JP4152315B2 - 線維芽細胞増殖因子−８に対するヒト化抗体および該抗体断片 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、ＦＧＦ−８に対する抗体、特にヒト化抗体および該抗体断片に関する。本発明はさらに、上記の抗体および該抗体断片をコードするＤＮＡ配列に関する。本発明は、該ＤＮＡ配列を含んでなるベクターおよび該ベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。本発明はさらに、該宿主細胞を用いた上記の抗体および該抗体断片の製造方法、ならびに該抗体および該抗体断片を用いる癌の治療薬および診断薬に関する。
背景技術
アンドロジェン誘導増殖因子（ＡＩＧＦ）は、１９９２年に性ホルモン依存的増殖を示すマウス乳癌細胞株ＳＣ−３（Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７，４５９，１９８７）の培養上清より単離された因子である。ＡＩＧＦは、アンドロジェン刺激により誘導産生され、オートクライン的にＳＣ−３細胞を増殖させる因子である（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，８９２８，１９９２）。遺伝子クローニングの結果、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーとアミノ酸配列で３０〜４０％の相同性を有することが明らかとなり、ＦＧＦ−８と命名された。その後、マウスＦＧＦ−８遺伝子をプローブとしてヒト胎盤ゲノムライブラリーよりヒトＦＧＦ−８遺伝子がクローン化され、マウスＦＧＦ−８と塩基配列で８５％、アミノ酸配列で１００％一致することが示された（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３６３，２２６，１９９５）。従来より、前立腺癌や乳癌などの性ホルモン依存的増殖を示す癌においては、性ホルモン誘導性の増殖因子がオートクライン的に作用していると推測されてきたが、ＦＧＦ−８の発見は、マウスの系ではあるものの、この仮説を初めて実証したものであった。ヒトにおいても同様の機構でＦＧＦ−８が癌の発生や増殖に関与していることが推測されたが、これまでのところ、証明されるに至っていない。しかし、ＦＧＦ−８の添加により、ある種のヒト前立腺癌細胞株の増殖が促進されること（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３６３，２２６，１９９５）、前立腺癌、乳癌、卵巣癌の各種ヒト癌細胞株でＦＧＦ−８のｍＲＮＡの発現が確認されていること（Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ．，７，１４２５，１９９６、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，１０５３，１９９９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８８，７１８，２０００）、前立腺癌、乳癌、卵巣癌のヒト癌組織で正常組織と比較してＦＧＦ−８が過剰発現していることが報告され（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８，２０５３、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，２７５５，１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，１０５３，１９９９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８８，７１８，２０００）、ヒトにおいてもＦＧＦ−８が癌細胞の性ホルモン依存的増殖にオートクラインまたはパラクライン的に関与している可能性が指摘されている。一方で、ホルモン非依存性のヒトの各種前立腺癌細胞、前立腺癌組織、乳癌細胞（Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ．，７，１４２５，１９９６、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，２７５５，１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，１０５３，１９９９）おいてもＦＧＦ−８の高率な発現が認められることなどから、ＦＧＦ−８が性ホルモンを介さない発現制御を受けている可能性も十分あると考えられる。さらに、ＦＧＦ−８のアンチセンスがｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏでのホルモン非依存前立腺癌細胞株の増殖を抑制したとの報告もあり（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１６，１４８７，１９９８）、ホルモン依存性を消失した癌においてもＦＧＦ−８依存的な増殖機構の存在が示唆されている。
以上のような事実から、ＦＧＦ−８に対する抗体は、癌細胞に対するＦＧＦ−８の生物学的機能の解析、さらには、前立腺癌および乳癌などの癌細胞の免疫学的検出法を用いた診断に有効である。さらに、ＦＧＦ−８の機能を阻害する中和抗体であれば、ＦＧＦ−８の生物学的機能の解析、さらには、前立腺癌および乳癌、卵巣癌などの癌の診断、性ホルモン依存癌および性ホルモン非依存癌の治療にも有効であることが期待される。そこで、本発明者らは、ＦＧＦ−８に対する抗体の作製を行い、その結果、ＦＧＦ−８に特異的に反応し、かつＦＧＦ−８の機能を阻害するマウスモノクローナル抗体ＫＭ１３３４を作製することに成功した（特開平９−２７１３９１）。
一方、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＡＭＡ）が誘導されることが知られている。ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２，８８１，１９８４、Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９，１９８５、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０，９３２，１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，１２４２，１９８５）、マウス抗体の体内からの消失を速め（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６，１０１１，１９８５、Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９，１９８５、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０，９３７，１９８８）、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０，１９８５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６，６４８９，１９８６）。
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みられている。
ヒト型キメラ抗体とは、抗体Ｖ領域がヒト以外の動物の抗体で、Ｃ領域がヒト抗体である抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１，１９８４）、ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２，１９８６）。これらのヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体に比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、免疫原性および血中での安定性に関しては、ヒト型キメラ抗体では、ヒトに投与した場合、マウス抗体に比べて血中半減期が約６倍伸びたことが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，４２２０，１９８９）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体においても、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，１１１８，１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８，１９９５）。すなわち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒトにおいて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。
また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（ＣＨ）として１サブクラスを使用すれば、抗体依存性細胞障害活性などのエフェクター機能の高いヒト化抗体を作製することができる（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，１１１８，１９９６）。エフェクター機能の高いヒト化抗体は、抗原が癌細胞などの細胞表面上に存在し、標的細胞の破壊が望まれる場合には、極めて有用である。一方、単に標的分子を中和する作用のみが必要とされる場合やエフェクター機能による標的細胞の破壊による副作用が懸念される場合には、ヒト抗体のＣＨとして４サブクラスを使用すれば、４サブクラスは一般的にエフェクター機能が低いため（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６，１３５１，１９８７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６８，１３５１，１９８８）、副作用を回避でき、かつ、マウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８，１９９５）。さらには、ヒト化抗体は、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３，１９８８）、Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，６２９，１９９７）、ｄｓＦｖ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９，１９９５）、ＣＤＲを含むペプチド（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９６６，１９９６）などの、分子量の小さい抗体断片としても作製でき、これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ、標的組織への移行性に優れている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２，３４０２，１９９２）。
以上の事実は、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、マウス抗体などのヒトを除く動物の抗体よりもヒト化抗体の方が望ましいことを示している。
以上述べてきたように、ＦＧＦ−８に対して特異的に反応し、かつ、ＦＧＦ−８の機能を阻害するヒト化抗体または該抗体断片ができれば、ＦＧＦ−８が関与する癌などの疾患のより効果的な診断薬、治療薬となり得ると考えられるが、これまでのところそのような抗体または該抗体断片は作製されていない。
発明の開示
本発明の目的は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌などの増殖因子と考えられるＦＧＦ−８に特異的に反応し、さらにＦＧＦ−８の生物学的機能を阻害するヒト化抗体または該抗体断片を提供することにある。
本発明者らは、ＦＧＦ−８に対するＩｇＧ１サブクラスのマウス抗体ＫＭ１３３４を生産するハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５１）より抗体Ｈ鎖ｃＤＮＡおよびＬ鎖ｃＤＮＡを取得し、それらのＶ領域およびＣＤＲが新規なアミノ酸配列を有することを見出し、該新規Ｖ領域またはＣＤＲからなるＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域（ＣＬ）をコードするｃＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにクローニングしてヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより抗ＦＧＦ−８ヒト型キメラ抗体および抗ＦＧＦ−８ヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現、精製し、本発明を完成させた。
（１） 線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）に特異的に反応し、かつＦＧＦ−８の生物学的機能を阻害するヒト化抗体または該抗体断片。
（２） ヒト化抗体または該抗体断片が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む上記（１）記載のヒト化抗体または該抗体断片。
（３） ヒト化抗体または該抗体断片が、それぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む上記（１）記載のヒト化抗体または該抗体断片。
（４） ヒト化抗体または該抗体断片が、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、およびそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片。
（５） ヒト化抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
（６） ヒト型キメラ抗体が、ＦＧＦ−８に対するモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）および軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域を含む、上記（５）記載の抗体または該抗体断片。
（７） ヒト型キメラ抗体が、ＦＧＦ−８に対するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域（ＶＨ）およびＬ鎖Ｖ領域（ＶＬ）、ならびにヒト抗体のＨ鎖定常領域（Ｃ領域）およびＬ鎖Ｃ領域からなる、上記（５）または（６）記載の抗体または該抗体断片。
（８） 抗体のＶＨが配列番号４０で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載のヒト型キメラ抗体または該抗体断片。
（９） 抗体のＶＬが配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載のヒト型キメラ抗体または該抗体断片。
（１０） 抗体のＶＨが配列番号４０、ＶＬが配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載のヒト型キメラ抗体または該抗体断片。
（１１） 抗体のＶＨが配列番号４０、ＶＬが配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載のヒト型キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＫＭ３３３４または該抗体断片。
（１２） ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に対するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを含む、上記（５）記載の抗体または該抗体断片。
（１３） ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に対するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲとヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、上記（５）または（１２）記載の抗体または該抗体断片。
（１４） ヒト型ＣＤＲ移植抗体が、ＦＧＦ−８に対するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲとヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ、ならびにヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域からなる、上記（５）、（１２）および（１３）のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
