NO332593B1 - Humanisert eller humant Angiopoietin-2 spesifikt antistoff, metode for a fremstille antistoffet, anvendelse av antistoffet for fremstilling av et medikament, og farmasoytiskpreparat omfattende antistoffet - Google Patents

Abstract

171263-EOH Sammendrag Spesifikke bindingsmidler, for eksempel fullt ut humane antistoffer, som bindes til angiopoietin-2, beskrives. Videre beskrives tungkjedefragmenter, lettkjedefragmenter og CDR i antistoffene, så vel som fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av antistoffene.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse gjelder spesifikke bindingsmidler som gjenkjenner og bindes til angiopoietin-2 (Ang-2). Nærmere bestemt gjelder oppfinnelsen fremstilling, diagnostisk anvendelse og terapeutisk anvendelse av monoklonale og polyklonale antistoffer og fragmenter av disse som spesifikt bindes til Ang-2.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Angiogenese, dannelsen av nye blodkar fra eksisterende kar, er avgjørende for mange fysiologiske og patologiske prosesser. Normalt reguleres angiogenesen nøye av pro- og anti-angiogenetiske faktorer, men når det gjelder sykdommer som kreft, okulare neovaskulære sykdommer, artritt og psoriasis kan prosessen gå feil. Folkman, J. Nat. Med., 1:27-31 (1995).

Det finnes en rekke sykdommer som vites å være forbundet med feilregulert eller uønsket angiogenese. Slike sykdommer omfatter okular neovaskularisering, for eksempel retinopatier (innbefattet diabetisk retinopati), aldersforbundet makular degenerering, psoriasis, hemangioblastom, hemangiom, arterisklerose, inflammasjonssykdommer som revmatoid eller revmatisk inflammasjonssykdom, fortrinnsvis artritt (innbefattet revmatoid artritt) eller andre kroniske inflammasjonsforstillelser som kronisk astma, arteriell eller posttransplasjonell aterosklerose, endometriose og neoplastiske sykdommer, for eksempel såkalte faste tumorer og flytende (eller hematopoetiske) tumorer (som leukemier og lymfomer). Andre sykdommer forbundet med uønsket angiogenese vil være åpenbare for fagfolk.

Selv om mange signaloverføringssystemer har blitt foreslått å inngå i regulering av angiogenesen omfatter ett av de best karakteriserte og mest endotelcelleselektive systemene Tie-2-reseptor tyrosinkinasen (betegnet "Tie-2" eller "Tie-2R" (også betegnet "ORK"), Tie-2 fra mus betegnes også "tek") og dennes ligander, angiopoietinene (Gale, N.W. og Yancopoulos, G.D., Genes Dev. 13:1055-1066 [1999]. Det finnes 4 kjente angiopoietiner, angiopoietin-1 ("Ang-1") til angiopoietin-4 ("Ang-4"). Disse angiopoietinene betegnes også "Tie-2-ligander". (Davis, S., et al, Cell, 87:1161-1169 [1996], Grosios, K., et al, Cytogenet Cell Genet, 84:118-120 [1999], Holash, J., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [1999], Koblizek, T.I. et al, Current Biology, 8:529-532 [1998], Lin, P., et al, Proe Nati Acad Sei USA, 95:8829-8834 [1998], Maisonpierre, P.C., et al, Science, 277:55-60 [1997], Papapetropoulos, A., et al., Lab Invest, 79:213-223 [1999], Sato, T.N., et al, Nature, 375:70-74 [1998], Shyu, K.G., et al, Circulation, 98:2081-2087 [1998], Suri, C, et al, Cell, 87:1171-1180 [1996], Suri, C, et al., Science, 282:468-471 [1998], Valenzuela, D.M. et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96:1904-1909 [1999], Witzenbichler, B., et al, J. Biol Chem, 273:18514-18521 [1998]). Mens Ang-l-binding til Tie-2 stimulerer reseptorfosforylering i dyrkede endotelceller har Ang-2 blitt observert å både agonisere og antagonisere Tie-2-reseptorfosforylering (Davis S., et al., [1996], supra, Maisonpierre, P.C. et al., [1997], supra, Kim, I., J.H. Kim, et al, Oncogene 19(39), 4549-4552 (2000), Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, et al, Cardiovascular Research 49 (3): 659-70 (2001)).

Fenotypene for "knockouts" av Tie-2 i mus og Ang-1 ligner på hverandre, noe som tyder på at Ang-1-stimulert Tie-2-fosforylering formidler remodellering og stabilisering av kar under utvikling in utero via opprettholdelse av endotelcelle-støttecelleadhesjon (Dumont, D.J., et al, Genes & Development, 8:1897-1909 [1994], Sato, T.N., et al, Nature, 376:70-74 [1995], Suri, C, et al., [1996], supra). Rollen til Ang-1 når det gjelder karstabilisering antas å være konservert hos voksne, hvor proteinet har bred og konstitutiv ekspresjon (Hanahan, D., Science, 277:48-50 [1997], Zagzag, D„ et al, Experimental Neurology, 159:391-400 [1999]. I motsetning til dette er Ang-2-ekspresjonen hovedsakelig begrenset til seter for vaskulær remodellering, hvor proteinet antas å blokkere Ang-1-funksjonen og derved indusere en tilstand med vaskulær plastisitet som fremmer angiogenesen (Hanahan, D., [1997], supra, Holash, J., et al., Science, 284:1994-1998 [1999], Maisonpierre, P.C, et al., [1997], supra).

En rekke publiserte undersøkelser har angivelig påvist karselektiv Ang-2-ekspresjon i sykdomstilstander forbundet med angiogenese. Disse patologiske tilstandene omfatter for eksempel psoriasis, makulær degenerering og kreft (Bunone, G., et al., American Journal of Pathology, 155:1967-1976 [1999], Etoh, T., et al, Cancer Research, 61:2145-2153 [2001], Hangai, M., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [2001], Holash, J., et al [1999] supra, Kuroda, K., et al, Journal of Investigative Dermatology, 116:713-720 [2001], Otani, A., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920

[1999], Stratmann, A., et al, American Journal of Pathology, 153:1459-1466 [1998], Tanaka, S., et al., J Clin Invest, 103:34-345 [1999], Yoshida, Y., et al., International Journal of Oncology, 15:1221-1225 [1999], Yuan, K., et al, Journal of Periodontal Research, 35:165-171 [2000], Zagzag, D., et al, [1999] supra). De fleste av disse undersøkelsene har konsentrert seg om kreft, hvor mange tumortyper tilsynelatende viser vaskulær Ang-2-ekspresjon. I motsetning til ekspresjonen ved patologisk angiogenese er Ang-2-ekspresjonen i normale vev ekstremt begrenset (Maisonpierre, P.C, et al., [1997], supra, Mezquita, J., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 260:492-498 [1999]. Hos normale voksne er de tre hovedsetene for angiogenese ovarie, placenta og uterus, disse er de primære vev i normale vev (dvs. ikke-kreftvev) i hvilke Ang-2-mRNA har blitt påvist.

Visse funksjonelle undersøkelser antyder at Ang-2 kan delta i tumorangiogenesen. Ahmad et al. (Cancer Res., 61:125-1259 [2001]) beskriver Ang-2-overekspresjon og viser at denne angivelig er forbundet med økt tumorvekst i en xenotransplantatmodell i mus. Se også Etoh et al., supra og Tanaka et al., supra, hvori det presenteres resultater som angivelig assosierer Ang-2-overekspresjon med hypervaskularitet i tumoren. I motsetning til dette rapporterer imidlertid Yu et al. (Am. J. Path., 158:563-570 [2001] resultater som viser at overekspresjon av Ang-2 i Lewis-lungekarsinomceller og TA3-brystkarsinomceller angivelig gir forlenget overlevelse av mus som har blitt injisert med de tilsvarende transfektanter.

I løpet av de siste par år har flere publikasjoner foreslått Ang-1, Ang-2 og/eller Tie-2 som mulige mål for antikreftbehandling. For eksempel beskriver US patentskrifter nr. 6166185, 5650490 og 5814464 alle idéen om anti-Tie-2-ligandantistoffer og reseptorstoffer. Lin et al. (Proe. Nati. Acad. Sei USA, 95:8829-8834 [1998] injiserte et adenovirus som uttrykte løselig Tie-2 i mus, det løselige Tie-2 reduserte angivelig antall tumorer som musen utviklet og størrelsen av tumorene. I en beslektet undersøkelse injiserte Lin et al (J. Clin. Invest, 100:2072-2078 [1997] en løselig form av Tie-2 i rotter, denne forbindelsen reduserte angivelig tumor-størrelsen i rottene. Siemeister et al. (Cancer Res., 59:3185-3189 [1999] frembrakte humane melanomcellelinjer som uttrykte det ekstracellulære domene i Tie-2 og injiserte disse cellelinjene i nakne mus, og konkluderte med at løselig Tie-2 angivelig førte til en "signifikant inhibering" av tumorvekst og tumorangiogenese. I lys av denne informasjon og ut fra at både Ang-1 og Ang-2 bindes til Tie-2 er det ikke klart fra disse undersøkelsene hvorvidt Ang-1, Ang-2 eller Tie-2 vil være et attraktivt mål for antikreftbehandling.

Fusjon av visse peptider til et stabilt plasmaprotein, for eksempel et konstant Ig-område, for å forbedre halveringstiden til disse molekylene har for eksempel blitt beskrevet i PCT-patentskrift WO 00/24782, publisert 4. mai 2000.

Fusjon av et protein eller et fragment derav til et stabilt plasmaprotein, for eksempel et konstant Ig-område, for å forbedre disse molekylenes halveringstid har blitt beskrevet flere steder (se for eksempel US patentskrift 5480981, Zheng et al, J. Immunol, 154:5590-5600,

(1995), Fischer et al, N. Engl. J. Med., 334:1697-1702, (1996), Van Zee, K. et al, J. Immunol, 156:2221-2230, (1996), US patentskrift 5808029, tildelt 15. september 1998, Capon et al., Nature, 337:525-531, (1989), Harvill et al, Immunotech., 1:95-105, (1995), WO 97/23614, publisert 3. juli 1997, PCT/US 97/23183, innlevert 11. desember 1997, Linsley, J. Exp. Med., 174:561-569, (1991), WO 95/21258, publisert 10. august 1995).

WO00/57901 beskriver en fremgangsmåte for å minske permeabilitet og plasmalekasje ved anvendelse av et anti-Ang-2 nøytraliserende antistoff. Videre beskriver WO0057901 at et slikt antistoff kan anvendes i en farmasøytisk blanding for regulering av angiogenese i en pasient, og kan anvendes for behandling av kreft, psoriasis, astma, og inflamatoriske sykdommer.

WO00/75323 beskriver anti-Ang-2 antistoff som inhiberer bindingen av Ang-2 til Tie-2 reseptorfusjonsprotein.

WO98/05779 beskriver modifiserte Tie-2 reseptor ligander.

En effektiv anti-Ang-2-behandling kan by på fordeler for en stor mengde kreftpasienter, siden de fleste, faste tumorer krever neovaskularisering for å vokse ut over 1-2 millimeter i diameter. Slik behandling kan ha en bredere anvendelse også for andre angiogeneseassosierte sykdommer, for eksempel retinopatier, artritt og psoriasis.

Det foreligger et ikke utviklet behov for påvisning av nye midler som spesifikt gjenkjenner og bindes til Ang-2. Slike midler ville være nyttige for diagnostisk analyse og terapeutiske inngrep ved sykdomstilstander som er forbundet med Ang-2-aktivitet.

Det er følgelig et formål ved foreliggende forbindelse å tilveiebringe spesifikke bindingsmidler for Ang-2 som modulerer Ang-2-aktivitet.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et isolert humanisert eller humant antistoff, kjennetegnet ved at det omfatter en tungkjede variabel region og en lettkjede variabel region, hvori nevnte tungkjede variabel region omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 11 som ikke har mer enn fem aminosyresubstitusjoner, og nevnte lettkjede variabel region omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 12 som ikke har mer enn to aminosyre-substitusjoner, og hvor antistoffet nøytraliserer eller inhiberer interaksjonen mellom angiopoietin-2 (Ang-2) og Tie-2.

Oppfinnelsen gjelder også konjugater som omfatter antistoffet ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen gjelder videre nukleinsyremolekyler som koder for det spesifikke antistoffet ifølge oppfinnelsen, så vel som en vektor som omfatter et slikt nukleinsyremolekyl, så vel som en vertscelle som inneholder vektoren.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff som omfatter: (a) transformasjon av en vertscelle med minst ett nukleinsyremolekyl som koder for antistoffet ifølge oppfinnelsen, (b) ekspresjon av nukleinsyremolekylet i vertscellen, og (c) isolering av det spesifikke antistoffet.

Videre gjelder oppfinnelsen anvendelse av antistoffet for fremstilling av et medikament for inhibering av uønsket angiogenese i et pattedyr ved tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av antistoffet ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av antistoffet for fremstilling av et medikament for behandling av kreft i et pattedyr ved å tilføre en terapeutisk effektiv mengde av antistoffet ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen gjelder også anvendelse av antistoffet for fremstilling av et medikament for inhibering av uønsket angiogenese i et pattedyr som omfatter tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av antistoffet ifølge oppfinnelsen.

Det vil forstås at oppfinnelsen videre gjelder farmasøytiske preparater som omfatter det spesifikke antistoffet ifølge oppfinnelsen og et farmasøytisk aksepterbart utformingsmiddel.

Oppfinnelsen tilveiebringer anvendelse av antistoffet for fremstilling av et medikament inhibering av angiopoietin-2-aktivitet ved tilførsel av ett eller flere spesifikke antistoffet ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen gjelder også anvendelse av antistoffet for fremstilling av et medikament for behandling av kreft i et pattedyr som omfatter tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff ifølge oppfinnelsen og et kjemoterapeutisk middel. Det spesifikke bindingsmiddel og det kjemoterapeutiske middel må ikke nødvendigvis tilføres samtidig. I en foretrukket utførelse er det kjemoterapeutiske middel minst én av 5-FU, CPT-11, og Taxotere. Det vil imidlertid forstås at andre egnede kjemoterapeutiske midler og andre former for kreftbehandling kan anvendes.

Det vil forstås at antistoffet ifølge oppfinnelsen kan anvendes til fremstilling av et medikament for behandling av en rekke sykdommer forbundet med feilregulert eller uønsket angiogenese. Slike sykdommer omfatter okular neovaskularisering, for eksempel retinopatier (innbefattet diabetisk retinopati og aldersforbundet makular degenerering), psoriasis, hemangioblastom, hemangiom, arteriosklerose, inflammasjonssykdom, for eksempel revmatoid eller revmatisk inflammasjonssykdom, fortrinnsvis artritt (innbefattet revmatoid artritt) eller andre kroniske inflammasjonsforstyrrelser som kronisk astma, arterielt eller posttransplasjonell aterosklerose, endometriose og neoplastiske sykdommer, for eksempel såkalte faste tumorer og flytende tumorer (for eksempel leukemier). Ytterligere sykdommer som kan behandles ved tilførsel av de spesifikke bindingsmidler vil være åpenbare for fagfolk. Slike ytterligere sykdommer omfatter fedme, vaskulær permeabilitet, plasmalekkasje og benforbundne forstyrrelser, innbefattet osteoporose..

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser en kurve over tumorstørrelse (y-aksen) som funksjon av tiden (x-aksen) i tumorbærende mus behandlet med enten et anti-Ang-2-antistoff (klon 533,537 eller 544) ifølge oppfinnelsen, med et kontrollantistoff eller med fosfatbufret saltvann (PBS). Detaljer gis i eksemplene. Figurene 2A, 2B og 2C viser epitopkartleggingsresultater (O.D. 370) for fullengde humant Ang-2 (hAng-2), for N-enden av hAng-2 og for C-enden av hAng-2, for peptistoffene TN8-Con4-C, L1-7-N, og 12-9-3-C ifølge oppfinnelsen og for kontrollpeptistoffet Tie2-Fc, C2B8 eller 5B12. Detaljer gis i eksemplene.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Standardteknikker kan anvendes for fremstilling av rekombinante DNA-molekyler, proteiner og antistoffer, så vel som for vevsdyrkning og celletransformasjon. Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker utføres typisk ifølge produsentens spesifikasjoner eller som vanligvis utført innen faget ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter, for eksempel fremgangsmåtene som beskrives i Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989] eller som beskrevet heri. Med mindre spesifikke definisjoner gis har nomenklaturen som anvendes i forbindelse med laboratoriefremgangsmåter og teknikker innen analytisk kjemi, syntetisk organisk kjemi og medisinsk og farmasøytisk kjemi som beskrives heri den samme nomenklatur som er velkjent og vanligvis anvendes innen faget. Standardteknikker kan anvendes for kjemiske synteser, kjemiske analyser, farmasøytisk fremstilling, utforming og tilførsel samt behandling av pasienter.

Definisjoner

Som anvendt i forbindelse med den foreliggende beskrivelse skal de påfølgende begreper dersom ikke annet er angitt forstås å ha følgende betydninger:

Begrepet "Ang-2" viser til polypeptidet som er beskrevet i Figur 6 i

US patentskrift nr. 6166185 ("Tie-2-ligand-2") eller fragmenter derav, så vel som beslektede polypeptider, som omfatter alleliske varianter, spleisevarianter, derivater, substitusjons-, delesjons- og/eller insersjonsvarianter, fusjonspeptider og -polypeptider og homologer fra andre arter. Ang-2-polypeptidet kan, men må ikke, omfatte ytterligere endeaminosyrerester, for eksempel ledersekvenser, målstyrende sekvenser, aminoterminal metionin, aminoterminale metionin- og lysinrester og/eller merkings- eller fusjonsproteinsekvenser, avhengig av måten som polypeptidet er fremstilt på.

I forbindelse med Ang-2 eller et Ang-2-spesifikt bindingsmiddel viser uttrykket "biologisk aktiv" til et peptid eller polypeptid med minst én aktivitet som er karakteristisk for Ang-2 eller et Ang-2-spesifikt bindingsmiddel. Et spesifikt bindingsmiddel for Ang-2 kan ha agonistaktivitet, antagonistaktivitet eller nøytraliserende eller blokkerende aktivitet når det gjelder minst én biologisk aktivitet forbundet med Ang-2.

Begrepet "spesifikt bindingsmiddel" viser til et molekyl, fortrinnsvis et proteinmolekyl, som binder Ang-2 (og varianter og derivater derav som definert heri) med høyere affinitet enn andre angiopoietiner. Et spesifikt bindingsmiddel kan være et protein, et peptid, en nukleinsyre, et karbohydrat, et lipid eller en lavmolekylær forbindelse som fortrinnsvis bindes til Ang-2.1 en foretrukket utførelse er det spesifikke bindingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse et antistoff, for eksempel et polyklonalt antistoff, et monoklonalt antistoff (mAb), et kimært antistoff, et CDR-transplantert antistoff, et multispesifikt antistoff, et bispesifikt antistoff, et katalytisk antistoff, et humanisert antistoff, et humant antistoff, et antiidiotypisk (anti-Id) antistoff og antistoff som kan være merket i løselig eller bundet form, så vel som fragmenter, varianter eller derivater av disse, enten alene eller i kombinasjon med andre aminosyresekvenser tilveiebrakt ved kjente teknikker. Slike teknikker omfatter enzymatisk spalting, kjemisk spalting, peptidsyntese eller rekombinante teknikker. De anti-Ang-2-spesifikke bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan binde deler av Ang-2 som modulerer, for eksempel inhiberer eller fremmer, den biologiske aktivitet av Ang-2 og/eller andre Ang-2-assosierte aktiviteter.

Begrepet "polyklonalt antistoff viser til en heterogen blanding av antistoffer som gjenkjenner og bindes til forskjellige epitoper på samme antigen. Polyklonale antistoffer kan erholdes fra urensede cerumpreparater eller renses ved for eksempel anvendelse av antigenaffinitetskromatografi eller protein A/protein G-affinitetskromatografi.

Uttrykket "monoklonale antistoffer" viser til en samling av antistoffer som kodes av samme nukleinsyremolekyl og som om ønskelig er dannet av én enkelt hybridom eller en annen cellelinje eller av et transgent pattedyr, slik at hvert av de monoklonale antistoffene typisk vil gjenkjenne samme epitop på antigenet.

Uttrykket "kimære antistoffer" viser til antistoffer i hvilke en del av tungkjeden og/eller lettkjeden er identisk med eller homolog med en tilsvarende sekvens i et antistoff avledet fra en gitt art eller tilhørende en spesiell antistoffklasse eller -underklasse, mens resten av kjeden eller kjedene er identiske med eller homologe med en tilsvarende sekvens i antistoffer avledet fra en annen art eller tilhørende en annen antistoffklasse eller -underklasse. Videre omfattes fragmenter av slike antistoffer som fremviser den ønskede biologiske aktivitet (dvs. evnen til spesifikt å bindes til Ang-2). Se US patentskrift

nr. 4816567 og Morrison et al, Proe Nati Acad Sei (USA), 81:6851-6855 [1985].

Utrykket "CDR-transplantert antistoff viser til et antistoff i hvilket CDR fra ett antistoff fra en gitt art eller isotype ved rekombinante midler er innsatt i rammeverket til et annet antistoff fra samme art eller isotype eller en forskjellig art eller isotype.

Uttrykket "multispesifikt antistoff viser til et antistoff med variable områder som gjenkjenner mer enn én epitop på ett eller flere antigener. En subklasse av denne antistofftypen er et "bispesifikt antistoff, som gjenkjenner to forskjellige epitoper på samme antigen eller på forskjellige antigener.

"Katalytiske" antistoffer viser til antistoffer i hvilke én eller flere cytotoksiske, eller generelt én eller flere biologisk aktive, grupper er koblet til det målstyrende bindingsmiddel.

Begrepet "humanisert antistoff viser til en spesifikk type av CDR-transplantert antistoff i hvilket antistoffets rammeverkområde er avledet fra et menneske, men hvor hver CDR er erstattet med en CDR avledet fra en annen art, for eksempel en muse-CDR. Uttrykket "CDR" er definert nedenfor.

Uttrykket "fullt ut humant" antistoff viser til et antistoff i hvilket både CDR og rammeverket er avledet fra ett eller flere humane DNA-molekyler.

Uttrykket "antiidiotypisk" antistoff viser til et antistoff som spesifikt bindes til et annet antistoff som gjenkjenner et antigen. Fremstilling av antiidiotypiske antistoffer kan utføres ved hvilke som helst av fremgangsmåtene som beskrives heri for fremstilling av et Ang-2-spesifikt antistoff, bortsett fra at disse antistoffene oppstår ved for eksempel immunisering av et dyr med et Ang-2-spesifikt antistoff eller et Ang-2-bindende fragment derav, snarere enn Ang-2-polypeptidet selv eller et fragment av dette.

Begrepet "varianter" som anvendt heri omfatter polypeptider i hvilke aminosyrerester er innsatt i, delert fra og/eller substituert inn i den naturlig forekommende (eller i det minste en kjent) aminosyresekvens for bindingsmidlet. Varianter av oppfinnelsen omfatter fusjonsproteiner som beskrevet nedenfor.

"Derivater" omfatter bindingsmidler som har blitt kjemisk modifisert på en måte som er forskjellig fra insersjons-, delesjons- eller substitusjonsvarianter.

