DE69521789T2

DE69521789T2 - Fusionierte proteine die antikörper-teile und nicht-antikörper-teile enthalten

Info

Publication number: DE69521789T2
Application number: DE69521789T
Authority: DE
Inventors: A. Aaronson; Olaf Dirsch; J. Larochelle
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1994-02-01
Filing date: 1995-02-01
Publication date: 2002-04-25
Anticipated expiration: 2015-02-02
Also published as: JPH09509054A; EP0742830A1; WO1995021258A1; CA2182498A1; AU689214B2; US6403769B1; AU1690295A; EP0742830B1; ATE203274T1; DE69521789D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Immunglobulin (Ig)-Moleküle standen im Mittelpunkt anhaltender Forschungen, da sie mit einem vielfältigen Spektrum von Antigenen reagieren, unterschiedliche Effektorfunktionen besitzen und von biologischer Bedeutung sind. Von besonderem Interesse ist das hauptsächliche Serumimmunglobulin bei Säugern, IgG, welches der Hauptbestandteil der sekundären immunologischen Reaktion auf die meisten Antigene ist.
Immunglobulin G ist ein Tetramer, aufgebaut aus zwei identischen leichten (L) Ketten und zwei identischen schweren (H) Ketten, die jeweils durch Disulfidbrücken verknüpft sind. Die L-Ketten falten sich in zwei funktionelle Domänen, während sich die H-Ketten in vier oder fünf Domänen falten. Jede Domäne besteht aus etwa 100 bis 120 Aminosäureresten.
Die H- und L-Ketten-Halbmere sind durch Disulfidbindungen in der H-Ketten- "Gelenk"-Region kovalent verbunden, wie in Fig. 1 gezeigt. Die Anzahl der Gelenk- Disulfidbindungen ist variabel und hängt von dem H-Ketten-Isotyp ab. Die Gelenkregion ist flexibel und einer proteolytischen Verdauung zugänglich.
Sogenannte "variable" Regionen, gebildet durch die N-terminalen Domänen für jede Kette, unterscheiden sich von Antikörper zu Antikörper in der Aminosäuresequenz und definieren Antigen-bindende Stellen einzigartiger Spezifität und Affinität. Die anderen "konstanten" (C) IgG-Domänen, CH&sub1;, CH&sub2; und CH&sub3;, besitzen dieselbe Aminosäuresequenz für eine gegebene Antikörperkette desselben Isotyps, mit Ausnahme von Einzelrest-Differenzen an einigen wenigen Positionen, und tragen zu der Aktivierung von Wirts-Effektormechanismen zur Eliminierung von Antigen bei.
Die V-Domänen des IgG-Moleküls sind so für die Antigen-Erkennung und die Bindung von Antigenen verantwortlich, während die C-Domänen die Bindung des Immunglobulins an Wirtszellen, einschließlich verschiedener Zellen des Immunsystems und einiger phagozytischer Zellen, und an C&sub1;q, die erste Komponente des klassischen Komplement-Systems, vermitteln. Konkreter steht C&sub1;q mit der CH&sub2;- Domäne von IgG in Wechselwirkung. Von vier erkannten IgG-Subtypen besitzen zwei (IgG1 und IgG3) eine höhere Komplementfixierungsaktivität als die anderen (IgG2 und IgG4).
Die Domänenstruktur von IgG und anderen Antikörpern empfiehlt diese als Ziele für Protein-Engineering. Siehe Rothwell, Nature 342: 99 (1989). Diesbezügliche Versuche in der Vergangenheit, wie beispielsweise von Wright et al., GUt Rev. Immunol. 12: 125 (1992), im Überblick dargestellt, konzentrierten sich auf die Herstellung potentiell wertvoller Agenzien zur Behandlung einer menschlichen Krankheit. Ein großer Teil dieses "Antikörper-Engineerings" umfasste die Beibehaltung der ursprünglichen Spezifität der V-Region für ein gegebenes Ig- Molekül, während der Rest des Moleküls verändert wurde, beispielsweise durch Verknüpfung eines Enzyms, Toxins oder Wachstumsfaktors mit dem gesamten Molekül oder einem Teil davon. Siehe beispielsweise Shin & Morrison, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 5322 (1990) (insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1 ersetzt die konstante Region von Maus-Human-IgG3-Anti-Dansyl-Antikörper). Umgekehrt wurden chimäre Moleküle produziert, bei denen die V-Region durch die Gesamtheit oder einen Teil eines anderen Moleküls, einschließlich Rezeptormoleküle wie CD4 [Capon et al., Nature: 525 (1989)], humaner natriuretischer Peptid-Rezeptor [Bennett et el., J BioL Chem. 266: 23060 (1991)] und Human-Hepatozytenwachstumsfaktor- Rezeptor [Mark ef al., ibid. 267: 26166 (1992)] und des Cytokins Interleukin-2 [Landolfi, J. Immunol. 146: 915 (1992)], ersetzt wurde.
Diese IgG-enthaltenden Fusionsproteine demonstrierten die Möglichkeit der Beibehaltung der Ig-Effektorfunktion nach Ersatz der variablen Region nicht nur durch eine Nicht-Antikörperkomponente wie CD4, welche mit der sogenannten "Immunglobulin-Überfamilie" assoziiert ist und somit in einer Weise faltet, die mit der konstanten IgG-Region kompatibel ist, sondern auch durch eine Nicht-Antikörperdomäne wie IL-2, welche sich strukturell von derjenigen der Ig-Überfamilie unterscheidet. Beispielsweise bemerkte Landolfi (1992) ein "Potential zur Schaffung einer Vielfalt von Immunliganden, bei denen die Bindungsspezifität eine Nicht-Ig- Natur aufweist (z. B. Hormon, Lektin, Peptid oder ein anderer Ligand)", und er spekulierte, dass solche "Agenzien ein therapeutisches Potential haben könnten, falls deren Bindungsspezifität für eine Neoplasie oder ein anderes Gewebe, das für einen Krankheitszustand charakteristisch ist, einzigartig ist". Ebendort auf S. 918. Nichtsdestoweniger war die Entwicklung von praktischen Anwendungen solcher IgG- basierten Chimären tatsächlich langsam. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass die H- und L-Ketten von IgG in Abwesenheit der Partner-L- bzw. -H-Ketten schlecht sekretiert und schnell abgebaut werden, eine Situation, welche auf die fraglichen chimären Moleküle zutrifft. Es gibt auch relativ wenig spezifische Informationen oder voraussagende Theorie, um die biologischen Eigenschaften verschiedener Kategorien von chimären Molekülen aufzuklären.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, IgG/Nicht-IgG- Fusionsproteine bereitzustellen, welche, nach heterologer Expression in transfizierten Säugerzellen, in stabiler Form stark sekretiert werden und welche Effektoreigenschaften zeigen, die für Antikörper- bzw. Nicht-Antikörper- Vorläufermoleküle charakteristisch sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Fc-enthaltenden chimären Molekülen in einer Form, welche unschwer in Anwendungen einsetzbar ist, die herkömmlicherweise mit monoklonalen Antikörpern verbunden sind, einschließlich Durchflußzytometrie, Immunhistochemie und Immunpräzipitation.
Bei der Erreichung dieser und anderer Ziele wurde gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Fusionsprotein bereitgestellt, umfassend (A) eine IgG- Sequenz, (B) eine Nicht-Antikörpersequenz, die kovalent an das aminoterminale Ende der IgG-Sequenz geknüpft ist, und (C) ein heterologes Signalpeptid, das kovalent an den Aminoterminus der Nicht-Antikörpersequenz geknüpft ist, worin
(i) die IgG-Sequenz im Wesentlichen aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;- Domäne und einer CH&sub3;-Domäne, in dieser Reihenfolge, besteht, wobei der IgG-Sequenz eine CH&sub1; -Domäne fehlt,
(ii) die Nicht-Antikörpersequenz eine Effektordomäne eines Moleküls umfasst, und
(iii) die Effektordomäne eine Aktivität zeigt, die charakteristisch für die Effektordomäne in dem Molekül ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Fusionsprotein bereitgestellt, umfassend eine Nicht-Antikörpersequenz, die kovalent an das aminoterminale Ende einer IgG-Sequenz geknüpft ist, welche im Wesentlichen aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;-Domäne und einer CH&sub3;-Domäne, in dieser Reihenfolge, besteht, wobei der IgG-Sequenz eine CH&sub1;-Domäne fehlt, worin die Nicht-Antikörpersequenz eine Effektordomäne eines Wachstumfaktor-Moleküls umfasst, das in der Natur einen Einzeleinheit-Rezeptor bindet, derart, dass das Fusionsprotein eine DNA-Synthese, wie durch die Aufnahme von ³H-Thymidin gemessen, in einer Zielzelle induziert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren zum Nachweis eines pathologischen Zustands, der mit der Überexpression eines Moleküls verbunden ist, welches an einer bindenden Wechselwirkung teilnimmt, bereitgestellt, umfassend die Schritte
(A) Bereitstellen eines Fusionsproteins, das eine Nicht-Antikörpersequenz umfasst, welche kovalent an das aminoterminale Ende einer IgG-Sequenz geknüpft ist, welche im Wesentlichen aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;- Domäne und einer CH&sub3;-Domäne, in dieser Reihenfolge, besteht, wobei der IgG-Sequenz eine CH&sub1;-Domäne fehlt, worin die Nicht-Antikörpersequenz eine Effektordomäne eines Moleküls umfasst und wobei die Effektordomäne eine Aktivität zeigt, die für die Effektordomäne in dem Molekül charakteristisch ist;
(B) Inkontaktbringen des Fusionsproteins mit einer biologischen Probe, die einen Bindungspartner für die Effektordomäne enthält; und
(C) Überwachen der Bindung der Effektordomäne durch den Bindungspartner in der Probe, um eine Überexpression des Bindungspartners relativ zu einer Kontrolle nachzuweisen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren bereitgestellt zur Identifikation von Agonisten und Antagonisten, die störend auf eine bindende Wechselwirkung einwirken, umfassend die Schritte
(A) Bereitstellen eines Fusionsproteins, das eine Nicht-Antikörpersequenz umfasst, welche kovalent an das aminoterminale Ende einer IgG-Sequeriz geknüpft ist, die im wesentlichen aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;-Domäne und einer CH&sub3;-Domäne, in dieser Reihenfolge, besteht, wobei der IgG- Sequenz eine CH&sub1;-Domäne fehlt, worin die Nicht-Antikörpersequenz eine Effektordomäne eines Moleküls umfasst und worin die Effektordomäne eine Aktivität zeigt, die für die Effektordomäne in dem Molekül charakteristisch ist;
(B) in Anwesenheit eines mutmaßlichen Agonisten oder Antagonisten für die Bindung zwischen der Effektordomäne und einem Bindungspartner derselben, wobei das Fusionsprotein mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, welche den Bindungspartner enthält; und dann
(C) Bestimmen, ob der mutmaßliche Agonist oder Antagonist die Bindung der Effektordomäne durch den Bindungspartner beeinflußt hat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wurden rekombinante DNA-Moleküle bereitgestellt, welche für Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung codieren.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 präsentiert eine schematische Darstellung der Struktur des IgG- Antikörpermoleküls. Die V(L) und V(H) repräsentieren die variablen Regionen der leichten bzw. schweren Kette. Die drei komplementaritätsbestimmenden Regionen in den V(L)- und V(H)-Domänen sind in fetteren Linien dargestellt. Die schattierten Bereiche sind die konstanten Regionen der L- und H-Ketten. Die schwere Kette besteht aus CH&sub1;-, CH&sub2;- und CH&sub3;-Domänen. Die beiden schweren Ketten sind durch Disulfidbindungen (SS) in der Gelenkregion verbunden.
Fig. 2 ist eine Strichzeichnung, die repräsentative Tyrosinkinase-Rezeptoren zeigt. Wachstumsfaktoren, von denen bekannt ist, dass sie an Rezeptoren einer gegebenen Familie binden, sind oben aufgelistet und die Rezeptoren, welche jede Familie bilden, sind unten aufgelistet. Kästchen bezeichnen diejenigen Wachstumsfaktoren oder Rezeptoren, deren Gene ursprünglich als aktivierte Onkogene identifiziert wurden. Die c-onc-Bezeichnung wird zur Spezifizierung von zellulären Homologen retroviraler Onkogene verwendet. Offene Kreise illustrieren Ig- ähnliche Repeats. Schraffierte Kästchen zeigen Cystein-reiche Domänen an. Getüpfelte Kästchen zeigen konservierte Tyrosinkinase-Domänen an.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung von Molekülen, einschließlich bestimmter Fusionsproteine, im Rahmen der vorliegenden Erfindung, welche sich auf Beispiel 1 unten beziehen.
