JP5044608B2 - アンギオポエチン−２特異的結合剤 - Google Patents

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Description

本発明はアンギオポエチン−２（Ａｎｇ−２）を認識し、Ａｎｇ−２に結合する特異的結合剤に関する。より具体的には、本発明はＡｎｇ−２に特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及びその断片の産生、診断用途及び治療用途に関する。
既存の血管からの新しい血管の形成である血管形成は、多くの生理学的及び病理学的プロセスにとって必須である。通常、血管形成はプロ−及び抗−血管形成因子によりしっかり調節されるが、癌、眼血管新生疾患、関節炎や乾癬のような病気の場合には前記プロセスはなくなることがある（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１：２７−３１（１９９５））。
脱調節となったまたは望ましくない血管形成に関連している病気は多数ある。前記病気には、眼血管新生、例えば糖尿病性網膜症を含めた網膜症及び老人性黄斑変性；乾癬；血管芽腫；血管腫；動脈硬化症；炎症性疾患、例えばリウマチ様またはリウマチ性炎症性疾患、特に関節リウマチを含めた関節炎、または他の慢性炎症性疾患、例えば慢性喘息；動脈または移植後アテローム性動脈硬化症；子宮内膜症；並びに新生物疾患、例えば所謂充実性腫瘍及び流動性（または、造血性）腫瘍、例えば白血病またはリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。望ましくない血管形成に関連する他の疾患は当業者に自明である。
血管形成の調節には多くのシグナル形質導入系が関与しているが、最もよく特徴づけられている多くの内皮細胞選択的系の１つにはＴｉｅ−２受容体チロシンキナーゼ（“Ｔｉｅ−２”または“Ｔｉｅ−２Ｒ”（“ＯＲＫ”とも呼ばれる）と称される；マウスＴｉｅ−２は“ｔｅｋ”とも称される）及びそのリガンドのアンギオポエチンが含まれる（Ｎ．Ｗ．Ｇａｌｅ及びＧ．Ｄ．Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｕｓ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１３：１０５５−１０６６（１９９９））。アンギオポエチン−１（“Ａｎｇ−１”）〜アンギオポエチン−４（“Ａｎｇ−４”）の４つのアンギオポエチンが公知である。これらのアンギオポエチンは“Ｔｉｅ−２リガンド”とも称されている（Ｓ．Ｄａｖｉｓら，Ｃｅｌｌ，８７：１１６１−１１６９（１９９６）；Ｋ．Ｇｒｏｓｉｏｓら，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．，８４：１１８−１２０（１９９９）；Ｊ．Ｈｏｌａｓｈら，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５（１９９９）；Ｔ．Ｉ．Ｋｏｂｌｉｚｅｋら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：５２９−５３２（１９９８）；Ｐ．Ｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４（１９９８）；Ｐ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：５５−６０（１９９７）；Ａ．Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７９：２１３−２２３（１９９９）；Ｔ．Ｎ．Ｓａｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ，３７５：７０−７４（１９９８）；Ｋ．Ｇ．Ｓｈｙｕら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８：２０８１−２０８７（１９９８）；Ｃ．Ｓｕｒｉら，Ｃｅｌｌ，８７：１１７１−１１８０（１９９６）；Ｃ．Ｓｕｒｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：４６８−４７１（１９９８）；Ｄ．Ｍ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ，９６：１９０４−１９０９（１９９９）；Ｂ．Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１８５１４−１８５２１（１９９８））。Ｔｉｅ−２に結合するＡｎｇ−１は培養内皮細胞において受容体リン酸化を刺激するのに対して、Ａｎｇ−２はＴｉｅ−２受容体リン酸化を作動も拮抗もすることが判明している（上掲のＳ．Ｄａｖｉｓら（１９９６）；上掲のＰ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ（１９９７）；Ｉ．Ｋｉｍ及びＪ．Ｈ．Ｋｉｍら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９（３９）：４５４９−４５５２（２０００）；Ｋ．Ｔｅｉｃｈｅｒｔ−Ｋｕｌｉｓｚｅｗｓｋａ，Ｐ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９（３）：６５９−７０（２００１））。
マウスＴｉｅ−２及びＡｎｇ−１ノックアウトの表現型は類似しており、Ａｎｇ−１刺激Ｔｉｅ−２リン酸化は内皮細胞−支持細胞付着の維持により子宮内の発生血管のリモデリング及び安定化を媒介する（Ｄ．Ｌ．Ｄｕｍｏｎｔら，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：１８９７−１９０９（１９９４）；Ｔ．Ｎ．Ｓａｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７０−７４（１９９５）；上掲のＣ．Ｓｕｒｉら（１９９６））。血管安定化におけるＡｎｇ−１の役割は成人では保存され、ここではＡｎｇ−１は広く且つ構成的に発現されると考えられる（Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：４８−５０（１９９７）；Ｄ．Ｚａｇｚａｇら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１５９：３９１−４００（１９９９））。対照的に、Ａｎｇ−２発現は主に血管リモデリングの部位に限定され、ここではＡｎｇ−２はＡｎｇ−１機能をブロックして血管形成を招く血管可塑性の状態を誘導すると考えられる（上掲のＤ．Ｈａｎａｈａｎ（１９９７）；Ｊ．Ｈｏｌａｓｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１９９４−１９９８（１９９９）；上掲のＰ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９７））。
多くの発表された研究から、血管形成に関連する病的状態での血管選択的Ａｎｇ−２発現が明らかとされている。これらの病的状態の例には、乾癬、黄斑変性及び癌が含まれる（Ｇ．Ｂｕｎｏｎｅら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５５：１９６７−１９７６（１９９９）；Ｔ．Ｅｔｏｈら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１：２１４５−２１５３（２００１）；Ｍ．Ｈａｎｇａｉら，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５（２００１）；上掲のＪ．Ｈｏｌａｓｈら（１９９９）；Ｋ．Ｋｕｒｏｄａら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１６：７１３−７２０（２００１）；Ａ．Ｏｔａｎｉら，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１９１２−１９２０（１９９９）；Ａ．Ｓｔｒａｔｍａｎｎら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５３：１４５９−１４６６（１９９８）；Ｓ．Ｔａｎａｋａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０３：３４−３４５（１９９９）；Ｙ．Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５：１２２１−１２２５（１９９９）；Ｋ．Ｙｕａｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１６５−１７１（２０００）；上掲のＤ．Ｚａｇｚａｇら（１９９９））。これらの研究の殆どは多くの腫瘍タイプが血管Ａｎｇ−２発現を示すと思われる癌に向けられている。病的血管形成での発現とは対照的に、正常組織でのＡｎｇ−２発現は非常に限られている（上掲のＰ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９７）；Ｊ．Ｍｅｚｑｕｉｔａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２６０：４９２−４９８（１９９９））。正常な成人では、血管形成の３つの主な部位は卵巣、胎盤及び子宮である。これらはＡｎｇ−２ ｍＲＮＡが検出された正常（すなわち、非癌）組織中の主な組織である。
ある機能研究から、Ａｎｇ−２が腫瘍血管形成に関与する恐れがあることが示唆されている。Ａｈｍａｄら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６１：１２５５−１２５８（２００１））はＡｎｇ−２過剰発現を記載しており、これがマウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖の増加に関連すると言われていることを示している。Ａｎｇ−２過剰発現と腫瘍血管分布過多の関連を示すデーターが挙げられている上掲のＥｔｏｈら及び上掲のＴａｎａｋａらも参照されたい。しかしながら、対照的に、Ｙｕら（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１５８：５６３−５７０（２００１））は、ルイス肺癌及びＴＡ３乳癌細胞におけるＡｎｇ−２過剰発現は対応のトランスフェクタントを注射したマウスの寿命を延長させたことを示すデーターを報告している。
数年前には、複数の文献にＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２及び／またはＴｉｅ−２が抗癌治療に対する可能な標的として示唆されている。例えば、米国特許第６，１６６，１８５号明細書、同第５，６５０，４９０号明細書及び同第５，８１４，４６４号明細書はそれぞれ抗−Ｔｉｅ−２リガンド抗体及び受容体の概念を開示している。Ｌｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４（１９９８））はアデノウイルス発現可溶性Ｔｉｅ−２をマウスに注射した。可溶性Ｔｉｅ−２はマウスで発生した腫瘍の数及びサイズを減少させると言われている。関連した研究で、Ｌｉｎら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２０７２−２０７８（１９９７））は可溶性形態のＴｉｅ−２をラットに注射した。この化合物はラットにおいて腫瘍サイズを縮小させたと言われている。Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：３１８５−３１８９（１９９９））はＴｉｅ−２の細胞外ドメインを発現するヒト黒色腫細胞株を作成し、この細胞株をヌードマウスに注射して、可溶性Ｔｉｅ−２は腫瘍増殖及び腫瘍血管形成を有意に抑制すると言われているとの結論を得た。この情報にてらして、Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２の両方がＴｉｅ−２に結合すると仮定すると、これらの研究からＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２またはＴｉｅ−２が抗癌治療に対する魅力的な標的であるかどうかは明らかでない。
分子の半減期を延長させるためにあるペプチドを安定な血漿タンパク質（例えば、Ｉｇ定常領域）へ融合させることは、例えば２０００年５月４日に公開された国際特許出願公開第００／２４７８２号パンフレットに記載されている。
分子の半減期を延長させるためにタンパク質またはその断片を安定な血漿タンパク質（例えば、Ｉｇ定常領域）へ融合させることはいろいろな文献に記載されている［例えば、米国特許第５，４８０，９８１号明細書；Ｚｈｅｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：５５９０−５６００（１９９５）；Ｆｉｓｈｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：１６９７−１７０２（１９９６）；Ｋ．Ｖａｎ Ｚｅｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：２２２１−２２３０（１９９６）；１９９８年９月１５日に付与された米国特許第５，８０８，０２９号明細書；Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｈａｒｖｉｌｌら，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ．，１：９５−１０５（１９９５）；１９９７年７月３日に公開された国際特許出願公開第９７／２３６１４号パンフレット；１９９７年１２月１１日に出願された国際特許出願第ＵＳ ９７／２３１８３号明細書；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：５６１−５６９（１９９１）；１９９５年８月１０日に公開された国際特許出願公開第９５／２１２５８号パンフレット参照］。
多くの充実性腫瘍は直径１〜２ｍｍ以上に増殖するために血管新生を必要としているので効果的な抗−Ａｎｇ−２治療は大多数の患者のためになるであろう。前記治療は他の血管形成関連疾患、例えば網膜症、関節炎や感染においても広く適用されるであろう。
Ａｎｇ−２を特異的に認識し、結合する新規物質を同定することが依然として要望されている。前記物質はＡｎｇ−２活性に関連する病的状態における診断スクリーニング及び治療手段のために有用である。
従って、本発明の目的はＡｎｇ−２活性を調節するＡｎｇ−２の特異的結合剤を提供することである。
米国特許第６，１６６，１８５号明細書 米国特許第５，６５０，４９０号明細書 米国特許第５，８１４，４６４号明細書 国際公開第００／２４７８２号パンフレット 米国特許第５，４８０，９８１号明細書 米国特許第５，８０８，０２９号明細書 国際公開第９７／２３６１４号パンフレット 国際特許出願第ＵＳ ９７／２３１８３号明細書 国際公開第９５／２１２５８号パンフレット参照
Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１：２７−３１（１９９５） Ｎ．Ｗ．Ｇａｌｅ及びＧ．Ｄ．Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｕｓ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１３：１０５５−１０６６（１９９９） Ｓ．Ｄａｖｉｓら，Ｃｅｌｌ，８７：１１６１−１１６９（１９９６） Ｋ．Ｇｒｏｓｉｏｓら，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．，８４：１１８−１２０（１９９９） Ｊ．Ｈｏｌａｓｈら，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５（１９９９） Ｔ．Ｉ．Ｋｏｂｌｉｚｅｋら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：５２９−５３２（１９９８） Ｐ．Ｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４（１９９８） Ｐ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：５５−６０（１９９７） Ａ．Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７９：２１３−２２３（１９９９） Ｔ．Ｎ．Ｓａｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ，３７５：７０−７４（１９９８） Ｋ．Ｇ．Ｓｈｙｕら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８：２０８１−２０８７（１９９８） Ｃ．Ｓｕｒｉら，Ｃｅｌｌ，８７：１１７１−１１８０（１９９６） Ｃ．Ｓｕｒｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：４６８−４７１（１９９８） Ｄ．Ｍ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ，９６：１９０４−１９０９（１９９９） Ｂ．Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１８５１４−１８５２１（１９９８） Ｉ．Ｋｉｍ及びＪ．Ｈ．Ｋｉｍら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９（３９）：４５４９−４５５２（２０００） Ｋ．Ｔｅｉｃｈｅｒｔ−Ｋｕｌｉｓｚｅｗｓｋａ，Ｐ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９（３）：６５９−７０（２００１） Ｄ．Ｌ．Ｄｕｍｏｎｔら，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：１８９７−１９０９（１９９４） Ｔ．Ｎ．Ｓａｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７０−７４（１９９５） Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：４８−５０（１９９７） Ｄ．Ｚａｇｚａｇら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１５９：３９１−４００（１９９９） Ｊ．Ｈｏｌａｓｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１９９４−１９９８（１９９９） Ｇ．Ｂｕｎｏｎｅら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５５：１９６７−１９７６（１９９９） Ｔ．Ｅｔｏｈら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１：２１４５−２１５３（２００１） Ｍ．Ｈａｎｇａｉら，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５（２００１） Ｋ．Ｋｕｒｏｄａら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１６：７１３−７２０（２００１） Ａ．Ｏｔａｎｉら，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１９１２−１９２０（１９９９） Ａ．Ｓｔｒａｔｍａｎｎら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５３：１４５９−１４６６（１９９８） Ｓ．Ｔａｎａｋａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０３：３４−３４５（１９９９） Ｙ．Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５：１２２１−１２２５（１９９９） Ｋ．Ｙｕａｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１６５−１７１（２０００） Ｊ．Ｍｅｚｑｕｉｔａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２６０：４９２−４９８（１９９９） Ａｈｍａｄら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６１：１２５５−１２５８（２００１）） Ｙｕら（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１５８：５６３−５７０（２００１）） Ｌｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４（１９９８）） Ｌｉｎら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２０７２−２０７８（１９９７）） Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：３１８５−３１８９（１９９９）） Ｚｈｅｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：５５９０−５６００（１９９５） Ｆｉｓｈｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：１６９７−１７０２（１９９６） Ｋ．Ｖａｎ Ｚｅｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：２２２１−２２３０（１９９６） Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９） Ｈａｒｖｉｌｌら，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ．，１：９５−１０５（１９９５） Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：５６１−５６９（１９９１）
本発明は、５２６ ＨＣ（配列番号１）、５２８ ＨＣ（配列番号３）、５３１ ＨＣ（配列番号５）、５３３ ＨＣ（配列番号７）、５３５ ＨＣ（配列番号９）、５３６ ＨＣ（配列番号１１）、５３７ ＨＣ（配列番号１３）、５４０ ＨＣ（配列番号１５）、５４３ ＨＣ（配列番号１７）、５４４ ＨＣ（配列番号１９）、５４５ ＨＣ（配列番号２１）、５４６ ＨＣ（配列番号２３）、５５１ ＨＣ（配列番号２５）、５５３ ＨＣ（配列番号２７）、５５５ ＨＣ（配列番号２９）、５５８ ＨＣ（配列番号３１）、５５９ ＨＣ（配列番号３３）、５６５ ＨＣ（配列番号３５）、Ｆ１−Ｃ６ ＨＣ（配列番号３７）、ＦＢ１−Ａ７ ＨＣ（配列番号３９）、ＦＤ−Ｂ２ ＨＣ（配列番号４１）、ＦＥ−Ｂ７ ＨＣ（配列番号４３）、ＦＪ−Ｇ１１ ＨＣ（配列番号４５）、ＦＫ−Ｅ３ ＨＣ（配列番号４７）、Ｇ１Ｄ４ ＨＣ（配列番号４９）、ＧＣ１Ｅ８ ＨＣ（配列番号５１）、Ｈ１Ｃ１２ ＨＣ（配列番号５３）、ＩＡ１−１Ｅ７ ＨＣ（配列番号５５）、ＩＦ−１Ｃ１０ ＨＣ（配列番号５７）、ＩＫ−２Ｅ２ ＨＣ（配列番号５９）、ＩＰ−２Ｃ１１ ＨＣ（配列番号６１）及びその抗原結合断片からなる群から選択される重鎖可変領域を含む重鎖、及び５２６カッパ（配列番号２）、５３６カッパ（配列番号１２）、５４３カッパ（配列番号１８）、５４４カッパ（配列番号２０）、５５１カッパ（配列番号２６）、５５３カッパ（配列番号２８）、５５５カッパ（配列番号３０）、５５８カッパ（配列番号３２）、５６５カッパ（配列番号３６）、ＦＥ−Ｂ７カッパ（配列番号４４）、ＦＪ−Ｇ１１カッパ（配列番号４６）、ＦＫ−Ｅ３カッパ（配列番号４８）、ＩＡ１−１Ｅ７カッパ（配列番号５６）、ＩＰ−２Ｃ１１カッパ（配列番号６２）、５２８ラムダ（配列番号４）、５３１ラムダ（配列番号６）、５３３ラムダ（配列番号８）、５３５ラムダ（配列番号１０）、５３７ラムダ（配列番号１４）、５４０ラムダ（配列番号１６）、５４５ラムダ（配列番号２２）、５４６ラムダ（配列番号２４）、５５９ラムダ（配列番号３４）、Ｆ１−Ｃ６ラムダ（配列番号３８）、ＦＢ１−Ａ７ラムダ（配列番号４０）、ＦＤ−Ｂ２ラムダ（配列番号４２）、Ｇ１Ｄ４ラムダ（配列番号５０）、ＧＣ１Ｅ８ラムダ（配列番号５２）、Ｈ１Ｃ１２ラムダ（配列番号５４）、ＩＦ−１Ｃ１０ラムダ（配列番号５８）及びＩＫ−２Ｅ２ラムダ（配列番号６０）及びその抗原結合断片からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体を提供する。
また、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号２、配列番号１２、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０及びその断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む特異的結合剤を提供する。
前記特異的結合剤は、例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化または完全ヒト化抗体のような抗体であり得ると認められる。前記抗体は単鎖抗体でもあり得る。本発明は更に本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマにも関する。
本発明は本明細書に記載されているコンジュゲートに関すると認められる。前記コンジュゲートの例は本発明の特異的結合剤（例えば、抗体）であり得る。
更に、本発明は本発明の特異的結合剤（例えば、抗体）をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、及び前記ベクターを含む宿主細胞に関する。
加えて、本発明は（ａ）宿主細胞を請求の範囲第１項に記載の特異的結合剤をコードする少なくとも１つの核酸分子で形質転換し、（ｂ）前記宿主細胞において前記核酸分子を発現させ、（ｃ）特異的結合剤を単離することを含む特異的結合剤の作成方法を提供する。本発明は（ａ）宿主細胞を本発明の抗体をコードする少なくとも１つの核酸分子で形質転換し、（ｂ）前記宿主細胞において前記核酸分子を発現させ、（ｃ）特異的結合剤を単離することを含む抗体の作成方法をも提供する。
また、本発明は治療有効量の本発明の特異的結合剤を投与することによる哺乳動物における望ましくない血管形成の阻止方法に関する。本発明は治療有効量の本発明の特異的結合剤を投与することによる哺乳動物における癌の治療方法にも関する。
更に、本発明は治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む哺乳動物における望ましくない血管形成の阻止方法に関する。本発明は治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む哺乳動物における癌の治療方法にも関する。
更に、本発明は本発明の特異的結合剤及び医薬的に許容され得る製剤化剤を含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物は本発明の抗体及び医薬的に許容され得る製剤化剤を含み得る。
本発明は１つ以上の本発明の特異的結合剤を投与することによるアンギオポエチン−２活性の調節または阻害方法を提供する。本発明は本発明の抗体を投与することによるアンギオポエチン−２活性の調節または阻害方法をも提供する。
更に、本発明は治療有効量の本発明の特異的結合剤を投与することを含む哺乳動物における血管透過性または血漿漏出の少なくとも１つの調節方法に関する。本発明はまた、治療有効量の本発明の特異的結合剤を投与することを含む哺乳動物における眼血管新生疾患、肥満、血管芽腫、血管腫、動脈硬化症、炎症性疾患、炎症性障害、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、新生物疾患、骨関連疾患及び乾癬の少なくとも１つの治療方法にも関する。
更に、本発明は治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む哺乳動物における血管透過性または血漿漏出の少なくとも１つの調節方法を提供する。また、本発明は治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む哺乳動物における眼血管新生疾患、肥満、血管芽腫、血管腫、動脈硬化症、炎症性疾患、炎症性障害、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、新生物疾患、骨関連疾患及び乾癬の少なくとも１つの治療方法をも提供する。
更に、本発明は治療有効量の本発明の特異的結合剤及び化学療法剤を投与することを含む哺乳動物における癌の治療方法に関する。当業者は特異的結合剤及び化学療法剤を同時に投与する必要はないと理解している。
また、本発明は治療有効量の本発明の抗体及び化学療法剤を投与することを含む哺乳動物における癌の治療方法に関する。抗体及び化学療法剤を同時に投与する必要はない。