"Som spesifikt binder Ang-2" viser til evnen til et spesifikt bindingsmiddel (for eksempel et antistoff eller et fragment derav) ifølge foreliggende oppfinnelse til å gjenkjenne og binde modent humant Ang-2-polypeptid eller en ortolog derav av fullengde eller partiell lengde, slik at affiniteten (bestemt ved f.eks. affinitets-ELISA eller BIAcore-analyser som beskrevet heri) eller nøytraliseirngsevnen (bestemt ved f.eks. nøytraliserings-ELISA-analyser som beskrives heri eller tilsvarende analyser) er minst 10 ganger høyere, men om ønskelig 50 ganger høyere, 100, 250 eller 500 ganger høyere, eller til og med minst 1000 ganger høyere enn

affiniteten eller nøytraliseirngsevnen til bindingsmidlet overfor ethvert annet angiopoietin eller et annet peptid eller polypeptid.

Begrepet "antigenbindende domene" eller "antigenbindende område" viser til den del av det spesifikke bindingsmiddel (for eksempel et antistoffmolekyl) som inneholder de spesifikke aminosyrerestene (eller andre grupper) i bindingsmidlet som interagerer med et antigen og gir bindingsmidlet dets spesifisitet og affinitet for antigenet. I et antistoff betegnes det antigenbindende domene ofte det "komplementaritetsbestemmende område", eller "CDR".

Begrepet "epitop" viser til den del av ethvert molekyl som kan gjenkjennes av og bindes av et spesifikt bindingsmiddel, f.eks. et antistoff, via ett eller flere av bindingsmidlets antigenbindende områder. Epitoper består vanligvis av kjemisk aktive overflategrupper av molekyler, for eksempel aminosyrer eller karbohydratsidekjeder, og har spesifikke tredimensjonale strukturelle egenskaper så vel som spesifikke ladningsegenskaper. Epitoper som anvendt heri kan være kontinuerlige eller ikke-kontinuerlige. Videre kan epitoper være "mimetiske" i den forstand at de omfatter en tredimensjonal struktur som er identisk med epitopen som anvendes for frembringelse av antistoffet, men likevel ikke omfatter noen av eller kun noen få av aminosyrerestene som forefinnes i det Ang-2 som ble benyttet for stimulering av antistoffimmunresponsen.

Uttrykket "inhiberende og/eller nøytraliserende epitop" er en epitop som når den bindes av et spesifikt bindingsmiddel, for eksempel et antistoff, fører til tap av (eller i det minste en reduksjon av) den biologiske aktivitet til molekylet, cellen eller organismen som inneholder en slik epitop, in vivo, in vitro eller in situ. I forbindelse med foreliggende oppfinnelse har den nøytraliserende epitop lokalisert få eller forbundet med et biologisk aktivt område i Ang-2. Alternativt er uttrykket "aktiverende epitop" en epitop som når den bindes av et spesifikt bindingsmiddel ifølge oppfinnelsen, for eksempel et antistoff, fører til aktivering eller i det minste opprettholdelse av en biologisk aktiv konformasjon for Ang-2.

Begrepet "antistoffragment" viser til et peptid eller polypeptid som omfatter mindre enn et komplett, intakt antistoff. Komplette antistoffer omfatter to funksjonelt uavhengige deler eller fragmenter: et antigenbindende fragment som betegnes "Fab" og et karboksyterminalt, krystalliserbart fragment som betegnes "Fc"-fragmentet. Fab-fragmentet omfatter det første, konstante domene fra både tungkjede og lettkjede (CH1 og CL1), sammen med de variable områdene fra både tungkjede og lettkjede som binder det spesifikke antigen. Både tungkjedens og lettkj edens variable områder omfatter tre komplementaritetsbestemmende områder (CDR) og rammeverksaminosyrerester som skiller de enkelte CDR fra hverandre. Fc-området omfatter det andre og tredje konstante tungkjedeområde (CH2 og CH3) og deltar i effektorfunksjoner som komplementaktivering og angrep av fagocytiske celler. I noen antistoffer er Fc-området og Fab-området adskilt av et antistoff-"hengselområde", og avhengig av hvordan fullengde-antistoffet spaltes proteolytisk kan hengselområdet være forbundet med enten Fab-fragmentet eller Fc-fragmentet. Spalting av et antistoff med proteasen papain fører for eksempel til at hengselområdet er forbundet med det resulterende Fc-fragment, mens spalting med proteasen pepsin gir et fragment hvori hengselområdet er forbundet med begge Fab-fragmenter samtidig. Siden de to F ab-fragmentene faktisk er kovalent sammenbundet etter pepsinspalting betegnes det resulterende fragment F(ab')2 fragmentet.

Et Fc-domene kan ha relativt lang halveringstid i serum, mens et Fab-fragment har kort levetid. [Capon et al, Nature, 337:525-31 (1989)]. Ved ekspresjon som del av et fusjonsprotein kan et Fc-domene gi proteinet som det er fusjonert til lengre halveringstid, eller det kan innføre funksjoner som Fc-reseptorbinding, protein A-binding, komplementfiksering og kanskje til og med overføring via morkaken. Fc-området kan være et naturlig forekommende Fc-område, eller det kan være endret for å forbedre visse egenskaper, for eksempel terapeutiske egenskaper eller halveringstiden i sirkulasjonen.

Uttrykket "variabelt område" eller "variabelt domene" viser til en del av et antistoffs lettkjede og/eller tungkjede og omfatter typisk tilnærmet de aminoterminale 120 til 130 aminosyrer i tungkjeden og de tilnærmet 100 til 110 aminoterminale aminosyrene i lettkjeden. De variable områdene avviker typisk i omfattende grad fra hverandre når det gjelder aminosyresekvens, selv blant antistoffer fra samme art. Det variable område i et antistoff bestemmer typisk binding og spesifisitet av et gitt antistoff for dets spesielle antigen. Variabiliteten i sekvensen er konsentrert til de områder som betegnes komplementaritetsbestemmende områder (CDR), mens de mer konserverte områder i det variable domene kalles rammeverksområder (FR). CDR i tungkjeden og lettkjeden omfatter de aminosyrer som i størst grad er ansvarlige for den direkte interaksjon mellom antistoff og antigen, aminosyrer i FR kan imidlertid i vesentlig grad påvirke antigenbinding og antigengjenkjenning, som diskutert heri nedenfor.

Begrepet "lettkjede" anvendt ved henvisning til et antistoff viser til to adskilte typer under ett, disse kalles kappa (k) eller lambda (1) avhengig av aminosyresekvensen i de konstante domener.

Begrepet "tungkjede" anvendt i forbindelse med et antistoff viser til fem adskilte typer under ett, disse betegnes alfa, delta, epsilon, gamma og mjx avhengig av aminosyresekvensen i tungkjedens konstante domene. Kombinasjonen av tungkjeder og lettkjeder gir opphav til fem kjente antistoffklasser: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, innbefattet fire kjente subklasser av IgG som betegnes IgGi, IgG2, IgG3og IgG4.

Begrepet "naturlig forekommende" anvendt i forbindelse med biologiske materialer som nukleinsyremolekyler, polypeptider, vertsceller og lignende, viser til slike enheter som finnes i naturen og som ikke er modifisert av et menneske.

Begrepet "isolert" anvendt i forbindelse med Ang-2 eller et spesifikt bindingsmiddel for Ang-2 viser til en forbindelse som er fri for minst ett kontaminerende polypeptid eller en kontaminerende forbindelse som forefinnes i dets naturlige miljø, og fortrinnsvis i det vesentlige fri for alle andre kontaminerende pattedyrs polypeptider som kan interferere med dets terapeutiske eller diagnostiske anvendelse.

Begrepet "modent" anvendt i forbindelse med Ang-2, anti-Ang-2-antistoff eller ethvert annet spesifikt bindingsmiddel for Ang-2 av proteinnatur viser til et peptid eller polypeptid som mangler en ledersekvens eller signalsekvens. Dersom et bindingsmiddel ifølge oppfinnelsen uttrykkes i for eksempel en prokaryotvertscelle kan det "modne" peptid eller polypeptid også omfatte ytterligere aminosyrerester (men fortsatt mangle en ledersekvens), for eksempel en aminoterminal metionin eller én eller flere metionin- og lysinrester. Et peptid eller polypeptid som er fremstilt på denne måte kan anvendes med eller uten fjerning av disse tilleggsaminosyrerestene.

Uttrykkene "effektiv mengde" og "terapeutisk effektiv mengde" anvendt i forbindelse med et spesifikt bindingsmiddel for Ang-2 viser til en mengde av et spesifikt bindingsmiddel som er anvendbar eller tilstrekkelig til å understøtte en observerbar endring i nivået av én eller flere biologiske aktiviteter forbundet med Ang-2. Endringen kan være enten en økning eller en reduksjon i nivået av Ang-2-aktivitet. Endringen er fortrinnsvis en reduksjon av Ang-2-aktiviteten.

Spesifikke bindingsmidler og antistoffer

Som anvendt heri viser uttrykket "spesifikt bindingsmiddel" til et molekyl som har spesifisitet for gjenkjenning og binding av Ang-2 som beskrevet heri. Egnede spesifikke bindingsmidler omfatter antistoffer og antistofffragmenter, polypeptider og små molekyler. Egnede spesifikke bindingsmidler kan fremstilles ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjente innen faget. Et eksemplarisk Ang-2-polypeptidspesifikt bindingsmiddel ifølge beskrivelsen er i stand til å binde en gitt del av Ang-2-polypeptidet og fortrinnsvis modulere aktiviteten eller funksjonen av Ang-2-polypeptidet.

Antistoffer som spesifikt bindes til Ang-2-polypeptider ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område. Antistoffene kan være polyklonale, innbefattet monospesifikke polyklonale, monoklonale (mAb), rekombinante, kimære, humaniserte, for eksempel CDR-transplanterte, humane, enkeltkjedede, katalytiske, multispesifikke og/eller bispesifikke, så vel som fragmenter, varianter og/eller derivater av disse.

Polyklonale antistoffer rettet mot et Ang-2-polypeptid fremstilles generelt i dyr (f.eks. kanin, hamster, geit, sau, hest, gris, rotte, ørkenrotte, marsvin, mus så vel som andre ikke-patte-dyrsarter) ved hjelp av flere subkutane eller intraperitoneale injeksjoner av Ang-2-polypeptid eller et fragment derav, med eller uten en adjuvans. Slike adjuvanser omfatter Freunds komplette og ukomplette adjuvans, mineralgeler som aluminiumhydroksid og overflateaktive forbindelser som lysolecitin, "pluronic"-polyoler, polyanioner, peptider, oljeemulsjoner, hemocyanin fra albueskjell og dinitrofenol. BCC (Bacilli Calmette-Guerin) og Corynebacterium parvum er mulige anvendbare humane adjuvanser. Det kan være nyttig å konjugere et antigenpolypeptid til et bærerprotein som er immunogent i arten som skal immuniseres, for eksempel hemocyanin fra albueskjell, serum, albumin, bovint tyroglobulin eller trypsininhibitor fra soyabønne. Videre anvendes aggregeringsmidler som alun for å forsterke immunresponsen. Etter immuniseringen tappes dyrene for blod, og serum analyseres for anti-Ang-2-polypeptidantistofftiter, som kan bestemmes ved anvendelse av analysene som beskrives heri under "Eksempler". Polyklonale antistoffer kan anvendes i det serum som de ble påvist i, eller de kan renses fra serum ved anvendelse av for eksempel antigenaffinitetskromatografi eller protein A- eller G-affinitetskromatografi.

Monoklonale antistoffer rettet mot Ang-2-polypeptider kan for eksempel fremstilles ved anvendelse av den tradisjonelle "hybridom"-fremgangsmåte eller den nyere "bakteriofag-fremvisnings"-teknikk. For eksempel kan monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen fremstilles ved hybridomfremgangsmåten som beskrevet i Kohler et al. Nature 256:495 [1975]; human-B-cellehybridomteknikken [Kosbor et al., Immunol Today 4:72 (1983); Cote et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 80: 2026-2030 (1983); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)] og EBV-hybridomteknikken [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc., New York, New York s. 77-96, (1985)]. Videre tilveiebringer oppfinnelsen hybridomcellelinjer som danner monoklonale antistoffer som reagerer med Ang-2-polypeptider.

Dersom hybridomteknikken benyttes kan myelomcellelinjer anvendes. Slike cellelinjer som er egnede for anvendelse i hybridomproduserende fusjonsfremgangsmåter er fortrinnsvis ikke antistoffprodusenter, har høy fusjonseffektivitet og har enzymmangler som gjør dem ute av stand til å vokse i visse seleksjonsmedier som understøtter vekst av kun de ønskede fusjonerte cellene (hybridomene). Cellelinjer som anvendes i musefusjoner er for eksempel Sp-20, PX-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS 1/1. Ag 4 1, Sp210-Agl4„ FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 og S194/5XX0 Bul; cellelinjer som anvendes i rottefusjoner er R210.RCY3, Y3-AG 1.2.3, IR983F og 4B210. Andre cellelinjer som er anvendbare for cellefusjoner er U-266, GM 1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 og UC729-6. Hybridomer og andre cellelinjer som danner monoklonale antistoffer omfattes som nye preparater ifølge foreliggende oppfinnelse.

Bakteriofagfremvisningsteknikken kan også anvendes for frembringelse av monoklonale antistoffer fra enhver art. Denne teknikk anvendes fortrinnsvis for fremstilling av fullt ut humane monoklonale antistoffer, hvor et polynukleotid som koder for et enkelt Fab- eller Fv-antistoffragment uttrykkes på overflaten av en bakteriofagpartikkel. [Hoogenboom et al., J Mol Biol 227: 381 (1991); Marks et al., J Mol Biol 222:581 (1991); se også U.S. patentskrift nr.

5 885 793)]. Bakteriofagene kan "utvelges" ved anvendelse av bindingsanalyser som beskrives heri for påvisning av de antistoffragmenter som har affinitet for Ang-2. Disse prosessene etter-ligner således immunseleksjon via fremvisning av antistoffragmentrepertoarer på overflaten av filamentøse bakteriofag og påfølgende seleksjon av bakteriofag ut fra binding til Ang-2. En slik fremgangsmåte beskrives i PCT-patentsøknad nr. PCT/US98/17364, innlevert under navnet Adams et al., som beskriver isolering av antistoffragmenter med høy affinitet og funksjonell agonisme overfor MPL- og MSK-reseptorer ved en slik tilnærming. I denne tilnærming kan et fullstendig repertoar av humane antistoffgener dannes ved å klone naturlig rearrangerte humane V-gener fra lymfocytter fra perifert blod som tidligere beskrevet [Mullinax et al., Proe Nati Acad Sei (USA) 87: 8095-8099 (1990)].

Når først det har blitt påvist polynukleotidsekvenser som koder for kjedene i det monoklonale antistoff av full lengde eller Fab- eller Fv-fragmentet eller -fragmentene ifølge oppfinnelsen kan vertsceller, enten eukariote eller prokariote, anvendes for ekspresjon av de monoklonale antistoffpolynukleotidene ved anvendelse av rekombinante teknikker som er velkjente og som rutinemessig anvendes innen faget. Alternativt fremstilles transgene dyr hvor et polynukleotid som koder for det ønskede spesifikke bindingsmiddel innføres i genomet til et mottakerdyr, for eksempel en mus, kanin, geit eller ku, på en måte som tillater ekspresjon av polynukleotidmolekylene som koder for et monoklonalt antistoff eller et annet spesifikt bindingsmiddel. I én utførelse kan polynukleotidene som koder for det monoklonale antistoff eller et annet spesifikt bindingsmiddel være ligert til brystvevsspesifikke regulatoriske sekvenser, og de kimære polynukleotidene kan innføres i kimcellelinjen hos måldyret. Det resulterende transgene dyr danner da det ønskede antistoff i melken. [Pollock et al, J. Immunol Today 8:364-370 (2000)]. I tillegg kan planter anvendes for ekspresjon og fremstilling av Ang-2-spesifikke bindingsmidler, for eksempel monoklonale antistoffer, ved å transfektere egnede planter med polynukleotidene som koder for de monoklonale antistoffene eller for andre spesifikke bindingsmidler.

I en annen utførelse av foreliggende oppfinnelse kan et monoklonalt eller polyklonalt antistoff eller et fragment av dette som er avledet fra en ikke-menneskelig art "humaniseres" eller "kimeriseres". Fremgangsmåter for humanisering av ikke-menneskelige antistoffer er velkjente innen faget (se U.S. patentskrifter numrene 5 859 205, 5 585 089 og 5 693 762). Humanisering utføres for eksempel ved å benytte fremgangsmåter som er beskrevet innen faget [Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) ved å innføre i det minste en del av de komplementaritetsbestemmende områder fra f.eks. en gnager i stedet for de tilsvarende områder i et humant antistoff. Oppfinnelsen tilveiebringer også varianter og derivater av disse humane antistoffene, som diskutert heri og som velkjent innen faget.

Også omfattet av oppfinnelsen er fullt ut humane antistoffer som binder Ang-2-polypeptider, så vel som fragmenter, varianter og/eller derivater av disse. Slike antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av bakteriofagfremvisningsteknikken som er beskrevet ovenfor. Alternativt kan transgene dyr (f.eks. mus) som kan danne et repertoar av humane antistoffer i fravær av endogen immunglobulinproduksjon anvendes for frembringelse av slike antistoffer. Dette kan oppnås ved å immunisere dyret med et Ang-2-antigen eller fragmenter av dette, hvor Ang-2-fragmentene har en aminosyresekvens som er spesiell for Ang-2. Slike immunogener kan om ønskelig være konjugert til et bærerstoff. Se for eksempel Jakobovits et al., Proe Nati Acad Sei (USA), 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno, 7: 33(1993). I én fremgangsmåte fremstilles slike transgene dyr ved å inaktivere de endogene loci som koder for immunglobulinets tungkjede og lettkjede i dyret og innsette loci som koder for humane tungkjede- og lettkjedeproteiner i dyrets genom. Delvis modifiserte dyr, det vil si dyr med mindre enn det fulle komplement av disse modifikasjonene, krysses så for erholdelse av et dyr som har alle de ønskede immunsystemmodifikasjoner. Ved tilførsel av et immunogen kan disse transgene dyr danne antistoffer med humane variable områder, innbefattet humane aminosyresekvenser (snarere enn sekvenser fra for eksempel mus) som er immunspesifikke for de ønskede antigener. Se PCT-patentsøknader numrene PCT/US96/05928 og PCT/US93/06926. Ytterligere fremgangsmåter beskrives i U.S. patentskrift nr. 5 545 807, PCT-patentsøknadene numrene PCT/US91/245 og PCT/GB89/01207, og i EP 546073B1 og EP 546073A1. Humane antistoffer kan også fremstilles ved ekspresjon av rekombinant DNA i vertsceller eller ved ekspresjon i hybridomceller som beskrevet heri.

Transgenese oppnås på en rekke forskjellige måter. Se for eksempel, Bruggeman et al, Immunol Today 17:391-7 (1996). I én tilnærming konstrueres et minilocus slik at gensegmenter i kimcellelinjekonfigurasjon bringes nær hverandre på kunstig vis. Grunnet størrelses-begrensninger (dvs. at de generelt er mindre enn 30 kb) vil det resulterende minilocus inneholde et begrenset antall forskjellige gensegmenter, men det kan fortsatt danne et stort repertoar av antistoffer. Miniloci som kun inneholder humane DNA-sekvenser, innbefattet promotere og enhancere, er fullt ut funksjonelle i den transgene mus.

Dersom et større antall gensegmenter er ønskelig i det transgene dyr anvendes kunstige gjærkromosomer (YAC). YAC kan variere fra flere hundre kilobase til 1 Mb og innføres i genomet til musen (eller et annet egnet dyr) via mikroinjeksjon direkte inn i et egg eller via overføring av YAC inn i embryonale stamcellelinjer (ES-cellelinjer). Generelt overføres YAC til ES-celler ved lipofeksjon av rensede det DNA eller ved gjærsferoblastfusjon, hvor det rensede DNA bæres i miceller og fusjonen utføres på en måte som ligner på hybridomfusjons-fremgangsmåter. Seleksjon av ønskede ES-celler etter DNA-overføring oppnås ved å la det angjeldende YAC inneholde en av seleksjonsmarkørene som er kjente innen faget.

Som et annet alternativ anvendes bakteriofag Pl-vektorer som er amplifisert i en bakteriell E. coli- vQtt. Selv om disse vektorene generelt bærer mindre innsatt DNA enn et YAC, kan klonene lett dyrkes til et tilstrekkelig høyt utbytte til at direkte mikroinjeksjon i et museegg tillates. Anvendelse av en blanding av forskjellige Pl-vektorer har blitt vist å føre til et høyt nivå av homolog rekombinasjon.

Når først en egnet transgen mus (eller et annet egnet dyr) har blitt påvist ved anvendelse av én av teknikkene som er kjente innen faget for bestemmelse av nivået i serum av et sirkulerende antistoff (f.eks. ELISA) krysses det transgene dyr med en mus i hvilken det endogene Ig-locus har blitt ødelagt. Resultatet er at det dannes avkom i hvilket i det vesentlige alle B-celler uttrykker humane antistoffer.

I nok et alternativ erstattes hele Ig-locus i dyret med det humane Ig-locus, med den følge at det resulterende dyr kun uttrykker humane antistoffer. I en annen tilnærming erstattes deler av dyrets locus spesifikke og tilsvarende områder fra det humane locus. I visse tilfeller kan dyrene som dannes ved denne fremgangsmåte uttrykke kimære antistoffer i motsetning til fullt ut humane antistoffer, avhengig av hva slags utbytting som har skjedd i musens Ig-locus.

Humane antistoffer kan også fremstilles ved å eksponere humane splenocytter (B- eller T-celler) overfor et antigen in vitro, og så rekonstituere de eksponerte cellene i en immun-kompromittert mus, f.eks. en SCID eller nod/SCID-mus. Se Brams et al, J Immunol, 160: 2051-2058 [1998]; Carballido et al, Nat Med, 6: 103-106 [2000]. I én tilnærming fører transplantasjon av humant føtalt vev inn i SCID-mus (SCID-hu) til langvarig hematopoiese og utvikling av humane T-celler [McCune et al., Science 241: 1532-1639 (1988); Ifversen et al, Sem Immunol 8:243-248 (1996)]. Eventuelle humorale immunresponser i disse kimære musene er fullstendig avhengig av samtidig utvikling av T-celler i dyrene [Martensson et al, Immunol 83:1271-179

(1994)]. I en alternativ tilnærming transplanteres humane lymfocytter fra perifert blod intraperitonealt (eller på annet vis) i SCID-mus [Mosier et al, Nature 335:256-259 (1988)]. Når de transplanterte celler behandles med enten et primingsmiddel som Stafylokokk Enterotoksin A (SEA) [Martensson et al, Immunol 84: 224-230 (1995)], eller monoklonale anti-human CD40-antistoffer [Murphy et al., Blood 86:1946-1953 (1995)], påvises et høyere nivå av B-celle-produksjon.