（１５） 抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）、（１２）〜（１４）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（１６） 抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）、（１２）〜（１４）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（１７） 抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）、（１２）〜（１４）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（１８） 抗体のＶＨが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、上記（５）、（１２）〜（１７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（１９） 抗体のＶＬが、配列番号１７で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、上記（５）、（１２）〜（１７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（２０） 抗体のＶＨが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒ、ならびに抗体のＶＬが、配列番号１７で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、上記（５）、（１２）〜（１７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（２１） 抗体のＶＨが配列番号１６または１８で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）および（１２）〜（２０）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（２２） 抗体のＶＬが配列番号１７、１９、３８または３９で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）および（１２）〜（２０）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（２３） 抗体のＶＨが配列番号１６または１８、ＶＬが配列番号１７、１９、３８または３９で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）および（１２）〜（２０）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（２４） 抗体のＶＨが配列番号１６、ＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）および（１２）〜（２０）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（２５） 抗体のＶＨが配列番号１６、ＶＬが配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）および（１２）〜（２０）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（２６） 抗体のＶＨが配列番号１６、ＶＬが配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む、上記（５）および（１２）〜（２０）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片。
（２７） 抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２量体化Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドから選ばれる抗体断片である上記（１）〜（２６）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（２８） 上記（１）〜（２７）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（２９） 上記（２８）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（３０） 上記（２９）記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（３１） 上記（３０）記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に上記（１）〜（２７）のいずれか１項に記載のヒト化抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする該抗体または該抗体断片の製造方法。
（３２） 上記（１）〜（２７）のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する医薬。
（３３） 上記（１）〜（２７）のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する癌の治療薬。
（３４） 上記（１）〜（２７）のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する癌の診断薬。
本発明はＦＧＦ−８に特異的に反応し、かつ、ＦＧＦ−８の生物学的機能を阻害するヒト化抗体および該抗体断片に関する。
ＦＧＦ−８の生物学的機能としては、前立腺癌、乳癌、卵巣癌などの各種癌細胞に対する性ホルモン依存的および非依存的な増殖促進活性（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，８９２８，１９９２）、血管新生作用（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０，２７９１，２００１）、関節の発生における機能（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７，２４７１，２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，２６，４６０，２０００）などがあげられる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
本発明のヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＦＧＦ−８に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（ｈＩｇ）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、γ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ＦＧＦ−８に特異的に反応するヒト型キメラ抗体（抗ＦＧＦ−８キメラ抗体）としては、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなる抗体重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）の相補性決定領域（以下、ＣＤＲと略記する）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むヒト型キメラ抗体、好ましくはＶＨが配列番号４０で示されるアミノ酸配列および／またはＶＬが配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体があげられる。具体的には、抗体のＶＨが配列番号４０記載のアミノ酸配列、ヒト抗体のＣＨがγ１サブクラスのアミノ酸配列から成り、抗体のＶＬが配列番号４１記載のアミノ酸配列、ヒト抗体のＣＬがκクラスのアミノ酸配列からなる抗体ＫＭ３０３４があげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＦＧＦ−８に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、γ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ＦＧＦ−８に特異的に反応するヒト型ＣＤＲ移植抗体（抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体）としては、それぞれ配列番号５、６、７で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号８、９、１０で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、好ましくは抗体のＶＨが配列番号１６および／またはＶＬが配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、より好ましくはＶＨが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＬが、配列番号１７で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８４番目のＳｅｒ、８７番目のＡｒｇおよび９５番目のＴｙｒ、ならびに抗体のＶＬが、配列番号１７で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕおよび９２番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。具体的に、ＶＨとしては、配列番号１６に示されるアミノ酸配列のうち、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、９５番目のＴｙｒの６残基をそれぞれＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅに改変した配列番号１８に記載のアミノ酸配列があげられる。ＶＬとしては、配列番号１７で示されるアミノ酸配列のうち、２番目のＩｌｅ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの６残基をそれぞれＶａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した配列番号１９に記載のアミノ酸配列、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの４残基をそれぞれＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した配列番号３８に記載のアミノ酸配列、２番目のＩｌｅ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの３残基をそれぞれＶａｌ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した配列番号３９記載のアミノ酸配列があげられる。
具体的には、抗体のＶＨが配列番号１６または１８で示されるアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＬが配列番号１７、１９、３８または３９で示されるアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号１６または１８、ＶＬが配列番号１７、１９、３８または３９で示されるアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられ、好ましくは抗体のＶＨが配列番号１６、ＶＬが配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号１６、ＶＬが配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号１６、ＶＬが配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられる。
本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、ＦＧＦ−８に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）_２は、ＦＧＦ−８に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはＳ−Ｓ結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、ＦＧＦ−８に特異的に反応するＦ（ａｂ’）_２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のｓｃＦｖは、ＦＧＦ−８に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＤｉａｂｏｄｙは、例えば、ＦＧＦ−８に特異的に反応する２価のＤｉａｂｏｄｙは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、３〜１０残基のポリペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりＤｉａｂｏｄｙを発現させ、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものである。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のｄｓＦｖは、ＦＧＦ−８に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることにより製造することができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ＦＧＦ−８に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするｃＤＮＡを構築し、該ｃＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
以下に、ＦＧＦ−８に特異的に反応し、かつ、ＦＧＦ−８の機能を阻害するヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体および抗体断片の作製方法、活性評価方法およびそれらの使用方法について説明する。
１．ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３，１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７，１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３，１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８，１５２７，１９８１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３，１９９０）、ｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９，１９９３）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーター（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７，１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０，１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９，１９８５）とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７，１９８３）などがあげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１，１９９４）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９，１９９８）などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下の様にして取得する。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域あるいはＶ領域をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマから全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３，１９８７）、また、全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）などがあげられる。また、ハイブリドーマからｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）、あるいは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８，１９９２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４，１９８９）、λｚａｐ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９，１９８５）、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０，１９８３）およびｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１，１９９２）、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０，１９５４）、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８，１９８３）、ＮＭ５２２（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１，１９８３）、Ｋ８０２（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８，１９６６）およびＪＭ１０５．（Ｇｅｎｅ，３８，２７５，１９８５）などが用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）らのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３，１９７７）などの反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ＡＢＩ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列を同定することができる。
