums ausgehen, versehen ist und keine externen Matrizen benötigt. Vorzugsweise gehen solche Bindungen von chemischen Gerüstgruppen innerhalb des Mimetikums aus und nicht von den aktiven chemischen Gruppen. Ist das Mimetikum ein Peptid, umfassen solche Bindungen Amidbindungen und Disulfidbrücken oder andere Bindungen wie Ester-, Thio-Ester-, Ether- oder Thio-Ether-Bindungen.
Ein Mimetikum kann zwei oder mehrere Schleifen umfassen, die aktive chemische Gruppen einbinden. Dies kann bedeuten, dass, sofern das Ausgangsmolekül ein Protein ist, die Aminosäuregruppen, die in der primären Aminosäuresequenz weit voneinander entfernt sind, durch geeignete Bindungen in räumlich nahe Beziehungen gestellt werden. Andere Beispiele von Mimetikum-Strukturen umfassen eine Schleife, die mit einem linearen Peptid verbunden ist, zwei Schleifen, die miteinander verbunden sind, zahlreiche Schleifen, die miteinander verbunden sind, oder eine Kombination aus Schleifen und verbundenen linearen Peptiden.
Bindungsstruktur
Oft ist eine Art Bindungsstruktur erforderlich, um das Mimetikum in einer geeigneten Anordnung zu halten. Ist ein Schleifenmimetikum geeignet, kann die Bindungsstruktur eine einfache chemische Bindung sein, die von den chemischen Gruppen des Mimetikums ausgeht. Die Bindung kann von jeder der aktiven chemischen Gruppen oder der chemischen Gerüstgruppen des Mimetikums ausgehen. Dennoch wird bevorzugt, dass die Bindung von den chemischen Gerüstgruppen ausgeht. Ist das Mimetikum ein Peptid, kann eine chemische Bindung von den Aminosäuregruppen des Mimetikums ausgehen, z. B. von den Seitenketten dieser Aminosäuren.
Sind zahlreiche aktive chemische Gruppen verbunden, um die Geometrie dieser aktiven chemischen Gruppen mit einer Struktur, die sich topologisch vom Ausgangsmolekül unterscheidet, aufrechtzuerhalten, so kann die Bindungsstruktur mehr als einfache chemische Bindungen darstellen. In diesem Fall kann die Bindungsstruktur zusätzliche chemische Gruppen (chemische Bindungsgruppen) enthalten, von denen chemische Bindung ausgehen. Die Bindungsstruktur ist daher eine Kombination aus den chemischen Bindungsgruppen und den chemischen Bindungen, die von ihnen ausgehen.
Im Allgemeinen wird in beiden der zuvor beschriebenen Situationen die Bindungsstruktur verändert, um für die passende Anordnung der aktiven chemischen Gruppen im Mimetikum zu sorgen. Die Variation könnte durch Ersetzung, Deletion oder Ände rung der Bindungen oder chemischen Gruppen in der Bindungsstruktur durchgeführt werden.
Arten des Mimetikums
Folgend werden Peptidmimetika erläutert. Peptoide sind ein Beispiel für nichtpeptidische Mimetika. Anders als Peptide sind in Peptoidmolekülen die Seitenkettengruppen an Stickstoff und nicht an Kohlenstoff gebunden. Peptoide können durch die Polymerisation von N-substituierten Glycinresten synthetisiert werden. Die N-Substitutionen können an jeder geeigneten Seitenkette vorhanden sein, die in Aminosäuren gefunden werden, sodass N-Ala Glycin wäre, das mit CH₂ am N substituiert ist (siehe R.J. Simon et al., Peptoids: A Modular Approach to Drug Discovery, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9367–71 (1992)).
Nachstehend ist eine Peptoid-Hauptkette dargestellt:
Zusätzlich zu Peptoiden umfassen andere Mimetika z. B. Pseudopeptide, in die eine modifizierte Amidbindung eingeführt ist, z. B. Retro-inverso-Peptide, in denen die Amidbindung umgekehrt ist, und Peptidbindungsmimetika. Diese Mimetika sind in den folgenden Artikeln beschrieben: Emmons et al., Current Opinion in Biotechnology 8, 435–441 (1997); Olson et al., Journal of Medicinal Chemistry 8 (21), 3039–3049 (1993}; Fletcher und Campbell, Chem. Rev. 98, 763–795 (1998); Marraud et al., Biopolymers 33, 1135–1148 (1993); Gante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 1699–1720 (1994).
Aminosäuren können auch durch eine Kohlenhydrat-Hauptkette oder jegliche definierte Gerüst- und Matrizenmoleküle verbunden sein.
Tatsächlich kann jede geeignete Bindungsstruktur verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Anordnung aktiver Gruppen geeignet ist, um die Funktion des Ausgangsmoleküls nachzuahmen.
Peptidmimetika
Außer wenn anders angegeben sind die hierin beschriebenen Peptidsequenzen in herkömmlichem 1-Buchstaben-Code und in der N-terminalen zu C-terminalen Ausrichtung dargestellt.
Die Bezeichnung "umfassend" bedeutet "einschließlich" und ermöglicht die Gegenwart weiterer Aminosäuresequenzen oder anderer chemischer Gruppierungen an den N- und/oder C-Termini, vorausgesetzt, dass das Peptid in seiner Gesamtheit die, Aktivität des Ausgangsmoleküls beibehält. Mimetika der Erfindung umfassen die Sequenzen, Fragmente davon und Varianten dieser Sequenzen und Fragmente, wie zuvor definiert.
Die Erfindung betrifft auch Fusionspeptide, umfassend die zuvor beschriebenen Mimetika, die am N- oder C-Terminus oder beiden an weitere Peptid-Sequenzen} gebunden sind. Diese weitere(n) Sequenzen) können ausgewählt werden, um das resultierende Fusionspeptid mit zusätzlichen Funktionen auszustatten. Solche weiteren Sequenzen können unter Berücksichtigung des beabsichtigten Zwecks der Funktion von Fachleuten ausgewählt werden.
Die weitere Peptidsequenz kann eine Membran-Translokationssequenz sein, die in der Lage ist, das Fusionspeptid durch die Membran einer eukaryotischen Zelle zu leiten. Beispiele für solche Peptide umfassen das HSV-1-VP22-Protein, das HIV-Tat-Protein oder Teile davon oder eine Sequenz, die vom Drosophila-melanogaster-Antennapedia-Protein abgeleitet ist. Letzteres ist ein Peptid, das 16 Aminosäurereste aus der dritten Helix des Antennapedia-Homeodomänen-Proteins enthält, das sich über die biologischen Membranen transloziert. Andere Membran-Translokations sequenzen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können auf analoge Weise verwendet werden.
Eine weitere Sequenzklasse sind Markierungen, die die Detektion des Peptids oder seine Gewinnung durch beispielsweise Affinitätschromatographie ermöglichen. Zahlreiche solcher Markierungen sind erhältlich und umfassen die T7-Markierung, die HA-Markierung und eine myc-Markierung.
Eine weitere Sequenzklasse kann Effektorfunktionen bereitstellen oder kann ein Teil der konstanten Region eines Antikörpers sein und kann Antikörper-Effektorfunktionen bereitstellen.
Im Allgemeinen wird/werden die weitere(n) Sequenzen) nicht mehr als 500 Aminosäuren insgesamt umfassen, die gegebenenfalls zwischen N- und C-Termini in jedem beliebigen Verhältnis aufgeteilt werden können. Noch wünschenswerter sind die Sequenzen viel kürzer, beispielsweise nicht länger als 200, vorzugsweise nicht länger als 100, beispielsweise nicht länger als 50 oder sogar nicht länger als 20 Aminosäuren insgesamt.
Herstellung von Peptidmimetikum
Peptidmimetika können synthetisch oder rekombinant unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung weithin erhältlich sind. Synthetische Herstellung bindet im Allgemeinen schrittweises Zusetzen einzelner Aminosäurereste in ein Reaktionsgefäß ein, in dem ein Peptid einer erwünschten Sequenz hergestellt wird. Beispiele für rekombinante Verfahren sind nachstehend beschrieben.
Um ein Peptidmimetikum durch rekombinante Mittel herzustellen, können Polynucleotide, die für das Peptid kodieren, in einen rekombinanten replikablen Vektor inkorporiert werden. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nucleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. Geeignete Wirtszellen werden nachste hend in Verbindung mit Expressionsvektoren beschrieben. Vorzugsweise ist ein Polynucleotid, das für ein unter Verwendung der Erfindung entworfenes Peptid kodiert, in einem Vektor operabel an eine Kontrollsequenz gebunden, die in der Lage ist, für die Expression der kodierenden Sequenz durch die Wirtszelle zu sorgen, d.h. der Vektor ist ein Expressionsvektor.
Die Bezeichnung "operabel gebunden" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, worin die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die ihnen ermöglicht, auf ihre beabsichtigte Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz, die an eine kodierende Sequenz "operabel gebunden" ist, ist auf solch eine Weise ligiert, dass Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Solche Vektoren können zu einer geeigneten Wirtszelle transformiert werden, um für Expression eines Peptids zu sorgen, das gemäß der Erfindung entworfen ist. Ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die gemäß der Erfindung entworfen sind, umfasst das Kultivieren einer mit einem Expressionsvektor transformierten oder transfizierten Wirtszelle, wie zuvor beschrieben, unter solchen Bedingungen, dass für Expression durch den Vektor einer kodierenden Sequenz, die für die Peptide kodiert, und das Gewinnen der exprimierten Peptide gesorgt ist.
Die Vektoren können beispielsweise Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Replikationsstartpunkt, gegebenenfalls einem Promotor für die Expression des Polynucleotids und gegebenenfalls einem Regulator des Promotors versehen sind. Die Vektoren können ein oder mehrere auswählbare Markergene enthalten, beispielsweise ein Ampicillin-Resistenzgen im Fall eines bakteriellen Plasmids oder ein Neomycin-Resistenzgen für einen Säugetier-Vektor. Vektoren können in vitro verwendet werden, beispielsweise zur Herstellung von RNA, oder sie können verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transfizieren oder transformieren.
Wirtszellen können mit den Vektoren zur Replikation und Expression von Polynucleotiden, die gemäß der Erfindung entworfen wurden, transformiert oder transfiziert werden. Die Zellen werden so ausgewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind und können beispielsweise Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen sein.