Alternativt kan et fullt ut syntetisk humant tungkjederepertoar dannes fra ikke-rearrangerte V-gensegmenter ved å sammenkoble hvert av de humane VH-segmentene med V-segmenter med tilfeldige nukleotider sammen med et humant J-segment [Hoogenboom et al, J Mol Biol 227:381-388 (1992)]. Likeså kan et lettkjederepertoar konstrueres ved å kombinere hvert av de humane V-segmentene med et J-segment [Griffiths et al., EMBO J 13:3245-3260

(1994)]. Nukleotider som koder for det fullstendige antistoff (dvs. både tungkjede og lettkjede) sammenkobles som et enkeltkjedet Fv-fragment, og dette polynukleotid ligeres til et nukleotid som koder for et underordnet kappeprotein fra filamentøs bakteriofag. Når dette fusjonsprotein uttrykkes på bakteriofagens overflate identifiseres et polynukleotid som koder for et spesifikt antistoff ved seleksjon ved anvendelse av et immobilisert antigen.

I nok en tilnærming oppbygges antistoffragmenter som to Fab-fragmenter ved fusjon av én kjede til et bakteriofagprotein og sekresjon av den andre kjeden inn i bakteriens periplasma [Hoogenboom et al, Nucl Acids Res 19:4133-4137 [1991]; Barbas et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 88:7978-7982 (1991)].

Fremstilling i stor skala av kimære, humaniserte, CDR-transplanterte og fult ut humane antistoffer eller fragmenter av disse utføres typisk ved rekombinante fremgangsmåter. Polynukleotidmolekyler som koder for tungkjeden og lettkjeden for hvert antistoff eller antistoffragment kan innføres i vertsceller og uttrykkes ved anvendelse av materialer og fremgangsmåter som beskrives heri. I en foretrukket utførelse fremstilles antistoffene i pattedyrsvertsceller, for eksempel CHO-celler. Detaljer vedrørende slik fremstilling gis nedenfor.

Fusjonspartnere for spesifikke bindingsmidler

I nok en utførelse av oppfinnelsen kan polypeptidene som omfatter aminosyresekvensen til de variable domener fra Ang-2-antistoffer, for eksempel et variabelt tungkjedeområde med en aminosyresekvens som beskrevet heri eller et variabelt lettkjedeområde med en aminosyresekvens som beskrevet heri, være fusjonert i enten en N-enden eller C-enden til ett eller flere domener fra et Fc-område fra humant IgG. Ved sammenkobling til et terapeutisk protein, for eksempel Fab fra et Ang-2-spesifikt antistoff kan et Fc-domene gi lengre halveringstid eller innføre funksjoner som Fc-reseptorbinding, protein-A-binding, komplementfiksering og kanskje til og med overføring via morkake.[Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989)].

I ett eksempel kan antistoffets hengselområde, CH2-området og CH3-området være fusjonert via enten N-enden eller C-enden til de spesifikke bindingsmiddelpolypeptider, for eksempel et anti-Ang-2-Fab- eller -Fv-fragment (f.eks. erholdt fra et bakteriofagrfemvisnings-bibliotek) ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjente blant fagfolk. Det resulterende fusjonsprotein kan renses ved anvendelse av en protein A- eller protein G-affinitetskolonne. Peptider og proteiner som er fusjonert til et Fc-område har blitt vist å besitte en vesentlig lengre halveringstid in vivo enn det ikke-fusjonerte motstykke. Videre fusjon til et Fc-område dimerisering/multimerisering av fusjonspolypeptidet. Fc-området kan være et naturlig forekommende Fc-område, eller det kan være endret for å forbedre visse egenskaper, for eksempel terapeutiske egenskaper, halveringstiden i sirkulasjonen, for reduksjon av aggregeringsproblemer osv. Andre eksempler som er kjente innen faget omfatter eksempler i hvilke Fc-området, som kan være fra mennesket eller en annen art eller være syntetisk, er fusjonert til N-enden av CD30L for behandling av Hodgkins sykdom, anaplastisk lymfon og T-celle leukemi (U.S. patentskrift nr. 5 480 981), Fc-området er fusjonert til TNF-reseptoren for behandling av septisk sjokk [Fisher et al., N Engl J Med, 334: 1697-1702 (1996)], og Fc-området er fusjonert til Cd4-reseptoren for behandling av AIDS [Capon et al, Nature, 337; 525-31

(1989)].

Katalytiske antistoffer er en annen type fusjonsmolekyler og omfatter antistoffer til hvilke én eller cytotoksiske, eller mer generelt én eller flere biologisk aktive grupper er koblet til det spesifikke bindingsmiddel. Se for eksempel [Rader et al, Chem Eur J 12:2091-2095 (2000)]. Cytotoksiske midler av denne type forbedrer den antistoffformidlede cytotoksisitet og omfatter grupper som cytokiner som direkte eller indirekte stimulerer celledød, radioaktive isotoper, kjemoterapeutiske medikamenter (innbefattet promedikamenter), bakterietoksiner (f.eks. pseudomonos-eksotoksin, difteritoksin osv.), plantetoksiner (f.eks. ricin, gelonin osv.), kjemiske konjugater (f.eks. maytansinoidtoksiner, calechaemicin osv.), radioaktive konjugater, enzym-konjugater (RNase-konjugater, antistoffstyrt enzym/promedikamentbehandling [ADEPT], og lignende. I én utførelse kan det cytotoksiske middel være "koblet" til én bestanddel av et bispesifikt eller multispesifikt antistoff ved at det er bundet til dette middel via ett av de alternative antigengjenkjenningsseter i antistoffet. Som et alternativ kan proteincytotoksiner uttrykkes som fusjonsproteiner med det spesifikke bindingsmiddel etter legering av et polynukleotid som koder for toksinet til et polynukleotid som koder for bindingsmidlet. I nok et alternativ kan det spesifikke bindingsmiddel være kovalent modifisert slik at det omfatter det ønskede cytotoksin.

Eksempler på slike fusjonsproteiner er immunogene polypeptider, proteiner med lang halveringstid i sirkulasjonen, for eksempel konstante immunglobulinområder, markørproteiner, proteiner eller polypeptider som letter rensing av det ønskede spesifikke bindingsmiddelpolypeptid og polypeptidsekvenser som fremmer dannelse av multimere proteiner (for eksempel leucin-"zipper"-motiver som er anvendbare for dimerdannelse/stabilitet).

I denne type insersjonsvariant er generelt hele eller en vesentlig del av utgangs-molekylet koblet via N- eller C-enden til hele eller en del av et andre polypeptid. For eksempel benytter fusjonsproteiner typisk ledersekvenser fra andre arter for å tillate rekombinant ekspresjon av et protein i en heterolog vert. Et annet anvendbart fusjonsprotein omfatter addisjon av et immunologisk aktivt domene, for eksempel en antistoffepitop, for å lette rensing av fusjonsproteinet. Innføring av et kløyvingssete i eller nær fusjonsovergangen vil lette fjerning av det ekstra polypeptid etter rensingen. Andre anvendbare fusjoner omfatter tilkobling av funksjonelle domener, for eksempel aktive seter fra enzymer, glykosyleringsdomener, cellulære målstyringssignaler eller transmembranområder.

Det finnes en rekke kommersielt tilgjengelige fusjonsproteinekspresjonssystemer som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse. Spesielt anvendbare systemer omfatter glutation-S-transferase (GST)-systemet (Pharmacia), det maltosebindende proteinsystem (NEB, Beverley, MA), FLAG-systemet (IBI, New Haven, CT), og 6xHis-systemet (Qiagen, Chatsworth, CA). Disse systemene kan gi rekombinante polypeptider som kun har et lite antall ekstra aminosyrer som sannsynligvis ikke vil påvirke det rekombinante polypeptids antigene evner. For eksempel adderer både FLAG-systemet og 6xHis-systemet kun korte sekvenser som begge vites å være lite antigene og som ikke på uønsket måte påvirker foldingen av polypeptidet til den native konformasjon. En annen N-terminal fusjon som anses å være anvendbar er fusjon av et Met-Lys-dipeptid til proteinets eller peptidets N-terminale område. En slik fusjon kan gi gunstig økning av proteinekspresjon eller -aktivitet.

En spesiell anvendbar fusjonskonstruksjon kan være én i hvilken et spesifikt bindingsmiddelpeptid er fusjonert til et hapten for å forhøye immunogenisiteten av en spesifikk bindings-middelfusjonskonstruksjon, noe som for eksempel er anvendbart ved fremstilling av antiidiotype antistoffer ifølge oppfinnelsen. Slike fusjonskonstruksjoner for å øke immunogenisiteten er velkjente blant fagfolk, for eksempel vil en fusjon mellom et spesifikt bindingsmiddel og et hjelperantigen, for eksempel hsp70, eller peptidsekvenser fra for eksempel en difteritoksinkjede eller et cytokin som IL-2 være anvendbart for utløsing av en immunrespons. I andre utførelser kan det fremstilles fusjonskonstruksjoner som vil forbedre målstyringen av de antigenbindende middelpreparater til et spesifikt sete eller en spesifikk celle.

Andre fusjonskonstruksjoner, innbefattet heterologe polypeptider med ønskede egenskaper, f.eks. et konstant Ig-område for forlengelse av halveringstiden i serum eller et antistoff eller antistoffragment for målstyring omfattes også. Andre fusjonssystemer gir poly- peptidhybrider hvor det er ønskelig å spalte fusjonspartneren fra det ønskede polypeptid. I én utførelse er fusjonspartneren koblet til det rekombinante spesifikke bindingsmiddelpolypeptid via en peptidsekvens som inneholder en spesifikk gjenkjenningssekvens for en protease. Eksempler på egnede sekvenser er sekvensene som gjenkjennes av proteasen fra "Tobacco Etch"-virus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) eller Faktor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA).

Oppfinnelsen tilveiebringer også fusjonspolypeptider som omfatter hele eller en del av et variabelt domene fra et Ang-2-antistoff, for eksempel et variabelt tungkjedeområde med en aminosyresekvens som beskrevet heri eller et variabelt lettkjedeområde med en aminosyresekvens som beskrevet heri, i kombinasjon med avkortet vevsfaktor (tTF), et vaskulært mål-styringsmiddel som består av en avkortet form av et humant koagulasjonsinduserende protein som fungerer som koagulasjonsmiddel i tumorblodkar. Fusjonen av tTF til anti-Ang-2-antistoffet eller fragmenter derav kan lette tilførselen av anti-Ang-2 til målcellene.

Varianter av spesifikke bindingsmidler

Varianter av spesifikke bindingsmidler ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter insersjonsvarianter, delesjonsvarianter og/eller substitusjons varianter. I én utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes insersjonsvarianter hvori én eller flere aminosyrerester supplementerer aminosyresekvensen til et spesifikt bindingsmiddel. Insersjoner kan være lokalisert til en av proteinets ender eller begge ender, eller de kan være plassert i indre områder i aminosyresekvensen til det spesifikke bindingsmiddel. Insersjonsvarianter med ekstra aminosyrerester i den ene eller begge ender kan for eksempel omfatte fusjonsproteiner og proteiner som omfatter aminosyre-"merkelapper". Insersjonsvarianter omfatter spesifikke bindingsmiddelpolypeptider hvori én eller flere aminosyrerester er addert til aminosyresekvensen til et spesifikt bindingsmiddel eller et fragment derav.

Variantpodukter ifølge oppfinnelsen omfatter også modne spesifikke bindingsmiddelprodukter. I slike spesifikke bindingsmiddelprodukter er ledersekvensen eller signalsekvensen fjernet, det resulterende protein har imidlertid ekstra aminosyrerester i aminoenden sammenlignet med Ang-2-polypeptid av villtype. De ekstra aminoterminale aminosyrerestene kan være avledet fra et annet protein eller omfatte én eller flere aminosyrerester som ikke påvisbart er avledet fra et spesifikt protein. Spesifikke bindingsmiddelprodukter med en ekstra metioninrest i posisjon -1 (Met"<1->spesifikt bindingsmiddel) omfattes, likeså spesifikke bindingsmiddelprodukter med ekstra metionin (og lysinrester i posisjon -2 og -1 (Met^-Lys"<1->spesifikt bindingsmiddel. Varianter av spesifikke bindingsmidler med ekstra Met, Met-Lys eller Lys-rester (eller generelt én eller flere basiske aminosyrerester) er spesielt anvendbare for forhøyet rekombinant proteinproduksjon i bakterievertsceller.

Oppfinnelsen omfatter også spesifikke bindingsmiddelvarianter som har ekstra aminosyrerester som skyldes anvendelse av spesifikke ekspresjonssystemer. For eksempel fører anvendelse av kommersielt tilgjengelige vektorer som uttrykker et ønsket polypeptid som del av et glutation-S-transferase (GST)-fusjonsprodukt det ønskede polypeptid med en ekstra glysinrest i aminosyreposisjon -1 etter avspalting av GST-bestanddelen fra det ønskede polypeptid. Varianter som oppstår grunnet ekspresjon i andre vektorsystemer omfattes også, også varianter i hvilke poly-histidinmerkelapper er innført i aminosyresekvensen, generelt i sekvensens karboksyende og/eller aminoende.

Insersjonsvarianter omfatter også fusjonsproteiner som beskrevet ovenfor hvori amino-og/eller karboksyenden av det spesifikke bindingsmiddel polypeptid er fusjonert til et annet polypeptid, et fragment derav eller aminosyresekvenser som ikke generelt kan ses å utgjøre del av en spesifikk proteinsekvens.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen delesjonsvarianter i hvilke én eller flere aminosyrerester i et spesifikt bindingsmiddelpolypeptid er fjernet. Delesjoner kan innføres i den ene enden eller i begge ender av det spesifikke bindingsmiddelpolypeptid eller ved å fjerne én eller flere aminosyrerrester inne i aminosyresekvensen til det spesifikke bindingsmiddel. Delesjonsvarianter omfatter nødvendigvis alle fragmenter av et spesifikt bindingsmiddelpolypeptid.

Antistoffragmenter omfatter de deler av antistoffet som bindes til en epitop på antigenpolypeptidet. Eksempler på slike fragmenter omfatter Fab-fragmenter og F(ab')2-fragmenter, for eksempel dannet ved enzymatisk eller kjemisk spalting av fullengde-antistoffer. Andre bindende fragmenter omfatter fragmenter dannet ved rekombinante DNA-teknikker, for eksempel ekspresjon av rekombinante plasmider som inneholder nukleinsyresekvenser som koder for variable antistoffområder. Oppfinnelsen omfatter også polypeptidfragmenter av et Ang-2-bindende middel hvori fragmentene opprettholder evnen til spesifikt å bindes til et Ang-2 - polypeptid. Fragmenter som omfatter minst 5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 eller 50 eller flere på hverandre følgende aminosyrer fra et peptid eller polypeptid ifølge oppfinnelsen omfattes heri. Foretrukne polypeptidfragmenter viser immunologiske egenskaper som er enestående eller spesifikke for det antigenbindende middel ifølge oppfinnelsen. Fragmenter ifølge oppfinnelsen med de ønskede immunologiske egenskaper kan fremstilles ved en rekke fremgangsmåter som er velkjente og rutinemessig anvendte innen faget.

I nok en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen substitusjonsvarianter av spesifikke bindingsmidler ifølge oppfinnelsen. Substitusjonsvarianter anses generelt å "ligne" på det opprinnelige polypeptid eller å ha en viss "prosent likhet" med det opprinnelige polypeptid og omfatter polypeptider i hvilke én eller flere aminosyrerester er fjernet og erstattet med alternative aminosyrerester. I én utførelse er substitusjonene konservative av natur, oppfinnelsen omfatter imidlertid også ikke-konservative substitusjoner.

Identitet og likhet mellom beslektede polypeptider kan lett beregnes ved kjente fremgangsmåter. Slike fremgangsmåter omfatter fremgangsmåtene som beskrives i Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., red., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., red., Academic Press, New York

(1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., og Griffin, H.G., red.

Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. og Devereux, J., red., M. Stockton Press, New York (1991); og Carillo et al, SJAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

Foretrukne fremgangsmåter for å bestemme slektskap eller prosent identitet mellom to polypeptider er utformet slik at de gir den høyeste grad av tilpasning mellom sekvensene som analyseres. Fremgangsmåter for bestemmelse av identitet er beskrevet i offentlig tilgjengelige datamaskinprogrammer. Foretrukne datamaskinprogramfremgangsmåter for bestemmelse av identitet mellom to sekvenser omfatter GCG-programpakken, innbefattet GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN, og FASTA (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). BLASTX-programmet er offentlig tilgjengelig fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) og andre kilder (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al, supra (1990)). Den velkjente Smith-Waterman-algoritme kan også anvendes for å bestemme identitet.

Visse sammenstillingsskjemaer for sammenstilling av to aminosyresekvenser kan føre til at kun et kort område i de to sekvensene sammenstilles, og dette korte sammenstilte område kan ha svært høy sekvensidentitet selv om det ikke er noe signifikant slektskap mellom de to fullengdesekvensene. I visse utførelser vil følgelig den valgte sammenstillingsfremgangsmåte

(GAP-programmet) føre til en sammenstilling som strekker seg over minst ti prosent av den fulle lengde av målpolypeptidene som sammenlignes, dvs. minst 40 på hverandre følgende aminosyrer dersom sekvenser på minst 400 aminosyrer sammenlignes, 30 på hverandre følgende aminosyrer dersom sekvenser på minst 300 til tilnærmet 400 aminosyrer sammenlignes, minst 20 på hverandre følgende aminosyrer dersom sekvenser på 200 til tilnærmet 300 aminosyrer sammenlignes og minst 10 på hverandre følgende aminosyrer dersom sekvenser på tilnærmet 100 til 200 aminosyrer sammenlignes.

For eksempel sammenstilles ved anvendelse av datamaskinalgoritmen GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), to polypeptider hvis prosent sekvensidentitet skal bestemmes slik at man får optimal tilpasning av de angjeldende aminosyrer (det "tilpassede strekk", bestemt ved algoritmen). I visse utførelser anvendes en gapåpningstraff (som typisk beregnes som 3X gjennomsnittsdiagonalen, "gjennomsnittsdiagonalen" har gjennom-snittet av diagonalen i sammenligningsmatrisen som anvendes, "diagonalen" er poengsummen eller tallet som tilskrives hver perfekte aminosyretilpasning av den angjeldende sammenligningsmatrise) og en gaputvidelsesstraff (som vanligvis er 1/10 ganger gapåpningsstraffen), så vel som en sammenligningsmatrise som PAM 250 eller BLOSUM 62, i forbindelse med algoritmen. I visse utførelser anvendes også en standard sammenligningsmatrise (se Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) for PAM 250-sammenligningsmatrisen, Henikoff et al, Proe. Nati. Acad. Sei USA, 89:10915-10919 (1992) for BLOSUM 62-sammenligningsmatrisen) også av algoritmen.

I visse utførelser omfatter parametrene for en polypeptidsekvenssammenligning følgende: Algoritme: Needleman et al, J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970);

Sammenligningsmatrise: BLOSUM 62 fra Henikoff et al., supra (1992);

Gapstraff: 12

Gaputvidelsesstraff: 4

Terskel for likhet: 0

GAP-programmet kan være anvendbart med de ovenfor angitte parametre. I visse utførelser er de ovenfor nevnte parametre standardparametrene for polypeptidsammenligninger (sammen med manglende straff for endegap) ved anvendelse av GAP-algoritmen.

I visse utførelser omfatter parametrene for polynukleotidmolekylsekvenssammenligning følgende: Algoritme: Needleman et al, supra (1970);

Sammenligningsmatrise: identitet = +10, ikke identitet = 0

Gapstraff: 50

Gaputvidelsesstraff: 3.

GAP-programmet kan også være anvendbart med de ovenfor angitte parametre. De ovenfor nevnte parametre er standardparametre for polynukleotidmolekylsammenligning.

Andre eksempler på algoritmer, gapåpningsstraff, gaputvidelsesstraff, sammen-ligningsmatriser, terskel for likhet og så videre kan anvendes, innbefattet parametrene som beskrives i Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, september 1977. De valg som må gjøres vil være åpenbare for fagfolk og vil avhenge av hvilken sammenligning som skal utføres, for eksempel DNA med DNA, protein med protein, protein med DNA, og i tillegg hvorvidt sammenligningen er mellom gitte par av sekvenser (i hvilket tilfelle GAP eller BestFit generelt foretrekkes) eller mellom én sekvens og en stor database over sekvenser (i hvilket tilfelle FASTA eller BLASTA foretrekkes).

Som anvendt heri følger betegnelsen på de tjue konvensjonelle aminosyrene og deres forkortelser den konvensjonelle bruk. Immunology~A Synthesis (2. utgave), E.S. Golub og D.R. Gren, red., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).

Aminosyrene kan ha enten L eller D-stereokjemi (bortsett fra Gly, som verken er L eller D) og polypeptidene og preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte en kombinasjon av stereokjemier. L-stereokjemien foretrekkes imidlertid. Oppfinnelsen tilveiebringer også reverse molekyler i hvilke sekvensen av aminosyrer fra aminoende til karboksyende er reversert. For eksempel vil den reverse sekvens av et molekyl med den normale sekvens X1-X2-X3være X3-X2-X1. Oppfinnelsen tilveiebringer også retroreverse molekyler i hvilke aminosyresekvensen fra aminoende til karboksyende som ovenfor er reverset og hvor aminosyrerester som normalt er "L"-enantiomerer er endret til den "D"-stereoisomere form.

Stereoisomerer (f.eks. D-aminosyrer) av de tjue konvensjonelle aminosyrene, unaturlige aminosyrer som a-, a-disubstituerte aminosyrer, N-alkylaminosyrer, melkesyre og andre ukonvensjonelle aminosyrer kan også være egnede bestanddeler av polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på ukonvensjonelle aminosyrer omfatter: aminoadipinsyre, beta-alanin, beta-aminopropionsyre, aminosmørsyre, piperidinsyre, aminokaprionsyre, aminoheptansyre, aminoisosmørsyre, aminopimelinsyre, diaminosmørsyre, desmosin, diaminopimelinsyre, diaminopropionsyre, N-etylglycin, N-etylasparagin, hydroksylysin, allo-hydroksylysin, hydroksyprolin, isodesmosin, allo-isoleucin, N-metylglycin, sarkosin, N-metylisoleucin, N-metylvalin, norvalin, norleucin, ornitin, 4-hydroksyprolin, y-karboksyglutamat, e-N,N,N-trimetyllysin, e-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin, a-N-metylarginin, og andre lignende aminosyrer og aminosyrer (f.eks. 4-hydroksyprolin).

På tilsvarende måte er dersom ikke annet er angitt venstre ende av enkelttrådede polynukleotidsekvenser den 5' ende, retningen til venstre på dobbelttrådede polynukleotidsekvenser betegnes 5' retning. Retningen fra 5' til 3' addering av RNA-transkripter under syntese betegnes transkripsjonsretningen, sekvensområder i DNA-tråden med samme sekvens som RNA og som ligger 5' for den 5' ende av RNA-transkriptet betegnes "oppstrømssekvenser", sekvensområder i DNA-tråden med samme sekvens som RNA og som ligger 3' for RNA-transkriptets 3' ende betegnes "nedstrømssekvenser".