Fig. 4 zeigt als Diagramm die Konstruktion eines Plasmids (MMTneo) wie im Folgenden in Beispiel 2 beschrieben, welches DNA, die für ein KGF-HFc- Fusionsprotein im Rahmen der vorliegenden Erfindung codiert, enthält. Der Fc-Anteil des Gens der schweren Immunglobulinkette wurde in die BamHI-Stelle von pUC 18 kloniert, nachdem PCR zur Erzeugung von BamHI-kompatiblen Enden angewandt wurde. Es wurden zwei Konstrukte mit einem bzw. ohne ein heterologen/s Signalpeptid konstruiert, wie in Feld A dargestellt. Feld A zeigt auch die verbindende cDNA-Sequenz sowie die codierten Aminosäuren. Die BamHI-Klonierungsstellen von HFc-pUC 18 oder spHFc-pUC 18 erleichterten letztlich die Klonierung in die BgIII- Stelle des Expressionsvektors MMTneo, was zu den Vektoren MMTneo-HFc oder MMTneo-spHFc (Feld B) führte. Der letztere Vektor wurde erzeugt durch Hinzufügung des PDGF A-Signalpeptids stromaufwärts und im Leserahmen mit der Xhol-Klonierungsstelle von MMTneo-HFc (Feld A). Die HFc- oder spHFc-PCR- Produkte enthielten auch eine Xhol-Klonierungsstelle, welche 5' und im Leserahmen mit der HFc-Region, jedoch nach der 5'-BamHI-Stelle, mittels PCR eingeführt wurde. So wurden GF- oder GFR-cDNAs durch PCR mit entweder Xhol- oder SalI- kompatiblen Enden amplifiziert, mit Restriktionsenzym verdaut und dann in den MMTneo HFc-Vektor im Leserahmen mit der IgG HFc-Domäne ligiert.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Es wurde festgestellt, dass die hohe Affinität, welche für Homodimere von schweren IgG-Ketten charakteristisch ist, zusammen mit einer vorteilhaften Sekretion und vorteilhaften Flexibilitäts/Anwendbarkeits-Eigenschaften in einem Fusionsprotein erreicht wird, das einen Nicht-Antikörperanteil, umfassend eine Effektordomäne von einem Wachstumsfaktor oder Wachstumsfaktor-Rezeptor in Verknüpfung mit dem aminoterminalen Ende einer IgG-abgeleiteten Sequenz, die im Wesentlichen aus einem Gelenk : CH&sub2; : CH&sub3;-Segment, dem eine CH&sub1;-Domäne fehlt, besteht, aufweist. Eine Sequenz "bestehend im Wesentlichen aus" diesem Segment kann andere Komponenten einschließen, welche die hervorstechenden Eigenschaften des Fusionsproteins, wie z. B. dessen Vermögen nach heterologer Expression in stabiler Form sekretiert zu werden (siehe unten), nicht wesentlich beeinflussen. Ein Beispiel einer IgG-abgeleiteten Sequenz ist eine γ&sub1;-Sequenz, die aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;-Domäne und einer CH&sub3;-Domäne besteht.
Es wurde auch festgestellt, dass ein heterologes Signalpeptid, das stromaufwärts des Nicht-Antikörperanteils eines chimären Moleküls im Rahmen der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, im allgemeinen die Sekretion des Fusionsproteins beeinflußt. Dies gilt sogar, wenn der Nicht-Antikörperanteil des Fusionsproteins ein intrazelluläres Protein oder ein Segment eines Moleküls ist, welches per se nicht sekretiert wird.
Chimäre Moleküle der vorliegenden Erfindung werden ohne weiteres in stabiler Form von Säugerzellen sekretiert, die mit DNA, welche für das Molekül codiert, transfiziert wurden. Darüber hinaus sind sie einer schnellen effizienten Reinigung bis zur Homogenität, beispielsweise unter Verwendung von Protein A, zugänglich. Nachdem diese Moleküle deshalb in einer kommerziell brauchbaren Menge und Form erhältlich sind, stellen sie einen vorteilhaften Ersatz für monoklonale Antikörper in einem Kontext wie Durchflußzytometrie, Immunhistochemie, Immunpräzipitation und Enzym-gekoppelte Immunosorbens-Assays (ELISAs) dar.
Eine Kategorie von chimären Molekülen gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch besonders bemerkenswert hinsichtlich der mitogenen Aktivität, die von den Fusionsproteinen in dieser Kategorie gezeigt wird. Insbesondere wurde festgestellt, dass Mitogenizität diejenigen Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung kennzeichnet, bei denen der Nicht-Antikörperanteil eine Effektordomäne eines Wachstumsfaktors enthält, der in der Natur einen Rezeptor bindet, welcher ein "Einzeleinheit"-Rezeptor ist, d. h., einer, der kein Rezeptor aus mehreren Einheiten ist, wie z. B. der Hochaffinitäts-IL-2-Rezeptor, der aus einer α-Kette, einer β-Kette und einer γ-Kette aufgebaut ist.
Besonders bevorzugt in dieser Hinsicht sind Fusionsproteine, bei denen der Nicht- Antikörperanteil eine Effektordomäne eines Wachstumsfaktors enthält, der in der Natur einen Einzeleinheit-Rezeptor mit inhärenter Tyrosinkinase-Aktivität bindet. Fig. 2 illustriert, dass solche Rezeptoren eine extrazelluläre Liganden-bindende Domäne und eine intrazelluläre Tyrosinkinase-Domäne, verantwortlich für die Weiterleitung des mitogenen Signals nach Bindung des zugehörigen GF, einschließen. Siehe Aaronson, Science 254: 1146 (1991), dessen Inhalt hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
Fusionsproteine in der vorgenannten Kategorie erfahren eine Internalisierung durch Rezeptor-vermittelte Endozytose, im Wesentlichen ähnlich dem natürlichen GF, im Gegensatz zu der Situation, die typischerweise für Antikörper zutrifft, die gegen externe Rezeptordomänen gerichtet sind. In diesem Kontext bezeichnet "Internalisierung" die Bewegung des Fusionsproteins in eine Zelle, welche den zugehörigen Rezeptor trägt, und dann durch intrazelluläre Kompartimente, die mit Rezeptor-Ligand-Entkopplung bzw. Rezeptor-Rückführung assoziiert sind, zu einem Kompartiment oder Kompartimenten, wo das Fusionsprotein akkumuliert und schließlich abgebaut wird. Siehe Jäckle et al., J. Biol. Chem. 266: 1396 (1991), dessen Inhalt hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist. So wird angenommen, dass sich die fraglichen Fusionsproteine nicht in einem intrazellulären Kompartiment, das mit der Rezeptor-Rückführung assoziiert ist, ansammeln und somit nicht der Rückführung zu der Zelloberfläche mit rückgeführtem Rezeptor unterworfen sind. Folglich repräsentieren diese Fusionsproteine ein besonders wirksames Mittel zum Transport von bioaktiven Molekülen und bildgebenden Agenzien ins Innere von Zielzellen.
Die Wirkung einer solchen Fusionsprotein-Internalisierung mag als Veränderung des Zellwachstums und/oder der Zelldifferenzierung beobachtet werden. Beispielsweise kann ein Keratinozyten-Wachstumsfaktor-Fusionsprotein eine mitogene Reaktion in BALB/MK-Zellen induzieren, wie in Beispiel 2 unten gezeigt. Es steht zu erwarten, dass Fusionsproteine, die eine Wachstumsfaktor-Effektordomäne umfassen, eine Veränderung im Zellwachstum und/oder der Zelldifferenzierung über Signalwege induzieren, die im wesentlichen ähnlich wie bei natürlichen Wachstumsfaktoren sind.
Ein "Wachstumsfaktor" (GF) in der vorliegenden Beschreibung ist ein Polypeptid, welches das Wachstum und/oder den Metabolismus einer Zielzelle moduliert durch die Bindung an ein Rezeptorprotein, welches an die extrazelluläre Membran der Zielzelle gebunden ist. Beispiele von Wachstumsfaktoren umfassen Thrombozyten- Wachstumsfaktor (PDGF), Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), Insulin, Nervenwachstumsfaktor (NGF), insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF), transformierenden Wachstumsfaktor (TGF), hepatischen Wachstumsfaktor (HGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), das Produkt des Wnt-2-Proto-Onkogens (wnt- 2). Aaronson, supra; Norman et al., HORMONES, S. 719-748 (Academic Press 1987). Siehe auch allgemein Heath (Hrsg.), GROWTH FACTORS, IRL Press (1990).
Ein "Wachstumsfaktor-Rezeptor" (GFR) ist ein Membran-überspannendes Protein, welches die Wirkungen eines GF über eine extrazelluläre GF-bindende Domäne vermittelt. Illustrative GFR sind PDGFR, KGFR, EGFR, HGFR, FGFR1, Insuünrezeptor, IGF-1 R, HGFR ("Met") und NGFR. Bevorzugte GFR weisen mindestens eine Domäne auf, welche zwei β-Faltblätter umfasst, die ein Sandwich bilden, das durch eine Disulfidbindung stabilisiert wird. Eine solche Struktur wird als eine "Immunglobulin (Ig)-ähnliche Domäne" bezeichnet.
Eine "Effektordomäne" eines Moleküls ist ein Anteil des Moleküls, der für eine funktionelle charakteristische Eigenschaft des Moleküls verantwortlich ist. Beispielsweise ist die Effektordomäne eines GF ein Anteil eines GF, der an den zugehörigen Rezeptor bindet, während sich die Effektordomäne eines GFR auf einen Anteil eines GFR bezieht, der an den zugehörigen Liganden bindet. Dementsprechend schließt eine "Aktivität, die charakteristisch ist" für eine GF- Effektordomäne und eine GRF-Effektordomäne, die Bindung an einen zugehörigen GFR bzw. zugehörigen GF ein. In dieser Beschreibung bezeichnet der Ausdruck "Nicht-Antikörpersequenz" eine Aminosäuresequenz für eine oder mehrere Effektordomäne(n) eines Moleküls, das kein Antikörper ist.
Ein "Signalpeptid" ist eine Aminosäuresequenz, welche die Passage eines sekretierten Proteinmoleküls oder eines Membranproteinmoleküls durch das endoplasmatische Retikulum erleichtert. Kreil, Ann. Rev. Biochem. 50: 317 (1981); Walter et al., Cell 38: 5 (1984). In eukaryotischen Zellen haben Signalpeptide die charakteristischen Merkmale von (1) einer N-terminalen Position auf dem Protein, (2) einer Länge von etwa 16 bis etwa 35 Aminosäureresten, (3) einer netto positiv geladenen Region innerhalb der ersten 2 bis 10 Reste, (4) einem zentralen Kernbereich von mindestens 9 neutralen oder hydrophoben Resten, die zur Bildung einer Alpha-Helix in der Lage sind, (5) einem Kehren-induzierenden Aminosäurerest nahe des hydrophoben Kerns, und (6) einer spezifischen Spaltstelle für eine Signalpeptidase gemeinsam, von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683 (1986). Zahlreiche spezifische Signalpeptide wurden dokumentiert und sind beispielsweise in Tabelle 21-7 von Darnell et al., MOLECULAR CELL BIOLOGY (Scientific American Books, Inc. 1986), zu finden.
Im vorliegenden Kontext ist ein "heterologes" Signalpeptid eines, das in der Natur nicht mit dem Nicht-Antikörperanteil eines Fusionsproteins im Rahmen der vorliegenden Erfindung assoziiert ist. Geeignete heterologe Signalpeptide schließen Signalpeptide ein, die in der Natur mit einem GF oder GFR, wie z. B. einem Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus PDGF A, PDGF B, KGF, Gefäßendothel- Wachstumsfaktor (VEGF), KGF-Rezeptor (KGFR) und β-PDGF-Rezeptor (β- PDGFR), ausgewählt ist, assoziiert sind.
Ein "intrazelluläres Protein" in dieser Beschreibung ist ein Protein, wie z. B. p53- Protein, Retinoblastom (Rb)-Protein und ras, das normalerweise nicht von einer Zelle sekretiert wird, welches es synthetisiert, und das Effektordomänen enthält, wie z. B. diejenigen, die an Proteinwechselwirkungen, Nukleinsäurewechselwirkungen oder enzymatischen Funktionen beteiligt sind.
Eine "Markergruppierung" in der vorliegenden Beschreibung bezieht sich auf ein Molekül, welches unter vorbestimmten Bedingungen ein Signal erzeugen wird. Beispiele von Markergruppierungen schließen Radioisotope, Enzyme, Fluoreszenzmarkierungen, Chemilumineszenzmarkierungen, Biolumineszenzmarkierungen und paramagnetische Markierungen ein.