Promotoren und andere Expressions-Regulierungssignale können so ausgewählt werden, dass sie mit der Wirtszelle, für die der Expressionsvektor entworfen ist, kompatibel sind. Beispielsweise umfassen Hefepromotoren S.-cerevisiae-GAL4- und -ADH-Promotoren, S.-pombe-nmt1- und -adh-Promotoren. Säugetier-Promotoren umfassen den Metallothionein-Promotor, der als Reaktion auf Schwermetalle wie Cadmium eingebunden werden kann. Virale Promotoren umfassen den SV40-large-T-Antigen-Promotor, retrovirale LTR-Promotoren und Adenovirus-Promotoren. Alle diese Promotoren sind auf dem Gebiet der Erfindung leicht erhältlich.
Modifikationen von Peptiden
Wie bereits zuvor erwähnt kann die Aminosäuresequenz von Peptiden, die gemäß der Erfindung entworfen sind, nicht natürlich vorkommende Aminosäuren umfassen. Werden die Peptide auf synthetischem Weg hergestellt, können solche Aminosäuren während der Herstellung eingeführt werden.
Das Peptid kann auch entweder gemäß synthetischer oder rekombinanter Produktion modifiziert werden, z. B. um Stabilität oder Aktivität des Peptids zu verbessern. Beispielsweise können Seitenketten-Modifikationen für Aminosäuren an den Seitenketten von Peptiden, die gemäß der vorliegenden Erfindung entworfen sind, unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, vorgenommen werden. Solche Modifikationen umfassen beispielsweise Modifikationen von Aminogruppen durch reduktive Alkylierung durch Reaktion mit einem Aldehyd, gefolgt von Reduktion mit NaBH₄, Amidinierung mit Methylacetimidat oder Acylierung mit Essigsäureanhydrid. Die Guanidin-Gruppen von Argininresten können durch die Bildung von heterozyklischen Kondensationsprodukten mit Reagenzien wie 2,3-Butandion oder Glyoxal modifiziert werden. Sulfhydrylgruppen können durch Verfahren wie Carboxymethylierung modifiziert werden. Der Carboxy-Terminus und andere Carboxy-Seitenketten können in Form einer Estergruppe, z. B. eines C₁_₆-Alkylesters, eines Biotin-Fluoreszenzfarbstoffs, Fluorescein und Rhodamin blockiert sein.
Formulierungen
Peptide, die gemäß der Erfindung entworfen sind, können in Form eines Salzes formuliert werden. Salze von Peptiden, die gemäß der Erfindung entworfen sind, die gut in Therapien eingesetzt werden können, umfassen physiologisch annehmbare Basensalze, z. B. von einer geeigneten Base abgeleitet, wie Alkalimetall- (z. B. Natrium-, Kalium-), Erdalkalimetall- (z. B. Magnesium-) Salze, Ammoniumsalze und NR₄-Salze (worin R ein C₁_₄-Alkyl ist). Salze umfassen auch physiologisch annehmbare Säureadditionssalze, umfassend die Trifluoracetat-, Hydrochlorid- und Acetatsalze.
Peptide, die gemäß der Erfindung entworfen sind, können in einer im Wesentlichen isolierten Form vorliegen. Es ist verständlich, dass das Peptid mit Trägern oder Verdünnern vermischt werden kann, die den beabsichtigten Zweck des Peptids nicht stören, das immer noch als im Wesentlichen isoliert betrachtet wird. Ein Peptid, das gemäß der Erfindung entworfen ist, kann auch in einer im Wesentlichen gereinigten Form vorliegen, wobei es hier im Allgemeinen das Peptid in einem Präparat umfasst, in dem mehr als 90%, z. B. 95%, 98% oder 99% des Peptids im Präparat ein Peptid gemäß der Erfindung ist.
Ein Peptid, das gemäß der Erfindung entworfen ist, kann mit einer Hinweismarkierung markiert sein. Die Hinweismarkierung kann jede geeignete Markierung sein, die es ermöglicht, das Peptid nachzuweisen. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, z. B.¹²⁵|, Enzyme, Antikörper, Polynucleotide und Linker wie Biotin. Markierte Peptide können für Diagnoseverfahren wie Immuntests verwendet werden, um die Menge eines Peptidmimetikums in einer Probe zu bestimmen.
Ein Peptid oder markiertes Peptid, das gemäß der Erfindung entworfen ist, oder ein Fragment davon kann auch an eine feste Phase gebunden werden, beispielsweise an die Oberfläche eines Immuntest-Wells oder -Messstabs.
Solche markierten und/oder immobilisierten Peptide können in einem geeigneten Gefäß zusammen mit geeigneten Reagenzien, Kontrollen, Anweisungen und dergleichen in Sets verpackt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Peptide, die gemäß der Erfindung entworfen sind, können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden. Die Zusammensetzungen umfassen das Peptid zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner. Pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünner umfassen jene, die in Formulierungen verwendet werden, die zur oralen, topischen oder parenteralen (z. B. intramuskulären oder intravenösen) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können aus praktischen Gründen in Einheitsdosierungsform vorhanden sein und können mittels jedes auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahrens hergestellt werden. Solche Verfahren umfassen den Schritt, den aktiven Bestandteil mit dem Träger, der einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile darstellt, in Verbindung zu bringen. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch einheitliches und nahes In-Verbindunge-Bringen des aktiven Bestandteils mit flüssigen Trägern oder fein verteilten, festen Trägern oder beiden und anschließendes Formen des Produkts, sofern erforderlich, hergestellt.
Beispielsweise umfassen Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, wässrige und nicht wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und Gelöststoffe enthalten können, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Rezipienten isotonisch machen; und wässrige und nicht wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel umfassen können, sowie Liposomen oder andere Mikropartikel-Systeme, die dafür bestimmt sind, das Peptid auf Blutkomponenten oder ein oder mehrere Organe zu richten.
Geeignete Liposomen umfassen beispielsweise jene, die positiv geladenes Lipid (N[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA)) umfassen, jene, die Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) umfassen, und jene, die 3β[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin (DC-Chol) umfassen.
Zusammensetzungen können jede beliebige Menge eines Peptids, das gemäß der Erfindung entworfen ist, umfassen. Teilweise hängt dies von der beabsichtigten Formulierung und ihrer beabsichtigten Verwendung ab. Gemäß allgemeinen Anhaltspunkten kann die Zusammensetzung von etwa 1% bis etwa 99%, beispielsweise von 10% bis 90%, eines Peptids, das gemäß der Erfindung entworfen ist, umfassen.
Die Zusammensetzung kann ein Gemisch aus mehr als einem, beispielsweise zwei oder drei, Peptiden, die gemäß der Erfindung entworfen sind, umfassen.
Die Erfindung wird nun unter Verweis auf ein bestimmtes Beispiel, das sich auf die Herstellung eines Peptidmimetikums eines Antikörpers bezieht, im Detail beschrieben. Die verwendeten Verfahren sind auf das Entwerten von Mimetika von Antikörpern im Allgemeinen, basierend auf der hierin beschriebenen Methodik, anwendbar.
In manchen Antikörpern ist die VH-Kette alleine ausreichend, um für Bindung an ein Antigen zu sorgen, und manche Spezies (z. B. Kamele) produzieren auf natürliche Weise einkettige Antikörper dieses Typs. Die vorliegende Erfindung kann eingesetzt werden, um Mimetika von VH-Einketten-Antikörpern oder die Bindungsregion eines Antikörpers basierend auf der Wechselwirkung einer VH- und einer VL-Kette bereitzustellen, und der Verweis auf die Herstellung eines Mimetikums eines Antikörpers zielt darauf ab, beide Möglichkeiten abzudecken.
Um ein Mimetikum eines Antikörpers zu erhalten, ist, um dies kurz darzustellen, der Ausgangspunkt, eine dreidimensionale Struktur des Zielantikörpers bereitzustellen. Ist keine Röntgenstruktur erhältlich, ist ein Strukturvorhersageverfahren erforderlich. Das Vorhersagen der Struktur einer variablen Antikörper-Region ausgehend von der Sequenz war Gegenstand beträchtlicher Tätigkeiten, ausgehend von den Arbeiten von Kabat und Wu (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 960–964 (1972); Vorhersage einer Kappa-Leichtkette), Padlan et. al (Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. 41, 627–637 (1977)), Stanford und Wu (J. Theor. Biol. 88, 421–439 (1981)) und Feldmann et. al (J. Mol. Immunol. 18, 683–698 (1981)).
Nach den im Wesentlichen "Homologie"-basierten Vorhersagen dieser frühen Ansätze wurden Verfahren entwickelt, die mehr regelbasierte Verfahren einführten, wie beispielsweise die Arbeiten von Rees und Mitarbeitern (Darsley und Rees, EMBO J. 4, 383–392 (1985); de la Paz et al., EMBO J. 5, 415–425 (1986); Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 9268–9272 (1989) & Methods Enzymol. 203, 121–153 (1991); Pederson et al., Immunomethods 1, 126–136 (1992); Rees et al., in "Protein Structure Prediction", Oxford University Press, herausgegeben von Sternberg MJE (1996)) und jenen von Chothia, Lesk und Kollegen (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987); Nature 342, 877–883 (1989); J. Mol. Biol. 227, 799–817 (1992); Tomlinson et al., EMBO J. 18, 4628–4638 (1995); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273(4), 927–948 (1997)), die aufbauend auf den Beobachtungen von Kabat et. al (Ann. N.Y. Acad. Sci. 169, 43–54 (1970); J. Biol. Chem 252, 6609–6616 (1977)) und Padlan und Davies (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 819–823 (1975)) das Konzept von kanonischen Klassen für bestimmte Variable-Regionen-CDR entwickelten. Seither konzentrierte sich die Aufmerksamkeit auf das schwierigere Problem nichtkanonischer CDR, von denen die Antikörper-Schwerketten-CDR3 (im Folgenden als H3 bezeichnet) die am am stärksten nicht-konformistische ist.