本発明はまた５２６ ＨＣ（配列番号１）、５２８ ＨＣ（配列番号３）、５３１ ＨＣ（配列番号５）、５３３ ＨＣ（配列番号７）、５３５ ＨＣ（配列番号９）、５３６ ＨＣ（配列番号１１）、５３７ ＨＣ（配列番号１３）、５４０ ＨＣ（配列番号１５）、５４３ ＨＣ（配列番号１７）、５４４ ＨＣ（配列番号１９）、５４５ ＨＣ（配列番号２１）、５４６ ＨＣ（配列番号２３）、５５１ ＨＣ（配列番号２５）、５５３ ＨＣ（配列番号２７）、５５５ ＨＣ（配列番号２９）、５５８ ＨＣ（配列番号３１）、５５９ ＨＣ（配列番号３３）、５６５ ＨＣ（配列番号３５）、Ｆ１−Ｃ６ ＨＣ（配列番号３７）、ＦＢ１−Ａ７ ＨＣ（配列番号３９）、ＦＤ−Ｂ２ ＨＣ（配列番号４１）、ＦＥ−Ｂ７ ＨＣ（配列番号４３）、ＦＪ−Ｇ１１ ＨＣ（配列番号４５）、ＦＫ−Ｅ３ ＨＣ（配列番号４７）、Ｇ１Ｄ４ ＨＣ（配列番号４９）、ＧＣ１Ｅ８ ＨＣ（配列番号５１）、Ｈ１Ｃ１２ ＨＣ（配列番号５３）、ＩＡＩ−１Ｅ７ ＨＣ（配列番号５５）、ＩＦ−１Ｃ１０ ＨＣ（配列番号５７）、ＩＫ−２Ｅ２ ＨＣ（配列番号５９）、ＩＰ−２Ｃ１１ ＨＣ（配列番号６１）、５２６カッパ（配列番号２）、５３６カッパ（配列番号１２）、５４３カッパ（配列番号１８）、５４４カッパ（配列番号２０）、５５１カッパ（配列番号２６）、５５３カッパ（配列番号２８）、５５５カッパ（配列番号３０）、５５８カッパ（配列番号３２）、５６５カッパ（配列番号３６）、ＦＥ−Ｂ７カッパ（配列番号４４）、ＦＪ−Ｇ１１カッパ（配列番号４６）、ＦＫ−Ｅ３カッパ（配列番号４８）、ＩＡ１−１Ｅ７カッパ（配列番号５６）、ＩＰ−２Ｃ１１カッパ（配列番号６２）、５２８ラムダ（配列番号４）、５３１ラムダ（配列番号６）、５３３ラムダ（配列番号８）、５３５ラムダ（配列番号１０）、５３７ラムダ（配列番号１４）、５４０ラムダ（配列番号１６）、５４５ラムダ（配列番号２２）、５４６ラムダ（配列番号２４）、５５９ラムダ（配列番号３４）、Ｆ１−Ｃ６ラムダ（配列番号３８）、ＦＢ１−Ａ７ラムダ（配列番号４０）、ＦＤ−Ｂ２ラムダ（配列番号４２）、Ｇ１Ｄ４ラムダ（配列番号５０）、ＧＣ１Ｅ８ラムダ（配列番号５２）、Ｈ１Ｃ１２ラムダ（配列番号５４）、ＩＦ−１Ｃ１０ラムダ（配列番号５８）及びＩＫ−２Ｅ２ラムダ（配列番号６０）のいずれかの相補性決定領域１（ＣＤＲ １）を含む特異的結合剤を提供する。
更に、本発明は５２６ ＨＣ（配列番号１）、５２８ ＨＣ（配列番号３）、５３１ ＨＣ（配列番号５）、５３３ ＨＣ（配列番号７）、５３５ ＨＣ（配列番号９）、５３６ ＨＣ（配列番号１１）、５３７ ＨＣ（配列番号１３）、５４０ ＨＣ（配列番号１５）、５４３ ＨＣ（配列番号１７）、５４４ ＨＣ（配列番号１９）、５４５ ＨＣ（配列番号２１）、５４６ ＨＣ（配列番号２３）、５５１ ＨＣ（配列番号２５）、５５３ ＨＣ（配列番号２７）、５５５ ＨＣ（配列番号２９）、５５８ ＨＣ（配列番号３１）、５５９ ＨＣ（配列番号３３）、５６５ ＨＣ（配列番号３５）、Ｆ１−Ｃ６ ＨＣ（配列番号３７）、ＦＢ１−Ａ７ ＨＣ（配列番号３９）、ＦＤ−Ｂ２ ＨＣ（配列番号４１）、ＦＥ−Ｂ７ ＨＣ（配列番号４３）、ＦＪ−Ｇ１１ ＨＣ（配列番号４５）、ＦＫ−Ｅ３ ＨＣ（配列番号４７）、Ｇ１Ｄ４ ＨＣ（配列番号４９）、ＧＣ１Ｅ８ ＨＣ（配列番号５１）、Ｈ１Ｃ１２ ＨＣ（配列番号５３）、ＩＡＩ−１Ｅ７ ＨＣ（配列番号５５）、ＩＦ−１Ｃ１０ ＨＣ（配列番号５７）、ＩＫ−２Ｅ２ ＨＣ（配列番号５９）、ＩＰ−２Ｃ１１ ＨＣ（配列番号６１）、５２６カッパ（配列番号２）、５３６カッパ（配列番号１２）、５４３カッパ（配列番号１８）、５４４カッパ（配列番号２０）、５５１カッパ（配列番号２６）、５５３カッパ（配列番号２８）、５５５カッパ（配列番号３０）、５５８カッパ（配列番号３２）、５６５カッパ（配列番号３６）、ＦＥ−Ｂ７カッパ（配列番号４４）、ＦＪ−Ｇ１１カッパ（配列番号４６）、ＦＫ−Ｅ３カッパ（配列番号４８）、ＩＡ１−１Ｅ７カッパ（配列番号５６）、ＩＰ−２Ｃ１１カッパ（配列番号６２）、５２８ラムダ（配列番号４）、５３１ラムダ（配列番号６）、５３３ラムダ（配列番号８）、５３５ラムダ（配列番号１０）、５３７ラムダ（配列番号１４）、５４０ラムダ（配列番号１６）、５４５ラムダ（配列番号２２）、５４６ラムダ（配列番号２４）、５５９ラムダ（配列番号３４）、Ｆ１−Ｃ６ラムダ（配列番号３８）、ＦＢ１−Ａ７ラムダ（配列番号４０）、ＦＤ−Ｂ２ラムダ（配列番号４２）、Ｇ１Ｄ４ラムダ（配列番号５０）、ＧＣ１Ｅ８ラムダ（配列番号５２）、Ｈ１Ｃ１２ラムダ（配列番号５４）、ＩＦ−１Ｃ１０ラムダ（配列番号５８）及びＩＫ−２Ｅ２ラムダ（配列番号６０）のいずれかの相補性決定領域２（ＣＤＲ ２）を含む特異的結合剤を提供する。
また、本発明は５２６ ＨＣ（配列番号１）、５２８ ＨＣ（配列番号３）、５３１ ＨＣ（配列番号５）、５３３ ＨＣ（配列番号７）、５３５ ＨＣ（配列番号９）、５３６ ＨＣ（配列番号１１）、５３７ ＨＣ（配列番号１３）、５４０ ＨＣ（配列番号１５）、５４３ ＨＣ（配列番号１７）、５４４ ＨＣ（配列番号１９）、５４５ ＨＣ（配列番号２１）、５４６ ＨＣ（配列番号２３）、５５１ ＨＣ（配列番号２５）、５５３ ＨＣ（配列番号２７）、５５５ ＨＣ（配列番号２９）、５５８ ＨＣ（配列番号３１）、５５９ ＨＣ（配列番号３３）、５６５ ＨＣ（配列番号３５）、Ｆ１−Ｃ６ ＨＣ（配列番号３７）、ＦＢ１−Ａ７ ＨＣ（配列番号３９）、ＦＤ−Ｂ２ ＨＣ（配列番号４１）、ＦＥ−Ｂ７ ＨＣ（配列番号４３）、ＦＪ−Ｇ１１ ＨＣ（配列番号４５）、ＦＫ−Ｅ３ ＨＣ（配列番号４７）、Ｇ１Ｄ４ ＨＣ（配列番号４９）、ＧＣ１Ｅ８ ＨＣ（配列番号５１）、Ｈ１Ｃ１２ ＨＣ（配列番号５３）、ＩＡＩ−１Ｅ７ ＨＣ（配列番号５５）、ＩＦ−１Ｃ１０ ＨＣ（配列番号５７）、ＩＫ−２Ｅ２ ＨＣ（配列番号５９）、ＩＰ−２Ｃ１１ ＨＣ（配列番号６１）、５２６カッパ（配列番号２）、５３６カッパ（配列番号１２）、５４３カッパ（配列番号１８）、５４４カッパ（配列番号２０）、５５１カッパ（配列番号２６）、５５３カッパ（配列番号２８）、５５５カッパ（配列番号３０）、５５８カッパ（配列番号３２）、５６５カッパ（配列番号３６）、ＦＥ−Ｂ７カッパ（配列番号４４）、ＦＪ−Ｇ１１カッパ（配列番号４６）、ＦＫ−Ｅ３カッパ（配列番号４８）、ＩＡ１−１Ｅ７カッパ（配列番号５６）、ＩＰ−２Ｃ１１カッパ（配列番号６２）、５２８ラムダ（配列番号４）、５３１ラムダ（配列番号６）、５３３ラムダ（配列番号８）、５３５ラムダ（配列番号１０）、５３７ラムダ（配列番号１４）、５４０ラムダ（配列番号１６）、５４５ラムダ（配列番号２２）、５４６ラムダ（配列番号２４）、５５９ラムダ（配列番号３４）、Ｆ１−Ｃ６ラムダ（配列番号３８）、ＦＢ１−Ａ７ラムダ（配列番号４０）、ＦＤ−Ｂ２ラムダ（配列番号４２）、Ｇ１Ｄ４ラムダ（配列番号５０）、ＧＣ１Ｅ８ラムダ（配列番号５２）、Ｈ１Ｃ１２ラムダ（配列番号５４）、ＩＦ−１Ｃ１０ラムダ（配列番号５８）及びＩＫ−２Ｅ２ラムダ（配列番号６０）のいずれかの相補性決定領域３（ＣＤＲ ３）を含む特異的結合剤を提供する。
更に、本発明は本発明の特異的結合剤をコードする核酸分子を提供する。
更に、本発明は（ａ）本発明の特異的結合剤を生物学的サンプルと接触させ、（ｂ）前記サンプルへの特異的結合剤の結合の程度を測定することを含む前記サンプル中のアンギオポエチン−２レベルの検出方法に関する。本発明は（ａ）本発明の抗体を生物学的サンプルと接触させ、（ｂ）前記サンプルへの抗体の結合の程度を測定することを含む前記サンプル中のアンギオポエチン−２レベルの検出方法にも関する。
また、本発明は治療有効量の本明細書に記載されているポリペプチドまたは組成物を投与することを含む哺乳動物における望ましくない血管形成の阻止方法に関する。また、本発明は治療有効量の本明細書に記載されているポリペプチドまたは組成物を投与することを含む哺乳動物における血管形成の調節方法に関する。更に、本発明は治療有効量の本明細書に記載されているポリペプチドまたは組成物を投与することを含む哺乳動物における望ましくない血管形成により特徴づけられる腫瘍増殖の抑制方法に関する。更に、本発明は治療有効量の本明細書に記載されているポリペプチドまたは組成物及び化学療法剤を投与することを含む哺乳動物における癌の治療方法に関する。好ましい実施態様において、化学療法剤は５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１及びタキソテールの少なくとも１つである。しかしながら、他の好適な化学療法剤及び他の癌治療剤を使用し得ると認められる。
本発明の特異的結合剤は脱調節となったまたは望ましくない血管形成に関連している多数の疾患を治療するために使用され得ると認められる。前記疾患には、眼血管新生、例えば糖尿病性網膜症を含めた網膜症及び老人性黄斑変性；乾癬；血管芽腫；血管腫；動脈硬化症；炎症性疾患、例えばリウマチ様またはリウマチ性炎症性疾患、特に関節リウマチを含めた関節炎、または他の慢性炎症性疾患、例えば慢性喘息；動脈または移植後アテローム性動脈硬化症；子宮内膜症；並びに新生物疾患、例えば所謂充実性腫瘍及び流動性腫瘍（例えば、白血病）が含まれるが、これらに限定されない。特異的結合剤を投与することにより治療され得る別の疾患は当業者に自明である。これらの例には、肥満、血管透過性、血漿漏出、及び骨粗鬆症を含めた骨関連疾患が含まれるが、これらに限定されない。よって、本発明は脱調節となったまたは望ましくない血管形成に関連している疾患の治療方法に関する。
本発明の他の実施態様は本明細書の開示から容易に分かるであろう。
腫瘍を持つマウスを本発明の抗−Ａｎｇ−２抗体（クローン５３３、５３７または５４４）、コントロール抗体またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて処置したときの腫瘍サイズ（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフを示す。詳細は実施例に記載されている。 本発明のペプチ体ＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ及び１２−９−３−Ｃ並びにコントロールペプチ体、Ｔｉｅ２−Ｆｃ、Ｃ２Ｂ８または５Ｂ１２のそれぞれについて、および完全長ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）について、ｈＡｎｇ−２のＮ末端及びｈＡｎｇ−２のＣ末端に対するエピトープマッピングデータ（Ｏ．Ｄ．３７０）を示す、詳細は実施例に記載されている。 本発明のペプチ体ＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ及び１２−９−３−Ｃ並びにコントロールペプチ体、Ｔｉｅ２−Ｆｃ、Ｃ２Ｂ８または５Ｂ１２のそれぞれについて、および完全長ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）について、ｈＡｎｇ−２のＮ末端及びｈＡｎｇ−２のＣ末端に対するエピトープマッピングデータ（Ｏ．Ｄ．３７０）を示す、詳細は実施例に記載されている。 本発明のペプチ体ＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ及び１２−９−３−Ｃ並びにコントロールペプチ体、Ｔｉｅ２−Ｆｃ、Ｃ２Ｂ８または５Ｂ１２のそれぞれについて、および完全長ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）について、ｈＡｎｇ−２のＮ末端及びｈＡｎｇ−２のＣ末端に対するエピトープマッピングデータ（Ｏ．Ｄ．３７０）を示す、詳細は実施例に記載されている。
本明細書中、セクションの表題は組織化目的のみで使用されており、決して本発明の主題を限定するものと解釈されない。
組換えＤＮＡ分子、タンパク質及び抗体産生のため、及び組織培養及び細胞形質転換のためには一般的方法が使用され得る。酵素反応及び精製方法は通常製造業者の仕様書に従って、またはＳａｍｂｒｏｏｋら（「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーに所在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行）や本明細書に記載されているような慣用手順を用いて当業界で通常実施されているように実施される。特記しない限り、本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、医化学及び製薬化学の実験手順及び方法及びこれに関連して使用されている命名法は当業者に公知であり、当業界で一般的に使用されている。化学合成、化学分析、薬剤の製造、処方及びデリバリー、並びに患者の治療のためには一般的方法が使用され得る。
定義
本明細書の開示に従って使用されているように、特記しない限り以下の用語は次の意味を有すると理解されたい。
用語「Ａｎｇ−２」は、米国特許第６，１６６，１８５号明細書の図６に示されているポリペプチド（“Ｔｉｅ−２リガンド−２”）またはその断片、並びにアレリック変異体、スプライス変異体、誘導体、置換，欠失及び／または挿入変異体、融合ペプチド及びポリペプチド、種間ホモログを含めた関連ペプチドを指す。場合により、Ａｎｇ−２ポリペプチドはその作成方法に応じて追加の末端残基、例えばリーダー配列、標的配列、アミノ末端メチオニン、アミノ末端メチオニン及びリシン残基、及び／またはタグまたは融合タンパク質配列を含んでいてもよいし、含んでなくてもよい。
Ａｎｇ−２またはＡｎｇ特異的結合剤に関連して使用するとき、用語「生物学的活性」はＡｎｇ−２またはＡｎｇ−２特異的結合剤の少なくとも１つの活性特性を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。Ａｎｇ−２の特異的結合剤はＡｎｇ−２の少なくとも１つの生物学的活性に関するアゴニスト、アンタゴニスト、または中和もしくは阻害活性を有し得る。
用語「特異的結合剤」は、他のアンギオポエチンよりも高いアフィニティーでＡｎｇ−２（及び本明細書に定義したその変異体及び誘導体）に結合する分子、好ましくはタンパク質様分子を指す。特異的結合剤はＡｎｇ−２に優先的に結合するタンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質または低分子量化合物であり得る。好ましい実施態様では、本発明の特異的結合剤は公知の方法で得られる抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、触媒抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、及び可溶性または結合形態で標識され得る抗体、或いはその断片、変異体または誘導体、それ自体、または他のアミノ酸配列との組合せである。前記方法には、酵素開裂、化学開裂、ペプチド合成または組換え技術が含まれるが、これらに限定されない。本発明の抗−Ａｎｇ−２特異的結合剤はＡｎｇ−２の一部に結合してＡｎｇ−２の生物学的活性及び／または他のＡｎｇ−２関連活性を調節（例えば、阻害または促進）し得る。
用語「ポリクローナル抗体」は、同一抗原上の異なるエピトープを認識し、そのエピトープに結合する抗体の異種混合物を指す。ポリクローナル抗体は粗な血清調製物から入手され得るか、抗原アフィニテイークロマトグラフィーまたはプロテインＡ／プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー等により精製され得る。
用語「モノクローナル抗体」は 、各モノクローナル抗体が通常抗原上の同一エピトープを認識するように場合により単一ハイブリドーマまたは他の細胞株により、またはトランスジェニック哺乳動物により産生される同一核酸分子によりコードされる抗体を指す。用語「モノクローナル抗体」は、抗体を作成する特定方法を限定しないし、特定種（例えば、マウス、ラット等）で産生される抗体に限定されない。
用語「キメラ抗体」は重鎖及び／または軽鎖の一部が特定種に由来するかまたは特定抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一であるか相同であり、鎖の残部が別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一であるか相同である抗体を指す。また、所望の生物学的活性（すなわち、Ａｎｇ−２に特異的に結合する活性）を発揮する前記抗体の断片も含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号明細書及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８１：６８５１−６８５５（１９８５）参照。
用語「ＣＤＲグラフト化抗体」は、特定の種またはアイソタイプの１つの抗体からのＣＤＲが同一もしくは異なる種またはアイソタイプの別の抗体の骨格に組換え挿入されている抗体を指す。
用語「多重特異性抗体」は、１つ以上の抗原上の２つ以上のエピトープを認識する可変領域を有する抗体を指す。このタイプの抗体のサブクラスは同一もしくは異なる抗原上の２つの別個のエピトープを認識する“二重特異性抗体”である。
“触媒”抗体は、１つ以上の細胞毒性部分、またはより一般的には１つ以上の生物学的活性部分が標的とする結合剤に結合している抗体を指す。
用語「ヒト化抗体」は、抗体骨格枠領域がヒトに由来するが各ＣＤＲが別種由来のもの、例えばマウスＣＤＲで置換されている特定タイプのＣＤＲグラフト化抗体を指す。用語「ＣＤＲ」は上記と同義である。
用語「完全ヒト」抗体は、ＣＤＲ及び骨格の両方が１つ以上のヒトＤＮＡ分子に由来している抗体を指す。
用語「抗−イディオタイプ」抗体は、抗原を認識する別の抗体に特異的に結合する抗体を指す。抗−イディオタイプ抗体は、例えばＡｎｇ−２ポリペプチドまたはその断片よりはＡｎｇ−２特異的抗体またはそのＡｎｇ−２結合断片を用いて動物を免疫化して生ずるような抗体を除くＡｎｇ−２特異的抗体の作成について本明細書に記載されている方法により作成され得る。
本明細書中、用語「変異体」は結合剤の天然に存在する（または、少なくとも公知の）アミノ酸配列にアミノ酸残基を挿入、欠失及び／または置換されているポリペプチドが含まれる。本発明の変異体には以下に記載の融合タンパク質も含まれる。
「誘導体」には、挿入、欠失または置換変異体とは異なる幾つかの方法で化学的に修飾されている結合剤が含まれる。
「Ａｎｇ−２に特異的に結合する」は、（例えば本明細書に記載されているＡｆｆｉｎｉｔｙ ＥＬＩＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより測定した）アフィニティーまたは（例えば本明細書に記載されているＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡアッセイまたは類似アッセイにより測定した）中和能が他のアンギオポエチン、或いは他のペプチドまたはポリペプチドの同一方法で測定したアフィニティーまたは中和能よりも少なくとも１０倍、場合により５０倍、１００，２５０または５００倍、更には少なくとも１０００倍であるように本発明の特異的結合剤（例えば、抗体またはその断片）が成熟、完全長または部分長ヒトＡｎｇ−２ポリペプチドまたはそのオルソログを認識し、結合する能力を指す。
用語「抗原結合ドメイン」または「抗原結合領域」は、抗原と相互作用し、抗原に対する特異性及びアフィニティーを結合剤に付与する特異的結合剤アミノ酸残基（または、他の部分）を含む特異的結合剤（例えば、抗体分子）の一部を指す。抗体において、抗原結合ドメインは通常“相補性決定領域またはＣＤＲ”とも称される。
用語「エピトープ」は、１つ以上の結合剤の抗原結合領域で特異的結合剤（例えば、抗体）により認識され、結合され得る分子の部分を指す。エピトープは通常分子の化学的に活性な表面グループ、例えばアミノ酸または炭水化物側鎖から構成され、特定の３次元構造的特徴及び特定の帯電特徴を有する。本明細書中、エピトープは連続していてもいなくてもよい。更に、エピトープは抗体を作成するために使用されるエピトープと同一の３次元構造からなり、抗体免疫応答を刺激するために使用されるＡｎｇ−２中に存在するアミノ酸残基を全くまたはほんの少ししか含まない点で擬態性であり得る。
用語「阻害及び／または中和エピトープ」は、抗体のような特異的結合剤により結合したときにインビボ、インビトロまたは原位置でエピトープを含む分子、細胞または生物の生物学的活性が喪失（または、少なくとも減少）するエピトープである。本発明において、中和エピトープはＡｎｇ−２の生物学的活性領域に位置しているかまたは関連している。或いは、用語「活性化エピトープ」は、抗体のような本発明の特異的結合剤により結合したときにＡｎｇ−２が活性化されたり、Ａｎｇ−２の生物学的活性なコンフォメーションが少なくとも維持されるエピトープである。
用語「抗体断片」は、完全に無傷の抗体よりも小さいペプチドまたはポリペプチドを指す。完全抗体は２つの機能的に独立した部分または断片、すなわち“Ｆａｂ”として公知の抗原結合断片及び“Ｆｃ”断片として公知のカルボキシ末端結晶可能断片からなる。前記Ｆａｂ断片は、重鎖（ＣＨＩ）及び軽鎖（ＣＨＬ）の双方由来の第１定常ドメインに加えて特定抗原に結合する重鎖及び軽鎖の双方由来の可変領域を含む。重鎖及び軽鎖可変領域はそれぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び各ＣＤＲを分離する骨格アミノ酸残基を含む。前記Ｆｃ領域は第２及び第３重鎖定常領域（ＣＨ２及びＣＨ３）を含み、補体活性化及び食細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与している。幾つかの抗体では、Ｆｃ領域及びＦａｂ領域は、抗体“ヒンジ領域”により分離しており、完全長抗体がタンパク質分解により開裂される方法に依存しており、ヒンジ領域はＦａｂまたはＦｃ断片のいずれかに結合され得る。例えば、抗体をプロテアーゼパパインで開裂すると、Ｆｃ断片にヒンジ領域が結合した断片が生じ、プロテアーゼパパインで切断するとヒンジが両Ｆａｂ断片に同時に結合している断片が生ずる。実際２つのＦａｂ断片はペプシン開裂後共有結合しているので、生じた断片はＦ（ａｂ’）２断片と呼ばれる。
Ｆｃドメインは比較的長い血清半減期を有し得るのに対して、Ｆａｂは短命である（Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９））。融合タンパク質の一部として発現させたとき、Ｆｃドメインはより長い半減期を付与するか、またはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体固定及び多分融合されるタンパク質への胎盤トランスファーのような機能を導入し得る。Ｆｃ領域は天然に存在するＦｃ領域であってもよく、または治療品質または循環時間のようなある品質を改善するように改変されていてもよい。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の軽鎖及び／または重鎖の一部を指し、典型的には重鎖では約１２０〜１３０アミノ末端アミノ酸及び軽鎖では約１００〜１１０アミノ末端アミノ酸を含む。可変領域のアミノ酸配列は通常同一種の抗体の中でも大きく異なる。抗体の可変領域は通常特定抗原に対する特定各抗体の結合性及び特異性を決定する。配列の可変性は相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される領域に集中しており、可変ドメイン中のより高保存領域は骨格領域（ＦＲ）と称される。軽鎖及び重鎖のＣＤＲはその中に抗体と抗原の直接相互作用に大きく関与するアミノ酸を含むが、ＦＲ中のアミノ酸は上記した抗原結合／認識に有意に影響を与え得る。
抗体を参照して使用するとき、用語「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）またはラムダ（λ）と称される２つの別々のタイプをまとめて指す。
抗体を参照して使用するとき、用語「重鎖」は、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと称される５つの別々のタイプをまとめて指す。重鎖及び軽鎖の組合せにより、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの公知クラスの抗体が生ずる。この中には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４と称されるＩｇＧの４つの公知サブクラスが含まれる。
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等のような生物学的材料に関連して使用するとき、用語「天然に存在する」は天然に存在するがヒトにより修飾されていないものを指す。
Ａｎｇ−２またはＡｎｇ−２の特異的結合剤に関連して使用するとき、用語「単離」は、天然環境に存在する少なくとも１つの汚染ポリペプチドまたは化合物を含まない化合物、好ましくは治療または診断用途を妨げる他の汚染哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まない化合物を指す。
Ａｎｇ−２、抗−Ａｎｇ−２抗体またはＡｎｇ−２の他のタンパク質様特異的結合剤に関連して使用するとき、用語「成熟」は、リーダーまたはシグナル配列を欠くペプチドまたはポリペプチドを指す。本発明の結合剤を例えば原核宿主細胞において発現させるとき、“成熟”ペプチドまたはポリペプチドはアミノ末端メチオニンのような追加アミノ酸残基（ただし、リーダー配列を欠く）または１つ以上のメチオニン及びリシン残基を含み得る。このようにして産生したペプチドまたはポリペプチドはこれらの追加アミノ酸残基を除去してから又は除去しないで使用してもよい。
Ａｎｇ−２の特定結合剤に関連して使用するとき、用語「有効量」及び「治療有効量」は、Ａｎｇ−２の１つ以上の生物学的活性のレベルを目に見える程度変化させるのに有用なまたは必要な特異的結合剤の量を指す。前記変化はＡｎｇ−２活性レベルの上昇または低下のいずれであってもよい。好ましくは、前記変化はＡｎｇ−２活性の低下である。
特異的結合剤及び抗体
本明細書中、用語「特異的結合剤」は、本明細書に記載したＡｎｇ−２の認識及び結合に対して特異性を有する分子を指す。好適な特異的結合剤には、抗体及びその誘導体、ポリペプチド及び小分子が含まれるが、これらに限定されない。好適な特異的結合剤は当業界で公知の方法を用いて作成され得る。本発明のＡｎｇ−２ポリペプチド特異的結合剤の１例はＡｎｇ−２ポリペプチドの特定部分に結合し得、好ましくはＡｎｇ−２ポリペプチドの活性または機能を調節し得る。
Ａｎｇ−２ポリペプチドに特異的に結合する抗体や抗体断片のような特異的結合剤は本発明の範囲内である。前記抗体は、単一特異性ポリクローナルを含めたポリクローナル、モノクローナル（ｍＡｂ）、組換え、キメラ、ＣＤＲグラフト化のようなヒト化、ヒト、単鎖、触媒、多重特異性及び／または二重特異性、並びにその断片、変異体及び／または誘導体であり得る。
Ａｎｇ−２ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、通常動物（例えば、家兎、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ラット、アレチネズミ、モルモット、マウスまたは他の適当な哺乳動物、並びに他の非哺乳動物種）においてＡｎｇ−２ポリペプチドまたはその断片をアジュバントと一緒に又はアジュバントなしで皮下または腹腔内に注射することにより産生される。前記アジュバントには、フロイント完全及び不完全アジュバント、無機ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）及び表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノール）が含まれるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルブムも考えられる有用なヒトアジュバントである。抗原ポリペプチドを、免疫化しようとする種において免疫原性である担体タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシチログロブリンまたは大豆シリプシン阻害剤にコンジュゲートすることが有用であり得る。また、免疫応答を高めるためにミョウバンのような凝集剤も使用される。免疫化後、動物を放血させ、血清を抗−Ａｎｇ−２ポリペプチド抗体力価についてアッセイする。前記力価は本明細書の実施例の欄に記載されているアッセイを用いて測定され得る。ポリクローナル抗体は該抗体が検出された血清中で使用され得るか、例えば抗原アフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて血清から精製され得る。