I. HERSTELLUNG VON FUSIONSPROTEINEN

A. Konstruktion von Fusionsprotein-Expressionsvektoren

Zur Herstellung eines Fusionsproteins gemäß der vorliegenden Erfindung, welches Antikörper- und Nicht-Antikörperanteile umfasst und welches in stabiler Form von Säugerzellen sekretiert wird, werden DNA-Sequenzen, die für das Fusionsprotein codieren, in einen Expressionsvektor subkloniert, welcher zur Transfektion von Säugerzellen eingesetzt wird. Allgemeine Techniken zur Herstellung von Fusionsproteinen, die Antikörpersequenzen umfassen, werden in Coligan et al. (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, auf S. 10.19.1-10.19.11 (Wiley Interscience 1992) beschrieben, dessen Inhalt hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist. Siehe auch METHODS: A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY, Band 2 (Nr. 2), Academic Press (1991) und ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE, W. H. Freeman und Company (1992), worin Kommentare, die sich auf die Herstellung von Fusionsproteinen beziehen, über die jeweiligen Texte verteilt sind.
Somit ist der erste Schritt bei der Konstruktion von Fusionsproteinen die Subklonierung von Teilen der Fusionsproteine in Klonierungsvektoren. In diesem Kontext ist ein "Klonierungsvektor" ein DNA-Molekül, z. B. ein Plasmid, Cosmid oder Bakteriophage, das sich autonom in einer prokaryotischen Wirtszelle replizieren kann. Klonierungsvektoren enthalten typischerweise eine oder eine kleine Anzahl von Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle(n), an der/denen fremde DNA- Sequenzen in einer nachweisbaren Weise ohne Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion des Vektors eingeführt werden können, sowie ein Markergen, das zur Verwendung bei der Identifikation und Selektion von mit dem Klonierungsvektor transformierten Zellen geeignet ist. Markergene beinhalten typischerweise Gene, welche für Tetrazyklinresistenz oder Ampicillinresistenz sorgen. Geeignete Klonierungsvektoren werden von Sambrook et al. (Hrsg.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Zweite Auflage (Cold Spring Harbor Press 1989) (im folgenden "Sambrook"); von Ausubel et al. (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Wiley Interscience 1987) (im folgenden "Ausubel"), und von Brown (Hrsg.), MOLECULAR BIOLOGY LABFAX (Academic Press 1991) beschrieben. Klonierungsvektoren können beispielsweise von GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA), Invitrogen (San Diego, CA) und der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten werden.
Die DNA-Sequenz, die für den Ig-Anteil eines Fusionsproteins im Rahmen der vorliegenden Erfindung codiert, codiert vorzugsweise für eine schwere Ig-Kette. Bevorzugter codiert eine solche DNA-Sequenz für die Gelenk-, CH&sub2;- und CH&sub3;- Domänen von IgG, wie oben angegeben. Immunglobulin-DNA-Sequenzen können unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) wie beispielsweise von Coligan et al. (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, S. 10.20.1- 10.20.8 (Wiley Interscience 1992) (im folgenden "Coligan"), beschrieben erhalten werden.
Bei einer Vorgehensweise werden Antikörper-DNA-Sequenzen aus RNA von Zellen amplifiziert, welche ein Immunglobulin synthetisieren. Larrick et al., "PCR Amplification of Antibody Genes", in 2 METHODS: A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY 106 (1991). In Kürze, Gesamt-RNA wird aus Immunglobulinproduzierenden Zellen mit Hilfe von Standardtechniken isoliert. Siehe Ausubel auf den Seiten 4.1.2-4.2.8. Poly A+-RNA wird dann aus Gesamt-RNA mit Hilfe der Standardtechnik der Oligo-dT-Säulenchromatographie wie beispielsweise von Sambrook beschrieben isoliert. Einzelsträngige cDNA-Moleküle werden dann von Poly A+-RNA mit Hilfe von reverser Transkriptase synthetisiert. Techniken zur Synthese von cDNA werden jeweils in Sambrook, Ausubel und Coligan beschrieben. Darüber hinaus können im Handel erhältliche Kits eingesetzt werden, um cDNA-Moleküle zu synthetisieren. Beispielsweise sind solche Kits von GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI) und Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA) erhältlich.
Die PCR-Reaktion wird mit der einzelsträngigen cDNA-Matrize und einer Mischung von Oligonucleotid-Primern durchgeführt. Die Gestaltung der Oligonucleotid-Primer kann auf der DNA-Sequenz des Immunglobulins von Interesse basieren. Alternativ können Oligonucleotid-Primer auf Basis der Information aus einer Datenbank von Immunglobulin-Aminosäuresequenzen, wie z. B. Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U. S. Department of Health and Human Services (1983), unter Berücksichtigung von Degenerationen für jede Aminosäure konstruiert werden. Techniken zur Oligonucleotid-Synthese und -Reinigung werden in Sambrook bzw. Ausubel beschrieben. Das PCR-Verfahren wird mit einer wohlbekannten Methodik durchgeführt. Siehe beispielsweise Ausubel, Coligan und Bangham, "The Polymerase Chain Reaction: Getting Started," in PROTOCOLS IN HUMAN MOLECULAR GENETICS (Humana Press 1991). Darüber hinaus können PCR-Kits von Firmen wie Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA) und Invitrogen (San Diego, CA) bezogen werden.
Alternativ können Immunglobulin-codierende DNA-Sequenzen durch Anwendung von PCR mit klonierten Immunglobulinen synthetisiert werden. Diese Vorgehensweise wird im Folgenden in Beispiel 1 erläutert.
DNA-Sequenzen, die für GF- oder GFR-Effektordomänen codieren, können durch Anwendung von PCR mit RNA, die aus die GF- oder GRF-Proteine produzierenden Zellen isoliert wurde, wie oben beschrieben synthetisiert werden. Vorzugsweise codieren GFR-DNA-Sequenzen für eine oder mehrere Effektordomäne(n) mit der Struktur von Ig-ähnlichen Domänen.
Alternativ können DNA-Sequenzen, die für GF- oder GFR-Effektordomänen codieren, durch Anwendung von PCR mit einer GF-cDNA- oder GFR-cDNA-Matrize, wie unten in Beispiel 1 erläutert erhalten werden. Darüber hinaus sind GF- und GFRcodierende Klone von der American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Maryland, USA) neben anderen Quellen im Handel erhältlich. Siehe beispielsweise ATCC-Hinterlegungsnummern 57346 und 57415 (EGF-Rezeptorklone) und ATCC- Hinterlegungsnummer 41033 (PDGF B-Klon).
DNA-Sequenzen, die für heterologe Signalpeptide codieren, können durch PCR mit RNA, die aus GF- oder GFR-Proteine produzierenden Zellen isoliert wurde, wie oben beschrieben erhalten werden. Solche DNA-Sequenzen können auch durch Isolierung von Fragmenten von GF- oder GFR-cDNAs, die für ein Signalpeptid codieren, erhalten werden. Beispielsweise wurde das in dem Expressionsvektor- Konstrukt von Beispiel 1 verwendete PDGF A-Signalpeptid von dem 5'-Ende eines PDGF A-cDNA-Klons, beschrieben von Betsholtz et al., Nature 320: 695 (1986), dessen Inhalt hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist, erhalten.
Alternativ können DNA-Sequenzen, die für Signalpeptide codieren, durch die Synthese von Oligonucleotiden erhalten werden, welche für bekannte Signalpeptid- Aminosäuresequenzen codieren. Solche Aminosäuresequenzen werden beispielsweise von Darnell et al., supra, und Wallis et al., THE BIOCHEMISTRY OF THE POLYPEPTIDE HORMONES, S. 212 (John Wiley & Sons 1985), offenbart. Techniken für Oligonucleotid-Synthese werden beispielsweise von Ausubel auf den Seiten 2.11.1-2.12.5 offenbart. Siehe auch allgemein Eckstein et al. (Hrsg.), OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH (IRL Press 1992).
DNA-Sequenzen, die für ein heterologes Signalpeptid codieren, werden im Leserahmen mit DNA-Sequenzen, die für den N-Terminus einer GF- oder GFR- Effektordomäne codieren, subkloniert, während DNA-Sequenzen, die für die GF- oder GFR-Effektordomäne codieren, im Leserahmen mit dem N-Terminus des Antikörperanteils des Fusionsproteins subkloniert werden. Die Subklonierung wird nach herkömmlichen Techniken durchgeführt, wie z. B. der Anwendung einer Restriktionsenzymverdauung, um geeignete Termini bereitzustellen, der Anwendung einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um eine unerwünschte Verknüpfung von DNA-Molekülen zu vermeiden, und der Ligierung mit geeigneten Ligasen. Techniken für eine solche Manipulation werden von Sambrook und Ausubel beschrieben und sind im Stand der Technik wohlbekannt. Techniken zur Amplifizierung von klonierter DNA in bakteriellen Wirten und die Isolierung klonierter DNA aus Bakterienwirten sind ebenfalls wohlbekannt. Id.
Das klonierte Fusionsprotein wird von dem Klonierungsvektor abgespalten und in einen Expressionsvektor eingeführt. Geeignete Expressionsvektoren enthalten typischerweise (1) prokaryotische DNA-Elemente, codierend für einen bakteriellen Replikationsursprung und einen Antibiotikaresistenzmarker, um das Wachstum und die Selektion des Expressionsvektors in einem bakteriellen Wirt zu ermöglichen; (2) eukaryotische DNA-Elemente, welche die Initiation der Transkription kontrollieren, wie z. B. einen Promotor; und (3) DNA-Elemente, welche die Prozessierung von Transkripten steuern, wie z. B. eine Transkriptionsterminations/Polyadenylierungssequenz.
Ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in eukaryotischen Zellen, z. B. Säuger-, Insekten- und Hefezellen, exprimiert. Säugerzellen sind besonders bevorzugte eurkaryotische Wirte, da Säugerzellen für geeignete posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Glykosylierung, sorgen. Beispiele von Säugerwirtszellen umfassen Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-K1; ATCC CCL61), Rattenhypophysenzellen (GH1; ATCC CCL82), HeLa 53-Zellen (ATCC CCL2.2), Rattenhepatomzellen (H-4-II-E; ATCC CRL1548), SV40- transformierte Affennierenzellen (COS-1; ATCC CRL 1650) und Mausembryozellen (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Vorzugsweise sind die Säugerwirtszellen NIH-3T3-. Zellen.
Für einen Säugerwirt können die transkriptionalen und translationalen regulatorischen Signale aus viralen Quellen, z. B. Adenovirus, Rinderpapillomavirus, Simian-Virus oder dgl. stammen, worin die regulatorischen Signale mit einem bestimmten Gen assoziiert sind, welches ein hohes Expressionsniveau aufweist. Geeignete transkriptionale und translationale regulatorische Sequenzen können auch aus Säugergenen, wie z. B. Actin-, Kollagen-, Myosin- und Metallothionein- Genen, erhalten werden.
Transkriptionale regulatorische Sequenzen schließen eine Promotorregion ein, die ausreicht, um die Initiation der RNA-Synthese zu steuern. Geeignete eukaryotische Promotoren schließen den Promotor des Maus-Metallothionein I-Gens [Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet 1: 273 (1982)], den TK-Promotor des Herpesvirus [McKnight, Cell 31: 355 (1982)], den frühen SV40-Promotor [Benoist et al., Nature 290: 304 (1981)], den Rous-Sarkomvirus-Promotor [Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982)] und den Cytomegalovirus-Promotor [Foecking et al., Gene 45: 101 (1980)] ein.
Alternativ kann ein prokaryotischer Promotor, z. B. der Promotor der Bakteriophagen- T3-RNA-Polymerase zur Kontrolle der Fusionsgenexpression eingesetzt werden, falls der prokaryotische Promotor von einem eukaryotischen Promotor reguliert wird. Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990); Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19: 4485 (1991).
Ein Expressionsvektor kann in Wirtszellen unter Anwendung einer Vielfalt von Techniken, einschließlich Calciumphosphat-Transfektion, Liposomen-vermittelter Transfektion, Elektroporation und dgl., eingeführt werden. Vorzugsweise werden transfizierte Zellen ausgewählt und vermehrt, worin der Expressionsvektor stabil in das Wirtszellgenom integriert ist, um stabile Transformanten zu produzieren. Techniken zur Einführung von Vektoren in eukaryotische Zellen und Techniken zur Selektion stabiler Transformanten unter Verwendung eines dominanten selektierbaren Markers werden von Sambrook, von Ausubel, von Bebbington, "Expression of Antibody Genes in Nonlymphoid Mammalian Cells," in 2 METHODS: A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY 136 (1991), und von Murray (Hrsg.), GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS (Humana Press 1991), beschrieben.
Stabile Transformanten, welche ein Fusionsprotein produzieren, können unter Anwendung einer Vielfalt von Methoden identifiziert werden. Beispielsweise können stabile Transformanten mit Hilfe eines Antikörpers, welcher entweder an den Nicht- Antikörperanteil des Fusionsproteins oder an den Antikörperanteil des Fusionsproteins bindet, gescreent werden. Die Anwendung von Immunpräzipitation zur Identifizierung von Zellen, welche Fusionsproteine produzieren, wird in Beispiel 2 unten erläutert.
Nachdem Fusionsprotein-produzierende Zellen identifiziert wurden, werden die Zellen kultiviert und Fusionsproteine aus Kulturüberständen isoliert. Wie beschrieben, beispielsweise von Coligan, schließen Isolierungstechniken Affinitätschromatographie mit Protein-A-Sepharose, Größenausschlußchromatographie und Ionenaustauschchromatographie ein. Protein A wird vorzugsweise zur Isolierung von Fusionsproteinen aus Überständen eingesetzt.