Das Modellieren von Antikörpern hat gegenüber dem Modellieren von Proteinen im Allgemeinen den Vorteil, dass nur das Fv modelliert werden muss und die konstante Region konserviert bleibt. Weiters ist die Mehrheit der Fv selbst, das Gerüst, in der Struktur zwischen verschiedenen Antikörpern hoch konserviert und kann unter Verwendung des Gerüsts, das für die höchste Sequenz-Homologie bekannt ist, modelliert werden (Pedersen et. al (1992), s. o.). Zum CDR-Modellieren fallen 5 der 6 CDR (alle außer H3) häufig in eine von zwischen 1 und 10 kanonischen Klassen, ein Satz für jede CDR. Mitglieder einer kanonischen Klasse haben alle etwa dieselbe Hauptkettenkonformation. Diese ist durch die Schleifenlänge und die Gegenwart zahlreicher Hauptreste, sowohl in der CDR als auch im Gerüst, das die CDR in einer bestimmten Konformation durch Wasserstoffbindung, elektrostatische und/oder hydrophobe Wechselwirkungen hält, bestimmt. Um also eine unbekannte CDR zu modellieren, wird die Sequenz untersucht, die geeignete kanonische Klasse zugeordnet und die CDR mit der höchsten Sequenzhomologie verwendet. Für jede Schleife außer L2 fallen einige wenige Beispiele aus der Reihe der bestehenden kanonischen Klassen und müssen, gemeinsam mit der H3-Schleife, auf andere Weise modelliert werden (siehe http://antibody.bath.ac.uk). Es ist wahrscheinlich, dass weitere kanonische Klassen zu Tage treten, wenn mehr Kristallstrukturen gelöst werden, obwohl bis heute keine exakte "kanonische" Klassifizierung für H3 möglich gewesen ist.
Die Schwierigkeit des Modellierens der H3-Schleife ist auf die weitreichende Variabilität sowohl hinsichtlich der Sequenz als auch der Struktur zwischen den verschiedenen Antikörpern zurückzuführen. Im Wesentlichen gibt es drei Ansätze: wissensbasierte Verfahren wie Datenbankrecherche, worin die hinsichtlich der Sequenz und der Länge am besten passende Datenbankschleife entweder aus Antikörpern oder aus der gesamten Brookhaven Protein Data Bank (PDB; Bernstein et al., Eur. J. Biochem. 80, 319–324 (1977)) als Modell verwendet wird, oder Ab-initio-Verfahren, wie die CONGEN-Konformationssuche (Bruccoleri und Karplus, Biopolymers 26, 137–168 (1987)), oder eine Kombination aus beiden (Martin et. al (1991), s. o.). Jüngere Analysen schlagen vor, dass schließlich wissensbasierte Verfahren den für die meisten Modellierungsanwendungen, wie Antikörper-Humanisierung, erforderlichen Genauigkeitsgrad bereitstellen (Reichmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Roguska et al., Protein. Eng. 9, 895–904 (1996)). Zu dieser Zeit ist jedoch wahrscheinlich eine Kombination aus empirischen und Ab-initio-Verfahren notwendig, sofern eine Genauigkeit erforderlich ist, die einer Röntgenstruktur mittlerer Auflösung nahekommt.
Nachdem eine dreidimensionale Struktur eines Ausgangsantikörpers bereitgestellt wurde, werden zwei weitere Komponenten in beliebiger Reihenfolge bereitgestellt. Ein Abschnitt des Antikörpers, der das Zielantigen bindet, wird definiert. Beispielsweise ist dies im Allgemeinen ein Teil der Oberfläche des Antikörpers, in dem zahlreiche Reste angeordnet sind, die für ein Lösungsmittel und/oder das Target zugänglich sind.
Weiters werden die Reste des Ausgangsmoleküls, die mit Zielbindungsaktivität verbunden sind, identifiziert. Am einfachsten kann dies auf empirische Weise erreicht werden, z. B. durch Alanin-Scanning, wie zuvor erläutert wurde. Sind jedoch Modelle der Antikörper, die an das Target oder Strukturen von diesem gebunden sind, erhältlich – z. B. eine Röntgenkristallstruktur des gebundenen Antikörpers -, so können diese verwendet werden, um diese Aminosäuren zu bestimmen. Aufgrund der vorliegenden Beschreibung und des beiliegenden Beispiels versteht sich, dass Reste im Ausgangsmolekül, die mit Zielbindungsaktivität verbunden und tatsächlich von grundlegender Bedeutung für die Struktur und Funktion des Ausgangsmoleküls sind, Reste sind, die für das Antigen nicht direkt zugänglich und für die Einbindung in ein Mimetikum nicht essentiell sind.
Die Aminosäuren, die mit Zielbindungsaktivität verbunden sind, können dann in das Antikörpermodell aufgenommen werden, und jene Aminosäuren, die in der Zielbindungsregion angeordnet sind, können identifiziert werden (wie beispielsweise in 2 dargestellt).
Nach Identifikation von Aminosäuren, die sich auch in einer Zielbindungsregion befinden, können diese extrahiert werden, um ein Modell bereitzustellen (siehe beispielsweise 3), das die dreidimensionale Beziehung zwischen den einzelnen extrahierten Aminosäuren definiert.
Fachleuten wird verständlich sein, dass es nicht notwendig ist, die gesamten Aminosäuren, die mit Zielbindungsaktivität des Ausgangsmoleküls verbunden und dem Target zugänglich sind (z. B. die an der Bindungsoberfläche des Moleküls liegen), zu extrahieren. Die Bindungsoberfläche kann beispielsweise zwei Subregionen umfassen, die das Target binden, wobei die Aminosäuren nur aus einer Region extrahiert werden können.
Zur Erleichterung des Experiments kann es auch möglich sein, dass nur einige wenige Zielbindungs-Aminosäuren verworfen werden, um die Herstellung eines Mimetikums mit einer geeigneteren Größe zu ermöglichen. Beispielsweise kann auch experimentell bestimmt werden, dass manche Aminosäuren zu einem wesentlich höheren Grad zur Bindung beitragen als andere. So ist es möglich, ein "energetisches Paratop" der Antikörper-Bindungsregion zu definieren, aus der eine ausgewählte Selektion an Aminosäuren zur Extraktion bereitgestellt wird.
Beispielsweise ist die VH-CDR3- (H3-) Schleife eines Antikörpers oft mit stärkster Bindungsaktivität an ein Target verbunden, und es kann wünschenswert sein, die zielbindenden Reste dieser Schleife im Mimetikum zu behalten. Aus dem beiliegenden Beispiel ist ersichtlich, dass vier solcher Reste in der H3-Schleife vorhanden sind, was mehr ist als in allen anderen Schleifen. Bei der Auswahl der Aminosäuren wurde diese Schleife zentral in der Gruppe der auszuwählenden Aminosäuren angeordnet, und die zusammen ausgewählten Aminosäuren sind rund um die H3-Aminosäuren angeordnet. Allgemeiner gesagt kann die Selektion rund um eine Schleife oder um Schleifen, die die höchste Anzahl an Zielbindungs-Aminosäuren aufweisen, basiert sein, was ermöglicht, dass eine oder mehrere der weiter entfernten Zielbindungs-Aminosäuren verworfen werden. Es ist wünschenswert, dass aus etwa 4 bis 15, beispielsweise von 6 bis 12, Aminosäuren ausgewählt wird.
Wünschenswerterweise werden die Aminosäuren aus zumindest 2, vorzugsweise zumindest 3, und im Falle eines Zweiketten- (VH+VL-) Antikörpers noch bevorzugter zumindest 4, Schleifen des Antikörpers ausgewählt.
Nachdem die ausgewählten Aminosäuren definiert wurden, kann ein Mimetikum, das diese Aminosäuren inkorporiert, entworfen werden.
Wünschenswerterweise kann das Mimetikum zumindest teilweise zylindrisch sein, d. h. dass die Mehrheit der ausgewählten Aminosäuren in einem zyklischen Abschnitt des Mimetikums liegen, beispielsweise sollen nicht mehr als 1, 2 oder 3 der ausgewählten Aminosäuren in einem nicht-zyklischen Abschnitt liegen.
Linker zwischen den ausgewählten Aminosäuren werden so ausgewählt, dass sie die geometrische Beziehung zwischen den ausgewählten Aminosäuren aufrechterhalten. Die Linker können Peptidlinker sein.
In einer Ausführungsform können die Linker durch ein iteratives Verfahren neu definiert werden, worin eine MD-Simulation eines ersten Mimetikums laufen gelassen wird, das Flexibilitätsprofil des Mimetikums im Vergleich mit dem Ausgangsantikörper bestimmt wird, beispielsweise unter Verwendung der im beiliegenden Beispiel dargestellten Kriterien, ein oder mehrere Linkermoleküle ersetzt werden und bestimmt wird, ob die MD-Simulation ein Mimetikum bereitstellt, das verbesserte Flexibilitätseigenschaften aufweist (d. h, das dem Ausgangsantikörper ähnlicher ist).
Im ersten Beispiel kann das erste Mimetikum durch Modellieren von Linkergruppen zwischen den ausgewählten Resten entworfen werden, die bis zu einem durchführbaren Ausmaß die Struktur oder Packung des Raums zwischen den extrahierten Resten aus dem Ausgangsmolekül reflektieren. Kann der Raum zwischen zwei ausgewählten Resten auf diese Weise nicht nachgeahmt werden, können Glycinreste eingeführt werden, um Abstand oder Flexibilität aufrechtzuerhalten. Prolinreste können bereitgestellt werden, um Wendungen einzuführen oder um Flexibilität zu kontrollieren. Dieses Verfahren wird üblicherweise manuell oder semi-manuell mit Modellierungs-Software am Computer durchgeführt; um ein Ausgangsmimetikum bereitzustellen. Das Ausgangsmimetikum wird anschließend durch das iterative Verfahren des vorangehenden Absatzes neu definiert.
Dieses iterative Verfahren kann wiederholt werden, bis ein Linker mit Eigenschaften, die für Fachleute akzeptabel sind, erhalten wird. Was akzeptabel ist, wird letztlich experimentell bestimmt, wobei jedoch das Verfahren den Entwurf von potentiellen Mimetika ermöglicht, die sehr wahrscheinlich Aktivität aufweisen. Für eine MD von 100–500 ps auf einer Standard-Modellierungspackung wie AMBER beispielsweise ist eine RMSD des Mimetikums aus der originalen Antikörperstruktur von 10 Å oder weniger, wie beispielsweise 5 Å oder weniger, ein günstiger Hinweis auf Aktivität, die biologisch relevant sein könnte und so die Grundlage für die tatsächliche Synthese und das Testen des Moleküls bilden könnte.
Günstigerweise sind die Linker andere Aminosäuren, obwohl andere Arten an Linkern, wie zuvor erwähnt, auch möglich sind.