さらに、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ等に対してＢＬＡＳＴ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３，１９９０）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有するプラスミドを鋳型として、抗体のＶＨおよびＶＬを、適当な制限酵素の認識配列とＶ領域をコードする塩基配列よりなる５’末端側と３’末端側のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、それぞれの増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、本項１の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。得られたプラスミドより、抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを単離し、本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下の様にして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられるが、それらの中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項１の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、本項１の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６，１９９１）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６，１９９１）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５，１９７７）あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１，１９９４）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項１の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流に、本項１の（４）および（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項１の（４）および（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングすることができる。
（７）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項１の（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，７４１３，１９８７）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などにより測定できる。
（８）ヒト化抗体の安定発現
本項１の（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，１９９０）などがあげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４２１６，１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＹＢ２／０細胞；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（Ｇ４１８；ＳＩＧＭＡ社製）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１，１９９４）。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などの各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡなどにより測定できる。また、形質転換株は、ｄｈｆｒ増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１，１９９４）。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０，１９７０）やウエスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，１９８８、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などで測定することができる。
２．抗体断片の作製
抗体断片は、本項１に記載のヒト化抗体を元に遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。また、Ｆａｂは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。例えば、本項１の（２）、（４）および（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１，１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。
（２）Ｆ（ａｂ’）_２の作製
Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）_２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、本項２の（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサン等のようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢで処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、本項２の（２）に記載のＦ（ａｂ’）_２をジチオスレイトール等の還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。例えば、本項１の（２）、（４）および（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１６３，１９９２）などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラム等を用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、本項１の（２）、（４）および（５）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを、１２残基以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡを介して連結し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製する。作製したＤＮＡをｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、Ｐｈｆａ（Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィー等を用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（５）Ｄｉａｂｏｄｙの作製
Ｄｉａｂｏｄｙは、上記のｓｃＦｖを作製する際のポリペプチドリンカーを３〜１０残基程度にすることで、作製することができる。１種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合には、２価のＤｉａｂｏｄｙを、２種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合は、２特異性を有するＤｉａｂｏｄｙを作製することができる（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５３，１６４，１９９９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７７，７６３，１９９８）。
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。まず、本項１の（２）、（４）および（５）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＶＨおよびＶＬを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）。
（７）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＣＤＲを含むペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＣＤＲを含むペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）。
３．ヒト化抗体または抗体断片の活性評価
（１）抗原結合活性
作製したヒト化抗体または抗体断片のＦＧＦ−８に対する結合活性は、ＥＬＩＳＡあるいは表面プラズモン共鳴（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，２２９，１９９１）などにより測定できる。
（２）ＦＧＦ−８の機能阻害活性
作製したヒト化抗体または抗体断片のＦＧＦ−８の機能阻害活性は、細胞株を用いた細胞増殖試験などにより測定できる。例えば、標的細胞としてマウス乳癌細胞株ＳＣ−３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，８９２８，１９９２）、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、あるいはヒト前立腺癌、乳癌、卵巣癌細胞株を、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８あるいはテストステロンを含む培地にて培養する際、ヒト化抗体または抗体断片を最終濃度が０．００１〜１００μｇ／ｍＬとなるように段階希釈して培地中に添加し、２４〜７２時間培養後、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチル−２−チアゾニル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド］溶液、セルカウンティングキット、ＷＳＴ−１キットなどを用いて生細胞数を測定することで、ヒト化抗体または抗体断片のＦＧＦ−８の機能阻害活性を測定することができる。また、ボルトン−ハンター法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１３３，５２７，１９７３）などで^１２５Ｉ標識したＦＧＦ−８の上記の細胞株への結合測定系を用いて、ヒト化抗体または抗体断片のＦＧＦ−８の細胞表面上の受容体の結合阻害活性を測定することができる。
（３）ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
作製したヒト化抗体または抗体断片のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果は、例えば、以下に示すヌードマウスを用いた癌細胞移植系を用いて評価することができる。
ａ．初期癌モデルにおける抗腫瘍効果の評価
マウス乳癌細胞株ＳＣ−３の１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＰＢＳ懸濁液を調製し、これを０．１ｍＬ／匹（１×１０^６ｃｅｌｌｓ／匹）で６〜８週令のオスのヌードマウスの皮下に移植する。移植直後にヒト化抗体または抗体断片を１０μｇ〜４００μｇ／匹でマウス腹腔内または尾静脈に投与する。抗体は週１〜７回の頻度で合計１〜１０回投与する。抗腫瘍効果は腫瘍移植後より１４〜６０日まで経時的に腫瘍体積を測定し、陰性対照抗体投与群または溶媒投与群と腫瘍体積を比較することにより評価できる。なお、腫瘍体積（Ｖ）は、ノギスを用いて長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）、高さ（Ｈ）を測定し、下記の式により算出する。
（式）
Ｖ（ｍｍ^３）＝（Ｌ）×（Ｗ）×（Ｈ）×０．５２３６
ｂ．進行癌モデルにおける抗腫瘍効果の評価
ＳＣ−３の１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＰＢＳ懸濁液を調製し、これを０．１ｍＬ／匹（１×１０^６ｃｅｌｌｓ／匹）で６〜８週令のオスのヌードマウスの皮下に移植する。腫瘍体積が約１００〜３００ｍｍ^３となった時点より（腫瘍移植後１４日目前後）、ヒト化抗体または抗体断片を１０μｇ〜４００μｇ／匹でマウス腹腔内または尾静脈に投与を開始する。抗体は週１〜７回の頻度で合計１〜１０回投与する。抗腫瘍効果は、ａ．の初期癌モデルと同様にして評価することができる。
４．ヒト化抗体または抗体断片の使用方法
本発明のヒト化抗体または抗体断片は、性ホルモン依存性増殖を示すヒト癌細胞の増殖因子と考えられるＦＧＦ−８と特異的に結合し、かつＦＧＦ−８の機能を阻害するため、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、精巣腫瘍などのヒト癌の診断、治療において有用であると考えられる。また、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内において高い効果を示し、かつ、免疫原性が低く、その効果が長期間に渡り持続することが期待される。
本発明のヒト化抗体または抗体断片は、本発明の抗体断片は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、抗体断片の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体または抗体断片そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。抗体または抗体断片および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
以下に、本発明の実施例を示すが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１ 抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の作製
１．ＦＧＦ−８に対するマウス抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析（１）ＦＧＦ−８に対するマウス抗体生産ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
ＦＧＦ−８に対するマウス抗体（以下、抗ＦＧＦ−８マウス抗体と称す）を生産するハイブリドーマＫＭ１３３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５１）の１×１０^７細胞より、ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ｍＲＮＡを約８μｇ調製した。
（２）抗ＦＧＦ−８マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
実施例１の１項（１）で取得したＫＭ１３３４のｍＲＮＡの５μｇから、Ｔｉｍｅ Ｓａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプターを有するｃＤＮＡを合成した。続いて、λＺＡＰＩＩ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。まず、ｃＤＮＡ全量を２０μｌの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧクラスの抗体のＨ鎖に対応する約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片とκクラスのＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をそれぞれ約０．１μｇ回収した。次に、各々の約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇおよび約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片０．１μｇと、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで末端を脱リン酸化したλＺＡＰＩＩベクター１μｇとを、添付の使用説明書に従い連結した。
連結後の各々の反応液のうち４μｌをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔｓ Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、適当量を大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５，３７６，１９８７）に感染させて、ＫＭ１３３４のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーとしてそれぞれ約８．１×１０^４個と、５．５×１０^４個のファージクローンを取得した。次に各々のファージを常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に従い、ナイロンメンブレン上に固定した。
（３）抗ＦＧＦ−８マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡのクローニング
実施例１の１項（２）で作製したＫＭ１３３４のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーおよびＬ鎖ｃＤＮＡライブリーのナイロンメンブレンを、ＥＣＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のＣ領域のｃＤＮＡ〔Ｈ鎖はマウスＣγ１ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６，２０１０，１９９１）、Ｌ鎖はマウスＣκｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（Ｃｅｌｌ，２２，１９７，１９８０）〕をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをＨ鎖、Ｌ鎖各１０クローン取得した。次に、λＺＡＰＩＩ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の使用説明書に従い、ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎ法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列をＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてジデオキシ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）により決定した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長の機能的なＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４Ｈ７−１およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４Ｌ７−１を得た。