B. Assay hinsichtlich beibehaltener Effektoraktivität

Routine-Bindungsassays können durchgeführt werden, um festzustellen, ob der Nicht-Antikörperanteil des Fusionsproteins das Vermögen zur Bindung an seinen zugehörigen Liganden oder Rezeptor behält. Beispielsweise können Fusionsproteine, die eine GFR-Domäne umfassen, durch Anwendung eines Konkurrenz-Bindungsassays, wie z. B. Scatchard-Analyse, Scatchard, Ann. N. Y. Acad Sci. 51: 660 (1949), getestet werden. In diesem Beispiel wird eine Scatchard- Analyse durchgeführt, indem die Bindung von radioaktiv markiertem GF an das Fusionsprotein, das mindestens eine zugehörige GFR-Effektordomäne umfasst, in Gegenwart von überschüssigem unmarkiertem GF gemessen wird. Umgekehrt können Fusionsproteine, die eine GF-Domäne enthalten, getestet werden, indem die Bindung von radioaktiv markiertem GF an eine GFR-Membranpräparation oder an Zellen, die GFR enthalten, in Gegenwart von überschüssigem unmarkiertem Fusionsprotein gemessen wird. Ein Bindungstest wird unten in Beispiel 2 erläutert.
Alternativ kann die Bindungsaktivität eines Fusionsproteins, das eine GFR-Domäne umfasst, getestet werden, indem das Vermögen des Fusionsproteins zur Hemmung einer biologischen Aktivität, die durch den zugehörigen Liganden des GFR vermittelt wird, gemessen wird. Bei diesem Assay-Typ konkurriert das Fusionsprotein mit dem GFR der Zielzelle um eine limitierte Menge des zugehörigen GF. Beispiel 1 erläutert einen mitogenen Assay, worin ein Fusionsprotein, das eine GFR-Effektordomäne umfasst, verwendet wird, um eine GF-vermittelte Erhöhung der DNA-Synthese zu hemmen.
Umgekehrt können Fusionsproteine, die eine GF-Effektordomäne umfassen, getestet werden, indem das Vermögen des Fusionsproteins zur Induktion von Mitogenese oder Transformation gemessen wird, wie in den Beispielen 2, 4 und 5 erläutert.

II. Verwendung von Fusionsproteinen zur Diagnose und Therapie

A. Verwendung von Fusionsproteinen zur Diagnose

Die Anwesenheit eines speziellen GF oder GFR kann in einer biologischen Probe durch Anwendung eines in vitro-Assays nachgewiesen werden. Dementsprechend kann ein Fusionsprotein, das eine GF-Effektordomäne umfasst, verwendet werden, um die Anwesenheit von GFR in einer biologischen Probe nachzuweisen, während ein Fusionsprotein, das eine GFR-Effektordomäne umfasst, eingesetzt werden kann, um die Anwesenheit von GF in einer biologischen Probe nachzuweisen. In solchen in vitro-Assays können die Fusionsproteine in flüssiger Phase eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Anwesenheit eines GF in einer biologischen Probe getestet werden, indem die biologische Probe mit einer Spurenmenge von markiertem GF und einem Fusionsprotein, das eine GFR-Effektordomäne umfasst, unter Bedingungen, welche die Bindung von GF an das Fusionsprotein fördern, gemischt wird. Komplexe von GF und Fusionsprotein in der Probe können von der Reaktionsmischung abgetrennt werden, indem der Komplex mit einem immobilisierten Protein kontaktiert wird, welches für den Antikörperanteil des Fusionsproteins spezifisch ist, wie z. B. ein Fc-Antikörper oder Staphylococcus- Protein A. Die Konzentration an GF in der biologischen Probe wird umgekehrt proportional zu der Menge an markiertem GF sein, die an das Fusionsprotein gebunden ist, und in direkter Beziehung zur Menge an freiem markiertem GF stehen.
Alternativ können in vitro-Assays durchgeführt werden, worin das Fusionsprotein an einen Festphasen-Träger gebunden ist. Beispielsweise kann Fusionsprotein mit einem Polymer, z. B. Aminodextran, verknüpft werden, um die Antikörper- Komponente des Fusionsproteins mit einem unlöslichen Träger, wie z. B. einer Polymer-beschichteten Perle, einer Platte oder einem Röhrchen, zu verknüpfen.
Andere geeignete in vitro-Assays werden für Fachleute auf dem Gebiet unschwer ersichtlich sein.
Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung können auch eingesetzt werden, um die Anwesenheit spezieller Proteine in Gewebeschnitten, die von einer histologischen Probe präpariert wurden, nachzuweisen. Ein solcher in situ-Nachweis kann durchgeführt werden, indem ein nachweisbar markiertes Fusionsprotein auf den Gewebeschnitten aufgebracht wird. In situ-Nachweis kann eingesetzt werden, um die Anwesenheit eines bestimmten Proteins festzustellen und um die Verteilung des Proteins in dem untersuchten Gewebe zu bestimmen. Allgemeine Techniken des in situ-Nachweises sind Durchschnittsfachleuten wohlbekannt. Siehe beispielsweise Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application," in MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH 113-38, Monk (Hrsg.) (IRL Press 1987), und Coligan.
Fusionsproteine können mit irgendeiner geeigneten Markergruppierung, beispielsweise einem Radioisotop, einem Enzym, einer Fluoreszenzmarkierung, einer Chemilumineszenzmarkierung, einer Biolumineszenzmarkierung oder einer paramagnetischen Markierung, nachweisbar markiert werden. Verfahren zur Herstellung und zum Nachweis solcher nachweisbar markierten Fusionsproteine sind Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und werden detaillierter im folgenden beschrieben.
Die Markergruppierung kann ein Radioisotop sein, welches durch solche Mittel wie den Einsatz eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers oder mittels Autoradiographie nachgewiesen werden kann. Isotope, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders geeignet sind, sind ³H, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³&sup5;S, ¹&sup4;C und vorzugsweise ¹²&sup5;I.
Fusionsproteine können auch mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert werden. Die Anwesenheit eines fluoreszenzmarkierten Fusionsproteins wird festgestellt, indem das Fusionsprotein Licht der richtigen Wellenlänge ausgesetzt und die resultierende Fluoreszenz nachgewiesen wird. Fluoreszenzmarkierungsverbindungen umfassen Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerytherin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin. Fluoreszenzmarkierte Fusionsproteine sind besonders geeignet für die Durchflußzytometrie-Analyse und immunhistochemische Analyse, wie in Beispiel 2 erläutert.
Alternativ können Fusionsproteine nachweisbar markiert werden durch Kopplung des Fusionsproteins an eine chemilumineszierende Verbindung. Die Anwesenheit des chemilumineszenzmarkierten Fusionsproteins wird festgestellt durch Nachweis der Anwesenheit von Lumineszenz, welche im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele von Chemilumineszenzmarkierungsverbindungen schließen Luminol, Isoluminol, einen aromatischen Acridiniumester, ein Imidazol, ein Acridiniumsalz und einen Oxalatester ein.
Gleichermaßen kann eine biolumineszente Verbindung eingesetzt werden, um Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist ein Typ von Chemilumineszenz, der in biologischen Systemen gefunden wird, worin ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Die Anwesenheit eines biolumineszenten Proteins wird durch Nachweis der Anwesenheit von Lumineszenz festgestellt. Biolumineszenzverbindungen, welche zur Markierung geeignet sind, schließen Luciferin, Luciferase und Aequorin ein.
Alternativ können Fusionsproteine durch Verknüpfung des Fusionsproteins mit einem Enzym nachweisbar markiert werden. Wenn das Fusionsprotein-Enzym- Konjugat in Gegenwart des geeigneten Substrats inkubiert wird, reagiert die Enzymgruppierung mit dem Substrat, um eine chemische Gruppierung zu bilden, welche beispielsweise durch spektralphotometrische, fluorometrische oder visuelle Mittel nachgewiesen werden kann. Beispiele von Enzymen, welche eingesetzt werden können, um Fusionsproteine nachweisbar zu markieren, schließen Malatdehydrogenase, Staphylokokkennuclease, Delta-V-Steroid-Isomerase, Hefe- Alkoholdehydrogenase, α-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Catalase, Glucose-VI- phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase ein.
Fachleute auf dem Gebiet werden andere geeignete Markierungen kennen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Die Bindung von Markergruppierungen an Fusionsproteine kann mit Hilfe von Standardtechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt werden. Eine diesbezügliche typische Methodik wird von Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976), Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81: 1 (1977), Shih et al., Int'l J. Cancer 46: 1101 (1990), und Coligan beschrieben.
Die oben beschriebenen in vitro- und in situ-Nachweisverfahren können eingesetzt werden, um bei der Diagnose oder dem Staging eines pathologischen Zustands von Nutzen zu sein. Beispielsweise können solche Verfahren eingesetzt werden, um Tumore nachzuweisen, welche einen speziellen GFR überexprimieren, wie z. B. epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptor [Libermann et al., Nature 313: 144 (1985); Yamamoto ef at, Cancer Res. 46: 141 (1986)]; PDGFR [Fleming et al., ibid. 52: 4550 (1992)]; Oncogene 7: 1355 (1992)] und Met [Vande Woude, Jap. J. Cancer Res. 83 (1992)].
Die vorliegende Erfindung betrachtet auch die Verwendung von Fusionsproteinen für in vivo-Diagnose. Das Verfahren der diagnostischen Bildgebung mit radioaktiv markierten Proteinen ist wohlbekannt. Bei der Technik der Immunoszintigraphie werden beispielsweise Antikörper mit einem Gammastrahlen emittierenden Radioisotop markiert und in einen Patienten eingeführt. Eine Gamma-Kamera wird eingesetzt, um die Lokalisierung und Verteilung von Gammastrahlen emittierenden Radioisotopen nachzuweisen. Siehe beispielsweise Srivastava (Hrsg.), RADIOLABELLED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 18. Auflage, Gennaro et al. (Hrsg.), S. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990), und Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49, Pezzuto et al. (Hrsg.) (Chapman & Hall, 1993).
Für diagnostische Bildgebung können Radioisotope an den Antikörperanteil eines Fusionsproteins entweder direkt oder indirekt unter Verwendung einer intermediären funktionellen Gruppe gebunden werden. Geeignete intermediäre funktionelle Gruppen schließen Chelatbildner, wie z. B. Ethylendiamintetraessigsäure und Diethylentriaminpentaessigsäure, ein. Siehe beispielsweise Shih et al., supra, und US-Patent Nr. 5,057,313.
Die dem Patienten verabreichte Strahlungsdosis wird durch die Wahl eines Isotops für die beste Kombination von minimaler Halbwertszeit, minimaler Retention im Körper und minimaler Menge an Isotop, welche einen Nachweis und eine genaue Messung erlauben wird, auf einem so niedrigen Niveau wie möglich gehalten. Beispiele von Radioisotopen, welche an ein Fusionsprotein gebunden werden können und für diagnostische Bildgebung geeignet sind, schließen 99mTc und ¹¹¹In ein.
Fusionsproteine können auch mit paramagnetischen Ionen zum Zwecke der in vivo- Diagnose markiert werden. Elemente, welche für die Magnetresonanz-Bildgebung besonders geeignet sind, schließen Gd-, Mn-, Dy- und Fe-Ionen ein.