Ein Vorteil des vorliegenden Ansatzes ist, dass das Mimetikum den Bindungsabschnitt des Ausgangsmoleküls in einer kompakten Struktur reproduziert, die nicht von einer Base getragen werden muss, wie es hinsichtlich des TASP-Ansatzes zuvor besprochen wurde. Besonders im Peptidformat des Mimetikums stellt die vorliegende Erfindung ein Mimetikum bereit, in dem die Zielbindungsreste in einem Polypeptidmolekül angeordnet sind, das (abgesehen von der zyklischen Bindung) unverzweigt ist.
Ein weiterer Vorteil ist, dass die relative Reihenfolge der ausgewählten Aminosäuren im Mimetikum durch die natürliche Reihenfolge im Antikörpermolekül unbeschränkt ist. Beispielsweise treten im hierin beschriebenen ST40-Mimetikum die aus der H2-Kette ausgewählten Aminosäuren in umgekehrter Reihenfolge auf. Dies sorgt dafür, dass das Mimetikum kleiner ist, als dies der Fall sein würde, wenn die Aminosäuren in linearer Reihenfolge verbunden wären, selbst wenn Deletionen zwischen den ausgewählten Resten möglich wären.
Wie zuvor angegeben kann das zweite Mimetikum weiteren Durchgängen der Veränderung der Bindungsstruktur und der MD-Analyse unterzogen werden, um weitere Mimetika bereitzustellen, die vorgegebenen Kriterien besser folgen. Das zweite oder folgende Mimetikum kann dann synthetisiert und wie hierin beschrieben verwendet werden.
Wie zuvor angegeben kann die Auswahl auf der Identifikation der CDR-Schleife mit der größten Anzahl an Resten (oder der größten gleichen Anzahl an Resten), die dem Antigen zugänglich und als mit Zielbindungsaktivität im Ausgangsmolekül verbunden identifiziert sind, und der Auswahl jener zusammen mit Resten aus zumindest einer anderen CDR basieren. Vorzugsweise stellt die CDR-Schleife mit der höchsten Anzahl an Resten (oder je nachdem mit einer gleichen Anzahl) die zumindest eine andere Quelle der Reste dar.
So stellt die Erfindung ein Verfahren zum Entwerfen und zur Synthese eines Peptids bereit, das die Aktivität eines Antikörpers nachahmt, und insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zum Entwerfen und zur Synthese eines Peptids bereit, das den CD4-Rezeptor bindet, z. B. den CDR3-Rezeptor des CD4-Proteins. Fachleute wären in der Lage, diesen Ansatz auf andere Antikörper umzulegen, um Peptide zu entwerfen und zu synthetisieren, die die Targets dieser Antikörper binden würden. Beispiele umfassen Mimetika von Antikörpern gegen andere Rezeptoren, die in HIV-Infektion eingebunden sind, wie beispielsweise CCR5, und Mimetika von Antikörpern gegen Tumornekrose-Faktor.
Wie bereits erklärt wurde, müssen diese Mimetika nicht auf Grundlage eines natürlich vorkommenden Antikörpers oder sogar eines synthetischen Antikörpers entworfen sein. Tatsächlich könnten die Mimetika auf Grundlage einer Struktur eines Peptids entworfen sein, das aus einer Peptidbibliothek (z. B. einer Phagendisplay-Bibliothek) ausgewählt wurde; beispielsweise kann ein Peptid aus einer Phagendisplay-Bibliothek auf Grundlage seiner Fähigkeit, ein Target, z. B. CD4, zu binden, ausgewählt werden. Ein Mimetikum könnte auf Grundlage dieses Peptids hergestellt werden, und das resultierende Mimetikum würde CD4 binden.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren zum Entwerfen und zur Synthese eines Peptids bereit, das CD4 bindet.
Die Mimetikum-Peptide, die gemäß der Erfindung entworfen sind, können in Diagnoseverfahren, z. B. zur Detektion von Zellen, die das CD4 auf ihrer Oberfläche tragen, eingesetzt werden.
Das CD4-bindende Peptid kann in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch relevanten Träger eingebunden sein.
Die Peptide können zur Herstellung von Pharmazeutika zur Behandlung von Leiden verwendet werden, bei denen CD4 eine Rolle spielt. Ein Beispiel solcher Leiden ist HIV.
Beispiele für das Entwerfen und die Synthese von Peptid-Mimetika von ST40-Antikörper werden nun im Detail beschrieben.
In diesem Beispiel wurde der Teil eines Antikörpers untersucht, der ein Antigen (das Paratop) erkennt, und Mimetika dieses Paratops wurden entworfen. Die Mimetika sollten im Vergleich mit dem Antikörper ein geringes Molekulargewicht aufweisen und sollten leicht zu synthetisieren sein.
Biologische Tests, die überlappende, synthetische Peptide verwenden, gefolgt von Alanin-Scanning definieren die Aminosäuren, die in der Bindung eine Rolle spielen können.
ST40, ein Antikörper, der CD4 erkennt und ein neutralisierender Antikörper in einem zellbasierten HIV-Infektionsmodell ist, wurde ausgewählt, um das Projekt zu starten und das Verfahren zu bestätigen. Dieser Antikörper wurde ausgewählt, da er bereits gut erforscht war. Die dreidimensionale Struktur von ST40 wurde mit der AbM-Software (Forschungsversion) modelliert. Die durch den Alascan vorgegebenen Aminosäuren wurden in den CDR lokalisiert (wo es zur Bindung kommt), und jene mit guter Zugänglichkeit wurden ausgewählt, um in das Mimetikum eingebunden zu werden. Während des Aufbaus des Mimetikums wurden die Anordnung im Raum, die Ausrichtung und die Konformation aller wichtiger Aminosäuren, insbesondere ihre Seitenketten, so gut wie möglich konserviert. Eine Moleküldynamik- (MD-) Simulation in Wasser der CDR des Mimetikums und des Ausgangsanitkörpers wurde durchgeführt, um ihre Flexibilität zu definieren.
Zwei Verfahren zur Vorhersage und Bereitstellung von Mimetika wurden verwendet.
1) Die dreidimensionale Struktur von ST40 wurde unter Verwendung der Forschungsversion der AbM-Software (Oxford Molecular, UK) modelliert. Die Aminosäuren, von denen mittels Alanin-Scanning vorhergesagt wurde, dass sie aktiv sind (Monnet et al., J. Biol. Chem. 274, 3789–3796 (1999}), und die in den CDR mit guter Zugänglichkeit angeordnet waren, wurden ausgewählt, um in das Mimetikum eingebunden zu werden. Während des Aufbaus des Mimetikums wurden die Anordnung im Raum, die Ausrichtung und die Konformation aller "aktiven" Aminosäuren, insbesondere der Seitenketten, so gut wie möglich konserviert. Ein Oligopeptid-Mimetikum, das nur jene CDR-Reste enthielt, die als maßgeblich für die Bindung identifiziert worden waren, wurde entworfen. Diese maßgeblichen Aminosäuren wurden miteinander über andere Aminosäuren verbunden und anschließend an einer sorgfältig ausgewählten Position in der Sequenz zyklisiert. Da dieser Mimetikum-Entwurf eine zusammenhängende Sequenz darstellte, weist er keine exakte strukturelle Ähnlichkeit mit den nicht-kontinuierlichen CDR-Schleifen des Paratops auf. Die Flexibilität und Konformation verschiedener Versionen dieses Mimetikum-Entwurfs wurden mittels Analyse von Moleküldynamik-Simulationen in Wasser bewertet. Das Peptid-Mimetikum von ST40, das als aktiv ausgewählt wurde, wurde synthetisiert und auf seine Bindungsaffinität und seine biologische Aktivität getestet (retrovirale HIV-Hemmung). Ein zyklisches Peptid mit derselben Anzahl an Aminosäuren wie das Mimetikum, das die wichtigen Aminosäurereste enthielt, die jedoch an unter schiedlichen Positionen im Peptid angeordnet waren, wurde als negative Kontrolle verwendet.
2) Drei Mimetika-Typen wurden simuliert, die zahlreiche, an verschiedenen Punkten miteinander verbundene CDR-Schleifen enthielten, um pseudo-zyklische Strukturen zu bilden. Die Anzahl an CDR variierte von 1 bis 3, um die Anzahl an Aminosäureresten in den Mimetika zu reduzieren. Die Mimetika enthalten nur Aminosäuren (wobei es jedoch in Zukunft auch andere Molekülarten sein könnten) mit spezifischen Vernetzungen, die über die Seitenketten von Lys, Glu oder Cys erfolgten. Deren Flexibilität und globale Konformationen werden durch Moleküldynamik-Simulationen, mit oder ohne Ionen, in Wasser definiert, worauf eine Analyse mittels Principal Components Analysis (PCA) folgte. Die PCA basiert auf den MD-Bahnen der relevanten Moleküle und wird mit der PCA, die aus dem MD-Verhalten der intakten Fv-Region des Antikörpers berechnet wurde, verglichen.
Material- und Analysemethoden
(A) Modellieren von Antikörpern
Das Klonieren von MAb ST40 und sein Alanin-Scanning werden in Monnet et. al (1999), s. o., beschrieben.