（４）抗ＦＧＦ−８マウス抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
配列番号１にプラスミドｐＫＭ１３３４Ｈ７−１に含まれていたＶＨの全塩基配列、配列番号２に推定された全アミノ酸配列、配列番号３にプラスミドｐＫＭ１３３４Ｌ７−１に含まれていたＶＬの全塩基配列、配列番号４に推定された全アミノ酸配列をそれぞれ示す。既知のマウス抗体の配列データ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）との比較および精製した抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所製）を用いて自動エドマン分解により解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４をコードする完全長ｃＤＮＡであり、Ｈ鎖については配列番号２に記載のアミノ酸配列の１から１９番目が、Ｌ鎖については配列番号４に記載のアミノ酸配列の１から１９番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。なお、分泌シグナル配列を除いたアミノ酸配列で、ＶＨを配列番号４０に、ＶＬを配列番号４１にそれぞれ示した。
次に、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース（ＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒｅｌｅａｓｅ ５６．０））をＢＬＡＳＴ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３，１９９０）により検索した。その結果、Ｈ鎖、Ｌ鎖ともに完全に一致する配列は認められず、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨおよびＶＬは新規なアミノ酸配列であることが確認された。
また、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５、６および７に、ＶＬのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８、９および１０に示した。
２．抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（１）抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のＶＨｃＤＮＡを含むプラスミドの構築
実施例１の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４Ｈ７−１の５０ｎｇを鋳型とし、配列番号１１、１２に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（ＧＥＮＳＥＴ社製）をプライマーとして終濃度０．３μｍｏｌ／Ｌｏｌ／Ｌとなるように加え、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の使用説明書に従い、全量５０μＬでまず９４℃で２分間加熱した後、９４℃１５秒間、５７℃３０秒間、６８℃１分間の条件で３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。該反応液を精製した後、滅菌水に溶解し、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（５’末端側がＥｃｏＲＩ、３’末端側は平滑末端）を約０．３μｇ回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）の３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）及び１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＶ（宝酒造社製）を３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたＶＨｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片０．１μｇとを全量１０μｌの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、第１図に示した抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のＶＨｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５を得た。
（２）抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のＶＬｃＤＮＡを含むプラスミドの構築
実施例１の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４Ｌ７−１の５０ｎｇを鋳型とし、配列番号１３、１４に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（ＧＥＮＳＥＴ社製）をプライマーとして終濃度０．３μｍｏｌ／Ｌとなるように加え、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の使用説明書に従い、全量５０μＬでまず９４℃で２分間加熱した後、９４℃１５秒間、５７℃３０秒間、６８℃１分間の条件で３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。該反応液を精製した後、滅菌水に溶解し、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（５’末端側がＥｃｏＲＩ、３’末端側は平滑末端）を約０．３μｇ回収した。
次に、上記で得られたＶＬｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片０．１μｇを全量１０μｌの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、第２図に示した抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のＶＬｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４を得た。
（３）抗ＦＧＦ−８キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と実施例１の２項（１）および（２）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５およびｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４を用いて抗ＦＧＦ−８キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を以下の様にして構築した。
実施例１の２項（１）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５の３μｇに、１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）及び１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）とを３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４８ｋｂのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の３μｇに、１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とを３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．８ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとを全量１０μＬの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、第３図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４Ｈを得た。
次に、実施例１の２項（２）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４の３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）及び１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とを３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４Ｈの３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．３０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇとをプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４Ｈ由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇを全量１０μＬの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換し、第３図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を得た。
得られたプラスミドの４００ｎｇを用い、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてジデオキシ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）による塩基配列の解析を行った結果、目的のＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
（４）抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた安定発現
上記実施例１の２項（３）で得られた抗ＦＧＦ−８キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を用いて抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６，１９８０）での発現を以下の様にして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の１０μｇを１．６×１０^６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，１９９０）により導入後、１０〜３０ｍＬのＩＭＤＭ−１×ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−ｄＦＢＳ（１０）［透析牛胎児血清（ｄＦＢＳ）を１０％と１×ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＩＭＤＭ培地（何れもＧＩＢＣＯ社製）］に懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＩＷＡＫＩ社製）に１００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、培養液をＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔのみを除いた培地ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）と交換してさらに１〜２週間培養した。耐性コロニーが出現しコンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の２項（６）に示すＥＬＩＳＡにより測定した。
培養上清中に抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については２４ウェルプレートに播種し、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤であるメソトレキセート（ＭＴＸ；ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）で２週間培養した。更にＭＴＸ濃度を２００ｎｍｏｌ／Ｌ、５００ｎｍｏｌ／Ｌと高くし、それぞれの段階で２週間ずつ培養を行い、５００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の２項（６）に示すＥＬＩＳＡにより測定した。最終的に、５００ｎｍｏｌ／ＬのＭＴＸを含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を高発現する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、限界希釈法による単一細胞化（クローン化）を行い、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞クローンをＫＭ３０３４と命名した。なお、ＫＭ３０３４は平成１３年１２月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７８３６として寄託されている。
（５）抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のＹＢ２／０細胞を用いた安定発現
上記実施例１の２項（３）で得られた抗ＦＧＦ−８キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４を用いて抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）での発現を以下の様にして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の１０μｇを４×１０^６細胞のＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，１９９０）により導入後、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）［牛胎児血清（ＦＢＳ；ＰＡＡラボラトリーズ社製）を５％含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の２項（６）に示すＥＬＩＳＡにより測定した。
培養上清中に抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の２項（６）に示すＥＬＩＳＡにより測定した。
培養上清中に抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を上昇させ、終濃度が１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８、２００ｎｍｏｌ／ＬのＭＴＸを含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地で増殖可能かつ、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を高発現する形質転換株５−Ｄを得た。得られた形質転換株について、限界希釈法によるクローン化を行い、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の発現の最も高い形質転換細胞株を得た。得られた形質転換細胞株をＫＭ３３３４と命名した。
（６）抗体のＦＧＦ−８部分ペプチドに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ）
抗ＦＧＦ−８抗体が反応し得るヒトＦＧＦ−８ペプチドとして化合物１（配列番号１５）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法で牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ溶液９００μＬに、１００μＬの２５ｍｇ／ｍＬ ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（シグマ社製）−ＤＭＳＯ溶液を攪拌しながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍＬのＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムなどのゲルろ過カラムに反応液１ｍＬをアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした。各画分のＢＳＡ濃度は２８０ｎｍの吸光度で測定した。次に、１．０ｍｇの化合物１に２００μＬ ＤＭＳＯを加え、次いで８００μＬ ＰＢＳを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算２．５ｍｇ）を攪拌下で添加して室温で３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２μｍフィルターでろ過した後ＢＳＡ−化合物１溶液とした。
９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを０．５〜１．０μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、形質転換株の培養上清あるいは精製抗体を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００−６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、５分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止した。その後、４１５ｎｍの吸光度（ＯＤ４１５）を測定した。
