DE69737809T2

DE69737809T2 - Methoden zur herstellung von op-1 morphogen analoge

Info

Publication number: DE69737809T2
Application number: DE69737809T
Authority: DE
Inventors: Peter Millbury KECK; Diana L. Weston GRIFFITH; William D. Weston CARLSON; David C. Hopkinton RUEGER; Kuber T. Medway Sampath
Original assignee: Brandeis University; Curis Inc
Current assignee: Brandeis University; Stryker Corp
Priority date: 1996-01-22
Filing date: 1997-01-22
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2017-01-23
Also published as: EP0876401A2; AU725295B2; CA2244228A1; WO1997026277A2; AU2244997A; US6273598B1; ATE364629T1; DE69737809D1; JP2000501744A; EP0876401B1; WO1997026277A3; US20020028453A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zum Gestalten, Identifizieren und Herstellen von als Gewebeformbildungsprotein-Analogen nützlichen Verbindungen. Insbesondere betrifft die Erfindung Struktur basierende Verfahren, die beim Gestalten, Identifizieren und Herstellen von Molekülen nützlich sind, die als funktionelle Mimetika des Gewebeformbildungsproteins osteogenen beziehungsweise knochenbildenden Protein-1 (OP-1) wirken.
Die Zelldifferenzierung stellt die zentrale Eigenschaft der Gewebegestaltbildung dar, die während der Embryogenese beginnt und bis zu verschiedenen Graden durch das ganze Leben eines Organismus bei der Reparatur erwachsenen Gewebes und Regenerationsmechanismen fortdauert. Der Grad der Gestaltbildung in erwachsenem Gewebe variiert unter den unterschiedlichen Geweben und ist unter anderem auf den Grad des Zell-Turnover in einem gegebenen Gewebe bezogen.
Die zellulären und molekularen Ereignisse, die den Stimulus zur Differenzierung von Zellen steuern stellt einen Bereich intensiver Forschung dar. IN den medizinischen und tiermedizinischen Fachrichtungen wird erwartet, dass die Entdeckung des Faktors oder der Faktoren, die die Zelldifferenzierung und Gewebegestaltbildung steuern die Fähigkeit erkrankte oder geschädigte Säugetiergewebe und Organe zu reparieren und regenerieren wesentlich vorantreiben wird. Besonders nützliche Gebiete für Therapeutika für Mensch und Tier umfassen Wiederherstellungschirurgie, die Behandlung von Gewebe degenerativen Erkrankungen, einschließlich beispielsweise Arthritis, Emphysem, Osteoporose, Kardiomyopathie, Zirrhose, degenerative Nervenerkrankungen, entzündliche Erkrankungen und Krebs, und bei der Regeneration von Geweben, Organe und Gliedmaßen. Bei diesen und verwandten Anwendungen werden die Begriffe "morphogenetisch" und "morphogen beziegsweise gestalt- formbildend" austauschbar verwendet.
In den letzten Jahren wurde eine Anzahl unterschiedlicher Faktoren isoliert, die scheinbar eine Rolle bei der Zelldifferenzierung spielen. Kürzlich wurde eine andere Unterfamilie der "Superfamilie" von strukturell verwandten Proteinen als die wahren Gewebemorphogene identifiziert, die im Stand der Technik als die "transformierende Wachstumsfaktor-β (TGF-β) Superfamilie" bezeichnet wird.
Die Mitglieder dieser unterschiedlichen "Superfamilie" der wahren Gewebegestaltbildungsproteine teilen eine wesentliche Aminosäuresequenzhomologie innerhalb deren gestaltbildenden bzw. morphogenen aktiven C-terminalen Domänen (mindestens 50 % Identität in der C-terminalen 102 Aminosäuren umfassenden Sequenz), einschließlich eines konservierten sechs oder sieben Cysteine umfassenden Skeletts, und teilen die in vivo Aktivität eine gewebespezifische Gestaltbildung in einer Vielzahl von Organen und Geweben zu induzieren. Die Proteine treten scheinbar mit Vorläuferzellen in Kontakt oder interagieren mit diesen, beispielsweise indem sie an geeignete Zelloberflächenmoleküle binden, wodurch die Zellen prädisponiert oder auf andere Weise stimuliert werden sich zu teilen bzw. vermehren bzw. proliferieren und in einer gestaltbildenden permissiven Umgebung zu differenzieren. Die gestaltbildenden Proteine können die Entwicklungskaskade zellulärer und molekularer Ereignisse induzieren, die in der Bildung eines neuen organspezifischen Gewebes, einschließlich einer beliebigen Gefäßbildung, Bindegewebebildung und Nerveninnervation, wie es durch natürlich vorkommendem Gewebe erforderlich ist, gipfelt. Die Proteine zeigten, dass sie sowohl die Gestaltbildung von Knochenknorpel und Knochen, als auch periodontale Gewebe, Dentin, Leber und Nervengewebe, einschließlich Retinagewebe induzieren.
Die bis heute identifizierten wahren Gewebegestaltbildungsproteine umfassen Proteine, die ursprünglich als Knochen induzierende Proteine identifiziert wurden. Diese umfassen OP-1, (Knochen bildendes Protein-1, ebenfalls in verwandten Anwendungen als "OP1" bezeichnet), dessen Homolog 60Å bei Drosophila, mit dem es 69 % Identität in der C-terminalen "sieben Cysteine" Domäne teilt, und die verwandten Proteine OP-2 (ebenfalls in verwandten Anwendungen als "OP2" bezeichnet) und OP-3, die beide ungefähr 65-75 % Identität mit OP-1 in der C-terminalen sieben Cystein Domäne teilen, als auch BMP5, BMP6 und dessen homolog der Maus, Vgr-1, die alle mehr als 85 % Identität mit OP-1 in der C-terminalen Cystein Domäne teilen und das BMP6 Homolog von Xenopus, Vgl, das ungefähr 65-75 % Identität mit OP-1 in der C-terminalen sieben Cystein Domäne teilen, als auch BMP5, BMP6 und dessen homolog der Maus, Vgr-1, die alle mehr als 85 % Identität mit OP-1 in der C-terminalen Cystein Domäne teilen und das BMP6 Homolog von Xenopus, Vgl, das ungefähr 57 % Identität mit OP-1 in der C-terminalen Sieben Cystein Domäne teilt. Andere Knochen indizierende Proteine umfassen die CBMP2 Proteine (ebenfalls im Stand der Technik als BMP2 und BMP4 bezeichnet) und deren Drosophila-Homolog, DPP. Ein anderes Gewebegestaltbildungsprotein ist GDF-1 (aus der Maus). Siehe beispielsweise PCT-Dokumente US92/01968 und US92/07358 . Die Mitglieder der BMP/OP Unterfamilie und die Identitäten der Aminosäuresequenzen (ausgedrückt als Prozent) zwischen ausgewählten Mitgliedern der TGF-β Superfamilie sind in 6 gezeigt.
Diese wahren Gewebegestaltbildungsproteine werden, wie vorstehend erwähnt, im Stand der Technik als eine unterschiedliche Unterfamilie von Proteinen anerkannt, die sich darin von anderen Mitgliedern der TGF-β Superfamnilie unterscheidet, dass sie einen hohen Grad an Sequenzidentität in der C-terminalen Domäne teilen und dass die wahren Gewebegestaltbildungsproteine selbst die vollständige Kaskade von Ereignisse induzieren können, die zu einer Bildung funktionsfähigen Gewebes führt, als vielmehr lediglich die Bildung von fibrotischem (Narben) Gewebe zu induzieren. Insbesondere können die Mitglieder der Familie der Gestaltbildungsproteine alles das Folgende in einer gestaltbildenden permissiven Umgebung: Stimulieren einer Zellvermehrung und Zelldifferenzierung, und Unterstützen des Wachstums und Aufrechterhaltung von differenzierten Zellen. Die Gestaltbildungsproteine können offenkundig ebenfalls als endokrine, parakrine und autokrine Faktoren wirken.
Die Gestaltbildungsproteine sind zu einer wesentlichen "Kommunikation" (crosstalk) über die Arten befühigt. Das heißt, dass Homologe dieser Proteine von Xenopus (Fremdart) für einander bei der funktionellen Aktivität ersetzt werden können. Beispielsweise können dpp und 60Å, zwei Drosophila-Proteine deren Säugetierhomologe, BMP2/4 beziehungsweise OP-1 ersetzen und die endochondrale Knochenbildung an einer Nicht-Knochenstelle in einem Standardtest der Knochenbildung in der Ratte induzieren. Auf ähnliche Art und Weise wurde gezeigt, dass BMP2 eine dpp-Mutation in Drosophila rettet. In deren nativer Form scheinen jedoch die Proteine gewebespezifisch zu sein, wobei jedes Protein gewöhnlich in einem Gewebe exprimiert oder lediglich einem oder einigen Geweben bereitgestellt, oder alternativ lediglich zu bestimmten Zeiten während der Entwicklung exprimiert wird. Beispielsweise scheint GDF-1 hauptsächlich in Nervengewebe exprimiert zu sein, während OP-2 bei relativ hohen Spiegeln in frühen (beispielsweise Tag-8) Mausembryonen exprimiert zu sein scheint. Die endogenen Morphogene können durch die Zellen auf die sie Wirken, durch benachbarte Zellen, oder durch Zellen eines entfernten Gewebes synthetisiert werden, wobei das sekretierte Protein zu den Zellen transportiert wird, auf die es einwirken soll.
Ein besonders potentes gestaltbildendes beziehungsweise morphogenes Protein stellt OP-1 dar. Dieses Protein und dessen xeongenen Homologe werden in einer Vielzahl von Geweben, hauptsächlich Geweben von urogentalen Ursprungs, als auch im Knochen, in Brust- und Speicheldrüsengewebe, Reproduktionsgeweben und Verdauungskanal-Gewebe exprimiert. Es wird ebenfalls in unterschiedlichen Geweben während der Embryogenese exprimiert, wobei dessen Anwesenheit mit dem Beginn der Gestaltbildung von jenem Gewebe zusammenfällt.
Die Signalübertragung von Gestaltbildungsprotein über die Zellmembran scheint als ein Ereignis einer spezifischen Bindungsinteraktion mit einem oder mehreren Rezeptoren der Zelloberfläche aufzutreten. Vorherige Untersuchungen über die Bindung an Zelloberflächenrezeptoren von verschiedenen Mitgliedern der TGF-β Protein-Superfamilie legen nahe, dass die Liganden deren Aktivität durch Interaktion mit zwei unterschiedlichen Rezeptoren vermitteln, bezeichnet als Typ-I und Typ-II Rezeptoren, um einen Hetero-Komplex zu bilden. Ein an der Zelloberfläche gebundenes Beta-Glycan kann ebenfalls die Bindungsinteraktion verstärken. Die Typ-I und Typ-II Rezeptoren sind beides Serin/Threonin-Kinasen und teilen ähnliche Strukturen: eine intrazelluläre Domäne, die im Wesentlichen aus der Kinase besteht, eine kurze, gedehnte hydrophobe Sequenz, die ausreicht die Membran einmal zu überspannen und eine extrazelluläre Domäne, die durch eine hohe Konzentration konservierter Cysteine gekennzeichnet ist.
Morphogene Proteine sind über Disulfid verbundene Dimere, die als große Vorläufer- Polypeptidketten exprimiert werden, umfassen eine hydrophobe Signalsequenz, eine lange und relativ schwach konservierte N-terminale Pro-Region von mehreren hundert Aminosäuren, eine Spaltstelle und eine Reife- bzw. Reifungs-Domäne, die eine N-terminale Region umfasst, welche unter den Familienmitgliedern variiert und ein starker konservierte C-terminale Region. Die C-terminale Region, die in den prozessierten reifen Proteinen aller bekannter Mitglieder der Morphogenfamilie vorhanden sind, umfasst ungefähr 100 Aminosäuren mit einem charakteristischen Motiv, das ein konserviertes sechs oder sieben Cystein Skelett aufweist. Jedes der bis heute isolierten Morphogenproteine sind Dimerstrukturen, wobei die Mannoseuntereinheiten durch nicht kovalente Interaktionen oder durch eine oder mehrere Disulfidbindungen zusammengehalten werden. Die Morphogen-Proteine sind als dimere Proteine, jedoch nicht als individuelle monomere Einheiten, aktiv.
Als Ergebnis deren biologischer Aktivitäten wurden erhebliche Mühen auf die Entwicklung von auf Morphogenen basierenden Therapeutika zur Behandlung verletzten oder erkrankten Säugetiergewebes gerichtet, einschließlich beispielsweise therapeutischer Zusammensetzungen, um regeneratives Heilen von Knochendefekten, wie Brüchen zu induzieren, sowie therapeutische Zusammensetzungen, um gesunde metabolische Eigenschaften in erkranktem Knochengewebe, beispielsweise knochenbildendes Knochengewebe, zu erhalten oder wiederherzustellen. Vollständige Beschreibungen der Bemühungen auf Morphogen basierende Therapeutika für nicht-chondrogene Gewebeanwendungen in Säugern, insbesondere Menschen zu entwickeln, sind dargelegt in: EP 0 575 555 , WO93/04692 ; WO93/05751 ; WO94/06399 ; WO94/03200 ; WO94/06449 ; WO94/10203 und WO94/06420 ; Griffith et al., J. Bone & Mineral Research 10 (Supplement 1), Abstract 1, Abstract T394, Seventeenth Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research, Sept. 9-13 (1995) berichtet die 3-dimensionale Struktur von OP-1 bis 2,8 Amstrongs beziehungsweise Angström Auflösung und vergleicht dessen Struktur mit TGF-β2.
Es können bestimmte Schwierigkeiten auf Verabreichung von natürlich isolierten oder rekombinant hergestellten Morphogen-Proteinen an einen Säuger wahrgenommen werden. Diese Schwierigkeiten können beispielsweise den Verlust morphogener Aktivität aufgrund einer Dissoziation des biologisch aktiven Morphogen-Dimers in dessen nicht-aktive mono mere Einheiten umfassen und/oder Handhabungsprobleme aufgrund niedriger Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen.
Demgemäß verbleibt ein Bedarf für die Identifizierung von Morphogen-Analogen, die die physiologischen Wirkungen eines morphogenen Proteins, beispielsweise OP-1 nachahmen oder verstärken. Die Analoge können modifizierte, morphogen aktive hOP-1 Protein-Dimere oder Fragmente oder verkürzte Analoge davon sein, Peptide oder kleine organische Moleküle. Vorzugsweise weisen die Analoge verstärkte therapeutische Werte auf, beispielsweise indem sie unter physiologischen Bedingungen stabiler und/oder löslicher sind als natürlich vorkommendes hOP-1, oder beispielsweise erhöhte Zielgruppen- beziehungsweise Targetting Gewebespezifität, erhöhte biologische Verteilung oder eine verringerte Filtrationsrate in dem Körper aufweist.
Diese und andere Gegenstände und Merkmale werden aus der Beschreibung, den Zeichnungen und den folgenden Ansprüchen offenbar werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Röntgen-Kristallographie-Bestimmung der drei-dimensionalen Struktur von reifem, dimerem menschlichem osteogenem beziehungsweise knochenbildenden Protein-1 (hOP-1). Die drei-dimensionale Struktur von hOP-1 wurde bis auf 2,8 Å aufgelöst. Hier werden zwei Sätze von atomaren Röntgen-Kristallographie-Koordinaten für hOP-1 bereitgestellt, wobei ein Satz eine hOP-1 Struktur festlegt, die bis auf eine Auflösung von 2,8 Å aufgelöst wurde, wobei der andere Satz ein hOP-1 definiert, das bis zu einer Auflösung von 2,3 Å aufgelöst wurde. Mit dieser Beschreibung werden dem Fachmann zwei Sätze atomarer Koordinaten bereitgestellt, die bei einer herkömmlichen rechnergestützten Gestaltung (CAD)-Verfahren verwendet werden können, um Protein oder Peptidanaloge von OP-1 zu identifizieren oder zu gestalten oder alternativ kleine organische Moleküle zu identifizieren oder zu gestalten, die OP-1 funktionell nachahmen.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines, wie in den beigefügten Ansprüchen festgelegtes OP-1-Analog-Peptid bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die atomaren Koordinaten durch sowohl einen Anteil oder die gesamten atomaren Koordinaten, die in 15 und 16 dargelegt sind, festgelegt.
Der wie hier verwendete Begriff "Computersystem" soll so verstanden werden, dass er ein beliebiges allgemeines oder spezielles Zwecksystem bedeutet, das einen Prozessor umfasst, der mit sowohl einem Speicher als auch mindestens einer Eingabe-/Ausgabeeinrichtung, beispielsweise ein Terminal, elektrisch verbunden ist. Ein derartiges System kann Personalcomputer, Arbeitsstationen oder Großrechner umfassen, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Der Prozessor kann ein allgemeiner Zweckprozessor oder Mikroprozessor oder ein spezialisierter Prozessor sein, der in einem RAM-Speicher lokalisierte Programme ausführt. Die Programme können von einer Speichereinrichtung, wie beispielsweise einer Diskette oder einem vorprogrammierten ROM-Speicher in RAM angeordnet werden. In einer Ausführungsform wird der RAM-Speicher sowohl für Datenspeicherung als auch Programmausführung verwendet. Der Begriff Computersystem umfasst ebenfalls Systeme, bei denen der Prozessor und der Speicher in unterschiedlichen körperlichen Entitäten vorliegen, die jedoch durch ein Netzwerk elektrisch verbunden sind.
In der vorliegenden Erfindung führt der Prozessor ein Modellierungsprogramm aus, das auf Daten Zugriff hat, die für die Röntgenstrahl-Kristallographie-Koordinaten von HOP-1 repräsentativ sind, wodurch ein dreidimensionales Modell des Moleküls konstruiert werden kann. Außerdem kann der Prozessor ebenfalls ein anderes Programm, ein Lösungsmittel zugängliches Oberflächen-Programm, ausführen, das das dreidimensionale Modell von hOP-1 dazu verwendet, um eine einem Lösungsmittel zugängliche Oberfläche von mindestens einem Bereich des hOP-1-Moleküls zu konstruieren und wahlweise die dem Lösungsmittel zugänglichen Bereiche von Atomen zu berechnen. Das Programm für ein für die Oberfläche zugängliches Lösungsmittel und das Modellierungsprogramm können das gleiche Programm sein. Das Modellierungsprogramm und das Programm für ein der Oberfläche zugängliches Lösungsmittel können unterschiedliche Programme sein. Das Modellierungsprogramm kann entweder das dreidimensionale Modell von hOP-1 in einer Region eines Speichers speichern, der sowohl ihm als auch dem Programm für eine dem Lösungsmittel zugängliche Oberfläche zugänglichen ist, oder das dreidimensionale Modell kann auf einen externen Speicher, wie einer Diskette, einer CD ROM oder einem Magnetband für einen späteren Zugang durch das Programm für ein dem Lösungsmittel zugängliches Lösungsmittel geschrieben werden.
Der Speicher kann darin den gesamten Satz von Röntgen-Kristallographie-Koordinaten speichern, die reifes biologisch aktives menschliches OP-1 definieren, oder einen Untersatz derartiger Koordinaten umfassen können, die beispielsweise einen oder mehrere einschließen von: einer Finger 1-Region, einer Finger 2-Region und einer Fersen- bzw. Heel-region. Die Proteinstrukturen, die dem Finger und der Fersenregion entsprechen, werden nachfolgend ausführlich beschrieben.
Wie hier bezüglich OP-1 (oder verwandten Morphogenen) verwendet, oder bezüglich einer Region von OP-1, soll der Ausdruck "mindestens ein Protein der dreidimensionalen Struktur von" oder "mindestens ein Bereich von" einen Bereich der dreidimensionalen Oberflächenstruktur des Morphogens, oder Bereich des Morphogens bedeuten, einschließlich Ladungsverteilungs- und Hydrophilie/Hydrophobie-Eigenschaften, die durch mindestens drei, vorzugsweise mindestens drei bis zehn, und am meisten bevorzugt mindestens zehn benachbarter Aminosäurereste des OP-1-Monomers oder Dimers gebildet wird. Die benachbarten Reste, die einen derartigen Bereich bilden, können Reste darstellen, die einen benachbarten Bereich der primären Struktur des OP-1 Moleküls bilden, Reste, die einen benachbarten Bereich der dreidimensionalen Oberfläche des OP-1 Monomer bilden, Reste, die einen benachbarten Beeich der dreidimensionalen Oberfläche des OP-1 Dimers bilden, oder eine Kombination davon. Folglich ist es nicht erforderlich, dass die einen Bereich der dreidimensionalen Struktur von OP-1 bildenden Reste in der Primärsequenz des Morphogens benachbart sein/sind, jedoch vielmehr einen benachbarten Bereich der Oberfläche des Morphogen-Monomers oder -Dimers bilden müssen. Insbesondere können derartige Reste in der Primärstruktur eines einzelnen Morphogen-Monomers nicht-benachbart sein oder können Reste von unterschiedlichen Monomeren in der dimeren Form des Morphogens umfassen. Wie hier verwendet, bilden die Reste, die "einen Bereich der dreidimensionalen Struktur von" einem Morphogen, oder "einen Bereich von" einem Morphogen bilden, eine benachbarte dreidimensionale Oberfläche, in der jedes Atom oder funktionelle Gruppe, die einen Bereich der Oberfläche bildet von dem den Oberflächenbereich bildenden nächsten Atom oder der funktionellen Gruppe durch nicht mehr als 40 Å, vorzugsweise durch nicht mehr als 20 Å, noch bevorzugter nicht mehr als 5-10 Å, und am meisten bevorzugt durch nicht mehr als 1-5 Å getrennt.
Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck "Röntgen-Kristallographie-Koordinaten" auf eine Reihe von mathematischen Koordinaten (dargestellt als "X","Y" und "Z"-Werte), die sich auf die räumliche Verteilung von Reflexionen beziehen, die durch die Beugung eines monochromatischen Röntgenstrahls durch Atome eines hOP-1 Moleküls in Kristallform erzeugt werden. Die Beugungsdaten werden verwendet, um Elektronendichtekarten der Wiederholungseinheiten eines Kristalls zu erzeugen, wobei die sich ergebenden Elektronendichtekarten dazu verwendet werden, um die Positionen individueller Atome innerhalb der Einheitszelle des Kristalls zu definieren.
Es wird dem Fachmann klar sein, dass die hier dargestellte hOP-1 Struktur von dessen Orientierung unabhängig ist, und dass die in 15 und 16 aufgelisteten Atomkoordinaten lediglich eine mögliche Orientierung der hOP-1 Struktur darstellen. Es ist folglich offenkundig, dass die in 15 und 16 aufgelisteten Atomkoordinaten ohne Änderung der relativen Positionen von Atomen oder Merkmalen der hOP-1 Struktur mathematisch gedreht, translatiert, skaliert oder einer Kombination davon werden können. Derartige mathematische Manipulationen sind vorgesehen hierin umfasst zu sein. Weiterhin wird dem Fachmann offenbar sein, dass die hier festgelegten Röntgen-Atom-Koordinaten ein gewisses Maß an Unsicherheit bei der Lokalisierung (siehe beispielsweise Spalte "δ" in 16, die die thermisch Unsicherheit in der Lokalisierung von jedem Atom, ausgedrückt in Å, zeigt) aufweist. Es ist für diese Erfindung zweckdienlich, dass ein vorgewähltes Protein oder Peptid mit der gleichen Aminosäuresequenz, wie mindestens ein Bereich von hOP-1 als die gleiche Struktur wie der entsprechende Bereich von hOP-1 aufweisend angesehen wird, wenn ein Satz von Atom-Koordinaten, der die Rückgrat Cα-Atome des vorgewählten Proteins oder Peptids festlegt, den entsprechenden Cα-Atomen für hOP-1 (wie in 16 aufgelistet) überlagert werden können, um eine Standardabweichung von vorzugsweise weniger als ungefähr 1,5 Å und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 0,75 Å zu erhalten.
Wie hier verwendet, soll der Ausdruck "Morphogen-Analog" ein beliebiges Molekül bedeuten, das die Bindungsaktivität des OP-1-Rezeptors nachahmen oder eine durch den Rezeptor vermittelte biologische stromabwärts gelegene Wirkung induzieren kann, die für ein morphogenes Protein charakteristisch ist. Die Induktion einer alkalische Phosphatase-aktivität stellt ein charakteristischen biologische Wirkung dar. Das Analog kann ein Protein, Peptid, oder eine auf einem organischen Molekül basierendes Nicht-Peptidyl sein. Demgemäß umfasst der Ausdruck Morphogen-Analog eine beliebige Substanz, die eine derartige Op-1 ähnliche Aktivität ungeachtet der chemischen oder biochemischen Beschaffenheit davon aufweist. Das vorliegende Morphogen-Analog kann eine einfache oder komplexe Substanz sein, die durch ein lebendes System oder durch chemische oder biochemische Syntheseverfahren erzeugt wird. Es kann ein großes Molekül, beispielsweise ein modifiziertes hOP-1-Dimer sein, das durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird, oder ein kleines Molekül, beispielsweise ein organisches Molekül, das de novo gemäß den Prinzipien einer rationalen Arzneimittelgestaltung hergestellt wird. Es kann eine Substanz sein, die ein Mutein (oder Mutant-Protein) von hOP-1 ist, eine Substanz, die einer einem Lösungsmittel ausgesetzten Oberflächenepitop von hOP-1 strukturell ähnlich ist und an einen Op-1 spezifischen Rezeptor bindet, oder eine Substanz, die anderweitig einen OP-1 spezifischen Rezeptor stimuliert, der auf der Oberfläche einer auf OP-1 reagierenden Zelle gezeigt wird.