Molekulares Modellieren der Leicht- und Schwerketten des Antikörpers, besonders der 6 CDR (L1, L2, L3 (für die Leichtkette), H1, H2, H3 (für die Schwerkette)), die in das Antigen (CD4) eingebunden sind, und Erkennung wurden mit der Forschungsversion der Antikörper-Modellierungs-Software AbM (Rees et al., University of Bath, UK), die an einem O2-R5000-Silicon-Graphics-Computer laufen gelassen wurde, durchgeführt. Die AbM-Software wurde spezifisch entwickelt, um Antikörper durch eine Kombination aus Homologie-Regeln und Konformationssuche zu modellieren, wobei mit den primären Aminosäuresequenzen begonnen wird (Martin et. al (1989), s. o.; Pedersen et. al (1992), s. o.). Die letzte Version von AbM, die in dieser Studie verwendet wurde, wurde an der University of Bath entwickelt und enthält eine Daten bank von etwa 80 Röntgenstrukturen von Antikörpern. Die L2-, L3- und H1-Schleifen, die eine Standardgröße aufweisen, wurden unter Verwendung der Gerüste der kanonischen Klasse 1 und kanonischen Klasse 2 für H2, wie sie in AbM definiert sind, konstruiert. Eine neue kanonische Klasse musste für die unüblich lange L1-CDR-Schleife von ST40, die 15 Aminosäuren enthielt, definiert werden. Vier Röntgenstrukturen von Antikörpern (libg, 1 mf2, lacy und 1 ggc) mit L1 aus 15 Resten wurden identifiziert und übereinander gelegt. Jede dieser L1 wies eine ähnliche Konformation auf. Auf Grundlage dessen wurde die folgende kanonische Klasse für L1 definiert, und die in der Datenbank fehlenden Röntgenstrukturen wurden hinzugefügt: [TI]x(2β)-C(1)-x(1)-A-x(3)-V-x(7)-S-x(1)-[MLI]-x(1)-W(1)-x(35)-F (Searle et al., Antibody structure and function. Antibody engineering, herausgegeben von C.A.K. Borrebaeck, Oxford University press, 3–51 (1995)). Die N3-Schleife aus 13 Aminosäuren, die zu lange ist, um in eine der bestehenden H3-Klassifikationen zu passen (Shirai et al., FEBS Lett 399, 1–8 (1996); Shirai et al., J. Mol. Biol. 278, 481–496 (1998)) wurde unter Verwendung des Konformationssuchprogramms CONGEN (Bruccoleri und Karplus (1987), s. o.), kombiniert mit einer 3D-Struktur-Datenbanksuche, in AbM implementiert. Die Definition der Bausteine zur Herstellung von H3 mit CONGEN wurde mehrere Male modifiziert, um schließlich 4 verschiedene Modelle zu erhalten, da die "geknickte" Eigenschaft nicht sehr gut definiert war. Die Röntgenstruktur des Antikörpers libg, der eine L1- und eine H3-Schleife mit 15 und 13 Resten enthielt, wurde dann verwendet, um H3 von ST40 mit derselben Konformation zu modellieren. Dieses Modell von H3 weist einen Knick und eine verlängerte Form auf. Das Modellieren wurde durch einfache Mutationen erreicht, und die Struktur wurde unter Verwendung des Tripos-Kraftfelds zur Gänze minimiert. Wasserstoffatome wurden allen Modellen von ST40 unter Verwendung der Sybyl-Software (Tripos, Inc.) zugesetzt, und die Modelle wurden im Laufe von 100 Iterationen mittels des Konjugat-Gradientenverfahrens minimiert, um sämtliche geringen sterischen Konflikte zu eliminieren.
(B) Modellieren der Mimetika
Alle Moleküle wurden sichtbar gemacht und mittels der Sybyl-Software, die auf einem O2-R5000-Silicon-Graphics-Computer laufen gelassen wurde, modifiziert. Zum Modellieren der Mimetika wurden CDR aus dem Antikörper ausgewählt, ihre ursprünglichen Konformationen wurden aufrechterhalten, und anschließend wurden sie mit chemischen Linkern über geeignete Seitenketten miteinander verbunden und minimiert. Moleküldynamik- (MD-) Simulationen der Mimetika wurden in Wasser mit dem AMBER-Kraftfeld unter Verwendung der AMBER-Software (Oxford Molecular), die auf einem 0200-R10000-Silicon-Graphics-Computer mit 4 Prozessoren laufen gelassen wurde, durchgeführt. Die Eingabedateien für AMBER wurden mit dem XLEAP-Modul hergestellt. Die Vernetzungsbrücke, -CO-NH-, zwischen den Seitenketten wurde als eine Amidbindung definiert. Die Wasserbox wurde mit dem Modul SolvateBox mit einer Boxengröße von 8 Å berechnet. Die Wasserboxen enthielten zwischen 2.500 und 3.500 Wassermoleküle für alle Simulationen und wurden mit dem WATBOX216-Modul generiert. Dies entspricht einer Monte-Carlo-Verteilung von Wasser bei periodischen Bedingungen und konstantem Druck. Die Temperatur wurde bei 300 K fixiert, der Cut-off wurde auf 10 Å festgelegt, die Dielektrizitätskonstante wurde auf 1 festgelegt, und die Abtastfrequenz belief sich auf 1 ps. Bevor die Dynamik durchgeführt wurde, wurden die Lösungsmittelmoleküle und anschließend die Gelöststoffe minimiert. Die MD-Simulationen wurden 100 oder 300 ps lang durchgeführt. Die ersten 20 ps der Dynamik entsprachen der Wärmephase, während der das System von 10 K auf 300 k gebracht wurde, und es wurde dann um 15 K pro 1 ps erhöht.
Für die MD-Simulation des Antikörpers ST40 wurden nur die CDR plus manche Gerüst-Aminosäuren simuliert, während der Rest der Fv deletiert wurde (siehe 5). Wiederum wurden nur die H3-, L1- und L3-Schleifen während der Simulation bewegen gelassen, wobei diese die ausgewählten CDR für das Mimetikum waren. Zwei MD-Simulationen wurden, eine ohne Ionen und eine mit 3 Na⁺-Ionen, die rund um die H1-, L1- und H3-Schleifen zugesetzt wurden, laufen gelassen. Alle anderen geladenen Reste außer jenen von H3L1L3 wurden während der Simulation mit Ionen neutralisiert. Die Simulationszeit betrug 300 ps.
(C) Analyse der MD-Simulation
Die ersten 50 ps der Dynamik-Simulation wurden in der Analyse nicht mit einberechnet, da sie als Äquilibrierungszeit genommen wurden.
Die Flexibilität der Mimetika wurde mit dem Ausgangsantikörper mittels verschiedener Verfahren verglichen:
Zuerst wurden die Mimetika zu verschiedenen Zeiten während der Dynamik-Simulation auf das Ausgangskonformer übereinander gelegt, das der Konformation des Antikörpers sehr ähnlich war. Dies spiegelt die Deformation der Mimetika während der MD-Simulation sehr gut wider und wurde mittels der SYBYL-Software durchgeführt.
Anschließend wurden die RMSD unter Verwendung der Ausgangskonformere als Bezug für jede ps der MD-Simulation mit dem CARNAL-Modul aus der AMBER-Packung (Oxford molecular) berechnet. Diese wurden mit denselben Daten verglichen, die für die MD-Simulation der Antikörper berechnet worden waren.
Schließlich, um die MD-Simulation des Mimetikums im Vergleich mit dem Antikörper effizienter zu beschreiben, wurde die Principal Component Analysis (PCA) des Autokorrelogramms (Abstandsmatrix) der Hauptkette des Mimetikums bei jeder ps berechnet. Das Autokorrelogramm der entsprechenden Schleifen im Antikörper wurde als Bezugswert verwendet. Das Programm Anadyn, entwickelt von Synt:em, ermöglicht die Berechnung des Autokorrelogramms für spezifische Aminosäuren und auch für Fragmente der Hauptkette des Moleküls. Für diese Untersuchung wurden nur die Hauptketten der spezifischen Aminosäuren in Betracht gezogen, um die Problematik mutierter Aminosäuren zu umgehen. Die PCA-Analyse wurde mit dem Programm TSAR (Oxford molecular) durchgeführt.
(D) Modellieren von ST40
Der Abgleich der Aminosäuresequenz von ST40 und die Definition der CDR in AbM sind in 1 dargestellt. ST40 enthält zwei unüblich lange CDR-Schleifen, L1 (15 Reste) und H3 (13 Reste).
Die CDR L1, L2, L3, H1 und H2 wurden alle mittels kanonischer Klassen unter Verwendung des Homologie-Modellierens mit AbM definiert. Dahingegen wurde H3, das flexibler ist, unter Verwendung von Congen, einem Konformationssuchverfahren, modelliert. Die Definition der Bausteine, um H3 mit Congen herzustellen, wurde mehrmals modifiziert, um 4 verschiedene Modelle zu erhalten. Unglücklicherweise war der Knick in diesen 4 Modellen nicht gut definiert. Die Röntgenstruktur des Antikörpers libg, der eine L1- und eine H3-Schleife aus 15 und 13 Resten enthielt, wurde anschließend verwendet, um H3 von ST40 mit derselben Konformation zu modellieren. Dieses Modell von H3 weist einen Knick und eine verlängerte Form auf. Das Modellieren wurde mittels einfacher Mutationen erreicht, und die Struktur wurde durch das Tripos-Kraftfeld zur Gänze minimiert. Wasserstoffatome wurden allen Modellen von ST40 unter Verwendung der Sybyl-Software zugesetzt, und die Modelle wurden im Laufe von 100 Iterationen mittels des Konjugat-Gradientenverfahrens und des Tripos-Kraftfeldes minimiert, um sämtliche sterische Konflikte zu eliminieren.
Die seitens der Erfinder für L1 neu identifizierte kanonische Klasse ermöglichte die Konstruktion dieser Schleife in einer spezifischen Konformation, während für die H3-Schleife mehrere mögliche Konformationen identifiziert wurden. Nur vier Röntgenstrukturen von Antikörpern, die H3-Schleifen mit 13 Resten enthielten, wurden beschrieben, wobei jeder eine unterschiedliche Konformation aufwies. Es wurde ein Vergleich der 3D-Strukturen von H3-Schleifen, die 11, 12, 13, 14, 15 und 16 Reste enthielten, durchgeführt, der zeigte, dass die höchste Variabilität am Scheitelpunkt der Schleife auftritt. Enthält die Sequenz jedoch ein Arg an Position N-1 von H3 und Asp-x-Trp am C-Terminus, wie in ST40, so kann am C-terminalen Ende der Schleife eine geknickte Form beobachtet werden (Shirai et. al (1996), s. o.; Shirai et. al (1998), s. o.). Dies wurde im Antikörper libg beobachtet, der eine L1- und eine H3- Schleife mit 15 bzw. 13 Resten enthält. Die ausgewählte 3D-Struktur von H3 in ST40, die einen verlängerten terminalen Teil der Schleife und einen Knick in der Nähe des C-Terminus aufweist, ist in 2 dargestellt. Diese Struktur wurde als Bezugsmodell für den Entwurf von ST40-Mimetika ausgewählt. Dennoch ließ die inhärente Flexibilität dieser längeren H3-Schleifen darauf schließen, dass während der Mimetikumkonstruktion Sorge getragen werden sollte, diese Region von H3 nicht zu stark einzuzwängen.
(E) Dynamik-Simulation von ST40 in Wasser
Die Fragmente von ST40, die für die MD-Simulation ausgewählt worden waren, sind in 6 in Grau dargestellt.