３．抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の精製
（１）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の発現細胞の培養及び抗体の精製
実施例１の２項（４）で得られた抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を発現する形質転換細胞株ＫＭ３０３４を５００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸを含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０^５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１７５ｃｍ^２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に４０ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で５〜７日間培養し、コンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２０ｍＬのＰＢＳにて細胞を洗浄した。ＰＢＳを除去し、４０ｍＬのＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）を加え、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて７〜１４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を精製した。得られた抗ＦＧＦ−８キメラ抗体はＫＭ３０３４と名付けた。
（２）ＹＢ２／０細胞由来の発現細胞の培養及び抗体の精製
実施例１の２項（５）で得られた抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を発現する形質転換細胞株ＫＭ３３３４を２００ｎｍｏｌ／Ｌ ＭＴＸ、Ｄａｉｇｏ’ｓ ＧＦ２１（和光純薬社製）を５％の濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）培地中で、１７５ｃｍ^２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて培養した。８−１０日間培養して回収した培養上清より、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を精製した。得られた抗ＦＧＦ−８キメラ抗体はＫＭ３３３４と名付けた。
４．精製した抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の解析
実施例１の３項で得られた各種動物細胞で発現、精製した２種類の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＫＭ３３３４の各４μｇを公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０，１９７０）に従ってＳＤＳ−電気泳動にかけ、分子量及び精製度を解析した。精製した各抗ＦＧＦ−８キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約１５０Ｋｄの単一のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡの塩基配列から推定される分子量（Ｈ鎖：約４９Ｋｄ、Ｌ鎖：約２３Ｋｄ、分子全体：約１４４Ｋｄ）とほぼ一致し、更に、ＩｇＧ型の抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、分子量約５０ＫｄのＨ鎖と約２５ＫｄのＬ鎖にそれぞれ分解されるという報告（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）と一致し、これにより抗ＦＧＦ−８キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
５．精製した抗ＦＧＦ−８キメラ抗体の活性評価
精製した抗ＦＧＦ−８キメラ抗体のＦＧＦ−８中和活性の評価は、以下に示すマウス乳癌細胞株ＳＣ−３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，８９２８，１９９２）のＦＧＦ−８依存性増殖抑制効果により測定した。即ち、ＳＣ−３細胞を３．０×１０^４細胞／ｍＬの濃度で活性炭処理をしたＦＢＳを２％で含むＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ１２（１：１）培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に懸濁し、１５０μＬ（４．５×１０^３細胞）／ウェルずつ９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１８時間培養後、１００μＬ／ウェルの試験培地を用いて培地交換した。試験培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８（Ｒ＆Ｄ社製）及び各希釈濃度の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体を、ＢＳＡを０．１％で含むＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ１２（１：１）培地に溶解することにより作製した。また、陰性対照の抗体としてＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトケモカインＣＣＲ４に対するキメラ抗体ＫＭ２７６０を用いた。５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、４８時間培養後、新たに調製した試験培地と交換し、さらに４８時間培養した。ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）を１０μＬ／ウェルずつ添加し、軽く攪拌して５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１時間培養後ＯＤ_{４５０／６５０}を測定した。第４図において、横軸は添加した抗体濃度、縦軸は５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８のみの添加時の増殖に対する相対増殖（％）を示す。５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８のみの添加時の増殖に対する相対増殖（％）は下記の式により算出された。
（式）
ＦＧＦ−８添加時の増殖に対する相対増殖（％）＝｛（ＦＧＦ−８及び抗体添加時のＯＤ値−ＦＧＦ−８及び抗体未添加時のＯＤ値）／（ＦＧＦ−８のみ添加時のＯＤ値−ＦＧＦ−８及び抗体未添加時のＯＤ値）｝×１００
第４図に示したように、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＫＭ３３３４は、いずれも同等のＳＣ−３細胞増殖阻害活性を示し、キメラ抗体化による活性の低下は認められなかった。
実施例２ ＦＧＦ−８に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製
１．ＦＧＦ−８に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
（１）ＦＧＦ−８に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
まず、ＦＧＦ−８に対するヒト型ＣＤＲ移植抗体（抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体）のＶＨのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。実施例１の１項（４）で同定した抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性から３種類のサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を設計することとした。より活性の高い抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のＶＨの３種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ１３３４のＶＨのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。第１表には、相同性の検索結果を示した。第１表に示した様に、ＫＭ１３３４のＶＨ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。

以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号１６に記載の抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０を設計した。
次に、抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。実施例１の１項（４）で同定した抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＶ）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）。そこでＶＨの場合と同様にして、ヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ１３３４のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。
第２表には、相同性の検索結果を示した。第２表に示した様に、ＫＭ１３３４のＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＩと最も高い相同性を有していた。

以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号１７に記載の抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０を設計した。
上記で設計した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。多くの場合、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、マウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは結合活性が低下してしまう。それを回避するため、ヒト抗体とマウス抗体とのＦＲアミノ酸配列を比較し、異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基をＣＤＲのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を同定することを検討した。
まず、上記で設計した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０よりなる抗体Ｖ領域（ＨＶ０ＬＶ０）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）あるいはＲａｓＭｏｌ（Ｇｌａｘｏ社製）を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列において、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４と異なっているアミノ酸残基について順次、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４の相当する位置に見られるアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列からなる改変体のＶ領域三次元構造モデルを同様にして構築し、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４、ＨＶ０ＬＶ０および改変体のＶ領域の三次元構造を比較した。その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の活性に影響を与えると考えられる残基として、ＨＶ．０において１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７４番目のＴｈｒ、７６番目のＴｈｒ、８２番目のＧｌｕ、８７番目のＡｒｇ、９５番目のＴｙｒを、ＬＶ．０において２番目のＩｌｅ、３番目のＶａｌ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒを選択し、アミノ酸を改変することとした。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上をマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ残基へ改変し、様々な改変を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを以下のように設計した。
具体的には、ＶＨとしては、１２番目のＬｙｓ、１３番目のＬｙｓ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＭｅｔ、９５番目のＴｙｒの６残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅに改変した配列番号１８に記載のアミノ酸配列ＨＶ．６を設計した。ＶＬとしては、２番目のＩｌｅ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの６残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した配列番号１９に記載のアミノ酸配列ＬＶ．６を設計した。
（２）抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
実施例２の１項（１）で設計した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．０をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列に配列番号２に記載の抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＨ鎖の分泌シグナル配列を繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から１４１塩基ずつ区切り、区切った塩基の隣り合う塩基の約２０塩基が重複する様にし、センス鎖、アンチセンス鎖の交互に作製した。具体的には、配列番号２０から２３の４本の合成オリゴヌクレオチドを合成した（ＧＥＮＳＥＴ社製）。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌとなる様に５０μＬの反応液に加えて、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造社製）、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造社製）および２．５単位のＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付の使用説明書に従い、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は、９４℃で５分間加熱した後、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７４℃６０秒間のサイクルを２５サイクル行い、さらに７４℃で５分間加熱した。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）を３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片を約２．９μｇ回収した。
次に、上記で得られた抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＨのＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇとを全量１０μＬの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、形質転換株の１０個のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてジデオキシ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）による塩基配列の解析を行った。塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有する第５図に示したプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０を得た。
また、実施例２の１項（１）で設計した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ．６をコードするｃＤＮＡは、合成ＤＮＡとして配列番号２４から２７の４本の合成オリゴヌクレオチド（ＧＥＮＳＥＴ社製）を用いて上記と同様にしてＰＣＲ法により構築した。その結果、ＨＶ．６をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ６を得た。
（３）抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
実施例２の１項（１）で設計した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．０をコードするｃＤＮＡをＶＨと同様にＰＣＲ法により構築した。ただし、分泌シグナル配列としては、配列番号４に記載の抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４のＬ鎖の配列を用い、合成ＤＮＡとして配列番号２８から３１の４本の合成オリゴヌクレオチド（ＧＥＮＳＥＴ社製）を用いた。その結果、ＬＶ．０をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０を得た。