Wie hier verwendet, sollen der Ausdrücke "OP-1 oder OP-1 ähnliche biologische Aktivität" beliebige biologische Aktivitäten bedeuten, die bekannt sind durch OP-1 induziert oder verstärkt zu werden. OP-1 und OP-1 ähnliche biologische Aktivitäten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf ein Stimulieren einer Vermehrung von Vorläuferzellen, Stimulieren einer Differenzierung von Vorläuferzellen, Stimulieren einer Vermehrung von differenzierten Zellen und unterstützen eines Wachstums und Erhaltung von differenzierten Zellen. Der Ausdruck "Vorläuferzellen" umfasst nicht festgelegte beziehungsweise nicht kommitierte Zellen, vorzugsweise von einem Säugetierursprung, die kompetent sind in eine oder mehrere spezifische Typen von differenzierten Zellen, abhängig von deren genetischem Repertoire und Gewebespezifität des permissiven Umgebung, in dem Morphogenese induziert wird.
Insbesondere, bezüglich Knochen, Knorpel, Nerven und Lebergewebe, kulminiert die OP-1 stimulierte morphogene Kaskade in der Bildung von neuem oder regenerativ differenzierten Gewebe, das für die gewählte lokale Umgebung geeignet ist. Die durch OP-1 vermittelte Morphogenese unterscheidet sich folglich signifikant von einfachen wiederherstellenden Heilungsprozessen, bei denen Narbengewebe (beispielsweise faserartiges Bindegewebe) gebildet wird und eine Läsion oder einen anderen Fehler in differenziertem funktionellem Gewebe füllt.
Wie hier verwendet ist ein "Morphogen-Antagonist" ein Molekül, das eine Bindungsaktivität an einen OP-1 Rezeptor nachahmt, welches jedoch keine stromabwärts vermittelte Wirkung des Rezeptors induzieren kann.
Es ist vorgesehen, dass auf Bestimmung, ob die Testverbindung eine OP-1-Aktivität moduliert, die Testverbindung unter Verwendung herkömmlicher CAD und/oder rationaler Arzneimittelgestaltungsverfahren, die im Stand der Technik bekannt und gut dokumentiert sind, iterativ verbessert werden kann. Weiterhin ist vorgesehen, dass die so erhaltene folglich identifizierte Verbindung in gewerblich nützlicher Menge zur Verabreichung in einen Säuger hergestellt werden kann.
Durch Revision bzw. Durchsicht der in 15 und 16 ausgeführten Atomkoordinaten, kann der Fachmann die dreidimensionale Struktur bestimmter Aminosäuresequenzen beobachten, die in situ innerhalb der dreidimensionalen Struktur von hOP-1 lokalisiert sind. Beispiele möglicher Aminosäuresequenzen werden durch ein oder mehrere Peptide festgelegt, die aus der Gruppe bestehend aus H1, H-n2, H-c2, F1-2, F2-2 und F2-3, wie nachfolgend ausgeführt, ausgewählt sind. Die Peptide stellen Matrizes bzw. Template dar, die bei der Herstellung von wirksameren Morphogen-Analogen verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Cα-Atome der Aminosäurereste in dem Morphogen-Analog innerhalb von 6Å lokalisiert, vorzugsweise innerhalb von 3Å und am meisten bevorzugt innerhalb von 2Å des entsprechenden Cα-Atoms, wie durch die entsprechenden Atom-Koordinaten in 15 und 16 festgelegt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Cα-Atome der Aminosäurereste in dem Morphogen-Analog innerhalb von 6Å, vorzugsweise innerhalb von 3Å und am meisten bevorzugt innerhalb von 2Å der entsprechenden Cα-Atome von mindestens drei Aminosäuren in den Peptid-Sequenzen H1, H-n2, H-c2, F1-2, F2-2, und F2-3 lokalisiert, worin jedes der Cα-Atome in den Peptiden durch die entsprechenden, in 15 und 16 ausgeführten, Atom-Koordinaten festgelegt wird.
Nachdem die dreidimensionale Struktur von OP-1 bestimmt wurde, kann ein Fachmann, der im Besitz der die OP-1 Struktur festlegenden Atom-Koordinaten ist, hierdurch herkömmliche CAD und/oder rationale Arzneimittelgestaltungsverfahren verwenden, um Protein- oder Peptid-Analoge, oder andere kleine organische Moleküle zu identifizieren oder zu gestalten, die, nachdem sie unter Verwendung herkömmlicher Chemie und Verfahren hergestellt wurden, entweder in vitro oder in vivo getestet werden können, um zu beurteilen, ob sie die biologische Aktivität von menschlichem OP-1 nachahmen oder verstärken können.
Die vorstehenden und anderen Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung offenkundiger werden.
Die Aufgaben und Merkmale der Erfindung können durch Bezugnahme auf die nachfolgend beschriebenen Zeichnungen besser verstanden werden, worin ähnlich bezeichnete Merkmale in den entsprechenden Figuren gemeinsame Merkmale kennzeichnen.
1A stellt eine vereinfachte Linienzeichnung dar, die bei der Beschreibung der Struktur einer monomeren Untereinheit von hOP-1 nützlich ist. Siehe die Zusammenfassung der Erfindung, nachstehend zur Erklärung. 1B, 1C und 1D sind Bandverfolgungen in Monosicht (monovision ribbon tracings) der entsprechenden Peptidrückgrate von hOP-1 Finger-1, Ferse und Finger-2 Bereichen bzw. Regionen. 1E und 1F sind schematische Darstellungen von monomeren beziehungsweise dimeren Formen von hOP-1, wie durch ein linkshändiges Motiv dargestellt.
2 ist eine schematische Zeichnung einer Monomeren Untereinheit von hOP-1. Der hOP-1 Cysteinknoten, der drei Disulfidbrücken umfasst, bildet den Kern der monomeren hOP-1 Untereinheit. Zwei Disulfidbrücken, die die Reste Cys 67-Cys136 und Cys 71-Cys 138 verbinden, erzeugen einen acht Reste umfassenden Ring, durch welchen die dritte Disulfidbrücke hindurchfährt, die die Reste Cys 38-Cys 104 verbindet. Vier Strange von anti-parallelen β-Faltblättern, die aus dem Knoten hervorgehen, bilden die zwei Fingern ähnelnden Vorsprünge. Eine α-Helix, die an dem abgewandten Ende des Knotens lokalisiert ist, liegt senkrecht zu der Achse der zwei Finger, wodurch die Ferse gebildet wird. Der N-Terminus der monomeren Untereinheit bleibt unaufgelöst. Die β-Faltblätter werden als Pfeile gezeigt und von β1 bis β8 markiert. Die α-Helix wird als eine Röhre gezeigt und mit α1 markiert. Die den Cysteinknoten bildenden Disulfidbindungen der Intra-Untereinheit werden als solide Linien gezeigt. Ausgehend von Gln 36 ("N36"), dem ersten in dieser Figur gezeigten Rest, umfassen die in dem Finger 1 Bereich eine Sekundärstruktur erzeugenden Aminosäurereste Lys 39- His 41 (β1), Tyr 44-Ser 46 (β2), Glu 60-Ala 63 (β3), Tyr 65-Glu 70 (β4), wobei die Aminosäurereste, die in dem Finger 2 Bereich eine Sekundärstruktur erzeugen Cys 103-Asn 110 (β5), Ile 112-Asp 118 (β6), Asn 122-Tyr 128 (β7), Val 132-His 139 (138) umfassen, und wobei die Aminosäurereste, die in der Fersenregion eine Sekundärstruktur erzeugen, Thr 82-Ile 94 (α1) umfassen.
Die 3 ist eine Struktur basierte Sequenzabgleich bzw. Ausrichtung des hOP-1 und TGF-β2 Finger-1, der Fersen und der Finger-2 Regionen. Die Aminosäurereste in den Fersenregionen, die Interketten-Kontakte in den Dimeren von hOP-1 und TGF-β2 bilden, sind weiß auf schwarz hervorgehoben. Die Aminosäurereste in den Finger-1- und Finger-2-Regionen, die die andere Kette kontaktieren, sind schwarz auf grau hervorgehoben. In hOP-1 und TGF-β2 bilden die Aminosäuren, die an den gleichen Restepositionen lokalisiert sind, die Inter-Ketten-Kontakte.
4A und 4B stellen Stereo Peptidrückgrat Bandverfolgungs-Darstellungen dar, die die dreidimensionale Form von hOP-1 erläutern: A) von der "oberen Seite" (abwärts der zweifachen Symmetrie-Achse zwischen den Untereinheiten), wobei die Achsen der helikalen Fersenregionen allgemein normal zu der Papierebene stehen und die Achsen von jeder der Finger-1 und Figer-2 Regionen allgemein vertikal stehen, und B) von der "Seite", wobei die zweifache Achse zwischen den Untereinheiten in der Papierebene stehen, wobei die Achsen der Fersen allgemein horizontal stehen, und die Achsen der Finger allgemein vertikal stehen. Das hOP-1 Monomer weist einen zugänglichen nicht polaren Oberflächenbereich von ungefähr 4394 Å² auf, wobei/während die für das Dimer ungefähr 6831 Å² beträgt, was bei einer Dimerisierung zu einem versteckten Bereich von ungefähr 979 Å² pro Monomer führt. Der Leser wird ermuntert die stereo Alpha Kohlenstoff Verfolgungs-Zeichnungen in einem Fischaugen-Stereo, beispielsweise unter Verwendung einer Standard-Stereo-Betrachtereinrichtung zu betrachten, um die räumlichen Beziehungen der Aminosäuresequenzen in der Morphogen-Analog-Gestaltung einfacher zu sehen.
5A ist eine Rückgrat Bandverfolgungs-Darstellung, die das hOP-1-Dimer erläutert, das die zwei hOP-1 Monomer-Einheiten bis au 2,8Å aufgelöst, umfasst. Eine Monomer-Einheit ist in grün gezeigt und die andere Monomer-Einheit ist in gold gezeigt. Die in der vorgegebenen Rezeptor-Bindungsdomäne angeordneten Aminosäurereste, die Lösungsmittel zugängliche Seitenketten aufweisen, werden als Atomkugel gezeigt. Die Spitzen der Finger-1- und Finger-2-Regionen der einen OP-1 Monomer-Einheit und eine Schleife an dem C-terminalen Ende der Ferse der anderen OP-1 Monomer-Einheit bilden angenommener Weise die Rezeptorbindungsdomäne.
Die Aminosäuren, die an Positionen einer variablen Aminosäuresequenz lokalisiert sind, werden in weiß gezeigt, wohingegen an mehr konservierten Positionen lokalisierte die Aminosäuren in rot gezeigt sind. Die 5B und 5C sind Bilder, die die entsprechenden dem Lösungsmittel zugänglichen Oberflächen von OP-1- und TGF-β2-Dimeren zeigen, die basierend auf deren elektrostatischen Potential gefärbt sind. Oberflächenregionen, die ein elektrostatisches Potential von –3kT oder weniger aufweisen, werden in rot gezeigt, während Oberflächenregionen von +3kT oder größer in blau gezeigt werden. Neutrale Regionen werden in grün oder gold entsprechend zu den Rückgratbändern, in 5A gezeigt, gezeigt.
6 stellt eine Tabelle dar, die eine Identitätsmatrix für die TGF-β-Superfamilie zeigt.
Die Matrix umfasst Mitglieder der TGF-β-Superfamilie, die eine Aminosäuresequenz-Identität relativ zu OP-1 von mehr als 36 % aufweist. In der Matrix sind die Mitglieder der TGF-β-Superfamilie in abnehmender Ordnung der Aminosäure-Identität relativ zu OP-1 angeordnet. TGF-β2 weist eine Aminosäuresequenz-Identität relativ zu OP-1 von 36% auf, wobei sie unten an der Matrix positioniert ist. Kasten fassen Familien von Sequenzen mit 50 % oder höherer Identität ein, wobei ein Hauptteil der anderen Mitglieder der Familie mit Sequenzen mit Identitäten von 75 % oder höher in grau gezeigt sind. Rekombinant exprimierte OPBMP-Familienmitglieder von denen gezeigt wurde, dass sie Knochen erzeugen, werden durch ein "+" in dem linken Rand bezeichnet. Mitglieder der TGF-β-Superfamilie deren dreidimensionale Struktur bestimmt wurde, sind in dem linken Rand weiß oder schwarz hervorgehoben. Auf die Sequenzen wird verwiesen in Kingsley (Kingsley, (1994) Genes and Development 8:133-146), ausgenommen der Folgenden: (UNIVIN (Stenzel et al. (1994) Develop. Biol. 166:149-158.), SCREW (Arora, et al. (1994) Genes and Dev. 8:2588-2601.), BMP-9 (Wozney, et al. (1993) PCT/WO 93/00432 , SEQ. ID. NO.9), BMP-10 (Celeste et al. (1994) PCT/WO 94/26893 , SEQ. ID. NO. 1), GDF-5 (Storm et al. (1994) Nature 368:639-643) (ebenfalls als CDMP-1 bezeichnet (Chang et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 28227-28234.), GDF-6 (Storm, et al. (1994) Nature 368:639-643), GDF-7 (Storm et al. (1994) Nature 368:639-643), CDMP-2 (Chang et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 28227-28234.), OP-3 (Ozkaynak et al. (1994) PCT/WO 94/10203 , SEQ. ID. NO. 1), Inhibin 1k (Hätten, et al. (1995) Bioch. Biophys. Res. Comm. 206:608-613) und GDF-10 (Cunningham, et al. (1995) Growth Factors 12:99-109). Mehrere Sequenzen in der Matrix weisen alternative Namen auf: OP-1 (BMP-7), BMP-2 (BMP-2a), BMP-4 (BMP-2b), BMP-6(Vgrl), OP-2 (BMP-8), 60A (Vgr-D), BMP-3 (Osteogenin), GDF-5 (CDMP1, MP-52), GDF-6 (CDMP-2, BMP-13) and GDF-7 (CDMP-3, BMP-12).
7 ist eine Zusammenfassung von Aminosäureresten, die gemäß der 2,8 Å Auflösungsstruktur gemeinsam die dem Lösungsmittel zugängliche Oberflächen von dimerem hOP-1 festlegen. Die 7A, 7B und 7C zeigen die Aminosäuresequenzen, die die Regionen von menschlichem OP-1 Finger 1, Ferse beziehungsweise Finger-2 festlegen. Die Aminosäurereste, die 40 % oder mehr deren Seitenkette einem Lösungsmittel aussetzen, sind eingekastelt, wobei die dem Lösungsmittel zugänglichen Aminosäurereste, die unter der BMP/OP Familie der TGF-β-Superfamilie hoch variabel sind, durch schraffierte Kästen gekennzeichnet werden.
8 ist eine Tabelle, die auf der 2,8 Å Struktur basiert, die die prozentuale Oberflächenzugänglichkeit der Aminosäureseitenketten in einer hOP-1 Monomereinheit und ein einem hOP-1-Dimer zusammenfasst. Aminosäurereste, von denen angenommen wird, dass sie mögliche Epitope bilden, werden "EPITOP" genannt, wobei die Aminosäurereste, die mögliche Kandidaten als die Oberfläche modifizierende Aminosäuren sind, werden mit einem Stern markiert werden. Außerdem werden Oberflächen modifizierende Aminosäuren, die bevorzugte Kandidaten zum Erhöhen der Löslichkeit sind mit einem Stern markiert.
9 stellt eine Tabelle dar, die auf der 2,8 Å-Struktur basiert, die die Aminosäurereste zusammenfasst von denen angenommen wird, dass sie den Rücken beziehungsweise die Kante festlegen. Aminosäurereste, von denen angenommen wird, dass sie die Rezeptor-Bindungsdomäne in dem Rücken bilden, werden mit einem Stern markiert.
10 stellt eine schematische Darstellung eines Computersystems dar, das in der Praxis der Erfindung nützlich ist.
11A und 11B sind Tabellen, die durch Bezugnahme auf die 2,8 Å-Struktur erzeugt wurde, die die Aminosäurepaare zusammenfasst, von denen angenommen wird, dass sie als Orte zum Einführen zusätzlicher Inter-Ketten-(11A) oder Inter-Ketten (11B)-Disulfidbindungen in dem hOP-1-Dimer nützlich sind.
12 ist ein Aminosäuresequenzabgleich, der die Aminosäuresequenz von reifem menschlichem OP-1 und Peptiden zeigt, die Regionen von Finger-1, Finger-2 und Ferse von menschlichem OP-1 festlegen.
Die 13A-13D sind Säulendiagramme, die die Wirkung von Finger-2 und Fersen-Peptiden auf die alkalische Phosphataseaktivität von ROS-Zellen darstellen, die in entweder der Anwesenheit oder Abwesenheit von löslichem OP-1 inkubiert wurden. Die 13A, 13B, 13C und 13D zeigen die Wirkung der Peptide F2-2, F2-3, Hn-2 beziehungsweise Hn-3 auf die alkalische Phosphataseaktivität von ROS-Zellen, die in der Anwesenheit (schraffierte Säulen) oder der Abwesenheit von löslichem OP-1 (nicht schraffierte Säulen) inkubiert wurden.
14A und 14B sind Diagramme, die die Verdrängung von radioaktiv markiertem löslichem OP-1 von ROS-Zellmembranen durch Finger-1-, Finger-2- und Fersen-Peptide zeigen. 14A zeigt die Verdrängung von radioaktiv markiertem OP-1 von ROS-Zellmembranen durch unmarkiertes lösliches OP-1 (offene Kreise und Dreiecke), Finger-2-Peptid F2-2 (geschlossenen Kreise) und Finger-2-Peptid F2-3 (geschlossene Dreiecke). 14B zeigt die Verdrängung von radioaktiv markiertem OP-1 von ROS-Zellmembranen durch nicht markiertes lösliches OP-1 (offene Dreiecke), Finger-1 Peptid F1-2 (geschlossene Kasten), Fersen-Peptid H-n2 (offene Diamanten) und Fersen-Peptid H-c2 (offene Kreise).
15 ist eine Tabelle, die die Atom-Koordinaten von auf 2,8 Å aufgelöstem hOP-1 zusammenfasst.
16 stellt eine Tabelle dar, die die Atom-Koordinaten von auf 2,3 Å aufgelöstem hOP-1 zusammenfasst.
Weitere Besonderheiten, die die Zeichnungen betreffen, werden in der folgenden Beschreibung offenbart, die Einzelheiten der dreidimensionalen Struktur von hOP-1, Verfahren zur Identifizierung von Morphogen-Analogen und Verfahren zur Herstellung, zum Testen und zur Verwendung derartiger Morphogen-Analogen offenbart.
I. Einführung
Wie nachfolgend beschrieben, wurde die dreidimensionale Kristallstruktur von reifem hOP-1 nun auf 2,3 Å aufgelöst. Die Offenbarung stellt zwei Sätze von Atom-Koordinaten für hOP-1 bereit, worin ein Koordinatensatz (siehe 15) die Struktur von hOP-1 mit bis auf 2,8 Å aufgelöstem hOP-1 darstellt und wobei der andere Koordinatensatz (siehe 16) die Struktur von bis auf 2,3 Å aufgelöstes hOP-1 darstellt. Diese Offenbarung stellt somit die Atom-Koordinaten bereit, die die relativen Positionen in dem dreidimensionalen Raum von mindestens den C-terminalen 104 Aminosäuren von menschlichem Op-1 festlegen, die geeignet sind die biologische Aktivität zu verleihen. Die Offenbarung stellt eine Analyse der Strukturmerkmale von hOP-1 bereit. Der Fachmann kann nun mehrere oder die gesamten dieser Koordinaten in einer Datenbank verwenden, um morphogene Proteinanaloge, insbesondere OP-1-Analoge herzustellen. Insbesondere, kann der Fachmann einen Teil oder die gesamte Datenbank auswählen, um Matrizen eines Teils oder der gesamten der hOP-1-Struktur dreidimensional zu erzeugen, und wobei diese Matrize dazu verwendet wird, um ein erwünschtes Analog oder eine erwünschte Variante zu erzeugen, die auf Aminosäuren basieren kann.
Nachfolgend wird eine ausführliche Beschreibung der dreidimensionalen Kristallstruktur von hOP-1, zusammen mit einer ausführlichen Beschreibung wie die Koordinaten in einer Datenbank zu verwenden sind, bereitgestellt, um ein Morphogen-Analog oder eine strukturelle Variante von Interesse zu gestalten. Die Aminosäuresequenzen werden als beispielhafte Matrizen als Beispiele zum Gestalten, Identifizieren und Herstellen eines OP-1-Analogs unter Verwendung einer der atomaren Koordinaten-Datenbanken von OP-1, bereitgestellt. Insbesondere werden hier als nützliche Analoge vorgesehen, die Analoge umfassen, die eine verringerte Clearance- beziehungsweise Filtrationsrate aus dem Körper aufweisen. Der Leser wird erkennen, dass diese Beispiele lediglich beispielhaft sind. Ausgehend von der Offenbarung der Koordinaten, der dreidimensionalen Struktur, der Verwendung der Koordinaten in einer Datenbank und dem heutigen Niveau des Fachwissens, können durch diese Offenbarung immer noch andere hier nicht spezifisch genannte Analoge ermöglicht werden. Insbesondere wird klar sein, dass ausgehend von der hier gegebenen Offenbarung und den bekannten Aminosäuresequenzen für andere nahe verwandte Morphogene die Verfahren verwendet werden können, um andere Morphogen-Analoge, von beispielsweise BMP2, BMP4, OP2, BMP5 und BMP6, zu erzeugen.
II. Strukturbestimmung von hOP-1
A. Bestimmung der 2,8 Å Struktur
Es wurden Kristalle von reifem hOP-1 durch Mischen gleicher Volumen von gereinigtem Protein (Özkaynak et al. (1990) EMBO J. 9:2085-20893; und Sampath et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20352-20362) zu 10 mg/ml, mit 8% Ammoniumsulfat in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 5,0) (Griffith et al. (1994) J. Mol. Biol. 244:657-658) gezüchtet. Die Kristalle weisen die Symmetrie einer Raumgruppe P3₂21 mit Elementarzellendimensionen a=b=99,46 Å, und c=42,09 Å auf. Es wurde ein Kristall verwendet, um einen vollständigen nativen Datensatz bis zu 2,8 Å Auflösung bei 4°C zu sammeln. Es wurden zwei abgeleitete Datensätze bei 4°C gesammelt, einer von einem Kristall, das für sieben Tage in 0,3 mM Uranylnitrat getränkt wurde, und der andere von einem Kristall, das für acht Stunden in 0,5 mM Natriumgold (III)-tetrachlorid (Griffith et al., (1994) supra) getränkt wurde.
Die nativen und abgeleiteten Datensätze wurden integriert und mit der R-AXIS-IIC Software-Suite (Higashi (1990) A Program for Indexing and Processing R-AXIS IIC Imaging Plate Data, Rigaku Corp.) reduziert und unter Verwendung des CCP4-Programm ANSC (Collaborative Computation Project (1994) Acta Cryst. D50:760-763) gemeinsam skaliert. Inspektion der Harker-Abschnitte der Differenz-Patterson-Karte zeigte eine einzige Uranylstelle. Die Position der einzigen Goldstelle wurde unter Verwendung von Kreuz-Fourier-Verfahren unter Verwendung der Uranylposition als die Phasen- beziehungsweise Synchronisierungsstelle bestimmt. Die schweren Atom x, y, z Parameter und Belegung (occupancy) wurden mit dem Programm TENEYCK (Ten Eyck et al. (1976) J. Mol. Biol. 100:3-11) gefiltert bzw. verfeinert. Unter Verwendung dieser zwei Ableitungen und deren anormalen Signale wurde ein anfänglicher Phasensatz bis zu 4,0 Å Auflösung mit einem durchschnittlichen Gütefaktor (figure of merrit) von 0,72 berechnet. Die Phasen wurden verbessert und durch Zyklen von Lösungsmittelverflachung (solvent flattening) auf 3,5 Å Auflösung erweitert (Wang (1985) Meth. Enzymol. 115:90-112) und Phasen-Kombination (Reed (1986) Acta Cryst. A42:140-149) unter Verwendung des CCP4 (Collaborative Computation Project (1994) supra) Kristallographiepakets. Eine vollständige interpretierbare Elektronendichtekarte mit einer Auflösung von 3,5 Å gestattete die unzweifelhafte VerfolÅgung der Polypeptidkette und die Identifizierung der Aminosäuren von Gin 36 bis His 139 unter Verwendung des Graphikprogramms "O" (Jones et al. (1991) Acta Crystallogr. A47:110-119). Das Modell wurde mit dem Programm XPLOR (Brunger et al. (1987) Science 235:458-460) gefiltert, indem alle Reflexionen zwischen 10 Å und 2,8 Å Auflösung ver wendet wurden, für die F_obs>2,0σ (F_obs) ist. bei der Veredelung waren keine Wassermoleküle eingeschlossen. Die Standardabweichung (rms) von dem idealen Zustand beträgt 0,02 Å für Bindungslängen und 3,2° für Bindungswinkel. Eine gute Stereochemie wurde für die Rückgrattorsionswinkel beobachtet. Der gegenwärtige R Faktor beträgt 22,8 %.
Die Atom-Koordinaten, die die 2,8 Å Auflösungsstruktur festlegen, werden in 15 aufgelistet. In 15 bezeichnen die mit "Atom" betitelten Säulen als Atome, deren Koordinaten erfasst wurden. Der erste Buchstabe in der Säule legt das Element fest. Die als "Rest" betitelten Säulen bezeichnen die Aminosäurereste in dem hOP-1-Monomer, das ein Atom beinhaltet, dessen Koordinaten erfasst wurden. Die als "Kette" betitelte Säule bezeichnet, ob das Atom von Interesse innerhalb der ersten (A) oder zweiten (B) Monomer-Untereinheit des hOP-1-Dimers lokalisiert ist. Die Säulen "X, Y, Z" sind kartesische Koordinaten, die die Atomposition des erfasst Atoms festlegen.