Konservative aminosyresubstitusjoner kan omfatte ikke naturlig forekommende aminosyrerester, som typisk innføres ved kjemisk peptidsyntese snarere enn ved syntese i biologiske systemer. Disse omfatter peptidetterlignende stoffer og andre reverserte eller inverterte former for aminosyregrupper.

Naturlig forekommende aminosyrerester kan oppdeles i klasser basert på felles sidekj edeegenskaper:

1) hydrofobe: Met, Ala, Val, Leu, Ile,

2) nøytrale hydrofile: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin,

3) sure: Asp, Glu,

4) basiske: His, Lys, Arg,

5) aminosyrerester som påvirker kjedeorienteringen: Gly, Pro, og

6) aromatiske: Trp, Tyr, Phe.

For eksempel kan ikke-konservative substitusjoner omfatte utbytting av et medlem fra én av disse klassene med et medlem fra en annen klasse. Slike substituerte aminosyrerester kan innføres i områder i det humane antistoff som er homologe med ikke-

humane antistoffer eller i molekylets ikke-homologe områder.

Ved innføring av slike endringer kan ifølge visse utførelser aminosyrenes hydropatitall tas i betraktning. Hver aminosyre er tilskrevet et hydropatitall basert på aminosyrens hydrofobisitet og ladningsegenskaper. Tallene er: isoleucin (+4,5), valin (+4,2), leucin (+3,8), fenylalanin (+2,8), cystein/cystin (+2,5), metionin (+1,9), alanin (+1,8), glycin (-0,4), treonin (-0,7), serin (-0,8), tryptofan (-0,9), tyrosin (-1,3), prolin

(-1,6), histidin (-3,2), glutamat (-3,5), glutamin (-3,5), aspartat (-3,5), asparagin (-3,5), lysin (-3,9) og arginin (-4,5).

Betydningen av aminosyrens hydropatitall når det gjelder å gi et protein en interaktiv biologisk funksjon forstås innen faget. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Det er kjent at visse aminosyrer kan erstattes med andre aminosyrer med tilsvarende hydropatitall eller hydropatipoengsum mens en tilsvarende biologisk aktivitet fortsatt bibeholdes. Ved innføring av endringer basert på hydropatitallet omfattes i visse utførelser substitusjon av aminosyrer hvis hydropatitall ligger innenfor ±2 fra hverandre. I visse utførelser omfattes aminosyrer med hydropatitall innen ±1, og i visse utførelser omfattes aminosyrer hvis hydropatitall ligger innenfor ±0,5 fra hverandre.

Det er også forstått innen faget at substitusjon av aminosyrer som ligner hverandre effektivt kan utføres basert på hydrofilisitet, særlig dersom det biologisk funksjonelle protein eller peptid som derved dannes er ment anvendt i immunologiske utførelser, som i det foreliggende tilfelle. I visse utførelser korrelerer den høyeste lokale gjennomsnittshydrofilisitet for et protein, styrt av hydrofilisiteten til aminosyrene i nabostilling til hverandre, med proteinets immunogenisitet og antigenisitet, dvs. med en av proteinets biologiske egenskaper.

Følgende hydrofilisitetsverdier har blitt tilskrevet de angitte aminosyrerestene: arginin (+3,0), lysin (+3,0), aspartat (+3,0 ± 1), glutamat (+3,0 ± 1), serin (+0,3), asparagin (+0,2), glutamin (+0,2), glycin (0), treonin (-0,4), prolin (-0,5 ±1), alanin

(-0,5), histidin (-0,5), cystein (-1,0), metionin (-1,3), valin (-1,5), leucin (-1,8), isoleucin (-1,8), tyrosin (-2,3), fenylalanin (-2,5) og tryptofan (-3,4). Ved innføring av endringer basert på lignende hydrofilisitetsverdier omfattes i visse utførelser substitusjon av aminosyrer hvis hydrofilisitetsverdi ligger innenfor ± 2 fra hverandre, i visse utførelser omfattes aminosyrer hvis hydrofilisitetsverdi ligger innenfor ± 1, og i visse utførelser aminosyrer hvis hydrofilisitetsverdi ligger innenfor ± 0,5 fra hverandre. Man kan også identifisere epitoper ut fra primære aminosyresekvenser basert på hydrofilisitet. Disse områdene betegnes også "epitopiske kjerneområder".

Eksempler på aminosyresubstitusjoner gis i Tabell 1.

En erfaren fagperson vil kunne bestemme egnede varianter av polypeptidet som beskrevet heri ved anvendelse av velkjente teknikker. I visse utførelser kan en fagperson påvise egnede områder i molekylet som kan endres uten at aktiviteten ødelegges, ved at endringene styres til områder som antas ikke å være viktige for aktiviteten. I visse utførelser kan man påvise aminosyrerester og deler av molekylene som er konserverte sammenlignet med lignende polypeptider. I visse utførelser kan selv områder som kan være viktige for biologisk aktivitet eller for struktur utsettes for konservative aminosyresubstitusjoner uten at den biologiske aktivitet ødelegges og uten at polypeptidstrukturen påvirkes på uheldig måte.

I tillegg kan en fagperson studere struktur-funksjonssammenhenger som identifiserer aminosyrerester i lignende polypeptider som er viktige for aktivitet eller struktur. I lys av en slik sammenligning kan man forutsi betydningen av aminosyrerester i et protein som tilsvarer aminosyrerester som er viktige for aktivitet eller struktur i lignende proteiner. En fagperson kan bestemme seg for substitusjon med aminosyrer som kjemisk sett ligner utgangsaminosyren for slike antatt viktige aminosyrerester.

En fagperson kan også analysere den tredimensjonale struktur og aminosyresekvensen i relasjon til samme struktur i lignende polypeptider. I lys av slik informasjon kan en fagperson forutsi sammenstillingen av aminosyrerester i et antistoff med henblikk på den tredimensjonale struktur. I visse utførelser kan en fagperson velge ikke å innføre radikale endringer av aminosyrerester som kan forutsis å ligge på proteinets overflate, siden slike aminosyrerester kan delta i viktige interaksjoner med andre molekyler. En fagperson kan videre frembringe analysevarianter som inneholder en enkelt aminosyre substitusjon i hver ønskede aminosyreposisjon. Variantene kan så analyseres ved anvendelse av aktivitetsanalyser som er kjente blant fagfolk. Slike varianter kan anvendes for å samle informasjon vedrørende egnede varianter. Dersom man for eksempel oppdaget at en endring til en gitt aminosyrerest førte til ødelagt, i uønsket grad redusert eller uegnet aktivitet kan varianter med en slik endring unngås. Med andre ord an en fagperson basert på informasjon oppsamlet fra slike rutinemessige eksperimenter lett fastslå aminosyrene hvor ytterligere substitusjoner bør unngås, enten alene eller i kombinasjon med andre mutasjoner.

En rekke vitenskapelige publikasjoner omhandler forutsigelse av sekundærstruktur. Se Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al, Biochemistry, 13(2):222-245

(1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47:45-148 (1978); Chou et al, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 og Chou et al, Biophys. J., 26:367-384 (1979). Videre er det i dag tilgjengelig datamaskinprogrammer som kan bidra til å forutsi sekundærstruktur. Én fremgangsmåte for forutsigelse av sekundærstruktur bygger på homologimodellering. For eksempel har to polypeptider eller proteiner som har en sekvensidentitet på mer enn 30 % eller likhet på mer enn 40 % ofte tilsvarende strukturell topologi. Den senere tids vekst i proteinstrukturdatabasen (PDB) gir økte muligheter for forutsigelse av sekundærstruktur, innbefattet det mulige antall foldinger i et polypeptids eller proteins struktur. Se Holm et al, Nucl. Acid. Res., 27(l):244-247 (1999). Det har blitt foreslått (Brenner et al, Curr. Op. Struct. Biol, 7(3):369-376 (1997) at det finnes et begrenset antall foldinger i et gitt polypeptid eller protein, og at når først et kritisk antall strukturer har blitt lost vil strukturforutsigelse bli dramatisk mer nøyaktig.

Ytterligere fremgangsmåter for forutsigelse av sekundærstruktur omfatter "treing"

(Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol, 7(3):377-87 (1997), Sippl et al, Structure, 4(1):15-19

(1996)), "profilanalyse" (Bowie et al, Science, 253:164-170 (1991), Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990), Gribskov et al, Proe. Nat. Acad. Sei., 84(13):4355-4358 (1987)), og "evolusjonær kobling" (se Holm, supra (1999), og Brenner, supra (1997)).

I visse utførelser omfatter antistoffvarianter glykosyleringsvarianter hvori antall og/eller type glykosyleirngsseter har blitt endret sammenlignet med aminosyresekvensen til utgangspolypeptidet. I visse utførelser omfatter proteinvarianter et større eller lavere antall N-koblede glykosyleringsseter enn det native protein. Et N-koblet glykosyleirngssete særpreges ved sekvensen: Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr, hvori aminosyreresten betegnet X kan være hvilken som helst aminosyrerest bortsett fra prolin. Substitusjonen av aminosyrerester for å danne denne sekvensen tilveiebringer et mulig nytt sete for addering av en N-koblet karbohydratkjede. Alternativt vil substitusjoner som fjerner denne sekvens fjerne en eksisterende N-koblet karbohydratkjede. Videre tilveiebringes en rearrangering av N-koblede karbohydratkjeder hvori ett eller flere N-koblede glykosyleirngsseter (typisk de naturlig forekommende setene) fjernes og ett eller flere nye N-koblede seter dannes. Ytterligere foretrukne antistoffvarianter omfatter cysteinvarianter hvori én eller flere cysteinrester er fjernet eller erstattet med en annen aminosyre

(for eksempel serin), sammenlignet med utgangsaminosyresekvensen. Cysteinvarianter kan være anvendbare dersom antistoffer må refoldes til en biologisk aktiv konformasjon, for eksempel etter isolering av uløselige inklusjonslegemer. Cysteinvarianter har typisk færre cysteinrester enn det native protein, og har typisk et like antall for å minimalisere interaksjoner som oppstår grunnet uparede cysteiner.

Ifølge visse utførelser er aminosyresubstitusjonene substitusjoner som: (1) reduserer følsomheten overfor proteolyse, (2) reduserer følsomheten overfor oksidasjon, (3) endrer bindingsaffiniteten for dannelse av proteinkomplekser, (4) endrer bindingsaffiniteter, og/eller (5) innfører eller modifiserer andre funksjonelle egenskaper i slike polypeptider. Ifølge visse utførelser kan enkeltvise eller multiple aminosyresubstitusj oner (i visse utførelser konservative aminosyresubstitusj oner) innføres i den naturlig forekommende sekvens (i visse utførelser i den del av polypeptidet som ligger utenfor domenet eller domenene som danner intermolekylære kontakter). I visse utførelser vil en konservativ aminosyresubstitusj on typisk ikke i vesentlig grad endre utgangssekvensens strukturelle egenskaper (for eksempel bør en aminosyre som erstatter en annen ikke bidra til å oppbryte en heliks som opptrer i utgangssekvensen eller forstyrre andre typer sekundærstruktur som særpreger utgangssekvensen). Eksempler på sekundær- og tertiærstrukturer for polypeptider som er kjente innen faget beskrives i Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, red., W.H. Freeman and Company, New York (1984)), Introduction to Protein Structure (C. Branden og J. Tooze, red. Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)), og Thornton et al. Nature 354:105 (1991).

For antistoffvarianter kan tungkjeden ha opp til 5,4, 3, 2 eller 1 aminosyre erstattet mens lettkjeden kan ha 2 eller 1 aminosyrer erstattet.

Derivater av spesifikke bindingsmidler

Oppfinnelsen tilveiebringer også derivater av spesifikke bindingsmiddelpolypeptider. Derivatene omfatter spesifikke bindingsmiddelpolypeptider som bærer modifikasjoner som er forskjellige fra insersjon, delesjon eller substitusjon av aminosyrerester. Modifikasjonene er fortrinnsvis kovalente av natur og omfatter for eksempel kjemisk binding til polymerer, lipider, andre organiske grupper og uorganiske grupper. Derivater ifølge oppfinnelsen kan fremstilles for å forlenge halveringstiden i sirkulasjonen for et spesifikt bindingsmiddelpolypeptid, eller de kan være utformet slik at de forbedrer målstyringsevnen for polypeptidet til ønskede celler, vev eller organer.

Oppfinnelsen omfatter videre bindingsmiddelderivater som er kovalent modifiserte slik at de omfatter tilkobling av én eller flere vannløselige polymerer, for eksempel polyetylenglykol, polyoksyetylenglykol eller polypropylenglykol, som beskrevet i US patentskrifter nr. 4640835, 4496689,4301144,4670417,4791192 og 4179337. Enda flere anvendbare polymerer som er kjente innen faget omfatter monometoksypolyetylenglykol, dekstran, cellulose og andre karbohydratbaserte polymerer, poly-(N-vinylpyrrolidon)-polyetylenglykol, propylenglykol-homopolymerer, en polypropylenoksid/etylenoksid-kopolymer, polyoksyetylerte polyoler (f.eks. glyserol) og polyvinylalkohol, så vel som blandinger av disse polymerer. Spesielt foretrukne er spesifikke bindingsmiddelprodukter som er kovalent modifisert med polyetylenglykol (PEG)-subenheter. Vannløselige polymerer kan være bundet til spesifikke posisjoner, for eksempel til aminoenden av de spesifikke bindingsmiddelproduktene, eller tilfeldig koblet til én eller flere sidekjeder i polypeptidet. Anvendelse av PEG for å forbedre spesifikke bindingsmidlers terapeutiske evne, og særlig for humaniserte antistoffer, beskrives i US patentskrift nr. 6133427, tilhørende Gonzales et al., tildelt 17. oktober 2000.

Målseter for antistoffmiitagenese

Visse strategier kan benyttes for å manipulere et Ang-2-spesifikt antistoffs iboende egenskaper, for eksempel antistoffets affinitet overfor sitt mål. Disse strategiene omfatter anvendelse av setespesifikk eller tilfeldig mutagenese av polynukleotidmolekylet som koder for antistoffet slik at det dannes antistoffvarianter, fulgt av et gjennomsøkingstrinn som er utformet slik at det gjenvinnes antistoffvarianter som viser den ønskede endring, f.eks. forhøyet eller redusert affinitet.

Aminosyrerestene som vanligvis endres i mutagenesestrategier er aminosyrerestene i CDR. Som beskrevet ovenfor inneholder disse områdene de aminosyrerester som faktisk interagerer md Ang-2 og andre aminosyrer som påvirker det rommelige arrangement av disse aminosyrerestene. Aminosyrer i rammeverksområdene i de variable områder utenfor CDR-områdene har imidlertid også blitt vist å bidra i vesentlig grad til antistoffets antigenbindende egenskaper, og disse kan mutageniseres for å manipulere slike egenskaper. Se Hudson, Curr Opin Biotech, 9:395-402 (1999).

Mindre biblioteker over antistoffvarianter som kan gjennomsøkes mer effektivt kan fremstilles ved å begrense den tilfeldige eller setestyrte mutagenese til seter i CDR som tilsvarer områder som er utsatt for "hyper-mutasjon" under den somatiske affinitetsmodningsprosess. Se Chowdhury og Pastan, Nature Biotech, 17: 568-572 [1999]. De typer av DNA-elementer som vites å definere hypermutasjonsseter på denne måte omfatter direkte og inverterte repitisjoner, visse konsensussekvenser, sekundærstrukturer og palindromer. Konsensus-DNA-sekvensene omfatter tetrabasesekvensen Purin-G-Pyirmidin-A/T (dvs. A eller G - G- C eller T-A eller T) og serinkodonet AGY (hvori Y kan være C eller T).

En utførelse av foreliggende oppfinnelse omfatter således mutagenesestrategier med det mål å forhøye et antistoffs affinitet overfor sitt mål. Disse strategiene omfatter mutagenese av hele den variable del av tungkjeden og lettkjeden, mutagenese av CDR-områdene alene, mutagenese av konsensus-hypermutasjonssetene i CDR, mutagenese av rammeverksområder eller enhver kombinasjon av disse tilnærminger ("mutagenese" kan i denne sammenheng være tilfeldig eller setestyrt). En endelig avgrensing av CDR-områdene og identifisering av aminosyrerester som utgjør antistoffets bindingssete kan oppnås ved å løse strukturen til antistoffet det gjelder samt antistoff-ligandkomplekset via teknikker som er kjente blant fagfolk, for eksempel røntgenkrystallografi. Forskjellige fremgangsmåter basert på analyse og karakterisering av slike antistoffkrystallstrukturer er kjente blant fagfolk og kan anvendes, om enn ikke på en avgjørende måte, for en tilnærmet avgrensing av CDR-områdene. Eksempler på slike vanlig anvendte fremgangsmåter omfatter Kabat-, Chothia-, AbM- og kontaktdefinisjonene.

Kabat-definisjonen bygger på sekvensvairabiliteten og er den mest vanlig anvendte definisjon for forutsigelsen av CDR-områder. [Johnson og Wu, Nucleic Acids Res, 28; 214-8

(2000)]. Chothia-definisjonen bygger på lokalisering av de strukturelle løkkeområder. [Chothia et al, J Mol Biol, 196:901-17 (1986), Chothia et al, Nature, 342: 877-83 (1989)]. AbM-definisjonen er et kompromiss mellom Kabat-definisjonen og Chothia-definisjonen. AbM er en integrert programpakke for antistoffstrukturmodellering fremstilt av Oxford Molecular Group [Martin et al., Proe Nati Acad Sei (USA) 86:9268-9272 (1989), Rees, et al, "ABM", en programpakke som modellerer forskjellige områder av antistoffer, Oxford, UK, Oxford Molecular, Ltd.]. AbM-programpakken modellerer et antistoffs tertiærstruktur ut fra primær-sekvensen ved anvendelse av en kombinasjon av kunnskapsdatabaser og ab-initiofremgangs-måter. Ytterligere en definisjon som betegnes kontaktdefinisjonen har nylig blitt innført.

[MacCallum et al, J Mol Biol, 5:732-45 (1996)]. Denne definisjon bygger på en analyse av de tilgjengelige komplekskrystallstrukturer.

Konvensjonelt betegnes CDR-områdene i tungkjeden typisk Hl, H2 og H3, og er nummerert i rekkefølge fra aminoenden til karboksyenden. CDR-områdene i lettkjeden betegnes typisk LI, L2 og L3 og er nummerert i rekkefølge fra aminoenden til karboksyenden.

CDR-H1 er tilnærmet 10 til 12 aminosyrerester lang og begynner typisk 4 aminosyrerester etter en Cys ifølge Chothia- og AbM-definisj onene eller typisk 5 aminosyrerester senere ifølge Kabat-definisjonen. Hl følges typisk av en typisk Trp, typisk Trp-Val, men også Trp-Ile, eller Trp-Ala. Lengden av Hl er tilnærmet 10 til 12 aminosyrerester-AbM-definisjonen, mens Chothia-definisjonen utelater de siste 4 aminosyrerestene.

CDR-H2 starter typisk 15 aminosyrerester etter enden av Hl ifølge Kabat- og AbM-definisjonen. Aminosyrerestene som ligger foran H2 er typisk Leu-Glu-Trp-Ile-Gly, men det finnes en rekke varianter. H2 følges typisk av aminosyresekvensen Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. Ifølge Kabat-definisjonen er lengden av H2 tilnærmet 16 til 19 aminosyrerester, mens AbM-definisj onen typisk utleder en lengde på 9 til 12 aminosyrerester.

CDR-H3 starter typisk 33 aminosyrerester etter enden av H2 og foreløpes typisk av aminosyresekvensen Cys-Ala-Arg. H3 følges typisk av aminosyresekvensen-Gly. Lengen av H3 kan være hva som helst mellom 3 og 25 aminosyrerester.

CDR-L1 starter typisk ved tilnærmet aminosyrerest 24 og vil typisk komme etter en Cys. Aminosyreresten etter CDR-L1 er alltid Trp og vil typisk begynne sekvensen Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln eller Trp-Tyr-Leu. Lengden av CDR-L1 er tilnærmet 10 til 17 aminosyrerester. Den straffende CDR-L1 for antistoffene ifølge oppfinnelsen følger dette mønster nøyaktig med en Cys-aminosyrerest fulgt av 15 aminosyrer og så Trp-Tyr-Gln.

CDR-L2 starter tilnærmet 16 aminosyrerester etter enden av LI. L2 vil typisk komme etter aminosyrerestene Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys eller Ile-Phe. Lengden av CDR-L2 er tilnærmet 7 aminosyrerester.

CDR-L3 starter typisk 33 aminosyrerester etter enden av L2 og kommer typisk etter en Cys. L3 etterfølges typisk av aminosyresekvensen Phe-Gly-XXX-Gly. Lengden av L3 er fra tilnærmet 7 til 11 aminosyrerester.

Forskjellige fremgangsmåter for modifisering av antistoffer er beskrevet innen faget. For eksempel beskriver U.S. Patentskrift nr. 5 530 101 (tilhørende Queen et al., 25. juni 1996) fremgangsmåter for fremstilling av humaniserte antistoffer hvori sekvensen til rammeverksområdet i tungkj edens variable område i det humaniserte immunglobulin er 65 % til 95 % identisk med sekvensen til rammeverket i det variable området i donorimmunglobulinets tungkjede. Hver av de humaniserte immunglobulinkjedene vil vanligvis i tillegg til CDR omfatte aminosyrer fra donorimmunglobulinets rammeverkområde, som for eksempel kan interagere med CDR for å påvirke bindingsaffiniteten, for eksempel én eller flere aminosyrer som ligger i umiddelbar nabostilling til CDR i donorimmunglobulinet eller aminosyrer som ligger innenfor en avstand på 3 ångstrøm, utledet ved molekylmodellering. Tungkjeden og lettkjeden kan begge utformes ved anvendelse av en rekke forskjellige posisjonskriterier. Ved kombinasjon av disse til et intakt antistoff vil de humaniserte immunglobulinene ifølge foreliggende oppfinnelse i det vesentlige være ikke-immunogene i mennesker og vil bibeholde i det vesentlige den samme affinitet som donorimmunglobulinet overfor antistoffet, for eksempel et protein eller en annen forbindelse som inneholder en epitop. Se også beslektede fremgangsmåter i U.S. Patentskrift nr. 5 693 761 tilhørende Queen et al, tildelt 2. desember 1997. ("Polynucleotides encoding improved humanized immunoglobulins"), U.S. Patentskrift nr. 5 693 762 tilhørende Queen et al, tildelt 2. desember 1997 ("Humanized Immunoglobulins") U.S. Patentskrift nr. 5 585 089 tilhørende Queen et al, tildelt 17. desember 1996 ("Humanized Immunoglobulins").