また、実施例２の１項（１）で設計した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．６をコードするｃＤＮＡは、合成ＤＮＡとして配列番号３２から３５の４本の合成オリゴヌクレオチド（ＧＥＮＳＥＴ社製）を用いて上記と同様にしてＰＣＲ法により構築した。その結果、ＬＶ．６をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６を得た。
２．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と実施例２の１項（２）および（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０およびｐＫＭ１３３４ＬＶ０とを用いて抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０を以下の様にして構築した。
実施例２の１項（２）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０の３μｇに、１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）及び１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４７ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の３μｇに、１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）及び１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．８ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたｐＫＭ１３３４ＨＶ０由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片０．１μｇとを全量１０μＬの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第６図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０を得た。
次に、実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０の３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）及び１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０の３μｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）及び制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．３０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、上記で得られたｐＫＭ１３３４ＬＶ０由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片０．１μｇとを全量１０μＬの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第６図に示した発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０を得た。
得られたプラスミドの４００ｎｇに、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてジデオキシ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）による塩基配列の解析を行った結果、目的のＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
また、実施例２の１項（２）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０および実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６を用いて上記と同様の方法により、発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６を構築した。
また、実施例２の１項（２）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ６および実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６を用いて上記と同様の方法により、発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ６ＬＶ６を構築した。
３．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＹＢ２／０細胞を用いた安定発現
実施例２の２項で得られた抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体発現ベクター
ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ６ＬＶ６を用いて各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＹＢ２／０細胞での安定発現を上記実施例１の２項（５）に記載の方法に従い、行った。
４．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の精製
実施例２の３項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体を発現するＹＢ２／０細胞由来の形質転換株の培養及び上清からの抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の精製を上記実施例１の３項（２）に記載の方法に従い、行った。ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ６、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ６ＬＶ６を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ６ＬＶ６と名付けた。
５．精製した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の解析
実施例２の４項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを上記実施例１の４項に記載の方法に従い、行った。その結果、いずれの抗体も正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
６．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ）
実施例２の４項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性は、上記実施例１の２項（６）に記載のＥＬＩＳＡにより測定した。陽性対照として、実施例１の３項（２）で得られたＹＢ２／０細胞由来の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３３３４を用いた。その結果を第７図に示した。第７図に示したように、いずれの抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体も、ＫＭ３３３４と同等のＦＧＦ−８結合活性を示し、ＣＤＲ移植化による明らかな結合活性の低下は認められなかった。
７．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性の測定
実施例２の４項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性をより詳細に検討するため、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性を以下のようにして測定、比較した。陽性対照として、実施例１の３項（２）で得られたＹＢ２／０細胞由来の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３３３４を用いた。
以下、サンプルの希釈および測定中の緩衝液としてはＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を使用した。まず、センサーチップＣＭ５（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）をセットし、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いて３１．２５μｇ／ｍＬに溶解したＦＧＦ−８（Ｒ＆Ｄ社製）をアミンカップリング法によりセンサーチップ表面に固定化した。固定化量は４４９８ＲＵであった。
ＦＧＦ−８固定化フローセルに２０μＬ／分の流速で、各種抗体溶液を６０μＬ添加し、その後、３分間に渡り解離反応をモニターした。解離反応後、２０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ−塩酸溶液（ｐＨ１．５）を２回連続してフローセルに添加し、チップ表面を再生させた。このサイクルを各種濃度（５０−０．０６８μｇ／ｍＬ）の抗体溶液について行い、各種濃度におけるセンサーグラムを得た。各々の抗体のセンサーグラムは、陰性対照としてＧＤ３に対するキメラ抗体ＫＭ８７１（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３，１９９３）を用いて得られたセンサーグラムを差し引くことにより特異的な反応のセンサーグラムとした。第８図に５０μｇ／ｍＬの各種抗体のセンサーグラムを示した。センサーグラムから明らかなように、いずれの抗体も解離反応時にほとんど解離が認められず、正確な解離速度定数を求めることが困難であった。そこで、各種抗体の結合活性の比較は、結合反応時の結合［共鳴シグナル（ＲＵ）］の高さを比較することにより、行った。その結果、第８図に示したように、キメラ抗体ＫＭ３３３４が最も高い結合反応を示し、ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６は、ＫＭ３３３４と同等の高い結合反応を示した。一方、ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０およびＨＶ６ＬＶ６は、ＫＭ３３３４およびＨＶ０ＬＶ６と比較して若干低い結合反応を示した。以上の結果は、ＥＬＩＳＡでは認められなかった抗体間の結合活性の比較がＢＩＡｃｏｒｅを用いることにより可能であること、そして、ＶＬのＦＲの６アミノ酸残基の改変により、ＣＤＲ移植抗体の結合活性がキメラ抗体と同等レベルに回復することを示している。また、ＶＨのＦＲの６アミノ酸残基については、結合活性の回復に対する効果は認められなかった。
キメラ抗体ＫＭ３３３４と同等の高い結合反応を示したＹＢ２／０細胞由来のＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６をＫＭ８０３７と命名し、また、ＫＭ８０３７を高発現するＹＢ２／０細胞由来の形質転換細胞株も同様にＫＭ８０３７と命名した。なお、形質転換細胞株ＫＭ８０３７は平成１４年６月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−８０８４として寄託されている。
実施例３ より免疫原性の低い抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の作製（１）
実施例２の結果より、ＶＬのＦＲにマウス抗体ＫＭ１３３４由来の６アミノ酸残基の改変を有する抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体は、キメラ抗体と同等の結合活性を示すことが明らかとなった。そこで、さらにこれら６残基の活性回復に対する効果を検討し、充分な活性を有し、かつマウス抗体由来のアミノ酸残基の少ない、より免疫原性の低下が期待される抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の作製を以下のようにして行った。
１．ＶＬのアミノ酸配列の設計
上記の６アミノ酸残基について、以下のような改変を有する６種類のＶＬのアミノ酸配列を設計した。いずれもＬＶ．０のアミノ酸残基からの改変を示した。
ＬＶ．４−１では、２番目のＩｌｅ、５０番目のＧｌｎ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの４残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．４−２では、２番目のＩｌｅ、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、９２番目のＴｙｒの４残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．３−１では、２番目のＩｌｅ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの３残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．３−２では、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、９２番目のＴｙｒの３残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．２−１では、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの２残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．２−２では、２番目のＩｌｅ、９２番目のＴｙｒの２残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＶａｌ、Ｐｈｅに改変した。
２．ＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
実施例３の１項で設計した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の各種ＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは以下のようにして構築した。
（１）ＬＶ．４−１をコードするｃＤＮＡの構築
ＬＶ．４−１をコードするｃＤＮＡは、合成ＤＮＡとして配列番号２９、３２、３４、３５の４本の合成オリゴヌクレオチド（ＧＥＮＳＥＴ社製）を用いて実施例２の１項（３）に記載の方法に従い、構築した。その結果、ＬＶ．４−１をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−１を得た。
（２）ＬＶ．３−１をコードするｃＤＮＡの構築
実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６の５０ｎｇを鋳型とし、Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造社製）および配列番号３６に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（ＧＥＮＳＥＴ社製）をプライマーとして終濃度０．３μｍｏｌ／Ｌｏｌ／Ｌとなるように加え、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の使用説明書に従い、全量５０μＬでまず９４℃で２分間加熱した後、９４℃１５秒間、５０℃３０秒間、６８℃１分間の条件で３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。該反応液を精製した後、滅菌水に溶解し、１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．２２ｋｂのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩ断片を約０．３μｇ回収した。
次に、実施例３の２項（１）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−１の３μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．２１ｋｂのＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ断片を約０．２μｇ回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）の３μｇに、１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）および１０単位の制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）を３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９５ｋｂのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩ断片を約２μｇ回収した。
上記で得られたＶＬｃＤＮＡのＫｐｎＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−１由来のＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ断片０．１μｇとをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）由来のＫｐｎＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇを全量１０μｌの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第９図に示したＬＶ．３−１をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−１を得た。
（３）ＬＶ．２−１をコードするｃＤＮＡの構築
プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−１の代わりに実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０を用いる以外は、実施例３の２項（１）に記載の方法と同様の方法で、ＬＶ．２−１をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−１を得た。
（４）ＬＶ．２−２をコードするｃＤＮＡの構築
プライマーとして配列番号３６に記載の合成ＤＮＡの代わりに配列番号３７に記載の合成ＤＮＡを用いる以外は、実施例３の２項（１）に記載の方法と同様の方法で、ＬＶ．２−２をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−２を得た。
（５）ＬＶ．４−２をコードするｃＤＮＡの構築
実施例３の２項（４）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−２の３μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約３．１６ｋｂのＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６の３μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．２１ｋｂのＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ断片を約０．２μｇ回収した。
上記で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−２由来のＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６由来のＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ断片０．１μｇとを全量１０μｌの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第１０図に示したＬＶ．４−２をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−２を得た。
（６）ＬＶ．３−２をコードするｃＤＮＡの構築
実施例３の２項（５）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−２の３μｇに、１０単位の制限酵素Ｔｔｈ１１１Ｉ（宝酒造社製）およびＸｍｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．２４ｋｂのＴｔｈ１１１Ｉ−ＸｍｎＩ断片を約２μｇ回収した。
次に、実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０の３μｇに、１０単位の制限酵素Ｔｔｈ１１１Ｉ（宝酒造社製）およびＸｍｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１．１１ｋｂのＴｔｈ１１１Ｉ−ＸｍｎＩ断片を約１μｇ回収した。
上記で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−２由来のＴｔｈ１１１Ｉ−ＸｍｎＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０由来のＴｔｈ１１１Ｉ−ＸｍｎＩ断片０．１μｇとを全量１０μｌの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第１１図に示したＬＶ．３−２をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−２を得た。
３．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
実施例２の２項で得られた発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６のＶＬｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を実施例３の２項で構築した各種ＶＬｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片で置換することにより、各種ＶＬｃＤＮＡを有する抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築した。具体的には、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−１、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−２、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−１、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−２、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ２−１、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ２−２の６種類を構築した。
４．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた安定発現
実施例２の２項で得られた抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体発現ベクター
ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６、実施例３の３項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを用いて各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞での安定発現を上記実施例１の２項（４）に記載の方法に従い、行った。
５．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の精製
実施例３の４項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体を発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換株の培養及び上清からの抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の精製を上記実施例１の３項（１）に記載の方法に従い、行った。ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ０／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−１を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−２を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ４−２／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−１を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−２を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ３−２／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ２−１を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ２−２を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ２−２／ＣＨＯと名付けた。
６．精製した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の解析
実施例３の５項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを上記実施例１の４項に記載の方法に従い、行った。その結果、いずれの抗体も正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
７．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性の測定（ＢＩＡｃｏｒｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）
実施例３の５項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性をより詳細に検討するため、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性を以下のようにして測定、比較した。陽性対照として、実施例１の３項（１）で得られたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４を用いた。
以下、サンプルの希釈および測定中の緩衝液としてはＨＢＳ−ＥＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を使用した。まず、センサーチップＳＡ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）をセットし、５μＬ／ｍｉｎの流速で０．０５μｇ／ｍＬに調製したＣ末端ビオチン標識化合物１（ＦＧＦ−８のＮ末端ペプチド；配列番号１５）を５μＬ添加した。その後、５μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ−塩酸溶液（ｐＨ１．５）を２回連続して添加し、チップ表面を洗浄した。ＦＧＦ−８ペプチドの固定化量は３５ＲＵであった。
ＦＧＦ−８ペプチド固定化フローセルに２０μＬ／分の流速で、各種抗体溶液を６０μＬ添加し、その後、３分間に渡り解離反応をモニターした。解離反応後、２０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ−塩酸溶液（ｐＨ１．５）を２回連続して添加し、チップ表面を再生させた。このサイクルを各種濃度（５０−１．８５μｇ／ｍＬ）の抗体溶液について行い、各種濃度におけるセンサーグラムを得た。各々の抗体のセンサーグラムは、陰性対照としてＧＤ３に対するキメラ抗体ＫＭ８７１（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３，１９９３）を用いて得られたセンサーグラムを差し引くことにより特異的な反応のセンサーグラムとした。
第１２図に１６．７μｇ／ｍＬの各種抗体のセンサーグラムを示した。センサーグラムから明らかなように、いずれの抗体も解離反応時にほとんど解離が認められず、正確な解離速度定数を求めることが困難であった。そこで、各種抗体の結合活性の比較は、結合反応時の結合［共鳴シグナル（ＲＵ）］の高さを比較することにより、行った。
その結果、第１２図に示したように、キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯが最も高い結合反応を示し、次いで、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯが高い結合反応を示した。一方、ＨＶ０ＬＶ３−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−２は、低い結合反応を示し、ＨＶ０ＬＶ０／ＣＨＯは、最も低い結合反応を示した。これらの結果は、実施例２の７項に記載のＹＢ２／０細胞由来の抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体を用いた結果と一致していた。
８．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する中和活性の測定
実施例３の７項においてＦＧＦ−８に対する高い結合反応が確認された４種類の抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯのＦＧＦ−８中和活性の評価を実施例２の５項に記載の方法に従って、行った。陽性対照として、実施例１の３項（１）で得られたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４を、陰性対照として、ＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトケモカインＣＣＲ４に対するキメラ抗体ＫＭ２７６０を用いた。その結果を第１３図に示した。第１３図に示したように、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯは、キメラ抗体ＫＭ３０３４と同等のＦＧＦ−８中和活性を示し、次いで、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯが高いＦＧＦ−８中和活性を示した。ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯは、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯに比べて若干低いＦＧＦ−８中和活性を示し、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯの中和活性が最も低かった。ＦＧＦ−８中和活性の強さと、ＢＩＡｃｏｒｅによる結合反応の強さとの間には相関が認められた。
実施例４ より免疫原性の低い抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の作製（２）
実施例３の結果より、ＬＶ６の６アミノ酸残基の改変のうち、５１番目の改変は活性回復に必須であることが明らかとなった。また、２番目の改変は、単独の改変では、活性回復に対する効果は小さいが５１番目の改変との組合せにより、協調的に活性回復に寄与することが示唆された。１４番目、１５番目の改変についても、５１番目の改変との組合せにより、協調的に活性回復に寄与することが示唆された。一方、５０番目の改変の効果は小さいことが示唆された。そこで、２番目の改変と１４番目、１５番目の改変のどちらがより活性回復に対する効果が高いかを検討するため、また、９２番目の改変の効果を検討するため、抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の作製を再検討した。
１．ＶＬのアミノ酸配列の再設計
以下のような改変を有する２種類のＶＬのアミノ酸配列を設計した。いずれもＬＶ．０のアミノ酸残基からの改変を示した。
ＬＶ．４−３では、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５１番目のＬｅｕ、９２番目のＴｙｒの４残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅに改変した。
ＬＶ．３−３では、１４番目のＴｈｒ、１５番目のＰｒｏ、５１番目のＬｅｕの３残基をそれぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に見られるアミノ酸残基であるＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌに改変した。
２．ＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
実施例４の１項で設計した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の各種ＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは以下のようにして構築した。
（１）ＬＶ．４−３をコードするｃＤＮＡの構築
実施例３の２項（５）に記載の方法に従い、構築した。ただし、プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−２の代わりに実施例３の２項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ２−１を用い、プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ６の代わりに実施例３の２項（６）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−２を用いた。その結果、ＬＶ．４−３をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−３を得た。
（２）ＬＶ．３−３をコードするｃＤＮＡの構築実施例４の２項（１）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−３の３μｇを１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）及び１０単位の制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約３．２３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片を約２．５μｇ回収した。
次に、実施例２の１項（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０の３μｇを１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）及び１０単位の制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．１３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片を約０．１５μｇ回収した。
上記で得られたプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−３由来のＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇとプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ０由来のＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片０．１μｇを全量１０μｌの滅菌水に加え、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、第１４図に示したＬＶ．３−３をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−３を得た。