B. Bestimmung der 2,3 Å Struktur (für veranschaulichende Zwecke)
Kristalle von reifem hOP-1 wurden wie in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben hergestellt. Ein Kristall, das in flüssigem Stickstoff gefroren wurde, wurde verwendet, um einen Datensatz bis zu 2,3 Å Auflösung zu sammeln, der zu 91 % vollständig war. Die Daten wurden auf Bildplatten (imaging plates) bei Strahlinie X12 (National Synchrotron Light Source) mit einem Schwingbereich von 0,5 Grad (Überlappung von 0,1 Grad) und Expositionszeit von 60-90 Sekunden gesammelt. Die digitalisierten Daten werden bearbeitet, verflochten bzw. fusioniert und mit DENZO und SCALEPACK (verfügbar von Molecular Structure Corporation, Texas) skaliert. Eine anfängliche 2Fo-FC-Karte, die nach X-PLOR Starrkörper-Verfeinerung unter Verwendung des 2,8 Å Modells berechnet wurde, war leicht zu interpretieren. Es wurden Bereiche des Models mit den interaktiven Graphikprogrammen "0" und "Kette" an die Elektronendichtekarte manuell erneut angepasst. Anschließende Zyklen einer Verfeinerung (XPLOR/PROFFT) und manueller Wiederaufbau (QUANTA) konvergierten schnell zu dem vorliegenden Modell.
Das gegenwärtige Modell ergab einen herkömmlichen Kristallographie R-Faktor von 23,5 % für Daten von 10 bis 2,3 Å (1,5σ Abschluss) und einen R_free von 27 %. Die verfeinerte Struktur wurde unter Verwendung des PROCHECK (verfügbar von Protein Daten-Bank, Brookhaven, NY)-Algorithmus analysiert und wo erforderlich berichtigt. Die Standardabweichung (rms) vom idealen Zustand beträgt 0,015 Å für Bindungsabstände, 0,034 Å für Winkelabstände und 0,142 Å für Planare 1-4 Abstände. Die rms Abweichung von dem idealen Zustand beträgt 1,7° für Bindungswinkel. Bei der oberen Schätzung aus den Luzzati graphischen Darstellungen (EXPLOR) unter Verwendung des freien R-Faktors beträgt der Fehler in den Atom-Positionen 0,25-0,33Å. Das Endmodell umfasst eine Monomer-Einheit, die aus 828 Protein-Atomen (d.h. alle Nicht-Wasserstoffatome) und 33 Wassermolekülen besteht. Die durchschnittliche Temperatur (B)-Faktor beträgt 33 Å² für Proteinatome und 37 Å² für Lösungsmittelatome.
Die Atom-Koordinaten, die die 2,3 Å Auflösungsstruktur festlegen sind in 16 aufgelistet. In 16 bezeichnet die als "Atom" betitelte Säule Atome, deren Koordinaten erfasst wurden. Der erste Buchstabe in der Säule legt das Element fest. Die als "Rest" betitelte Säule bezeichnet die Aminosäurereste in dem hOP-1 Monomer, das ein Atom beinhaltet, dessen Koordinaten erfasst wurden. Die als "Kette" betitelte Säule bezeichnet ob das Atom von Interesse innerhalb der ersten (A) oder zweiten (B) Monomer-Einheit des hOP-1-Dimers lokalisiert vorliegt. Die Säulen "X, Y, Z" sind kartesische Koordinaten, die die Atomposition des erfasst Atoms festlegen. Die mit "δ" bezeichnete Säule stellt die Unbestimmtheit beziehungsweise Unsicherheit in der Position der Koordinate dar, wie sie von dem Temperatur (B)-Faktor von jedem entsprechenden Atom abgeleitet wird. Die Unsicherheit von jeder Koordinate wurde aus der Formel
(siehe "Protein Crystallography" (1976) T.L. Blundell and L.N. Johnson, Academic Press, p. 121) abgeleitet und wird in Einheiten von Å ausgedrückt.
III. Strukturelle Eigenschaften der hOP-1 Monomeruntereinheiten
Menschliches OP-1 ist ähnlich wie TGF-β2 ein dimeres Protein, das ein einzigartiges Faltungsmuster aufweist, an welchem, wie in Figur gezeigt, sechs der sieben C-terminalen Cysteinreste beteiligt sind. Jede der Untereinheiten in OP-1, ähnlich zu TGF-β2 (Siehe Daopin et al., (1992), Science 257:369-373; und Schulnegger et al., (1992), Nature 358:430-434) weist ein, wie in 1A schematisch dargestelltes, charakteristisches Faltungsmuster auf, an welchem sechs der sieben C-terminalen Cysteinreste beteiligt sind.
In 1A bilden vier der Cysteinreste in jeder Untereinheit zwei Disulfidbindungen, die zusammen einen acht Reste umfassenden Ring erzeugen, während zwei zusätzliche Cysteinreste eine Disulfidbindung ausbilden, die durch den Ring hindurchgeht bzw. passt, um eine Knoten-ähnliche Struktur (Cysteinknoten) zu bilden. Mit einem Zählschema, das beginnend mit dem am nächsten zum N-terminal gelegenen Cystein der 7 konservierten Cysteinreste die Nummer 1 zuordnet, dann sind die zweiten und sechsten Cysteinreste über Disulfid gebunden, um eine Seite des acht Reste umfassenden Rings zu schließen, während die dritten und siebten Cysteinreste über Disulfid verbunden sind, um die andere Seite des Rings zu schließen. Der erste und fünfte konservierte Cysteinrest sind über Disulfid durch das Zentrum des Rings gebunden, um den Kern des Knotens zu bilden. Ein Aminosäureabgleichmuster legt nahe, dass dieses Strukturmotiv zwischen den Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie konserviert ist. Das vierte Cystein ist halb-konserviert und wenn vorhanden, dann bildet es gewöhnlich eine Inter-Ketten-Disulfidbindung (ICDB) mit dem entsprechenden Cysteinrest in der anderen Untereinheit.
Jede hOP-1 Monomer-Untereinheit umfasst drei hauptsächliche Tertiär-Strukturelemente und eine N-terminale Region. Die Strukturelemente sind aus Regionen einer benachbarten Polypeptidkette gemacht, die über 50 % Sekundär-Struktur der folgenden Typen aufweist: (1) Schleife, (2) Helix und (3) β-Faltblatt. Weiterhin sind in diesen Regionen die N-terminalen und C-terminalen Strange über nicht mehr als 7 Å getrennt.
Die Aminosäuresequenz zwischen den ersten und zweiten konservierten Cysteinen (1A) bildet eine strukturelle Region, die durch einen anti-parallelen β-Faltblatt-Finger, hier als die Finger 1-Region (F1) bezeichnet, gekennzeichnet vorliegt. Ein Ribbon-Trace des mensch lichen OP-1-Finger-1 Peptidrückgrats ist in 1B gezeigt. In ähnlicher Weise bilden die Reste zwischen den fünften und sechsten konservierten Cysteinen, in 1A, ebenfalls einen anti-parallelen β-Faltblatt-Finger, der hier als die Finger-2 Region (F2) bezeichnet wird. Eine Bandverfolgung des menschlichen OP-1 Finger-2 Peptidrückgrats ist in 1D gezeigt. Ein β-Faltblatt-Finger ist eine einzelne Aminosäurekette, die einen β-Strang umfasst, der mittels der β-Drehung bzw. Windung oder einer gewissen größeren Schleife auf sich selbst so zurück faltet, dass die eintretenden und austretenden Stränge eine oder mehrere anti-parallele β-Faltblatt-Strukturen ausbilden. Die dritte hauptsächliche strukturelle Region, die die Reste zwischen den dritten und vierten konservierten Cysteinen, in 1A, beteiligt, ist durch eine dreifach gewendete beziehungsweise gedrehte α-Helix gekennzeichnet, die hier als die Fersen-Region (H) bezeichnet wird. Eine Bandverfolgung des menschlichen OP-1 Fersen-Peptidsrückgrats ist in 1C gezeigt.
Die Organisation der monomeren Struktur ist ähnlich zu der einer linken Hand (siehe 1E), an der die Knotenregion an der Position äquivalent zu der Handfläche (16) lokalisiert ist, wobei die Finger-1 Region äquivalent zu dem Index und Mittelfingern (12 beziehungsweise 13), die α-Helix oder die Fersenregion zu der Ferse der Hand (17) äquivalent und die Finger-2 Region dem Ring- und dem Kleinen Finger (14 beziehungsweise 15) äquivalent ist. Die N-terminale Region (nicht definiert in der hier offenbarten 2,8 Å Auflösungskarte) ist an einer Position vorhergesagt, die grob äquivalent zu dem Daumen (11) lokalisiert ist.
Monovisuelle Bandverfolgung, die die Alpha Kohlenstoff Rückgrate von jeder der drei hauptsächlichen unabhängigen strukturellen Elemente des Monomers erläutern, sind in den 1B-1D dargestellt. Insbesondere wird die Finger 1 Region, die den ersten antiparallelen β-Faltblatt-Abschnitt umfasst, in 1B gezeigt, die Fersen-Region, die den dreifach gedrehte α-helikale Abschnitt umfasst, ist in 1 C gezeigt und die Finger-2 Region, die zweite und dritte anti-parallele β-Faltblatt-Abschnitte umfasst, ist in 1D gezeigt.
Für Vergleichszwecke zeigt 3 einen Abgleich der Aminosäuresequenzen, die die Regio nen des Fingers-1, Fingers-2 und der Ferse von hOP-1 und TGF-β2 festlegen. In 3 wurden die Aminosäuresequenzen von OP-1 und TGF-β2 gemäß der entsprechenden Regionen lokaler struktureller Identität in den OP-1 und TGF-β2 Strukturen abgeglichen. Abgleichungslücken wurden in Schleifenpositionen positioniert, die sich dort befinden wo die örtliche konformative Homologie der α-Kohlenstoffverfolgungen neigen die geringsten zu sein.
Die strukturbasierte Abgleichung von OP-1 und TGF-β2 wurde anschließend als eine Matrize für den Abgleich der Sequenzen der 7-Cystein-Domäne von anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie (andere Mitglieder der TGF-β-Superfamilie werden in 6 ausgeführt) verwendet. Abgleichlücken wurden in Regionen positioniert, die in sowohl der OP-1 als auch der TGF-β2 Struktur Schleifen sind. Die prozentuale Identität zwischen Sequenzpaaren wurden als die Anzahl von identisch abgeglichenen Sequenzpositionen berechnet, ausnehmend Lücken, normalisiert gegenüber dem geometrischen Mittel der Sequenzlängen und multipliziert mit 100. 6 stellt eine Matrix dar, die die paarweise vorhandenen Identitäten zwischen den so abgeglichenen Superfamilien-Sequenzen darstellt. Unter Verwendung derartiger Prinzipien ist vorgesehen, dass die hOP-1 und TGF-β2 Strukturen entweder alleine oder in Kombination für ein Homologiemodellieren von anderen Proteinen verwendet werden können, die zu der TGF-β-Superfamilie gehören, deren dreidimensionale Strukturen bisher nicht bestimmt wurden (Siehe beispielsweise die anderen Mitglieder der in 6 aufgelisteten der TGF-β-Superfamilie). Es ist vorgesehen, dass derartige Modelle bei der Gestaltung von Morphogen-Analogen für bestimmte Kandidaten- bzw. Test-Morphogene von Interesse nützlich sein können, wobei sich jedoch zur Einfachheit die hier folgende Offenbarung spezifisch auf die Gestaltung, Identifikation und Herstellung von Morphogen-Analogen von hOP-1 bezieht.
3 zeigt ebenfalls basierend auf einer Analyse der 2,8 Å Auflösungsstruktur einen Vergleich von Interketten-Kontaktresten bzw. kontaktierenden Resten in OP-1 und TGF-β2. Die Reste wurden als Kontaktreste bezeichnet, falls der Abstand zwischen den Zentren von mindestens einem Nicht-Wasserstoffatom von jeder Seitenkette geringer war als die Summe deren Van der Waals-Radien plus 1,1 Å. Trotz des geringen Niveaus einer Sequenzidentität zwischen OP-1 und TGF-β2 sind die Interkettenkontakte zwischen Resten in der Ferse von einer Kette und Resten in Finger-1 und Finger-2 von der anderen Kette gut konserviert.
Bei ausführlicher Inspektion bzw. Untersuchung der 2,8 Å Auflösungsstruktur von hOP-1 ist die Finger-1 Region von hOP-1 ein anti-paralleles β-Faltblatt, das eine dreizehn Reste umfassende Omega-Schleife (Phe 47-Glu 60) (2) beinhaltet. Der Strukturabgleich der OP-1 und TGF-β2 Sequenzen in 3 ordnet zwei Lücken in der Omega-Schleife. Die erste Lücke stellt eine Deletion in hOP-1 dar, die mit Arg 26 in der α2 Helix von TGF-β2 abgleicht. Diese Deletion führt verglichen mit TGF-β2 zu einer engeren, nicht-α-helikalen Windung in OP-1. Die zweite Lücke entspricht der Insertion von Gln 53 in OP-1, die zu dem Ergebnis führt, dass sowohl Gln 53 als auch Asp 54 Seitenketten in das Lösungsmittel gerichtet werden. Verglichen mit der entsprechenden Region in TGF-β2 liegt lediglich Lys 31 mit dem Lösungsmittel in Kontakt. Diese Unterschiede in der Konformation der Omega-Schleife führen ebenfalls dazu, dass das konservierte Prolin (Pro 59) vielmehr eine trans Konformation in hOP-1 annimmt als eine cis wie in TGF-β2. Die Konformation der Omega-Schleife orientiert sechs nicht-polare Reste, so dass sie zu einer für Lösungsmittel unzugänglichen Grenzfläche mit Finger-2 beiträgt. Von diesen sechs sind vier aromatisch (Phe 47, Trp 55, Tyr 62 and Tyr 65), und zwei sind aliphatisch (Ile 56 und Ile 57). Insgesamt ordnet die Konformation des Rückgrats der Omega-Schleife fünf polare Reste (Arg 48, Asp 49, Gln 53, Asp 54, und Glu 60) in Kontakt mit dem Lösungsmittel. Die netto Oberflächenladung in dieser Region beträgt –2, wohingegen die für TGF-β2 (5) +2 beträgt.
Gemäß der 2,8 Å Struktur ist die einzige α-Helix in dem Monomer zwischen dem dritten und dem fünften Cystein (Cys 71 und Cys 104) lokalisiert. Diese Helix, die sich für dreieinhalb Windungen von Rest Thr 82 bis zu Ile 94 erstreckt, ist amphipatisch und beinhaltet eine Anzahl hydrophober Reste, die in dem Dimer den Kontakt mit Resten von Finger-1 und Finger-2 des anderen Monomers (3) herstellen. Mehrere hydrophile Reste (Thr 82, His 84, und Gln 88) bilden eine Wand einer internen Lösungsmitteltasche nahe der zweifachen Achse des Dimers, während andere (Asn 83, His 92, und Asn 95) mit dem externen Lösungsmittel in Kontakt stehen. Die Konformation der Schleife, die von dem C-terminalen Ende der Helix zurück zu dem Cysteinknoten führt ist in OP-1 und TGF-β2 ähnlich. Im Vergleich ist die Schleife an dem N-terminalen Ende der Helix 3 Reste länger in Op-1, was zu einer unterschiedlichen Faltung als in TGF-β2 führt. Es wird angenommen, dass in dieser Schleife von OP-1 an dem Asn 80 ein N-verbundener Zuckerrest angebracht vorliegt, wobei jedoch keine derartige entsprechende Glycosylierungsstelle in TGF-β2 vorkommt. Diese Schleife ist ferner in OP-1 nicht geladen, wohingegen sie in TGF-β2 geladen ist.
Entsprechend der 2,8 Å Struktur liegt der Finger-2 als das zweite anti-parallele β-Faltblatt in OP-1 (2) vor. Die Polypeptidkette kehrt die Richtung zwischen den Segmenten 136 und 137 durch eine 3:5 Drehung bzw. Windung (Sibanda et al., (1991) Methods in Enzymol. 202:59-82) um, die bei Rest Asp 118 beginnt und an Rest Asn 122 endet. Dagegen weist TGF-β2 in dieser Schleife einen Rest weniger auf und nimmt eine 2:2 Windung (Sibanda et al., (1991), supra) an. Die Reste Arg 129 bis Val 132, die zwischen den Segmenten 137 und 138 lokalisiert sind, bilden ein Peptidbrücke, die das C-terminale Ende von Strang 135 kreuzt und in der antiparallelen Struktur des Finger-2 eine 180° Verdrehung erzeugt. Eine ähnliche Struktur wird in anderen Cysteinknoten-Wachstumsfaktoren beobachtet, wobei jedoch die Peptidbrückenlänge variiert (McDonald et al. (1991) Nature 354:411-414). In dem Monomer macht Finger-2 durch Beitragen der aromatischen Reste Tyr 116, Phe 117 und Tyr 128 mit Finger-1 Intra-Ketten-Kontakt, und die aliphatischen Reste Val 114, Leu 115, Val 123, Met 131 und Val 133 mit einer einem Lösungsmittel unzugänglichen Grenzfläche. OP-1 und TGF-β2 unterscheiden sich durch drei Ladungen in der Finger-2-Windung, Op-1 weist zwei negative Ladungen auf, während TGF-β2 eine positive Ladung aufweist. In der Region zwischen der Windung und der Peptidbrücke weist OP-1 eine Nettoladung von +3 auf, während TGF-β2 neutral ist (5).
Der N-Terminus von jeder monomeren Untereinheit ist angenommener Weise hoch mobil und wurde in der 2,8 Å Auflösungsstruktur von hOP-1 nicht aufgelöst. Die N-terminale Region kann ohne die biologische Aktivität zu beeinflussen deletiert werden, und folglich ist vorgesehen, dass dieser Bereich von reifen hOP-1 entfernt und durch andere Protein- oder Peptidsequenzen, wie beispielsweise Antikörpern, ersetzt werden kann und/oder radiomarkierte Bindungsstellen, um das Targetting auf einen bestimmten Lokus in vivo zu ver stärken oder zur Verwendung bei in vivo Abbildungsexperimenten. Außerdem kann die N-terminale Region durch ein Ionen chelatierenden Motiv (beispielsweise His₆) ersetzt werden, um in Affinitätsreinigungsschemata verwendet zu werden, oder mit Proteinen oder Peptiden ersetzt werden, um die Löslichkeit in wässrigen Lösungsmitteln zu erhöhen.
IV. Strukturelle Eigenschaften des hOP-1 Dimers
4 zeigt Stereobandverfolgungs-Zeichnungen, die das Peptidrückgrat des hOP-1-Dimerkomplexes, basierend auf der 2,8 Å Struktur darstellen. Die zwei Monomer-Untereinheiten in dem Dimerkomplex sind symmetrisch orientiert, so dass die Fersenregion von einer Untereinheit die Fingerregionen der anderen Untereinheit kontaktieren, wobei die Knotenregionen der verbundenen Untereinheiten den Kern des Moleküls bilden. Das vierte Cystein bildet eine Inter-Ketten-Disulfidbindung mit dessen Gegenstück an der zweiten Kette, wodurch die Ketten an der Mitte der Handflächen äquivalent verbunden sind. Das so gebildete Dimer ist ein ellipsenförmiges (Zigarren-förmiges) Molekül, wenn es von der Oberseite gesehen, die zweifache Symmetrieachse zwischen den Untereinheiten (4) abwärts gesehen wird. Seitlich betrachtet ähnelt das Molekül einer gebogenen "Zigarre', da die zwei Untereinheiten mit einem geringfügigen Winkel relativ zu einander orientiert (4B) sind.
Wie in 4 gezeigt, ist jedes der Strukturelemente, die gemeinsam die nativen Monomeruntereinheiten des Dimers festlegen, mit 43, 43', 44, 44', 45, 45', 46 und 46' markiert, worin die Elemente 43, 44, 45 und 46 durch eine Untereinheit definiert sind und wobei die Elemente 43', 44', 45' und 46' zu der anderen Untereinheit gehören. Insbesondere bezeichnen 43 und 43' die Finger-1-Regionen, 44 und 44' die Fersen-Regionen, 45 und 45' die Finger-2-Regionen und 46 und 46' bezeichnen die Disulfidbindungen, die das erste und fünfte konservierte Cystein von jeder Untereinheit verbindet, um die Knoten ähnliche Struktur zu bilden. Aus 4 kann ersehen werden, dass die Fersenregion von einer Untereinheit, beispielsweise 44, und die Finger-1 und Finger-2-Regionen, beispielsweise 43' beziehungsweise 45', von der anderen Untereinheit miteinander interagieren. Es wird angenommen, dass diese drei Elemente miteinander kooperieren, um eine Struktur zu definieren, die mit der den Liganden bindenden interaktiven Oberfläche des Erkennungsrezeptors bzw. des spezifischen Rezeptors interagiert.
Die helikale Achse wird als die Linie definiert, die von den alpha Kohlenstoffen in der helikalen Region äquidistant ist. Eine Sequenz von vier Punkten ist erforderlich, um den Öffnungswinkel zwischen den Achsen des Helices in dem Dimer zu definieren. Die zwei Innenpunkte wurden so gewählt, dass sie an den helikalen Achsen benachbart zu dem a-Kohlenstoff von jeweils Rest His 84 in OP-1 oder His 58 in TGF-β2 liegen. Die zwei äußeren Punkte wurden so gewählt, dass sie auf deren entsprechenden helikalen Achsen liegen, wobei jedoch deren Lage beliebig ist. Um den Winkel zwischen den Helices zu erfassen, wurden die ersten zwei Punkte, die zum Festlegen des Öffnungswinkel verwendet wurden, translatiert, um so die inneren Punkte zu überlagern. Die sich ergebenden drei Punkte definieren den Winkel.
Ein Hauptunterschied zwischen den OP-1 und TGF-β2 Dimeren besteht in der relativen Orientierung der Helices in der Fersen-Region. Der Winkel zwischen den Achsen der Helices in der Fersen-Region von OP-1 beträgt 43°, was 10° größer ist als der für TGF-β2 erfasste. Der erfasste Öffnungswinkel zwischen den Helices beträgt –20° für OP-1, was 14° mehr negativ als für TGF-β2 ist. Trotz dieser Unterschiede in der helikalen Orientierung, sind die gleichen Reste-Positionen der Helix und Finger am Erzeugen der Kontakte der Interketten beteiligt, wie durch die schraffierten Reste in 3 gezeigt wird.
A. Unterschiede bei dem hOP-1 Dimer bezüglich den individuellen Monomeruntereinheiten
Während der Dimerisierung der Monomer-Untereinheiten werden mehrere Aminosäuren an der Oberfläche von jeder Monomer-Untereinheit in dem hOP-1-Dimer verborgen beziehungsweise begraben. 8 hebt, wie von der 2,8 Å Struktur bestimmt wurde, die Unterschiede in der Oberflächenzugänglichkeit von bestimmten Aminosäureresten, die in der hOP-1 Monomer-Untereinheit lokalisiert sind relativ zu solchen in dem hOP-1 Dimer hervor.
Es wurde unter Verwendung von ACCESS (Version 2.1) mit einer 1,4 Å Sonde (Lee et al., (1971) J. Mol. Biol. 55:379-400) ein Verlust eines nicht-polaren Oberflächenbereichs während der Dimerisierung berechnet. Ein nicht-polarer Oberflächenbereich ist als der Beitrag/die Kontribution zu der gesamten zugänglichen Oberfläche von Kohlenstoff- und Schwefelatomen definiert. Der Erfassungsalgorithmus in ACCESS für den Oberflächenbereich schneidet die Struktur in 0,25 Å Scheiben orthogonal zu der Z-Achse. Als Folge sind die Ergebnisse empfindlich gegenüber der Orientierung einer Struktur relativ zu der Z-Achse (Lee et al., (1971) supra). Um diese Wirkung zu minimieren wurden drei orthogonale und eine intermediäre Orientierung von jeder Struktur berechnet. Die Ergebnisse dieser Berechnungen wurden kombiniert, indem für jedes nicht-polare Atom der größte zugängliche Bereich angenommen wurde, der unter den vier Orientierungen erfasst wurde. Die hier für TGF-β2 berichteten Werte wurden unter Verwendung von Koordinaten von dem Eintrag 2TG1 (Daopn et al., (1992) Supra) und dem Eintrag 1TFG (Schlunegger et al. (1992) supra) berechnet, die von der Januar 1994-Freigabe der Protein-Datenbank (Bernstein et al. (1977) J. Mol. Biol. 112:535-542) am Nationalen Labor von Brookhaven erhalten wurden.
In 8 bezeichnet die mit "Rest" betitelte Säule eine Aminosäure von Interesse. Die mit "Monomer % Bereich" betitelte Säule bezeichnet den prozentualen Anteil, der an der Oberfläche des hOP-1 Monomers ausgesetzten Aminosäure, die mit "Dimer % Bereich" betitelte Säule bezeichnet den prozentualen Anteil der auf der Oberfläche des hOP-1-Dimers ausgesetzten Aminosäure, und die mit "versteckt % Bereich" betitelte Säule bezeichnet die Menge an Oberflächenbereich für jede Aminosäure, die auf Dimerisierung von jeder Monomeruntereinheit verloren geht, um das hOP-1 Dimer zu erzeugen. Diese Analyse zeigt Aminosäuren, die während der Dimerisierung begraben werden und folglich wahrscheinlich an der Grenzfläche der zwei Monomer-Untereinheiten lokalisiert sind. Beispielsweise werden 70.75% des Oberflächengebiets von His 84 bei einer Dimerisierung verborgen. Eine Revision der Struktur von dimerem hOP-1 zeigt, das His 84 an der Grenzfläche zwischen den zwei Monomeren lokalisiert ist.