Die Überlagerung der Schleifen, die sich frei bewegen konnten, ist in 7 für die Simulation ohne Ionen und in 8 für die Simulation mit Ionen dargestellt.
Der Scheitelpunkt von L1 erfuhr starke Bewegungen, wie auch für das Mimetikum beobachtet wurde, während L3 sich nur zu Beginn bewegte und dann während der Simulation stabil blieb. Wechselwirkungen zwischen H3 und L3 wurden beobachtet.
Die Schleife L1 bewegte sich anderes im Vergleich zur Beobachtung während der MD-Simulation ohne Ionen und schien stabiler zu sein. H3 wies weniger Wechselwirkung mit L3 auf. Der Vergleich zwischen den zwei Dynamik-Simulationen unter Verwendung von PCA ist in 8 dargestellt.
Die MD-Simulation ohne Ionen ist kompakter als die MD mit Ionen. Dies ist möglicherweise auf die Wechselwirkung zwischen H3 und L1 zurückzuführen, die in der MD-Simulation mit Ionen weniger stark ausgedrückt ist. Die Gegenwart von Ionen induzierte Streuung. Es gilt anzumerken, dass sowohl H3 als auch L1 bestimmte Flexibilität aufwiesen, die während des Entwerfens der Mimetika in Betracht gezogen werden sollte.
(F) CD4
Das menschliche rekombinante CD4, die für die kinetische Analyse und die biologischen Tests verwendet wurde, wurde von RepliGen (USA) erhalten.
(G) BIAcore-Analyse
Die kinetischen Parameter, Assoziationsgeschwindigkeitskonstante (k_a) und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (kd), wurden durch Oberflächen-Plasmonresonanz- (SPR = surface plasmon resonance) Analyse unter Verwendung von BIACORE 2000 (BIAcore AB, Uppsala, Schweden) bestimmt. k_a und k_d wurden unter Verwendung von BIAevaluation-3.0-Software (BIAcore AB) bestimmt. Die Gleichgewichtskonstante Kp stellt das Verhältnis von k_d/k_a dar. Alle Experimente wurden bei 25°C durchgeführt.
Die freie SH-Gruppe der Lysin-Seitenkette, die durch einen 3-Mercaptopropionsäure-Linker des Mimetikums verlängert wurde, wurde eingesetzt, um Moleküle chemisch auf einen B1-Sensorchip zu fixieren (BIAcore AB), worauf ein Standard-PDEA/EDC/NHS-Verfahren von BIAcore folgte.
Für die SPR-Signale für immobilisierte Peptidmimetika wurde ein Wert von 280–500 Resnonanzeinheiten (RU) nach Abschluss des Chip-Regenerationszyklus nachgewiesen, was 280–500 pg/mm² entspricht. Die Bindungskinetik von CD4 zu immobilisiertem Mimetikum wurde durch Injizieren von CD4 (1–20 μg/ml, 16–330 nM) in HBS-Puffer (Elektrophoresepuffer) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 30 μl/min bestimmt.
Für die Untersuchung zur Selektivität des Mimetikums wurde die Bindungskinetik von immobilisiertem Mimetikum durch Injizieren irrelevanter Proteine: 8A6 (Anti-Lyphozyt MAb), 9E8 (Anti-Traponin i MAb), Troponin C und Thyroglobulin (Tg), jedes mit 50 μg/ml in HBS-Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 30 μl/min, bestimmt.
Für die Konkurrenz-Studie wurden ST40 mAb (50 μg/ml – 330 nM) und CD4 (20 μg/ml – 330 nM) vorgemischt, dann auf den Sensorchip co-injiziert. Dasselbe Experiment wurde für das irrelevante Protein 9E8 (50 μg/ml) durchgeführt.
(H) Anti-retrovirale Aktivitätstests
(i): Isolierung und Kultivierung einkerniger Zellen aus periphärem Blut Einkernige Zellen wurden aus periphärem Blut eines gesunden Spenders (und seronegative für HIV und Hepatitis-Viren) mit einem Gradienten von Ficoll-Hypaque isoliert. Die PBMC wurden durch 1 mg/ml Phytohemaglutinin-P (PHA-P, Difco Laboratories, Detroit, USA) drei Tage lang aktiviert, anschließend mit 200.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte in einem Kulturmedium A, das mit 20 IU/ml rekombinantem lnterleukin-2 (rHulL-2, Roche Products, Mannheim, Deutschland) ergänzt war, kultiviert. Medium A besteht aus: RPMI-Zellkultur (RPMI 1640, Roche Products), 10% fötales Kälberserum (FCS, Roche Products}, komplementinaktiviert durch Erhitzen auf 56°C 45 min lang, 2 mM L-Glutamin (Roche Products) und einer Lösung aus drei Antibiotika (Penicillin, Streptomycin und Neomycin (PSN, LifeTechnologies, Grand Island, USA). Während des Kultivierens wurden die Zellen bei +37°C in gesättigter feuchter Atmosphäre unter 5% CO₂ gehalten.
(ii): HIV-Virus
PBMC wurden eine Stunde lang bei 37°C mit einer 10.000 Gewebekultur-Infektionsdosis 50% (TCID50} des lymphozytären Tropismus-Bezugsstamms HIV-1-LAI infiziert. Am Ende der Inkubation würden die Zellen zweimal mit Medium A gewaschen. Der HIV-1-Stamm wurde im Neurovirology Service ausschließlich mit umbilikalen mononuklearen Blutzellen (UBMC), aktiviert mit PHA-P, amplifiziert, und die TCID50 wurde unter Verwendung der Kärber-Formel berechnet.
(iii): Mimetikum und Kontrollmoleküle
Das Mimetikum und das ungeordnete Peptid wurden in ultrareinem sterilem Wasser aufgelöst. Fünf Konzentrationen wurden getestet (50 μM, 10 μM, 5 μM, 1 μM und 0,5 μM). Antikörper ST40 und 9E8 (zur Verfügung gestellt vom CNRS UMR 9921, Montpellier) wurden bei den folgenden Konzentrationen getestet: 100 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml, 100 ng/ml und 10 ng/ml.
Die Aktivitäten dieser Verbindungen wurden mit dem Q4120-Bezugs-Antikörper und mit AZT verglichen. Diese zwei letzten Verbindungen wurden von SpiBio (Paris, Frankreich) zur Verfügung gestellt. Der Q4120-Antikörper wurde bei den folgenden Konzentrationen getestet: 5 μg/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 50 ng/ml und 25 ng/ml. Die Anti-HIV-Aktivität von AZT wurde bei den folgenden Konzentrationen gemessen: 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM und 1 nM. Alle Verdünnungen wurden in Medium A durchgeführt.
(iv): Antiviraler Aktivitätstest von PBMC, infiziert durch HIV-Isolate
Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. PBMC wurden eine Stunde lang bei +4°C mit dem relevanten Molekül vorbehandelt und anschließend 4 Stunden lang bei 37°C mit 10.000 TCID50 des HIV-1-LAI-Stamms infiziert. Die Zellen wurden zweimal mit 100 ml A-Medium gewaschen. Die Zellen wurden in Medium A, ergänzt mit 20 IU/ml von rHulL-2, kultiviert, und die Hälfte des Kulturmediums wurde am 7. Tagen der Kultur erneuert. An den Tagen 7 und 10 der Kultur wurde der Überstand entfernt und bei –20°C eingefroren. Die virale Replikation wurde durch Dosieren der inversen Transkriptaseaktivierung im Überstand des 7. Tages der Kultur unter Verwendung eines Dosierungs-Sets Retrosys(r), geliefert von Innovagen (Lund, Schweden), gemessen.
Parallel zu diesem Test der antiviralen Aktivität wurde die zelluläre Lebensfähigkeit durch Mikroskopbeobachtung bewertet. Jeglicher Rückgang der zellulären Konzentration und die Gegenwart zellulärer Fragmente oder einer Modifikation der zellulären Morphologie wurden aufgezeichnet. Der Rückgang der zellulären Lebensfähigkeit wurde mit dem Exklusionsfarbstoff Trypanblau quantifiziert.
Beispiel 1: Kontinuierliches zyklisches Mymetikum
Um ein kontinuierliches zyklisches Mymetikum zu erhalten, das leicht zu synthetisieren ist, wurden die ausgewählten Aminosäuren aus den CDR (dargestellt in 3) extrahiert. Die wichtigen Aminosäurereste von ST40, definiert durch Peptid-Scanning, gefolgt von Alanin-Scanning nach Monnet et al. (1999, s. o.), sind in den 1 und 2 dargestellt. Es wurde beobachtet, dass bestimmte wichtige Aminosäuren nicht innerhalb, oder in manchen Fällen nicht einmal in der Nähe, der CDR-Regionen, wo das Paratop angeordnet ist, angeordnet waren (2). Um die Aminosäuren auszuwählen, die in das Mimetikum eingebunden werden sollten, wurden die bioaktiven Reste auf der 3D-Struktur von ST40 dargestellt (2), und deren Zugänglichkeit für Wasser wurde berechnet (Tabelle 1). Manche Reste wurden in beträchtlicher Entfernung von der Paratopbindungsoberfläche angeordnet gefunden (oberer Teil von 2), wie Lys152 und Lys43, während andere im Protein mit geringer Zugänglichkeit für das Antigen regelrecht vergraben waren. Zahlreiche aromatische Reste wie beispielsweise Tyr40, Phe102 oder Trp149, die oft eine strukturelle Rolle in allen variablen Antikörperregionen spielten, wurden beispielsweise unter den vergrabenen Resten mittels des Kartierungsverfahrens als "aktiv" identifiziert. Im Gegensatz dazu waren geladene Reste wie Arg218 und Arg219, die eher direkt in die Bindung eingebunden waren, konserviert. Zusätzlich zu diesen hydrophilen Resten waren Aminosäuren, für die vorhergesagt wurde, dass sie wesentlich an der Aufrechterhaltung der hydrophoben Stabilisierung des Mimetikums beteiligt wären und die dazu tendierten, erhöhte Zugänglichkeit im Mimetikum aufgrund der Flexibilität der H3-Schleife (z. B. Phe222, Trp163 und Tyr36) aufzuweisen, konserviert, obwohl ihre gemessenen Zugänglichkeitswerte am statischen Modell gering gewesen sein können.