３．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
実施例２の２項で得られた発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ６のＶＬｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を実施例４の２項で構築した各種ＶＬｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片で置換することにより、各種ＶＬｃＤＮＡを有する抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築した。具体的には、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−３、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−３の２種類を構築した。
４．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた安定発現
実施例４の３項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを用いて各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞での安定発現を上記実施例１の２項（４）に記載の方法に従い、行った。
５．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の精製
実施例４の４項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体を発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換株の培養及び上清からの抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の精製を上記実施例１の３項（１）に記載の方法に従い、行った。ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ４−３を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、ｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ３−３を導入した形質転換株由来の抗体をＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯと名付けた。
６．精製した抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体の解析
実施例４の５項で得られた各種抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを上記実施例１の４項に記載の方法に従い、行った。その結果、いずれの抗体も正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
７．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する結合活性の測定
実施例３の５項で得られた抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、実施例４の５項で得られた抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯのＦＧＦ−８に対する結合活性を実施例３の７項に記載の方法に従い、測定した。陽性対照として、実施例１の３項（１）で得られたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４を用いた。
第１５図に１６．７μｇ／ｍＬの各種抗体のセンサーグラムを示した。センサーグラムから明らかなように、いずれの抗体も解離反応時にほとんど解離が認められず、正確な解離速度定数を求めることが困難であった。そこで、各種抗体の結合活性の比較は、結合反応時の結合［共鳴シグナル（ＲＵ）］の高さを比較することにより、行った。その結果、第１５図に示したように、キメラ抗体ＫＭ３０３４が最も高い結合反応を示し、ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯは、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯよりも高く、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯと同等の結合反応を示した。ＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯの結合反応は、ＨＶ０ＬＶ３−１よりも低かった。以上の結果より、結合反応の高さに関しては、２番目の改変よりも、１４番目、１５番目の改変の方がより協調的に働くこと、また、９２番目の改変は、活性の回復に必須であることが示唆された。
８．抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体のＦＧＦ−８に対する中和活性の測定
実施例３の５項で得られた抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、実施例４の５項で得られた抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯのＦＧＦ−８中和活性の評価を実施例２の５項に記載の方法に従って、行った。陽性対照として、実施例１の３項（１）で得られたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４を、陰性対照として、ＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトケモカインＣＣＲ４に対するキメラ抗体ＫＭ２７６０を用いた。その結果を第１６図に示した。第１６図に示したように、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯは、キメラ抗体ＫＭ３０３４と同等のＦＧＦ−８中和活性を示した。一方、ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯおよびＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯは、同等の中和活性を示し、その活性はキメラ抗体ＫＭ３０３４に比べて１／２程度であった。ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯとＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯの中和活性は、ＢＩＡｃｏｒｅでの結合反応の高さと相関せず、２番目のアミノ酸残基と１４番目、１５番目のアミノ酸残基は、ＦＧＦ−８に対する結合活性と細胞に対するＦＧＦ−８中和活性において独立した影響を与えることが示唆された。
以上の各種評価結果より、キメラ抗体ＫＭ３０３４と同等の高い結合反応およびＦＧＦ−８中和活性を示したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯをＫＭ８０３４と命名し、また、ＫＭ８０３４を高発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換細胞クローンも同様にＫＭ８０３４と命名した。また、ＫＭ８０３４と同等の高い結合反応を示したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯをＫＭ８０３５と命名し、また、ＫＭ８０３５を高発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換細胞株も同様にＫＭ８０３５と命名した。ＫＭ８０３５のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．４−３を配列番号３８に示した。なお、形質転換細胞株ＫＭ８０３５は平成１４年６月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−８０８２として寄託されている。また、ＫＭ８０３４と同等の高いＦＧＦ−８中和活性を示したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯをＫＭ８０３６と命名し、また、ＫＭ８０３６を高発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の形質転換細胞株も同様にＫＭ８０３６と命名した。ＫＭ８０３６のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ．３−１を配列番号３９に示した。なお、形質転換細胞株ＫＭ８０３６は平成１４年６月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−８０８３として寄託されている。
抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８０３４は、キメラ抗体ＫＭ３０３４と同等の高い結合反応およびＦＧＦ−８中和活性を示し、かつ、ヒトにおける免疫原性がキメラ抗体よりも低下することから、キメラ抗体よりも高い治療効果が期待される。抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８０３６およびＫＭ８０３５では、ＫＭ８０３４に比べて、結合活性およびＦＧＦ−８中和活性が若干低下する可能性があるが、それぞれマウス抗体ＫＭ１３３４に由来するＶ領域ＦＲのアミノ酸残基が３残基および４残基となることから、ＫＭ８０３４よりもさらに免疫原性が低下することが期待される。
産業上の利用可能性
本発明によれば、前立腺癌、乳癌、卵巣癌などの増殖因子と考えられるＦＧＦ−８に特異的に反応し、さらにＦＧＦ−８の機能を阻害するヒト化抗体または該抗体断片を提供することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｈ５の造成工程を示した図である。
第２図は、プラスミドｐＫＭ１３３４ＣＨ−Ｌ４の造成工程を示した図である。
第３図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４の造成工程を示した図である。
第４図は、抗ＦＧＦ−８マウス抗体ＫＭ１３３４、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４およびＫＭ３３３４のマウス乳癌細胞株ＳＣ−３細胞のＦＧＦ−８依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸がＦＧＦ−８のみを添加した場合の増殖を１００％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がＫＭ１３３４、□がＫＭ３０３４、△がＫＭ３３３４、×が陰性対照であるＫＭ２７６０の活性を示す。
第５図は、プラスミドｐＫＭ１３３４ＨＶ０の造成工程を示した図である。
第６図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１３３４ＨＶ０ＬＶ０の造成工程を示した図である。
第７図は、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３３３４、抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ６ＬＶ６のＦＧＦ−８に対する結合活性をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が結合活性（ＯＤ４１５）を示す。△がＫＭ３３３４、○がＨＶ０ＬＶ０、□がＨＶ０ＬＶ６、×がＨＶ６ＬＶ６の活性を示す。
第８図は、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３３３４、抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ６ＬＶ６のＦＧＦ−８に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ ２０００により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（ＲＵ）を示す。
第９図は、プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−１の造成工程を示した図である。
第１０図は、プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ４−２の造成工程を示した図である。
第１１図は、プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−２の造成工程を示した図である。
第１２図は、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ０／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ２−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−２／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯのＦＧＦ−８に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ ２０００により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（ＲＵ）を示す。
第１３図は、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯのマウス乳癌細胞株ＳＣ−３細胞のＦＧＦ−８依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸がＦＧＦ−８のみを添加した場合の増殖を１００％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がＫＭ３０３４、□がＨＶ０ＬＶ２−１／ＣＨＯ、△がＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、◇がＨＶ０ＬＶ４−１／ＣＨＯ、●がＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、×が陰性対照であるＫＭ２７６０の活性を示す。
第１４図は、プラスミドｐＫＭ１３３４ＬＶ３−３の造成工程を示した図である。
第１５図は、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯのＦＧＦ−８に対する結合活性をＢＩＡｃｏｒｅ２０００により測定した結果を示した図である。横軸が時間（秒）、縦軸が共鳴シグナル（ＲＵ）を示す。
第１６図は、抗ＦＧＦ−８キメラ抗体ＫＭ３０３４、抗ＦＧＦ−８ＣＤＲ移植抗体ＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、ＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯのマウス乳癌細胞株ＳＣ−３細胞のＦＧＦ−８依存性増殖に対する中和活性を示した図である。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸がＦＧＦ−８のみを添加した場合の増殖を１００％とした場合の相対増殖（％）を示す。○がＫＭ３０３４、△がＨＶ０ＬＶ３−１／ＣＨＯ、■がＨＶ０ＬＶ３−３／ＣＨＯ、▲がＨＶ０ＬＶ４−３／ＣＨＯ、●がＨＶ０ＬＶ６／ＣＨＯ、×が陰性対照であるＫＭ２７６０の活性を示す。

Claims (10)

1. 抗体の重鎖可変領域（以下、VHと記す）が配列番号16で示されるアミノ酸配列、抗体の軽鎖可変領域（以下、VLと記す）が配列番号19で示されるアミノ酸配列を有し、かつ線維芽細胞増殖因子-8（FGF-8）に特異的に反応し、FGF-8の生物学的機能を阻害するヒト型CDR移植抗体または該抗体断片。
2. 抗体のVHが配列番号16で示されるアミノ酸配列、抗体のVLが配列番号39で示されるアミノ酸配列を有し、かつ線維芽細胞増殖因子-8（FGF-8）に特異的に反応し、FGF-8の生物学的機能を阻害するヒト型CDR移植抗体または該抗体断片。
3. 抗体断片が、Fab、Fab'、F(ab')₂、1本鎖抗体（scFv）、2量体化V領域断片（Diabody）およびジスルフィド安定化V領域断片（dsFv）から選ばれる抗体断片である請求項1または2のいずれか1項に記載の抗体断片。
4. 請求項１〜3のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または該抗体断片をコードするDNA。
5. 請求項4記載のDNAを含有する組換えベクター。
6. 請求項5記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
7. 請求項6記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項1〜3のいずれか1項に記載のヒト型CDR移植抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする該抗体または該抗体断片の製造方法。
8. 請求項 1 〜 3 のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片から選ばれる少なくとも 1 種を有効成分として含有する FGF-8 阻害剤。
9. 請求項1〜3のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する癌の治療薬。
10. 請求項1〜3のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する癌の診断薬。

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