B. Verwendung von Fusionsproteinen zur Therapie

Die Vorgehensweise für eine Fusionsprotein-Therapie ist ähnlich der bei der monoklonalen Antikörpertherapie angewandten Vorgehensweise. In beiden Fällen ist das Ziel, zytotoxische Dosen von Radioaktivität, Toxin oder Arzneimittel Zielzellen zu verabreichen, während die Exposition gegenüber Nicht-Zielgeweben minimiert wird. Fusionsproteine, die eine GF-Effektordomäne umfassen, sind bevorzugt. Solche Fusionsproteine werden an Zielzellen binden, welche den zugehörigen GFR in der extrazellulären Membran exprimieren. Im Gegensatz zu der Situation, welche typischerweise für Antikörper zutrifft, die gegen externe Rezeptordomänen gerichtet sind, werden Fusionsproteine, die eine GF-Effektordomäne umfassen, jedoch nach der Bindung an den zugehörigen GFR internalisiert, im wesentlichen ähnlich wie der natürliche GF.
Fusionsproteine, die GF-Effektordomänen umfassen, können eingesetzt werden, um beispielsweise Tumore, die GFR überexprimieren, wie z. B. Glioblastome und Brustkrebs, zu behandeln.
Wie oben erörtert, kann ein Radioisotop mit einem Fusionsprotein direkt oder indirekt, über einen Chelatbildner, verknüpft werden. Beispielsweise kann &sup6;&sup7;Cu, das aufgrund seiner Halbwertszeit von 61,5 Stunden und reichlichen Bereitstellung von Beta-Teilchen und Gammastrahlen als eines der aussichtsreicheren Radioisotope für eine Radioimmuntherapie betrachtet wird, mit einem Fusionsprotein unter Verwendung des Chelatbildners p-Bromacetamidobenzyltetraethylamintetraessigsäure (TETA) konjugiert werden, Chase, supra. Alternativ kann &sup9;&sup0;Y, welches ein energiereiches Beta-Teilchen emittiert, mit einem Fusionsprotein unter Verwendung von Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) gekoppelt werden.
Alternativ können Bor-Addenden, wie z. B. Carborane, mit Fusionsproteinen verknüpft werden. Carborane können mit Carboxylfunktionen auf angehängten Seitenketten hergestellt werden, wie dies im Stand der Technik wohlbekannt ist. Die Verknüpfung von Carboranen mit einem Träger, wie z. B. Aminodextran, kann durch Aktivierung der Carboxylgruppen der Carborane und Kondensation mit Aminen auf dem Träger erzielt werden. Das Zwischenprodukt-Konjugat wird dann mit dem Fusionsprotein konjugiert. Nach Verabreichung des Fusionsprotein-Konjugats wird ein Bor-Addend durch thermische Neutronenbestrahlung aktiviert und in radioaktive Atome überführt, welche durch α-Emission zerfallen, um hochtoxische Wirkungen kurzer Reichweite zu entfalten.
Darüber hinaus können therapeutisch brauchbare Fusionsproteine hergestellt werden, worin ein Fusionsprotein mit einem Toxin oder einem Arzneimittel konjugiert ist. Beispiele von Toxinen, welche geeigneter-Weise bei der Herstellung solcher Konjugate eingesetzt werden, sind Ricin, Abrin, antivirales Kermesbeeren-Protein, Gelonin, Diphtherin-Toxin und Pseudomonas-Endotoxin. Geeignete chemotherapeutische Arzneimittel zur Herstellung von Fusionsprotein-Konjugaten schließen Doxorubicin, Daunorubicin, Methotrexat, Melphalin, Chlorambucil, Vinca- Alkaloide, 5-Fluor-Uridin und Mitomycin-C ein.
Nachdem Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung, welche GF-Effektordomänen umfassen, internalisiert werden, wird deren Wirksamkeit in Konjugation mit einem Toxin oder einem Arzneimittel im allgemeinen größer sein als diejenige der entsprechenden Antikörper-Konjugate. Dementsprechend kann eine niedrigere Dosis des Fusionsprotein-Konjugats, verglichen mit der Dosis, die für das entsprechende Antikörper-Konjugat erforderlich ist, einem Patienten verabreicht werden.
Im allgemeinen wird die Dosierung der verabreichten Fusionsprotein-Konjugate in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Alter, Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, allgemeinen medizinischen Zustand und der vorangegangenen Krankengeschichte des Patienten variieren. Typischerweise ist es wünschenswert, den Empfänger mit einer Dosis eines Fusionsprotein-Konjugats zu versorgen, welche im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Menge an Agens/Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl auch eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann, wenn es die Umstände verlangen.
Die Verabreichung von Fusionsprotein-Konjugaten an einen Patienten kann intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrapleural, intrathekal, mittels Perfusion durch einen regionalen Katheter oder durch direkte intraläsionale Injektion erfolgen. Bei der Verabreichung von Fusionsprotein- Konjugaten durch Injektion kann die Verabreichung durch kontinuierliche Infusion oder durch einen Einzelbolus oder mehrere Boli erfolgen.
Fusionsprotein-Konjugate, die einen Bor-Addend-beladenen Träger für eine Aktivierungstherapie durch thermische Neutronen aufweisen, werden normalerweise auf ähnliche Weise hergestellt werden. Es wird jedoch vorteilhaft sein, zu warten, bis das Fusionsprotein-Konjugat, das kein Ziel gefunden hat, ausgeschieden ist, bevor die Neutronenbestrahlung durchgeführt wird. Die Clearance kann beschleunigt werden durch Verwendung eines Antikörpers, der an die Antikörpergruppierung des Fusionsproteins bindet. Siehe US-Patent Nr. 4,624,846 für eine Beschreibung dieses allgemeinen Prinzips.
Die Fusionsprotein-Konjugate der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch geeignete Zusammensetzungen herzustellen, wodurch Fusionsprotein-Konjugate in einer Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert werden. Eine Zusammensetzung wird als "pharmazeutisch annehmbarer Träger" bezeichnet, falls dessen Verabreichung von einem Empfängerpatienten toleriert werden kann. Sterile phosphatgepufferte Salzlösung ist ein Beispiel eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers. Andere geeignete Träger sind Fachleuten wohlbekannt. Siehe beispielsweise REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Auflage (1990).
Für Therapiezwecke werden ein Fusionsprotein-Konjugat und ein pharmazeutisch annehmbarer Träger einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Eine Kombination eines Fusionsprotein-Konjugats und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers wird als in einer "therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht bezeichnet, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Agens ist physiologisch signifikant, falls dessen Anwesenheit in einer nachweisbaren Veränderung der Physiologie eines Empfängerpatienten resultiert.
Weitere pharmazeutische Verfahren können eingesetzt werden, um die Wirkungsdauer eines Fusionsprotein-Konjugats in einer therapeutischen Anwendung zu steuern. Präparate zur kontrollierten Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren zur Komplexierung oder Adsorption des Fusionsprotein-Konjugats hergestellt werden. Beispielsweise schließen biokompatible Polymere Matrices von Poly(ethylen-co-vinylacetat) und Matrices eines Polyanhydrid-Copolymers von einem Stearinsäure-Dimer und Sebacinsäure ein. Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992). Die Rate der Freisetzung eines Fusionsprotein-Konjugats aus einer solchen Matrix hängt von dem Molekulargewicht des Fusionsprotein-Konjugats, der Menge des Fusionsprotein-Konjugats innerhalb der Matrix und der Größe dispergierter Teilchen ab. Saltzman et al., Biophys. J 55: 163 (1989); Sherwood et al., supra. Andere feste Dosierungsformen werden in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Auflage (1990), beschrieben.

III. Arbeitsbeispiele

Somit allgemein beschrieben, wird die vorliegende Erfindung leichter verständlich werden durch die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche zu Illustrationszwecken gegeben werden und die vorliegende Erfindung nicht beschränken sollen.

Beispiel 1. Herstellung und Analyse von Fusionsproteinen, die KGFR- Effektordomänen umfassen