B. Elektrostatischen Lösungspotentiale auf der Oberfläche von OP-1 und TGF-β2
Die elektrostatischen Lösungspotentiale, die die Op-1 und TGF-β2 (1TFG) (Schlunegger et al. (1992) supra) Dimere umgeben, wurden unter Verwendung von DELPHI (Gilson et al., (1987) Nature 330:84-86, und Nicholls et al., (1991) J. Comput. Chem. 12:435-445) (Biosym Technologies, Inc., San Diego, CA)) berechnet. Die Berechnungen wurden unter Verwendung einer Dielektrizitätskonstante eines Lösungsmittels von 80, einem Lösungsmittelradius von 1,4 Å, einer Innenstärke von 0,145 M und einem Innenradius von 2,0 Å ausgeführt. Das Innere des Proteins wurde unter Verwendung einer Dieletrizitätskonstanten von 2,0 modelliert. Es wurden Formalladungen verwendet und wie folgt verteilt: Atome OD1 und OD2 von Asp wurden jeweils –0,5 geladen, Atome OE1 und OE2 von Glu wurden jeweils –0.5 geladen, Atome NDI und NE2 von His wurden jeweils 0.25, Atom NZ von Lys wurde +1.0 geladen, Atome NH1 und NH2 von Arg wurden +0.5 geladen und Atom OXT der C-terminalen Carboxylgruppe wurde –1.0 geladen.
Die Unterschiede in der Ladungsverteilung auf der Oberfläche von OP-1 und TGF-β2 können durch Vergleich der Farbverteilungen von 5B beziehungsweise 5C beobachtet werden. Oberflächenregionen, die ein elektrostatisches Potential von –3kT oder weniger aufweisen sind in rot gezeigt, während Oberflächenbereiche von +3kT oder größer in blau gezeigt sind. Neutrale Regionen sind in grün oder gold gezeigt, um den, in 5A gezeigten, Rückgratbändern zu entsprechen. Wie in den folgenden Abschnitt erwähnt, können die Unterschiede im elektrostatischen Potential auf der Oberfläche von OP-1 und TGF-β2 eine wichtige Rolle in den spezifischen Wechselwirkungen der Mitglieder der TGF-β-Superfamilie mit deren Erkennungsrezeptoren spielen.
C. Rezeptorbindedomäne
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, ist, wie aus der Aminosäuresequenz von hOP-1 bestimmt wurde, wenn sie mit anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie (Siehe 3) abgeglichen wird, vorgesehen, dass die Rezeptorbindungsregionen von hOP-1 Aminosäuren umfassen, die sowohl Lösungsmittel zugänglich sind als auch an Positionen der heterogenen Zusammensetzung liegen. Unterschiedliche Strukturmerkmale in hOP-1, ähnlich wie TGF-β2, treten hauptsächlich in den äußeren Schleifen von Finger-1 und Finger-2 auf, den Schleifen, die an die Helixregion grenzen, und den Resten in der N-terminalen Domäne, die dem ersten Cystein des Cysteinknotens vorangehen. Diese Regionen sind einem Lösungsmittel zugänglich. In sowohl dimeren OP-1 als auch TGf-β2 Strukturen bilden die Spitze von Finger-2 und die Omega-Schleife von Finger-1 von der ersten Kette, und das C-terminale Ende der α-Helix in der Ferse der anderen Kette einen zusammenhängenden/Rücken von ungeführ 40 Å Länge und 15 Å Weite (5A). Es ist vorgesehen, dass dieser Rücken die primären strukturellen Merkmale beinhaltet, die mit dem Erkennungsrezeptor interagieren, und dass sich die Bindungsspezifität zwischen unterschiedlichen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie von den konformativen und elektrostatischen Variationen der Oberfläche dieses Rückens ableitet.
Unterschiede in der Konformation der Omega-Schleife des Fingers-1 die den Mittelabschnitt des Rückens bildet, und in dem Ende von Finger-2, der ein Ende des Rückens bildet, sind bekannt. Es gibt jedoch hervorstechende Unterschiede in der Oberflächenladung des Rückens von hOP-1 relativ zu TGF-β2 (siehe 5B und 5C). In hOP-1 sind die Enden der Fingerregionen negativ geladen, wohingegen in TGF-β2 die Enden der Fingerregionen positiv geladen sind. Dies führt zu einer Netto-Ladung von –4 für die Rezeptorbindungsrücken von hOP-1 gegenüber +3 für TGF-β2. Umgekehrt ist der β-Strang, der an der Windung von Finger-2 (β2, 2) lokalisiert ist, in OP-1 positiv geladen, wohingegen er in TGF-β2 negativ geladen ist (5B und 5C). Diese Eigenschaften bzw. Merkmale legen nahe, dass die elektrostatische Ladungsverteilung bei den spezifischen Interaktionen der Mitglieder der TGf-β-Superfamilie mit deren Erkennungsrezeptoren ein wichtige Rolle spielen.
9 fasst die Aminosäurereste zusammen, von denen gemäß der 2,8 Å Struktur abgenommen wird, dass sie den Rücken bilden und ebenfalls anzeigen, ob jeder Aminosäurerest in der Ferse, den Finger-1- oder Finger-2-Domänen angeordnet vorliegt. 9 stellt eine Liste von Aminosäureresten bereit, von denen angenommen wird, dass sie mindestens teilweise, wenn nicht die gesamte Rezeptorbindungsdomäne von hOP-1 bilden.
V. Gestaltung von Morphogen-Analogen
Obwohl vorgesehen ist, dass die Gestaltung bzw. das Design von Morphogen-Analogen durch herkömmliche Modellierungsverfahren vom Kugel- und Stabtyp unterstützt werden kann, ist vorgesehen, dass die Fähigkeit Morphogen-Analoge zu gestalten unter Verwendung moderner Computer gestützter Modellierungs- und Gestaltungs-Verfahren signifikant verbessert wird.
Es ist vorgesehen, dass die Gestaltung von Morphogen-Analogen, wie nachfolgend ausführlich besprochen, unter Verwendung herkömmlicher molekularer Modellierungscomputer oder Arbeitsplatzrechner unterstützt wird, die gewerblich von beispielsweise Silicon Graphics, Inc., oder Evans and Sutherland Computer Corp., erhältlich sind, die gleichfalls herkömmliche Computermodellierungsprogramme beispielsweise INSIGHTII, DISCOVER und DELPHI anwenden, die im Handel von Biosym, Technologies Inc., erhältlich und QUANTA, und CHARMM von Molecular Simulations, Inc., im Handel erhältlich sind.
Weiterhin ist klar, dass ein beliebiges Computersystem mit den, in 10 dargelegten, gesamten Eigenschaften bei der Durchführung/Praxis der vorliegenden Erfindung nützlich sein kann. Insbesondere ist 10 eine schematische Darstellung eines gewöhnlichen Computers am Arbeitsplatz, der miteinander in elektrischer Verbindung (100), beispielsweise über einen internen Bus oder externes Netzwerk, einen Prozessor (101), einen RAM (102), einen ROM (103), einem Terminal bzw. Anschluss (104) und wahlweise eine externe Speichereinrichtung, beispielsweise eine Diskette, CD ROM oder Magnetband (105) aufweist.
Es ist vorgesehen, dass die Koordinaten verwendet werden können, um nicht nur eine Basis zum Umbauen bzw. konstruieren von hOP-1-Dimeren unter Verwendung beispielsweise Ort spezifischer Mutageneseverfahren bereitzustellen, um beispielsweise die Löslichkeit und/oder Stabilität des aktiven hOP-1-Dimers in physiologischen Puffer zu erhöhen, sondern ebenfalls um einen Ausgangspunkt für die de novo Gestaltung und Herstellung von Peptiden oder anderen kleinen Molekülen bereitzustellen, die die biologische Aktivität von hOP-1 nachahmen. Nachfolgend sind erläuternde Beispiele dargelegt, die die Nützlichkeit von hOP-1 Atom-Koordinaten bei der Gestaltung von Morphogen-Analogen zeigen, wobei jedoch klar sein sollte, dass die nachfolgenden Beispiele erläuternd und in keiner Weise beschränkend gemeint sind.
A. Umbau von hOP-1 Dimeren
In einer Ausführungsform ermöglicht die Verfügbarkeit der Atom-Koordinaten für hOP-1 dem Fachmann theoretische Aminosäureersetzungen auszuführen und durch Berechnung im voraus zum tatsächlichen Ausführen und Testen des Test-Moleküls in einem Labormaßstab, ob eine bestimmte Aminosäureersetzung die Packung des OP-1-Dimers zerstört und ob es wahrscheinlich ist, dass ein Morphogen-Analog stabiler und/oder löslicher als das Matrizen-OP-1-Molekül ist. Derartige Verfahren helfen dem Fachmann nicht-entwicklungsfähige beziehungsweise unbrauchbare Ersetzungen zu beseitigen und die Bemühungen auf aussichtsreiche Test-Analoge zu fokussieren.
(i) Erhöhen der Stabilität von hOP-1 Dimeren (ausschließlich für veranschauliche Zwecke)
Es ist vorgesehen, dass der Fachmann im Besitz der Atom-Koordinaten, die hOP-1 definieren, kovalente und/oder nicht-kovalente Interaktionen von zusätzlichen Inter- oder Intra-Ketten in das hOP-1-Dimer einfügen kann, um das Dimer durch Verhinderung von Dissoziation oder Entfalten jeder Monomer-Untereinheit zu stabilisieren. Bevorzugte konstruierte bzw. umgebaute kovalente Interaktionen umfassen beispielsweise konstruierte Disulfidbindungen, und bevorzugte konstruierte nicht-kovalente Interaktionen umfassen beispielsweise Wasserstoffbindungen, Salzbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen.
Um beispielsweise zusätzliche Disulfidbindungen einzufügen kann der Fachmann Stellen identifizieren, die für das Einfügen eines Paars von Cystein-Aminosäureresten geeignet sind, indem Standard Molekular-Modellierungs-Programme, beispielsweise INSIGHT, DISCOVER, CHARMM und QUANTA verwendet werden. Ein anderes Programm, das beim Identifizieren von Paaren von Aminosäuren als mögliche Stellen zum Einfügen stabilisierender Disulfidbindungen nützlich ist, wird in US-P-4,908,773 beschrieben.
Der Fachmann, der beispielsweise das INSIGHT-Programm verwendet, kann auf Paare von Aminosäuren durchmustern, bei denen der Abstand zwischen den Cβ-Atomen von jeder Aminosäure in dem Bereich von ungefähr 3,0 bis ungefähr 5,0, oder noch bevorzugter ungefähr 3,5 bis ungefähr 4,5 Å getrennt beträgt. Für diesen Zweck werden an dem Computer zuerst Glycine, die keine Cβ-Cβ Bindung aufweisen zu Alaninen umgewandelt. Der mögliche Bereich von Cβ-Cβ Abstanden in einer Disulfidbindung liegt bei 3,1 bis 4,6 Å, wobei jedoch Trennungen außerhalb dieses Bereichs durch kleine Verschiebungen in die Nachbaratome angepasst werden können. Das Aufsuchen von Cβ anstelle von Cα-Abständen gewährleistet sowohl einen angemessenen Abstand als auch eine genaue Orientierung von der Cα-Cβ Bindung. Die Wirkungen eines Hinzufügens einer derartigen zusätzlichen Verbindung an eine Proteinstruktur wird durch Mutieren der zwei Test-Reste an Cys bestimmt; Drehen von jedem neuen Cys um die Cα-Cβ Bindung, um die zwei γ Schwefel so nahe wie möglich bis innerhalb 2 Å zu bringen; Erzeugen eines Disulfids zwischen den γ Schwefeln; und Energie minimieren der struktureller Regionen innerhalb 5 Å der Disulfidbindung. Eine beliebige Verformung der Struktur, die durch Einfügen der zusätzlichen Disulfidbindung bewirkt wird, wird durch Inspektion aufgedeckt, falls die minimierte, mutierte Modellstruktur auf die native Struktur überlagert wird.
Es ist vorgesehen, dass die Einfügung zusätzlicher Verbindungen die Löslichkeit dadurch verbessern wird, dass ein vorübergehendes Aussetzen von einer nicht-polaren Grenzfläche oder begrabenen Resten verhindert wird. 11A listet basierend auf der 2,8 Å Struktur Aminosäurereste auf, die zu Cysteinresten mutiert werden können, um zusätzliche Inter-Kettendisulfidbindungen, basierend auf den vorstehend erwähnten Auswahlkriterien, einzufügen. Für Bezugszwecke umfasst Tabelle 11A ebenfalls die Länge der natürlich vorkommenden Inter-Ketten-Disulfidverbindung im Wildtyp hOP-1, das heißt die Disulfidverbindung die Cys 103 von einer Monomer-Untereinheit mit dem Gegenstück Cys 103 der anderen Monomer-Untereinheit verbindet.
Ein bevorzugtes Paar von Resten, das zur Modifikation geeignet ist, umfasst den Rest an Position 83 der einen Kette und den Rest an Position 130 der anderen Kette. Es ist vorgesehen, dass die zusätzliche Inter-Kettenverbindung die dimere Struktur durch Verbinden des N-terminalen Endes der Fersenhelix der ersten Untereinheit mit der Mitte der Finger-2 Region in der zweiten Untereinheit stabilisiert. Eine Disulfidbindung zwischen Position 82 an einer Kette und Position 130 der anderen Kette ist geometrisch durchführbar beziehungsweise plausibel, wobei jedoch dessen Modifikation eine geeignete Glycosylierung hemmen kann, da Thr 82 Teil der NAT-Glycosylierungsstelle in OP-1 ist.
11B fasst Aminosäurereste zusammen, die zu Cysteinresten mutiert werden können, um zusätzliche Intra-Ketten-Disulfidbindungen basierend auf den vorstehend ausgeführten Auswahlkriterien einzuführen. Wie vorher angemerkt, umfasst die mögliche Rezeptor-Bindungsregion mindestens zwei körperlich proximal, jedoch sequentiell getrennte Regionen, namentlich die Spitze von Finger-1 und Finger-2. Es ist vorgesehen, dass die strukturelle Integrität des möglichen Rezeptorbindungsrückens durch Konstruieren einer Intra-Ketten-Disulfidverbindung zwischen Resten von Finger 1 und Finger-2 stabilisiert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Rest an Position 58 in Finger 1 über Disulfid mit dem Rest an Position 114 in Finger-2 gebunden sein. Es ist vorgesehen, dass eine Verbindung zwischen den Resten an Position 58 und 115 ebenfalls entwicklungsfähig bzw. plausibel sein würde, wobei dies jedoch die Disulfidbindung näher an die mögliche Rezeptorbindungsregion an Finger-2 bewegen würde. Eine Verbindung zwischen Positionen 65 und 133 ist ebenfalls möglich, wobei jedoch diese nahe an der Knotenregion von jeder Kette angeordnet wäre und folglich eine geringe Wirkung auf ein Stabilisieren der möglichen Rezeptorbindungsregionen an den Spitzen von Finger-1 und Finger-2 aufweisen kann. Außerdem könnte die Nähe einer derartigen Verbindung zu den Disulfidbindungen in der Knotenregion die genaue Ausbildung jener Strukturen beeinträchtigen.
Bezüglich von nicht-kovalenter Interaktionen ist vorgesehen, dass die strukturelle Stabilität des hOP-1-Dimers durch Erhöhen einer Inter-Ketten-Wasserstoffverbindung verstärkt werden kann.
Das elektrostatische Potential (aufgrund anderer Ladungen in einem Protein) in der Region einer geladenen Restes beeinflusst den pK-Wert dieses Restes. Da die pK-Werte von sowohl Histidin als auch der N-terminale primären Aminogruppe nahezu neutral sind, kann es möglich sein, dass deren pK-Werte durch die Anordnung von Ladungen an der Oberfläche des Moleküls modifiziert werden. Es ist vorgesehen, dass das begrabene His an Position His 84 in hOP-1 behilflich ist die Struktur des Dimers durch Teilnahme an Wasserstoffbindungen mit Rückgrat-Carbonylgruppen von Resten Ala 64 und Tyr 65 der anderen Kette zu stabilisieren. Dementsprechend ist vorgesehen, dass das Einfügen von Oberflächenladungen diese Wirkung erhöhen kann und dadurch die Struktur des Moleküls stabilisiert wird. Mutieren von Tyr 65 oder Val 132 zu Asp kann weiterhin beispielsweise die Car bonylbindungen der Aminosäurereste an Position 64 und 65 polarisieren als auch den pK-Wert von His 84 erhöhen. Der pK-Wert von His 84 kann weiterhin durch Ersetzen von Resten Tyr 44, Ala63 oder Asn 110 durch ein Asp beeinflusst werden., Es ist vorgesehen, dass die bevorzugte Modifikation für diesen Zweck Tyr 65 → Asp 65 ist.
Unter Verwendung der gleichen grundlegenden Prinzipien kann der Fachmann auf ähnliche Weise Paare von Aminosäuren identifizieren, deren Ersetzung das Einfügen einer Inter-Ketten Salzbrücke, internen Wasserstoffbindung oder hydrophobe Wechselwirkungen fördert. Derartige Bestimmungen liegen innerhalb des Umfangs eines Fachmann auf dem Gebiet des molekularen Modellierens.
Sobald ein Paar Zielaminosäuren identifiziert wurden, kann die auf den Ort gerichtete Ersetzung dieser Zielaminosäuren mit den wünschenswerten Ersetzungen durch die Verwendung herkömmlicher ortsspezifischer Mutageneseverfahren gefördert werden, beispielsweise durch Kassetten-Mutagenese oder Oligonukleotid gerichtete Mutagenese. Derartige Verfahren sind sorgfältig im Stand der Technik dokumentiert und werden folglich hier nicht ausgeführt. Die Wirkung der ortsspezifischen Ersetzungen auf die Stabilität von so erhaltenem modifizierten hOP-1-Dimeren oder Muteinen kann nach Herstellung und Reinigung unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Standardverfahren erfasst werden, beispielsweise Cirkulardichroismus, analytische Zentrifugation, differenzielle Scanningkalorimetrie, Fluoreszenz oder andere spektroskopische Verfahren.
(ii) Erhöhen der Wasserlöslichkeit des hOP-1 Dimers (für veranschauliche Zwecke)
OP-1 weist eine begrenzte Löslichkeit in wässrigen Lösungsmitteln auf. Es ist jedoch vorgesehen, dass durch Verwendung der hOP-1 Atom-Kordinaten der Fachmann Aminosäuren an der Lösungsmittel zugänglichen Oberfläche des Dimers ersetzen kann, wodurch die dielektrischen Eigenschaften von dimerem hOP-1 erhöht werden. Beispielsweise können die Lösungsmittel zugänglichen Hydrophoben Aminosäurereste, wie beispielsweise Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin durch mehr polare Reste wie beispielsweise Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat, Asparagin, Glutamat und Glutamin ersetzt werden.
Die Lösungsmittel zugänglichen Aminosäuren können unter Verwendung eines Computerprogramms, wie beispielsweise ACCESS (Version 2.1) unter Verwendung einer 1,4 Å Sonde (Lee et al., (1972) supra) identifiziert werden. In 7, sind die Aminosäurereste eingekastelt, die mindestens 20 % von deren Seitenkettenbereichen aufweisen, die Lösungsmittel ausgesetzt sind. Werden Oberflächenreste modifiziert, dann ist wichtig keine neuen Epitope zu erzeugen, die als Nicht-Wirt erkannt werden, insbesondere wenn die hOP-1-Analoge als injizierbare Moleküle verwendet werden sollen. Es wird angenommen, dass Aminosäureseitenketten, die durch ein 10 Å Kugelsonde gesehen werden wahrscheinlich Teil der Oberflächenepitope sind. Ein Fachmann kann ACCESS mit einer 10 Å Kugelsonde verwenden, um mögliche Epitope zu identifizieren, wobei jedoch dieser Vorgang manuell unter Verwendung eine Graphikpackung, wie beispielsweise INSIGHTII ausgeführt werden kann. In 8 sind so identifizierte Restseitenketten als mögliche Epitope hervorgehoben. Restpositionen, die Kandidaten beziehungsweise Tests zur Modifikation darstellen, um so die Löslichkeit des Dimers zu verbessern sind hervorgehoben. Bevorzugte Test-Aminosäuren zur Ersetzung umfassen beispielsweise Ala 63, Ala 72, Ala 81, Ala 111, und Ala 135, Ile 86, Ile 112, Tyr52, Tyr 65 und Tyr 128.
Sobald Lösungsmittel zugängliche hydrophobe oder nicht-polare Aminosäuren identifiziert wurden (siehe 9), können diese Aminosäuren dann über einen Computer theoretisch durch mehr polare Aminosäuren ersetzt werden. Die Wirkung der Aminosäureersetzungen beziehungsweise -austausche auf die elektrostatischen Potentiale der Lösung, die das modifizierte hOP-1-Dimer umgeben, als auch die freie Energie des Dimers können unter Verwendung des DELPHI-Programms (Gilson et al., (1987) supra), Nicholls et al., (1991) supra) berechnet werden. Bevorzugte Aminosäuresubstitutionen erniedrigen die freie Energie des hOP-1-Dimers ohne mögliche antigene Stellen einzuführen. Wie vorstehend erwähnt, können derartige antigene Stellen durch Implementierung eines Computerprogramms wie ACCESS (Version 2.1) unter Verwendung einer 10 Å Sonde nachgewiesen werden. Außerdem ist vorgesehen, dass bevorzugte Oberflächenreste, die zur Ersetzung geeignet sind nicht an der Rezeptorbindungsdomäne beteiligt sind.
Die erhaltenen Test beziehungsweise Kandidaten-Morphogen-Analoge können unter Ver- Wendung herkömmlicher ortsgerichteter Mutageneseverfahren hergestellt werden und die Wirkung der ortsgerichteten Modifikation auf die Löslichkeit des hOP-1-Dimers kann beispielsweise durch Vergleich des Verteilungskoeffizienten oder der "Aussalzungseigenschaften" des modifizierten hOP-1-Dimers gegenüber dem nativen hOP-1-Dimer erfasst werden. Siehe beispielsweise Scofes (1987) in Protein Purification: Principles and Practice, 2nd Edition (Springer-Verlag) und Englard et al., (1990) Methods in Enzymology 182: 285-300.
(iii) Konstruieren von Glycosylierungsstellen (lediglich für Erläuterungszwecke)
Zusätzlich zum Ersetzen einzelner Lösungsmittel zugänglicher Aminosäurereste mit einem mehr polaren oder hydrophoben Aminosäurerest können ein oder mehrere Lösungsmittel zugängliche Aminosäurereste ersetzt werden, um so eine neue eukaryotische Glycosylierungsstelle zu erzeugen oder alternativ zu beseitigen oder eine vorhandene Glycosylierungsstelle zu verändern. Glycosylierungsstellen sind wohl bekannt und sorgfältig im Stand der Technik beschrieben. Hinzufügen einer neuen Glycosylierungsstelle oder Änderung einer vorhandenen Stelle kann zu der Addition einer oder mehrerer Glycosylgruppen, beispielsweise N-Acetylsialinsäure führen, die die Löslichkeit des Morphogen-Analogs erhöhen kann. Wie hier beschrieben können derartige Stellen durch ortsgerichtete Mutageneseverfahren eingefügt werden, die im Stand der Technik wohl bekannt sind. Vorzugsweise erzeugen derartige Stellen keine neuen antigenen Determinanten (obwohl diese für kurz dauernde therapeutische Verwendungen toleriert werden können). Bezugnahme auf Tabelle 8 identifiziert, basierend auf der 2,8 Å Struktur, Oberflächen zugängliche Aminosäurereste, die wahrscheinlich nicht Teil eines antigenen Epitops sind und die als Kandidaten zum Einfüngen einer zusätzlichen Glycosylierungsstelle verwendet werden können.
B. Konstruieren kleiner Moleküle basierend auf der hOP-1-Struktur
Die Verfügbarkeit von Atom-Koordinaten für hOP-1 ermöglicht dem Fachmann kleine Moleküle, beispielsweise Peptide zu gestalten, die die biologische Aktivität von hOP-1 nachahmen.
(i) Peptide
Nachdem bestimmt wurde, welche Aminosäurereste zu der Rezeptorbindungsdomäne (Supra) beitragen, besteht für den Fachmann die Möglichkeit synthetische Peptide zu gestalten, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die ein vorgewähltes Rezeptorbindungsmotiv festlegen. Ein für das Gestalten von möglichen biologisch aktiven Peptidomimetika nützliches Computerprogramm ist in US-P-5,331,573 beschrieben.
Zusätzlich zum Wählen einer erwünschten Aminosäuresequenz kann der Fachmann unter Verwendung von standardmäßigen molekularen Modellierungs-Softwarepaketen, infra, spezifische Peptide gestalten, die beispielsweise zusätzliche Aminosäuren wie Cystein aufweisen, die an vorgewählten Positionen lokalisiert sind, um eine Zyklisierung des Peptids von Interesse zu fördern. Eine Oxidation des zusätzlichen Cysteinreste führt zu einer Zyklisierung des Peptids, wodurch das Peptid in eine Konformation eingeschränkt wird/beschränkt wird, die die Konformation der entsprechenden Aminosäuresequenz in nativem hOP-1 nachahmt. Es ist vorhergesehen, dass beliebige standardmäßige kovalente Bindungen, beispielsweise Disulfidbindungen, die gewöhnlich zum Zyklisieren synthetischer Peptide verwendet werden, in der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich – sein können. Eine alternative Zyklisierungschemie wird in der PCT/WO95/01800 erläutert.
Derartige Peptide können synthetisiert und auf OP-1 ähnliche Aktivität unter Verwendung eines beliebigen der nachfolgend beschriebenen Standardprotokolle durchmustert werden.