Ａｎｇ−２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、例えば一般的な“ハイブリドーマ”法またはより新しい“ファージディスプレー”法を用いて産生され得る。ただし、これらの方法に限定されない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法［Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法［Ｋｏｓｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８０：２０２６−２０３０（１９８３）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，「モノクローナル抗体作成法及び応用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)」，ｐ．５１−６３，ニューヨークに所在のＭａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９８７年）発行］及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法［Ｃｏｌｅら，「モノクローナル抗体及び癌治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」，ｐ．７７−９６，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＡｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．（１９８５年）発行］を用いて作成され得る。本発明はＡｎｇ−２ポリペプチドと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も提供する。
ハイブリドーマ法を使用する場合、ミエローマ細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ産生融合方法で使用するのに適した細胞株は、好ましくは非抗体産生であり、高い融合効率を有し、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支える特定の選択培地では増殖し得ないようにする酵素欠乏性を有する。例えば、マウス融合に使用される細胞株はＳｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ １１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌである。ラット融合に使用される細胞株はＲ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及びＲＢ２１０である。細胞融合に使用される他の細胞株はＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６である。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び他の細胞株は本発明の新規組成物であると考えられる。
ファージディスプレー法は任意の種からモノクローナル抗体を作成するためにも使用され得る。好ましくは、この方法は単一ＦａｂまたはＦｖ抗体断片をコードするポリヌクレオチドがファージ粒子の表面上で発現している完全ヒトモノクローナル抗体を産生するために使用される（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）；米国特許第５，８８５，７９３号明細書も参照）。Ａｎｇ−２に対してアフィニティーを有する抗体断片を同定するために各ファージを本明細書に記載されている結合アッセイを用いてスクリーニングにかけてもよい。よって、これらの方法は糸状バクテリオファージの表面上に抗体断片レパートリーを表示することによる免疫選択及びその後のＡｎｇ−２に対する結合によるファージの選択を真似ている。前記方法の１つがＡｄａｍｓらの国際特許出願第ＵＳ９８／１７３６４号明細書に記載されており、ここには前記方法を用いたＭＰＬ−及びマスク−受容体に対する高アフィニティー及び機能性アゴニスト抗体断片の単離が記載されている。この方法では、ヒト抗体遺伝子の完全レパートリーは前記（Ｍｕｌｌｉｎａｘら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８７：８０９５−８０９９（１９９０））に記載されているように末梢血リンパ球由来の天然に再編成したヒトＶ遺伝子をクローニングすることにより作成され得る。
本発明の完全長モノクローナル抗体の各鎖、ＦａｂまたはＦｖ断片をコードするポリヌクレオチド配列が同定されたら、当業界で公知であり且つ日常的に実施されている組換え法によりモノクローナル抗体ポリヌクレオチドを発現させるために真核または原核宿主細胞が使用され得る。或いは、所望の特異的結合剤をコードするポリヌクレオチド配列がモノクローナル抗体または他の特異的結合剤をコードするポリヌクレオチド分子を発現させ得るようにレシピエント動物（例えば、マウス、家兎、ヤギまたはウシ）のゲノムに導入されているトランスジェニック動物を作成する。１つの態様では、モノクローナル抗体または他の特異的結合剤をコードするポリヌクレオチドを哺乳動物特異的調節配列にライゲートし得、キメラポリヌクレオチドを標的動物の生殖細胞系に導入し得る。次いで、生じたトランスジェニック動物はその乳に所望の抗体を産生する（Ｐｏｌｌｏｃｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，２３１：１４７−１５７（１９９９）；Ｌｉｔｔｌｅら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，８：３６４−３７０（２０００））。更に、モノクローナル抗体または他の特異的結合剤をコードするポリヌクレオチドを適当な植物にトランスフェクトすることによりモノクローナル抗体のようなＡｎｇ−２特異的結合剤を発現させ、産生させるために植物を使用し得る。
本発明の別の実施態様では、ヒト種以外の他の種由来のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはその断片をヒト化またはキメラ化してもよい。非ヒト抗体のヒト化方法は当業界で公知である（米国特許第５，８５９，２０５号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書参照）。ヒト化は、例えば当業界で公知の方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））を用いて例えばげっ歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒト抗体の対応領域で置換することにより実施される。本発明は、本明細書に記載されており、当業界で公知の前記ヒト抗体の変異体及び誘導体も提供する。
Ａｎｇ−２ポリペプチドに結合する完全ヒト抗体もその断片、変異体及び／または誘導体も本発明に包含される。前記抗体は上記したファージディスプレー法により産生され得る。或いは、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を前記抗体を作成するために使用し得る。これは、Ａｎｇ−２断片がＡｎｇ−２に対してユニークなアミノ酸配列を有するＡｎｇ−２抗原またはその断片を用いて動物を免疫化することにより実施され得る。場合により前記免疫原を担体にコンジュゲートさせてもよい。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９６）参照。１つの方法では、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードする内在性座を無能にし、ヒト重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする座をそのゲノムに挿入することにより産生される。次いで、完全補体よりも少ない修飾を有する部分修飾動物を交雑すると、所望の免疫系修飾をすべて有する動物が得られる。免疫原を投与すると、トランスジェニック動物は所望抗原に対して免疫特異性である（例えばマウスよりもむしろ）ヒトアミノ酸配列を含めたヒト可変領域を有する抗体を産生することができる。国際特許出願第ＵＳ９６／０５９２８号明細書及び同第ＵＳ９３／０６９２６号明細書参照。別の方法は米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際特許出願第ＵＳ９１／２４５号明細書、国際特許出願第ＧＢ８９／０１２０７号明細書、欧州特許第５４６０７３号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３号明細書に記載されている。ヒト抗体は、宿主細胞において組換えＤＮＡ発現させたり、本明細書に記載されているハイブリドーマ細胞を発現させることによっても産生され得る。
遺伝子導入は多種多様の方法で実施される。例えば、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７：３９１−７（１９９６）参照。１つの方法では、生殖細胞系コンフィギュレーションの遺伝子セグメントが相互に人工的に近づくようにミニ座を構築する。（通常３０ｋｂ未満の）サイズの制限のために、生じたミニ座は限定数の異なる遺伝子セグメントを含むが、依然として多数の抗体レパートリーを産生し得る。プロモーター及びエンハンサーを含めてヒトＤＮＡ配列のみを含むミニ座がトランスジェニックマウスにおいて完全に機能性である。
トランスジェニック動物において多数の遺伝子セグメントが所望されるときには、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いる。ＹＡＣは数百キロｋｂ〜１Ｍｂの範囲であり得、卵に直接マイクロインジェクションすることにより、またはＹＡＣを胚性幹（ＥＳ）細胞株に導入することによりマウス（または他の適当な動物）ゲノムに導入する。通常、ＹＡＣを精製ＤＮＡまたは精製ＤＮＡをミセル中に含む酵母スフェロプラスト融合物のリポフェクションによりＥＳ細胞に導入し、融合はハイブリドーマ融合プロトコルに類似の方法で実施する。ＤＮＡ導入後の所望ＥＳ細胞の選択は当業界で公知の選択マーカーをＹＡＣに導入することにより実施される。
別の方法として、細菌大腸菌中で増幅されるバクテリオファージＰ１ベクターを用いる。前記ベクターは通常ＹＡＣよりも少ない挿入ＤＮＡを有しているが、クローンはマウス卵に直接マイクロインジェクションするのに十分な収率で容易に増殖する。各種Ｐ１ベクターのカクテルの使用により高レベルの相同組換えが生ずることは判明している。
循環抗体の血清レベルを検出するための当業界で公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて適当にトランスジェニックマウス（または、他の適当な動物）が同定されたら、このトランスジェニック動物は内在性Ｉｇ座が破壊されているマウスと交配させる。こうすると、本質的に全てのＥＳ細胞がヒト抗体を発現する子孫が生ずる。
更に別の方法として、全動物Ｉｇ座をヒトＩｇ座で置換すると、生じた動物はヒト抗体のみを発現する。別の方法では、動物座の一部をヒト座中の特定の対応領域で置換する。ある場合には、この方法により生じた動物はマウスＩｇ座の置換の種類に応じて完全ヒト抗体とは対照的にキメラ抗体を発現し得る。
ヒト抗体はインビトロでヒト脾細胞（ＢまたはＴ細胞）を抗原に曝した後発現細胞を免疫無防備状態の細胞（例えば、ＳＣＩＤまたはｎｏｄ／ＳＣＩＤ）において再編成することによっても産生され得る。Ｂｒａｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６０：２０５１−２０５８（１９９８）；Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６：１０３−１０６（２０００）参照。１つの方法では、ヒト胎児組織をＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ）に移植すると長期間にわたり造血及びヒトＴ細胞発生が生ずる（ＭｃＣｕｎｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１５３２−１６３９（１９８８）；Ｉｆｖｅｒｓｅｎら，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：２４３−２４８（１９９６））。前記キメラマウスにおける液性免疫応答は動物中のＴ細胞の同時発生に完全に依存している（Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８３：１２７１−１７９（１９９４））。別の方法では、ヒト末梢血リンパ球を腹腔内（または他の方法で）ＳＣＩＤマウスに移植する（Ｍｏｓｉｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：２５６−２５９（１９８８））。移植した細胞をブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）（Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８４：２２４−２３０（１９９５））のようなプライミング剤または抗−ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｍｕｒｐｈｙら，Ｂｌｏｏｄ，８６：１９４６−１９５３（１９９５））で処理すると、高レベルのＢ細胞産生が検出される。
或いは、完全合成ヒト重鎖レパートリーは、非再編成Ｖ遺伝子セグメントから各ヒトＶＨセグメントをランダムヌクレオチドのＤセグメント及びヒトＪセグメントと集合することにより構築される（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２））。同様に、軽鎖レパートリーは各ヒトＶセグメントをＪセグメントと集合することにより構築される（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：３２４５−３２６０（１９９４））。完全抗体をコードするヌクレオチド（すなわち、重鎖及び軽鎖）を単鎖Ｆｖ断片として連結し、このポリヌクレオチドを糸状ファージマイナーコートタンパク質をコードするヌクレオチドにライゲートする。この融合タンパク質をファージの表面上で発現させると、特異的抗体をコードするポリヌクレオチドが固定化抗原を用いる選択により同定される。
更に別の方法では、抗体断片を１つの鎖をファージタンパク質に融合し、他の鎖を細菌ペリプラズムに分泌することにより２つのＦａｂ断片として集合させる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７（１９９１）；Ｂａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８８：７９７８−７９８２（１９９１））。
キメラ、ヒト化、ＤＣＲ−グラフト化及び完全ヒト抗体、またはその断片は通常組換え法により大規模に産生される。各抗体またはその断片の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチド分子は、本明細書に記載されている材料及び手順を用いて宿主細胞に導入され、発現される。好ましい実施態様では、抗体は哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において産生される。前記産生の詳細については以下に記載する。
特異的結合剤の融合パートナー
本発明の更なる態様で、Ａｎｇ−２抗体のアミノ酸配列可変領域、例えば本明細書に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域または本明細書に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むポリペプチドをＮ末端またはＣ末端でヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上に融合させてもよい。Ａｎｇ−２特異的抗体のＦｂのような治療用タンパク質と一緒に構築した場合、Ｆｃドメインはより長い半減期を与え得るかまたはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体固定及び多分胎盤トランスファーのような機能を導入し得る（Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９））。
１例では、抗体ヒンジのＣＨ２及びＣＨ３領域は、当業界で公知の方法を用いて特異的結合剤ポリペプチド、例えば（例えばファージディスプレーライブラリーから得られる）抗−Ａｎｇ−２ ＦａｂまたはＦｖ断片のＮまたはＣ末端で融合され得る。生じた融合タンパク質はプロティンＡまたはプロティンＧアフィニティーカラムを用いて精製され得る。Ｆｃ領域に融合させたペプチド及びタンパク質は、非融合対応物よりも実質的に長いインビボ半減期を示すことが判明した。また、Ｆｃ領域に融合させると、融合ポリペプチドはダイマー化／マルチマー化し得る。Ｆｃ領域は天然に存在するＦｃ領域であるかまたは治療品質、循環時間、低い凝集問題等のような特定の品質を改善するように改変され得る。当業界で公知の他の例には、ヒトまたは別の種であり得るかまたは合成物であり得るＦｃ領域がホジキン病、未分化リンパ腫及びＴ細胞白血病を治療するためにＣＤ３０ＬのＮ末端に融合しているもの（米国特許第５，４８０，９８１号明細書）、Ｆｃ領域が敗血症性ショックを治療するためにＴＮＦ受容体に融合しているもの（Ｆｉｓｈｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：１６９７−１７０２（１９９６））、及びＦｃ領域がＡＩＤＳを治療するためにＣｄ４受容体に融合しているもの（Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−３１（１９８９））が含まれる。
触媒抗体は融合分子の別のタイプであり、この中には１つ以上の細胞毒性部分、より一般的には１つ以上の生物学的活性部分が特異的結合剤に結合している抗体が含まれる。例えば、Ｒａｄｅｒら，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，１２：２０９１−２０９５（２０００）を参照されたい。このタイプの細胞毒性剤は抗体媒介細胞毒性を改善し、この中には直接または間接的に細胞死を刺激するサイトカイン、放射性同位元素、（プロドラッグを含めた）化学療法剤、細菌毒素（例えば、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素等）、植物毒素（例えば、リシン、ゲロニン等）、化学コンジュゲート（例えば、メイタンシノイド毒素、ｃａｌｅｃｈａｅｍｉｃｉｎ等）、ラジオコンジュゲート、酵素コンジュゲート（ＲＮａｓｅコンジュゲート、抗体酵素／プロドラッグ治療（ＡＤＥＰＴ））等のような部分が含まれる。１つの態様では、細胞毒性剤は、二重特異性または多重特異性抗体の１成分にこの抗体上の別の抗原認識部位の１つに前記物質を結合することにより“結合”され得る。別の態様として、タンパク質細胞毒をコードするポリヌクレオチドを結合剤をコードするポリヌクレオチドにライゲートした後前記毒を特異的結合剤との融合タンパク質として発現し得る。別の態様では、特異的結合剤を所望細胞毒を含むように共有的に修飾してもよい。
前記融合タンパク質の例は、長い循環半減期を有する免疫原性ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、免疫グロブリン定常領域）、マーカータンパク質、所望の特異的結合剤ポリペプチドの精製を容易とするタンパク質またはポリペプチド、及びマルチマータンパク質の形成を促進するポリペプチド配列（例えば、ダイマー形成／安定性に有用なロイシンジッパーモチーフ）である。
このタイプの挿入変異体は、通常ＮまたはＣ末端で第２ポリペプチドの全部または一部に結合した天然分子の全部または実質的部分を有する。例えば、融合タンパク質は通常異種宿主でタンパク質が組換え発現し得るように別の種由来のリーダー配列を使用している。別の有用な融合タンパク質は、融合タンパク質の精製を容易とするために抗体エピトープのような免疫学的に活性なドメインの付加を含む。融合ジャンクションまたはその近くに開裂部位を挿入すると、精製後異質ポリペプチドの除去が容易となる。他の有用な融合には、酵素由来の活性部位のような機能的ドメイン、グリコシル化ドメイン、細胞標的シグナルまたは貫膜領域の連結が含まれる。
本発明で使用され得る融合タンパク質発現システムは多数市販されている。特に有用なシステムには、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＣＳＴ）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、マルトース結合タンパク質システム（マサチューセッツ州ビバリーに所在のＮＥＢ）、ＦＬＡＧシステム（コネティカット州ニューヘーブンに所在のＩＢＩ）及び６ｘＨｉｓシステム（カリフォルニア州チャッツワースに所在のＱｉａｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されない。これらのシステムは、組換えポリペプチドの抗原能に殆ど影響を及ぼさない追加アミノ酸を少ししか持たない組換えポリペプチドを産生し得る。例えば、ＦＬＡＧシステム及び６ｘＨｉｓシステムは、抗原性に乏しいことが知られており且つポリペプチドの天然コンフォーメーションへのフォールディングに悪影響を及ぼさない短い配列のみを付加する。有用であると考えられる別のＮ末端融合はタンパク質またはペプチドのＮ末端領域でのＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合である。そのような融合により、タンパク質発現または活性が十分に上昇し得る。
特に有用な融合構築物は、例えば本発明の抗−イディオタイプ抗体の産生において有用な特異的結合剤融合構築物の免疫原性を高めるために特異的結合剤ペプチドがハプテンに融合しているものであり得る。前記した免疫原性を高めるための融合構築物は当業者に公知であり、例えば特異的結合剤のヘルパー抗原（例えば、ｈｓｐ７０またはジフテリア毒素鎖由来のようなペプチド配列）またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）との融合物が免疫応答を引き出すのに有用であろう。１つの実施態様では、抗原結合剤組成物の特定の部位または細胞へのターゲッティングを高める融合構築物が作成され得る。
所望の特性を有する異種ポリペプチド、例えばターゲッティングのために血清半減期を延長させるＩｇ定常領域、または抗体またはその断片を含む他の融合構築物も意図される。他の融合システムは、所望ポリペプチドから融合パートナーを切り出すことが望ましいポリペプチドハイブリッドを産生する。１つの実施態様では、融合パートナーをプロテアーゼに対する特異的認識配列を含むペプチド配列により組換え特異的結合剤ポリペプチドに連結させる。好適な配列の例は、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓプロテアーゼ（メリーランド州ゲーザーズバーグに所在のＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または因子Ｘａ（マサチューセッツ州ビバリーに所在のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により認識されるものである。
本発明はまた、Ａｎｇ−２抗体の可変領域、例えば本明細書に記載されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域または本明細書に記載されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の全部または一部を腫瘍血管凝固剤として作用するヒト凝固誘導タンパク質の切断タイプからなる血管ターゲッティング剤、切断組織因子（ｔＴＦ）と一緒に含む融合ポリペプチドを提供する。ｔＴＦの抗−Ａｎｇ−２−抗体またはその断片に融合させると、抗−Ａｎｇ−２の標的細胞へのデリバリーが容易となり得る。
特異的結合剤の変異体
本発明の特異的結合剤の変異体には挿入、欠失及び／または置換変異体が含まれる。本発明の１態様では、１つ以上のアミノ酸残基が特異的結合剤アミノ酸配列に付加されている挿入変異体が提供される。挿入はタンパク質の片方もしくは両方の末端に位置してもよく、或いは特異的結合剤アミノ酸配列の内部領域内に位置していてもよい。片方もしくは両方の末端に追加残基を有する挿入変異体の例には、融合タンパク質及びアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれる。挿入変異体には、１つ以上のアミノ酸残基が特異的結合剤アミノ酸配列に付加されている特異的結合剤ポリペプチドまたはその断片が含まれる。
本発明の変異体産物には成熟特異的結合剤産物も含まれる。前記した特異的結合剤産物では、リーダー配列またはシグナル配列が除去されているが、生じたタンパク質は野生型Ａｎｇ−２ポリペプチドに比して追加のアミノ末端残基を有する。追加アミノ末端残基は他のタンパク質から誘導され得るか、または特定タンパク質から誘導されるものとして同定され得ない１つ以上の残基を含み得る。１位に追加メチオニン残基を有する特異的結合剤産物（Ｍｅｔ−１−特異的結合剤）及び２位及び１位に追加のメチオニン及びリシン残基を有する特異的結合剤（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−特異的結合剤）も意図される。追加のＭｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ残基（または、通常１つ以上の塩基性残基）を有する特異的結合剤の変異体は細菌宿主細胞における組換えタンパク質産生を高めるために特に有用である。
本発明はまた、特定発現系を使用して生ずる追加アミノ酸残基を有する特異的結合剤変異体も包含する。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合産物の一部として所望ポリペプチドを発現する市販されているベクターを使用すると、所望ポリペプチドからＧＳＴ成分を切断後アミノ酸１位に追加グリシン残基を有する所望ポリペプチドが得られる。ポリヒスチジンタグをアミノ酸配列に通常配列のカルボキシ及び／またはアミノ末端に組み込んだものを含めた他のベクター系での発現により生ずる変異体も考えられる。
挿入変異体には、特異的結合剤ポリペプチドのアミノ及び／またはカルボキシ末端が他のポリペプチドまたはその断片、または特定タンパク質配列の一部として通常認識されないアミノ酸配列に融合している上記した融合タンパク質も含まれる。
別の態様として、本発明は特異的結合剤ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失は特異的結合剤ポリペプチドの片方もしくは両方の末端で生ずるか、或いは特異的結合剤アミノ酸配列内の１つ以上の残基の除去により生じ得る。欠失変異体は必ず特異的結合剤ポリペプチドの全断片を含んでいる。
抗体断片は抗原ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体の部分を含む。前記断片の例には、例えば完全長抗体の酵素的または化学的開裂により生ずるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。他の結合断片には、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現のような組換えＤＮＡ法により生ずるものが含まれる。本発明はまた、Ａｎｇ−２ポリペプチドに特異的に結合し得る能力を維持しているＡｎｇ−２結合剤のポリペプチド断片を包含する。本発明では、本発明のペプチドまたはポリペプチドの連続アミノ酸を少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれ以上含む断片が含まれる。好ましいポリペプチド断片は本発明の抗原結合剤に対してユニークまたは特異的な免疫学的特性を示す。所望の免疫学的性質を有する本発明の断片は当業界で公知であり、日常的に実施されている方法により作成され得る。
別の態様として、本発明は本発明の特異的結合剤の置換変異体を提供する。置換変異体は通常オリジナルポリペプチドに“類似”しているかまたはオリジナルポリペプチドにある程度の“同一性”を有していると見做され、この中にはポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が除去されて別の残基で置換されているポリペプチドが含まれる。１つの態様で置換は保存性であるが、本発明は非保存性な置換も包含する。