Ein Plasmid-Klonierungsvektor pUC 18, welcher die Gelenk-, CH&sub2;- und CH&sub3;- Domänen des Gens der schweren Immunglobulinkette enthielt, wurde konstruiert und als "HFc-pUC 18" bezeichnet. Zur Erzeugung dieses Konstrukts wurde der HFc- Anteil der cDNA der schweren sis 1-Immunglobulinkette mittels PCR unter Einsatz der Primersequenzen:
5' (680-) CGTCTGGATCCCTCGAGAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAA und
3' (1390-) TCTCCGGATCCCTGGGATCATTTACCAGGAGAGTG amplifiziert.
Der Polymerasekettenreaktions-Kit und der Thermozykler wurden von Perkin-Elmer Co. (Norwalk, CT) bezogen und eine PCR nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die für die schwere Ig-Kette codierende cDNA wurde aus einer cDNA- Bank erhalten, die von einem Hybridom hergestellt wurde, welches einen monoklonalen Anti-PDGF-Antikörper, sis 1, produzierte, wie in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/365,715 (eingereicht am 14. Juni 1989) beschrieben, deren Inhalt hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
Das HFc-PCR-Produkt enthielt eine Xhol-Klonierungsstelle im Leserahmen mit der HFc-cDNA und BamHI-Ausschnittstellen an den 5'- und 3'-Enden. Ein zweiter Plasmid-Klonierungsvektor, als spHFc-pUC 18 bezeichnet, wurde ebenfalls konstruiert, der ein PDGF A-Signalpeptid, als "generisches Signalpeptid", im Leserahmen mit der Xhol-Klonierungstelle und der HFc-cDNA enthielt.
PCR wurde ebenfalls eingesetzt, um Keratinozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (KGFR)-cDNA, entsprechend den Ig-ähnlichen Effektordomänen D2 und D3 (Nucleotide 650 bis 1450), D2 allein (Nucleotide 650 bis 1130) oder D3 allein (Nucleotide 1132 bis 1359), zu amplifizieren. Miki et al., Science 251: 72-75 (1991). Die für die PCR eingesetzten Primersequenzen waren wie folgt:
5' (650-) TTAAGGTCGACAGAGGACCAGGGATTGGCACTGTG;
3' (1450-) ATAGCGTCGACGGAAGCCGTGATCTCCTTCTCTCT;
3' (1130-) ATAGCGTCGACGGAGGCATTTGCAGGCAGTCCAGC;
5' (1132-) TTAAGGTCGACACGGTGGTCGGAGGGGATGTGGAG;
3' (1359-) ATAGCGTCGACGGAGACCTTACATATATATTCCCCAGC.
Extrazelluläre D2/3- und D2-Domänen-PCR-Produkte wurden dann in das HFcpUC&sub1;&sub8;-Konstrukt im Leserahmen mit der HFc-cDNA unter Verwendung von mittels PCR erzeugten Xhol-kompatiblen Enden kloniert. Die D3-Domäne wurde in spHFcpUC18 kloniert. KGFR-HFc-Konstrukte sind in Fig. 3 als Diagramm dargestellt.
Eine Restriktionsendonukleaseverdauung unter Verwendung von BamHI schnitt jede chimäre KGFR-HFc-cDNA aus pUC18-Vektoren aus. Die KGFR-DNA-Fragmente wurden dann in die BgIII-Stelle des Maus-Metallothionein-Vektors MMTneo kloniert. Der Expressionsvektor MMTneo enthielt. ein Ampicillinresistenzgen, welches hinsichtlich Wachstum in Bakterienzellen selektioniert, sowie ein Neomycingen, welches das Säugerzellwachstum in Gegenwart von Geneticin, "G418", erlaubt.
Plasmid-DNAs von D213-HFc-, D2-HFc- und D3-HFc-MMTneo-Konstrukten wurden in NIH 3T3-Zellen mit 40 ug Träger-Kalbsthymus-DNA nach dem Calciumphosphat- Präzipitationsverfahren eingeführt. Wigler et al., Cell 11: 223 (1977). Etablierte Transfektanten wurden in Gegenwart von G418-haltigem Medium kultiviert.
Die Zellen wurden in Gegenwart von radioaktiv markierten Aminosäuren inkubiert, um die Expression der Fusionsproteine zu überprüfen. In Kürze, Zellkulturen wurden gewaschen und 30 Min. lang in Methionin- und Cystein-freiem Dulbecco's Modified Eagle Minimal Essential Medium (DMEM), enthaltend 25 uM Zinkchlorid, inkubiert wie von LaRochelle et al., J. Biol. Chem. 267: 17074 (1992), beschrieben, gefolgt von metabolischer Markierung mit [³&sup5;S]-Methionin (125 uCi/ml) und [³&sup5;S]-Cystein (125 uCi/ml) für 3 h. Konditioniertes Medium wurde gewonnen und mit S. aureus- Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia LKB Biotechnology; Piscataway, NJ), welche den Fc-Anteil der chimären Genprodukte erkannte, immunpräzipitiert. Die immunpräzipitierten Proteine wurden dann mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) analysiert und die immunpräzipitierten Spezies nach Fluorographie sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass das D2/3-HFc-Fusionsprotein als vorhergesagte 80-kd-Spezies bei einer unter reduzierenden Bedingungen durchgeführten SDS-PAGE wanderte, während sich die D2-HFc- und D3-HFc- Fusionsproteine jeweils bei 55 kD auftrennten. Als Kontrolle zeigten konditionierte Medien aus NIH 3T3-Zellen keine korrespondierenden, radioaktiv markierten, mit Protein A immunreaktiven Spezies. Unter nichtreduzierenden Bedingungen wanderten D2/3-HFc, D2-HFc und D3-HFc bei 160, 110 bzw. 110 kd. Wie das IgG- Molekül mit einem HFc-Anteil, das kovalent dimerisiert, wurde somit jedes KGFR- HFc-Genprodukt als ein Disulfid-verknüpftes Dimer sekretiert, welches Protein A- Bindungsdeterminanten behielt.
Ein in vitro-Bindungsassay wurde entwickelt, um festzustellen, ob die KGFR-HFc- Fusionsproteine Bindungsdeterminanten des nativen KGFR besaßen. Zur Untersuchung der Bindungseigenschaften der Fusionsproteine wurden KGFR-HFc5 (20 ug) partiell gereinigt durch Protein A-Säulenchromatographie wie zuvor beschrieben. Ey et al. Immunochem. 15: 429 (1978). Für eine Scatchard-Analyse wurde jedes KGFR-HFc bei 4ºC in 200 ul RIP-Puffer (10 mM Tris, 0,25 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM KCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,05% Tween 20)/0,3% Milch mit variierenden Konzentrationen von entweder radioiodiertem KGF (270.000 CpM/ng) oder einem radioiodierten Rinderfibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGH) (29.000 CpM/ng) in Abwesenheit oder Gegenwart eines hundertfachen Überschusses an unmarkiertem Liganden inkubiert. Rekombinanter humaner KGF wurde gereinigt und mit I markiert wie von Bottaro et al., J. Biol. Chem. 265: 12767 (1990), beschrieben. Rinderhirn-aFGF wurde von Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY), erhalten. ¹²&sup5;I-aFGF wurde wie von Friesel et al., J Biol. Chem. 261: 7581 (1986), beschrieben hergestellt.
Nach 5 h Inkubation wurden 30 ul einer 50%igen Lösung von Gamma Bind G, welches zuvor mit 3,0% Milch/PBS blockiert und in PBS erneut äquilibriert worden war, zu der lnkubationsmischung zugegeben, es wurde 1 h lang heftig geschüttelt, pelletiert und dreimal mit dem Puffer gewaschen (jeweils 0,5 ml). Der von den Pellets gewonnene gebundene Ligand wurde in einem Beckman-Gammazähler gezählt. Die spezifische Bindung wurde definiert als der Unterschied zwischen der Bindung in Abwesenheit oder Gegenwart von überschüssigem unmarkiertem Liganden.
Eine sättigungsfähige Bindung wurde zwischen 15 ng/ml und 25 ng/ml KGF und zwischen 40 ng/ml und 50 ng/ml aFGF erzielt. Die Dissoziationskonstante für jedes Fusionsprotein wurde bestimmt durch Messung der Konzentrationen an unmarkiertem Liganden, die für ein 50%ige Verdrängung von radioaktiv markiertem Liganden erforderlich waren. Wenn KGF als Ligand eingesetzt wurde, wurden die jeweiligen Dissoziationskonstanten für die Fusionsproteine D2/3-HFc, D2-HFc und D3-HFc4 als 120 pM, größer als 2,0 uM und 20 pM bestimmt. Die Dissoziationskonstante für das Fusionsprotein D2/3-HFc war sehr ähnlich derjenigen von nativem KGFR, exprimiert von Epithelzellen (180 pM).
Wenn aFGF als Ligand eingesetzt wurde, wies das D2/3-HFc-Fusionsprotein eine sättigungsfähige aFGF-Bindungsaktivität mit einer scheinbaren Dissoziationskonstante von 520 pM auf, welche ähnlich derjenigen von nativem KGFR (600 pM) ist. In deutlichem Kontrast zu den mit KGF erhaltenen Ergebnissen, band das D2- HFc-Fusionsprotein aFGF mit hoher Affinität (960 pM), während das D3-HFc- Fusionsprotein nicht in der Lage war, mit aFGF unter denselben Bedingungen nachweisbar zu wechselwirken (Dissoziationskonstante > 2,0 uM). Die Ergebnisse der Bindungsstudien deuten darauf hin, dass die dritte Igähnliche Domäne des KGFR die hauptsächliche KGF-Bindungsstelle enthielt, während die zweite Igähnliche Domäne die Hauptdeterminanten enthielt, die für aFGF-Wechselwirkungen mit hoher Affinität verantwortlich waren.
Die Ergebnisse der Bindungsstudien legten nahe, dass die KGFR-D2- und -D3-HFc- Fusionsproteine als spezifische Antagonisten von KGF bzw. aFGF wechselwirken könnten. Zur Prüfung dieser Möglichkeit wurden ruhende Balb/MK-Zellen, welche den nativen KGFR exprimieren, verschiedenen Liganden ausgesetzt und die [³H]- Thymidin-Aufnahme in Gegenwart zunehmender Mengen einer jeden KGFR-HFe- Chimäre gemessen. Die Thymidin-lnkorporation in epidermale Balb/MK-Maus- Keratinozyten wurde durchgeführt wie von Rubin et al., Proc. Nat'I Acad. SdL USA 86: 802 (1989), beschrieben. Die Balb/MK-Zellinie wird in Weissman et all, Cell 32: 599 (1983), beschrieben. In Kürze, variierende Konzentrationen eines jeden KGFR- HFc-Proteins wurden ruhenden Balb/MK-Zellen zugegeben, gefolgt von der Zugabe des geeigneten Liganden. Es wurden Ligandenkonzentrationen eingesetzt, welche eine etwa 80%ige Induktion der maximalen DNA-Synthese ergaben. Die Zellen wurden 16 h lang bei 37ºC inkubiert und [³H]-Thymidin für die letzten 5 h zugegeben. Die Zellen wurden gewaschen, geerntet und die [³H]-Thymidin- Aufnahme durch Flüssigszintillationszählung gemessen.
Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass das Fusionsprotein D2/3-HFc die KGF- und aFGF-induzierte DNA-Synthese in ähnlichem Ausmaß inhibierte, wobei nachweisbare Wirkungen bei einer Konzentration von 2 mg D2/3-HFc- fusionsprotein/ml beobachtet wurden. Jedoch zeigte dasselbe Fusionsprotein selbst bei so hohen Konzentrationen wie 100 mg/ml keine nachweisbare Wirkung auf die Thymidin-Inkorporation in Reaktion auf entweder bFGF oder das nichtverwandte Molekül des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF). Als weitere Spezifitätskontrollen inhibierte weder ein unspezifisches IgG (MOPC21) noch konditioniertes Medium aus NIH 3T3-Zellen nachweisbar die [³H]-Thymidin-Aufnahme in Reaktion auf irgendeinen der Liganden.
Das mit dem Fusionsprotein D2-HFc beobachtete Inhibierungsmuster stand in Einklang mit seiner hochaffinen und spezifischen Bindung von aFGF. Das Fusionsprotein D2-HFc inhibierte die mitogene aFGF-Aktivität, besaß jedoch keine Wirkung auf KGF, bFGF oder EGF. Im Gegensatz dazu blockierte das Fusionsprotein D3-HFc spezifisch die KGF-induzierte Thymidinaufnahme, besaß jedoch keine nachweisbaren Wirkungen auf aFGF, bFGF oder EGF. Somit wirkte das Fusionsprotein D2-HFc als selektiver Antagonist von aFGF, während D3-HFc als einziges mitogene KGF-Wirkungen blockierte.

Beispiel 2. Herstellung und Analyse von Fusionsproteinen, die KGF- Effektordomänen umfassen