I et eksempel beskriver U.S. Patentskrift nr. 5 565 332 tilhørende Hoogenboom et al., tildelt 15. oktober 1996 ("Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach") fremgangsmåter for fremstilling av antistoffer og antistoff-fragmenter som har tilsvarende bindings-spesifisitet som et utgangsantistoff, men som har økende grad av humane egenskaper. Humaniserte antistoffer erholdes ved kjedestokking ved anvendelse av for eksempel bakteriofagfremvisnings-teknologi, og et polypeptid som omfatter et variabelt tungkjede- eller lettkjededomene fra et ikke-humant antistoff som er spesifikt for et antigen av interesse, kombineres med et repertoar av humane, komplementære, variable tungkjede- eller lettkjededomener. Hybridparing som er spesifikk for antigenet av interesse påvises, og humane kjeder fra de utvalgte par kombineres med et repertoar av humane, komplementære, variable domener (fra tungkjede eller lettkjede). I en annen utførelse kombineres en bestanddel av et CDR fra et ikke-humant antistoff med et repertoar av bestanddeler fra CDR fra humane antistoffer. Fra det resulterende bibliotek over antistoff-polypeptiddimerer utvelges hybrider og anvendes i et andre, humaniserende stokketrinn. Alternativt utelates dette andre trinn dersom hybridet allerede har tilstrekkelig grad av humane egenskaper til å være av terapeutisk verdi. Fremgangsmåter for modifisering for å øke graden av humane egenskaper beskrives også. Se også Winter, FEBS Letts 430:92-92 (1998).

Som et annet eksempel beskriver U.S. Patentskrift nr. 6 054 297 tilhørende Carter et al, tildelt 25. april 2000, en fremgangsmåte for fremstilling av humaniserte antistoffer ved å la en CDR-aminosyresekvens erstatte den tilsvarende, humane CDR-aminosyresekvens og/eller å la en rammeverksaminosyresekvens erstatte den tilsvarende, humane rammeverksaminosyresekvens.

Som et annet eksempel beskriver U.S. Patentskrift nr. 5 766 886 tilhørende Studnicka et al., tildelt 16. juni 1998 ("Modified antibody variable domains") fremgangsmåter for identifisering av de aminosyrerester i et variabelt antistoffdomene som kan modifiseres uten å redusere utgangsaffiniteten av det antigenbindende domenet, samtidig som immunogenisiteten når det gjelder heterologe arter reduseres, samt fremgangsmåter for fremstilling av disse modifiserte, variable antistoffdomenene som er anvendbare for tilførsel til heterologe arter. Se også U.S.

Patentskrift nr. 5 869 619 tilhørende Studnicka, tildelt 9. februar 1999.

Som diskutert, gjennomføres modifisering av et antistoff ved hvilken som helst av fremgangsmåtene som er kjente innen faget typisk slik at det oppnås forhøyet bindingsaffinitet overfor et antigen og/eller slik at antistoffets immunogenisitet i mottakeren reduseres. I en tilnærming kan humaniserte antistoffer modifiseres slik at glykosileringsseter fjernes for å øke antistoffets affinitet overfor det tilhørende antigen. [Co et al., Mol Immunol 30:1361-1367 (1993)]. Teknikker som "omforming", "hyperkimerisering" og "finéring/overflatemodifisering" har gitt humaniserte antistoffer med større terapeutisk potensiale. [Vaswami et al, Annals of Allergy, Asthma & Immunol 81:105 (1998): Roguska et al. Prot Engineer 9:895-904 (1996)]. Se også U.S. Patentskrift nr. 6 072 035 tilhørende Hardman et al, tildelt 6. juni 2000, som beskriver fremgangsmåter for omforming av antistoffer. Selv om disse teknikkene reduserer antistoffets immunogenisitet ved å redusere antall fremmede aminosyrerester, forhindrer de ikke antiidiotypiske og antiallotypiske responser etter gjentatt tilførsel av antistoffene. Alternativer til disse fremgangsmåtene for reduksjon av immunogenisiteten beskrives i Gilliland et al, J. Immunol 62(6): 3663-71 (1999).

I mange tilfeller fører humanisering av antistoffer til tap av antigenbindende evne. Det er derfor å foretrekke å "tilbakemutere" det humaniserte antistoff, slik at det omfatter én eller flere av aminosyrerestene som forefinnes i det opprinnelige antistoff (vanligvis et gnagerantistoff) i et forsøk på å gjendanne antistoffets bindingsaffinitet. Se for eksempel Saldanha et al. Mol Immunol 36:709-19 (1999).

Ikke- peptider som spesifikke bindingsmiddelanaloger/ proteinetterlignende forbindelser

Videre omfattes også spesifikke bindingsmiddelpeptidanaloger av ikke-peptidnatur som gir stabilisert struktur eller redusert biodegradering. Peptidetterlignende analoger av det spesifikke bindingsmiddel kan fremstilles basert på et utvalgt, inhibitorisk peptid ved å erstatte én eller flere aminosyrerester med ikke-peptidgrupper. Ikke-peptidgruppene tillater fortrinnsvis peptidet å opprettholde sin naturlige konformasjon eller vil stabilisere en foretrukket, for eksempel bioaktiv konformasjon som bibeholder evnen til å gjenkjenne og binde Ang-2.1 en utførelse viser den resulterende analog/det resulterende peptidetterlignende middel økt bindingsaffinitet for Ang-2. Et eksempel på fremgangsmåter for fremstilling av etterlignende analoger av ikke-peptidnatur fra spesifikke bindingsmiddelpeptider beskrives i Nachman et al, Regul Pept 57:359-370 (1995). Om ønskelig kan de spesifikke bindingsmiddelpeptidene være modifiserte, for eksempel ved glykolisering, amidering, karboksylering eller fosforylering eller ved dannelse av syreaddisjons-salter, amider, estere, fortrinnsvis C-terminale estere og N-acylderivater av peptidene ifølge oppfinnelsen. De spesifikke bindingsmiddelpeptidene kan også være modifisert slik at det dannes peptidderivater ved å danne kovalente eller ikke-kovalente komplekser med andre grupper. Kovalent sammenbundne komplekser kan fremstilles ved å koble de kjemiske gruppene til funksjonelle grupper på sidekjedene til aminosyrer som inngår i de spesifikke bindingsmiddelpeptidene eller til N- eller C-enden.

Nærmere bestemt forventes det at de spesifikke bindingsmiddelpeptidene kan konjugeres til en rapportørgruppe, innbefattet en radioaktivt merket gruppe, en fluorescensmerket gruppe, et enzym (for eksempel et enzym som katalyserer kolorimetrisk eller fluorometrisk reaksjon), et substrat, et fast støttemiddel eller et bærerstoff (for eksempel biotin eller avidin). Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig et molekyl som omfatter et antistoffmolekyl, hvori molekylet fortrinnsvis videre omfatter en rapportørgruppe utvalgt fra gruppen som består av en radioaktivt merket gruppe, en fluorescensmerket gruppe, et enzym, et substrat, et fast støttemiddel og et bærerstoff. Slike merkede grupper er velkjente blant fagfolk, for eksempel omfattes spesielt biotinmerking. Anvendelse av slik merking er velkjent blant fagfolk og beskrives i for eksempel U.S. Patentskrift nr. 3 817 837, U.S. Patentskrift nr. 3 850 752, U.S. Patentskrift nr. 3 996 345 og U.S. Patentskrift nr. 4 277 437. Andre merkede grupper som vil være anvendbare omfatter radioaktivt merkede grupper, fluorescensmerkede grupper og kjemiluminiscensmerkede grupper. U.S. patentskrifter som omfatter anvendelse av slik merking omfatter for eksempel U.S. Patentskrift nr. 3 817 837, U.S. Patentskrift nr. 3 850 752, U.S. Patentskrift nr. 3 939 350 og U.S. Patentskrift nr. 3 996 345. Ethvert av peptidene ifølge beskrivelsen kan omfatte én, to eller flere av hvilken som helst av disse merkede gruppene.

Fremgangsmåter for fremstilling av spesifikke bindingsmidler

Spesifikke bindingsmidler ifølge foreliggende oppfinnelse som er proteiner, kan fremstilles ved kjemisk syntese i løsning eller på et fast støttemiddel i samsvar med konvensjonelle teknikker. Dagens grense for syntese i fast fase er en lengde på tilnærmet 85-100 aminosyrer. Kjemiske synteseteknikker kan imidlertid ofte anvendes for kjemisk sammenligering av en serie av kortere peptider slik at det dannes polypeptider av full lengde. Forskjellige, automatiske syntese-instrumenter er kommersielt tilgjengelige og kan anvendes i samsvar med kjente fremgangsmåter. Se for eksempel Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. utgave, Pierce Chemical Co.,

(1984), Tam et al. J Am Chem Soc, 105:6442 (1983), Merrifield, Science, 232-341-347, (1986), og

Barany og Merrifield, The Peptides, Gross og Meienhofer, red. Academic Press, New York, 1-284, Barany et al, Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739 (1987), og U.S. Patentskrift nr. 5 424 398).

Fremgangsmåter for peptidsyntese i fast fase anvender et kopoly(styren-divinylbenzen) som inneholder fra 0,1-1,0 mM aminer/g polymer. Disse fremgangsmåtene for peptidsyntese anvender butyloksykarbonyl (t-BOC)- eller 9-fluorenylmetyloksykarbonyl (FMOC)-beskyttelse av alfa-aminogrupper. Begge fremgangsmåter omfatter trinnvis syntese hvori én enkelt aminosyre adderes i hvert trinn med start ved peptidets C-ende (se Coligan et al, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, enhet 9). Når den kjemiske syntese er fullført, kan det syntetiske peptid avbeskyttes ved at den aminosyreblokkerende gruppe t-BOC eller FMOC avspaltes fra polymeren ved behandling med syre ved redusert temperatur (for eksempel flytende HF-10 % anisol i fra tilnærmet 0,25 til tilnærmet 1 time ved 0 °C). Etter avdamping av reagensene ekstraheres de spesifikke bindingsmiddelpeptidene fra polymeren med 1 % eddiksyreløsning som så frysetørkes for erholdelse av et råmateriale. Dette kan normalt renses ved teknikker som gelfiltrering på Sefadex G-I5 ved anvendelse av 5 % eddiksyre som løsemiddel. Frysetørking av egnede fraksjoner fra kolonnen vil gi det homologe, spesifikke bindingsmiddelpeptid eller peptidderivat, som så kan karakteriseres ved standardteknikker som aminosyreanalyse, tynnsjiktskromatografi, høyytelsesvæskekromatografl, ultrafiolett absorpsjonsspektroskopi, molar rotasjon og løselighet, og kvantifiseres ved Edman-degradering i fast fase.

Kjemisk syntese av anti-Ang-2-antistoffer og derivater, varianter og fragmenter derav, så vel som andre proteinbaserte Ang-2-bindingsmidler tillater innføring av ikke-naturlig forekommende aminosyrer i middelet.

Rekombinant DNA-teknikker er en hendig fremgangsmåte for fremstilling av fullengde-antistoffer og andre, store, spesifikke bindingsmidler av proteinnatur ifølge foreliggende oppfinnelse eller fragmenter av disse. Et cDNA-molekyl som koder for antistoffet eller fragmentet kan innføres i en ekspresjonsvektor, som så kan innføres i en vertscelle for fremstilling av antistoffet eller fragmentet. Det bør forstås av cDNA som koder for slike antistoffer kan være modifisert, slik at det avviker fra det "opprinnelige" cDNA (translatert fra mRNA), slik at det oppnås kodondegenererthet eller at kodonpreferansebruk i forskjellige vertsceller tillates.

Generelt kan et DNA-molekyl som koder for et antistoff erholdes ved anvendelse av fremgangsmåter som beskrives heri i eksemplene. Dersom det er ønskelig å erholde Fab-molekyler eller CDR som er beslektet med det opprinnelige antistoffmolekyl, kan man gjennomsøke et egnet bibliotek (bakteriofagfremvisningsbibliotek, lymfocyttbibliotek osv.) ved anvendelse av standardteknikker for påvisning og kloning av beslektede Fab/CDR. Prober som anvendes for slik gjennomsøking kan være fullengde- eller avkortede Fab-prober som koder for Fab-delen av det opprinnelige antistoff, prober rettet mot ett eller flere CDR fra det opprinnelige antistoffs Fab-del eller andre egnede prober. Dersom DNA-fragmenter anvendes som prober, er typiske hybridiseringsbetingelser betingelsene som beskrives i Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press [1994]). Etter hybridiseringen kan det probede blot vaskes ved en egnet stringens, avhengig av faktorer som probestørrelse, forventet homologi mellom probe og klon, hva slags type bibliotek som gjennomsøkes og antall kloner som analyseres. Eksempler på gjennomsøking ved høy stringens er 0,1 X SSC og 0,1 prosent SDS ved en temperatur på mellom 0,1 prosent SDS ved en temperatur på mellom 50-65 °C.

En rekke ekspresjonsvektor/vertsystemer kan benytter for å inneholde og uttrykke polynukleotidmolekylene som koder for de spesifikke bindingsmiddelpolypeptidene ifølge oppfinnelsen. Disse systemene omfatter mikroorganismer som bakterier transformert med rekombinant bakteriofag-, plasmid- eller kosmid-DNA-ekspresjonsvektorer, gjær transformert med gjærekspresjonsvektorer, insektcellesystemer infisert med virusekspresjonsvektorer (for eksempel baculovirus), plantecellesystemer transfektert med virusekspresjonsvektorer (for eksempel blomkål-mosaikvirus CaMV, eller tobakkmosaikvirus, TMV) eller transformert med bakterieekspresjons-vektorer (for eksempel Ti- eller pBR322-plasmid) eller dyrecellesystemer.

Pattedyrceller som er anvendbare ved fremstilling av rekombinant spesifikt bindingsmiddelprotein omfatter VERO-celler, HeLa-celler, kinahamsterovarie (CHO)-cellelinjer, COS-celler (som COS-7), W138-celler, BHK-celler, HepG2-celler, 3T3-celler, RIN-celler, MDCK-celler, A549-celler, PC12-celler, K562-celler, og 293-celler, så vel som hybridomcellelinjer som beskrevet heri. Pattedyrceller foretrekkes for fremstilling av de spesifikke bindingsmidler, for eksempel antistoffer og antistoff-fragmenter, som typisk er glykosylerte og som krever korrekt gjenfolding for aktivitet. Foretrukne pattedyrceller omfatter CHO-celler, hybridomceller og myeloide celler.

Noen eksempler på fremgangsmåter for rekombinant ekspresjon av de spesifikke bindingsmiddelproteiner beskrives heri nedenfor.

Uttrykket "ekspresjonsvektor" viser til et plasmid, en bakteriofag, et virus eller en vektor for ekspresjon av et polypeptid fra en DNA (RNA)-sekvens. En ekspresjonsvektor kan omfatte en transkripsjonsenhet som omfatter en sammensetning av (1) ett eller flere genetiske elementer med en regulatorisk rolle i genekspresjonen, for eksempel promotere eller enhancere, (2) en strukturell enhet eller en sekvens som koder for bindingsmiddelet og som transkriberes til mRNA og translateres til protein, og (3) egnede transkripsjonsinitierings- og -terminerings-sekvenser. Strukturelle enheter ment for bruk i gjærekspresjonssystemer eller eukaryote ekspresjonssystemer omfatter fortrinnsvis en ledersekvens som tillater ekstracellulær sekresjon av translatert protein fra en vertscelle. Dersom det rekombinante spesifikke bindingsmiddelprotein uttrykkes uten en ledersekvens eller transportsekvens kan det alternativt omfatte en aminoterminal metioninrest. Denne rest kan eller kan ikke deretter avspaltes fra det uttrykte, rekombinante protein for erholdelse av et endelig spesifikt bindingsmiddelprodukt.

For eksempel kan de spesifikke bindingsmidlene uttrykkes rekombinant i gjær ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig ekspresjonssystem, for eksempel Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, CA), ifølge produsentens instruksjoner. Dette system bygger også på pre-pro-alfasekvensen for styring av sekresjonen, men transkripsjonen av innskuddet drives av alkoholoksidase (AOXl)-promoteren etter induksjon med metanol.

Det utskilte spesifikke bindingsmiddelpeptid renses fra gjærdyrkningsmediet ved f.eks. fremgangsmåtene som anvendes for rensing av peptidet fra supernatanter fra bakterieceller eller pattedyrceller.

Alternativt kan cDNA som koder for det spesifikke bindingsmiddelpeptid klones inn i baculovirusekspresjonsvektoren pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Denne vektor kan anvendes i samsvar med produsentens retningslinjer (PharMingen) for infeksjon av Spodoptera frugiperda-celler i proteinfritt sF9-medium for fremstilling av rekombinant protein. Det spesifikke bindingsmiddelprotein kan renses og oppkonsentreres fra mediet ved anvendelse av en heparin-Sepharose-kolonne (Pharmacia).

Alternativt kan peptidet uttrykkes i et insektsystem. Insektsystemer for proteinekspresjon er velkjente for fagfolk. I ett slikt system kan Autographa californica kjernepolyhedrosevirus (AcNPV) anvendes som vektor for ekspresjon av fremmede gener i Spodoptera frugiperda- celler eller i Trichoplusia larvae. Den kodende sekvens for det spesifikke bindingsmiddelpeptid kan klones inn i et ikke essensielt område i viruset, for eksempel i polyhedringenet, og plasseres under kontroll av polyhedrinpromoteren. Vellykket innsetting av det spesifikke bindingsmiddelpeptid vil gjøre polyhedringenet inaktivt og gi rekombinant virus som mangler kappeproteinkappen. De rekombinante virus kan anvendes for infeksjon av S. frugiperda- celler eller Trichoplusia larvae, hvor peptidet vil uttrykkes [Smith et al., J Virol 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proe Nat Acad Sei (USA) 91: 3224-7 (1994)].

I et annet eksempel kan DNA-sekvensen som koder for det spesifikke bindingsmiddelpeptid amplifiseres ved PCR og klones inn i en egnet vektor, for eksempel pGEX-3X (Pharmacia). pGEX-vektoren er utformet for dannelse av et fusjonsprotein som omfatter glutation-S-transferase (GST), som kodes av vektoren, og et spesifikt bindingsmiddelprotein som kodes av et DNA-fragment som er innsatt i vektorens kloningssete. PCR-primere kan utformes slik at de for eksempel omfatter et egnet kuttesete. Dersom spesifikt bindingsmiddel-fusjonsgruppen kun anvendes for å lette ekspresjonen eller på annet vis ikke er ønsket tilkoblet til peptidet av interesse kan det rekombinante spesifikt bindingsmiddel-fusjonsprotein så avspaltes fra fusjonsproteinets GST-del. pGEX-3X/spesifikt bindingsmiddelpeptid-konstruksjonen transformeres inn i E. coli XL-1 Blue-celler (Stratagene, La Jolla CA), og enkelttransformanter isoleres og dyrkes. Plasmid-DNA fra enkelttransformanter kan renses og delvis sekvenseres ved anvendelse av et automatisert sekvenseringsinstrument for å bekrefte nærvær av nukleinsyreinnskuddet som koder for det ønskede spesifikke bindingsmiddel i korrekt orientering.

Ekspresjon av polynukleotider som koder for anti-Ang-2-antistoffer og fragmenter av disse ved anvendelse av de rekombinante systemene som beskrives ovenfor kan føre til dannelse av antistoffer eller fragmenter av slike som må "gjenfoldes" (for korrekt dannelse av forskjellige disulfidbroer) for å være biologisk aktivt. Typiske gjenfoldings rfemgangsmåter for slike antistoffer gis i eksemplene heri og i den påfølgende seksjon.

Spesifikke bindingsmidler fremstilt i bakterieceller som danner uløselige inklusjonslegemer i bakteriene kan renses som følger: vertscellene kan høstes ved sentrifugering, vaskes med 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA og behandles med 0,1 mg/ml lysozym (Sigma, St. Louis, MO) i 15 minutter ved romtemperatur. Lysatet kan klarnes ved ultralyd-behandling, og cellerester kan nedsentrifugeres i 10 minutter ved 12000 X g. Nedsentrifugert materiale som inneholder det spesifikke bindingsmiddel kan resuspenderes i 50 mM Tris, pH 8, 10 mM EDTA, legges over 50 % glyserol og sentrifugeres i 30 minutter ved 6000 X g. Nedsentrifugerte materiale kan resuspenderes i en standardløsning av fosfatbufret saltvann (PBS) uten Mg<++>og Ca"<1-1>". Det spesifikke bindingsmiddel kan renses videre ved å fraksjonere det resuspenderte materiale i en denaturerende SDS-polyakrylamidgel (Sambrook et al., supra). Gelen kan behandles med 0,4 M KC1 for synliggjøring av proteinet, som så kan utkuttes og elektroelueres i elektroforesebuffer uten SDS. Dersom GST-fusjonsproteinet fremstilles i bakterier som et løselig protein kan det renses ved anvendelse av GST Purification Module (Pharmacia).

Pattedyrvertssystemer for ekspresjon av det rekombinante protein er velkjente blant fagfolk. Vertscellestammer kan utvelges for en spesiell evne til å prosessere det uttrykte protein eller innføre visse posttranslasjonelle modifikasjoner som vil være nyttige for erholdelse av proteinaktivitet. Slike modifikasjoner av polypeptidet omfatter acetyleiing, karboksylering, glykosylering, fosforylering, lipidering og acylering. Forskjellige vertsceller som cellelinjene CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, samt hybridomcellelinjer og lignende har spesifikke cellemaskinerier og karakteristiske mekanismer for slike posttranslasjonelle aktiviteter og kan velges slik at det sikres korrekt modifisering og prosessering av det innførte fremmede protein.

En rekke seleksjonssystemer kan anvendes for gjenvinning av celler som er transformert for rekombinant proteinproduksjon. Slike seleksjonssystemer omfatter genene for HSV tymidinkinase, hypoksantin-guaninfosforibosyltransferase og adeninfosforibosyltransferase i tk~-, hgprt"- hhv. aprf-celler. Videre kan antimetabolitt resistens anvendes som grunnlag for seleksjon for DHFR, som gir resistens overfor metotrexat, gpt, som gir resistens overfor mykofenolsyre, neo, som gir resistens overfor aminoglykosidet G418 og gir resistens overfor klorsulfuron, og hygro, som gir resistens overfor hygromycin. Ytterligere seleksjonsgener som kan være anvendbare omfatter trpB, som tillater cellene å benytte indol istedenfor tryptofan, eller hisD, som tillater cellene å benytte histinol istedenfor histidin. Markører som gir en visuell anvisning for påvisning av transformanter omfatter anthocyaniner, (5-glucuronidase og dets substrat GUS, og luciferase og dets substrat luciferin.

Rensing og gjenfolding av spesifikke bindingsmidler

I visse tilfeller kan de spesifikke bindingsmidler som dannes ved anvendelse av fremgangsmåter som beskrevet ovenfor trenge "gjenfolding" og oksidasjon til en korrekt tertiær struktur og dannelse av disulfidbroer for å være biologisk aktive. Gjenfolding kan oppnås ved anvendelse av en rekke fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Slike fremgangsmåter omfatter for eksempel behandling av det solubiliserte polypeptidmiddel med en pH som vanligvis er over 7 i nærvær av et kaotropt middel. Valget av kaotropt middel tilsvarer valg av middel for solubilisering av inklusjonslegemer, imidlertid anvendes typisk et kaotropt middel i lavere konsentrasjon. Et eksempel på et kaotropt middel er guanidin. I de fleste tilfeller vil gjenfoldings-/oksidasjonsløsningen også inneholde et reduksjonsmiddel pluss dettes oksiderte form i et spesifikt forhold, for dannelse av et gitt redokspotensiale som tillater disulfid-stokking for dannelse av systeinbroer. Noen vanlig anvendte redoks-par omfatter cystein/cystamin, glutation/ditiobisGSH, kobber(II)klorid, ditiothreitol DTT/ditian DTT, og 2-merkaptoetanol (bME)/ditio-bME. I mange tilfeller kan et koløsemiddel anvendes for å øke gjenfoldings-effektiviteten. Vanlig anvendte koløsemidler omfatter glyserol, polyetylenglykol med forskjellig molekylvekt og arginin.