Schließlich wurde eine Grenze für jene Aminosäurereste fixiert, die in das Mimetikum auf Grundlage ihrer Bedeutung, wie sie durch das Alanin-Scanning-Protokoll definiert wurde, und ihrer wahrscheinlichen Zugänglichkeit für das Antigen eingebunden werden sollten. Die ausgewählten Aminosäuren sind in 1 in Kästchen und auf den Schleifen in 3 dargestellt. Alle CDR außer L2 sind im Mimetikum durch zumindest einen Rest vertreten.
Um ein kontinuierliches Peptidmimetikum, das der Synthese zugänglich ist, zu erhalten, wurden die ausgewählten Aminosäuren aus den CDR (in 3 dargestellt) extrahiert. Die relativen Anordnungen und Ausrichtungen im Raum der ausgewählten Aminosäurereste, insbesondere der Seitenketten, wurden konserviert, und die Aminosäuren wurden unter Verwendung von Glycinresten miteinander verbunden, um ein zyklisches Peptid zu erhalten. Die Zyklisierung wird durch eine kovalente Bindung zwischen dem NH2 einer inneren Lysin-Seitenkette und dem C-terminalen Carboxy des Peptids durchgeführt. Diese Position wurde ausgewählt, um eine gewisse Flexibilität innerhalb des N-terminalen Segments des Mimetikums, das die zwei von der flexiblen H3-Schleife von ST40 abgeleiteten Arginine enthält, sicherzustellen. Um das Mimetikum zu stabilisieren, wurden die Glycinreste anschließend systematisch durch hydrophobe Reste oder Prolinreste für die Biegungen ersetzt, um das stabilste Mimetikum zu erhalten, in dem wichtige Aminosäuren dieselben (oder sehr ähnliche) Ausrichtungen, wie sie am intakten Ausgangsantikörper ST40 beobachtet worden waren, aufwiesen. Nach Minimierung und kurzen MD-Simulationen (100 ps) wurden die Positionen und Ausrichtungen der Seitenketten der wichtigen Reste überprüft. Die kurze MD-Simulation ermöglicht es, eine "starke" Verformung des Mimetikums zu beobachten. Das aus den MD-Simulationen zur Synthese ausgewählte, stabilste Mimetikum wies die geringste RMSD (5Å) nach 100 ps auf. Dieses Mimetikum, MK3Tyr genannt, weist die folgende Aminosäuresequenz auf:
In diesem Mimetikum erhalten die meisten Seitenketten der wichtigen Aminosäuren korrekte Konformationen während der 100 ps der MD-Simulation aufrecht. Wird die Simulation auf 300 ps verlängert, erhöht sich die RMSD auf 5,49 (Mittelwert für die letzten 100 ps) aufgrund der inhärenten Flexibilität des Peptids.
Um die Bedeutung der Anordnung der Aminosäurereste, die in die Bindung eingebunden sind, zu beweisen, wurde ein ähnliches zyklisches Peptid mit den wichtigen Resten an unterschiedlichen Positionen und an anderen Aminosäuren für die Bindung als im Mimetikum synthetisiert. Diese "ungeordneten" Peptide wiesen die folgende Aminosäuresequenz auf:
Die Synthesen der Mimetika und der ungeordneten Peptide wurden schrittweise in einer Automated Multiple Peptide Synthesis (AMS 422, ABIMED) durchgeführt. HPLC-Analysen wurden an einem Beckman-LC126-System unter Verwendung der Waters SymetryShield-Säule RP18, 5 Mimetikum, 100 Å (150 × 4,6 mm) mit Puffern A: 0,1% TFA in Wasser, und B: 0,08% TFA in Acetonitril; Gradient von 95% Å bis 100% B in 12,5 min mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,5 ml/min durchgeführt. HPLC-Reinigungen wurden an einem Waters-Prep-LC-4000-System unter Verwendung der Waters PrepPak-Cartridge C18, 6 mm, 60 Å (40 × 100 mm); Gradient von A bis 60% B in 60 min mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 20 ml/min durchgeführt. Die Massenanalyse wurde unter Verwendung eines Maldi-tof-Spektrometers (Voyager DE Elite, PE Applied Biosystems) mit Dihydroxybenzoesäure als Matrix durchgeführt.
Die Peptidsynthese erfolgte mittels eines klassischen Fmoc-Festträger-Protokolls. Die Synthese wurde unter Verwendung eines Polyethylenglykol-Pfropf-Polystyrol-Trägers (Fmoc-PAL-PEG-PS-Harz, Substitution: 0,41 mmol/g) durchgeführt. Die Fmoc-Aminosäuren wurden in situ durch die Aktivierungsreagenzien DIPCDI (Diisopropylcarbodiimid) und HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) in DMF (N,N-Dimethylformamid) mit einem standardmäßigen vierfachen Überschuss aktiviert. Ein Acetylierungsschritt wurde nach jeder Aminosäureeinbindung zur Verkappung möglicher verbleibender Aminogruppen und zur Sicherstellung der Abwesenheit von Deletionspeptiden durchgeführt. Die Fmoc-Schutzgruppen wurden durch eine Lösung von Piperidin in DMF (20%) vor jedem Verbinden entfernt.
Nach Spalten des Trägers und Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen durch Reagens B, ein TFA-basiertes Standardgemisch (88% TFA, 5% Phenol, 5% H₂O, 4% TIPS [Vol.-%]), und eine nach der Spaltung durchgeführte Aufarbeitung durch Etherausfällung wurde die Reinheit von linearem Rohpeptid durch analytische HPLC und Massenspektroskopie geprüft. Lag die Reinheit über 85%, wurde lineares Rohpeptid bei Raumtemperatur unter Verwendung von 1 Äquivalente PyBop und 5 Äquivalenten von NaHCO₃ in DMF zyklisiert. Das Reaktionsgemisch wurde durch präparatives HPLC gereinigt, und das reine Produkt wurde lyophilisiert, um ein weißes Pulver mit einer Gesamtausbeute von 5 bis 20% zu erhalten.
Lag die Reinheit des linearen Peptids unter 85%, so wurde vor der Zyklisierung eine Zwischenreinigung durch präparative HPLC, gefolgt von Lyophilisierung, durchgeführt.
Im Fall des mutierten Mimetikums mit einem durch einen 3-Mercaptopropionsäure-Linker verlängerten Lysin statt eine Isoleucin war die anfängliche NH2-Funktion der Seitenkette dieses Rests besonders durch die Alloc- (Allyloxycarbonyl-) Schutzgruppe geschützt, die nach dem Zyklisierungsschritt gemäß den folgenden Bedingungen spezifisch entfernt wurde: Pd[PPh3]4 (3 Äquivalente), CHCl3/AcOH/NMM (37/2/ 1), r.t., 3 H. Die 3-(Tritylthio)propionsäure wurde dann an die freie NH2-Funktion unter Verwendung von Standard-PyBOP-Aktivierung in DMF gebunden. Das Spalten des Trägers und das Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.
Die reinen Produkte wurden mittels analytischer HPLC und Maldi-Tof-Massenspektrometrie analysiert.
Kinetische Parameter
Das Mimetikum MK3Tyr wurde kovalent an den Sensorchip gebunden, und das CD4 wurde in Lösung gehalten. Das Binden des Mimetikums an den Sensorchip erforderte eine freie Amin- oder Sulfidgruppe am Mimetikum. Aufgabe einer Lösung war, ei ne Aminosäure des Mimetikums, die nicht in die Bindung an ein Lys, verlängert durch eine 3-Mercaptopropionsäuregruppe (3MP = COCH₂CH₃SH), eingebunden war, zu mutieren, um einen langen Linker zu erhalten. Diese Mutation wurde sorgfältig ausgewählt, da die Oberfläche des Mimetikums, die mit dem CD4 wechselwirkte, zugänglich sein musste, wenn das Mimetikum an den Sensorchip fixiert war. Auf Basis der mittleren Struktur der letzten 100 ps der 300 ps der Dynamik-Simulation wurde das Ile zwischen Tyr140 und Asn144 als die beste Stelle für Mutation identifiziert. Es wurde beobachtet, dass an dieser Position die Lys-Seitenkette, verlängert durch 3MP, von der Oberfläche hervorstand, von der vorhergesagt wurde, dass sie für die CD4-Wechselwirkung wichtig wäre. Dieser Entwurf ist in 4 dargestellt, und das Mimetikum ist als Mk3Tyr-long1SH bezeichnet.
Die kinetischen Parameter, ka und kd, des immobilisierten Mimetikums Mk3Tyrlong1SH und löslichen CD4 wurden gemessen und ergaben Werte von ka 8,26 × 104 s^–1m–¹ und kd 2,64 × 10^–4s^–1. Der berechnete K_D beträgt 3,2 nM.
Die Wechselwirkung verschiedener, nicht relevanter Proteine (8A6, ein Antilyphozyt MAb, 9E8, ein Anti-Troponin I MAb, Troponin C und Tyroglobulin) mit dem immobilisierten Mimetikum wurden auch getestet, und die Ergebnisse sind in 5A gezeigt. Für keines dieser Proteine wurde eine Bindung beobachtet.
Für die Vergleichsstudie wurden ST40 MAb (50 μg/ml) und CD4 (20 μg/ml) vorgemischt und anschließend auf den Sensorchip ko-injiziert (5B). Dasselbe Experiment wurde mit dem irrelevanten MAb 9E8 durchgeführt. Das Binden von CD4 an das Mimetikum wurde durch ST40 gehemmt, während das irrelevante MAb 9E8 keine Wirkung auf die Bindung hatte. Dies zeigt eindeutig, dass sich das Mimetikum an derselben Stelle oder einer Stelle, die dieser sehr nah war, band wie ST40 an CD4.
Anti-retrovirale Aktivitätstests
Die anti-retrovirale Aktivität des Mimetikums wurde in einem Zelltest, wie im Abschnitt der Verfahren beschrieben wurde, getestet. Der irrelevante Antikörper 9E8 wurde als eine negative Kontrolle und ST40 als positive Kontrollen verwendet. Der Anti-HIV-Reverse-Transkriptase-Inhibitor AZT und der Antikörper Q4120 wurden als der positive Bezugspunkt herangezogen. Die Daten sind in Tabelle 2 dargestellt.