関連ポリペプチドの同一性及び類似性は公知方法により容易に計算され得る。前記方法には、計算的分子生物学(Computational Molecular Biology)，Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編，ニューヨークに所在のオックスフォード大学出版（１９８８年）発行；「バイオコンピューティング：インフォーマティックス及びゲノムプロジェクト(Biocomputing: Informatis and Genome Projects)」，Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編，ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）発行；「配列データーのコンピューター分析(Computer Analysis of Sequence Data)」，第１部，Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ及びＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編，ニュージャージに所在のＨｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９４年）出版；「分子生物学における配列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)」，Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）発行；「配列分析プライマー(Sequence Analysis Primer)」，Ｍ．Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編，ニューヨークに所在のＭ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）発行；及びＧａｒｉｌｌｏら，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。
２つのポリペプチドの関連性または同一％を測定するための好ましい方法は試験した配列間の最大整合を与えるように設計されている。同一性の測定方法は公開されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）；ウィスコンシン州マディソンに所在のウィスコンシン大学のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０））を含めたＧＣＧプログラムパッケージが含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ；上掲のＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）から入手可能である。公知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用され得る。
２つのアミノ酸配列をアラインするための或るアラインメントスキームにより、２つの配列の短領域が整合され、この小さなアライン領域は２つの完全長配列間に有意な関係がないとしても非常に高い配列同一性を有し得る。従って、ある実施態様では、選択したアライン方法（ＧＡＰプログラム）により、比較する標的ポリペプチドの完全長の少なくとも１０％、すなわち少なくとも４００アミノ酸の配列を比較するときには少なくとも４０個の連続アミノ酸、少なくとも３００〜約４００アミノ酸の配列を比較するときには３０個の連続アミノ酸、２００〜約３００アミノ酸の配列を比較するときには少なくとも２０個の連続アミノ酸、及び約１００〜２００アミノ酸の配列を比較するときには少なくとも１０個の連続アミノ酸の範囲のアラインメントが生ずる。
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（ウィスコンシン州マディソンに所在のウィスコンシン大学のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、配列の同一％を調べようとする２つのポリペプチドを各アミノ酸の最適整合のためにアラインさせる（アルゴリズムにより測定した“マッチドスパン”）。ある実施態様では、前記アルゴリズムと組み合わせて、ギャップオープニングペナルテイー（通常３×平均ダイアゴナルとして計算する；“平均ダイアゴナル”は使用した比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；“ダイアゴナル”は特定比較マトリックスによる各完全アミノ酸マッチに帰属されるスコアまたは数である）、ギャップ延長ペナルティー（通常ギャップオープニングペナルテイーの１／１０倍）及び比較マトリックス（例えば、ＰＡＭ ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２）が使用される。ある実施態様では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスの場合にはＤａｙｈｏｆｆら，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５（３）（１９７８）；ＢＬＯＳＵＭ ６２コンピューターマトリックスの場合にはＨｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２））もアルゴリズムにより使用される。
ある実施態様では、ポリペプチド配列比較のためのパラメーターには、
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）、
比較マトリックス：上掲のＨｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）のＢＬＯＳＵＭ ６２、
ギャップペナルティー：１２、
ギャップ長ペナルティー：４、
類似性の閾値：０
が含まれる。
ＧＡＰプログラムは上記パラメーターで使用され得る。ある実施態様では、上記パラメーターはＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（エンドギャップに対してはペナルティーなしで）のためのデフォルトパラメーターである。
ある実施態様では、ポリペプチド分子配列比較のためのパラメーターには、
アルゴリズム：上掲のＮｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）、
比較マトリックス：マッチ＝＋１０，ミスマッチ＝０、
ギャップペナルティー：５０、
ギャップ長ペナルティー：３
が含まれる。
ＧＡＰプログラムは上記パラメーターでも使用され得る。上記パラメーターはポリヌクレオチド分子比較のためのデフォルトパラメーターである。
プログラムマニュアル，ウィスコンシンパッケージ、バージョン９（１９９７年９月）に記載されているものを含めた他の例示アルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップ延長ペナルティー、比較マトリックス、類似性の閾値等が使用され得る。なされる特定選択は当業者に自明であり、なされる特定比較、例えばＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ、更には比較が所与の対の配列間（ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔの場合に通常好ましい）または１つの配列と配列の大きなデーターベース間（ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡの場合に好ましい）で比較するかどうかに依存する。
本明細書中、２０個の慣用アミノ酸及びその略号は一般的使用法に従う。援用により本明細書に含まれるとする「免疫学―合成(Immunology - A Synthesis)」，第２版，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ及びＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編，マサチューセッツ州サンダーランドに所在のＳｉｎａｕｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９１年）発行を参照されたい。
アミノ酸は（ＬでもＤでもないＧｌｙを除いて）ＬまたはＤ立体化学を有し得、本発明のポリペプチド及び組成物は立体化学の組合せからなり得る。しかしながら、Ｌ立体化学が好ましい。本発明はまた、アミノ酸のアミノ末端−カルボキシ末端配列が逆転している逆分子を提供する。例えば、正常な配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する分子の逆はＸ３−Ｘ２−Ｘ１である。本発明はまた、上記したようにアミノ酸のアミノ末端−カルボキシ末端が逆で、通常“Ｌ”エナンチオマーである残基が“Ｄ”立体異性体形態に変化しているレトロ逆分子を提供する。
２０個の慣用アミノ酸、非天然アミノ酸（例えば、α−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非慣用アミノ酸）の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）も本発明のポリペプチドに対する好適な成分であり得る。非慣用アミノ酸の例には、アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、ジアミノ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の類似アミノ酸及びアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれるが、これらに限定されない。
また、特記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端である。二本鎖ポリヌクレオチドの左手方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加方向は転写方向と称される。ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上のＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’にある配列領域は“上流配列”と称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上のＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’にある配列領域は“下流配列”と称される。
保存的アミノ酸置換は、生物学的系での合成よりもむしろ通常化学的ペプチド合成により挿入される非天然アミノ酸残基を含み得る。これらにはペプチド擬態及びアミノ酸部分の他の逆または反転形態が含まれる。
天然残基は共通の側鎖特性に基づいて分類され得る：
１）疎水性：Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ、
２）中性親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ、
３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ、
４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ、
５）鎖方位に影響を与える残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ、及び
６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ。
例えば、非保存的置換は上記クラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを含み得る。前記の置換される残基は非ヒト抗体に相同のヒト抗体の領域または分子の非相同領域に導入され得る。
上記変化を加える場合、ある実施態様によればアミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。各アミノ酸に対してその疎水性及び電荷特性に基づいて次のようにヒドロパシー指数が割り当てられている。イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋４．２）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）。
タンパク質に対して相互作用の生物学的機能を付与する際のアミノ酸ヒドロパシー指数の重要性は当業界で理解されている（Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２））。特定のアミノ酸がなお類似の生物学的活性を保持しながら類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換され得ることは公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を加える場合、ある実施態様ではヒドロパシー指数が±２以内のアミノ酸の置換が考えられる。ある実施態様では±１以内のアミノ酸の置換が考えられ、ある実施態様では±０．５以内のアミノ酸の置換が考えられる。
類似アミノ酸の置換は親水性に基づいて、特に生成される生物学的機能性タンパク質またはペプチドを本発明のように免疫学的実施態様に使用したい場合には効果的になされ得ることは当業界で理解されている。ある実施態様では、隣接するアミノ酸の親水性により決定されるタンパク質の最高局部平均親水性(local average hydrophilicity)はその免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性に相関している。
各アミノ酸残基に対して以下のように親水性値が割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を加える場合、ある実施態様では親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が考えられる。ある実施態様では±１以内のアミノ酸の置換が考えられ、ある実施態様では±０．５以内のアミノ酸の置換が考えられる。親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は“エピトープコア領域”とも呼ばれる。
アミノ酸置換の例を表１に示す。
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当業者は公知の技術を用いて本明細書に記載されているポリペプチドの適当な変異体を決定することができる。ある実施態様では、当業者は活性にとって重要でないと考えられている領域をターゲッティングすることにより活性を破壊することなく変化を加えられ得る分子の適当な領域を同定することができる。ある実施態様では、当業者は類似ポリペプチドの中で保存される分子の残基及び部分を同定することができる。ある実施態様では、生物学的活性または構造にとって重要であり得る領域にも生物学的活性を破壊したりポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸置換を加えることができる。
更に、当業者は活性または構造にとって重要である残基を類似ポリペプチド中で同定する構造−機能研究を検討することができる。比較のために、類似のタンパク質において活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に相当するタンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者はこのように予測された重要なアミノ酸残基に対して化学的に類似のアミノ酸置換を選択し得る。
当業者は、類似ポリペプチドの中で３次元構造及び前記構造に対するアミノ酸配列を分析することもできる。前記情報にてらして、当業者は３次元構造に対する抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測し得る。ある実施態様では、当業者はタンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与し得るので、前記残基に対してラジカル変化を加えないように選択することができる。更に、当業者はそれぞれの所望アミノ酸残基で１つのアミノ酸置換を含む試験変異体を作成することができる。その後、前記変異体は当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。前記変異体は適当な変異体に関する情報を集めるために使用することができる。例えば、特定アミノ酸残基に変化を加えて破壊された、望ましくなく低下した、または不適当な活性が生ずることを知見したならば、そのような変化を有する変異体は避けられ得る。換言すると、ルーチンな実験から集めた情報に基づいて、当業者は単独でまたは他の変異と併せて更なる置換を避けなければならないアミノ酸を容易に決定することができる。
二次構造を予測するために多数の科学文献が発表されている。Ｊ．Ｍｏｕｌｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）；Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６；及びＣｈｏｕら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）を参照されたい。また、二次構造を予測するのを助けるためにコンピュータープログラムが現在利用されている。二次構造を予測する１つの方法はホモロジーモデリングに基づいている。例えば、３０％以上の配列同一性または４０％以上の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質はしばしば類似の構造トポロジーを有する。ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の可能性ある襞の数を含めた二次構造の予測性が向上したタンパク質構造データーベース（ＰＤＢ）が最近開発された。Ｈｏｌｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質における襞の数は限られており、決定的な数の構造が解明されたら構造予測は劇的により正確になるであろうと示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
二次構造を予測する別の方法には、“縫合(threading)”（Ｄ．Ｊｏｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、“プロフィール分析”（Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５３−４３５８（１９８７））及び“進化的連結”（上掲のＨｏｌｍ（１９９９）；上掲のＢｒｅｎｎｅｒ（１９９７））が含まれる。
ある実施態様では、抗体変異体はグリコシル化部位の数及び／または種類が親ポリペプチドのアミノ酸配列と比して異なっているグリコシル化変異体を含む。ある実施態様では、タンパク質変異体は天然タンパク質に比してより多いまたはより少ないＮ−結合グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここで、Ｘで表されるアミノ酸残基はプロリン以外のアミノ酸残基であり得る）により特徴づけられる。この配列が生ずるようにアミノ酸残基を置換すると、Ｎ−結合炭水化物鎖を付加するための新しい部位が与えられる。或いは、この配列を除去する置換では、既存のＮ−結合炭水化物鎖が除去される。１つ以上のＮ−結合グリコシル化部位（典型的には、天然に存在するＮ−結合グリコシル化部位）が除去され、１つ以上の新しいＮ−結合部位が作成されているＮ−結合炭水化物鎖の再構成も考えられる。別の好ましい抗体変異体には、親アミノ酸配列に比して１つ以上のシステイン残基が別のアミノ酸（例えば、セリン）から欠失しているかまたは別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されているシステイン変異体が含まれる。システイン変異体は、不溶性封入体を単離した後のように抗体を生物学的に活性なコンフォメーションにリフォールディグしなければならないときに有用であり得る。システイン変異体は通常天然タンパク質よりも少ないシステイン残基を有しており、通常対でないシステインから生ずる相互作用を最小限とするために偶数を有する。
ある実施態様では、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるもの、（２）酸化に対する感受性を低下させるもの、（３）タンパク質複合体を形成するために結合アフィニティーを変化させるもの、（４）結合アフィニティーを変化させるもの及び／または（５）ポリペプチドに対して他の機能性を付与または修飾するものである。ある実施態様によれば、天然配列に（ある実施態様では、分子間コンタクトを形成するドメイン外のポリペプチドの部分に）１つまたは複数のアミノ酸置換（ある実施態様では、保存的アミノ酸置換）を加えることができる。ある実施態様では、保存的アミノ酸置換により通常親配列の構造特徴が実質的に変化しないことがある（例えば、置換アミノ酸は親配列で見られるヘリックスを分解したり、親配列を特徴づける二次構造の他のタイプを壊す傾向を有してはならない）。当業界で認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例は、「タンパク質、構造及び分子原理(Proteins, Structures and Molecular Principles)」，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編，ニューヨークに所在のＷ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４年）発行；「タンパク質構造入門(Introduction to Protein Structure)」，Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ及びＪ．Ｔｏｏｚｅ編，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＧａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９１年）発行；Ｔｈｏｒｎｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
ポリペプチドまたはペプチド置換変異体である本発明の特異的結合剤分子は、オリジナルのアミノ酸配列の約１０〜１２％まで置換されていてもよい。抗体変異体の場合、重鎖は５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個の置換アミノ酸を有し得、軽鎖は２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個の置換アミノ酸を有し得る。
特異的結合剤の誘導体
本発明は特異的結合剤ポリペプチドの誘導体も提供する。この誘導体にはアミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外の修飾を有する特異的結合剤ポリポプチドが含まれる。好ましくは、修飾は共有結合性であり、例えばポリマー、脂質、他の有機及び無機部分との化学的結合を含む。本発明の誘導体は特異的結合剤ポリペプチドの循環半減期を延長させるように作成され得、またはポリペプチドの所望細胞、組織または有機物へのターゲッティング能力を改善するように設計され得る。
本発明には更に、米国特許第４，６４０，８３５号明細書、同第４，４９６，６８９号明細書、同第４，３０１，１４４号明細書、同第４，６７０，４１７号明細書、同第４，７９１，１９２号明細書及び同第４，１７９，３３７号明細書に記載されているポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールのような１つ以上の水溶性ポリマー結合を含むように共有的に修飾された誘導体結合剤が含まれる。当業界で公知の他の有用なポリマーにはモノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール、並びにこれらのポリマーの混合物が含まれる。特に好ましいものはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有的に修飾した特異的結合剤生成物である。水溶性ポリマーは特定位置、例えば特異的結合剤生成物のアミノ末端で結合されたり、ポリペプチドの１つ以上の側鎖にランダムに結合され得る。特異的結合剤及びヒト化抗体の治療能力を改善するためにＰＥＧを使用することは２０００年１０月１７日にＧｏｎｚａｌｅｓに付与された米国特許第６，１３３，４２６号明細書に記載されている。
抗体突然変異誘発のための標的部位
Ａｎｇ−２特異的抗体の固有特性、例えば前記抗体のその標的に対するアフィニティーを操作するために特定の戦略を使用することができる。前記戦略には、前記抗体をコードするポリヌクレオチド分子を部位特異的またはランダム突然変異誘発して抗体変異体を作成した後、所望の変化、例えば向上または低下したアフィニティーを示す抗体変異体を回収するように設計されたスクリーニングステップの使用が含まれる。
突然変異戦略において最も一般的に標的とされるアミノ酸残基はＣＤＲ中のものである。上記したように、前記領域は、実際Ａｎｇ−２及び残基の空間配置に影響を及ぼす他のアミノ酸と実際相互作用する残基を含む。しかしながら、ＣＤＲ領域外の可変ドメインの骨格領域中のアミノ酸が抗体の抗原結合性に実質的に寄与することは判明しており、そのアミノ酸は前記特性を操作するために標的とされ得る。Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：３９５−４０２（１９９９）及びその引用文献を参照されたい。
抗体変異体のより小さくより効率的にスクリーニングされるライブラリーは、体細胞アフィニティー成熟プロセス中に“過剰変異”しがちな領域に対応するＣＤＲ中の部位にランダムまたは部位特異的突然変異誘発を限定することにより構築され得る。Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ及びＰａｓｔａｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：５６８−５７２（１９９９）及びその引用文献を参照されたい。このようにして過剰突然変異を規定することが公知のＤＮＡ因子のタイプには、直列反復、逆向き反復、あるコンセンサス配列、二次構造及びパリンドロームが含まれる。コンセンサスＤＮＡ配列は４塩基配列プリン−Ｇ−ピリミジン−Ａ／Ｔ（すなわち、ＡまたはＧ−Ｇ−ＣまたはＴ−ＡまたはＴ）及びセリンコドンＡＧＹ（ここで、ＹはＣまたはＴであり得る）を含む。
従って、本発明の実施態様は、抗体のその標的に対するアフィニティーを向上させるための突然変異戦略を含む。前記戦略には、全可変重鎖及び軽鎖の突然変異誘発、ＣＤＲ領域のみの突然変異誘発、ＣＤＲ内のコンセンサス過剰変異部位の突然変異誘発、骨格領域の突然変異誘発、または前記方法の組合せが含まれる（この関係で“突然変異”はランダムまたは部位特異的てあり得る）。ＣＤＲ領域の明確な描写及び抗体の結合部位を含む残基の同定は、問題の抗体及び抗体−リガンド複合体の構造を当業界で公知の技術、例えばＸ線結晶学を用いて解明することにより実施され得る。抗体結晶構造の分析及び特性付けに基づく各種方法は当業者に公知であり、ＣＤＲ領域を明確ではないが概算するために使用され得る。一般的に使用される方法の例には、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ及びコンタクト定義が含まれる。
Ｋａｂａｔ定義は配列変動性に基づき、ＣＤＲ領域を予測するために最も一般的に使用されている定義である（Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＷｕ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１４−８（２０００））。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づく（Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−１７（１９８６）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８３（１９８９））。ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ定義の折衷である。ＡｂＭはオックスフォード分子グループが作成した抗体構造モデリングに対するプログラムの統合組である（Ｍａｒｔｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：９２６８−９２７２（１９８９）；Ｒｅｅｓら，ＡＢＭ（商標），抗体の可変領域をモデリングするためのコンピュータープログラム，英国オックスフォードに所在のＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．）。ＡｂＭ組は公知のデーターベース及び最初の方法を併用して一次配列決定から抗体の３次構造のモデルを作る。コンタクト定義といして公知の追加の定義は最近導入された（ＭａｃＣａｌｌｕｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：７３２−４５（１９９６））。この定義は利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づいている。