(vi) Herstellung von Morphogen-Analogen
Wie vorstehend erwähnt, können die Morphogen-Analoge der Erfindung modifizierte dimere hOP-1-Proteine oder kleine Moleküle, beispielsweise Peptide umfassen. Es ist vorgesehen, dass beliebige geeignete Verfahren zum Herstellen eines vorgewählten Morphogen-Analogs verwendet werden können. Beispielsweise können derartige Verfahren, Verfahren einer biologischen Herstellung aus geeigneten Wirtszellen oder eine synthetische Herstellung unter Verwendung der synthetischen organischen Chemie umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Dimere modifizierte hOP-1-Proteine oder auf hOP-1 basierende Peptide können beispiels weise unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten und sorgfältig dokumentierten, herkömmlichen DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Unter diesen Umständen können die Proteine oder Peptide durch die Präparation von Nukleinsäuresequenzen hergestellt werden, die die entsprechenden Protein- oder Peptidsequenzen kodieren, wonach die erhaltene Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden kann. Beispielhaft können die Proteine und Peptide durch die Anordnung von synthetischen Nukleotidsequenzen und/oder durch 'Verbinden von DNA-Restriktionsfragmenten erzeugt werden, um ein synthetisches DNA-Molekül zu erzeugen. Die DNA-Moleküle werden anschließend in ein Expressionsvehikel, beispielsweise ein Expressionsplasmid, ligiert und in eine geeignete Wirtszelle, beispielsweise E. coli, transfiziert. Das durch das DNA-Moleküle kodierte Protein wird dann exprimiert, gereinigt, falls erforderlich gefaltet, in vitro auf eine Bindungsaktivität mit einem OP-1 Rezeptor getestet und anschließend getestet, um zu beurteilen, ob das Morphogen-Analog eine hOP-1-ähnliche biologische Aktivität induziert oder stimuliert.
Die Verfahren zum Manipulieren, Vermehren und Rekombinieren von DNA, die die Aminosäuresequenzen von Interesse kodieren, sind allgemein im Stand der Technik wohl bekannt und werden folglich hier nicht ausführlich beschrieben. Die Verfahren zum Identifizieren und Isolieren von hOP-1 und deren Erkennungsrezeptoren kodierenden Gene sind ebenfalls wohl verstanden und werden in der Patent- und anderer Literatur beschrieben.
Kurz, die Konstruktion von DNAs, die die hier offenbarten biosynthetischen Konstrukte kodieren, wird unter Verwendung bekannter Verfahren ausgeführt, die die Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme einbeziehen, die die DNA sequenzspezifisch schneiden, um glatte Enden oder kohäsive Enden zu erzeugen, DNA-Ligasen, Verfahren, die eine enzymatische Addition von klebrige beziehungsweise versetzte Enden an glatt beendeter DNA ermöglichen, Konstruktion von synthetischen DNAs durch Anordnung von kurzen oder mittellangen Oligonukleotiden, cDNA-Syntheseverfahren, Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)-Verfahren zum Vermehren geeigneter Nukleinsäuresequenzen aus Bibliotheken und synthetische Sonden zum Isolieren von OP-1-Genen oder Genen, die andere Mitglieder der TGF-β-Superfamilie als auch deren Erkennungsrezeptoren kodieren. Es werden verschiedene Promotorsequenzen von Bakterien, Säugern oder Insekten, um ein paar zu nennen, und andere regulatorische DNA-Sequenzen verwendet, um eine Expression zu vollbringen, und unterschiedliche Wirtszelltypen sind ebenfalls bekannt und verfügbar. Herkömmliche Transfektionsverfahren und ebenso herkömmliche Verfahren zum Klonieren und Subklonieren von DNA sind bei der Durchführung dieser Erfindung nützlich und dem Fachmann bekannt. Es können verschiedene Typen von Vektoren, wie Plasmide und Viren, einschließlich tierischer Viren und Bakteriophagen verwendet werden. Die Vektoren können unterschiedliche Markergene ausnutzen, die einer erfolgreich transfizierten Zelle eine nachweisbare beziehungsweise erfassbare phänotypische Eigenschaft verleihen, die zur Identifikation verwendet werden kann, welcher von einer Familie von Klonen die rekombinante DNA des Vektors erfolgreich eingebaut aufweist.
Ein Verfahren DNA zu erhalten, die die hier offenbarten biosynthetischen Konstrukte kodiert, besteht darin synthetische Oligonukleotide anzuordnen, die in einem herkömmlichen, automatisierten Oligonukleotid-Synthesizer hergestellt werden, gefolgt durch Ligation mit geeigneten Ligasen. Beispielsweise können überlappende, komplementäre DNA-Fragmente unter Verwendung der Phosphoramidit-Chemie synthetisiert werden, wobei Endsegmente nicht phosphoryliert bleiben, um eine Polymerisation während einer Ligation zu vermeiden. Ein Ende der synthetischen DNA verbleibt mit einem "klebrigen Ende", das der Wirkungsstelle einer bestimmten Restriktionsendonuklease entspricht, und wobei das andere Ende mit einem Ende verbleibt, das der Wirkungsstelle einer anderen Restriktionsendonuklease entspricht. Die komplementären DNA-Fragmente werden miteinander ligiert, um ein synthetisches DNA-Konstrukt zu erzeugen.
Nachdem das geeignete DNA-Molekül synthetisiert wurde, kann es in einen Expressionsvektor eingebaut und zur Proteinexpression in eine geeignete Wirtszelle transfiziert werden. Nützliche prokaryotische Wirtszellen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, E. coli und B. subtilis. Nützliche eukaryotische Wirtszellen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hefezellen, Insektenzellen, Myelomzellen, Fibroblasten 3T3-Zellen, Affennieren oder COS-Zellen, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Lungenepithelzellen des Nerzes, menschliche Vorhautfibroblastenzellen, Glioblastomzellen des Menschen und Teratocar cinomzellen. Alternativ können die Gene in einem Zellfreien System, wie beispielsweise dem Retikulozyten-Lysatsystem des Kaninchens exprimiert werden.
Der Vektor kann zusätzlich unterschiedliche Sequenzen umfassen, um eine korrekte Expression des rekombinanten Proteins zu fördern, einschließlich Transkriptions-Promotor- und Terminations-Sequenzen, Enhancer-Sequenzen, vorzugsweise Sequenzen der Ribosomenbindungsstelle, vorzugsweise mRNA Leader-Sequenzen, vorzugsweise Protein prozessierende Sequenzen, vorzugsweise Signalsequenzen für eine Proteinsekretion und dergleichen. Die DNA-Sequenz, die das Gen von Interesse kodiert, kann ebenfalls manipuliert werden, um mögliche hemmende Sequenzen zu entfernen oder um eine unerwünschte Bildung von Sekundärstrukturen zu minimieren. Die morphogenen Proteinanaloge können ebenfalls als Fusionsproteine exprimiert werden. Nachdem die Proteine translatiert wurden, können sie aus den Zellen selbst gereinigt oder aus dem Kulturmedium gewonnen werden und anschließend an einer spezifischen Proteasestelle, falls so erwünscht, gespalten werden.
Falls das Gen beispielsweise in E. coli exprimiert werden soll, wird es in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert. Dies kann durch Positionieren des konstruierten Gens stromabwärts einer Promotorsequenz, wie beispielsweise Trp oder Tac, und/oder einem Gen, das für ein Leaderpeptid, wie das Fragment B von Protein A (FB), kodiert, erreicht werden. Während der Expression reichern sich die erhaltenen Fusionsproteine in refraktilen Körperchen im Zytoplasma der Zellen an und können nach Zerstörung der Zellen mit Hilfe einer French-Presse oder Ultraschall geerntet werden. Die isolierten refraktilen Körperchen werden dann aufgeschlossen und die exprimierten Proteine werden durch Verfahren, die bereits bei zahlreichen anderen rekombinanten Proteinen eingeführt wurden, gefaltet und die Leadersequenz abgespalten, falls erforderlich.
Eine Expression der konstruierten Gene in eukaryotischen Zellen erfordert Zellen und Zelllinien, die einfach zu transfizieren sind, die Fähigkeit aufweisen die Fremd-DNA mit einer nicht rearrangierten Sequenz stabil zu halten und die die nötigen zellulären Komponenten für eine effiziente Transkription, Translation, post-translationale Modifikation und Sekretion des Proteins aufweisen. Außerdem ist ein geeigneter Vektor notwendig, der das Gen von Interesse trägt. Eine DNA-Vektorgestaltung für eine Transfektion in Säugetierzellen sollte geeignete Sequenzen umfassen, um eine Expression des Gens von Interesse, wie hier beschrieben, zu födern, einschließlich geeigneter Transkriptionsinitiations-, Terminations- und Enhancer-Sequenzen, als auch Sequenzen, die die Translationseffizienz erhöhen, wie beispielsweise die Kozak-Konsensus-Sequenz. Bevorzugte DNA-Vektoren umfassen ebenfalls ein Markergen und Mittel zum Vermehren der Kopienanzahl des Gens von Interesse. Eine ausführliche Übersicht über den Stand der Technik zur Herstellung von Fremd-Proteinen in Säugetierzellen, einschließlich nützlicher Zellen, fordernder Sequenzen für eine Proteinexpression, Markergenen, und Genvermehrungsverfahren ist in Bendig (1988) Genetic Engineering 7:91-127 offenbart.
Die am besten charakterisierten Transkriptionspromotoren zur Expression eines Fremdgens in einer bestimmten Säugetierzelle sind der SV40 frühe Promotor, der Adenvirus-Promotor (AdMLP), der Metallothionein-I-Promotor der Maus (mMT-I), die lange terminale Wiederholung (LTR) des Rous-sarcoma-Virus (RSV), die lange terminale Wiederholung des Mammatumorvirus der Maus (MMTV-LTR) und der hauptsächliche intermediär frühe Promotor des Zytomegalie-Virus des Menschen (hCMV). Die DNA-Sequenzen für alle diese Promotoren sind im Stand der Technik bekannt und im Handel erhältlich.
Die Verwendung eines auswählbaren DHFR-Gens in einer dhfr^– Zelllinie stellt ein wohl charakterisiertes Verfahren dar, das bei der Vermehrung von Genen in Säugetierzellsystemen nützlich ist. Kurz, das DHFR-Gen wird auf dem Vektor bereitgestellt, der das Gen von Interesse trägt, und wobei die Zugabe steigender Konzentrationen des zytotoxischen Arzneimittels Methotrexat, das durch DHFR metabolisiert wird, zu einer Vermehrung der Kopienzahl des DHFR-Gens führt, als auch der des assoziierten Gens von Interesse. DHFR als ein wählbares, vermehrbares Markergen in transfizierten Ovarialzelllinien des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) ist besonders gut im Stand der Technik charakterisiert. Andere nützliche vermehrbare Markergene schließen die Adenosin-Deaminase (ADA) und die Glutamin-Synthetase (GS) Gene ein.
Die Wahl von Zellen/Zelllinien ist ebenfalls bedeutsam und ist von den Anforderungen des Experimentators abhängig. COS-Zellen stellen hohe Spiegel/Pegel von vorübergehender beziehungsweise transienten Genexpression bereit, wobei sie ein nützliches Mittel zum schnellen Durchmustern der biosynthetischen Konstrukte der Erfindung bereitstellen. Die COS-Zellen werden gewöhnlich mit einem Simian-Virus 40 (SV40) Vektor transfiziert, der das Gen von Interesse trägt. Die transfizierten COS-Zellen sterben schließlich, wodurch die Langzeitproduktion des erwünschten Proteinprodukts verhindert wird, wobei es jedoch ein nützliches Verfahren zum Testen vorläufiger Analoge auf eine Bindungsaktivität bereitstellt.
Die unterschiedlichen Zellen, Zelllinien und DNA-Sequenzen, die für eine Expression der Einzelketten-Konstrukte der Erfindung in Säugetierzellen verwendet werden können, sind im Stand der Technik wohl charakterisiert und einfach verfügbar. Andere Promotoren, selektionierbare beziehungsweise wählbare Marker, Genvermehrungsverfahren und Zellen können ebenfalls verwendet werden, um die Proteine dieser Erfindung zu exprimieren. Besondere Einzelheiten der Transfektion, Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen sind im Stand der Technik gut dokumentiert und werden vom Fachmann verstanden. Weitere Einzelheiten über verschiedene technische Gesichtspunkte von jedem der Schritte, die bei der rekombinanten Herstellung von Fremdgenen in Säugetierzellexpressionssystemen verwendet werden, können in einer Anzahl von Fach-, Lehr- und Laborhandbüchern, wie Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (1989), gefunden werden..
Alternativ können Morphogen-Analoge, die kleine Moleküle sind, die gewöhnlich bis zu 50 Aminosäuren lang sind, unter Verwendung von Standard-Festphasen-Peptidsyntheseverfahren synthetisiert werden, beispielsweise, Verfahren, die denen in Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149 beschriebenen ähnlich sind. Während einer Synthese werden beispielsweise N-α geschützte Aminosäuren mit geschützten Seitenketten schrittweise an eine wachsende Polypeptidkette angefügt, die durch deren C-terminales Ende an einen unlöslichen polymeren Träger, beispielsweise Polystyren-Kügelchen, verbunden ist. Die Peptide werden durch Verbinden einer Aminogruppe einer N-α entschützten Aminosäure an eine α-Carboxygruppe einer N-α geschützten Aminosäure synthetisiert, die durch Reagieren mit einem Reagenz, wie Dicyclohexylcarbodiimid, aktiviert wurde. Die Anfügung einer freien Aminogruppe an das aktivierte Carboxyl führt zur Bildung einer Peptidbindung. Die am häufigsten verwendeten N-α Schutzgruppen umfassen Boc, das säureempfindlich und Fmoc, das basenempfindlich ist.
Kurz, die C-terminale N-α geschützte Aminosäure wird zuerst an die Polystyren-Kügelchen angebracht. Dann wird die N-α-Schutzgruppe entfernt. Die entschützte α-Aminogruppe wird an die aktivierte α-Carboxylatgruppe der nächsten N-α geschützten Aminosäure gekoppelt. Der Vorgang wird solange wiederholt bis das erwünschte Peptid synthetisiert ist. Die erhaltenen Peptide werden von dem unlöslichen Trägerpolymer gespalten und die Aminosäureseitenketten werden entschützt. Längere Peptide, die beispielsweise größer als ungefähr 50 Aminosäuren in der Länge sind, werden gewöhnlich durch Kondensation von geschützten Peptidfragmenten abgeleitet. Einzelheiten einer geeigneten Chemie, Harzen, Schutzgruppen, geschützten Aminosäuren und Reagenzien sind im Stand der Technik wohl bekannt und werden somit hier nicht ausführlich erläutert. Siehe beispielsweise Atherton et al. (1963) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press,), und Bodanszky (1993) Peptide Chemistry; A Practical Textbook, 2. Auflage Ed, Springer Verlag, und Fields et al. (1990) Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214, wobei deren Offenbarungen durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind.
Eine Reinigung des erhaltenen Peptids wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wie beispielsweise einer präparativen HPLC, beispielsweise Gelpermeation, Verteilungs- und/oder Innenaustausch-Chromatographie erreicht. Die Wahl von geeigneten Matrizes und Puffer ist im Stand der Technik wohl bekannt und wird somit hier nicht ausführlich beschrieben.
VII. Durchmustern nach Bindung und biologischer Aktivität
Als ersten Schritt bei einer Bestimmung ob ein Morphogen-Analog eine OP-1 ähnliche biologische Aktivität induziert, kann der Fachmann einen standardmäßigen Liganden-Rezeptor-Assay verwenden, um zu bestimmen, ob das Morphogen-Analog vorzugsweise an OP-1 Rezeptor bindet. Der Fachmann wird für standardmäßige Rezeptor-Liganden-Assays beispielsweise auf Legerski et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 183: 672-679; Frakar et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80:849-857; Chio et al. (1990) Nature 343: 266-269; Dahlman et al. (1988) Biochem 27:1813-1817; Strader et al. (1989) J. Biol. Chem.264:13572-13578; und D'Dowd et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992, hingewiesen.
Bei einem gewöhnlichen Liganden/Rezeptor-Eindungs-Assay, der bei der Durchführung dieser Erfindung nützlich ist, wird gereinigtes OP-1 mit einer bekannten, quantifizierbaren Affinität für einen vorgewählten OP-1-Rezeptor (siehe beispielsweise Ten Dijke et. al (1994) Science 264:101-103, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist) mit einem erfassbaren Rest, beispielsweise einer radioaktiven Markierung, einer chromogenen Markierung oder einer fluorogenen Markierung markiert. Aliquots von gereinigtem Rezeptor, Fragmenten der Rezeptorbindungsdomäne, oder Zellen, die den Rezeptor von Interesse auf deren Oberfläche exprimieren, werden mit markierten OP-1 in der Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des nicht-markierten Morphogen-Analogs inkubiert. Die relative Bindungsaffinität des Morphogen-Analogs kann dadurch erfasst werden, dass die Fähigkeit des Kandidaten (nicht-markiertes Morphogen-Analog) die Bindung von markiertem OP-1 an dem Rezeptor zu hemmen, quantifiziert wird. Bei Ausführen des Assays werden der Rezeptor und das OP-1 mit festen Konzentrationen in der Anwesenheit und Abwesenheit von nicht-markiertem Morphogen-Analog inkubiert. Die Empfindlichkeit kann durch Vorinkubieren des Rezeptors mit dem Test-Morphogen-Analog vor der Zugabe von markiertem OP-1 erhöht werden. Nachdem der markierte Konkurrent zugegeben wurde, wird für eine adäquate Konkurrenten-Bindung ausreichend Zeit gegeben, und wobei anschließend freies und gebundenes markiertes OP-1 von einander getrennt, und das eine oder das andere erfasst werden.
Bei der Durchführung der Durchmusterungsprozesse nützliche Markierungen umfassen radioaktive Markierungen (beispielsweise ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In oder ⁷⁷Br), chromogene Markierungen, spektroskopische Markierungen (wie beispielsweise solche in Haughland (1994) "Handbook of Fluorescent and Research Chemicals 5 ed" by Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) oder konjugierte Enzyme, die hohe Umsatzraten aufweisen, beispielsweise Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase oder β-Galactosidase, die in Kombination mit chemilumineszenten oder fluorogenen Substraten verwendet werden können.
Die biologische Aktivität, namentlich die Agonisten- oder Antagonisten-Eigenschaften des sich ergebenden Morphogen-Analogs können anschließend unter Verwendung beliebig herkömmlicher in vivo und in vitro Assays charakterisiert werden, die dazu entwickelt wurden die biologische Aktivität von OP-1 zu erfassen. Verschiedene spezifische Assays, von denen angenommen wird bei der Durchführung der Erfindung nützlich zu sein, werden nachfolgend ausführlich in Beispiel 1 dargelegt.
Weiterhin sollte klar sein, dass viele der Standard-OP-1-Assays automatisiert sein können, wodurch das Durchmustern einer großen Anzahl von Morphogen-Analogen gleichzeitig gefördert wird. Derartige Automationsverfahren liegen auf dem Niveau der Fertigkeit des Fachgebiets der Arzneimitteldurchmusterung und werden somit hier nicht ausgeführt.
Folgend auf die Identifikation von nützlichen Morphogen-Analogen kann das Morphogen-Analog in gewerblich nützlichen Mengen (beispielsweise ohne Begrenzung, Gramm- und Kilogrammmengen) hergestellt werden, beispielsweise durch Herstellen von Zelllinien, die die Morphogen-Analoge von Interesse exprimieren oder durch Herstellen synthetischer Peptide, die die geeignete Aminosäuresequenz festlegen. Es ist jedoch klar, dass herkömmliche Verfahren zur Herstellung der geeigneten Zelllinien und zum Herstellen synthetischer Peptide wohl bekannt und sorgfältig im Stand der Technik dokumentiert sind, und somit hier nicht ausführlich ausgeführt werden.
VIII. Formulierung und biologische Aktivität (lediglich zu Erläuterungszwecken)
Morphogen-Analoge, einschließlich OP-1-Analogen, können zur Verabreichung an einen Säuger, vorzugsweise einen dafür bedürftigen Menschen, als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden. Die Zusammensetzung kann durch ein beliebiges Mittel, beispielsweise parenteral, oral oder lokal verabreicht werden. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise eine wässrige Lösung, mit der das zu verabreichende Morphogen-Analog lokal durch Injektion an eine erwünschte Gewebestelle, oder systemisch intravenös, subkutan, intramuskulär, intraorbital, ophthalmisch, intraventrikulär, intracranial, intracap sular, intraspinal, intracisternal, intraperitoneal, buccal, rektal, vaginal, intranasal verabreicht wird oder durch Verabreichung eines Aerosols. Die Lösung ist vorzugsweise physiologisch verträglich, so dass eine Verabreichung davon an einen Säuger das normale Elektrolyt- und Flüssigkeitsvolumengleichgewicht nicht nachteilig beeinflusst. Die wässrige Lösung kann folglich beispielsweise normale physiologische Salzlösung (0,9 % NaCl, 0,15 M), pH-Wert 7-7,4 umfassen.
Nützliche Lösungen für eine orale oder parenterale Verabreichung können durch ein beliebiges im Fachgebiet der Pharmazie wohl bekanntes Verfahren hergestellt werden, die beispielsweise in "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Gennaro, A., ed., Mack Pub., 1990) beschrieben werden. Formulierungen können, beispielsweise, Polyalkylenglycole umfassen, wie beispielsweise Polyethylenglycol, Öle pflanzlichen Ursprungs, hydrierte Naphthalin und dergleichen. Formulierungen zur direkten Verabreichung können insbesondere Glycerol und andere Zusammensetzungen hoher Viskosität beinhalten. Biologisch verträgliche, vorzugsweise biologisch resorbierbare Polymere einschließlich beispielsweise Hyaluronsäure, Kollagen, Tricalciumphosphat, Polybutyrat, Polylactid, Polyglycolid und Lactid/Glycolid-Ko-Polymere können nützliche Arzneimittelträger sein, um das Morphogen-Analog in vivo kontrolliert freizusetzen.
Andere potentiell nützliche Zuführungs- beziehungsweise Abgabesysteme für die vorliegenden Analoge, können Ethylenvinylacetat-Kopolymer-Teilchen, Osmosepumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen umfassen. Formulierungen für eine Inhalationsverabreichung können als Arzneimittelträger, beispielsweise Lactose beinhalten, oder können wässrige Lösungen sein, die beispielsweise Polyoxyethylen-9-laurylether, Glycocholat oder Desoxycholat beinhalten, oder ölige Lösungen zur Verabreichung in der Form von Nasentropfen oder als ein intranasal aufzubringenden Gel.
Alternativ können die Morphogen-Analoge, einschließlich OP-1-Analogen, die wie hier beschrieben, identifiziert wurden, oral verabreicht werden. Flüssige Formulierungen von Morphogen-Analogen können, beispielsweise, gemäß von Standardverfahren, wie beispielsweise solchen in "Remington's Pharmaceutical Sciences" (supra) beschriebenen, hergestellt werden. Derartige flüssige Formulierungen können zu einem Getränk oder einer anderen Nahrungsmittelergänzung zur Verabreichung zugegeben werden. Eine orale Verabreichung kann ebenfalls unter Verwendung von Aerosolen dieser flüssigen Formulierungen erreicht werden. Alternativ können feste beziehungsweise solide Formulierungen, die unter Verwendung von im Fachgebiet anerkannten Emulgatoren hergestellt werden, in Tabletten, Kapseln oder Pastillen angefertigt werden, die zur oralen Verabreichung geeignet sind.
Wahlweise können Analoge in Zusammensetzungen formuliert sein, die Mittel zur verstärkten beziehungsweise erhöhten Aufnahme des Analogs durch das erwünschte Gewebe umfassen. Tetracyclin und Diphosphonate (Bisphosphonate) sind, beispielsweise bekannt an Knochenmaterial binden zu können, insbesondere an Zonen eines Knochenumbaus, falls sie systemisch in einem Säuger bereitgestellt werden. Dementsprechend können derartige Komponenten verwendet werden, um eine Zuführung des vorliegenden Analogs zu Knochengewebe zu erhöhen. Alternativ kann, ein Antikörper oder ein Bereich davon, der spezifisch an eine zugängliche Substanz, bindet, die mit dem erwünschten Zielgewebe spezifisch assoziiert ist, beispielsweise ein Zelloberflächenantigen, ebenfalls verwendet werden. Falls erwünscht, können derartige spezifischen Zielmoleküle an das vorliegende Analog, beispielsweise durch chemisches Vernetzen oder unter Verwendung von Standardverfahren der Gentechnik kovalent gebunden werden, um beispielsweise eine säureempfindliche Bindung, wie eine Asp-Pro-Verbindung zu erzeugen. Es können nützliche Zielmoleküle, beispielsweise gemäß den Lehren von US-5,091,513 gestaltet werden.
Es ist vorgesehen, dass ebenfalls mehrere Morphogen-Analoge die höchsten Aktivitätsgrade in vivo zeigen können, falls sie mit Trägermatrices, d.h. unlöslichen Polymermatrices kombiniert werden. Siehe beispielsweise US-P-5,266,683 . Gegenwärtig bevorzugte Trägermatrices sind in der Beschaffenheit xenogen, allogen oder autogen. Es ist jedoch vorgesehen, dass synthetische Materialien, die Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polybuttersäure, Derivate und Kopolymere davon umfassen ebenfalls verwendet werden können, um geeignete Trägermatrices zu erzeugen. Bevorzugte synthetische und natürlich abgeleitete Matrixmaterialien, deren Herstellung, der Verfahren zur deren Formulierung mit Morphogen-Analogen der Erfindung, und Verfahren zur Verabreichung sind im Stand der Technik wohl bekannt und werden somit hier nicht ausführlich ausgeführt. Siehe beispielsweise US-P-5,266,683 .