Det vil være ønskelig å rense spesifikke bindingsmiddelproteiner eller varianter av disse ifølge foreliggende oppfinnelse. Proteinrenseteknikker er velkjente blant fagfolk. Disse teknikkene omfatter på ett nivå råfraksjonering av polypeptid- og ikke-polypeptidfraksjoner. Etter separasjon av det spesifikke bindingsmiddelpolypeptid fra andre proteiner kan polypeptidet av interesse renses videre ved anvendelse av kromatografiske og elektroforetiske teknikker for å oppnå delvis eller fullstendig rensing (eller rensing til homogenitet). Analytiske fremgangsmåter som er spesielt godt egnet for fremstilling av et rent spesifikt bindingsmiddel er ionebytterkromatografi, eksklusjonskromatografi, polyakrylamidgelelektroforese og isoelektrisk fokusering. En spesielt effektiv fremgangsmåte for rensing av peptider er hurtig proteinvæske-kromatografi eller til og med HPLC.

Visse utførelser av foreliggende oppfinnelse gjelder rensingen, og i visse utførelser den vesentlige rensingen, av et kodet spesifikt bindingsmiddelprotein eller -peptid. Uttrykket "renset spesifikt bindingsmiddelprotein eller -peptid" som anvendt heri er ment å vise til en sammensetning som kan isoleres fra andre bestanddeler, hvori det spesifikke bindingsmiddelprotein eller -peptid er renset i en viss grad relativt til den naturlig erholdbare tilstand. Et renset spesifikt bindingsmiddelprotein eller -peptid viser derfor også til et spesifikt bindingsmiddelprotein eller - peptid som er frigjort fra det miljø som det naturlig forekommer i.

Generelt vil "renset" vise til et spesifikt bindingsmiddelpreparat som har blitt fraksjonert for å fjerne visse andre bestanddeler og som i vesentlig grad bibeholder den uttrykte biologiske aktivitet. Dersom uttrykket "i vesentlig grad renset" anvendes vil denne betegnelse vise til et spesifikt bindingsmiddelpreparat i hvilket det spesifikke bindingsmiddelprotein eller -peptid utgjør hovedandelen av preparatet, for eksempel tilnærmet 50 %, tilnærmet 60 %, tilnærmet 70 %, tilnærmet 80 %, tilnærmet 90 %, tilnærmet 85 % eller mer av proteinene i preparatet.

Forskjellige fremgangsmåter for kvantifisering av rensegraden av det spesifikke bindingsmiddel vil være kjente blant fagfolk i lys av den foreliggende beskrivelse. Disse omfatter for eksempel bestemmelse av den spesifikke bindingsaktivitet av en aktiv fraksjon eller å anslå mengden spesifikt bindingsmiddelpolypeptid i en fraksjon ved SDS/PAGE-analyse. En foretrukket fremgangsmåte for anslåelse av renheten av en spesifikk bindingsmiddelfraksjon er å beregne fraksjonens bindingsaktivitet og sammenligne denne med bindingsaktiviteten til det opprinnelige ekstrakt, og således beregne rensingsgraden, heri angitt ved et "gangers rensetall". De faktiske enheter som anvendes for å representere mengden av bindingsaktivitet vil naturligvis avhenge av den spesielle analyseteknikk som velges for å følge rensingen og hvorvidt det uttrykte spesifikke bindingsmiddelprotein eller -peptid viser en påvisbar bindingsaktivitet.

Forskjellige teknikker som er egnede for anvendelse ved rensing av spesifikt bindingsmiddelprotein vil være velkjente blant fagfolk. Disse omfatter for eksempel utfelling med ammoniumsulfat, PEG, antistoffer (immunutfelling) og lignende eller ved varme-denaturering, fulgt av sentrifugering, kromatografitrinn som affinitetskromatografi (f.eks. Protein-A- Sepharose) ionebytterkromatografi, gelfiltrering, revers fasekromatografi, hydroksyl-apatittkromatografi og affinitetskromatografi, isoelektrisk fokusering, gelelektroforese og kombinasjoner av slike og andre teknikker. Som generelt kjent innen faget antas det at rekkefølgen som de forskjellige rensetrinn utføres i kan endres og at visse trinn kan utelates, og at dette fortsatt vil føre til en egnet fremgangsmåte for fremstilling av et i det vesentlige renset spesifikt bindingsmiddel.

Det foreligger intet generelt krav om at det spesifikke bindingsmiddel alltid må tilveiebringes i den mest rensede tilstand. Man tenker seg faktisk at mindre vesentlig rensede spesifikke bindingsmiddelprodukter vil finne anvendelse i visse utførelser. En delvis rensing kan oppnås ved anvendelse av færre rensetrinn i kombinasjon eller ved benyttelse av forskjellige former av det samme generelle renseskjema. For eksempel anses det at en kationbytter-kolonnekromatografi utført ved benyttelse av et HPLC-apparat generelt vil føre til høyere grads rensing enn den samme teknikk ved anvendelse av et lavtrykkskromatografisystem. Fremgangsmåter som viser lavere grad av relativ rensing kan by på fordeler når det gjelder total gjenvinning av spesifikt bindingsmiddelproteinprodukt eller for opprettholdelse av bindingsaktivitet av et uttrykt spesifikt bindingsmiddelprotein.

Det er kjent at migrasjonen av et polypeptid kan variere, noen ganger signifikant, ved forskjellige betingelser for SDS/P AGE [Capaldi et al., Biochem Biophys/Res Comm, 76:425

(1977)]. Det vil derfor forstås at den tilsynelatende molekylvekt av rensede eller delvis rensede spesifikke bindingsmiddelekspresjonsprodukter kan variere under forskjellige elektroforese-betingelser.

Bindingsanalyser

Immunologiske bindingsanalyser benytter typisk et innfangingsmiddel for spesifikk binding til og ofte immobilisering av målantigenet i analytten. Innfangingsmiddelet er en gruppe som spesifikt bindes til analytten. I én utførelse av foreliggende oppfinnelse er innfangingsmidlet et antistoff eller et antistoffragment som spesifikt bindes til Ang-2. Disse immunologiske bindingsanalysene er velkjente innen faget [se Asai, red. Methods in Cell Biology, bind 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)].

Immunologiske bindingsanalyser benytter hyppig et merkingsmiddel som vil signalisere forekomsten av det bundne kompleks som dannes av innfangingsmidlet og antigenet. Merkingsmidlet kan være et av molekylene som utgjør det bundne kompleks, dvs. at det kan være merket spesifikt bindingsmiddel eller et merket anti-spesifikt bindingsmiddelantistoff. Alternativt kan merkingsmidlet være et tredje molekyl, ofte et annet antistoff, som bindes til bindingskomplekset. Det merkede middel kan for eksempel være et anti-spesifikt bindingsmiddelantistoff som bærer en merket gruppe. Det sekundære antistoff som er spesifikt for bindingskomplekset kan mangle en merket gruppe, men være bundet til et fjerde molekyl som er spesifikt for antistofftypen som sekundærantistoffet er medlem av. For eksempel kan sekundærantistoffet være modifisert med en påvisbar gruppe, for eksempel biotin, som så kan bindes av et fjerde molekyl, for eksempel enzymmerket streptavidin. Andre proteiner som spesifikt kan binde konstante immunglobulinområder, for eksempel protein A eller protein G, kan også anvendes som merkingsmiddel. Disse bindende proteinene er normale bestanddeler av celleveggen til streptokokkbakterier og viser en kraftig ikke-immunogen reaktivitet med konstante immunglobulinområder fra en rekke arter [se generelt Akerstrom, J Immunol, 135:2589-2542 (1985); og Chaubert, Mod Pathol, 10:585-591 (1997)].

I analysene kan det være nødvendig med inkubasjonstrinn og/eller vasketrinn etter hver sammenblanding av reagenser. Inkubasjonstrinnene kan variere fra tilnærmet 5 sekunder til flere timer, fortrinnsvis fra tilnærmet 5 minutter til tilnærmet 24 timer. Inkubasjonstiden vil imidlertid avhenge av analyseformatet, analytten, løsningens volum, konsentrasjoner og lignende. Analysene vil vanligvis utføres ved romtemperatur, selv om de kan utføres over et gitt temperaturområde.

A. Ikke- konkurrerende bindingsanalyser:

Immunologiske bindingsanalyser kan være av ikke-konkurrerende type. Disse analysene har en mengde innfanget analytt som måles direkte. I én foretrukket "sandwich"-analyse kan for eksempel innfangingsmidlet (antistoffet) være bundet til et fast støttemiddel som immobiliserer det. Disse immobiliserte antistoffene vil så innfange (bindes til) antigen som foreligger i analyseprøven. Det således immobiliserte protein bindes så til et merkingsmiddel, for eksempel et sekundærantistoff med en merket gruppe. I en annen foretrukket "sandwich"-analyse mangler sekundærantistoffet en merket gruppe, men kan bindes av et merket antistoff som er spesifikt for antistoffer fra den art som sekundærantistoffet er avledet fra. Sekundærantistoffet kan også være modifisert med en påvisbar gruppe, for eksempel biotin, til hvilken et tredje merket molekyl spesifikt kan bindes, for eksempel streptavidin. [Se Harlow og Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, kap. 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988)].

B. Konkurransebindingsanalyser:

Immunologiske bindingsanalyser kan være av konkurransetype. Mengden analytt som foreligger i prøven måles indirekte ved å måle mengden av en tilsatt analytt som forskyves eller utkonkurreres fra et innfangingsmiddel ved analytten som foreligger i prøven. I én foretrukket konkurransebindingsanalyse tilsettes en kjent mengde analytt, vanligvis merket, til prøven, og prøven settes så i forbindelse med et antistoff (innfangingsmidlet). Mengden merket analytt som er bundet til antistoffet er invers proporsjonal med konsentrasjonen av analytt som foreligger i prøven. (Se Harlow og Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, kap. 14, s. 579-583, supra).

I en annen foretrukket konkurransebindingsanalyse er antistoffet immobilisert til et fast støttemiddel. Mengden protein som bindes til antistoffet kan bestemmes enten ved å måle mengden protein som foreligger i et protein/antistoffkompleks, eller alternativt ved å måle mengden gjenværende, ikke kompleksbundet protein. Proteinmengden kan bestemmes ved tilsetning av et merket protein. Se Harlow og Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, kap. 14, supra.

Nok en foretrukket konkurransebindingsanalyse, hapteninhibering, benyttes. Her er en kjent analytt immobilisert til et fast støttemiddel. En kjent mengde antistoff tilsettes til prøven, og prøven settes i forbindelse med den immobiliserte analytt. Mengden antistoff som bindes til den immobiliserte analytt er invers proporsjonal med mengden analytt som foreligger i prøven. Mengden immobilisert antistoff kan bestemmes ved å måle enten den immobiliserte antistoffraksjon eller fraksjonen som forblir i løsning. Påvisningen kan være direkte dersom antistoffet er merket eller indirekte, ved påfølgende tilsetning av en merket gruppe som spesifikt bindes til antistoffet som beskrevet ovenfor.

C. Benyttelse av konkurransebindingsanalvser:

Konkurransebindingsanalysene kan anvendes for kryssreaktivitetsbestemmelse slik at en erfaren fagperson kan fastslå hvorvidt et protein eller enzymkompleks som gjenkjennes av et spesifikt bindingsmiddel ifølge oppfinnelsen er det ønskede protein og ikke et kryssreagerende protein, eller for å fastslå hvorvidt antistoffet er spesifikt for antigenet og ikke bindes til ubeslektede antigener. I analyser av denne typen kan antigenet være immobilisert til et fast støttemiddel, og en ukjent proteinblanding som konkurrerer med binding av de spesifikke bindingsmidlene til det immobiliserte protein tilsettes til analysen. Det konkurrerende molekyl bindes også til ett eller flere antigener som ikke er beslektet med antigenet. Proteinenes evne til å konkurrere med binding av de spesifikke bindingsmiddelantistoffene til det immobiliserte antigen sammenlignes med binding av det samme protein som var immobilisert til det faste støttemiddel for å bestemme kryssreaktiviten av proteinblandingen.

D. Andre bindingsanalyser:

Foreliggende beskrivelse omtaler også Western-blottingsfremgangsmåter for påvisning eller kvantifisering av nærvær av Ang-2 i en prøve. Teknikken omfatter generelt separasjon av prøveproteiner ved gelelektroforese basert på molekylvekt og overføring av proteinene til et egnet fast støttemiddel, for eksempel et nitrocellulosefilter, et nylonfilter eller et derivatisert nylonfilter. Prøven inkuberes med antistoffer eller antistoffragmenter som spesifikt bindes til Ang-2, og det resulterende kompleks påvises. Disse antistoffene kan være direkte merket, eller de kan eventuelt påvises etterpå ved anvendelse av merkede antistoffer som spesifikt bindes til antistoffet.

Bindingsanalyser for påvisning av Ang-2-spesifikke bindingsmidler som forstyrrer binding av Ang-2 til dets reseptor gis i eksemplene heri.

Diagnostiske analyser

Antistoffene eller antistoffragmentene ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendbare for diagnose av tilstander eller sykdommer som særpreges ved ekspresjon av Ang-2 eller Ang-2 - subenheter, eller analyser for oppfølging av pasienter som behandles med indusere av Ang-2 eller Ang-2-fragmenter, eller agonister eller inhibitorer av Ang-2-aktivitet. Diagnostiske analyser for Ang-2 omfatter fremgangsmåter som benytter et spesifikt bindingsmiddel og en merket gruppe for påvisning av Ang-2 i humane kroppsvæsker eller ekstrakter av celler eller vev. De spesifikke bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes med eller uten modifisering. I en foretrukket diagnostisk analyse vil de spesifikke bindingsmidlene være merket ved tilkobling av for eksempel en merket gruppe eller et rapportørmolekyl. Et bredt utvalg av merkede grupper og rapportørmolekyler er kjente, og noen av disse er allerede beskrevet heri. Nærmere bestemt er foreliggende oppfinnelse anvendbar for diagnose av sykdom hos mennesker.

En rekke fremgangsmåter for måling av Ang-2-proteiner ved anvendelse av enten polyklonale eller monoklonale antistoffer som er spesifikke for det angjeldende protein er kjente innen faget. Eksemplene omfatter enzymkoblet immunadsorpsjonsanalyse (ELISA), radioimmunanalyse (RIA) og fluorescensaktivert cellesortering (FACS). En toseters immunanalyse basert på monoklonale antistoffer som reagerer med to ikke-interfererende epitoper på Ang-2 foretrekkes, men en konkurransebindingsanalyse kan benyttes. Disse analysene beskrives for eksempel i Maddox et al., J Exp Med. 158:1211 [1983].

For å danne et grunnlag for diagnosen etableres vanligvis normale verdier eller standardverdier for human Ang-2-ekspresjon. Denne bestemmelsen kan oppnås ved å sammenblande kroppsvæsker eller celleekstrakter for normale individer, fortrinnsvis mennesker, med et spesifikt bindingsmiddel, for eksempel et antistoff, mot Ang-2 under betingelser som er egnede for kompleksdannelse, som velkjent innen faget. Mengden standardkompleksdannelse kan kvantifiseres ved å sammenligne bindingen av de spesifikke bindingsmidlene til kjente mengder Ang-2-protein med både kontrollprøver og sykdomsprøver. Standardverdiene som erholdes fra normale prøver kan så sammenlignes med verdier erholdt fra prøver fra individer som muligens lider av sykdom. Avvik mellom standardverdier og verdier fra slike individer kan tyde på en rolle for Ang-2 i sykdomstilstanden.

For diagnostiske anvendelser vil i visse utførelser spesifikke bindingsmidler være merket med en påvisbar gruppe. Den påvisbare gruppen kan være hvilken som helst gruppe som enten direkte eller indirekte kan gi et påvisbart signal. Den påvisbare gruppen kan for eksempel være en radioaktiv isotop, for eksempel H, C, P, S eller I, en fluorescerende eller kjemiluminiscerende forbindelse som fluoresceinisotiocyanat, rhodamin eller luciferin, eller et enzym som alkalisk fosfatase, (3-galaktosidase eller pepperrot-peroksidase [Bayer et al, Meth Enz, 184: 138-163, (1990)].

Sykdommer

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et spesifikt bindingsmiddel som bindes til Ang-2 og som er anvendbar for bruk ved behandling av sykdommer og patologiske tilstander hos mennesker. Midler som modulerer Ang-2-bindende aktivitet eller annen cellulær aktivitet kan anvendes i kombinasjon med andre terapeutiske midler for å forsterke de terapeutiske virkningene eller redusere mulige bivirkninger.

I én utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse reagenser og fremgangsmåter som er anvendbare for behandling av sykdommer og tilstander som særpreges ved et uønsket eller avvikende Ang-2-aktivitetsnivå i en celle. Disse sykdommene omfatter forskjellige kreftformer og andre hyperproliferative tilstander som hyperplasi, psoriasis, kontaktdermatitt, immunologiske forstyrrelser og ufruktbarhet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også anvendelse av et antistoff for fremstilling av et medikament for behandling av kreft i et dyr, innbefattet mennesker, som omfatter tilførsel til dyret av en effektiv mengde av et spesifikt bindingsmiddel som inhiberer eller reduserer Ang-2-aktiviteten. Oppfinnelsen er videre rettet mot anvendelse av et antistoff for fremstilling av et medikament for inhibering av kreftcellevekst, innbefattet prosesser for cellulær proliferasjon, invasivitet og metastase i biologiske systemer. Medikamentet benyttes fortrinnsvis for å inhibere eller redusere kreftcellevekst, invasivitet, metastase eller tumorforekomst hos levende dyr, for eksempel pattedyr. Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan lett tilpasses anvendelse i analyse-systemer, for eksempel analyse av kreftcellevekst og vekstegenskapene, så vel som for påvisning av forbindelser som påvirker kreftcellevekst.

Kreftformer som kan behandles med medikamentet ifølge foreliggende oppfinnelse opptrer fortrinnsvis hos pattedyr. Pattedyr omfatter for eksempel mennesker og andre primater, så vel som kjeledyr eller ledsagerdyr som hunder og katter, laboratoriedyr som rotter, mus og kaniner, og husdyr som hest, gris, sau og storfe.

Tumorer eller neoplasmer omfatter utvekster av vevsceller i hvilke celleoppformeringen er ukontrollert og progressiv. Noen slike utvekster er godartede, mens andre betegnes ondartede og kan føre til organismens død. Ondartede neoplasmer eller cancere skiller seg fra godartede utvekster ved at de i tillegg til å vise aggressiv cellulær proliferasjon kan invadere omliggende vev og metastasere. Ondartede neoplasmer særpreges videre ved at de viser større tap av differensiering (høyere grad av dedifferensiering) og av relativ organisering mellom cellene og de omliggende vev. Denne egenskap kalles også "anaplasi".

Neoplasmer som kan behandles ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også faste tumorer, dvs. karsinomer og sarkomer. Karsinomer omfatter ondartede neoplasmer avledet fra epitelceller som infiltrerer (invaderer) omliggende vev og gir opphav til metastaser. Adenokarsinomer er karsinomer som er avledet fra kjertelvev eller som danner gjenkjennbare kjertelstrukturer. En annen bred klasse av kreftformer omfatter sarkomer, som er tumorer hvis celler er innbakt i en fibrillær eller homogen substans, for eksempel embryonalt bindevev. Oppfinnelsen tillater også behandling av kreftformer i myeloidsystemet eller lymfoidsystemet, innbefattet leukemier, lymfomer og andre kreftformer som typisk ikke danner en tumormasse, men som er fordelt i karsystemet eller det lymforetikulære system.

Typene av kreftceller eller tumorceller som er følsomme for behandling ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter for eksempel ACTH-dannende tumor, akutt lymfocytisk leukemi, akutt ikke-lymfocytisk leukemi, kreft i binyrebark, blærekreft, hjernekreft, brystkreft, cervixkreft, kronisk lymfocytisk leukemi, kronisk myelocytisk leukemi, colorektal kreft, kutan T-cellelymfom, endometriumkreft, spiserørskreft, Erwings sarkom, galleblærekreft, hårcelleleukemi, kreft i hode og hals, Hodgkins lymfom, Kaposis sarkom, nyrekreft, leverkreft, lungekreft (small og non-small celle), ondartet peritoneal effusjon, ondartet pleural effusjon, melanom, mesoteliom, multippel myelom, nevroblastom, gliom, non-Hodgkins lymfom, osteosarkom, ovariekreft, ovarie- (kimcelle)-kreft, bukspyttkjertelkreft, peniskreft, prostatakreft, retinoblastom, hudkreft, mykvevssarkom, skvamocellekarsinomer, magekreft, testikkelkreft, skjoldkjertelkreft, tropoblastiske neoplasmer, uteruskreft, vaginakreft, vulvakreft og Wilms tumor.