Der Antikörper der negativen Kontrolle 9E8 zeigt eine dosisunabhängige Aktivität zwischen –5% und +13% Hemmung, ein Wert, der als innerhalb des Bereichs des Hintergrundtestrauschens liegt. Der Antikörper der positiven Kontrolle Q4120 und der Mimetikum-Ausgangsantikörper ST40 zeigen ähnliche dosisabhängige Aktivität, die zu 96% maximaler Hemmung führt. Das Mimetikum zeigt eine dosisabhängige Hemmung mit einem Maximum von 70% viraler Hemmung bei 50 μM. Während sämtlicher Tests wurde kein Zellsterben beobachtet. Dahingegen zeigt das ungeordnete Peptid ein dosisunabhängiges, nicht lineares Verhalten und wird, wie 9E8, als innerhalb des Bereichs des Hintergrundrauschens erachtet.
Beispiel 2: Entwurf eines Mimetikums von ST40 mit CDR-Schleifen
Der erste Schritt im Entwurf war die Auswahl der Aminosäuren der Fv, die eingebunden werden sollten. Die 5 ausgewählten Fragmente, die insgesamt 36 Reste enthielten, sind in Kästchen in 6 dargestellt. Das schwierigste Problem ist es, diese Fragmente von Aminosäuren miteinander zu verbinden und die Konformationen der CDR in Bezug zueinander zu bewahren. Sind alle 5 Schleifen in das Mimetikum eingebunden, so würde die Anzahl der Reste nach der Bindung höher als 60 sein, was im Rahmen der Synthese nicht annehmbar ist. Aus diesem Grund wurde beschlossen, dass Mimetika von H3 zuerst alleine modelliert, synthetisiert und getestet werden würden, dann in einem zweiten Schritt Mimetika von H3-L1 und schließlich Mimetika, die alle drei Schleifen H3-L1-L3 enthielten. Die Schleifen wurden unter Verwendung der Seitenketten geeignet angeordneter Reste verbunden. Es wurden zahlreiche Mimetika modelliert, wobei hierin jedoch nur einige wenige Beispiele dargebracht werden.
A) H3-Mimetikum
Alle H3-Mimetika wurden an jedem Ende der Schleife durch eine Amidbindung oder durch eine Disulfidbrücke, umfassend die Seitenketten von Cys, Glu, Lys, Arg oder Orn, verbunden.
Eine MD-Simulation wurde an sechs Mimetika von H3 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Mimetikum mit einer Disulfidbrücke seine Ausgangskonformation nicht beibehält. Die stabilsten Mimetika von H3 sind R und E, die in 10 gezeigt sind. Diese 2 Mimetika wurden für den Zusatz von L1 ausgewählt. Das Mimetikum E wird bevorzugt, da die Bindung keine wichtige Aminosäure umfasst. Das Mimetikum E wurde synthetisiert.
B) H3L1-Mimetikum
Das zweite Fragment, das L1 darstellt (siehe 1), wurde über die Seitenketten von Asp221 und ein Lys, das L1 durch Mutation von Asn38 hinzugefügt worden war, an H3 gebunden. Die H3-Mimetika R und E wurden beide zum Modellieren von H3L1 verwendet.
Das erste Mimetikum RM wies ein sehr kurzes Fragment von L1 auf (siehe 11), das sehr flexibel war und mit H3 wechselwirkte, was zu einer Verformung dieser Schleife während der MD-Simulation führte. Anschließend wurde ein Fragment von L1 verwendet (Val29 bis Met37), und eine Disulfidbrücke wurde durch Mutation von Val29 und Met 37 zu Cys eingebunden, um die Konformation von L1 zu stabilisieren. Trp39 wurde L1 hinzugefügt, um die Anzahl der aromatischen Reste am unteren Ende des Mimetikums wie im Ausgangs-ST40 zu erhöhen. Das Mimetikum EC war nach 100 ps Dynamik-Simulation stabiler als RM, sogar wenn L1, im Gegensatz zu ST40, eine zyklische Konformation am Scheitelpunkt der Schleife einnahm (12). Dies wurde nicht als relevant erachtet, da dieser Teil des Moleküls während der MD-Simulation von ST40 selbst flexibel ist, und in jedem Fall sollte das Fragment L1 stabiler in Gegenwart von L3 sein. Somit wurde keine weitere Version des H3L1-Mimetikums modelliert.
Schließlich wurde die Bindung zwischen E und C modifiziert, um die Synthese zu erleichtern. Asp221 der E-Schleife (H3) wurde zu Cys mutiert, um eine Bindung S-CH2-CO-NN mit dem Lys der C-Schleife (L1) durch die Addition von 1-CH2-CO-(N1-CO-CH2-CH2-C10) zu bilden. Eine MD-Simulation von 300 ps dieses Mimetikums in Wasser mit einem Na⁺-Ion wurde für dieses Mimetikum durchgeführt. Die Überlagerung der Strukturen ist in 13 und die PCA-Ergebnisse sind in 14 dargestellt.
Die Schleife H3 wird während der Dynamik relativ stark verformt, doch die 2 Schleifen befinden sich stets in korrektem Abstand voneinander, und die PCA an der Hauptkette ist nicht allzu unterschiedlich. Die einzelne Schleife C (L1) von EC₂ wurde synthetisiert und weist eine geringe biologische Aktivität auf. Die Synthese von EC ist in Bearbeitung, wobei vorhergesagt wird, dass durch Hinzufügen der 2 Schleifen die biologische Aktivität im Vergleich zu Schleife C (L1) alleine steigt.
C) H3L1L3-Mimetikum
Nach dem Testen verschiedener Bindungsarten zwischen L1 und L3, um H3L1L3 zu entwerfen, scheint es, dass die stabilsten Mimetika gefunden werden, wenn L3 länger als die anfängliche Auswahl ist und wenn L3 sowohl mit L1 als auch mit H3 verbunden ist.
Schließlich wurde das Mimetikum E[WFK]2 (15) oder E[WFK]3, worin ein Orn anstelle eines Lys verwendet wurde, um H3 und L1 zu verbinden, zur Synthese ausgewählt. Die MD-Simulationen dieser 2 Mimetika wurden durchgeführt, und die Ergebnisse sind in den 16 und 17 dargestellt. Ist Orn vorhanden, so ist das Modell kompakter als mit Lys und weist eine bessere RMSD aufgrund der Deformation von L3 mit dem Lys auf.
Natürlich wird es aufgrund der Abwesenheit mehrerer Schleifen schwer sein, ein Mimetikum zu erhalten, das exakt dieselbe Konformation wie ST40 aufweist, doch wenn zumindest das Mimetikum H3L1L3 während der Dynamik-Simulation stabil bleibt, wie beispielsweise mit E[WF_k]3 beobachtet wurde, so weist es wahrscheinlich auch in Lösung gewisse Stabilität auf. Die Synthese von E[WF_k]3 kann schwierig sein, und in diesem Fall kann die Verbindung zwischen H3 und L3 entfernt werden müssen.
Tabelle 1. Die für das Lösungsmittel zugänglichen Oberflächenabschnitte der wichtigen (rot) und weniger wichtigen Reste für das 3D-Modell von ST40 wurden mit dem SALVOL-Programm, entwickelt von R.S. Pearlman et al., in Sybyl implementiert berechnet. Die Aminosäuren im Fettdruck sind jene, die ausgewählt wurden, um Teile des Mimetikums darzustellen.
Tabelle 2 Antiviraler Aktivitätstest an PBMC, infiziert durch HIV-Isolate. Die Ergebnisse sind in % der Hemmung angegeben

Claims

Verfahren zum Entwerfen eines Mimetikums, das mit einem Ausgangsmolekül verbundene Aktivität aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Identifizieren mehrerer chemischer Gruppen des Ausgangsmoleküls, die mit der Aktivität verbunden sind; Bilden eines Mimetikums, das die chemischen Gruppen, die mit Aktivität verbunden sind, und eine Struktur umfasst, welche die chemischen Gruppen verbindet; Durchführen einer Moleküldynamik-Simulation des gebildeten Mimetikums am Computer; Bestimmen aus der Simulation, ob das Mimetikum einem vorgegebenen Kriterium folgt; Variieren der Bindungsstruktur, um ein zweites Mimetikum herzustellen, das dem vorgegebenen Kriterium besser folgt.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Entwerfen eines Mimetikums einer Antikörperbindungsregion, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bereitstellen der dreidimensionalen Struktur zumindest der Zielbindungsregion der variablen Antikörperdomäne; Identifizieren von Aminosäureresten innerhalb der Region, die möglicherweise mit der Zielbindung zusammenhängen, auf Basis von experimentellen Daten; Bestimmen des jeweiligen Zugänglichkeitsgrades der einzelnen identifizierten Aminosäurereste innerhalb der dreidimensionalen Struktur am Computer; Auswählen mehrerer Aminosäurereste, denen Zielbindungsaktivität zugeordnet wird, aus den identifizierten Aminosäuren; Bilden eines Mimetikums, das die Vielzahl an Aminosäuren umfasst, wobei die Aminosäuregruppen innerhalb des Mimetikums eine relative geometrische Anordnung aufweisen, die ihrer ermittelten relativen geometrischen Anordnung im Ausgangsantikörper entspricht; Durchführen einer Moleküldynamik-Simulation des gebildeten Mimetikums am Computer; Bestimmen aus der Simulation, ob das Mimetikum einem vorgegebenen Kriterium folgt; Variieren der Bindungsstruktur, um ein zweites Mimetikum herzustellen, das dem vorgegebenen Kriterium besser folgt.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Aminosäurereste, denen Zielbindung zu geordnet wird, zumindest einen ersten Rest, der sich auf einer ersten Schleife der variablen Antikörperdomäne befindet, und zumindest einen Rest umfassen, der sich nicht auf der ersten Schleife der variablen Antikörperdomäne befindet; und Entwerfen eines Mimetikums, das einen ersten zyklischen Abschnitt mit dem ersten Rest umfasst und außerhalb des ersten zyklischen Abschnitts den zweiten Rest umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, worin sich zumindest der zweite Rest auf einer zweiten Schleife der variablen Antikörperdomäne befindet; und worin das Mimetikum einen ersten zyklischen Abschnitt mit dem Rest umfasst und außerhalb des ersten zyklischen Abschnitts einen zweiten zyklischen Abschnitt umfasst, der zumindest den zweiten Rest umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Mimetikum ein Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Ausgangsmolekül ein Antikörper ist, der CD4 bindet, und das Mimetikum ein Peptid ist, das CD4 bindet.