Die vorliegenden Analoge können noch weiterhin dem dafür bedürftigen Säuger entweder alleine oder in Kombination mit einer anderen Substanz verabreicht werden, die eine vorteilhafte Wirkung auf eine Morphogenese beziehungsweise Gestaltbildung von Gewebe aufweist. Beispiele derartiger Substanzen (hier Co-Faktoren) umfassen Substanzen, die die Gewebereparatur und -Regeneration fördern und/oder Entzündung hemmen. Beispiele nützlicher Co-Faktoren zum Stimulieren eines Knochenwachstums in osteoporotischen Individuen umfassen, beispielsweise, sind jedoch nicht beschränkt auf Vitamin D3, Calcitonin, Prostaglandine, Parathormon beziehungsweise Nebenschilddrüsenhormon, Dexamethason, Östrogen und IGF-I oder IGF-II. Nützliche Co-Faktoren für eine Nervengewebereparatur und -Regeneration können Nervenwachstumsfaktoren umfassen. Andere nützliche Co-Faktoren umfassen Symptom lindernde Co-Faktoren, einschließlich Antiseptika, Antibiotika, Antivirale und Anti-Pilzmittel, Analgentika und Anästhetika.
Analoge werden vorzugsweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Beimengung mit pharmazeutisch verträglichen, nicht toxischen Arzneimittelträgern und Trägern formuliert. Wie vorstehend angemerkt, können derartige Zusammensetzungen für eine systemische, beispielsweise parenterale Verabreichung, insbesondere in der Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen, für eine orale Verabreichung insbesondere in der Form von Tabletten oder Kapseln, oder intranasal, insbesondere in der Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen hergestellt werden. Wird eine Adhäsion an einer Gewebeoberfläche erwünscht, dann kann die Zusammensetzung ein Fibrinogen-Thrombin-Dispergiermittel oder ein anderes biologisches Haftmittel umfassen, wie beispielsweise eines, das in PCT US91/09275 offenbart ist, welche Offenbarung durch Bezugnahme hier aufgenommen ist. Die Zusammensetzung kann dann lackiert, gesprüht beziehungsweise besprüht oder auf andere Weise der erwünschten Gewebeoberfläche aufgebracht werden.
Die Zusammensetzungen können für eine parenterale oder orale Verabreichung an Menschen oder andere Säugertiere in therapeutisch wirksamen Mengen formuliert werden, bei spielsweise Mengen, die dem Zielgewebe geeignete Konzentrationen des Morphogen-Analogs für eine ausreichende Zeit bereitstellen, um die erwünschte Wirkung zu induzieren. Vorzugsweise lindern oder milder die vorliegenden Zusammensetzungen die Bedürftigkeit des Säugertiers nach einer Morphogen assoziierten biologischen Antwort, wie beispielsweise einer Erhaltung einer gewebespezifischen Funktion oder Wiederherstellung eines gewebespezifischen Phänotyps bei seneszenten Geweben (beispielsweise osteopenem Knochengewebe).
Es wird dem Fachmann klar sein, dass die Konzentration der Verbindungen, die in einer therapeutischen Zusammensetzung beschrieben werden, von einer Anzahl von Faktoren, einschließlich der Dosierung des zu verabreichenden Arzneimittels abhängig sein wird, den chemischen Eigenschaften (beispielsweise Hydrophobizität) der angewendeten Verbindungen und der Verabreichungsroute. Die bevorzugte Dosierung eines zu verabreichenden Arzneimittels wird ebenfalls wahrscheinlich von derartigen Variablen, wie dem Typ und dem Ausmaß einer Erkrankung, des Gewebeverlustes oder Defekts, dem gesamten Gesundheitsstatus des bestimmten Patienten abhängig sein, der relativen biologischen Wirksamkeit der gewählten Verbindung, von der Formulierung der Verbindung, der Gegenwart und dem Typ von Arzneimittelträgern in der Formulierung, und der Verabreichungsroute abhängig sein. Allgemein gesagt, können die therapeutischen Moleküle dieser Erfindung einem Individuum bereitgestellt werden, wobei gewöhnliche Dosisbereiche von ungeführ 10 ng/kg bis ungefähr 1 g/kg Körpergewicht pro Tag liegen, mit einem bevorzugten Dosisbereich von ungefähr 0,1 mg/kg bis ungeführ 100 mg/kg Körpergewicht.
IX. Beispiele
Die Praxis beziehungsweise Durchführung der Erfindung wird aus den folgenden Beispielen, die hier lediglich zu Erläuterungszwecken dargestellt werden, besser verstanden, und sollten nicht als die Erfindung in irgendeiner Weise beschränkend angesehen werden.
Beispiel 1 (vergleichend). Einfügen von Inter-Kettendisulfidbindungen zur Stabilisierung des hOP-1-Dimers (lediglich für Erläuterungszwecke)
Wie unter Abschnitt V.A. (i) ausgeführt, wird vorgesehen, dass das Einfügen von einem oder mehreren zusätzlichen Inter-Ketten-Disulfiden das hOP-1-Dimer weiterhin stabilisieren kann. Das Einfügen zusätzlicher Inter-Kettendisulfidbindungen wird hier beschrieben.
Es wird, wie in Ozkaynak et al., (1990) Supra beschrieben, ein Sma I-Bam HI-Fragment der menschlichen OP-1 cDNA, in einen Bluescript KS+ (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) kloniert, der vorher mit Eco RV und Bam HI gespalten wurde. Auf eine Transformation in E. coli, wurden die erhaltenen Kolonien durch einen Blau-Weiß Selektionsvorgang durchmustert, worin die erwünschten Kolonien, die die OP-1 cDNA beinhalten, blau waren. Der korrekte Klon kann durch Restriktionsscreening identifiziert werden, um die folgenden erwarteten Restriktionsfragmente zu erhalten.

Restriktionsenzym Fragmentgröße (bp)

Eco RI 84, 789, 3425

Xho I 161, 1223, 2914

Sac II 97, 650, 3551
Um zwei zusätzliche Inter-Ketten-Disulfidbrücken einzufügen, wird eine Doppel-Cystein-Mutante hergestellt, die die Ersetzungen von Asn 83 zu Cys und Asn 130 zu Cys beinhaltet. Die Cystein-Mutante kann durch ortsspezifisch gerichtete Mutagenese unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden und entweder PCR oder den ortsspezifisch gerichteten Mutageneseverfahren hergestellt werden, siehe beispielsweise Kunkel et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 822: 488, Kunkel et al., (1985) Meth. Enzymol. 154: 367 und US-P-4,873,192 . Keine Mutation bewirkte eine Leserahmenverschiebung und folglich zeigten E. coli, die mit Mutageneseprodukten transformiert waren und weiße Kolonien ergaben, einen Fehler in der Sequenz an. Die Anwesenheit einer geeigneten Mutation wird durch eine herkömmliche Didesoxy-Sequenzierung verifiziert.
Anschließend werden unter Verwendung geeigneter Oligonukleotide durch Oligonukleotid gerichtete Mutagenese Linker in die N- und C-Termini des Mutantengens eingefügt. Ein bevorzugter N-terminaler Linker fügt eine einzigartige Not I-Stelle ein und ein bevorzugter C-terminaler Linker fügt an dem Ende des Muteingens ein nicht zu unterdrückendes Stopp- Codon TAA, gefolgt durch eine einzigartige Bgl II-Stelle (AGATCT) ein. Jedes der erhaltenen mutierten Gene wird aus dem Klonierungsvektor durch die Restriktionsenzyme Nde I und Bgl II ausgeschnitten, isoliert, und unabhängig in einen pET-Vektor (New England Biolabs, Beverly, MA) ligiert, der vorher mit Nde I und Bam HI gespalten wurde. Die Ligationsprodukte wurden dann in E. coli transformiert und die Transformanden, die das jeweilige, individuell mutierte Protein beinhalteten und exprimierten, wurden identifiziert.
Die Expression des Doppel-Cystein beinhaltenden mutierten Analogs wird nach der Expression von T7 RNA-Polymerase (initiiert durch Infektion mit λCE6 Phagen) induziert. Während der Expression wird das mutierte Analog als Einschlusskörperchen hergestellt, die von der Zellpaste geerntet werden. Anschließend wird das mutierte Protein in 6 M Guanidin-HCl, 0,2 M Tris-HCl, pH-Wert 8,2 und 0,1 M 2-Mercaptoethanol gelöst, und das Gemisch wurde gegen 6 M Harnstoff, 2,5 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5 und 1 mM EDTA erschöpfend dialysiert. Es wurde 2-Mercaptoethanol bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M zugegeben und die Lösung wurde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde erschöpfend gegen einen Puffer dialysiert, der 2,5 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5 und 1 mM EDTA beinhaltete. Durch Affinitätschromatographie auf einer Säule, die mit auf der Oberfläche immobilisiertem OP-1-Rezeptor gepackt war, wurde gefaltetes mutiertes Protein gereinigt. Nicht gebundenes Material wurde, wie vorstehend beschrieben, durch Waschen entfernt und das spezifische am OP-1-Rezeptor bindende Material eluiert.
Nach der Reinigung wird die Stabilisierungswirkung der zusätzlichen Bindung durch Fluoreszenzpolarisation bestimmt. Die Rotations- beziehungsweise Drehrate eines Morphogen-Analogs (Muteins) und natürlichem hOP-1 werden, beispielsweise unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrometers, das für Fluoreszenzanisotropie (Photon Technology International) modifiziert ist, als eine Funktion von der Temperatur bestimmt. Es wird erwartet, dass das Mutein-Dimer eine geringere Drehungsrate bis zu einer höheren Temperatur als das natürliche hOP-1 zeigen wird, wodurch angezeigt wird, dass das Mutein-Dimer wie ein Dimer bleibt und bis zu einer höheren Temperatur stabiler als das Wild-Typ-Protein ist.
Die biologische Aktivität des erhaltenen mutierten Proteins oder Muteins kann unter Verwendung beliebiger Bioassays, die bis heute zur Bestimmung der biologischen Aktivität entwickelt wurden, getestet werden. Verschiedene derartiger beispielhafter Assays werden nachfolgend beschrieben. Die folgenden Assays werden zur Erleichterung eines Testens dargestellt. Spezifische in vivo Assays zum Testen der Wirksamkeit eines morphogenen Proteins oder Analogs in einer Anwendung zum Reparieren oder Regenerieren geschädigten Knochen-, Leber-, Nieren-, oder Nervengewebes, peridontalen Gewebes, einschließlich Cementum und/oder peridontalem Ligament, gastrointestinalen und renalen Geweben, und durch Immunzellen vermittelte Gewebeschädigungen, werden in den öffentlich verfügbaren Dokumenten, wie beispielsweise EP 0 575 555 , WO93/04692 , WO93/05751 , WO/06399 , WO94/03200 ; WO94/06449 und WO94/06420 . Der Fachmann kann ein Analog mit einem beliebigen dieser Assays ohne übermäßiges Experimentieren testen.
A. Mitogene Wirkung auf Osteoblasten von Ratten und Menschen
Das folgende Beispiel stellt einen gewöhnlichen Assay dar, der beim Bestimmen nützlich ist, ob ein OP-1-Morphogen-Analog in vitro eine Vermehrung von Osteoblasten induziert. Es wird beabsichtigt, dass in diesem und allen anderen Beispielen Osteoblastenkulturen verwendet werden, wobei vorzugsweise angereicherte primäre Kulturen von Osteoblasten der Ratte verwendet werden. Obwohl diese Kulturen dahingehend heterogen sind, dass sich die einzelnen Zellen auf unterschiedlichen Differenzierungsstadien befinden, wird angenommen, dass die Kultur den Metabolismus und die Funktion von Osteoblasten in vivo akkurater widerspiegeln als Osteoblastenkulturen, die von etablierten Zelllinien erhalten wurden. Wenn nicht anderweitig angezeigt, sind alle angegebenen Chemikalien standardisierte, im Handel erhältliche Reagenzien, die von einer Vielzahl von Quellen einschließlich Sigma Chemicals, Co., St. Louis, Calbiochem, Corp., San Diego und Aldrich Chemicals Co., Milwaukee einfach erhalten werden.
Kurz, angereicherte primäre Osteoblastenkulturen von der Ratte wurden durch einen aufeinanderfolgenden Kollagenaseverdau von Calvaria von neugeborenen Ratten (beispielsweise von 1-2 Tage alten Tieren, Long-Evans-Stamm, Charles River Laborstories, Wilmington, MA) Standardverfahren folgend, erhalten, wie beispielsweise Wong et al., (1975) Proc Natl. Acad. Sci. USA 72:3167-3171. Einzelzellsuspensionen von Rattenosteoblasten wurden dann auf einer Mehrfach-Lochplatte (beispielsweise einer 24-Lochplatte mit einer Konzentration von 50.000 Osteoblasten pro Loch) in Alpha MEM (modifiziertem Eagle's Medium, Gibco, Inc., N.Y.) ausplattiert, das 10 % FBS (fötales Rinderserum), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin beinhaltete. Die Zellen wurden für 24 Stunden bei 37°C inkubiert, zu welchem Zeitpunkt das Wachstumsmedium durch Alpha MEM ersetzt wurde, das 1 % FBS beinhaltete und die Zellen wurden für weitere 24 Stunden inkubiert, so dass sich die Zellen zum Zeitpunkt des Experiments in von Serum entzogenem Wachstumsmedium befanden.
Die kultivierten Zellen wurden in vier Gruppen aufgeteilt: 1) Löcher, die beispielsweise 0,1, 1,0, 10,0, 40,0 und 80,0 ng des Op-1 Morphogen-Analogs (Muteins) erhielten, (2) Löcher, die 0,1, 1,0, 10,0 und 40,0 ng von Wildtyp OP-1 erhielten, (3) Löcher, die 0,1, 1,0, 10,0 und 40,0 ng von TGF-β erhielten und (4) die Kontrollgruppe, die keine Wachstumsfaktoren erhielt. Die Zellen wurden dann für weitere 18 Stunden inkubiert, wonach die Löcher mit 2 mCi/Loch mit ³H-Thymidin gepulst und für weitere sechs Stunden inkubiert wurden. Die überschüssige Markierung wurde dann mit einer kalten Lösung von 0,15 M NaCl weggewaschen, wobei dann jedem Loch 250 μl einer 10 % Trichloressigsäure zugegeben wurde, und die Löcher wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal mit kaltem destilliertem Wasser gewaschen, und durch Zugabe von 250 μl einer 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) -Lösung für einen Zeitraum von 30 Minuten bei 37°C lysiert. Das erhaltene Zelllysat wurde unter Verwendung eines Standardmittels geerntet und der ³H-Thymdin-Einbau in zelluläre DNA wurde durch Flüssig-Scintillation als eine Anzeige der mitogenen Aktivität der Zellen bestimmt. Bei dem Experiment wird beabsichtigt, dass das OP-1-Morphogen-Analog-Konstrukt (Mutein), ähnlich wie natürliches OP-1, den ³H-Thyidin-Einbau in DNA stimulieren wird, wobei dadurch die Zellvermehrung von Osteoblasten gefördert wird. Dagegen wird erwartet, dass die Wirkung von TGF-β vorübergehend ist und bi-phasisch verläuft. Weiterhin wird erwartet, dass bei höheren Konzentrationen TGF-β keine signifikante Wirkung auf die Zellvermehrung von Osteoblasten aufweisen wird.
Die in vitro Wirkung eines OP-1-Morphogen-Analogs auf die Vermehrung von Osteoblasten kann ebenfalls unter Verwendung von primären Osteoblasten des Menschen (erhalten aus Knochengewebe eines normalen erwachsenen Patienten und wie vorstehend beschrieben, präpariert werden) und an von einem Osteosarkom abgeleiteten Zelllinie bewertet werden.
B. Stimulation von Vorläuferzellen
Das folgende Beispiel wurde entwickelt, um die Fähigkeit von OP-1-Morphogen-Analogen zu zeigen, die die Vermehrung von mesenchymalen Vorläuferzellen stimulieren werden. Nützliche naive Stammzellen umfassen pluripotente Stammzellen, die aus dem Knochenmark oder dem Nabelschnurblut unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (siehe beispielsweise Fardji et al., Vox Sang 55 (3) 133-138 oder Broxmeyer et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 86:3828-3832) isoliert werden können, als auch naiven Stammzellen, die aus dem Blut erhalten werden. Alternativ können embryonale Zellen (beispielsweise von einer kultivierten mesodermalen Zelllinie) verwendet werden.
Ein anderes Verfahren, um Vorläuferzellen zu erhalten und zum Bestimmen der Fähigkeit von OP-1 Morphogen-Analogen die Zellvermehrung zu stimulieren, besteht darin, Vorläuferzellen von einer in vivo Quelle einzufangen. Beispielsweise kann ein biologisch verträgliches Matrixmaterial, das den Influx migratorischer beziehungsweise wandernder Vorläuferzellen ermöglichen kann, an einer in vivo Stelle lange genug implantiert sein, um den Influx von wandernden Vorläuferzellen zu gestatten. Beispielsweise kann eine vom Knochen abgeleitete, Guanidin extrahierte Matrix, die wie beispielsweise im Sampath et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6591-6595 oder US-P-4,975,526 offenbart, formuliert ist, in eine Ratte, im Wesentlichen dem Verfahren von Sampath et al., folgend, an einer subkutanen Stelle implantiert werden. Nach drei Tagen wird das Implantat entfernt und die mit der Matrix assoziierten Vorläuferzellen werden dispergiert und kultiviert.
Die erhaltenen Vorläuferzellen werden jedoch dann in vitro mit dem Test OP-1 Morphogen-Analog unter Standardzellkulturbedingungen, beispielsweise jenen nachfolgend beschriebenen, inkubiert. In der Abwesenheit externer Stimuli, vermehren sich die Vorläuferzellen selbst nicht oder in Kultur lediglich minimal.
Vorläuferzellen, die jedoch in der Anwesenheit eines biologisch aktiven OP-1-Morphogen- Analogs, ähnlich OP-1, kultiviert werden, werden sich vermehren. Das Zellwachstum kann optisch oder spektrophotometrisch unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren bestimmt werden.
C. Durch Morphogen induzierte Zelldifferenzierung
Ebenfalls können zahlreiche Assays verwendet werden, um eine auf OP-1 basierendem Morphogen-Analog induzierte zelluläre Differenzierung zu bestimmen.
(1) Differenzierung eines embryonalen Mesenchyms
Wie bei natürlichem OP-1 ist vorgesehen, dass das OP-1 Morphogen-Analog (Mutein) die Zelldifferenzierung induzieren kann. Die Fähigkeit von Morphogen-Analogen die Zelldifferenzierung zu induzieren, kann durch Kultivieren früher mesenchymaler Zellen in der Anwesenheit von OP-1 Morphogen-Analog gezeigt werden, wobei anschließend die Histologie der kultivierten Zellen durch Färbung mit Toluidin-Blau unter Verwendung von Standard-Zellkultur- und Zellfarbungsverfahren, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, untersucht wird. Es ist bekannt, dass beispielsweise Mesenchymzellen der Ratte, die dazu bestimmt sind Manibular-Knochen zu werden nicht fortfahren zu differenzieren, falls sie von den darüber liegenden Epithelzellen an Stufe 11 getrennt werden und in vitro unter Standard Gewebekulturbedingungen, beispielsweise in einem chemisch definierten, Serumfreien Medium kultiviert werden, das beispielsweise 67 % DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium), 22 % F-12 Medium, 10 mM Hepes pH-Wert 7, 2 mM Glutamin, 50 mg/ml Transferrin, 25 mg/ml Insulin, Spurenelemente, 2 mg/ml Rinderserumalbumin, das an Oleinsäure gekoppelt ist, mit HAT (0,1 M Hypoxanthin, 10 mM Aminopterin, 12 mM Thymidin) beinhaltet. Werden diese gleichen Zelle jedoch im Kontakt mit dem darüber liegenden Endoderm für einen zusätzlichen Tag belassen, zu welchem Zeitpunkt sie Stufe 12 Zellen werden, dann werden sie in vitro selbst fortfahren zu differenzieren, um Chondrozyten zu bilden. Eine weitere Differenzierung in Osteoblasten und schließlich in Mandibular-Zellen erfordert eine geeignete lokale Umgebung, beispielsweise eine vaskularisierte Umgebung.
Es wird erwartet, dass, wie bei natürlichem OP-1 Stufe 11-Mesenchymzellen, die in vitro in der Anwesenheit von OP-1 Morphogen-Analog (Mutein), mit beispielsweise 10-100 ng/ml kultiviert werden, fortfahren werden sich in vitro zu differenzieren, um Chondrozyten zu bilden, gerade wie sie fortfahren in vitro zu differenzieren, falls sie mit den Zellprodukten kultiviert werden, die von der darüber liegenden endodermalen Zellen geerntet werden. Dieses Experiment kann mit unterschiedlichen mesenchymalen Zellen ausgeführt werden, um die Zelldifferenzierungsfähigkeit von OP-1 Morphogen-Analog in unterschiedlichen Geweben zu zeigen.
Ein anderes Beispiel einer durch ein Morphogen induzierten Zelldifferenzierung kann die Fähigkeit von OP-1 Morphogen-Analogen die Osteoblastendifferenzierung in vitro zu induzieren zeigen, indem primäre Osteoblastenkulturen oder Osteoblasten ähnliche Zelllinien verwendet werden, und wobei auf zahlreiche Knochenzellmarker getestet wird, die für den differenzierten Osteoblastentyp spezifische Marker darstellen, beispielsweise alkalische Phosphataseaktivität, Parathormon vermittelte zyklische AMP (cAMP)-Produktion, Osteocalcinsynthese und erhöhte Mineralisierungsraten.
(2) Induktion einer alkalischen Phosphataseaktivität in Osteoblasten
Es werden in Serum-freiem Medium kultivierte Osteoblasten in einem Konzentrationsbereich von OP-1 Morphogen-Analog, beispielsweise 0,1, 1,0, 10,0, 40,0 oder 80,0 ng OP-1 Morphogen-Analog/ml Medium inkubiert, oder mit einem ähnlichen Konzentrationsbereich von natürlichem OP-1 oder TGF-β. Nach 72 Stunden einer Inkubation wurde die Zellschicht mit 0,5 ml einer 1 %Triton X-100-Lösung extrahiert. Das erhaltene Zellextrakt wird zentrifugiert und 100 ml des Extrakts werden zu 90 ml von Para-Nitrophenylphosphat (PNPP)/Glyceringemisch zugegeben und für 30 Minuten in einem 37°C Wasserbad inkubiert, wobei die Reaktion mit 100 ml NaOH gestoppt wurde. Die Proben durchlaufen dann ein Plattenlesegerät (beispielsweise Dynatech MR700-Plattenlesegerät, wobei die Absorption bei 400 nm unter Verwendung von p-Nitrophenol als Standard erfasst wurde), um die Anwesenheit und Menge von alkalischer Phosphataseaktivität zu bestimmen. Die Proteinkonzentrationen werden durch die Bio-Rad-Methode bestimmt. Die alkalische Phosphataseaktivität wird in Einheiten/mg Protein berechnet, wobei 1 Einheit = 1 nmol p-Nitrophenol pro 30 Minuten bei 37°C freisetzt.
Es wird vorgesehen, dass das OP-1 Morphogen-Analog, ähnlich zu natürlichem OP-1, die Produktion von alkalischer Phosphatase in Osteoblasten stimulieren wird, wodurch das Wachstum und die Expression des differenzierten Phänotyps der Osteoblasten gefördert wird. Der Langzeiteffekt von OP-1 Morphogen-Analog auf die Produktion von alkalischer Phosphatase durch Osteoblasten der Ratte kann wie folgt gezeigt werden.
Es werden Rattenosteoblasten präpariert und, wie vorstehend beschrieben in Mehrfachloch-Platten kultiviert. In diesem Beispiel werden sechs Sätze von 24 Lochplatten mit 50.000 Rattenosteoblasten pro Loch ausplattiert. Die Löcher in jeder Platte, präpariert wie vorstehend beschrieben, werden dann in drei Gruppen ausgeteilt: (1) solche die beispielsweise 1 ng von OP-1 Morphogen-Analog pro ml Medium erhalten, (2) solche die 40 ng von OP-1 Morphogen-Analog pro ml Medium erhalten und (3) solche die 80 ng von OP-1 Morphogen-Analog pro ml Medium erhalten. Jede Platte wird dann für unterschiedliche Zeiten: 0 Stunden (Kontrollzeit), 24 Stunden, 48 Stunden, 96 Stunden, 120 Stunden und 144 Stunden inkubiert. Nach jeder Inkubationsperiode wurde die Zellschicht mit 0,5 ml einer 1 % Triton-X-100-Lösung extrahiert. Der so erhaltene Zellextrakt wird zentrifugiert und die alkalische Phosphataseaktivität wird unter Verwendung von para-Nitrosophenylphosphate (PNPP), wie vorstehend bestimmt. Es wird vorgesehen, dass OP-1 Morphogen-Analog, ähnlich wie natürliches OP-1, die Produktion von alkalischer Phosphatase in Osteoblasten in einer Dosis abhängigen Weise so stimuliert, dass ansteigende Dosen von OP-1 Morphogen-Analog den Spiegel einer alkalischen Phosphataseproduktion weiterhin erhöhen wird. Außerdem wird vorgesehen, dass die durch OP-1 Morphogen-Analog stimulierten erhöhten Spiegel von alkalischer Phosphatase in den behandelten Osteoblasten für eine ausgedehnte Zeitperiode anhalten werden.