Oppfinnelsen illustreres spesielt heri ved henvisning til behandling av visse typer av eksperimentelt definerte kreftformer. I disse illustrerende behandlingene har det blitt benyttet in vitro- og in v/vo-standardmodeller ifølge teknikkens stand. Disse fremgangsmåtene kan anvendes for påvisning av midler som kan forventes å være effektive i behandlingsskjemaer in vivo. Kreftformer hvis invasivitet eller metastase er forbundet med Ang-2-ekspresjon eller -aktivitet er spesielt følsomme for inhibering eller til og med induksjon til regresjon ved hjelp av oppfinnelsen,

Oppfinnelsen kan også utføres ved å kombinere et spesifikt bindingsmiddel ifølge oppfinnelsen, for eksempel et antistoff, med et annet kjemoterapeutisk antikreftmiddel, for eksempel ethvert konvensjonelt kjemoterapeutisk middel for femstilling av et medikament. Kombinasjonen av et spesifikt bindingsmiddel og andre midler kan forsterke den kjemoterapeutiske behandlingsmåte. Ethvert kjemoterapeutisk middel kan anvendes, innbefattet alkylerende midler, antimetabolitter, hormoner og antagonister, radioaktive isotoper samt naturprodukter. For eksempel kan forbindelsen ifølge oppfinnelsen tilføres sammen med antibiotika som doxorubicin og andre antrasyklinanaloger, nitrogenmustarder som syklofosfamid, pyrimidinanaloger som 5-fluoruracil, cisplatin, hydroksyurea, taxol og naturlige og syntetiske taxolderivater og lignende. Som et annet eksempel kan forbindelsen når det gjelder blandede tumorer, for eksempel adenokarsinom i brystet, hvor tumorene omfatter gonadotropinavhengige og gonadatropinuavhengige celler, tilføres sammen med leuprolid eller goserelin (syntetiske peptidanaloger av LH-RH). Andre antineoplastiske behandlingsformer omfatter anvendelse av en tetrasyklinforbindelse sammen med en annen behandlingsform, f.eks. kirurgisk behandling, strålebehandling osv., også betegnet heri "komplementerende antineoplastiske behandlingsformer". Medikamentet ifølge oppfinnelsen kan således anvendes sammen med slike konvensjonelle behandlingsformer og gi den fordel at bivirkningene reduseres og effektiviteten forsterkes.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således preparater som er anvendbare for behandling av et bredt utvalg av kreftformer, innbefattet faste tumorer og leukemier. Krefttyper som kan behandles omfatter: adenokarsinom i bryst, prostata og colon, alle former for bronkogene karsinomer i lunge, myeloid, melanom, hepatom, nevroplastom, papillom, apudom, koristom, brankiom, ondartet karsinoid syndrom, karsinoid hjertesykdom, karsinom (f.eks. Walkers karsinom, basalcellekarsinom, basoskvamøs karsinom, Brown-Pearce-karsinom, duktal karsinom, Ehrlich tumorkarsinom, Krebs 2-karsinom, merkelcellekarsinom, mukøs karsinom, "non-small ceH"-lungekarsinom, oat cell-karsinom, papillært karsinom, skirrus karsinom, bronkiolært karsinom, bronkogent karsinom, skvamocellekarsinom og transisjonscellekarsinom), histiocytiske forstyrrelser, leukemi, ondartet histiocytosis, Hodgkins sykdom, immunproliferativ small lung cell-karsinom, non-Hodgkins lymfom, plasmacytom, reticuloendoteliose, melanom, kondroblastom, kondrom, kondrosarkom, fibrom, fibrosarkom, kjempecelletumorer, histiocytom, lipom, liposarkom, mesoteliom, myxom, myxosarkom, osteom, osteosarkom, kordom, kraniofaryngiom, dysgerminom, hamartom, mesenchymon, mesonefrom, myosarkom, ameloblastom, cementom, odontom, teratom, tymom, tofoblastisk tumor. Videre kan de påfølgende krefttyper også behandles: adenom, cholangiom, kolesteatom, syklindrom, cystadenokarsinom, cystadenom, granulosacelletumor, gynandroblastom, hepatom, hidradenom, øycelletumor, Leydig-celletumor, papillom, Sertoli-celletumor, tekacelletumor, leiomyom, leiomyosarkom, myoblastom, myom, myosarkom, rhabdomyom, rhabodmyosarkom, ependymom, ganglionevron, gliom, medulloblastom, meningiom, nevrilemmom, nevroblastom, nevroepitelom, nevrofibrom, nevrom, paragangliom, ikke-kromaffin-paragangliom, angiokeratom, angiolymfoidhyperplasi med eosinofili, sklerøs angiom, angiomatose, glomangiom, hemangioendoteliom, hemangion, hemangiopericytiom, hemangiosarkom, lymfangiom, lymfangiommyom, lymfangiosarkom, pinealom, karsinosarkom, kondrosarkom, cystosarkoma phyllodes, fibrosarkom, hemangiosarkom, leiomyosarkom, leukosarkom, liposarkom, lymfangiosarkom, myosarkom, myxosarkom, ovariekarsinom, rhabdomyosarkom, sarkom, neoplasmer, nevrofibromatose og cervix dysplasi.

En annen utførelse av foreliggende oppfinnelse er anvendelse av materialene ifølge foreliggende oppfinnelse for forebyggelse og/eller behandling av en hyperproliferativ tilstand i huden, innbefattet psoriasis, kontaktdermatitt og andre hyperproliferative sykdommer. Det har blitt vist at pasienter med psoriasis og kontaktdermatitt har forhøyet Ang-2-aktivitet i lesjonene [Ogoshi et al., J. Inv. Dermatol, 110:818-23 (1998)]. Spesifikke bindingsmidler som er spesifikke for Ang-2 vil fortrinnsvis anvendes i kombinasjon med andre farmasøytiske midler for behandling av mennesker som uttrykker disse kliniske symptomene. De spesifikke bindingsmidlene kan tilføres ved anvendelse av hvilket som helst av en rekke bærerstoffer via tilførselsveier som beskrives heri og andre som er velkjente blant fagfolk.

Andre beskrevne utførelser omfatter behandling av forskjellige retinopatier (innbefattet diabetisk retinopati og aldersforbundet, makulær degenerasjon) hvori angiogenese inngår, så vel som forstyrrelser/sykdommer i de kvinnelige reproduksjonsorganer, for eksempel endometriose, uterusfibroider og andre tilstander forbundet med dysfunksjonen, vaskulær proliferasjon (innbefattet endometriell, mikrovaskulær vekst) under kvinnens reproduksjonssyklus.

Nok en beskrevet utførelse gjelder behandling av unormal karvekst, innbefattet cerebrale, arteriovenøse feildannelser (AVM), slimhinneskader og -reparasjon i mage-tarmkanalen, ulcerdannelse i mage-tolvfingertarmslimhinner hos pasienter som har lidd av magesår, innbefattet ichemi som følge av slag, et bredt spektrum av pulmonare karforstyrrelser ved leversyksom og portal hypertensjon hos pasienter med ikke-hepatisk portal hypertensjon.

En annen beskrevet utførelse gjelder forebyggelse av kreft ved anvendelse av preparatene som tilveiebringes av foreliggende oppfinnelse. Slike reagenser vil omfatte spesifikke bindingsmidler mot Ang-2.

Farmasøytiske preparater

Farmasøytiske preparater av Ang-2-spesifikke bindingsmidler ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område. Farmasøytiske preparater som omfatter antistoffer beskrives i detalj i for eksempel U.S. Patentskrift nr. 6 171 586 tilhørende Lam et al, tildelt 9. januar 2001. Slike preparater omfatter en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av et spesifikt bindingsmiddel, for eksempel et antistoff eller et fragment, en variant, et derivat eller en fusjon derav som beskrevet heri, blandet med et farmasøytisk aksepterbart middel. I en foretrukket utførelse omfatter farmasøytiske preparater antagonistiske, spesifikke bindingsmidler som delvis, eller fullstendig, modulerer i det minste én biologisk aktivitet forbundet med Ang-2 sammenblandet med et farmasøytisk aksepterbart middel. De spesifikke bindingsmidlene vil typisk være tilstrekkelig rensede til at de kan tilføres til et dyr.

Det farmasøytiske preparat kan inneholde utformingsmaterialer for modifisering, opprettholdelse eller bevaring av for eksempel preparatets pH, osmolaritet, viskositet, klarhet, farge, isotonisitet, duft, sterilitet, stabilitet, oppløsnings- eller frigivelseshastighet, adsorpsjon eller penetrasjon. Egnede utformingsmaterialer omfatter aminosyrer (som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin), antimikrobielle midler, antioksidanter (som askorbinsyre, natriumsulfitt eller natriumhydrogensulfitt), buffere (som borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrater, fosfater, andre, organiske syrer), massegivende midler (som mannitol eller glysin), chelaterende midler [som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)], kompleksdannende midler (som kaffein, polyvinylpyrrolidon, betasyldodekstrin eller hydrolcsypropyl-beta-syWodelcstrin), fyllstoffer, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater (som glukose, mannose eller dekstriner), proteiner (som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner), fargestoffer, smaksstoffer og fortynningsmidler, emulsjonsmidler, hydrofile polymerer (som polyvinylpyrrolidon), lavmolekylære polypeptider, saltdannende motioner (for eksempel natrium), konserveringsmidler (som benzalkoniumklorid, benzosyre, salisylsyre, timerosal, fenetylalkohol, metylparaben, propylparaben, klorheksidin, sorbinsyre eller hydrogenperoksid), løsemidler (som glyserol, propylenglykol eller polyetylenglykol), sukkeralkoholer (som mannitol eller sorbitol), suspensjonsmidler, overfiateaktive midler eller fuktningsmidler (som pluronik, PEG, sorbitanestere, polysorbater, som polysorbat 20, polysorbat 80, triton, trometamin, lecitin, kolesterol, tyloksapal), stabilitetsfremmende midler (sukrose eller sorbitol), tonisitetsstyrkende midler (som alkalimetallhalider (fortrinnsvis natrium-eller kaliumklorid, mannitolsorbitol), bærere, fortynningsmidler, eksipienser og/eller farmasøytiske adjuvanser. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, A. R. Gennaro, red. Mack Publishing Company, 1990).

Det optimale farmasøytiske preparat vil fastslås av en fagperson, avhengig av for eksempel den påtenkte tilførselsvei, tilførselsformatet og den ønskede dose. Se for eksempel Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Slike preparater kan påvirke den fysiske tilstand, stabiliteten, frigivelseshastigheten in vivo og fjerningshastigheten in vivo for det spesifikke bindingsmiddel.

Den primære bærer, eller bærerstoffet i farmasøytisk preparat, kan være enten vandig eller ikke-vandig av natur. For eksempel kan en egnet bærer eller et egnet bærerstoff være injeksjonsvann, en fysiologisk saltløsning eller kunstig cerebrospinalvæske, muligens supplementert med andre materialer som vanligvis foreligger i preparater for parenteral tilførsel. Nøytralt bufret saltvann, eller saltvann blandet med serumalbumin, er andre eksempler på bærere. Andre eksempler på farmasøytiske preparater omfatter Tris-buffer ved tilnærmet pH 7,0-8,5 eller acetatbuffer ved tilnærmet pH 4,0-5,5, som videre kan omfatte sorbitol eller et egnet substitutt. I en utførelse av foreliggende oppfinnelse kan bindingsmiddelpreparater fremstilles for lagring ved å sammenblande den valgte sammensetning med den ønskede renhetsgrad med eventuelle utformingsmidler (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) i form av en frysetørket kake eller en vandig løsning. Videre kan bindingsmiddelproduktet utformes som et frysetørket produkt ved anvendelse av egnede eksipienser som sukrose.

De farmasøytiske preparatene kan utvelges for parenteral tilførsel. Alternativt kan preparatene utvelges for inhalering eller for enteral tilførsel, for eksempel oral, aural, optalmisk, rektal eller vaginal. Fremstilling av slike farmasøytisk aksepterbare preparater ligger innenfor fagpersonens kunnskapsområde.

Bestanddelene i preparatet foreligger i konsentrasjoner som er aksepterbare for tilførselssetet. For eksempel anvendes buffere for å holde preparatet ved fysiologisk pH eller ved en noe lavere pH, typisk innenfor et pH-område fra tilnærmet 5 til tilnærmet 8.

Dersom parenteral tilførsel påtenkes, kan de terapeutiske preparatene for anvendelse i foreliggende oppfinnelse foreligge i form av en pyrogenfri, parenteralt aksepterbar, vandig løsning som omfatter det ønskede, spesifikke bindingsmiddel i et farmasøytisk aksepterbart bærerstoff. Et spesielt egnet bærerstoff for parenteral injeksjon er sterilt, destillert vann i hvilket et bindingsmiddel er utformet som en steril, isoton løsning konservert på egnet vis. Nok et preparat kan omfatte utforming av det ønskede molekyl med et middel, for eksempel injiserbare mikrokuler, bioeroderbare partikler, polymere forbindelser (polymelkesyre, polyglykolsyre), kuler eller liposomer som gir kontrollert eller vedvarende frigivelse av produktet, som så kan tilføres via en deponeringsinjeksjon. Hyaluronsyre kan også anvendes, og denne kan bidra til å fremme vedvarende tilstedeværelse i sirkulasjonen. Andre egnede midler for innføring av det ønskede molekyl omfatter implantert»are medilcamenttilførselsinnreminger.

I en annen utførelse kan farmasøytiske preparater som er egnede for parenteral tilførsel utformes i vandige løsninger, fortrinnsvis i fysiologisk kompatible buffere som Hanks løsning, ringers løsning eller fysiologisk bufret saltvann. Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde forbindelser som øker suspensjonens viskositet, for eksempel natriurnkarboksymetylcellulose, sorbitol eller dekstran. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelser fremstilles som egnede oljeinjeksjonssuspensjoner. Egnede lipofile løsemidler eller bærere omfatter fettoljer, for eksempel sesamolje eller syntetiske fettsyreestere som etyloleat, triglyserider eller liposomer. Ikke-lipidiske, polykationiske aminopolymerer kan også anvendes for tilførsel. Om ønskelig kan suspensjonen også inneholde egnede stabilisatorer eller midler for å øke forbindelsenes løselighet og tillate fremstilling av svært konsentrerte løsninger.

I en annen utførelse kan et farmasøytisk preparat utformes for inhalasjon. For eksempel kan et bindingsmiddel utformes som et tørt pulver for inhalasjon. Polypeptid- eller nukleinsyremolekylholdige inhalasjonsløsninger kan også utformes med en drivgass for aerosoltilførsel. I nok en utførelse kan løsninger nebuliseres. Pulmonar tilførsel beskrives ytterligere i PCT-patentsøknad nr. PCT/US94/001875, som beskriver pulmonar tilførsel av kjemisk modifiserte proteiner.

Det omfattes også at visse preparater kan tilføres oralt. I en utførelse av foreliggende oppfinnelse kan bindingsmiddelmolekyler som tilføres på denne måte utformes med eller uten slike bærerstoffer som vanligvis anvendes ved utforming av faste doseringsformer som tabletter og kapsler. For eksempel kan en kapsel utformes for frigivelse av den aktive del av preparatet på det punkt i mage-tarmkanalen hvor biotilgjengeligheten er maksimal og den presystemiske degradering minimal. Ytterligere midler kan innføres for å lette absorbsjonen av bindingsmiddelmolekylet. Fortynningsmidler, smaksstoffer, vokser med lavt smeltepunkt, vegetabilske oljer, smøremidler, suspensjonsmidler, tablettdisintegrerende midler og bindemidler kan også benyttes.

Farmasøytiske preparater for oral tilførsel kan også utformes ved anvendelse av farmasøytisk aksepterbare bærerstoffer som er velkjente innen faget i doser som er egnet for oral tilførsel. Slike bærerstoffer tillater at de farmasøytiske preparatene utformes som tabletter, piller, drops, kapsler, væsker, geler, siruper, vellinger, suspensjoner og lignende som pasienten kan innta.

Farmasøytiske preparater for oral anvendelse kan erholdes ved å sammenblande aktive forbindelser med en fast eksipiens og prosessere den resulterende blanding av granuler (om ønskelig etter maling) for erholdelse av tabletter eller dropskjerner. Egnede tilleggsstoffer kan tilsettes om ønskelig. Egnede eksipienser omfatter karbohydrat- eller proteinfyllstoffer som sukkere, innbefattet laktose, sukrose, mannitol og sorbitol, stivelse fra mais, hvete, ris, potet eller andre planter, cellulose, for eksempel metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose eller natriurnkarboksymetylcellulose, gummier, innbefattet arabisk gummi og tragantgummi og proteiner som gelatin og kollagen. Om ønskelig kan disintegrasjonsmidler eller solubiliseringsmidler tilsettes, for eksempel kryssbundet polyvinylpyrrolidon, agar og alginsyre eller et salt derav, for eksempel natriumalginat.

Dropskjerner kan anvendes sammen med egnede belegg, for eksempel konsentrerte sukkerløsninger, som også kan inneholde gummi arabicum, talkum, polyvinylpyrrolidon, karbopolgel, polyetylenglykol og/eller titan dioksid, lakkløsninger og egnede, organiske løsemidler eller løsemiddelblandinger. Fargestoffer eller pigmenter kan tilsettes til tablettene eller beleggene for produktidentifisering eller for å karakterisere mengden aktiv forbindelse, det vil si dosen.

Farmasøytiske preparater som kan anvendes oralt omfatter også skyvepasningskapsler fremstilt av gelatin, så vel som myke, forseglede kapsler lagd av gelatin og et belegg, for eksempel glyserol eller sorbitol. Skyvepasningskapsler kan inneholde aktive bestanddeler blandet med fyllstoffer eller bindemidler, for eksempel laktose eller stivelse, smøremidler som talkum eller magnesiumstearat, og om ønskelig, stabiliseringsmidler. I myke kapsler kan de aktive forbindelser være opplost eller suspendert i egnede væsker, for eksempel fettoljer, væsker eller flytende polyetylenglykol med eller uten stabilisatorer.

Et annet farmasøytisk preparat kan omfatte en effektiv mengde av bindingsmiddel blandet med ikke-toksiske eksipienser som er egnede for fremstilling av tabletter. Ved å løse tablettene i sterilt vann eller et annet egnet bærerstoff kan løsninger fremstilles i enhetsdoseform. Egnede eksipienser omfatter inerte fortynningsmidler som kalsiumkarbonat, natriumkarbonat eller natriumbikarbonat, laktose eller kalsiumfosfat, eller bindemidler som stivelse, gelatin eller akasia, eller smøremidler som magnesiumstearat, stearinsyre eller talkum.

Ytterligere farmasøytiske preparater vil være åpenbare for fagfolk, innbefattet utforminger som omfatter bindingsmiddelmolekyler i utforminger for vedvarende eller kontrollert tilførsel. Teknikker for utforming av en rekke andre midler for vedvarende eller kontrollert tilførsel, for eksempel liposombærere, bioeroderbare mikropartikler eller porøse kuler og deponeringsinjeksjoner er også kjente blant fagfolk. Se for eksempel PCT/US93/00829, som beskriver kontrollert frigivelse av porøse, polymere mikropartikler for tilførsel av farmasøytiske preparater. Ytterligere eksempler på preparater for vedvarende frigivelse omfatter semipermeable polymerstøttestoffer i form av utformede artikler, for eksempel filmer eller mikrokapsler. Egnede støttemedier for vedvarende frigivelse kan omfatte polyestere, hydrogeler, polylaktider (U.S. 3 773 919, EP 58 481), kopolymerer av L-glutaminsyre og gamme-etyl-L-glutamat [Sidman et al, Biopolymers, 22:547-556 (1983)] poly (2-hydroksyetylmetakrylat) [Langer et al, J Biomed Mater Res, 15:167-277,

(1981)] og [Langer et al, Chem Tech, 12:98-105(1982)], etylenvinylacetat (Langer et al, supra) eller poly-D(-)-3-hydroksysmørsyre (EP 133 988). Preparater for vedvarende frigivelse omfatter også liposomer, som kan fremstilles ved en rekke fremgangsmåter som er kjente innen faget. Se for eksempel Eppstein et al, Proe Nati Acad Sei (USA) 82:3688-3692(1985), EP 36 676, EP 88 046, EP 143 949.

Det farmasøytiske preparat som skal anvendes for tilførsel in vivo må typisk være sterilt. Dette kan oppnås ved filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner. Dersom preparatet er frysetørket, kan sterilisering ved anvendelse av denne fremgangsmåten utføres enten før eller etter frysetørking og rekonstituering. Preparatet for parenteral tilførsel kan lagres i frysetørket form eller i løsning. I tillegg er parenterale preparater generelt plassert i en beholder med en åpning for steril tilgang, for eksempel en pose eller ampulle for intravenøse løsninger med en kork som kan gjennomtrenges av en hypoderm injeksjonskanyle.

Når først det farmasøytiske preparat er utformet, kan det lagres i sterile ampuller som en løsning, suspensjon, gel, emulsjon, som fast stoff eller som et dehydrert eller frysetørket pulver. Slike preparater kan lagres enten i en form som er klar til bruk eller i en form (for eksempel frysetørket) som krever rekonstituering før tilførsel.

En spesifikk beskrevet utførelse er rettet mot sett for fremstilling av en enhet for tilførsel av enkeltdoser. Settene kan inneholde både en første beholder med et tørket protein og en andre beholder med et vandig preparat. Også beskrevet er sett som inneholder ferdigfylte sprøyter med ett eller flere kammere (for eksempel sprøyter med væsker og sprøyter med frysetørket materiale).

En effektiv mengde av et farmasøytisk preparat som skal anvendes terapeutisk, vil for eksempel, avhengig av den terapeutiske sammenheng og de terapeutiske formål. En fagperson vil forstå at det egnede doseringsnivå for behandling således vil variere, delvis avhengig av molekylet som skal tilføres, indikasjonen for hvilken bindingmiddelmolekylet anvendes, tilførselsveien og pasientens størrelse (kroppsvekt, kroppsoverflate eller organstørrelse) og tilstand (alder og generell helsetilstand). Følgelig kan den behandlende lege titrere dosen og modifisere tilførselsveien for å oppnå en optimal terapeutisk virkning. En typisk dose kan variere fra tilnærmet 0,1 mg/kg opptil tilnærmet 100 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene som er nevnt ovenfor. I andre utførelser kan dosen variere fra 0,1 mg/kg opptil 100 mg/kg, fra 1 mg/kg opptil tilnærmet 100 mg/kg, eller fra 5 mg/kg opptil tilnærmet 100 mg/kg.

For enhver forbindelse kan den terapeutisk effektive dose i utgangspunktet estimeres, enten i celledyrkningsanalyser eller i dyremodeller som mus, rotte, kanin, hund eller gris. En dyremodell kan også anvendes for å bestemme det egnede konsentrasjonsområdet og tilførselsveien. Slik informasjon kan deretter anvendes for å bestemme anvendbare doser og tilførselsveier for mennesker.

Den nøyaktige dose vil bestemmes i lys av faktorer som er forbundet med individet som trenger behandling. Dose og tilførsel justeres slik at det oppnås et tilstrekkelig nivå av den aktive forbindelse til at den ønskede virkning opprettholdes. Faktorer som kan tas i betraktning, omfatter sykdomstilstandens omfang, individets generelle helsetilstand, individets alder, vekt og kjønn, tilførselstidspunkt og -hyppighet, medikamentkombinasjoner, reaksjonsfølsomhet og respons på behandlingen. Farmasøytiske preparater med lang tids virkning kan tilføres hver 3. til 4. dag, hver uke eller annenhver uke, avhengig av det gitte preparats halveringstid og fjerningshastighet.

Doseringshyppigheten vil avhenge av de farmakokinetiske parametere for bindingsmiddelmolekylet som foreligger i det anvendte preparat. Typisk tilføres et preparat inntil det nås en dose som oppnår den ønskede virkning. Preparatet kan derfor tilføres som én enkelt dose eller som flere doser (i samme eller en forskjellig konsentrasjon/dose) over tid, eller som en kontinuerlig infusjon. Ytterligere justering av den egnede dose utføres rutinemessig. Egnede doser kan fastslås ved anvendelse av egnede dose-responsresultater.

Tilførselsveien for det farmasøytiske preparat er i samsvar med kjente fremgangsmåter, f.eks. oralt, ved intravenøs, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenchymal), intracerebroventrikulær, intramuskulær, intraokulær, intraarteriell eller intraportal injeksjon, ved intralesjonale tilførselsveier, ved intramedullær, intratekal, intraventrikulær, transdermal eller subkutan injeksjon, intraperitonealt, intranasalt, enteralt, topisk, sublingvalt, uretralt eller vaginalt, ved systemer for vedvarende frigivelse eller ved implantasjonsinnretninger. Om ønskelig kan preparatene tilføres ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig ved infusjon, eller ved hjelp av en implantasjonsinnretning.

Alternativt eller i tillegg kan preparatet tilføres lokalt ved implantering av en membran, en svamp eller et annet egnet materiale til hvilken det ønskede molekyl har blitt absorbert eller innkapslet. Dersom en implantasjonsinnretning anvendes kan innretningen implanteres i ethvert egnet vev eller organ, og tilførselen av det ønskede molekyl kan skje via diffusjon, tidsavhengig bolusfrigivelse eller kontinuerlig tilførsel.