Zur Entwicklung von hochaffinen Sonden von Wachstumsfaktor-Rezeptoren mit den Nachweiseigenschaften eines Immunglobulins wurde ein Fusionsprotein konstruiert, bei dem KGF-cDNA, siehe Finch et al., Science 245: 752 (1989), mit dem HFc-Anteil der cDNA der schweren Maus-IgG-Kette an der Gelenkregion rekombiniert wurde, wie in Fig. 4 gezeigt. Gemäß Beispiel 1 oben bestand der HFc-Anteil aus den Gelenk-, CH&sub2;- und CH&sub3;-Domänen der schweren Kette von Immunglobulin.
Expressionsvektoren wurden unter Anwendung von in Beispiel 1 beschriebenen Techniken konstruiert. In Kürze, PCR wurde eingesetzt, um BamHI-kompatible Enden auf dem HFc-Anteil des Gens der schweren Immunglobulinkette zu erzeugen. Das HFc-Fragment wurde dann in die BamHI-Stelle von pUC18 kloniert. Das HFc- cDNA-Insert wurde auch mittels PCR manipuliert, um eine Xhol-Klonierungsstelle im Leserahmen und 5' zur HFc-Region, jedoch innerhalb der BamHI-Stellen, zu enthalten, in Fig. 4 gezeigt. Das HFc-Fragment, welches BamHI-kompatible Enden enthielt, wurde durch Restriktionsverdauung entfernt und in die BgIII-Stelle des MMTneo-Vektors kloniert.
KGF-cDNA wurde mittels PCR mit entweder Xhol- oder Sal/-kompatiblen Enden amplifiziert, mit Restriktionsenzym verdaut und in den MMTneo-HFc-Vektor im Leserahmen mit der IgG-HFc-Domäne subkloniert. Der resultierende Expressionsvektor wird als "KGF-HFc-MMTneo" bezeichnet.
NIH 3T3 = Zellen wurden mit KGF-HFc-MMTneo transfiziert und stabile Transformanten mittels G418 selektiert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Zur Feststellung, ob das Fusionsprotein KGF-HFc durch transfizierte Zellen exprimiert wurde und strukturelle Determinanten von sowohl KGF als auch der Immunglobulin-HFc-Domäne besaß, wurden Zellkulturen mit ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S- Cystein, wie in Beispiel 1 beschrieben inkubiert. Obwohl Protein A Sepharose CL-4B eingesetzt werden konnte, um die Anwesenheit des Fusionsproteins in konditionierten Medien nachzuweisen, wurde der Ertrag um etwa das 15- bis 20fache erhöht, wenn konditionierte Medien zuerst mit entweder monoklonalem KGF-Antikörper oder Antimaus-Fc-Antikörper behandelt wurden, um Fusionsprotein zu präzipitieren. Die isolierten Proteine wurden unter Anwendung von SDS-PAGE analysiert.
In einer Gruppe von Experimenten wurden konditionierte Medien mit einem monoklonalen KGF-Antikörper behandelt, gefolgt von Immunpräzipitation mit Protein A-Sepharose. Die SDS-PAGE zeigte 3 unterschiedliche, mit p94-98 immunreaktive Spezies. In einer zweiten Gruppe von Experimenten wurden konditionierte Medien vor der Behandlung mit Protein A-Sepharose mit Antimaus-IgG-Fc behandelt. Wiederum wurden p94-98-Spezies beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden diese Spezies nicht in Immunpräzipitaten von konditioniertem Medium von MMTneo- Kontrolltransfektanten gefunden.
Nachdem das Fusionsprotein KGF-HFc die Gelenkregion der schweren IgG-Kette aufwies, von der bekannt ist, dass sie dimerisiert, wurden Studien durchgeführt, um festzustellen, ob das Fusionsprotein KGF-HFc ein Disulfid-verknüpftes Dimer war.
Die Zugabe von 100 mM Dithiothreitol zu dem KGF-HFc-Genprodukt verringerte die Wanderung der mit monoklonalem KGF-Antikörper oder Anti-Maus-HFc immunreaktiven Spezies auf ein scheinbares Molekulargewicht von 48 kd. Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Fusionprotein KGF-HFc die strukturellen Determinanten von sowohl KGF als auch der Immunglobulin-Fc-Domäne besitzt. Darüber hinaus dimerisiert das KGFR-HFc biochemisch ähnlich wie das Ausgangsimmunglobulin.
Zur Feststellung, ob das KGF-HFc-Fusionsprotein die biologischen Eigenschaften des KGF besaß, wurde das Vermögen des Fusionsproteins zur Induktion der ³H- Thymidin-Aufnahme in BALB/MK-Zellen mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Assays untersucht. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass 85 pM KGFR-HFc- Fusionsprotein die ³H-Thymidin-Aufnahme mindestens um das 20fache stimulierte. Ein Vergleich mit rekombinantem KGF demonstrierte, dass das KGF-HFc- Fusionsprotein die ³H-Thymidin-Aufnahme bei etwa 45 pM halbmaximal stimulierte, während rekombinanter KGF die ³H-Thymidin-Aufnahme bei etwa 10 pM halbmaximal stimulierte. Konditioniertes Kontrollmedium zeigte wenig mitogene Aktivität. Ferner inhibierte ein KGF-neutralisierender, monoklonaler Antikörper die mitogene Aktivität des Fusionsproteins um mehr als 75 Prozent. Darüber hinaus inhibierte Heparin im Bereich von 1 bis 5 ug/ml ebenfalls die mitogene Aktivität von KGF-HFc und einer mitogen äquivalenten Menge von KGF um mehr als 80 Prozent.
Das Vermögen des Fusionsproteins KGF-HFc zur Bindung an seinen zugehörigen Rezeptor wurde getestet unter Verwendung von 32D-Zellen-Transfektanten, welche den KGFR exprimierten. In Kürze, 32D-Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in DMEM gewaschen, sanft in Bindungspuffer (DMEM/25 mM HEPES, pH 7,4, mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin) resuspendiert und bei 37ºC gehalten. Anschließend wurden Sättigungsniveaus an radioiodiertem KGF (2 ng) mit zunehmenden Konzentrationen von unmarkiertem KGF-HFc-Fusionsprotein-Konkurrent, mittels Protein A-Chromatographie teilweise-gereinigt, in 50 ul Bindungspuffer bei 4ºC zugegeben. Etwa 1,2 · 10&sup6; 32D-Zellen wurden in einem äquivalenten Volumen Bindungspuffer zugegeben und bei 16ºC inkubiert. Nach einer Stunde wurde die Zellsuspension über 300 ul einer gekühlten Ölmischung (n-Butylphthalat (Fischer)/Bis(2-ethylhexyl)phthalat (Kodak) 1,5: 1) geschichtet. Die Zellen wurden in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge bei 10.000 UpM 10 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Das Zellpellet wurde entfernt und in einem Beckman 5500- Gammazähler gezählt.
Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass das KGF-HFc-Fusionsprotein an den 32D-KGFR mit einer Affinität von etwa 1,4 nM band, während rekombinanter KGF an den 32D-KGFR mit einer Affinität von etwa 0,13 nM band. Typischerweise besitzt rekombinanter KGF eine fünf- bis zehnfach höhere Bindungsaffinität für den KGFR als KGF, der durch Säugersysteme exprimiert wird.
Dementsprechend zeigen diese Ergebnisse an, dass das KGF-HFc-Fusionsprotein die funktionalen mitogenen und bindenden Eigenschaften von KGF besitzt.
Mitglieder der Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor (FGFR)-Überfamilie, z. B. bek und flg, binden aFGF und bFGF, binden jedoch nicht KGF. Zur Überprüfung der Spezifität des Fusionsproteins KGF-HFc wurde das Fusionsprotein mit B5-589- Zellen oder mit NIH 3T3-Zellen, die mit entweder KGFR, bek oder flg transfiziert worden waren, inkubiert. Gebundener primärer Antikörper wurde mit Anti-Maus- Kaninchen-IgG, konjugiert mit Fluoresceinisothiocyanat, nachgewiesen. Als Kontrolle wurde das Fusionsprotein mit untransfizierten NIH 3T3-Zellen inkubiert. Eine Durchflußzytometrie-Analyse wurde mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierungsgeräts (FACSCAN-Analysator) durchgeführt.
Die Ergebnisse der Durchflußzytometrie-Analyse zeigten, dass KGFR-enthaltende B5-589- und NIH 3T3-Transfektanten von dem Fusionsprotein KGF-HFc erkannt wurden, wie angezeigt durch eine 10- bis 100fache Erhöhung der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu untransfizierten NIH 3T3-Zellen. Jedoch zeigten NIH 3T3-Zellen, welche die alternativ gespleißten FGFR-Isoformen bek und flg enthielten, keine erhöhte Anfärbung gegenüber dem Hintergrund von untransfizierten NIH 3T3-Zellen. Als weitere Kontrolle war der HFc-Anteil von IgG ebenfalls nicht in der Lage, die KGFR-enthaltenden B5-589- oder NIH 3T3- Transfektanten zu erkennen. Deshalb war die immunchemische Erkennung von KGF-HFc für die Anwesenheit des KGFR spezifisch und war nicht in der Lage, mindestens zwei andere nahe verwandte Mitglieder der FGFR-Überfamilie zu erkennen.
Ähnliche Durchflußzytometrie-Studien zeigten, dass die Fusionsproteine wnt-2-FHc und β-PDGF-HFc an den wnt-2-Rezeptor bzw. β-PDGFR banden.
Eine Immunhistochemie wurde unter Verwendung von gefrorenen Schnitten von menschlicher Haut durchgeführt. Konditioniertes Medium von KGF-HFc- Transfektanten wurde gereinigt oder direkt zum Nachweis von KGFR eingesetzt. Gebundenes KGF-HFc wurde mit Anti-Maus-Kaninchen-Meerrettichperoxidase unter Anwendung von Standardprotokollen nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Intensität der KGF-HFc-Färbung variierte von keiner nachweisbaren Färbung ("-") bis zu Färbung mit hoher Intensität ("+++"). Als Kontrolle wurde KGF befunden, mit dem Fusionsprotein KGF-HFc zu konkurrieren und die Färbung durch markiertes Fusionsprotein zu verringern. Kontroll- Immunglobulin HFc zeigte keine Färbung.

TABELLE 1

Nachweis von KGFR mit KGFR-HFc

Gewebe Intensität der Färbung

Rankenarterie +++
Endothel des Uterus
keine Behandlung +++
Estrogen +++
Estrogen + Progesteron +
Endometrium der Plazenta -
Normale Haut
Stratum basale -
Stratum spinosum +++
Stratum granulosum +
Haarfollikel (Wurzel) +++
Schweißdrüsen
Schwannzellen +
Psoriatisches Epithel -
Wundheilungsepithel
Tage 1-10 -
Tag 10+ +++
Gereizte Haut
+Retinsäurebehandlung +++
Magen
Oberflächenepithel +
Mesenchym -
Prostata
Epithel ++
Tumorzellinien
SMU16 +++
MDA-11B 453 +
MDA-11B 458 -
In analogen Studien wurde das Fusionsprotein KGFR-HFc eingesetzt, um die Anwesenheit von KGF in normaler menschlicher Haut nachzuweisen. Die Anwesenheit von KGF wurde im Stratum basale nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde KGF weder im Stratum spinosum noch Stratum granulosum nachgewiesen. Kontroll-Immunglobulin HFc zeigte keine Färbung.

Beispiel 3. Herstellung und Analyse von Fusionsproteinen, die PDGFR- Effektordomänen umfassen

Zur Entwicklung eines wirksamen Screeningverfahrens zur Identifizierung von β- PDGFR-Antagonisten wurde ein Fusionsprotein konstruiert, das die β-PDGFR- Domänen 1 bis 3 (D1-3) und die HFc-Domäne umfasst. Matsui et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 8314-18 (1989). Das β-PDGFR-HFc-Fusionsprotein wurde mittels Techniken konstruiert, die im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben waren.
NIH 3T3-Zellen wurden transfiziert und das β-PDGFR-HFc-Fusionsprotein analysiert wie oben beschrieben. Das Fusionsprotein β-PDGFR-HFc wurde von transfizierten Zellen als ein dimeres Molekül von 200 kd exprimiert und von Anti-Maus-Fc- Antikörper erkannt. Eine Scatchard-Analyse zeigte, dass das Fusionsprotein β- PDGFR-HFc eine Affinität für PDGF BB von etwa 1,5 nM besaß.
Für das Screening hinsichtlich β-PDGFR-Antagonisten wurde ein Assay entwickelt, der einem Enzym-gekoppelten Standard-Immunosorbens-Assay (ELISA) ähnelt. In Kürze, 10 ng PDGF BB wurden auf den Mulden einer flexiblen Falcon 3912 Assay- Platte in phosphatgepufferter Salzlösung, die 0,2% Natriumazid (PBS-SA) enthielt, immobilisiert. Die Mulden wurden 30 Minuten lang mit PBS-SA, die 4% Rinderserumalbumin enthielt, blockiert. Das Fusionsprotein β-PDGFR-HFc wurde den Mulden in PBS-SA, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,05% Tween 20, zugegeben, die Platten wurden 4 h lang bei Raumtemperatur inkubiert und die Mulden mit PBS-SA, enthaltend 0,05% Tween 20, gewaschen. Anti-Maus- Kaninchen-Fc, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert worden war, wurde den Mulden in PBS-SA, enthaltend 1% BSA und 0,05% Tween 20, in einer Konzentration von 5 ug Antikörper pro ml Pufferlösung zugegeben. Nach einer zweistündigen Inkubation wurden die Mulden gewaschen und Substrat für alkalische Phosphatase den Mulden in 100 mM Natriumhydrogencarbonat (pH 9,8)/1 mM Magnesiumchlorid zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation wurde die Anwesenheit des Produkts des chromogenen Substrats bei 405 nm mit Hilfe eines ELISA-Ablesegeräts gemessen.
Der Screening-Assay demonstrierte, dass das Fusionsprotein β-PDGFR-HFc, jedoch nicht HFc oder MOPC 21, an das Protein PDGF BB band. Die Bindung des β- PDGFR-HFc-Fusionsproteins an PDGF BB war vergleichbar mit der Bindung, die für einen hochaffinen monoklonalen PDGF BB-Antikörper erwartet wurde. Im Gegensatz dazu band das Fusionsprotein β-PDGFR-HFc unter Inkubationsbedingungen, unter denen PDGF AA an einen monoklonalen Anti-PDGF AA-Antikörper gebunden wurde, nicht an PDGF AA. Somit kann der Screening-Assay eingesetzt werden, um Agonisten und Antagonisten eines GFR zu identifizieren.