慣例により、重鎖中のＣＤＲ領域は通常Ｈ１、Ｈ２及びＨ３と称されており、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって順次ナンバリングされている。軽鎖中のＣＤＲ領域は通常Ｌ１、Ｌ２及びＬ３と称されており、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって順次ナンバリングされている。
ＣＤＲ−Ｈ１は約１０〜１２残基の長さを有し、通常Ｃｈｏｔｈｉａ及びＡｂＭ定義によるとＣｙｓの後４残基またはＫａｂａｔ定義によると通常５残基後から始まる。典型的には、Ｈ１の後にはＴｒｐ、通常Ｔｒｐ−Ｖａｌ、Ｔｒｐ−ＩｌｅまたはＴｒｐ−Ａｌａがある。Ｈ１の長さはＡｂＭ定義によると約１０〜１２残基であり、Ｃｈｏｔｈｉａ残基は最後の４残基を排除している。
ＣＤＲ−Ｈ２は典型的にはＫａｂａｔ及びＡｂＭ定義によるとＨ１の末端の後１５残基から始まる。Ｈ２の前の残基は通常Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙであるが、多数の変化が存在する。典型的にはＨ２の後にアミノ酸配列Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａがある。Ｋａｂａｔ定義によると、Ｈ２の長さは約１６〜１９残基であり、ＡｂＭ定義はその長さを通常９〜１２残基であると予測している。
ＣＤＲ−Ｈ３は典型的にはＨ２の末端の後３３残基から始まり、アミノ酸配列（通常、Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）の前である。典型的には、Ｈ３の後にアミノ酸配列−Ｇｌｙがある。Ｈ３の長さは３〜２５残基であり得る。
ＣＤＲ−Ｌ１は典型的には約残基２４から始まり、通常Ｃｙｓの後である。ＣＤＲ−Ｌ１の後の残基は常にＴｒｐであり、通常配列Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＧｌｎまたはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕが始まる。ＣＤＲ−Ｌ１の長さは約１０〜１７残基である。本発明の抗体に対する懲罰的ＣＤＲ−Ｌ１はこのパターンに従い、正確にはＣｙｓ残基の後に１５アミノ酸、その後にＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎが続く。
ＣＤＲ−Ｌ２はＬ１の末端の後約１６残基から始まる。通常、残基Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−ＬｙｓまたはＩｌｅ−Ｐｈｅに続く。ＣＤＲ−Ｌ２の長さは約７残基である。
ＣＤＲ−Ｌ３は典型的にはＬ２の末端の後３３残基から始まり、通常Ｃｙｓに続く。典型的には、Ｌ３の後にアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙがある。Ｌ３の長さは約７〜１１残基である。
いろいろな抗体の修飾方法は当業界で公知である。例えば、１９９６年６月２５日にＱｕｅｅｎらに付与された米国特許第５，５３０，１０１号明細書は、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域骨格の配列がドナー免疫グロブリン重鎖可変領域骨格の配列と６５〜９５％同一であるヒト化抗体の作成方法が記載されている。各ヒト化免疫グロブリン鎖は通常ＣＤＲに加えて、例えばＣＤＲと相互作用して結合アフィニティーに影響を及ぼし得るドナー免疫グロブリン骨格由来のアミノ酸、例えばドナー免疫グロブリン中のＣＤＲに直接隣接している１個以上のアミノ酸または分子モデリングで予測して約３Å範囲内の１個以上のアミノ酸を含む。重鎖及び軽鎖はそれぞれ各種の位置基準の１つまたは全てを用いて設計され得る。完全な抗体に組み合わせるとき、本発明のヒト化免疫グロブリンはヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、抗原（例えば、エピトープを含むタンパク質または他の化合物）に対してドナー免疫グロブリンと実質的に同じアフィニテイーを維持している。１９９７年１２月２日にＱｕｅｅｎらに付与された米国特許第５，６９３，７６１号明細書（改善されたヒト化免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド）、１９９７年１２月２日にＱｕｅｅｎらに付与された米国特許第５，６９３，７６２号明細書（ヒト化免疫グロブリン）及び１９９６年１２月１７日にＱｕｅｅｎらに付与された米国特許第５，５８５，０８９号明細書（ヒト化免疫グロブリン）に記載されている関連方法も参照されたい。
１例として、１９９６年１０月１５日にＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらに付与された米国特許第５，５６５，３３２号明細書（キメラ抗体の産生−コンビナトリアルアプローチ）は、親抗体として類似の結合特異性を有しているが高いヒト特性を有している抗体及び抗体断片の作成方法を記載している。ヒト化抗体は例えばファージディスプレー方法を用いる鎖シャフルにより得られ、当該抗原に対して特異的な非ヒト抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドがヒト相補性（軽または重）鎖可変ドメインのレパートリーと組み合わされる。当該抗原に対して特異的なハイブリットペアリングが同定され、選択したペアリングからのヒト鎖はヒト相補性（軽または重）鎖可変ドメインのレパートリーと組み合わされる。別の実施態様では、非ヒト抗体由来のＣＤＲの成分はヒト抗体由来のＣＤＲの成分部分のレパートリーと組み合わされる。得られた抗体ポリペプチドダイマーのライブラリーから、ハイブリッドが選択され、第２のヒト化シャッフリングステップで使用される。或いは、ハイブリッドが治療価値のある十分なヒト特性を既に有しているならばこの第２ステップは省略される。ヒト特性を向上させるための修飾方法も公知である。Ｗｉｎｔｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．，４３０：９２−９２（１９９８）も参照されたい。
別の例として、２０００年４月２５日にＣａｒｔｅｒらに付与された米国特許第６，０５４，２９７号明細書は、ＣＤＲアミノ酸配列を対応のヒトＣＤＲアミノ酸配列で置換及び／またはＦＲアミノ酸配列を対応のヒトＦＲアミノ酸配列で置換することによりヒト化抗体の作成方法を記載している。
別の例として、１９９８年６月１６日にＳｔｕｄｎｉｃｋａらに付与された米国特許第５，７６６，８８６号明細書（修飾抗体可変ドメイン）は、異種種に関する免疫原性を低下させながら抗原結合ドメインの先天的アフィニティーを損なうことなく修飾され得る抗体可変ドメインのアミノ酸残基を同定する方法及び異種種に投与するために使用される前記修飾抗体可変ドメインの作成方法を記載している。１９９９年２月９日にＳｔｕｄｎｉｃｋａに付与された米国特許第５，８６９，６１９号明細書も参照されたい。
上記したように、当業界で公知の方法を用いる抗体の修飾は通常抗原に対する結合アフィニテイーを向上させ及び／またはレシピエントにおける抗体の免疫原性を低下させるように設計される。１つのアプローチでは、抗体のその同族抗原に対するアフィニティーを向上させるべくグリコシル化部位を除去するようにヒト化抗体を修飾し得る（Ｃｏら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：１３６１−１３６７（１９９３））。“再成形”、“過剰キメラ化”及び“化粧張り(veneering)／再表面化”のような方法により高い治療可能性を有するヒト化抗体が産生された（Ｖａｓｗａｍｉら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ，８１：１０５（１９９８）；Ｒｏｇｕｓｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．，９：８９５−９０４（１９９６））。抗体の再成形方法を記載している２０００年６月６日にＨａｒｄｍａｎらに付与された米国特許第６，０７２，０３５号明細書も参照されたい。上記方法は外来残基の数を減らすことにより抗体免疫原性を低下させるが、抗体の反復投与後の抗−イディオタイプ及び抗−アロタイプ応答を防がない。免疫原性を減らす上記方法の代替はＧｉｌｌｉｌａｎｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６２（６）：３６６３−７１（１９９９）に記載されている。
多くの場合、抗体をヒト化すると抗原結合能が失われる。従って、抗体の結合アフィニテイーを回復させる試みでは元の（多くの場合げっ歯）抗体中に存在するアミノ酸残基の１つ以上を含むようにヒト化抗体を“復帰突然変異”させることが好ましい。例えば、Ｓａｌｄａｎｈａら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：７０９−７１９（１９９９）を参照されたい。
非ペプチド特異的結合剤アナログ／タンパク質擬態
更に、安定化構造またはより少ない生分解性を与えるペプチドの非ペプチド特異的結合剤アナログも包含される。特異的結合剤ペプチド擬態アナログは特定の抑制性ペプチドをベースとし、１つ以上の残基を非ペプチド部分で置換することにより作成され得る。好ましくは、非ペプチド部分により、ペプチドはその本来の構造を保持することができ、またはＡｎｇ−２を認識し且つＡｎｇ−２に結合する能力を維持する好ましい（例えば、生活性）構造を安定化することができる。１つの態様では、生じたアナログ／擬態はＡｎｇ−２に対して高い結合アフィニティーを示す。特異的結合剤ペプチドから非ペプチド擬態アナログの作成方法の１例はＮａｃｈｍａｎら，Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，５７：３５９−３７０（１９９５）に記載されている。所望により、本発明の特異的結合剤ペプチドは例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化により、または本発明のペプチドの酸付加塩、アミド、エステル（特にＣ末端エステル）及びＮ−アシル誘導体を生成することにより修飾され得る。また、特異的結合剤ペプチドはペプチド誘導体を生成するように他の物質部分との共有結合もしくは非共有結合複合体を形成することによっても修飾され得る。共有結合複合体は、特異的結合剤ペプチドを含むアミノ酸の側鎖上、またはＮ−またはＣ末端の官能基に化学物質部分を連結させることにより作成され得る。
特に、特異的結合剤ペプチドをレポーター基にコンジュゲートすることが意図される。前記リポーター基には放射標識、蛍光標識、酵素（例えば、比色または蛍光反応を触媒するもの）、基質、固体マトリックスまたは担体（例えば、ビオチンまたはアビジン）が含まれるが、これらに限定されない。従って、本発明は、更に放射標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックス及び担体からなる群から選択されるレポーター基を含むことが好ましい抗体分子からなる分子を提供する。前記標識は当業者に公知である。例えばビオチン標識が特に考えられる。前記標識の使用は当業者に公知であり、例えば米国特許第３，８１７，８３７号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，９９６，８４５号明細書及び同第４，２７７，４３７号明細書に記載されている。有用な他の標識には、放射性標識、蛍光標識及び化学ルミネッセンス標識が含まれるが、これらに限定されない。前記標識の使用に関する米国特許には、例えば米国特許第３，８１７，８３７号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，９３９，３５０号明細書及び同第３，９９６，３４５号明細書が含まれる。本発明のペプチドは１又は２以上の上記標識を含んでいてもよい。
特異的結合剤の作成方法
タンパク質である本発明の特異的結合剤は、慣用技術に従って溶液中または固体支持体上での化学合成により作成され得る。現在のところ、固相合成は約８５〜１００アミノ酸長に限定されている。しかしながら、化学合成法は完全長ポリペプチドを作成するように一連の小ペプチドを化学的にライゲートするためにしばしば使用され得る。各種の自動合成装置が市販されており、公知のプロトコルに従って使用され得る。例えば、いずれも援用により本明細書に含まれるとするＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ，「固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)」，第２版，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（１９８４）年発行；Ｔａｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６４４２（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１−３４７（１９８６）；Ｂａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，「ペプチド(The Peptides)」，ｐ．１−２８４．Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編，ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ発行；Ｂａｒａｎｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｒｅｓ．，３０：７０５−７０９（１９８７）；及び米国特許第５，４２４，３９８号明細書を参照されたい。
固相ペプチド合成法はポリマー１ｇあたり０．１〜１．０ｍＭのアミンを含むコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を使用する。ペプチド合成のための上記方法では、α−アミノ基の保護のためにブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）を用いる。いずれの方法も、ペプチドのＣ末端から始める各ステップで１つのアミノ酸を付加する段階的合成を含む（Ｃｏｌｉｇａｎら，「免疫学の現在のプロトコル(Current Protocols in Immunology)」，単位９，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１年）発行参照）。化学合成が完了したら、ｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣアミノ保護基を除去するために合成ペプチドを脱保護し、還元温度で酸と処理することにより（例えば、液体ＨＦ−１０％ アニソールを用いて０℃で約０．２５〜約１時間）ポリマーから開裂させ得る。試薬を蒸発させたら、特異的結合剤ペプチドを１％ 酢酸溶液を用いてポリマーから抽出し、その後凍結乾燥して粗生成物を得る。この粗生成物は通常溶媒として５％ 酢酸を用いてセファデックスＧ−１５を介してゲル濾過するような方法を用いて精製され得る。カラムの適当な画分を凍結乾燥すると、均質な特異的結合剤ペプチドまたはペプチド誘導体が得られ、これを次にアミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸収分光法、分子旋光度、溶解度のような標準技術を用いて特性付けられ、固相エドマン分解により定量化され得る。
抗−Ａｎｇ−２抗体、その誘導体、変異体及び断片、並びに他のタンパク質をベースとするＡｎｇ−２結合剤を化学合成すると、非天然アミノ酸を特異的結合剤に配合することができる。
組換えＤＮＡ技術は、本発明の完全長抗体及び他の大きなタンパク質様特異的結合剤またはその断片を作成するための便利な方法である。抗体または断片をコードするｃＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入することができ、その発現ベクターを抗体またはその断片を作成するために宿主細胞に挿入することができる。コドン縮重を与えるために、または各種宿主細胞におけるコドン優先使用を許すために（ｍＲＮＡから翻訳された）“オリジナルの”ｃＤＮＡから変化させるように前記抗体をコードするｃＤＮＡを修飾し得ると理解されたい。
通常、抗体をコードするＤＮＡ分子は本明細書の実施例に記載されている手順を用いて得ることができる。オリジナルの抗体分子に関連するＦａｂ分子またはＣＤＲを得ることが望ましい場合には、適当なライブラリー（ファージディスプレーライブラリー、リンパ球ライブラリー等）を関連Ｆａｂ／ＣＤＲを同定、クローン化するために標準技術を用いてスクリーニングすることができる。前記スクリーニングに使用されるプローブは、オリジナル抗体のＦａｂ部分をコードする完全長または切断Ｆａｂプローブ、オリジナル抗体のＦａｂ部分由来の１つ以上のＣＤＲに対するプローブ、または他の適当なプローブである。ＤＮＡ断片をプローブとして使用するときの典型的なハイブリダイゼーション条件はＡｕｓｕｂｅｌら，「免疫学の現在のプロトコル(Current Protocols in Immunology)」，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｒｅｓｓ（１９９４年）発行に記載されているような条件である。ハイブリダイゼーション後、プローブしたブロットをプローブサイズ、プローブのクローンに対する予想されるホモロジー、スクリーニングされるライブラリーの種類及びスクリーニングされるクローンの数のような要因に依存して適当なストリンジエンシーで洗浄され得る。高ストリンジェントなスクリーニングの例は５０〜６５℃での０．１×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳである。
本発明の特異的結合剤ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含み、発現させるために各種の発現ベクター／宿主系を使用し得る。前記系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌のような微生物；酵母発現ベクターで形質転換させた酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフォルニアモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））をトランスフェクトした植物細胞系；細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
組換え特異的結合剤タンパク質の産生において有用な哺乳動物細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、２９３細胞、及び本明細書に記載されているハイブリドーマ細胞株が含まれるが、これらに限定されない。典型的にはグリコシル化され、活性のために適正なリフォールディングが必要な抗体や抗体断片のような特異的結合剤の作成のためには哺乳動物細胞が好ましい。好ましい哺乳動物細胞にはＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞及び骨髄性細胞が含まれる。
特異的結合剤タンパク質を組換え発現させるための幾つかのプロトコルを以下に例示する。
「発現ベクター」は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現させるためのプラスミド、ファージ、ウイルスまたはベクターを指す。発現ベクターは、（１）遺伝子発現において調節役割を有する遺伝子因子（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される結合剤をコードする構造または配列、及び（３）適切な転写開始及び停止配列のアセンブリからなる転写単位を含み得る。酵母または真核発現系で使用するために意図される構造単位が翻訳されたタンパク質を宿主細胞により細胞外分泌させ得るリーダー配列を含むことが好ましい。或いは、組換え特異的結合剤タンパク質をリーダーまたはトランスポート配列なしで発現させる場合には、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。その後この残基は最終特異的結合剤産物を得るために発現組換えタンパク質から開裂させてもさせなくてもよい。
例えば、特異的結合剤は酵母において市販されている発現系、例えばＰｉｃｈｉａ発現系（カリフォルニア州サンディエゴに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造業者の指示に従って組換え発現させ得る。この系は分泌させるためにプレ−プロ−アルファ配列にも頼っているが、インサートはメタノールによる誘導時にアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターにより転写される。
分泌された特異的結合剤ペプチドは酵母増殖培地から、例えば細菌及び哺乳動物細胞上清からペプチドを精製するために使用される方法を用いて精製される。
或いは、特異的結合剤ペプチドをコードするｃＤＮＡはバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（カリフォルニア州サンディエゴに所在のＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）にクローン化され得る。このベクターはｓＦ９タンパク質非含有培地においてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させ、組換えタンパク質を産生するために製造業者の指示に従って使用され得る。特異的結合剤タンパク質は前記培地からヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製、濃縮され得る。
或いは、ペプチドは昆虫系において発現され得る。タンパク質発現用の昆虫系は当業者に公知である。１つの系では、オウトグラファカリフォルニア核多汗症ウイルス（ＡｃＮＰＶ）はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用され得る。特異的結合剤ペプチドコード配列はウイルスの非必須領域、例えば多面体遺伝子にクローン化し、多面体プロモーターの制御下に置かれ得る。特異的結合剤ペプチドをうまく挿入すれば、多面体遺伝子は不活性となり、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスが生じる。組換えウイルスはペプチドが発現されているＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅを感染するために使用され得る（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４６：５８４（１９８３）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９１：３２２４−７（１９９４））。
別の例では、特異的結合剤ペプチドをコードするＤＮＡ配列はＰＣＲにより増幅され、適当なベクター（例えば、ｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））にクローン化され得る。ｐＧＥＸベクターは、ベクターによりコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びベクターのクローニング部位に挿入されるＤＮＡ断片によりコードされる特異的結合剤タンパク質を含む融合タンパク質を生ずるように設計されている。ＰＣＲ用プライマーは例えば適当な開裂部位を含むように作成され得る。特異的結合剤融合部分を単に発現を容易とするために使用する場合や当該ペプチドへの結合として望ましくない場合には、組換え特異的結合剤融合タンパク質はその後融合タンパク質のＧＳＴ部分から開裂してもよい。ｐＧＥＸ−３Ｘ／特異的結合剤構築物を大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（カリフォルニア州ラホーヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、各形質転換体を単離、増殖させる。各形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、自動シークエンサーを用いて部分的に配列決定して適正な方位で核酸インサートをコードする所望の特異的結合剤の存在を確認することができる。
抗−Ａｎｇ−２抗体及びその断片をコードするポリヌクレオチドを上記した組換え系を用いて発現すると、生物学的に活性とすべくリフォールディング（複数のジスルフィド架橋を適正に作成するために）されなければならない抗体またはその断片が生ずる。前記抗体に対する典型的なリフォールディング手順は本明細書の実施例及び以下のセクションに記載されている。
細菌細胞中の特異的結合剤は細菌において不溶性封入体として産生され得、以下のように精製され得る。宿主細胞は遠心により殺し、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し、室温において０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）で１５分間処理する。ライセートを音波処理により清澄化し、細胞破片を１２，０００×ｇで１０分間遠心することによりペレット化し得る。特異的結合剤を含有するペレットを５０ｍＭ トリス（ｐＨ８）及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁し、５０％グリセロール上に重層し、６０００×ｇで３０分間遠心してもよい。ペレットはＭｇ＋＋もＣａ＋＋も含まない一般的なリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中に再懸濁してもよい。特異的結合剤を再懸濁したペレットを変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分画化することにより更に精製してもよい（上掲のＳａｍｂｒｏｏｋら）。タンパク質を可視化するためにゲルを０．４Ｍ ＫＣｌ中に浸してもよい。そのタンパク質は切り出され、ＳＤＳを欠くゲルランニング緩衝液中で電気溶出され得る。ＧＳＴ融合タンパク質を細菌中で可溶性タンパク質として産生されるならば、該タンパク質はＧＳＴ精製モジュール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製してもよい。
組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系は当業者に公知である。宿主細胞株は、発現タンパク質をプロセシングしたりまたはタンパク質活性を与えるのに有用な翻訳後修飾を生ずるような特定能力について選択され得る。ポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピド化及びアシル化が含まれるが、これらに限定されない。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８のような各種宿主細胞及びハイブリドーマ細胞株等は前記した翻訳後活性のための特定細胞組織及び特徴的機構を有しており、導入される外来タンパク質が適正に確実に修飾及びプロセシングされるように選択され得る。
組換えタンパク質の産生のために形質転換された細胞を回収するために多数の選択系を使用し得る。前記選択系には、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞中の、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、メトトレキサートに対する耐性を付与するＤＨＦＲ、マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性及びクロロスルフロンに対する耐性を付与するｎｅｏ、及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するＨｙｇｒｏに対する選択の基準として抗代謝薬耐性が使用され得る。使用され得る別の選択遺伝子には、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを使用し得るｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを使用し得るｈｉｓＤが含まれる。形質転換体を同定するための視覚的兆候を与えるマーカーには、アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質、ＧＵＳ、ルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンが含まれる。