(3) Induktion von PTH vermitteltem cAMP
Dieses Experiment ist so gestaltet, um die Wirkung von OP-1 Morphogen-Analog auf die von Parathormon vermittelte cAMP-Produktion in vitro in Rattenosteoblasten zu testen. Kurz, Rattenosteoblasten werden präpariert und wie, vorstehend beschrieben in einer Mehrfach-Lochplatte kultiviert. Die kultivierten Zellen werden dann in vier Gruppen aufgeteilt: (1) Löcher, die beispielsweise 1,0, 10,0 und 40,0 ng OP-1Morphogen-Analog/ml Medium erhalten, (2) Löcher, die beispielsweise natürliches OP-1 mit gleichen Konzentrationsbereichen erhalten, (3) Löcher, die beispielsweise TGF-β mit gleichen Konzentrationsbereichen erhalten, und (4) eine Kontrollgruppe, die keine Wachstumsfaktoren erhält. Die Platte wird dann für weitere 72 Stunden inkubiert. Am Ende der 72 Stunden werden die Zellen für 20 Minuten mit Medium behandelt, das 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin beinhaltet, gefolgt durch die Zugabe für 10 Minuten von menschlichem rekombinantem Parathormon (hPTH), Sigma, St. Louis) in die Hälfte der Löcher mit einer Konzentration von 200 ng/ml. Die Zellschicht von jedem Loch wird dann mit 0,5 ml einer Triton-X-100-Lösung extrahiert. Die Spiegel von cAMP werden dann unter Verwendung eines Radioimmunassay-Kits (beispielsweise Amersham, Arlington Heights, Illinois) bestimmt. Es ist vorgesehen, dass OP-1 Morphogen-Analog alleine, ähnlich wie OP-1 eine Zunahme in der durch PTH vermittelten cAMP-Antwort stimulieren wird, wodurch das Wachstum und die Expression des differenzierten Phänotyps der Osteoblasten gefördert wird.
(4) Induktion einer Osteocalcinbildung
Osteocalcin ist ein Knochen-spezifisches Protein, das durch Osteoblasten synthetisiert wird, das in vivo bei der Rate in der Knochenmineralisierung eine wesentliche Rolle spielt. Zirkulierende Serumspiegel von Osteocalcin werden als ein Marker für die Osteoblastenaktivität und die Knochenbildung in vivo verwendet. Die Induktion einer Osteocalcinbildung kann in angereicherten Osteoblastenkulturen verwendet werden, um eine Wirksamkeit von OP-1 Morphogen-Analog in vitro zu zeigen.
Rattenosteoblasten werden präpariert und, wie vorstehen beschrieben, in einer Mehrfach-Lochplatte kultiviert. In diesem Experiment wird das Medium mit 10 % FBS ergänzt und an Tag 2 werden die Zellen mit frischem Medium gefüttert, das mit frischem 10 mM β-Glycerophosphat (Sigma, Inc.,) ergänzt ist. Beginnend an Tag 5 und danach zweimal wöchentlich wurden Zellen mit einem kompletten Mineralisations-Medium gefüttert, das alle vorstehenden Komponenten plus L(+)-Ascorbat mit einer Endkonzentration von 50 mg/ml Medium beinhaltete. OP-1 Morphogen-Analog wird dann zu den Löchern unmittelbar, beispielsweise, in 50 % Acetonitril (oder 50 % Ethanol) zugegeben, das mit mehr als 5 ml Morphogen-Analog/ml Medium 0,1 Trifluoressigsäure (TFA) beinhaltet. Kontrolllöcher erhielten lediglich Lösungsmittelvehikel. Die Zellen wurden dann erneut gefüttert und die konditionierte Mediumprobe wurde 1:1 in Standardpuffer eines Radioimmunoassays verdünnt, der standardisierte Proteasehemmstoffe beinhaltete und bei –20°C gelagert wurde bis er auf Osteocalcin gestestet wurde. Eine Osteocalcinsynthese wird durch einen Standard-Radioimmunoassay erfasst, bei dem ein im Handel erhältlicher Osteocalcin spezifischer Antikörper verwendet wird.
Die Mineralisation wird an Langzeitkulturen (13 Tag) unter Verwendung einer modifizierten von Kossa-Färbetechnik an fixierten Zellschichten bestimmt: Die Zellen werden in frischem 4 % Paraformaldehyd bei 23°C für 10 Mm. fixiert, gefolgt von einer Spülung mit kalten 0,9 % NaCl. Die fixierten Zellen werden dann für die endogene alkalische Phosphatase bei pH-Wert 9,5 für 10 Min. unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (Sigma, Inc.,) gefärbt. Violett gefärbte Zellen werden anschließend mit Methanol dehydriert und luftgetrocknet. Nach 30 Min. Inkubation in 3 % AgNO₃ in der Dunkelheit, werden die Proben mit H₂O gespült und für 30 Sek. 254 nm UV-Licht exponiert, um die schwarzen silbergefärbten Phosphatknötchen zu entwickeln. Es wurden individuell mineralisierte Fokusse (mindestens 200 mm in der Größe) unter einem Präpariermikroskop gezählt und als Knötchen/Kultur ausgedrückt.
Es ist vorgesehen, das OP-1 Morphogen-Analog, ähnlich zu natürlichem OP-1, eine Osteocalcinsynthese in Osteoblastenkulturen stimulieren wird. Weiterhin wird vorgesehen, dass die erhöhte Osteocalcinsynthese als Antwort auf ein OP-1 Morphogen-Analog dosisabhängig sein wird, wodurch eine wesentliche Zunahme über den basalen Spiegel nach 13 Tagen Inkubation gezeigt wird. Eine verstärkte Osteocalcinsynthese kann ebenfalls durch Erfassen der erhöhten Osteocalcin mRNA Botschaft (20-facher Anstieg) unter Verwendung einer spezifischen Sonde von Ratten-Osteocalcin bestätigt werden. Außerdem entspricht, wie durch die Erscheinungsform mineralisierter Knötchen bestimmt wurde, der Anstieg der Osteocalcinsynthese der erhöhten Mineralisation in Langzeitkulturen von Osteoblasten. Es ist ebenfalls vorgesehen, dass OP-1 Morphogen-Analog, ähnlich wie natürliches OP-1, verglichen zu unbehandelten Kontrollen die anfängliche Mineralisationsrate wesentlich erhöhen wird.
(5) Morphogen induzierte CAM-Expression
Die Mitglieder der BMP/OP-Familie (siehe 6) induzieren eine Expression von CAM, insbesondere als Teil von deren Morphogenese eine N-CAM-Expression (siehe gleichzeitig anhängige U.S.S.N. 922,813). CAMs sind morphoregulatorische Moleküle, die in allen Geweben als ein wesentlicher Schritt in der Gewebeentwicklung identifiziert wurden. N-CAMs, die mindestens 3 Isoformen (N-CAM-180, N-CAM-140 und N-CAM-120, worin "180", "140" und "120" das offenbare Molekulargewicht der Isoformen anzeigt, das durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ermittelt wurde) umfassen, werden zumindest vorübergehend in sich entwickelnden Geweben und dauerhaft im Nervengewebe exprimiert. Sowohl N-CAM-180 als auch N-CAM-140 Isoformen werden in sowohl sich entwickelndem als auch erwachsenem Gewebe exprimiert. Die N-CAM-120-Isoform wird lediglich in erwachsenem Gewebe aufgefunden. Ein anderes neurales CAM ist L1.
Die Fähigkeit von auf OP-1 basierenden Morphogen-Analogen die CAM-Expression zu stimulieren, kann unter Verwendung des folgenden Protokolls unter Verwendung von NG108-15-Zellen gezeigt werden. NG108-15 ist eine transformierte Hybridzelllinie (Neuroblastom x Gliom, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD), die eine Morphologie zeigt, die transformierten embryonalen Neuronen charakteristisch ist. Wie in Beispiel D nachfolgend beschrieben wird, zeigen unbehandelte NG108-15 Zellen eine Fibroblasten- oder minimal differenzierte Morphologie und exprimieren lediglich die 180 und 140 Isoformen von N-CAM, die normaler Weise mit einer sich entwickelnden Zelle assoziiert sind. Folgend auf eine Behandlung mit Mitgliedern der vg/dpp-Untergruppe zeigten diese Zellen eine Morphologie, die erwachsenen Neuronen charakteristisch ist und erhöhte Spiegel von allen drei N-CAM Isoformen exprimieren.
In diesem Beispiel werden die NG108-15 Zellen mr 4 Tage in der Anwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von entweder OP-1 Morphogen-Analog oder natürlichem OP-1 unter Verwendung von standardisierten Kulturverfahren kultiviert, und Standard-Western-Blots wurden für die gesamten Zellextrakten ausgeführt. Die N-CAM Isoformen werden mit einem Antikörper, mAb H28.123, der von Sigma Chemicals Co., St. Louis erhältlich ist, der mit allen drei Isoformen kreuzreagiert, erfasst, wobei die unterschiedlichen Isoformen durch deren unterschiedlichen Mobilitäten auf einem Elektrophoresegel unterschieden werden. Kontroll-NG108-15 Zellen (unbehandelt) exprimieren sowohl die 140 kDa und die 180 kDA Isoformen, jedoch, wie durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung von bis zu 100 mg Protein bestimmt wurde, nicht die 120 kDa. Es ist vorgesehen, dass die Behandlung von NG108-15-Zellen mit OP-1 Morphogen-Analog, ähnlich natürlichem OP-1, zu einem dosisabhängigen Anstieg bei der Expression der 180 kDa und 140 kDa Isoformen, als auch der Induktion der 120 kDA Isoform fahren kann. Zusätzlich wird vorgesehen, dass die durch OP-1 Morphogen-Analog, ähnlich natürlichem OP-1 induzierte CAM-Expression mit der durch Histologie bestimmten Zellaggregation korreliert werden kann.
(D) Durch OP-1 Morphogen-Analog induzierte Entdifferenzierung eines transformierten Phänotyps
Es ist vorgesehen, dass das OP-1 Morphogen-Analog, ähnlich zu natürlichem OP-1, ebenfalls eine Re- beziehungsweise Entdifferenzierung von transformierten Zellen auf eine Morphologie induziert, die für nicht transformierte Zellen charakteristisch ist. Die unten bereitgestellten Beispiele beschreiben eine durch Morphogen induzierte Entdifferenzierung einer transformierten menschlichen Zelllinie von neuronalem Ursprung (NG108-15), als auch von Neuroblastomzellen (NIE-115) der Maus und embryonalen Carcinomzellen des Menschen auf eine nicht transformierten Zellen charakteristische Morphologie.
Wie vorstehend beschrieben, ist NG108-15 eine transformierte Hydribzelllinie, die durch Fusion von Neuroblastom- x Gliomzellen (erhalten von ATCC, Rockville, MD) erzeugt wurde, und eine Morphologie zeigt, die transformierten embryonalen Neuronen charakteristisch ist, beispielsweise eine Fibroblastenmorphologie aufweisen. Insbesondere, weisen die Zellen polygonale Zellkörper auf, kurze, dornähnliche Ausläufer beziehungsweise Fortsätze und machen mehrere Kontakte zu benachbarten Zellen. Eine Inkubation von NG108-15 Zellen, die in einem chemisch definierten Serum-freien Medium mit 0,1 bis 300 ng/ml eines Morphogen-Analogs oder natürlichem OP-1 für vier Stunden kultiviert werden, induzieren eine geordnete, dosisabhängige Änderung in der Zellmorphologie.
Beispielsweise werden NG108-15 Zellen auf mit Polylysin beschichteten 6-Lochplatten subkultiviert. Jedes Loch beinhaltet 40-50.000 Zellen in 2,5 ml eines chemisch definierten Mediums. Am dritten Tag werden 2,5 ml eines OP-1 Morphogen-Analogs oder natürlichem OP-1 in 60 % Ethanol, beinhaltend 0,025 % Trichloressigsäure jedem Loch zugegeben. Das Medium wird täglich mit neuen Aliquots von Morphogen gewechselt. Es ist vorgesehen, dass OP-1 Morphogen-Analog, ähnlich OP-1, eine dosisabhängige Entdifferenzierung der transformierten Zellen, einschließlich einer Rundung des Somas, einem Anstieg in der Phasen-Helligkeit, Erweiterung der kurzen Neuritfortsätze und anderen signifikanten Änderungen in der zellulären Ultrastruktur induzieren kann. Nach mehreren Tagen ist ebenfalls vorgesehen, dass behandelte Zellen beginnen können epitheloide Lagen beziehungsweise Schichten zu bilden, die, wie durch optische Inspektion mit dem Mikroskop bestimmt, dann in hohem Maße gepackte, mehrfach geschichtete Aggregate werden.
Außerdem wird vorgesehen, dass die Entdifferenzierung ohne irgendwelche assoziierten Änderungen in der DNA-Synthese, Zellteilung, oder Zelllebensfähigkeit beziehungsweise -Viabilität vorkommen kann, was es unwahrscheinlich macht, dass die morphologischen Änderungen zu der Zelldifferenzierung sekundär sind oder eine toxische Wirkung des Morphogens darstellen. Zusätzlich wird vorgesehen, dass die durch das Morphogen-Analog induzierte Entdifferenzierung nicht die Zellteilung hemmt, wie durch ³H-Thymidinaufnahme bestimmt wurde, unähnlich anderen Molekülen wie Butyrat, DMSO, Retinolsäure oder Forskolin, von denen gezeigt wurde, das sie die Differenzierung von transformierten Zellen in analogen Experimenten stimulierten. Folglich wird vorgesehen, dass das OP-1 Morphogen-Analog, ähnlich zu natürlichem OP-1, die Zellstabilität und -viabilität nach Induktion einer Entdifferenzierung aufrechterhalten kann.
Das hier beschriebene Morphogen würde folglich nützliche therapeutische Mittel zur Behandlung von Neoplasien und neoplastischen Läsionen des Nervensystems bereitstellen, insbesondere bei der Behandlung von Neuroblastomen, einschließlich Retinoblastomen und Gliomen.
E. Erhaltung des Phänotyps
OP-1 Morphogen-Analoge, ähnlich natürlichem OP-1, können verwendet werden, um einen differenzierten Phänotyp einer Zelle aufrechtzuerhalten. Diese Anwendung ist besonders nützlich, um die fortdauernde Expression eines Phänotyps in seneszenten oder ruhenden Zellen zu induzieren.
(1) In vitro Model für eine phänotypische Erhaltung
Die Fähigkeit von Morphogenen den Phänotyp zu erhalten, ist einfach zu bestimmen. Eine Anzahl von differenzierten Zellen wird nach mehreren Passagen in vitro unter Standard-Gewebebedingungen seneszent oder ruhend, wie im Stand der Technik (beispielsweise Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, C.R. Freshney, ed., Wiley 1987) beschrieben. Falls diese Zellen jedoch in vitro in Assoziation mit einem Morphogen, wie OP-1, kultiviert werden, dann werden die Zellen dazu stimuliert die Expression von deren Phänotyp durch mehrere Passagen zu erhalten. Die alkalische Phosphataseaktivität von kultivierten Osteoblasten, wie beispielsweise kultivierten Osteosarkomzellen und Calvaria-Zellen, ist beispielsweise nach mehreren Passagen in vitro verringert. Falls die Zellen jedoch in der Anwesenheit von OP-1 kultiviert werden, dann wird die alkalische Phosphataseaktivität über ausgedehnte Zeitspannen erhalten. In ähnlicher Weise wird ebenfalls die phänotypische Expression von Myozyten in der Anwesenheit eines Morphogens erhalten. In dem Experiment werden, wie in Beispiel A beschrieben, Osteoblasten kultiviert. Die Zellen werden in Gruppen aufgeteilt, mit verschiednen Konzentrationen von entweder OP-1 Morphogen-Analog oder natürlichem OP-1 (beispielsweise 0-300 ng/ml) inkubiert und mehrere Male (beispielsweise 3-5-mal) unter Verwendung von Standardverfahren passagiert. Die passagierten Zellen werden dann, wie in Beispiel C beschrieben, als ein Anzeichen einer differenzierten metabolischen Zellfunktion auf alkalische Phosphataseaktivität getestet. Es ist vorgesehen, dass in der Abwesenheit von OP-1 Morphogen-Analog kultivierte Osteoblasten verglichen zu mit OP-1 Morphogen-Analog oder mit natürlichem OP-1 behandelten Zellen eine verringerte alkalische Phosphataseaktivität aufweisen können.
(2) In Vivo-Modell einer phänotypische Erhaltung
Die Fähigkeit der phänotypischen Erhaltung kann ebenfalls unter Verwendung eines standardisierten Rattenmodells für Osteoporose in vivo gezeigt werden. Weibliche Long Evans Ratten (Charles River Laborstories, Wilmington, MA) wurden scheinoperiert oder unter Verwendung chirurgischer Verfahren die Eierstöcke entfernt, um einen osteoporotischen Zustand zu erzeugen, der von einer verringerten Östrogenproduktion herrührt. Nach dem chirurgischen Eingriff, beispielsweise 200 Tage nach der Entfernung der Eierstöcke, wird den Ratten systemisch Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) oder Morphogen (beispielsweise OP-1 Morphogen-Analog oder natürliches OP-1, 1-100 mg) für 21 Tage (beispielsweise durch tägliche Injektion in die Schwanzvene) bereitgestellt. Die Ratten wurden dann geopfert und die Serumspiegel der alkalischen Phosphatase, die Serumspiegel von Calcium und die Serumspiegel von Osteocalcin wurden unter Verwendung von darin und vorstehend beschriebenen Standardverfahren bestimmt. Es ist vorgesehen, dass die mit OP-1 Morphogen-Analog behandelten Ratten, ähnlich wie die mit OP-1 behandelten Ratten erhöhte Spiegel von Osteocalcin und alkalischer Phosphataseaktivität zeigen können. Es ist vorgesehen, dass ebenfalls eine Histomorphometrieanalyse an dem Schienbeinknochen in mit OP-1 Morphogen-Analog behandelten Tieren verglichen mit unbehandelten, Eierstock entfernten Ratten, eine verbesserte Knochenmasse zeigen können.
F. Vermehrung von Vorläuferzell-Populationen
Vorläuferzellen können stimuliert werden, um sich in vivo oder ex vivo zu vermehren. Es ist vorgesehen, dass Zellen in vivo durch Injektion stimuliert werden können oder auf andere Weise, die eine sterile Präparation, die das OP-1 Morphogen-Analog beinhaltet, in dem Individuum bereitstellt. Beispielsweise kann die hämatopoietische pluripotente Stammzellpopulation in einem Individuum durch Injektion dazu stimuliert werden sich zu vermehren oder auf eine andere Weise, die dem Knochenmark des Individuums eine geeignete Konzentration von OP-1 Morphogen-Analog bereitstellt.
Vorläuferzellen können ex vivo durch Inkontaktbringen von der zu erweiternden Population der Vorläuferzellen mit einem aktiven OP-1 Morphogen-Analog unter sterilen Bedingungen bei einer Konzentration und für eine Zeit, die geeignet ist die Vermehrung der Zellen zu stimulieren. Geeignete Konzentrationen und Stimulationszeiten können empirisch bestimmt werden, wobei im Wesentlichen dem vorstehend in Beispiel A beschriebenen Verfahren gefolgt wird. Es ist vorgesehen, dass eine Konzentration eines OP-1 Morphogen-Analogs zwischen ungefähr 0,1-100 ng/ml und eine Stimulationsperiode von ungefähr 10 Minuten bis ungefähr 72 Stunden, oder mehr beträgt, wobei allgemein ungefähr 24 Stunden gewöhnlich ausreichend sein sollten, um eine Zellpopulation von ungefähr 10⁴ bis 10⁶ Zellen zu stimulieren. Die stimulierten Zellen können anschließend dem Individuum, wie zum Beispiel durch Injektion der Zellen, an einem geeigneten in vivo Locus bereitgestellt werden. Geeignete biologisch verträgliche Vorläuferzellen können durch ein beliebiges der im Stand der Technik oder hier vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten werden.
G. Regeneration von geschädigtem oder erkranktem Gewebe
Es ist vorgesehen, dass die OP-1 Morphogen-Analoge dazu verwendet werden können, um erkranktes oder geschädigtes Säugetiergewebe zu reparieren. Das zu reparierende Gewebe wird vorzugsweise zuerst beurteilt, wobei übermäßig nekrotisches oder beeinträchtigendes beziehungsweise störendes Narbengewebe, wie erforderlich, beispielsweise durch Ablation beziehungsweise Entfernung oder durch chirurgische, chemische oder andere auf dem medizinischen Fachgebiet bekannten Verfahren, entfernt wird.
Ein OP-1 Morphogen-Analog kann dann dem Gewebelocus als Teil einer sterilen, biologisch verträglichen Zusammensetzung, entweder durch chirurgische Implantation oder Injektion unmittelbar bereitgestellt werden. Das Morphogen-Analog kann ebenfalls systemisch, durch orale oder parenterale Verabreichung bereitgestellt werden. Alternativ kann dem Gewebe eine sterile, biologisch verträgliche Zusammensetzung bereitgestellt werden, die Vorläuferzellen beinhaltet, die durch morphogenetisch aktives OP-1 Morphogen-Analog stimuliert wurden. Das an dem Locus vorhandene Gewebe, ob erkrankt oder beschädigt, stellt eine geeignete Matrix bereit, um die Vermehrung und gewebespezifische Differenzierung von Vorläuferzellen zu ermöglichen. Außerdem stellt ein geschädigter oder erkrankter Gewebelocus, insbesondere, einer der durch chirurgische Mittel weiter angegriffen wurde, eine morphogenetisch permissive Umgebung bereit. Eine systemische Bereitstellung eines OP-1 Morphogen-Analogs kann für bestimmte Anwendungen (beispielsweise bei der Behandlung von Osteoporose und anderen Erkrankungen des Umgestaltungszyklus des Knochens) ausreichend sein.
Unter bestimmten Umständen, insbesondere, bei denen eine Gewebeschädigung großflächig beziehungsweise ausgedehnt ist, kann das Gewebe nicht dazu fähig sein eine ausreichende Matrix für einen Zellinflux und eine Vermehrung bereitstellen zu können. In diesen Fällen kann es erforderlich sein durch das OP-1 Morphogen-Analog stimulierte Vorläuferzellen, dem Gewebelocus in Assoziation mit einem geeigneten biologisch verträglichen, formulierten Matrix bereitzustellen, die durch irgendeines der nachfolgend beschriebenen Mittel hergestellt wird. Die Matrix ist vorzugsweise in vivo biologisch abbaubar. Die Matrix kann ebenfalls gewebespezifisch sein und/oder poröse Teilchen mit Dimensionen innerhalb des Bereichs von 70-850 μm, am meisten bevorzugt 150-420 μm, umfassen.
Ein OP-1 Morphogen-Analog kann ebenfalls dazu verwendet werden eine durch eine Immun/Entzündungsantwort vermittelte Gewebeschädigung und Narbengewebebildung anschließend an eine Verletzung verhindern oder im Wesentlichen hemmen zu können. Ein Op-1 Morphogen-Analog kann einem neuerlich verletzten Gewebelocus bereitgestellt werden, um an dem Locus eine Gewebemorphogenese zu induzieren, was die Aggregation von wandernden Fibroblasten in nicht differenziertes Bindegewebe verhindern kann. Vorzugsweise kann das OP-1 Morphogen-Analog als eine sterile pharmazeutische Präparation bereitgestellt werden, die innerhalb von fünf Stunden der Verletzung in den Gewebelocus injiziert wird. Ist eine Immun/Entzündungsantwort nicht zu vermeiden oder absichtlich als Teil von, beispielsweise, einer chirurgischen oder anderen aggressiven klinischen Therapie, induziert, kann ein OP-1 Morphogen-Analog, vorzugsweise dem Patienten vorbeugend vor oder gleichzeitig mit der Therapie bereitgestellt werden.
Nachfolgend wird ein Protokoll zum Aufzeigen beschrieben, ob ein OP-1 Morphogen-Analog im Knochen eine Gewebemorphogenese induziert.
(1) OP-1 Morphogen-Analog induziert eine Knochenmorphogenese
Ein besonders nützliches Modellsystem des Säugetiergewebes zum Darstellen und Evaluieren der morphogenetischen Aktivität eines Morphogen-Analogs besteht in dem endochondralen Knochengewebemorphogenesemodell, das im Stand der Technik und beispielsweise in dem US-P-4,968,590 beschrieben ist. Die Fähigkeit eine endochondrale Knochenbildung zu induzieren, umfasst die Fähigkeit eine Vermehrung und Differenzierung von Vorläuferzellen in Chondroblasten und Osteoblasten zu induzieren, die Fähigkeit eine Knorpelmatrixbildung, eine Knorpelkalzifizierung und einen Knochenumbau zu induzieren und die Fähigkeit eine Bildung einer geeigneten vaskulären Versorgung und eine hämatopoietische Knochenmarksdifferenzierung zu induzieren.
Die lokale Umgebung, in der das morphogene Material angeordnet wird, ist für die Gewebemorphogenese wichtig. Wie hier verwendet, wird "lokale Umgebung" so verstanden, dass sie die strukturelle Gewebematrix und die das Gewebe umgebende Umgebung umfasst. Beispielsweise erfordern die durch Morphogene stimulierten Zellen zusätzlich zu dem Erfordernis eines geeigneten Ankersubstrats für die Vermehrung Signale, um deren gewebespezifische Differenzierung zu leiten. Diese Signale sind für verschiedene Gewebe unterschiedlich und können Zelloberflächenmarker umfassen. Außerdem erfordert die Vaskularisierung eines neuen Gewebes eine lokale Umgebung, die die Vaskularisierung unterstützt.
Das Nachfolgende wird verschiedene Verfahren darlegen, um von OP-1 Morphogen-Analogen und OP-1 Morphogen-Analog beinhaltenden Zusammensetzungen die morphogene Nützlichkeit in vivo zu beurteilen. Die Zusammensetzungen können injiziert oder in einen Säuger chirurgisch implantiert werden, wobei einer beliebigen Anzahl von im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren gefolgt werden kann. Beispielsweise können chirurgische Implantatiosassays ausgeführt werden, die im Wesentlichen dem Verfahren von Sampath et a1., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6591-6595 und US-P-4,968,590 folgen.