Beispiel 4. Herstellung und Analyse von Fusionsproteinen, die PDGF- Effektordomänen umfassen

Zur Entwicklung von Sonden von Wachstumsfaktor-Rezeptoren wurden Fusionsproteine konstruiert, welche die HFc-Region und Effektordomänen von PDGF A, PDGF B oder KGF umfassten, wie oben beschrieben. Die Fusionsproteine wurden unter Anwendung von Techniken konstruiert, die im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben waren.
Die Transfektion von NIH 3T3-Zellen und Analyse von Fusionsproteinen erfolgte wie oben beschrieben. Das Fusionsprotein PDGF A-HFc und das Fusionsprotein PDGF B-HFc wurden von trarisfizierten Zellen als dimere Proteine von 84-89 kd bzw. 84 kd exprimiert. Beide Fusionsproteine wurden von Anti-PDGF-Antikörper bzw. von Anti- Maus-Fc-Antikörper erkannt.
Eine Scatchard-Analyse zeigte, dass das PDGF A-HFc-Fusionsprotein an den α- PDGFR mit einer Affinität von 1,3 nM band, jedoch nicht an den β-PDGFR band. Im Gegensatz dazu band das Fusionsprotein PDGF B-HFc sowohl an a-PDGFR als auch β-PDGFR mit Affinitäten von 3,2 nM bzw. 1,4 nM.
Das PDGF A-HFc-Fusionsprotein und PDGF B-HFc-Fusionsprotein stimulierten beide die ³H-Thymidin-Aufnahme in NIH 3T3-Zellen in dem Konzentrationsbereich von 50 bis 600 pM.
Beide Fusionsproteine wurden auch zur Immunpräzipitation von PDGFRen eingesetzt, indem Fusionsproteine mit PDGFR inkubiert, die PDGFR-Fusionsprotein- Komplexe mit Anti-Maus Fc behandelt und die ternären Komplexe mit Protein A- Sepharose CL-4B inkubiert wurden.

Beispiel 5. Konstruktion und Transformationsaktivität von PDGF A-HFc- Fusionsproteinen

PDGF A-HFc-Fusionsproteine wurden konstruiert unter Anwendung von PCR zur Amplifizierung von PDGF A-cDNA zwischen den Codons 1 und 144 (A[1-144]HFc), zwischen den Codons 1 und 80 (A[1-80]HFc) oder zwischen den Codons 95 und 177 (A[95-177]HFc) mit entweder Xhol- oder 8eR-kompatiblen Enden. PDGF A-DNA- Sequenzen wurden in die Xhol-Stelle des Vektors MMTneo-HFc im Leserahmen mit der HFc-Domäne der schweren Kette des Maus-Immunglobulins IgG1 ligiert.
Zur Analyse von Transformationsaktivität wurde Plasmid-DNA von jeder Rekombinante in NIH 3T3-Zellen eingeführt durch Transfektion mit der rekombinanten Plasmid-DNA und 40 ug Träger-Kalbsthymus-DNA unter Anwendung des Calciumphosphat-Verfahrens. Transfizierte Kulturen wurden hinsichtlich Kolonienbildung in Gegenwart von G148 oder Focusbildung zwei bis drei Wochen nach der Transfektion bewertet. Kolonienbildung nach Selektion in Medium, das G148 enthielt, wurde als interner Marker der Transfektionseffizienz verwendet. Als negative Kontrolle wurden 0,1 ug des Maus-Metallothionein-Vektors transfiziert.
Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass die Fusionsproteine PDGF A[1-80]HFc und PDGF A[95-177]HFc das Vermögen zur Transformation von NIH 3T3-Zellen besitzen, während dem Fusionsprotein PDGF A[1-144]HFc dieses Vermögen fehlte. Daher entsprechen die Codons 95-177 der minimalen transformierenden PDGF-A- Domäne. Die Fusionsproteine PDGF A[1-80]HFc und PDGF A[95-177]HFc besaßen nahezu identische Transformationsaktivität im Vergleich zu PDGF A.

Claims

1. Fusionsprotein, umfassend (A) eine IgG-Sequenz, (B) eine Nicht-Antikörpersequenz, die kovalent an das aminoterminale Ende der IgG-Sequenz geknüpft ist, und (C) ein heterologes Signalpepfid, das kovalent an den Aminoterminus der Nicht-Antikörpersequenz geknüpft ist, worin

(i) die IgG-Sequenz im wesentlichen aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;- Domäne und einer CH&sub3;-Domäne, in dieser Reihenfolge, besteht, wobei der IgG-Sequenz eine CH&sub1;-Domäne fehlt,

(ii) die Nicht-Antikörpersequenz eine Effektordomäne eines Moleküls umfasst,

(iii) die Effektordomäne eine Aktivität zeigt, die charakteristisch für die Effektordomäne in dem Molekül ist, und

(iv) das heterologe Signalpeptid in der Natur mit einem Protein verbunden ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus PDGF A, PDGF B, KGF, VEGF, KGF-Rezeptor und β- PDGF-Rezeptor besteht.

2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, in dem das Molekül ein Mitglied der Ig- Überfamilie ist.

3. Fusionsprotein nach Anspruch 1, in dem die Effektordomäne eine Ig-artige Domäne ist.

4. Fusionsprotein nach Anspruch 1, in dem das Molekül ein Wachstumsfaktor ist.

5. Fusionsprotein nach Anspruch 1, in dem das Molekül ein intrazelluläres Protein ist.

6. Fusionsprotein nach Anspruch 1, in dem das Molekül ein Wachstumsfaktor- Rezeptor ist.

7. Fusionsprotein nach Anspruch 1, in dem das Molekül ein Protein ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus PDGF A, PDGF B, KGF, VEGF, KGFR, β-PDGFR, HGF, nk1, wnt-2 und FGFR1 besteht.

8. Fusionsprotein nach Anspruch 7, in dem das heterologe Signalpeptid in der Natur mit PDGF A verbunden ist.

9. Fusionsprotein nach Anspruch 1, in dem die Nicht-Antikörpersequenz derjenigen einer Effektordomäne eines Wachstumsfaktors oder eines Wachstumsfaktor-Rezeptors entspricht.

10. Fusionsprotein nach Anspruch 9, in dem die Nicht-Antikörpersequenz derjenigen einer Effektordomäne eines Wachstumsfaktors entspricht.

11. Fusionsprotein nach Anspruch 9, in dem die Nicht-Antikörpersequenz derjenigen eines Wachstumsfaktors entspricht.

12. Fusionsprotein nach Anspruch 1, in dem die IgG-Sequenz eine γ&sub1;-Sequenz ist, die aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;-Domäne und einer CH&sub3;-Domäne besteht.

13. Fusionsprotein nach Anspruch 1, weiter umfassend eine Markereinheit, die unter vorher festgelegten Bedingungen ein nachweisbares Signal erzeugt.

14. Rekombinantes DNA-Molekül, das für ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 codiert.

15. Fusionsprotein, umfassend eine Nicht-Antikörpersequenz, die kovalent an das aminoterminale Ende einer IgG-Sequenz geknüpft ist, welche im Wesentlichen aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;-Domäne und einer CH&sub3;- Domäne, in dieser Reihenfolge, besteht, wobei der IgG-Sequenz eine CH&sub1;- Domäne fehlt, worin die Nicht-Antikörpersequenz eine Effektordomäne eines Wachstumsfaktor-Moleküls umfasst, das in der Natur einen Einzeleinheit- Rezeptor bindet, derart, dass das Fusionsprotein eine DNA-Synthese, wie durch die Aufnahme von ³H-Thymidin gemessen, in einer Zielzelle induziert.

16. Fusionsprotein nach Anspruch 15, in welchem das Wachstumsfaktor- Molekül in der Natur einen Tyrosinkinase-Rezeptor bindet.

17. Rekombinantes DNA-Molekül, das für ein Fusionsprotein nach Anspruch 15 codiert.

18. Verfahren zum Nachweis eines pathologischen Zustands, der mit der Überexpression eines Moleküls verbunden ist, welches an einer bindenden Wechselwirkung teilnimmt, umfassend die Schritte:

(A) Bereitstellen eines Fusionsproteins, das eine Nicht-Antikörpersequenz umfasst, welche kovalent an das aminoterminale Ende einer IgG- Sequenz geknüpft ist, welche im Wesentlichen aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;-Domäne und einer CH&sub3;-Domäne, in dieser Reihenfolge, besteht, wobei der IgG-Sequenz eine CH&sub1;-Domäne fehlt, wobei die Nicht-Antikörpersequenz eine Effektordomäne eines Moleküls umfasst und wobei die Effektordomäne eine Aktivität zeigt, die für die Effektordomäne in dem Molekül charakteristisch ist;

(B) Inkontaktbringen des Fusionsproteins mit einer biologischen Probe, die einen Bindungspartner für die Effektordomäne enthält; und

(C) Überwachen der Bindung der Effektordomäne durch den Bindungspartner in der Probe, um eine Überexpression des Bindungspartners relativ zu einer Kontrolle nachzuweisen.

19. Verfahren nach Anspruch 18, in dem das Fusionsprotein weiter eine Markereinheit umfasst, die unter vorher festgelegten Bedingungen ein nachweisbares Signal erzeugt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, in dem die Markereinheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Luminol, Isoluminol, einem aromatischen Acridiniumester, einem Imidazol, einem Acridiniumsalz und einem Oxalatester besteht.

21. Verfahren nach Anspruch 19, in dem die Markereinheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Luciferin, Luciferase und Aequorin besteht.

22. Verfahren nach Anspruch 19, in dem die Markereinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Malatdehydrogenase, Staphylokokkennuclease, Delta-V-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, α-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Catalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase.

23. Verfahren nach Anspruch 18, in dem die biologische Probe ein gefrorener Gewebeschnitt ist.

24. Verfahren zur Identifikation von Agonisten und Antagonisten, die störend auf eine bindende Wechselwirkung einwirken, umfassend die Schritte:

(A) Bereitstellen eines Fusionsproteins, das eine Nicht-Antikörpersequenz umfasst, welche kovalent an das aminoterminale Ende einer IgG- Sequenz geknüpft ist, die im Wesentlichen aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;-Domäne und einer CH&sub3;-Domäne, in dieser Reihenfolge, besteht, wobei der IgG-Sequenz eine CH&sub1;-Domäne fehlt, worin die Nicht- Antikörpersequenz eine Effektordomäne eines Moleküls umfasst und worin die Effektordomäne eine Aktivität zeigt, die für die Effektordomäne in dem Molekül charakteristisch ist;

(B) in Anwesenheit eines mutmaßlichen Agonisten oder Antagonisten für die Bindung zwischen der Effektordomäne und einem Bindungspartner derselben, wobei das Fusionsprotein mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, welche den Bindungspartner enthält, und dann

(C) Bestimmen, ob der mutmaßliche Agonist oder Antagonist die Bindung der Effektordomäne durch den Bindungspartner beeinflusst hat.

25. Fusionsprotein, umfassend (A) eine IgG-Sequenz, (B) eine Nicht-Antikörpersequenz, die kovalent an das aminoterminale Ende der IgG-Sequenz geknüpft ist, und (C) ein heterologes Signalpeptid, das kovalent an den Aminoterminus der Nicht-Antikörpersequenz geknüpft ist, worin

(i) die IgG-Sequenz im Wesentlichen aus einer Gelenkregion, einer CH&sub2;- Domäne und einer CH&sub3;-Domäne, in dieser Reihenfolge, besteht, wobei der IgG-Sequenz eine CH&sub1;-Domäne fehlt.

(ii) die Nicht-Antikörpersequenz eine Effektordomäne eines Moleküls umfasst, wobei das Molekül ein Wachstumsfaktor ist, der in der Natur einen Einzeleinheit-Rezeptor bindet, welcher intrinsische Tyrosinkinase-Aktivität aufweist, und

(iii) die Effektordomäne eine Aktivität zeigt, die für die Effektordomäne in dem Molekül charakteristisch ist.