特異的結合剤の精製及びリフォールディング
場合により、上記した手順を用いて作成される特異的結合剤を適切な三次構造に“リフォールディング”及び酸化して、生物学的に活性とすべくジスルフィド結合を生ずる必要があることがある。リフォールディングは当業界で公知の複数の手順を用いて実施され得る。前記方法の例には、可溶化したポリペプチド剤をカオトロピック試薬の存在下でｐＨを通常７以上に曝すことが含まれる。カオトロピック剤の選択は封入体の可溶化のために使用される選択と同様であるが、カオトロピック剤は通常低濃度で使用される。カオトロピック剤の例はグアニジンである。多くの場合、リフォールディング／酸化溶液は、システイン架橋を形成するためにジスルフィド(dusykfide)シャッフリングさせ得る特定のレドックスポテンシャルを生ずるように特定比で還元剤及びその酸化形態をも含む。通常使用されている幾つかのレドックスカップルには、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれる。多くの場合、リフォールディングの効率を高めるために共溶媒を使用してもよい。慣用されている共溶媒には、グリセロール、各種分子量のポリエチレングリコール及びアルギニンが含まれる。
本発明の特異的結合剤またはその変異体を精製することが望ましい。タンパク質精製方法は当業者に公知である。この方法は１つレベルでポリペプチド及び非ポリペプチド分画の粗な分画化を含む。特異的結合剤ポリペプチドを他のタンパク質から分離したら、当該ポリペプチドは部分的または完全（すなわち、等質性まで精製）に精製するためにクロマトグラフィー及び電気泳動を用いて更に精製され得る。純粋な特異的結合剤ペプチドの製造に特に適した分析方法はイオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動である。ペプチドを精製するための特に効率的な方法は高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣである。
本発明の１つの態様はコードされた特異的結合剤タンパク質またはペプチドの精製に関し、特定実施態様ではその実質的精製に関する。本明細書中、用語「精製された特異的結合剤タンパク質またはペプチド」は他の成分から単離され得る組成物であって、特異的結合剤タンパク質またはペプチドが天然で得られる状態と同等まで精製されているものを指すと解される。従って、精製された特異的結合剤タンパク質またはペプチドはそれが元々存在しているかもしれない環境を含まない特異的結合剤タンパク質またはペプチドを指す。
通常、“精製”はいろいろな他の成分を除去するために分画化されてはいるが、発現された生物学的活性を実質的に保持している特異的結合剤組成物を指す。「実質的に精製」という用語を使用するとき、その用語は特異的結合剤タンパク質またはペプチドが組成物の主成分、例えばタンパク質が組成物の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上を構成しているような特異的結合剤組成物を指す。
特異的結合剤の精製度を定量するための各種方法は本明細書の記載にてらして当業者に公知である。この中には、例えば活性画分の特異的結合活性の測定、分画内の特異的結合剤ポリペプチドの量のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による評価が含まれる。特異的結合剤分画の純度を評価するための好ましい方法は、前記分画の結合活性を計算し、その値を最初の抽出物の結合活性と比較し、精製度（本明細書では“倍精製数”で表す）を計算することである。結合活性の量を表すために使用される実際の単位は勿論精製を追跡するために選択した特定のアッセイ法に依存し、発現した特異的結合剤タンパク質またはペプチドが検出可能な結合活性を示すか否かにも依存する。
特異的結合剤タンパク質を精製する際に使用するのに適した各種方法が当業者に公知である。その例には、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降）等を用いる沈降または熱変性による沈降後遠心；アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ−セファロース）、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイトまたはアフィニテイークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーステップ；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；及び前記した方法と他の方法との組合せが含まれる。当業界では通常公知のように、各種精製ステップを実施する順番は変えることができ、あるステップを省略することもでき、その結果実質的に精製された特異的結合剤の製造のための適当な方法がもたらされると考えられている。
特異的結合剤を常に最も精製された状態で得ることは一般的な要件ではない。実際、ある実施態様ではあまり実質的に特異的でない結合剤産物を使用することが意図されている。数少ない精製ステップを組合せたり、同一の一般的精製スキームを異なる形態で使用することにより部分的精製は達成され得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて実施されるカチオン交換カラムクロマトグラフィーにより通常低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同一方法よりも数倍高く精製されると見られる。低い相対的精製度を示す方法は特異的結合剤タンパク質産物の全回収の点または発現した特異的結合剤タンパク質の生物学的活性の維持の点で有利であり得る。
ＳＤＳ／ＰＡＧＥの条件の違いに応じてポリペプチドの移動が異なる、場合によっては大きく異なることは公知である（Ｃａｐａｌｉｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，７６：４２５（１９７７））。従って、異なる電気泳動条件下では精製もしくは部分精製された特異的結合剤発現産物の見かけ分子量が異なり得ることを理解できる。
結合アッセイ
免疫学的結合アッセイは通常、アナライト標的抗原に特異的に結合し、しばしばその抗原を固定化するために捕捉剤を使用している。前記捕捉剤はアナライトに特異的に結合する物質である。本発明の１実施態様では、捕捉剤はＡｎｇ−２に特異的に結合する抗体またはその断片である。免疫学的結合アッセイは当業界で公知である（Ａｓａｉ編，「細胞生物学における方法(Methods in Cell Biology)」，第３７巻，「細胞生物学における抗体(Antibodies in Cell Biology)」，ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９３）年発行参照）。
免疫学的結合アッセイは、多くの場合捕捉剤と抗原により形成される結合複合体の存在を示す標識剤を使用している。前記標識剤は結合複合体からなる分子の１つであり得、すなわち前記標識剤は標識特異的結合剤または標識抗特異的結合剤抗体であり得る。或いは、標識剤は結合複合体に結合する第３の分子、通常別の抗体であり得る。標識剤の例は、標識を有する抗−特異的結合剤抗体であり得る。結合複合体に対して特異的な第２抗体は標識を有していなくてもよいが、第２抗体がそのメンバーである抗体の種に特異的な第４分子により結合され得る。例えば、第２抗体はビオチンのような検出可能な部分で修飾されていてもよく、前記検出可能な部分はその後酵素標識ストレプトアビジンのような第４分子により結合される。免疫グロブリン定常領域に特異的に結合し得る他のタンパク質、例えばプロテインＡまたはプロテインＧも標識剤として使用され得る。これらの結合タンパク質はストレプトコッカル細菌の細胞壁の通常成分であり、各種の種由来の免疫グロブリン定常領域と強い非免疫原性反応性を示す（Ａｌｋｅｒｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２５８９−２５４２（１９８５）及びＣｈａｕｂｅｒｔ，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ，１０：５８５−５９１（１９９７）参照）。
アッセイ中、試薬をそれぞれ組み合わせた後インキュベーション及び／または洗浄ステップが必要な場合がある。インキュベーションステップは約５秒〜数時間、好ましくは約５分〜約２４時間の範囲で変更可能である。しかしながら、インキュベーション時間はアッセイフォーマット、アナライト、溶液の容量、濃度等に依存する。通常アッセイは室温で実施されるが、広範囲の温度で実施可能である。
（Ａ）非競合結合アッセイ
免疫学的結合アッセイは非競合タイプであり得る。このアッセイでは捕捉されたアナライトの量を直接測定する。例えば、１つの好ましい“サンドイッチ”アッセイでは、捕捉剤（抗体）が固定化されている固体基質に対して前記捕捉剤を直接結合させ得る。固定化した抗体は試験サンプル中に存在する抗原を捕捉（結合）する。その後、こうして固定化されたタンパク質は標識剤、例えば標識を有する第２抗体に結合する。別の好ましい“サンドイッチ”アッセイでは、第２抗体が標識を有していないが、第２抗体を誘導した種の抗体に対して特異的な標識抗体により結合し得る。第２抗体は検出可能部分（例えば、ビオチン）で修飾されていてもよく、前記検出可能部分に対してストレプトアビジンのような第３標識分子が特異的に結合し得る（援用により本明細書に含まれるとするＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，「抗体，実験マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」，第１４章，ニューヨーク州に所在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）発行参照）。
（Ｂ）競合結合アッセイ
免疫学的結合アッセイは競合タイプであってもよい。サンプル中に存在するアナライトの量は、サンプル中に存在するアナライトにより捕捉剤から置換されたか競合除去された添加アナライトの量を測定することにより間接的に測定される。１つの好ましい競合結合アッセイでは、既知量の（通常、標識されている）アナライトをサンプルに添加し、そのサンプルを抗体（捕捉剤）と接触させる。抗体に結合した標識アナライトの量はサンプル中に存在するアナライトの濃度に逆比例する（上掲のＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，「抗体，実験マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」，第１４章，ｐ．５７９−５８３参照）。
別の好ましい競合結合アッセイでは、抗体を固体基質に固定する。抗体に結合したタンパク質の量はタンパク質／抗体複合体中に存在するタンパク質の量を測定するかまたは残存している非複合体化タンパク質の量を測定することにより測定され得る。タンパク質の量は標識タンパク質を用意することにより検出され得る（上掲のＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，「抗体，実験マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」，第１４章参照）。
更に別の好ましい競合結合アッセイでは、ハプテン阻害を用いる。既知アナライトを固体基質に固定化する。既知量の抗体をサンプルに添加し、そのサンプルを固定化アナライトと接触させる。固定化アナライトに結合させた抗体の量はサンプル中に存在するアナライトの量に逆比例する。固定化抗体の量は抗体の固定化分画または溶液中に残存している分画を検出することにより検出され得る。抗体を標識することにより直接、または上記した抗体に特異的に結合する標識剤をその後添加することにより間接的に検出され得る。
（Ｃ）競合結合アッセイの使用
競合アッセイは、当業者が本発明の特異的結合剤により認識されるタンパク質または酵素複合体が所望タンパク質であるが交差反応する分子でないことを調べたり、または抗体が抗原に対して特異的であり、非関連抗原に結合しないかを調べることができるように交差反応性測定のために使用され得る。このタイプのアッセイでは、抗原を固体支持体に固定し得、固定化タンパク質に対する特異的結合剤の結合と競合するであろう未知のタンパク質混合物をアッセイに添加する。競合分子も抗原に関連しない１つ以上の抗原に結合する。特異的結合剤抗体の固定化抗原に対する結合と競合するタンパク質の能力を固体支持体に固定化した同一タンパク質による結合と比較して、タンパク質ミックスの交差反応性を調べる。
（Ｄ）他の結合アッセイ
本発明はまた、サンプル中のＡｎｇ−２の存在を検出または定量するためのウェスタンブロット法を提供する。この方法は通常サンプルタンパク質を分子量に基づくゲル電気泳動により分離し、そのタンパク質を適当な固体支持体、例えばニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導体化ナイロンフィルターに移すことを含む。前記サンプルをＡｎｇ−２に特異的に結合する抗体またはその断片とインキュベートし、生じた複合体を検出する。前記抗体は直接標識され得るか、または抗体に特異的に結合する標識抗体を用いてその後検出され得る。
Ａｎｇ−２のその受容体への結合を妨げるＡｎｇ−２特異的結合剤を検出するための結合アッセイは本明細書の実施例に記載されている。
診断アッセイ
本発明の抗体またはその断片は、Ａｎｇ−２またはサブユニットの発現により特徴づけられる症状または疾患の診断のため、或いはＡｎｇ−２誘導物質またはその断片、Ａｎｇ−２活性のアゴニストまたは阻害剤で治療される患者をモニターするためのアッセイにおいて有用である。Ａｎｇ−２に対する診断アッセイには、ヒト体液、細胞または組織の抽出物中のＡｎｇ−２を検出するための標識及び特異的結合剤を用いる方法が含まれる。本発明の特異的結合剤は場合により修飾を加えて使用され得る。好ましい診断アッセイでは、特異的結合剤を例えば標識またはレポーター分子を結合することにより標識される。広範囲の標識及びレポーター分子が公知であり、このうちの幾つかは本明細書に記載されている。特に、本発明はヒト疾患の診断のために有用である。
Ａｎｇ−２タンパク質を各タンパク質に対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて測定するための各種プロトコルが公知である。その例には、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。Ａｎｇ−２上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイも使用することができる。これらのアッセイは、例えばＭａｄｄｏｘら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１（１９８３）に記載されている。
診断基準を与えるために、ヒトＡｎｇ−２発現の正常または標準値が通常確立されている。これは、当業界で周知の複合体形成に適した条件下で正常被験者（好ましくは、ヒト）からの体液または細胞抽出物をＡｎｇ−２に対する特異的結合剤（例えば、抗体）と混合することにより測定され得る。標準複合体形成の量は、既知量のＡｎｇ−２タンパク質に対する特異的結合剤の結合をコントロール及び病気サンプルと比較することにより定量され得る。次いで、正常サンプルから得た標準値を病気に罹患している可能性のある被験者由来のサンプルから得た値と比較することができる。標準値と被験者の値の偏差から病的状態におけるＡｎｇ−２の役割が示唆される。
診断用途の場合、ある実施態様では、特異的結合剤を通常検出可能な部分で標識される。検出可能な部分は、直接または間接的に検出可能なシグナルを発生し得るものであり得る。例えば、検出可能部分は放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）、蛍光または化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリン）または酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）であり得る（Ｂａｙｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４；１３８−１６３（１９９０））。
疾患
本発明はヒト疾患及び病的状態を治療するのに有用なＡｎｇ−２に結合する特異的結合剤を提供する。Ａｎｇ−２結合活性または他の細胞活性を調節する特異的結合剤は治療効果を高めたり可能性ある副作用を抑えるために他の治療薬と一緒に使用され得る。
１つの態様で、本発明は、細胞におけるＡｎｇ−２活性の望ましくないまたは異常なレベルで特徴づけられる疾患及び状態を治療するために有用である試薬及び方法を提供する。前記疾患には、癌及び他の過剰増殖状態（例えば、過形成、乾癬、接触皮膚炎、免疫疾患及び不妊症）が含まれる。
本発明はまた、ヒトを含めた動物に対してＡｎｇ−２活性を阻害または低下させる特異的結合剤を有効量投与することを含む動物における癌の治療方法を提供する。本発明は更に、生体系における細胞増殖、侵襲及び転移のプロセスを含めた癌細胞増殖の抑制方法に関する。前記方法は癌細胞増殖抑制剤として本発明の化合物を使用することを含む。好ましくは、前記方法は哺乳動物のような生存動物における癌細胞増殖、侵襲、転移または腫瘍発生を抑制または低下させるために使用される。また、本発明の方法は癌細胞増殖及びその性質をアッセイしたり、癌細胞増殖に影響を及ぼす化合物を同定するようなアッセイシステムに使用するために容易に適合できる。
本発明の方法により治療され得る癌は、好ましくは哺乳動物で発生している。哺乳動物の例には、ヒト及び他の霊長類、イヌやネコのようなペットまたは愛玩動物、ラット，マウスや家兎のような実験動物、及びウマ，ブタ，ヒツジ及びウシのような家畜が含まれる。
腫瘍または新生物は細胞増殖がコントロールされずに進行している組織細胞の増殖を含む。幾つかの増殖は良性であるが、他のものは悪性と称され、臓器の死をもたらす恐れがある。悪性新生物または癌は、攻撃的細胞増殖を示す以外に周囲組織に侵襲し、転移するかもしれない点で良性増殖と区別される。更に、悪性新生物は、殆ど分化せず（殆ど脱分化）、相互及び周囲組織に比して器質化が殆ど失われているという特徴を有する。この性質は“退生”とも称される。
本発明により治療され得る新生物には充実腫、すなわち癌腫及び肉腫も含まれる。癌腫には、周囲組織に浸潤（侵襲）し、転移を起こす内皮細胞からの悪性新生物が含まれる。腺癌は腺組織由来の癌腫または認識可能な腺構造を形成する癌である。別の広範囲のカテゴリーの癌には、胚性結合組織のような原線維または均質物質中に埋没している細胞を含む腫瘍である肉腫が含まれる。本発明は、白血病、リンパ腫、及び通常腫瘍塊として存在しないが血管またはリンパ細網系中に分布している他の癌を含めた骨髄またはリンパ系の癌も治療することができる。
本発明の治療に適合され得る癌または腫瘍細胞のタイプの例には、ＡＣＨ産生腫瘍、急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、副腎皮質癌、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、毛様細胞性白血病、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、肝癌、肺癌（小細胞及び非小細胞）、悪性腹水、悪性胸水、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、卵巣（胚細胞）癌、膵臓癌、陰茎癌、前立腺癌、網膜芽腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、栄養膜新生物、子宮癌、膣癌、外陰癌及びウィルムス腫が含まれる。
本発明は、実験的に規定した癌の特定タイプの治療を参照して本明細書中に特に例示する。ここに例示した治療では、一般的な最新式インビトロ及びインビボモデルを使用している。これらの方法はインビボ治療レジメにおいて有効であると予想され得る物質を同定するために使用され得る。しかしながら、本発明の方法は上記した腫瘍タイプの治療方法に限定されず、あらゆる臓器系に由来するすべての充実性腫瘍の治療にも及ぶと理解されたい。侵襲または転移がＡｎｇ−２発現または活性と関係のある癌は特に本発明により抑制または退化の誘導を受けやすい。
本発明はまた、本発明の特異的結合剤（例えば、抗体）を別の抗癌化学療法剤（例えば慣用されている化学療法剤）と併せて配合することにより実施され得る。特異的結合剤と他の薬剤との併用は化学療法プロトコルを増強し得る。当業者は多数の化学療法プロトコルを本発明の方法に配合し得るものとして思いつく。アルキル化剤、抗代謝薬、ホルモン及びアンタゴニスト、放射性同位体及び天然産物を含めた化学療法剤を使用し得る。例えば、本発明の化合物は抗生物質（例えば、ドキソルビシン及び他のアントラサイクリンアナログ）、ナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファミド）、ピリミジンアナログ（例えば、５−フルオロウラシル）、シスプラチン、ヒドロキシウレア、タキソール、及びその天然及び合成誘導体等と一緒に投与され得る。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性細胞及びゴナドトロビン非依存性細胞を含む混合腫瘍、例えば乳腺癌の場合には、本発明化合物をロイプロリドまたはゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチドアナログ）と一緒に投与され得る。他の抗新生物プロトコルには、テトラサイクリン化合物と他の治療物理療法（例えば、手術、放射線等）との併用が含まれる。これは本明細書中で“補助抗新生物物理療法”とも呼ばれる。従って、本発明の方法は副作用を減らし、効果を高めるという効果をもって慣用レジメと一緒に使用され得る。
従って、本発明は充実性腫瘍及び白血病を含めた広範囲の癌の治療に有用な組成物及び方法を提供する。治療され得る癌のタイプには、乳腺癌、前立腺癌、結腸腺癌、あらゆる形態の気管支原性肺癌、骨髄腫、黒色腫、肝癌、神経芽腫、乳頭腫、アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、ウェーカー、基底細胞、基底有棘細胞、ブラウン−ピアース、導管、エールリヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、粘液性、非細胞性肺、燕麦細胞、乳頭状、硬性、細気管支、気管支原性、扁平上皮細胞及び移行細胞）、組織球性疾患、白血病、組織球性悪性疾患、ホジキン病、免疫増殖性小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、網肉症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、痛風結節芽球性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。更に、以下のタイプの癌も治療され得る：腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腺腫、顆粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、肝癌、汗腺腫、ランゲルハンス島細胞腫、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトーリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上皮腫、節神経腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、角化血管腫、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫、新生物、神経線維腫及び子宮頸部異形成。
本発明の別の態様は、乾癬及び接触皮膚炎を含めた皮膚の過剰増殖状態または他の過剰増殖疾患の予防及び／または治療のための本発明の材料及び方法の使用である。乾癬及び接触皮膚炎の患者ではその病巣中のＡｎｇ−２活性が高いことは立証されている（Ｏｇｏｓｈｉら，Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１０：８１８−２３（１９９８））。好ましくは、Ａｎｇ−２に対して特異的な特異的結合剤を上記した臨床症状を発現しているヒトを治療するために他の薬剤と一緒に使用される。特異的結合剤は本明細書に記載されている投与ルート及び当業者に公知の他のルートを介して各種担体を用いてデリバリーされ得る。
本発明の他の態様は、血管形成が関与している各種網膜症（糖尿病性網膜症及び老人性黄斑変性を含む）及び女性生殖管の障害／疾患、例えば子宮内膜症、子宮筋腫及び女性生殖サイクル中の機能不全性血管増殖（子宮内膜微小血管増殖を含む）を伴う他の状態の治療を含む。
本発明の更に別の態様は、脳動静脈奇形（ＡＶＭ）を含めた異常な血管増殖、胃腸粘膜損傷及び修復、消化性潰瘍の病歴を有する患者の胃十二指腸粘膜の潰瘍化、卒中により生ずる虚血、肝疾患における肺血管疾患、非肝性門脈高血圧患者における門脈高血圧症の治療に関する。
本発明の別の態様は、本発明の組成物及び方法を用いる癌の予防である。前記薬剤はＡｎｇ−２に対する特異的結合剤を含む。
医薬組成物
Ａｎｇ−２特異的結合剤の医薬組成物も本発明の範囲内である。抗体を含む医薬組成物は、例えば２００１年１月９日にＬａｍら付与された米国特許第６，１７１，５８６号明細書に詳記されている。前記組成物は治療または予防有効量の本明細書に記載されている特異的結合剤（例えば、抗体）、またはその断片、変異体、誘導体または融合物を医薬的に許容され得る物質と共に含む。好ましい実施態様では、医薬組成物はＡｎｇ−２の少なくとも１つの生物学的活性を部分的または完全に調節するアンタゴニスト特異的結合剤を医薬的に許容され得る物質と共に含む。典型的には、特異的結合剤は動物に投与するために十分に精製されている。
医薬組成物は、例えば組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色調、等張性、臭い、無菌、安定性、溶解または放出速度、吸収または浸透度を調節、維持または保存するための製剤化物質を含み得る。適当な製剤化物質には、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン）、抗菌剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、充填剤、単糖類、二糖類及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、着色剤、矯臭希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例：ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロールまたはチロキサポール）、安定性向上剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張性向上剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール）、デリバリービヒクル、希釈剤、賦形剤及び／または医薬用アジュバントが含まれるが、これらに限定されない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０年）発行参照。
最適な医薬組成物は、当業者により例えば意図する投与ルート、デリバリーフォーマット及び所望用量に応じて決定される。例えば、上掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ参照。前記組成物は特異的結合剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
医薬組成物中の主ビヒクルまたは担体は水性または非水性であり得る。例えば、適当なビヒクルまたは担体は注射用水、生理的食塩液または人工脳脊髄液であり、多分非経口投与用組成物において一般的な他の物質が補充されている。中性緩衝食塩液または血清アルブミンと混合した食塩液が別のビヒクルの例である。別の例の医薬組成物はｐＨ約７．０〜８．５のトリス緩衝液またはｐＨ約４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、更にソルビトールまたはその好適な置換物を含み得る。本発明の１実施態様では、結合剤組成物は所望の純度を有する特定組成物を凍結乾燥ケーキまたは水溶液形態の任意の製剤化物質（上掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合することにより貯蔵用に製造され得る。更に、結合剤製品はスクロースのような適当な賦形剤を用いて凍結乾燥物として調製され得る。