Es wird eine histologische Aufteilung beziehungsweise Schnittdarstellung und Färbung bevorzugt, um das Ausmaß einer Morphogenese in vivo zu bestimmen, insbesondere bei Verfahren der Gewebereparatur. Ausgeschnittene Implantate werden in Bouins-Lösung fixiert, eingebettet in Paraffin und in 6-8 μm Schnitte geschnitten. Eine Färbung mit Toluidin-Blau oder Hämatoxilin/Eosin zeigt deutlich die ultimative Entwicklung des neuen Gewebes. Zwölf-Tage-Implantate sind gewöhnlich ausreichend, um zu bestimmen, ob die Implantate neu induziertes Gewebe beinhalten.
Erfolgreiche Implantate zeigen eine kontrollierte Entwicklung beziehungsweise Folge durch die Stadien einer induzierten Gewebeentwicklung, die einem gestattet die sich ereignenden gewebespezifischen Ereignisse zu identifizieren und zu folgen. Beispielsweise, bei der endochondrialen Knochenbildung umfassen die Stadien: (1) Leukozyten an Tag eins, (2) mesenchymale Zellwanderung und Vermehrung an Tagen zwei und drei, (3) Chondrozyten-Erscheinung beziehungsweise -Auftreten an Tagen fünf und sechs, (4) Bildung einer Knorpelmatrix an Tag sieben, (5) Knorpelkalzifizierung an Tag acht, (6) vaskuläre Invasion, Auftreten von Osteoblasten und Bildung von neuem Knochen an Tagen neun und zehn, (7) Auftreten von Osteoklastenzellen und der Beginn des Knochenumbaus und Auflösung der implantierten Matrix an Tagen zwölf bis achtzehn, und (8) hämatopoietische Knochenmarksdifferenzierung in den erhaltenen Knöchelchen an Tag einundzwanzig.
Zusätzlich zu einer histologischen Beurteilung können biologische Marker als Marker für eine Gewebemorphogenese verwendet werden. Nützliche Marker umfassen gewebespezifische Enzyme, deren Aktivitäten nach Homogenisierung des Implantats getestet (beispielsweise spektrophotometrisch) werden können. Diese Assays können zur Quantifizierung nützlich sein und um schnell eine Beurteilung der Gewebebildung zu erhalten, nachdem die Implantate aus dem Tier entfernt wurden. Beispielsweise kann die alkalische Phosphataseaktivität als ein Marker für die Osteogenese verwendet werden.
Dem Einbau von systemisch bereitgestelltem OP-1-Morphogen-Analog kann unter Verwendung markierten Proteins (beispielsweise radioaktiv markiert) verfolgt und dessen Lokalisation in dem neuen Gewebe bestimmt, und/oder dessen Auftreten von dem zirkulatorischen System unter Verwendung eines standardisierten Protokolls und Pulse-Chase-Verfahren überwacht werden. Ein OP-1 Morphogen-Analog kann ebenfalls mit einem gewebespezifischen molekularen Etikett beziehungsweise Tag versehen sein, dessen Aufnahme überwacht und mit der bereitgestellten Konzentration des OP-1-Morphogen-Analogs korreliert werden kann. Beispielhaft führt eine Eierstockentfernung in weiblichen Ratten zu einer verringerten alkalischen Phosphataseaktivität, wodurch die Ratten gegenüber Osteoporose (wie in Beispiel E beschrieben) prädisponiert sind. Falls den weiblichen Ratten nun OP-1-Morphogen-Analog bereitgestellt wird, dann kann eine Verringerung der systemischen Calciumkonzentration beobachtet werden, die mit der Anwesenheit des bereitgestellten OP-1-Morphogen-Analogs korreliert wird, wobei was erwartet wird, dass es mit erhöhter alkalische Phosphataseaktivität einhergeht.
Beispiel 2 (vergleichend). Verstärkung der Löslichkeit von einem HOP-1-Dimer (lediglich für Erläuterungszwecke)
Wie in Abschnitt V.A.(ii) Supra beschrieben, wird vorgesehen, dass die Löslichkeit des hOP-1-Dimers durch ein Ersetzen von hydrophoben Aminosäureresten mit mehr polaren oder hydrophilen Aminosäureresten erhöht werden kann, die an der Lösungsmittel zugänglichen Oberfläche von dem hOIP-1-Dimer lokalisiert sind. Dieses Beispiel stellt eine Beschreibung eines derartigen Ansatzes bereit.
Wie in Ozkaynak et al., (1990) supra, beschrieben, wird ein Sma I-Bam HI Fragment der menschlichen OP-1 cDNA in einen Vektor kloniert, um ein Plasmid zu erzeugen, das ähnlich dem in PCT/US94/12063 pW24 genannten Plasmid ist, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Das pW24-Plasmid beinhaltet OP-1 cDNA, die unter der Transkriptionskontrolle des CMV (Zytomegalie-Virus) unmittelbar frühen Promotors steht. Der gewählte Marker auf pW24 ist ein Neomycingen, das eine Resistenz gegenüber dem zytostatischen Arzneimittel G418 bereitstellt. Bei dem pW24-Plasmid wird ebenfalls ein Ursprung der Replikation (ori) von SV40 verwendet. Es wird der frühe SV40 Promotor verwendet, um die Transkription des Markergens, Neomycin, anzutreiben.
Anschließend wird durch ortsspezifisch gerichtete Mutagenese das Alanin an Position 63 zu einem Serin mutiert, indem beispielsweise synthetische Oligonukleotide und entweder PCR oder die ortsspezifisch gerichteten Mutageneseverfahren verwendet werden. Siehe beispielsweise Kunkel et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 822:488, Kunkel et al., (1985) Meth. Enzymol. 154:367 und US-P-4,873,192 . Die erhaltene Mutation wird durch Didesoxy-Sequenzierung bestätigt.
Es wurden zwei zusätzliche Vektoren entwickelt, die bei einem Dreifach-Transfektionsverfahren zusammen mit pW24 verwendet werden, um eine OP-1-Expression zu erhöhen. Einer der Vektoren verwendet das E1A-Gen des Adenovirus unter dem VA1-Gen als Translationsstimulation für das Gen DHFR-Gen. Bei dem anderen Vektor wird das E1A-Gen unter der Kontrolle des Thymidinkinase-Promotors als einen trans-aktivierender Transkriptionsaktivator verwendet. Beide zusätzliche Vektoren, bekannt als pH1130 und pH1176, als auch bevorzugte Transfektions- und Durchmusterungsverfahren werden in der PCT/US94/12063 beschrieben.
Kurz, Dreifach-Transfektionen werden unter Verwendung des Calcium-Phosphat-Co-Präzipitations-Verfahrens ausgeführt. CHO-Zellen werden in αMEM kultiviert, das 5 % oder 10 % fötales Rinderserum (FBS), nicht essentielle Aminosäuren, Glutamin und Antibiotika, Penicillin und Streptomycin beinhaltet. Es werden stabile Transfektionen an Zelllinien ausgeführt, indem 1-2×10⁶ Zellen in einer 9 cm Petrischale ausgesät werden. Nach einer Inkubationszeit von bis zu 24 Stunden, wird jede Petrischale mit 10-30 μg gesamter Vektor-DNA in äquimolaren Mengen durch die Calcium-Phosphat-Co-Präzipitation, gefolgt durch einen Glycerol-Lagerhaltung nach Standardverfahren. Die Zellen werden bei 37°C in Wachstumsmedium für 24 Stunden inkubiert, anschließend in Selektionsmedium überführt. Alle Kulturen werden ein oder zweimal wöchentlich mit frischem Selektionsmedium gefüttert. Nach 10-21 Tagen werden resistente Kolonien gepickt und auf eine Proteinproduktion getestet.
Ungefär 30 individuelle Klone wurden gewählt, in eine 24-Loch-Petrischale überführt und konnten in einem Serum enthaltenden Medium bis zur Konfluenz wachsen. Das konditionierte Medium von allen überlebenden Klonen wird unter Verwendung eines Standard-ELISA (Enzymimmuntest) oder Western-Blot auf eine Proteinproduktion durchmustert. Die Methodologien für diese Assayprotokolle als auch zum Erzeugen von Antikörpern, um in diesen Assays verwendet zu werden, sind im Stand der Technik (siehe beispielsweise Ausubel, supra) gut beschrieben.
Unter derartigen Bedingungen wirken die VA1- und E1A-Gene gewöhnlich synergistisch, um eine OP-1 Expression in nicht vermehrten transformierten CHO-Zellen zu erhöhen. Test-Zelllinien, die durch das Durchmusterungsprotokoll identifiziert wurden, werden dann auf 100 mm Petrischalen mit einer Zelldichte von entweder 50 oder 100 Zellen pro Platte und mit einer höheren Arzneimittelkonzentration (beispielsweise 10 μm) ausgesät.
Nach 10-21 Tagen des Wachstums werden die Klone unter Verwendung von Klonierungszylindern und Standardverfahren isoliert, und in 24-Lochplatten kultiviert. Anschließend werden die Klone durch Western-Immoblots unter Verwendung von Standardverfahren auf eine OP-1 Expression durchmustert, wobei die OP-1-Expressionsspiegel mit den Elternlinien verglichen wurden. Testzellen, die eine höhere Proteinproduktion als Zellen von Elternlinien zeigen, werden dann ersetzt und in der Anwesenheit einer immer noch höheren Arzneimittelkonzentration (beispielsweise 5-20 μm) gezüchtet. Allgemein sind nicht mehr als 2-3 Runden dieser "Vermehrungs"-Klonierungsschritte erforderlich, um Zelllinien mit höherer Proteinproduktion zu erzielen. Nützliche stark produzierende Zelllinien können weiter subkloniert werden, um eine Homogenität von Zelllinien und eine Produktstabilität zu verbessern.
Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren einer großtechnischen Proteinproduktion, beispielsweise mindestens 2 Liter, besteht in einer Suspensionskultur der Wirtszellen, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO). CHO-Zellen bevorzugen eine Anheftung, wobei sie jedoch dazu angepasst werden können in Kultur im Suspensionsmodus zu wachsen. Die Zellen werden mit einer Trypsinbehandlung von der Kulturschale gelöst, in Wachstumsmedium überführt, das 10 % FBS beinhaltet und vollständig suspendiert, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Die Einzelzellsuspension wird in eine Spinner-Flasche eingefügt und in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C, 95 % Luft, 5 % CO₂ angeordnet. Über einen Zeitraum werden die Zellen in Medium mit abnehmenden Serumkonzentrationen subkultiviert.
Insbesondere werden die angepassten Zellen in eine 3L Spinner-Flasche mit einer anfänglichen Dichte lebender Zellen von ungefähr 2×10⁵ Zellen/ml eingefügt. Das bevorzugte Kulturmedium ist DMEM/F-12 (1:1) (Gibco, New York), das mit 2 % FBS ergänzt war, wobei eine Bewegung beziehungsweise Agitation von ungefähr 50-60 Upm, mit einem Schaufellaufrad, bevorzugt ist. Nach 7 Tagen wurden die Kulturmedien geerntet, bei 1500 Upm zentrifugiert und die geklärten konditionierten Medien wurden bei 4°C gelagert.
Ein repräsentatives Reinigungsschema zum Reinigen vom rekombinaritem morphogenem Protein schließt drei Chromatographieschritte (S-Sepharose, Phenyl-Sepharose und C-18 HPLC) ein und wird in der PCT/US94/12063 beschrieben. Kulturmedien, die Morphogen-Analog beinhalten, werden auf 6 M Harnstoff, 0,05 M NaCl, 13 mM Hepes, pH-Wert 7,0 verdünnt und auf eine S-Sepharose-Säule geladen, die als ein starker Kationenaustauscher wirkt. Die Säule wird anschließend mit zwei Salz-Flutionen entwickelt. Bei der ersten Flution wird eine Lösung verwendet, die 0,1 M NaCl beinhaltet, wobei bei der zweiten Flution ein Puffer verwendet wird, der 6 M Harnstoff, 0,3 M NaCl, 20 mM Hepes, pH-Wert 7,0 beinhaltet.
Es wird Ammoniumsulfat zu der 0,3 M NaCl-Fraktion gegeben, um eine Lösung zu erhalten, die 6 M Harnstoff, 1 M (NH₄)₂SO₄, 0,3 M NaCl, 20 mM Hepes, pH-Wert 7,0, beinhaltet. Anschließend wird die Probe in der Gegenwart von 1 M (NH₄)₂SO₄ auf die Phenyl-Sepharose-Säule geladen. Anschließend wird die Säule mit zwei Elutionsschritten entwickelt, bei denen abnehmende Konzentrationen von Ammoniumsulfat verwendet werden. Bei der ersten Flution wird 0,6M (NH₄)₂SO₄ verwendet und bei der zweiten Flution wird ein Puffer mit 6 M Harnstoff, 0,3 M NaCl, 20 mM Hepes, pH-Wert 7,0 verwendet. Das von der zweiten Flution geerntete Material wird gegen Wasser dialysiert, gefolgt durch 30 % Acetonitril (0,1 % TFA), und wird dann auf eine C-18 Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgetragen.
Die erhöhte Löslichkeit des erhaltenen Morphogen-Analogs wird durch Vergleichen des Verteilungskoeffizienten des Ala 63 > Ser 63 Muteins gegen das Wildtyp hOP-1-Dimer erfasst. Es wird erwartet, dass das Ala 63 > Ser 63 Mutein eine höhere Löslichkeit aufweist als das native hOP-1. Es wird erwartet, dass zusätzliche Muteine mit mehreren hydrophoben zu hydrophilien Substitutionen erzeugt und unter Verwendung der in diesem Beispiel beschriebenen Protokolle charakterisiert werden können. Die biologische Aktivität der erhaltenen Morphogen-Analoge kann unter Verwendung eines oder mehrerer der in Beispiel 1 beschriebenen Aktivitäts-Assays für OP-1 bestimmt werden.
Beispiel 3 (vergleichend). Biologische Aktivität von Finger 1-, Finger 2- und Fersen-Peptiden (lediglich für Erläuterungszwecke)
Die auf hOP-1 basierenden Peptide, die in diesem Beispiel beschrieben werden, wurden vorher hergestellt und charakterisiert, um die dreidimensionale Struktur von hOP-1 zu bestimmen. Diese Peptide wirken entweder agonistisch oder antagonistisch auf die biologische Aktivität von hOP-1. Es wird erwartet, dass weitere Veredelungen, die auf der Kristallstruktur von hOP-1 basieren, beispielsweise die Wahl von mehr geeigneten Stellen zum Zyklisieren von Peptiden, was das Peptid in einer Konformation ein-/beschränkt, die die Form der entsprechenden Region in hOP-1 näher nachahmt, dazu verwendet werden, um die agonistischen oder antagonistischen Eigenschaften derartiger auf hOP-1 basierenden Peptiden zu erhöhen.
Alle in den folgenden Experimenten verwendeten Peptide als auch deren Beziehungen zu der reifen hOP-1 Aminosäuresequenz werden in 12 gezeigt. Die auf Finger-1 basierenden Peptide werden als F1-2 bezeichnet, die auf der Ferse basierende Peptide werden als H-1, H-n2 und H-c2 bezeichnet, wobei die auf Finger-2 basierenden Peptide als F2-2, und F2-3 bezeichnet werden. Mögliche Intra-Peptid-Disulfidverbindungen werden für jedes Peptid gezeigt. Alle Peptide wurden an einem Standard-Peptidsynthesizer gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Die Peptide wurden entschützt, durch Oxidation zyklisiert und anschließend vor einer Verwendung von einem Harz gespalten.
In einer ersten Reihe von Experimenten wurden zunehmende Konzentrationen der Peptide F2-2 (13A), F2-3 (13B), Hn-2 (13C) und Hc-2 (13D) zu ROS-Zellen entweder alleine oder in Kombination mit 40,0 ng/ml von löslichem OP-1 (gefüllte Balken) gegeben und wobei deren Wirkung auf die alkalische Phosphataseaktivität erfasst wurde. Lösliches OP-1 ist die Form von OP-1, in der die Pro-Domäne immer noch an dem reifen Protein von OP-1 (siehe WO94/03600 ) angefügt vorliegt. Eine basale Aktivität von alkalischer Phosphatase wird durch die Linie angezeigt und stellt die alkalische Phosphataseaktivität von Zellen dar, die in der Abwesenheit von sowohl löslichem OP-1 als auch Peptid inkubiert wurden.
In 13A scheint das Peptid F2-2 bei einer Konzentration von ungefähr 60 μM den basalen alkalischen Phosphataseaktivitätsgrad zu verdoppeln, wobei in der Anwesenheit von löslichem OP-1 die Aktivität der alkalischen Phosphatase um ungefähr 20 % relativ zu löslichem OP-1 alleine ansteigt. In 13B scheint das Peptid F2-3 bei einer Konzentration von ungefähr 0,01 μM den basalen Aktivitätsgrad der alkalischen Phosphatase zu erhöhen und wobei die Anwesenheit von löslichem OP-1 die Aktivität der alkalischen Phosphatase um ungefähr 20 % relativ zu löslichem OP-1 alleine erhöht. Dementsprechend erscheinen beide Peptide F2-2 und F2-3 in dem alkalische Phosphataseassay als schwache OP-1 Agonisten zu wirken.
In 13C zeigt das Peptid H-n2 entweder alleine oder in Kombination mit löslichem OP-1 einen geringen oder keinen Effekt auf die alkalische Phosphataseaktivität. In 13D erscheint das Peptid H-c2 bei Konzentrationen größer als ungefähr 5 μM die Aktivität von löslichem OP-1 zu antagonisieren.
In einer zweiten Reihe von Experimenten wurde die Fähigkeit von nicht markiertem löslichem OP-1 und nicht markierten Peptiden F1-2, F2-2, F2-3, H-n2 und H-c2 erfasst das mit ¹²⁵I markierte lösliche OP-1 von ROS-Zellmembranen zu verdrängen. Die Aktivitäten der Peptide F2-2 und F2-3 relativ zu löslichem OP-1 werden in 14A gezeigt und die Aktivitäten der Peptide F1-2, H-n2 und H-c2 relativ zu löslichem OP-1 werden in 14B gezeigt. Plasmamembranen von ROS-Zellen, die mit OP-1-Rezeptoren angereichert waren, wurden für 20 Std. bei 4°C mit ¹²⁵I markiertem Rislichem OP-1 und nicht markiertem Peptid inkubiert. Mit Rezeptor gebundenes Material wurde von nicht-gebundenem Material durch Zentrifugation bei 39,500xg abgetrennt. Das erhaltene Pellet wurde geerntet und mit 50 mM Hepes-Puffer, pH-Wert 7,4 beinhaltend 5 mM MgCl₂ und 1 mM CaCl₂, gewaschen. Die im Pellet zurückgehaltene Radioaktivität wurde durch einen Gammazähler bestimmt.
In 14A konkurriert das lösliche Peptid F2-2 (gefüllte Kreise) mit löslichem OP-1 mit einer wirksamen Dosis₅₀ (ED₅₀) von ungeführ 1 μM, wobei es jedoch lösliches OP-1 nicht vollständig verdrängen kann ED₅₀ stellt die Konzentration von Peptid dar, um eine halb-maximale Verdrängung von markiertem löslichem OP-1 zu erzeugen. Das Peptid F2-3 (gefüllte Dreiecke) konkurriert mit und kann lösliches OP-1 mit einer ED₅₀ von ungefähr 5 μM vollständig verdrängen. In 14B scheinen alle, Peptid F1-2 (gefüllte Kasten), Peptid H-n2 (offene Diamanten) und Peptid H-c2 (offene Kreise) eine geringe oder keine Fähigkeit zu zeigen iodiniertes lösliches OP-1 von ROS-Zellmembranen zu verdrängen.
Obwohl die Peptidexperimente vielversprechend erscheinen, wird vorgesehen, dass eine Auflösung der hOP-1-Struktur dem Fachmann ermöglicht, beschränkte Peptide zu gestalten, die die Rezeptorbindungsdomänen von menschlichem OP-1 näher beziehungsweise stärker nachahmen und die eine hOP-1 vermittelte biologische Wirkung wirksamer agonisieren oder antagonisieren.
Beispiel 4. Beseitigung einer Bindungsstelle an der Oberfläche von OP-1
Ein eine Protease aufkehrendes beziehungsweise beseitigendes Protein, α-2 Makroglobulin, von dem bekannt ist, dass es im Serum Proteine bindet und sie zur Ausscheidung aus dem Körper zur Niere zielrichtet. Wie hier beschrieben, wurden α-2's-Interaktionsstellen an dem OP-1 Protein kartiert. Dementsprechend kann unter Verwendung der hier bereitgestellten Datenbanken und strukturellen Information ein Analog von OP-1 gestaltet werden, das ein oder mehrere α-2-Makroglobulin Interaktionsstellen beseitigt und ein Analog bereitstellen, das eine erhöhte biologische Verfügbarkeit in dem Körper aufweist. Diese gleiche Strategie kann zur Identifizierung und/oder Beseitigung von Interaktionsstellen für andere Bindungsproteine an der OP-1-Oberfläche angewendet werden.
A. Identifizieren von α-2 Makroglobulin-Bindungsstellen
Es wurde festgestellt, dass OP-1 in einem Standard-Konkurrenz-Bindungsassay, unter Verwendung von immobilisiertem, im Handel erhältlichen α-2-Makroglobulin und markiertem und nicht markiertem OP-1-Protein spezifisch wechselwirkt. Verkürztes reifes OP-1, worin die ersten 22 Aminosäuren von der reifen Form von OP-1 in einem standardisierten Trypsinverdau abgespalten wurden, band α-2 mit einer 10-fach geringeren Affinität, was anzeigt, dass der N-terminale Bereich des reifen Proteins an der Bindung beteiligt ist. Dieser N-terminale Bereich des Proteins, der nicht Teil der Proteinstruktur ist, liegt positiv geladen vor und ist in Lösung wahrscheinlich hoch flexibel. Beseitigung dieser Sequenz beeinflusst die OP-1-Aktivität nicht. Zwei zyklisierte Peptide der gesamten oder eines Teilbereichs der Fersenregion, H-n2 und H1 (Cys_7l-Pro₁₀₂, worin Pro₁₀₂ zu einem Cystein verändert wurde, um eine Disulfidbindung zwischen den zwei Cysteinen zu gestatten) konkurrieren ebenfalls um Bindung, während die Peptide zu den Fingerregionen (F2-2, F2-3) nicht konkurrieren.
Es wurde festgestellt, dass α-2-Makroglobulin die Fähigkeit von OP-1 die alkalische Phosphataseaktivität in einem ROS-Zellassay zu stimulieren nicht beeinflusst wird. Dementsprechend scheint eine α-2 Makroglobulinbindung die OP-1 Rezeptorbindung nicht sterisch zu hemmen.
B. Gestaltung eines modifizierten OP-1-Analogs
Die genaue Interaktionsstelle auf OP-1 von α-2-Makroglobulin kann nun kartiert und wobei ein Analog unter Verwendung der hier bereitgestellten strukturellen Information gestaltet werden kann. Beispielsweise können durch Erzeugen von Modellpeptiden, ähnlich H-N2 und/oder H1 in Verbindung mit einem "Alanin-Scan"-Mutagenese-Programm, die genauen Kontaktreste identifiziert werden, worim jeder Rest wiederum zu einem Alanin einzeln verändert wurde, und die Konstrukte anschließend auf deren Fähigkeit getestet werden mit der Bindung zu konkurrieren. Sobald die Kontaktreste kartiert sind, kann ein Analog gestaltet werden, das die Kontaktreste beseitigt ohne dass die Gesamtstruktur der Fersenregion geändert wird. Insbesondere kann eine Matrize der Region von der Datenbank auf den Computer aufgerufen werden, wobei Test- beziehungsweise Kandidaten-Ersetzungsreste getestet werden. Die Information in Tabelle 8 identifiziert besonders nützliche Test-Reste in der Fersenregion, die Lösungsmittel zugänglich sind, die wahrscheinlich nicht als Epitope verfügbar sind und gute Kandidaten für eine Modifikation bilden. SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Herstellung eines OP-1-Analogpeptids mit OP-1-ähnlicher biologischer Aktivität, welches die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Molekül-Models, dessen dreidimensionale Form mindestens einen Teil des humanen OP-1 darstellt, ausgewählt unter: der Finger-Region 1, der Fersen-Region, oder der Finger-Region 2, wobei die dreidimensionale Form durch die Atom-Koordinaten der humanen OP-1 Kristallstruktur, wie in 15 gezeigt, definiert ist, (b) Erzeugen eines zweiten Molekül-Models, welches ein mögliches Analogon ist, worin eine α-2 Makroglobulin-Wechselwirkungsstelle von OP-1 durch Ersetzen von mindestens einem Aminosäurerest des Bereichs mit einer anderen Aminosäure eliminiert wurde, wobei das mögliche Analogon die dreidimensionale Form, welche die Fersen-Region von humanem OP-1 darstellt, beibehält, und (c) Herstellen des in Schritt (b) erzeugten möglichen Analogon, wahlweise weiteren den Schritt umfassend, Bestimmen, ob die in Schritt (c) hergestellte Verbindung eine OP-1 ähnliche biologische Aktivität aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Analogon mehrere geladene Reste aufweist, welche um die einem Lösungsmittel zugängliche Oberfläche davon angeordnet sind, und in einer räumlichen Beabstandung lokalisiert sind, welche der geladener Reste, die um einen Teil der einem Lösungsmittel zugänglichen Oberfläche von humanen OP-1 entsprechen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Schritte (a) und (b) mittels eines elektronischen Prozessors durchgeführt werden, beispielsweise, wobei Schritt (a) Speichern einer Darstellung von mindestens einem Bereich der Atom-Koordinaten von humanem OP-1 in einem Computerspeicher umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 – 3, weiter den zusätzlichen Schritt umfassend, Herstellen der Verbindung in für den Handel verwendbaren Mengen.