医薬組成物は非経口デリバリー用に選択され得る。或いは、前記組成物は吸入のため、または経口、点耳、点眼、直腸または膣のような経腸デリバリーのために選択され得る。上記した医薬的に許容され得る組成物の製剤は当業者の範囲内である。
製剤化成分は投与部位に対して許容され得る濃度で存在する。例えば、緩衝剤は組成物を生理学的ｐＨまたは僅かに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨに維持するために使用される。
非経口投与が意図される場合、本発明で使用するための治療用組成物は医薬的に許容され得るビヒクル中に所望の特異的結合剤を含む発熱物質非含有の非経口的に許容され得る水溶液の形態であり得る。非経口注射のための特に好適なビヒクルは、結合剤が適切に保存される滅菌等張液として処方されている滅菌蒸留水である。更に別の製剤は、特異的結合剤をその後蓄積注射によりデリバリーされ得る製品を徐放または制御放出させる物質、例えば注射可能なミクロスフェア、生体分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームと処方することを含む。ヒアルロン酸も使用可能であり、これは血行中の持続期間を延長させる効果を有し得る。所望分子を導入するための他の好適な手段には移植可能なドラッグデリバリーデバイスが含まれる。
別の態様で、非経口投与に適した医薬組成物は水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲルー液または生理的緩衝食塩液のような生理学的に適合し得る緩衝液の形で調製され得る。水性注射用懸濁液は該懸濁液の粘度を上昇させる物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランを含み得る。更に、活性化合物の懸濁液は適正な油状注射用懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル、トリグリセリドまたはリポソーム）が含まれる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーもデリバリーのために使用され得る。場合により、上記懸濁液は適当な安定剤または化合物の溶解度を高め、高濃度溶液を調製し得る物質をも含み得る。
別の実施態様では、医薬組成物は吸入用に処方され得る。例えば、結合剤は吸入用乾燥粉末として処方され得る。ポリペプチドまたは核酸分子吸入溶液もエアゾールデリバリー用噴射剤と共に処方され得る。更に別の実施態様では、溶液は噴霧され得る。肺投与については、化学的に修飾したタンパク質の肺デリバリーを記載している国際特許出願第ＵＳ９４／００１８７５号明細書に記載されている。
また、ある処方物は経口投与され得ると意図される。本発明の１実施態様では、このようにして投与される結合剤分子は錠剤やカプセル剤のような固体剤形をコンパウドする際に慣用されている担体と一緒にもしくは担体を使用せずに処方され得る。例えば、カプセル剤は、処方物の活性部分がバイオアベイラビリティーが最大で前全身分解が最小のときに胃腸管のある点で処方されるように設計され得る。結合剤分子の吸収を促進する物質を更に配合することができる。希釈剤、矯臭剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用され得る。
経口投与用医薬組成物は、経口投与するのに適した剤形で当業界で公知の医薬的に許容され得る担体を用いても処方され得る。前記担体により、医薬組成物は患者が服用するために錠剤、ピル剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方され得る。
経口用医薬組成物は、活性化合物を固体賦形剤と混合し、場合により粉砕した後、錠剤または糖衣錠コアが得られるように生じた顆粒状混合物を加工することにより得ることができる。所望により、好適な助剤を添加してもよい。好適な賦形剤には、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトールを含めた糖；コーン、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物由来のスターチ；メチルセルローク、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースのようなセルロース；アラビアゴム及びトラガカントゴムを含めたゴム；ゼラチン及びコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、及びアルギン酸またはその誘導体（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊または溶解化剤を添加してもよい。
糖衣錠コアはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリジン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／または二酸化チタンを含み得る濃縮糖溶液、ラッカー溶液及び好適な有機溶媒または溶媒混合物のような適当なコーティングと共に使用され得る。製品同定のためまたは活性化合物の量（すなわち、用量）を識別するために染料及び着色剤を錠剤または糖衣錠コアに添加してもよい。
経口的に使用され得る医薬組成物には、ゼラチンからなるプッシュフィット(push-fit)カプセル、及びゼラチン及びグリセロールまたはソルビトールのようなコーテイングからなるソフトシールカプセルも含まれる。プッシュフィットカプセルは、活性成分を充填剤または結合剤（例えば、ラクトースまたはスターチ）、滑沢剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）及び場合により安定剤と混合して含み得る。軟カプセルの場合には、活性化合物は適当な液体（例えば、脂肪油、液体、液体ポリエチレングリコール）中に場合により安定化剤と共に溶解または懸濁され得る。
別の医薬組成物は有効量の結合剤を錠剤の製造に適した非毒性賦形剤と混合して含み得る。錠剤を滅菌水または他の適当なビヒクル中に溶解することにより、１回量剤形の溶液が調製され得る。好適な賦形剤には、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウム）、結合剤（例えば、スターチ、ゼラチンまたはアカシア）、または滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）が含まれるが、これらに限定されない。
持続または制御デリバリー処方物中に結合剤分子を配合した処方物を含めた別の医薬組成物は当業者に自明である。各種の他の持続または制御デリバリー手段、例えばリポソーム担体、生体分解性微粒子、多孔性ビーズや蓄積注射剤を処方するための技術も当業者に公知である。例えば、医薬組成物をデリバリーするための多孔性ポリマー微粒子の制御放出を記載している国際特許出願第ＵＳ９３／００８２９号明細書を参照されたい。徐放性製剤の別の例には、成形物（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書及び欧州特許出願公開第５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチルＬ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒら，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（上掲のＬａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）が含まれ得る。徐放性組成物には、当業界で公知の幾つかの方法により製造され得るリポソームも含まれる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８２：３６８８−３６９２（１９８５）、欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書、同第８８，０４６号明細書、同第１４３，９４９号明細書を参照されたい。
インビボ投与するために使用される医薬組成物は通常無菌でなければならない。このためには滅菌濾過膜を介して濾過され得る。組成物が凍結乾燥されている場合には、この方法を用いる滅菌は凍結乾燥／再構成の前またはその後に実施され得る。非経口投与用組成物は凍結乾燥形態または溶液状で貯蔵され得る。更に、非経口組成物は通常滅菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈溶液バッグまたはバイアル中に収容される。
医薬組成物を調製したら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体、或いは脱水または凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に貯蔵され得る。前記組成物は用時使用形態または投与前に再構成しなければならない形態（例えば、凍結乾燥形態）で貯蔵され得る。
特定実施態様では、本発明は１回量投与単位を作成するためのキットに関する。前記キットはそれぞれ乾燥タンパク質を含む第１容器及び水性処方物を含む第２容器から構成される。単一及び複数個のチャンバを有する予備充填シリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジ）を含むキットも本発明の範囲に含まれる。
治療用に使用され得る医薬組成物の有効量は例えば治療内容及び対象物に依存する。治療のために適切な用量レベルが部分的にデリバリーされる分子、結合剤分子を使用する適応症、投与ルート、並びに患者のサイズ（体重、表面積または臓器サイズ）及び状態（年齢及び全身健康状態）に依存して変更されることは当業者に自明である。従って、医者は最適の治療効果が得られるように用量を決定し、投与ルートを調整し得る。典型的な用量は上記した要因に応じて約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。他の実施態様では、用量は０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、１〜約１００ｍｇ／ｋｇまたは５〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
任意の化合物の場合、治療有効量はまず細胞培養アッセイまたは動物モデル（例えば、マウス、ラット、家兎、イヌまたはブタ）において推定され得る。動物モデルは適切な濃度範囲及び投与ルートを決定するためにも使用され得る。次いで、これらの情報を用いて、ヒトに投与するのに有用な用量及び投与ルートが決定され得る。
正確な用量は治療を要する患者に関連する要因にてらして決定される。用量及び投与は十分なレベルの活性化合物を与えるためまたは所望効果を維持するように調節される。考慮され得る要因には、病気の重篤度、患者の全身健康状態、患者の年齢，体重及び性別、投与時期及び頻度、薬物併用、反応感受性及び治療に対する応答が含まれる。長時間作用する医薬組成物は、特定処方物の半減期及びクリアランス率に応じて３〜４日毎、１週間に１回、２週間に１回投与され得る。
投与頻度は、使用する処方物中の結合剤分子の薬物動態的パラメーターに依存する。典型的には、所望効果が達成される用量になるまで組成物が投与される。従って、組成物をある期間中に１回または複数回（同一または異なる濃度／用量）投与してもよく、または連続注入してもよい。適切な用量の精巧な調整は日常的に実施されている。適切な用量は適当な用量−応答データーを使用して決定され得る。
医薬組成物の投与ルートは公知の方法に従い、例えば経口的に；静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳質内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または病巣内ルートにより注射することにより、髄質内、クモ膜下、脳質内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所、舌下、尿道、膣または直腸手段により、徐放性システムにより、または移植デバイスにより投与され得る。所望により、組成物はボーラス注射により、注入により連続的に、または移植デバイスにより投与され得る。
或いは乃至追加的に、組成物はその上に所望分子を吸収またはカプセル化した膜、スポンジまたは適当な材料を移植することにより局所的に投与され得る。移植デバイスを使用する場合、そのデバイスは適当な組織または臓器に移植され得、所望分子は拡散、時間放出ボーラスまたは連続投与によりデリバリーされ得る。
場合により、医薬組成物をエキソビボ（生体外）使用することが望ましいこともある。そのような場合、患者から摘出した細胞、組織または臓器を医薬組成物に曝した後前記細胞、組織及び／または臓器を患者に移植し戻す。
他の場合には、ポリペプチドである結合剤は遺伝子工学処理した特定細胞を本明細書に記載されているような方法を用いて移植してポリペプチドを発現及び分泌させることによりデリバリーされ得る。前記細胞は動物またはヒト細胞であり得、自己細胞、異種組織細胞または異種間細胞であってもよい。場合により、細胞を不死化してもよい。免疫学的応答のチャンスを減らすために、周囲組織の浸潤を避けるように細胞をカプセル化してもよい。カプセル化材料は通常、タンパク質産物を放出し得るが患者の免疫系または他の有害因子により細胞の破壊を周囲組織から防ぐ通常生適合性で半透過性のポリマー包囲体または膜である。
併用療法
本発明の特異的結合剤は、Ａｎｇ−２病状の治療において他の治療法と組み合わせて使用され得る。前記した他の治療法の例には放射線治療、化学治療剤及び他の成長因子が含まれる。
化学療法は抗新生物剤を使用し得る。前記した抗新生物剤の例には、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブチルのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）のようなニトロソウレア；トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）及びヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ，アルトレタミン）のようなエチレンイミン／メチルメラミン；ブスルファンのようなアルキルスルホネート；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）のようなトリアジンを含めたアルキル化剤、メトトレキサート及びトレメトレキサートのような葉酸アナログ；５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ，シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジンのようなピリミジンアナログ；６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダルビン及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン，２−ＣｄＡ）のようなプリンアナログを含めた代謝拮抗剤、パクリタキセルのような抗有糸分裂薬を含めた天然産物、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、ビノレルビンのようなビンカアルカノイド；タキソレート；エストラムチン及びエストラムチンホスフェート；エトプシド及びテニポシドのようなポドフィロトキシン、アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトザントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ及びアクチノマイシンのような抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼのような酵素、インターフェロンα、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦのような生物学的応答モディファイヤー、シスプランチン及びカルボプラチンのような白金配位複合体；ミトザントロンのようなアントラセンジオン；ヒドロキシウレアのような置換ウレア；Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカバジンのようなメチルヒドラジン誘導体；ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドのような副腎皮質サプレッサーを含めたその他の薬剤、プレドニゾン及び等価物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドのようなアドレノコルチコステロイドアンタゴニスト；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロールのようなプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物のようなエストロゲン；タモキシフェンのようなアンチエストロゲン；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／等価物のようなアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ及びロイプロリドのようなアンチアンドロゲン；及びフルタミドのような非ステロイドアンチアンドロゲンを含めたホルモン及びアンタゴニストが含まれる。
成長ホルモンとの併用療法には、サイトカイン、リンホカイン、成長因子または他の造血因子、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子及びエリスロポエチンが含まれ得る。他には公知のアンギオポエチン、例えばＡｎｇ−１，−２，−４，−Ｙ及び／またはヒトＡｎｇ様ポリペプチド、及び／または脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。成長因子には、アンギオゲニン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体−１Ａ、骨形態形成タンパク質受容体−１Ｂ、脳由来神経栄養性因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養性受容体、サイトカイン誘導好中球走化因子−１、サイトカイン誘導好中球走化性因子−２、サイトカイン誘導好中球走化性因子−２、内皮細胞増殖因子、エンドセリン−１、上皮細胞増殖因子、上皮誘導好中球誘因物質、線維芽細胞増殖因子−４、線維芽細胞増殖因子−５、線維芽細胞増殖因子−６、線維芽細胞増殖因子−７、線維芽細胞増殖因子−８、線維芽細胞増殖因子−８ｂ、線維芽細胞増殖因子−８ｃ、線維芽細胞増殖因子−９、線維芽細胞増殖因子−１０、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体−１、グリア細胞株誘導好中球因子受容体−２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質−２、増殖関連タンパク質−３、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラノサイト増殖因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子受容体−１、神経増殖因子、神経増殖因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子−２、血小板誘導内皮細胞増殖因子、血小板誘導増殖因子、血小板増殖因子Ａ鎖、血小板誘導増殖因子ＡＡ、血小板誘導増殖因子ＡＢ、血小板誘導増殖因子Ｂ鎖、血小板誘導増殖因子ＢＢ、血小板誘導増殖因子受容体−１、血小板誘導増殖因子受容体−２、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスホーミング増殖因子−１、トランスホーミング増殖因子−２、トランスホーミング増殖因子−３、トランスホーミング増殖因子−１．２、トランスホーミング増殖因子−４、トランスホーミング増殖因子−５、潜伏トランスフォーミング増殖因子−１、トランスホーミング増殖因子結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子結合タンパク質ＩＩ、トランスホーミング増殖因子結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体タイプＩ、腫瘍壊死因子受容体タイプＩＩ、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、血管内皮細胞増殖因子及びキメラタンパク質、並びにその生物学的または免疫学的活性断片が含まれる。
免疫療法
免疫療法は、通常癌細胞を標的とし、破壊するために免疫エフェクター細胞及び分子の使用に基づいている。免疫エフェクターは、例えば標的細胞の表面上のあるマーカーを認識する本発明の抗体であり得る。前記抗体は単独で治療のエフェクターとして使用し得、または実際細胞を殺すために他の細胞を強化し得る。前記抗体を薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）にコンジュゲートさせてもよく、よって単に標的剤として使用し得る。
本発明によれば、Ａｎｇ−２の変異体は免疫療法により本発明の抗体または抗体コンジュゲートにより標的化され得る。本発明の抗体組成物はＡｎｇ−２標的治療と一緒に併用治療法で使用され得ることを特に意図される。
受動的免疫療法は多数の癌に対して特に有効であることが判明している。例えば、国際特許出願公開第９８／３９０２７号パンフレット参照。
下記実施例は例示にすぎず、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
病的組織及び正常組織におけるＡｎｇ−２発現
Ａｎｇ−２発現を正常組織及び病的組織においてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイションを用いて試験した。ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００４３２７，ヌクレオチド１２７４−１７２６）及びマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００４３２６，ヌクレオチド１１３５−１５８８）Ａｎｇ−２配列の断片を、ヒトまたはマウス胎仔肺ｃＤＮＡから逆転写酵素−ＰＣＲにより増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミドにクローン化し、配列決定により確認した。３３Ｐ標識アンチチンスＲＮＡプローブを直線化プラスミド鋳型から３３Ｐ−ＵＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。ホルムアルデヒド固定し、パラフィンに包埋させた組織のブロックを５μｍで切片化し、帯電スライド上に収集した。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイションの前に、組織を０．２Ｍ ＨＣｌで透過化し、プロテイナーゼＫで消化し、トリエタノールアミン及び無水酢酸を用いてアセチル化した。切片をラジオ標識プローブと５５℃で一晩ハイブリダイズした後、ＲＮａｓｅ消化し、約０．１×ＳＳＣ中５５℃で高ストリンジェント洗浄した。スライドをコダックＮＴＢ２エマルションに浸し、４℃で２〜３分間暴露し、展開し、対比染色した。切片を暗野及び標準照明で試験して、組織形態及びハイブリダイゼーションシグナルを同時に評価した。
結果は、正常出生後ヒトの場合にはＡｎｇ−２発現は卵巣、胎盤及び子宮のような血管原性血管系を含む数少ない組織に限定されていることを示している。正常な成人心臓、脳、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓、筋肉、扁桃、胸腺、虫垂、リンパ節、胆嚢、前立腺または精巣ではＡｎｇ−２発現は検出できなかった。５週令マウス（成体サルでもヒトでもない）では、腎臓は直細血管で顕著なＡｎｇ−２発現を示した。この発現が胚発生の残遺物であったかどうかを調べるために、この実験を１年令までのマウス由来の腎臓でマウスＡｎｇ−２プローブ及び上記した条件を用いて繰り返した。Ａｎｇ−２発現は出生後発生中に減少することが認められたが、１年令マウスの腎臓でも依然として明らかであった。
Ａｎｇ−２発現は、大腸癌（５例）、乳癌（１０例）、肺癌（８例）及びグリア芽腫（１例）のような原発性ヒト腫瘍；脳に転移した、乳癌（２例）、肺癌（２例）及び卵巣癌（２例）のような転移性ヒト腫瘍；及びＣ６（ラット神経膠腫）、ＨＴ２９（ヒト大腸癌）、Ｃｏｌｏ−２０５（ヒト大腸癌）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌）、Ａ４３１（ヒト類表皮癌）、Ａ６７３（ヒト横紋筋肉腫）、ＨＴ１０８０（ヒト繊維肉腫）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌）、Ｂ１６Ｆ１０（マウス黒色腫）、ＭｅｔｈＡ（マウス肉腫）及びルイス肺癌のようなげっ歯腫瘍モデルを含めた試験した実質的に全ての腫瘍タイプでも検出された。更に、Ａｎｇ−２発現はＶＥＧＦに応答してＭａｔｒｉｇｅｌプラグに成長する新血管及びマウスの未熟児網膜症低酸素モデルで検出された。
組換えｍＡｎｇ−２タンパク質及び家兎ポリクローナル抗−Ａｎｇ−２抗血清の作成
完全長のＨｉｓタグ付きマウスＡｎｇ−２ ｃＤＮＡは、マウス１５日令胚ｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ−ｃＤＮＡ：カタログ番号７４５９−１，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）から完全長ヒトＡｎｇ−２に対するＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲキット；カタログ番号Ｋ１９０５−０１）により得た。ＰＣＲ産物をＣＭＶプロモーター発現ベクターにライゲートし、生じたプラスミドをＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号１８１４４４３）を用いてＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞（ＡＴＣＣから入手）にトランスフェクトした。安定なクローンをＧ４１８選択により単離した。抗−ＨｉｓタグＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティングを用いてｍＡｎｇ−２−ｈｉｓ発現クローンをスクリーニングした。
組換えｍＡｎｇ−２ポリペプチドを上記細胞のならし培地（Ｃ．Ｍ．）から精製した。ｍＡｎｇ−２−Ｈｉｓを含有するＣ．Ｍ．を２段階クロマトグラフィープロトコルにより精製した。簡単に説明すると、トリス緩衝液（ｐＨ９．５）を約２０ｍＭの最終濃度まで添加することによりならし培地をｐＨ８．９とした。更に、洗剤ＣＨＡＰＳを約５ｍＭ最終濃度まで添加した。次いで、Ｃ．Ｍ．を直接アニオン交換カラムＱ−セファロースｆｆ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。次いで、カラムを約５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する約１０ｍＭ トリス（ｐＨ８．０）で洗浄した。組換えｍＡｎｇ−２−Ｈｉｓを、約３５０ｍＭ ＮａＣｌ及び約５ｍＭ ＣＨＡＰＳを含有する１０ｍＭ トリス（ｐＨ８．０）を用いて１ステップで溶離した。
Ｑ−セファロースカラムからの溶離液を約４ｍＭ イミダゾールに調節し、固定化金属アフィニティーカラム（Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフロー；Ｑｉａｇｅｎ）にかけた。結合したタンパク質を約５ｍＭ ＣＨＡＰＳ及び約１００ｍＭ イミダゾールを含有するＰＢＳで溶離した。次いで、溶離液を約１．０ｍｇ／ｍｌに濃縮した後ＰＢＳに対して透析した。ｍＡｎｇ−２−Ｈｉｓの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色により測定して９０％以上であった。
抗体を産生するために、家兎を約０．２ｍｇのｍＡｎｇ−２／注射で免疫化した。家兎にハンターＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）及びｍＡｎｇ−２（１：１）を約１ｍｌ注射した。４週間後、各家兎に繰返し注射、すなわち追加投与した。それから２週間後、更に追加投与し、７週目に血清を抜き取り、ｍＡｎｇ−２に対する力価を評価した。血清力価が高いならば、５０ｍｌの生産出血(production bleeds)を連続６週間にわたり毎週採取した。しかしながら、血清力価が低いならば、家兎に更に追加投与し、５０ｍｌの生産出血を９週目から連続６週間にわたり毎週採取した。６回連続生産出血させた後、家兎を６週間安息状態とした。更に血清が必要ならば、最後の生産出血から１ヶ月後に再び追加投与した。
（上記した）中和ＥＬＩＳＡによれば、２匹の家兎（５２５４及び５２５５）からの抗−ｍＡｎｇ−２家兎ポリクローナル抗血清はｍＡｎｇ−２：Ｔｉｅ２相互作用を中和することが認められた。
Ａｎｇ−２抗体を評価するための分子アッセイ
Ａｎｇ−２及び関連ファミリーメンバーへの直接抗体結合及びＡｎｇ−２：Ｔｉｅ２相互作用に対する抗体の効果を評価するために分子アッセイ（アフィニティーＥＬＩＳＡ、中和ＥＬＩＳＡ及びＢＩＡｃｏｒｅ）が開発された。以下、これらのインビボ及び細胞ベースアッセイについて説明する。
Ａ．アフィニティーＥＬＩＳＡ
候補抗−Ａｎｇ−２抗体を最初にスクリーニングするために、精製ヒトＡｎｇ−２（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．：カタログ番号６２３−ＡＮ、Ａｎｇ−２は２つの切断型の混合物として提供されている）またはマウスＡｎｇ−２ポリペプチド（上記したように作成）を使用した。確証的結合アッセイのために、ヒトＡｎｇ−２を完全長ヒトＡｎｇ−２ ＤＮＡをトランスフェクトしたヒト２９３Ｔ細胞のならし培地から得、約５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルルブミン（ＢＳＡ）を含有する無血清ＤＭＥＭにおいて培養した。
微量測定プレートを用いて、約１００μｌ／ウェルのＡｎｇ−２を各ウェルに添加し、プレートを約２時間インキュベートした後、プレートを約０．１％ ツイーン２０を含有するリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を用いて４回洗浄した。次いで、ウェルを約２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ中約５％ ＢＳＡを用いてブロックし、プレートを室温において約２時間インキュベートした。インキュベート後、過剰のブロッキング液を捨て、約１００μｌの候補抗−Ａｎｇ−２抗体を各ウェルに約４０ナノモルから始め、その後約１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで４倍希釈する連続希釈法で添加した。次いで、プレートを室温において一晩インキュベートした。インキュベート後、プレートを約０．１％ ツイーン２０を含有するＰＢＳで洗浄した。洗浄を更に４回繰り返した後、予め１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＰＢＳで１：５０００希釈したヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，；カタログ番号３１４１６）を約１００μｌ／ウェル添加した。プレートを室温において約１時間インキュベートした。次いで、プレートを約０．１％ ツイーン２０を含有するＰＢＳで５回洗浄した後、約１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン液体基質システム；ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ；カタログ番号Ｔ８６６５）基質を添加し、青色が発色するまでプレートを約５〜１５分間インキュベートした。次いで、約３７０ｎｍで吸光度を分光光度計を用いて測定した。
Ｂ．中和ＥＬＩＳＡ
ヒトＡｎｇ−２ポリペプチドを結合した微量測定プレートをアフィニティーＥＬＩＳＡに関して上記したように作成した。候補抗−Ａｎｇ−２抗体を、約１％ ＢＳＡ及び約１ｎＭ Ｔｉｅ２（Ｔｉｅ２部分が分子の可溶性細胞外部分のみを含むＴｉｅ２−Ｆｃ分子として提供されている；Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．：カタログ番号３１３−ＴＩ）を含有するＰＢＳの溶液中でアフィニティーＥＬＩＳＡに関して上記した連続希釈法で作成した。約１００μｌの抗体／Ｔｉｅ２溶液を各ウェルに添加した後、プレートを室温において一晩インキュベートし、次いで約０．１％ ツイーン２０含有ＰＢＳで５回洗浄した。洗浄後、約１００μｌ／ウェルの抗−Ｔｉｅ２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｉｎｃ．；カタログ番号５５７０３９）を約１μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、プレートを室温において約１時間インキュベートした。次いで、約１００μｌ／ウェルのヤギ抗−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ．；カタログ番号３１４３２）を約１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：１００００希釈して添加した。プレートを室温において約１時間インキュベートした後、約０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳで５回洗浄した。次いで、約１００μｌ／ウェルの（上記した）ＴＭＢ基質を添加し、発色させた。次いで、約３７０ｎｍで吸光度を分光光度計を用いて測定した。
Ｃ．アフィニティーＢＩＡｃｏｒｅ
各候補Ａｎｇ−２抗体のアフィニティー分析をランニング緩衝液としてＰＢＳ及び０．００５％ Ｐ２０界面活性剤（ニュージャージー州ピスカタウェーに所在のＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用い、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて実施した。組換えプロテインＧ（マサチューセッツ州ニーダムに所在のＲｅｐｌｉｇｅｎ）をアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を製造業者の示唆プロトコルに従って用いて第１級アミン基を介して研究グレードのＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）に固定化した。
結合アッセイを、まず約１００ＲＵの各候補抗−Ａｎｇ−２抗体を固定化プロティンＧに結合させた後、各種濃度（０〜１００ｎＭ）のｈｕＡｎｇ−２またはｍＡｍｇ−２を結合抗体表面上に約５０ｕｌ／分の流速で約３分間注入することにより実施した。ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）及びＫＤ（解離平衡定数）を含めた抗体結合キネティックスをＢＩＡ評価３．１コンピュータープログラム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。解離平衡定数が低ければ、抗体のＡｎｇ−２に対するアフィニテイーが高いことを示す。
完全長Ａｎｇ−２抗体のファージディスプレーによる産生
完全ヒトＡｎｇ−２抗体を、ヒトＡｎｇ−２ポリペプチド（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，カタログ番号６２３−ＡＮ）に対してＴａｒｇｅｔ ＱｕｅｓｔファージディスプレーＦａｂライブラリー（Ｔａｒｇｅｔ Ｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．）を以下のプロトコルに従ってパニングすることにより作成した。
ヒトＡｎｇ−２をポリスチレン磁気ビーズの表面上に（１）４℃において５０ｕｇ／ｍｌのＡｎｇ−２を一晩直線コーティングする；及び（２）４℃においてＡｎｇ−２を５０ｕｇ／ｍｌのヤギ抗−Ａｎｇ−２抗体で一晩間接捕捉するという２つの方法により固定化した。ビーズ表面をＰＢＳ中２％ ミルク（ＭＰＢＳ）によりブロックした。ヒトＦａｂファージライブラリーを予備選択して、非被覆磁気ビーズまたはヤギ抗−Ａｎｇ−２抗体に反応するファージクローンを除去した。次いで、Ａｎｇ−２被覆磁気ビーズを室温においてライブラリーファージと１．５時間インキュベートした。ファージ結合ステップの後、表面を約０．１％ ツイーン２０含有ＭＰＢＳで６回、その後約０．１％ ツイーン２０含有ＰＢＳで６回、その後ＰＢＳで２回洗浄した。結合したファージをまず約１００ｕｇ／ｍｌのヒトＴｉｅ２−Ｆｃ（ミネソタ州ミネアポリスに所在のＲ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、次いで約１００ｍＭ トリエタノールアミンで溶離させた。溶離したファージを大腸菌ＴＧ１細胞に感染させた。増幅し、次回スクリーニングのためにレスキューした。より厳格な洗浄を組み込み、入力ファージの回数を減らすことによりその後のスクリーニングにおける選択圧を上昇させた。３回の選択後、１８個のユニークなＡｎｇ−２結合Ｆａｂクローンを同定した。これらは実質的にすべて上記したＥＬＩＳＡアフィニティーアッセイを用いて測定してヒトＡｎｇ−２、マウスＡｎｇ−２及びラットＡｎｇ−２と認められた。前記ファージの約１０％がヒトＡｎｇ−１にも結合した。前記クローンを以下のようにＩｇＧ１抗体に変換させた。
更にユニークファージを得るために、同一ライブラリーを用いるがプロトコルを若干変更して第２回スクリーニングを実施した。このプロトコルでは、ヒトＡｎｇ−２を約４℃においてＮｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐイムノチューブ中ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）において一晩平板培養した。Ａｎｇ−２を第１回、第２回及び第３回パニングでそれぞれ約１．５、０．７４及び０．３ｕｇ／ｍｌで平板培養した。イムノチューブ表面をＰＢＳ中約２％ ミルク（ＭＰＢＳ）を用いてブロックした後、約４ｍｌの２％ ＭＰＢＳ中で上記した同一ファージディスプレイライブラリー（Ｔａｒｇｅｔ Ｑｕｅｓｔ）からの約２兆個のファージ粒子（ライブラリー中約５０コピーの各ユニークファージ）とインキュベートした。ファージインキュベーションステップ後、表面をＰＢＳ＋約０．１％ ツイーン２０で２０回、その後ＰＢＳで２０回洗浄した。結合したファージを１ｕＭ ｈＡｎｇ−２または１ｕＭ ヒトＴｉｅ２（上記したＲ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて溶離させた。溶離したファージを大腸菌ＴＧ１細胞（ファージライブリーと一緒に提供された）に感染させ、増幅し、次回スクリーニングのためにレスキューした。１６個のユニークなＡｎｇ−２結合ＦａｂクローンをＰＣＲ増幅により同定した。全てのファージがヒトＡｎｇ−２またはＴｉｅ２に結合し、これらのクローンを制限消化により分析した。各クローンのＤＮＡを配列決定した。
各ファージ由来の各重鎖の可変領域をコードする配列を相補的プライマーを用いて増幅させた。前記プライマーは、可変領域の５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＸｂａＩ部位、コザック配列及びシグナル配列（翻訳ペブチドはＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣである；配列番号６９）を挿入するように設計されており、ＰＣＲ産物の３’末端にＢｓｍＢＩ部位を付加した。重鎖をクローンさせる方法の例として、クローン５４４（配列番号１９）の鋳型ファージＤＮＡを、シグナル配列の最後の７アミノ酸を付加したプライマー２２４８−２１（ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＣＣＡ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＣＡ Ｇ；配列番号７０）及び可変領域の末端にＢｓｍＢＩ部位を付加したプライマー２５０２−３１（ＡＴＴ ＡＣＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＧＴ ＴＣＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＡＣ；配列番号７１）を用いて増幅した。生じた産物を、シグナルペプチドに９アミノ酸（ＡＱＬＬＧＬＬＬＬ；配列番号７３）を付加したプライマー２１４８−９８（ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＧＧＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＴＡＴ ＴＧＴ ＧＧＴ ＴＧＡ ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＡＴ；配列番号７２）及びプライマー２５０２−３１、次いでプライマー２４８９−３６（ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＧＧＧ；配列番号７４）及びプライマー２５０２−３１を用いて増幅させた。プライマー２４８９−３６は、５’から３’に向かってＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＸｂａＩ部位、コザック配列及びシグナル配列の最初の６つのアミノ酸を付加した。ＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＢｓｍＢＩで消化した後、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクターにクローン化した。このベクターはＳＶ４０プロモーター及びＤＨＦＲ選択を含む。
各ファージ由来の軽鎖はκまたはλクララスであった。各軽鎖について、相補的プライマーは、５’から３’に向かってＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＸｂａＩ部位、コザック配列及びシグナル配列（上記）を付加するように設計された。誤りのないコード領域を有する上記鎖を完全長産物としてクローン化した。１例として、ファージクローン５３６（配列番号１１）由来の軽鎖を、シグナル配列の最後の７アミノ酸を付加したプライマー２６２７−６９（ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＧＡ ＣＡＴ ＴＧＴ ＧＡＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＴＣＣ；配列番号７５）及びストップコドンの後にＳａｌＩ部位を付加したプライマー２４５８−５４（ＣＴＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＴＡ ＴＴＡ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴＴ Ｇ；配列番号７６）を用いて完全長コード領域として増幅させた。次いで、このＰＣＲ産物を上記したようにそれぞれプライマー２４５８−５４の対として追加５’プライマー２１４８−９８及び２４８９−３６を用いて増幅させて、シグナル配列及びクローニング部位を付加した。完全長軽鎖をＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片として上記した哺乳動物発現ベクターにクローン化した。
幾つかのλクローンは、天然のヒト定常域配列に比してその定常領域に誤りを有していた。これらの差異を補正するために、重複ＰＣＲを完全λ定常領域及びファージ由来可変領域をコードするＤＮＡを用いて実施した。これらのクローンも上記したようにＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片としてクローン化した。
κ可変領域を定常領域とは別にクローン化したとき、ＰＣＲ産物の３’末端にＢｓｍＢＩ部位が付加された。ＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＢｓｍＢＩで消化後、κ鎖可変領域をヒトκ鎖可変領域を含む発現ベクターにクローン化した。
各変換ファージ由来の対の軽鎖及び重鎖構築物をリン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を通常製造業者が示唆するプロトコルに従って用いてＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクトから１４〜１６時間後に培地を交換し、細胞を約４８時間後選択のために製造業者が推奨するように組織培養皿で経代させた。トランスフェクトした細胞を約３週間ＨＴ選択により単離し、この時点でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞コロニーをトリプシン処理し、トランスフェクトした細胞の“プール”に合わせた。
４８時間後小規模のならし培地を集め、抗−ヒトＦｃ抗体、抗−ヒトκ抗体または抗−ヒトλ抗体のいずれかを用いるウェスタンブロットにより抗体産生についてアッセイした。次いで、選択した細胞集団を、４つの８５０ｃｍ２ローラーボトルにそれぞれ２×１０７生細胞を接種し、ＤＭＳＯを用いて凍結ストック細胞株を作成するのに十分な細胞を得るまで一般的な組織培養滅菌法を用いて選択圧下で経代した。接種後、細胞をローラーボトル中にグルタミン及び非必須アミノ酸を補充した約１０％ 血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｉｎｃ）で維持した。約８０％の細胞集密度に達するまで細胞を２〜３日間維持した。この時点で、ローラーボトル中の培地をグルタミン及び非必須アミノ酸を補充した無血清培地混合物（５０％ ＤＭＥＭ，５０％ Ｆ１２；Ｇｉｂｃｏ）に交換した。７日後、ならし培地を収集し、１または２収集毎に新しい無血清培地を加えた。
抗体をならし培地から直接標準方法を用いてプロティンＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。プロティンＧカラムから低ｐＨ（ｐＨ約３）緩衝液を用いて溶離させ、その後溶離した抗体タンパク質を１Ｍ トリス（ｐＨ８．５）を用いて中和し、その後１０ｋＤ分子量カットオフ遠心濃縮機を用いて濃縮した。次いで、濃縮した抗体ストックをＰＢＳに緩衝液交換した。
３１個の抗体を作成し、各抗体は下表２に示すように２つの重鎖及び２つの軽鎖（κまたはλ）から構成されている。
Figure 0005044608
 ＊本明細書に記載されているようにｈＡｎｇ−２、ｍＡｎｇ−２およびｈＡｎｇ−１への結合に対して試験した。
以下の４つの表はファージを完全長ＩｇＧ１抗体に変換させた３１個の抗−Ａｎｇ２抗体の重鎖及び軽鎖（κ及びλ）の配列及び配列番号を示す。モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、Ｋａｂａｔら，「免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｌｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，米国保健福祉省，第５版）に記載されている方法を用いるＶＢＡＳＥデーターベースを用いて予測した。Ｆａｂ領域を最も近い生殖細胞系配列を含むデーターベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ／ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ．ｈｔｍｌ参照）中の配列とアラインさせ、実際に前記配列と比較した。各可変領域（重鎖または軽鎖）のＣＤＲを表７に示す。
Figure 0005044608
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１７個の抗体及びネガティブコントロールＩｇＧ１（ＲＤＢＩと呼ぶ）をアフィニティー及び中和ＥＬＩＳＡ（上記実施例３に記載した）、ＢＩＡｃｏｒｅ中和アッセイを用いて試験して、アティニテイー、中和及び特異性の能力を調べた。結果を下表８に示し、標準の手順を用いて計算した。
Figure 0005044608
Figure 0005044608
クローン５３６及びクローン５４５の２個の抗体を上記したＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて評価した。抗体結合をＢＩＡｃｏｒｅアッセイについて上記したように測定した。ＫＤが低いことはアフィニティーが高いことを示している。結果を下表９に示す。
Figure 0005044608
抗−Ａｎｇ−２抗体を用いる治療効率の研究
プロティンＧ精製した家兎抗−Ａｎｇ−２ポリクローナル抗体の薬物動態をマウスで試験した。２４匹のマウスをポリクローナル抗−Ａｎｇ−２家兎抗体（１ｍｇ／マウス）で処置した。処置したマウス４匹を抗体を注射してから１時間、６時間、１日、３日、７日及び１４日後の各時点で殺した。
結果は、全家兎ＩｇＧが血清中約１９日の循環半減期を有していたのに対して、全ＩｇＧの抗−Ａｎｇ−２ ＩｇＧ成分は約８日の半減期を有していることを示した。
治療効率を評価するために、Ａ４３１腫瘍異種移植片を持つマウス（１群１０匹）に移植してから１、５、６、７、８、１２、１３、１４、１５及び１８日目にプロティンＧ精製抗−Ａｎｇ−２ポリクローナル抗体を１０回腹腔内投与した（約１０ｍｇ ＩｇＧ／マウス／投与）。腫瘍サイズを７、１２、１５、１９及び２１日目に測定した。体重を０、７、１５及び２１日目に測定し、体重は治療により影響されなかった。結果は、ＡＮＯＶＡの繰り返し測定により、抗−Ａｎｇ−２−ポリクローナル抗体がＡ４３１腫瘍異種移植片の増殖を非免疫精製ポリクローナル抗血清（１０ｍｇ ＩｇＧ／マウス／投与）及びビヒクル（ＰＢＳ）のコントロールに比して約５０％（ｐ＝０．００８）抑制することを示した。
完全ヒトモノクローナル抗−Ａｎｇ−２抗体の効果をインビボで試験するために、Ａ４３１腫瘍異種移植片を持つマウス（１群１０匹）に対して抗−Ａｎｇ−２抗体のクローン５３３、５３７または５４４、或いはネガティブコントロールのＰＢＳまたはヒトＩｇＧ１−κを腹腔内投与した。最初は約４２０ｕｇ／マウスのタンパク質を投与し、その後３回は約１４０ｕｇ／マウスのタンパク質を投与し、その後４回は約５５ｕｇ／マウスのタンパク質を投与し、全部で８回／マウス投与した。腫瘍容量及び体重を１週間に２回記録した。研究の最後に、動物を殺し、ＥＬＩＳＡにより抗体レベルを測定するために血清を集めた。腫瘍及び数個の正常組織を全ての群から集めた。
図１に示すように、抗−Ａｎｇ−２処理群とコントロール群の間で腫瘍増殖の点で顕著な差が見られた。３つの抗−Ａｎｇ−２処理群は全てコントロールに比して腫瘍増殖を抑制した（３個全ての抗体についてＡＮＯＶＡの繰り返し測定を用いて、全ての処理群でｈＩｇＧ１に対してｐ＜０．００５）。対照的に、コントロール群の腫瘍は非常に速い速度で増殖し続けた。
エピトープマッピング
完全長（アミノ酸１〜４９５）、Ｎ末端（アミノ酸１〜２５４）及びＣ末端（アミノ酸２５５〜４９５）ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）タンパク質をＣ末端６ｘＨｉｓタグを有するＣＭＶドライブ哺乳動物発現ベクターにクローン化した。生じた３つの構築物及びベクターコントロールを一過的に２９３Ｔ細胞に発現させた。次いで、トランスフェクトした細胞からならし培地を集め、前記培地におけるＡｎｇ−２の発現レベルを抗−６ｘｈｉｓ ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティングにより推定した。
抗−Ａｎｇ−２抗体及びペプチ体の結合エピトープを、ヒトｈＡｎｇ−２の３つのバージョンを結合する能力をＥＬＩＳＡにより以下のプロトコルに従って測定した。高結合９６ウェルアッセイプレートを１００μｌ／ウェルのならし培地で被覆し、３７℃において１時間インキュベートした。ならし培地を吸引し、プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中５％ ＢＳＡで室温において１時間ブロックした。その後、ブロッキング溶液を吸引した。１００μｌ／ウェルの抗体、ペプチ体またはＴｉｅ２−ＦｃをＰＢＳ中１％ ＢＳＡ中に１μｇ／ｍｌで添加し、室温において１時間インキュベートした。ウェルを２００μｌのＰＢＳ中の１％ ツイーンで４回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＧまたはヤギ抗−マウスＩｇＧを添加し、室温において４５分間インキュベートした。次いで、ウェルを２００μｌのＰＢＳ中０．１％ ツイーンで４回洗浄した。次いで、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を添加した。Ｏ．Ｄ．を３７０ｎｍで測定した。
結果を図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃに示す。

Claims (15)

  1. 重鎖および軽鎖を含む単離抗体であって、前記重鎖は配列番号１１の残基２６-３６、５０−６６及び９６−１１２に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、前記軽鎖は配列番号１２の残基２３−４０、５４−６２及び９３−１０２に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、アンギオポエチン−１（Ａｎｇ−１）及びアンギオポエチン−２（Ａｎｇ−２）に結合する前記抗体。
  2. 重鎖可変領域が配列番号１１を含み、軽鎖可変領域が配列番号１２の残基２３−４０、５４−６２及び９３−１０２に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  3. 重鎖可変領域が配列番号１１の残基２６-３６、５０−６６及び９６−１１２に対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が配列番号１２を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  4. 重鎖可変領域が配列番号１１を含み、軽鎖可変領域が配列番号１２を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  5. 配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域または配列番号１１の残基２６-３６、５０−６６及び９６−１１２に対応する、少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むその抗原結合フラグメント、ならびに配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域または配列番号１２の残基２３−４０、５４−６２及び９３−１０２に対応する、少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むその抗原結合フラグメントを含み、アンギオポエチン−１（Ａｎｇ−１）及びアンギオポエチン−２（Ａｎｇ−２）に結合する単離抗体。
  6. ａ）重鎖の骨格領域、配列番号１１の残基２６-３６に対応するＣＤＲ１を含む重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の残基５０−６６に対応するＣＤＲ２を含む重鎖ＣＤＲ２領域及び配列番号１１の残基９６−１１２に対応するＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲ３領域、ならびに
    ｂ）軽鎖の骨格領域、配列番号１２の残基２３−４０に対応するＣＤＲ１を含む軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１２の残基５４−６２に対応するＣＤＲ２を含む軽鎖ＣＤＲ２領域及び配列番号１２の残基９３−１０２に対応するＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含み、
    アンギオポエチン−１（Ａｎｇ−１）及びアンギオポエチン−２（Ａｎｇ−２）に結合する単離抗体。
  7. モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体である、請求項１または５に記載の単離抗体。
  8. 一本鎖抗体である、請求項７に記載の抗体。
  9. レポーター基、水溶性ポリマー、Ｆｃ領域及び細胞毒性物質からなる群より選択される分子に結合している、請求項７または８に記載の抗体。
  10. 一本鎖Ｆｖ抗体である、請求項８に記載の抗体。
  11. Ｆａｂ抗体フラグメントである、請求項８に記載の抗体。
  12. Ｆａｂ’抗体フラグメントである、請求項８に記載の抗体。
  13. （Ｆａｂ’）２抗体フラグメントである、請求項８に記載の抗体。
  14. 請求項７に記載の単離抗体および薬学的に許容される製剤化物質を含む医薬組成物。
  15. 請求項７に記載の単離抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
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