I noen tilfeller kan det være ønskelig å anvende farmasøytiske preparater på ex vivo-måte. I slike tilfeller behandles celler, vev eller organer som er fjernet fra pasienten med de farmasøytiske preparatene, hvoretter cellene, vevene og/eller organene implanteres tilbake til pasienten.

I andre tilfeller kan et bindingsmiddel som er et polypeptid tilføres ved å implantere visse celler som har blitt genetisk modifiserte ved anvendelse av fremgangsmåter som dem som beskrives heri, slik at de uttrykker og utskiller polypeptidet. Slike celler kan være dyreceller eller humane celler og kan være autologe, heterologe eller xenogeneiske. Om ønskelig kan cellene være immortaliserte. For å redusere faren for en immunologisk respons kan cellene være innkapslet slik at man unngår infiltrasjon av omliggende vev. Innkapslingsmaterialene er typisk biokompatible, semipermeable polymere rom eller membraner som tillater frigivelse av proteinproduktet eller -produktene, men som forhindrer ødeleggelse av cellene ved pasientens immunsystem eller ved andre skadelige faktorer fra de omliggende vev.

Kombinasj onsbehandling

Spesifikke bindingsmidler ifølge oppfinnelsen kan anvendes i kombinasjon med andre terapeutiske midler ved behandling av Ang-2-sykdomstilstander. Disse andre terapeutiske midlene omfatter for eksempel strålebehandling og kjemoterapeutiske midler, så vel som andre vekstfaktorer.

Kjemoterapeutisk behandling kan benytte antineoplastiske midler, for eksempel alkylerende midler, innbefattet nitrogenmustarder som mekloretamin, syklofosfamid, ifosfamid, melfalan og klorambucil; nitrosoureaer som carmustin (BCNU), lomustin (CCNU), og semustin

(metyl-CCNU); etyleniminer/metylmelamin slik som trietylenmelamin (TEM), trietylen, tiofosforamid (tiotepa), heksametylmelamin (HMM, altretamin); alkylsulfonater som busulfan, triaziner som dacarbazin (DTIC); antimetabolitter, innbefattet folsyreanaloger som metotreksat og trimetreksat, pyrimidinanaloger som 5-fluoruracil, fluordeoksyuridin, gemcitabin, cytosin-arabinosid (AraC, cytarabin), 5-azacytidin, 2,2'-difluordeoksycytidin, purinanaloger som 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, azatioprin, 2'-deoksykoformycin (pentostatin), erytrohydroksy-nonyladenin (EHNA), fludarabinfosfat, og 2-klordeoksyadenosin (cladribin, 2-CdA); naturprodukter, innbefattet antimitotiske medikamenter som paclitaxel, vinca-alkaloider, innbefattet vinblastin (VLB), vinkristin og vinorelbin, taksoter, estramustin, estramustinfosfat; pipodofylotoksiner som etoposid og teniposid; antibiotika som aktimomycin D, daunomycin

(rubidomycin), doksorubicin, mitoksantron, idarubicin, bleomyciner, plicamycin (mithramycin), mitomycin C og aktinomycin; enzymer som L-asparaginase, midler som modifiserer biologiske responser, f.eks. interferon-alfa, IL-2, G-CSF og GM-CSF; forskjellige andre midler, innbefattet platina-koordinasjonskomplekser som cisplatin og karboplatin, antracendioner som mitoksantron, substituert urea som hydroksyurea, metylhydrazinderivater, innbefattet N-metylhydrazin (MIH) og prokarbazin, binyrebarksupprimerende midler som mitotan (o,p'-DDD) og aminoglutetimid; hormoner og antagonister, innbefattet adrenokortikosteroide antagonister som prednison og tilsvarende forbindelser, dexametason og aminoglutetimid, progestin, f.eks. hydroksyprogesteronkaproat, medroksyprogesteronacetat og megestrolacetat, østrogener som dietylstilbestrol og etinylestradiolekvivalenter, antiøstrogener som tamoksifen, androgener, innbefattet testosteronpropionat og fluoksymesteron og ekvivalenter, antiandrogener som flutamid, gonadotropinfrigivende hormonanaloger og leuprolid, og ikke-steroide antiandrogener som flutamid.

Kombinasjonsbehandling med vekstfaktorer kan omfatte cytokiner, lymfokiner, vekstfaktorer eller andre hematopoetiske faktorer som M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFO, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoietin, stamcellefaktor og erytropoietin. Andre preparater kan omfatte kjente angiopoietiner for eksempel Ang-1, -2, -4, -Y og/eller det humane Ang-lignende polypeptid, og/eller vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF). Vekstfaktorer omfatter angiogenin, benmorfogent protein 1, benmorfogent protein 2, benmorfogent protein 3, benmorfogent protein 4, benmorfogent protein 5, benmorfogent protein 6, benmorfogent protein 7, benmorfogent protein 8, benmorfogent protein 9, benmorfogent protein 10, benmorfogent protein 11, benmorfogent protein 12, benmorfogent protein 13, benmorfogent protein 14, benmorfogent protein 15, benmorfogent proteinreseptor IA, benmorfogent proteinreseptor IB, hjerneavledet nevrotrofisk faktor, ciliarnøytrofisk faktor, ciliar nøytrofisk faktorreseptor, cytokinindusert nøytrofil kjemotaktisk faktor 1, cytokinindusert nøytrofil kjemotaktisk faktor 2, cytokinindusert nøytrofil kjemotaktisk faktor 2, endotelcellevekstfaktor, endotelin 1, epidermal vekstfaktor, epitelavledet nøytrofil attraktant, fibroblastvekstfaktor 4, fibroblastvekstfaktor 5, fibroblastvekstfaktor 6, fibroblastvekstfaktor 7, fibroblastvekstfaktor 8, fibroblastvekstfaktor 8b, fibroblastvekstfaktor 8c, fibroblastvekstfaktor 9, fibroblastvekstfaktor 10, sur fibroblastvekstfaktor, basisk fibroblastvekstfaktor, gliacellelinjeavledet nøytrofisk faktorreseptor 1, gliacellelineavledet nøytrofisk faktorreseptor 2, vekstforbundet protein, vekstforbundet protein 2, vekstforbundet protein 2, vekstforbundet protein 3, heparinbindende epidermal vekstfaktor, hepatocyttvekstfaktor, hepatocyttvekstfaktorreseptor, insulinlignende vekstfaktor I, insulinlignende vekstfaktorreseptor, insulinlignende vekstfaktor II, insulinlignende vekstfaktorbindende protein, keratinocyttvekstfaktor, leukemiinhiberende faktor, leukemiinhiberende faktorreseptor 1, nervevekstfaktor, nervevekstfaktorreseptor, nevrotrofin 3, nevrotrofin 4, placentavekstfaktor, placentavekstfaktor 2, blodplateavledet entotelcellevekstfaktor, blodplateavledet vekstfaktor, blodplateavledet vekstfaktor A-kjede, blodplateavledet vekstfaktor AA, blodplateavledet vekstfaktor AB, blodplateavledet vekstfaktor B-kjede, blodplateavledet vekstfaktor BB, blodplateavledet vekstfaktorreseptor 1, blodplateavledet vekstfaktorreseptor 2, pre-B-cellevekststimulerende faktor, stamcellefaktor, stamcellefaktorreseptor, transformerende vekstfaktor 1, transformerende vekstfaktor 2, transformerende vekstfaktor 3, transformerende vekstfaktor 1.2, transformerende vekstfaktor 4, transformerende vekstfaktor 5, latent transformerende vekstfaktor 1, transformerende vekstfaktorbindende protein I, transformerende vekstfaktorbindende protein II, transformerende vekstfaktorbindende protein III, tumornekrosefaktorreseptor type I, tumornekrosefaktorreseptor type II, urokinasetype plasminogenaktivatorreseptor, vaskulær endotelvekstfaktor og kimære proteiner og biologisk eller immunologisk aktive fragmenter av disse.

Immunoterapeutiske midler

Immunoterapeutiske midler bygger generelt på anvendelse av immuneffektorceller og molekyler for styring til og ødeleggelse av kreftceller. Immuneffektorene kan for eksempel være et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse som gjenkjenner en eller annen markør på overflaten av en målcelle. Antistoffet alene kan fungere som terapeutisk effektormolekyl, eller det kan rekruttere andre celler som faktisk utfører celledrepingen. Antistoffet kan også være konjugert til et medikament eller toksin (et kjemoterapeutisk middel, en radioaktiv isotop, ricin A-kjede, koleratoksin, pertussistoksin osv.) og kan således fungere som kun et målstyrende middel.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan mutante former av Ang-2 være målet for immunoterapi med enten antistoffer eller antistoffkonjugater ifølge oppfinnelsen. Det omfattes spesielt at antistoffpreparatene ifølge oppfinnelsen kan anvendes i en

kombinasjonsbehandlingstilnærming sammen med Ang-2-rettet behandling.

Passiv immunoterapi har vist seg å være spesielt effektiv mot en rekke kreftformer. Se for eksempel WO 98/39027.

EKSEMPEL 1

Ang- 2- ekspresjon i patologisk og normalt vev

Ang-2-ekspresjonen ble undersøkt i normalt og patologisk vev ved anvendelse av in s/fø-hybridisering. Fragmenter av den humane Ang-2-sekvensen (Genbank aksesjonsbetegnelse AF004327, nukleotid 1274-1726) og musesekvensen (Genbank aksesjonsbetegnelse AF004326, nukleotid 1135-1588) ble amplifisert ved revers transkriptase-PCR fra cDNA fra føtal lunge fra menneske eller mus, klonet i plasmidet pGEM-T og bekreftet ved sekvensering.<33>P-merkede "antisens"-RNA-prober ble transkribert fra lineariserte plasmidtemplater ved anvendelse av<33>P-UTP og RNA polymerase. Blokker med formaldehydfikserte, parafininnstøpte vev ble kuttet i 5 Hm snitt og oppsamlet på ladede objektglass. Før in s/Yw-hybridiseringen ble vevene permeabilisert med 0,2 M HC1, fulgt av behandling med proteinase K og acetylering med trietanolamin og eddiksyreanhydrid. Snittene ble hybridisert med den radioaktivt merkede probe over natten ved 55 og så behandlet med RNase og vask ved høy stringens i tilnærmet 0,1X SSC ved 55 "C. Objektglassene ble dyppet i Kodak NTB2-emulsjon, eksponert ved 4 "C i 2-3 uker, fremkalt og motfarget. Snittene ble undersøkt ved mørkefeltbelysning og standardbelys-ning for samtidig evaluering av vevsmorfologien og hybridiseringssignalet.

Resultatene viste at Ang-2-ekspresjonen i det normale postnatale menneske er begrenset til de få vevene som inneholder angiogen vaskulatur, for eksempel ovarie, placenta og uterus. Ingen Ang-2-ekspresjon kunne påvises i hjerte, hjerne, nyre, lever, lunge, bukspyttkjertel, milt, muskel, mandel, brissel, blindtarm, lymfeknute, galleblære, prostata eller testis fra et normalt voksent menneske. Hos fem uker gamle mus (men ikke hos voksen ape eller menneske) viste nyrene fremtredende Ang-2-ekspresjon i vasa recta. For å fastslå hvorvidt denne ekspresjonen var en rest fra den embryonale utvikling ble dette eksperiment gjentatt på nyrer avledet fra mus opp til en alder på ett år ved anvendelse av muse-Ang-2-proben og betingelsene som er beskrevet ovenfor. Ang-2-ekspresjonen ble observert å avta under den postnatale utvikling, men var fortsatt åpenbar i nyrer fra ett år gamle mus.

Ang-2-ekspresjon ble også påvist i nær sagt alle analyserte tumortyper, innbefattet primære humane tumorer som colonkarsinom (5 tilfeller), brystkarsinom (10 tilfeller), lungekarsinom (8 tilfeller), glioblastom (1 tilfelle), metastatiske humane tumorer som brystkarsinom (to tilfeller), lungekarsinom (2 tilfeller) og ovariekarsinom (to tilfeller) som hadde metastasert til hjerne, samt gnagertumormodeller som C6 (rottegliom), HT29 (human colonkarsinom), Colo-205 (human colonkarsinom), HCT116 (human colonkarsinom), A431 (human epidermoidkarsinom), A673 (human rhabdomyosarkom), HT1080 (human fibrosarkom), PC-3 (human prostatakarsinom), B16F10 (musemelanom), MethA (musesarkom) og Lewis lungekarsinommetastaser. I tillegg ble Ang-2-ekspresjon påvist i nydannede kar som vokste inn i en Matrigel-plugg som respons på VEGF og i en hypoksimodell i mus for prematur retinopati.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av rekombinant mAng- 2- protein og polyklonalt anti- Ang- 2- antiserum fra kanin

His-merket muse-Ang-2-cDNA av full lengde ble erholdt ved PCR (Clotech Advantage PCR Kit, Kat nr. K1905-01) fra et cDNA-bibliotek fra et 15 dager gammelt museembryo (Marathon-Ready-cDNA, Kat. nr. 7459-1, Clonetech, Inc.) ved anvendelse av PCR-primere for fullengde humant Ang-2. PCR-produktet ble ligert inn i en CMV-promoter-ekspresjonsvektor, og det resulterende plasmid ble transfektert inn i de humane fibrosarkomcellene HT1080 (erholdt fra ATCC) ved anvendelse av FuGENE6 Transfection Reagent (Roche, Kat. nr. 1814443). Stabile kloner ble isolert ved G418-seleksjon. Anti-His-merkings-ELISA og Western-blotting ble anvendt for søk etter mAng-2-his-uttrykkende kloner.

Rekombinant mAng-2-polypeptid ble renset fra kondisjonert medium (CM.) fra disse cellene. mAng-2-His-holdig CM. ble renset ved en to-trinns kromatografirfemgangsmåte. Kort beskrevet ble det kondisjonerte medium titrert til pH 8,9 ved tilsetning av tris-buffer pH 9,5 til en sluttkonsentrasjon på tilnærmet 20 mM. I tillegg ble detergenten CHAPS tilsatt til en sluttkonsentrasjon på tilnærmet 5 mM. CM. ble så direkte påsatt en anionbytterkolonne Q-sefarose ff (Pharmacia). Kolonnen ble så vasket med tilnærmet 10 mM tris pH 8,0 tilsatt tilnærmet 50 mM NaCl. Rekombinant mAng-2-His ble eluert i et enkelt trinn ved anvendelse av 10 mM tris pH 8,0 tilsatt tilnærmet 350 mM NaCl og tilnærmet 5 mM CHAPS.

Eluatet fra Q-sefarose-kolonnen ble justert til tilnærmet 4 mM imidazol og påsatt en immobilisert metallaffinitetskolonne (Ni-NTA superflow [Qiagen]). Bundet protein ble eluert med PBS tilsatt tilnærmet 5 mM CHAPS og tilnærmet 100 mM imidazol. Eluatet ble så konsentrert til tilnærmet 1,0 mg/ml, fulgt av dialyse mot PBS. Renheten av mAng-2-His var høyere enn 90 %, målt ved SDS-PAGE og Coomassie-farging.

Kaniner ble immunisert med tilnærmet 0,2 mg mAng-2/injeksjon i et forsøk på å frembringe antistoffer. Kaninene ble injisert med tilnærmet 1 ml Hunter's Titer Max® (Sigma) og mAng-2 i et forhold på 1:1. Fire uker senere ble hver kanin gitt en gjentatt injeksjon eller forsterkeirnjeksjon, to uker etter dette ble de gitt neste forsterkerinjeksjon, og i uke syv ble serum tappet og evaluert for titer mot mAng-2. Dersom serumtiteret var høyt ble 50 ml produksjonsblod tappet ukentlig på seks på hverandre følgende uker. Dersom serumtiteret var lavt ble imidlertid kaninene gitt ytterligere én forsterkerinjeksjon, og 50 ml produksjonsblod ble tappet ukentlig i seks på hverandre følgende uker med begynnelse i uke 9. Etter seks på hverandre følgende tappinger av produksjonsblod fikk kaninene hvile i seks uker. Dersom mer serum var nødvendig ble kaninene gitt en ny forsterkerinjeksjon én måned etter siste produksj onstapping.

Ved anvendelse av nøytraliserings-ELISA (beskrevet nedenfor) ble polyklonalt anti mAng-2-antiserum fra to kaniner, 5254 og 5255, observert å nøytralisere interaksjonen mellom mAng-2 og Tie2.

EKSEMPEL 3

Molekylære analyser for evaluering av Ang- 2- antistoffer

Molekylære analyser (affinitets-ELISA, nøytraliserings-ELISA og BIAcore) ble utviklet for å oppnå direkte antistoffbinding til Ang-2 og beslektede familiemedlemmer samt virkningen av antistoffer på interaksjonen mellom Ang-2 og Tie2. Disse in v/Vro-analysene og cellebaserte analysene kan beskrives som følger.

A. Affinitets- ELISA

For det innledende søk etter anti-Ang-2-antistoffkandidater ble renset humant Ang-2 (R and D Systems, Inc. Katalog nr. 623-AN, Ang-2 foreligger som en blanding av 2 avkortede versjoner) eller Ang-2-polypeptid fra mus (fremstilt som beskrevet ovenfor) anvendt. For bekreftende bindingsanalyser ble humant Ang-2 erholdt fra kondisjonert medium fra humane 293T-celler transfekterte med fullengde humant Ang-2-DNA og dyrket i semrnfritt DMEM tilsatt tilnærmet 50 ug/ml bovint serumalbumin (BSA).

Ved anvendelse av mikrotiterplater ble tilnærmet 100 (il Ang-2 tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i tilnærmet 2 timer, hvoretter de ble vasket fire ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) tilsatt tilnærmet 0,1 % Tween-20. Brønnene ble så blokkert ved anvendelse av tilnærmet 250 (il/brønn av tilnærmet 5 % BSA i PBS, og platene ble inkubert ved romtemperatur i tilnærmet 2 timer. Etter inkuberingen ble overskudd av blokkeringslosning kastet, og tilnærmet 100 ul anti-Ang-2-antistoffkandidat ble tilsatt til hver brønn i en fortynningsserie som startet ved en konsentrasjon på tilnærmet 40 nanomolar som så ble seriefortynnet 4 ganger med PBS tilsatt tilnærmet 1 BSA. Platene ble så inkubert over natten ved romtemperatur. Etter inkuberingen ble platene vasket med PBS tilsatt tilnærmet 0,1 % Tween-20. Vaskingen ble gjentatt fire ganger, hvoretter tilnærmet 100 ul/brønn av anti-humant IgG(Fc)-HRP (Pierce Chemical Co., katalog nr. 31416) fra geit, på forhånd fortynnet 1:5 000 i PBS tilsatt 1 % BSA (bovint serumalbumin), ble tilsatt. Platene ble inkubert i tilnærmet 1 time ved romtemperatur. Platene ble så vasket fem ganger med PBS tilsatt tilnærmet 0,1 % Tween-20, hvoretter tilnærmet 100 ul/brønn av TMB (3,3', 5,5'-tetrametylbenzidin Liquid Substrate System, Sigma chemical Company, St. Louis, MO, katalog nr T8665)-substrat ble tilsatt og platene inkubert i tilnærmet 5-15 minutter inntil en blå farge ble utviklet. Absorbansen ble så avlest i et spektrofotometer ved tilnærmet 370 nm.

B. Nøytraliserings- ELISA

Mikrotitetplater til hvilke humant Ang-2-polypeptid var bundet ble fremstilt som beskrevet for affinitets-ELISA. Anti-Ang-2-antistoffkandidater ble fremstilt i serifortynninger som er beskrevet for affinitets-ELISA ovenfor i en løsning av PBS tilsatt tilnærmet 1 % BSA og tilnærmet 1 nM Tie2 (erholdt som et Tie2-Fc-molekyl hvori Tie2-delen kun inneholder den løselige, ekstracellulære del av molekylet, R and D Systems, katalog nr. 313-TI). Etter tilsetning av tilnærmet 100 (il av antistoff/Tie2-løsningen til hver brønn, ble platene inkubert over natten ved romtemperatur og så vasket fem ganger med PBS tilsatt tilnærmet 0,1 % Tween-20. Etter vask ble tilnærmet 100 ul/brønn av anti-Tie2-antistoff (Pharmingen Inc., katalog nr. 557039) tilsatt til en sluttkonsentrasjon på tilnærmet 1 fig/ml og platene ble inkubert i tilnærmet 1 time ved romtemperatur. Deretter ble tilnærmet 100 (il/brønn av anti-muse-IgG-HRP (Pierce Chemical CO, katalog nr 31432 fra geit tilsatt i en fortynning på 1:10 000 i PBS tilsatt tilnærmet 1 % BSA. Platene ble inkubert ved romtemperatur i tilnærmet 1 time og så vasket fem ganger med PBS tilsatt tilnærmet 0,1 % Tween-20. Tilnærmet 100 (il/brønn av TMB-substrat (beskrevet ovenfor) ble så tilsatt, og fargen fikk utvikle seg. Absorbansen ble så avlest i et spektrofotometer ved 370 nm.

C. Affinitets- BIAcore

En affinitetsanalyse av hver Ang-2-antistoffkandidat ble utført i et "BIAcore" 2000-instrument (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) med PBS og 0,005 % av det overflateaktive middel P20 (BIAcore, Inc.) som analysebuffer. Rekombinant Protein G (Repligen Needham, MA) ble immobilisert til en CM5-sensorbrikke av forskningskvalitet (BIAcore, Inc.) via primære aminogrupper og anvendelse av Amine Coupling Kit (BIAcore, Inc.) ifølge produsentens foreslåtte fremgangsmåte.

Bindingsanalyser ble utført ved først å koble tilnærmet 100 Ru av hver anti-Ang-2 - antistoffkandidat til det immobiliserte protein G, hvoretter forskjellige konsentrasjoner (0-100 nM) av huAng-2 eller mAng-2 ble injisert over den bundne antistoffoveflate ved en gjennomstrømmingshastighet på tilnærmet 50 (il/min i tilnærmet 3 minutter. Antistoffets bindingskinetikk, innbefattet ka (assosiasjonshastighetskonstant), kj (dissosiasjonshastighets-konstant) og KD(dissosiasjonslikevektskonstant) ble bestemt ved anvendelse av datamaskin-programmet BIA evaluation 3.1 (BIAcore, Inc.) Jo lavere (dissosiasjonslikevektskonstant), jo høyere antistoffaffinitet for Ang-2.

EKSEMPEL 4

Fremstilling av fuUt ut humane Ang- 2- antistoffer ved bakteriofagfremvisning

Fullt ut humane Ang-2-antistoffer ble frembrakt ved søk i et Target Quest Phage Display Fab library (Target Quest, Inc.) mot et humant Ang-2-polypeptid (R and D Systems Inc. katalog nr 623-AN), ifølge følgende fremgangsmåte: Humant Ang-2 ble immobilisert på overflaten av magnetiske polystyrenkuler ved to fremgangsmåter: (1) direkte belegning av Ang-2 ved 50 ug/ml ved 4 °C over natten, og (2) indirekte innfanging av Ang-2 ved anti-Ang-2-antistoff fra geit ved 50 ug/ml og 4 °C over natten. Kuleoverflaten ble blokkert med 2 % melk i PBS (MPBS). Det humane Fab-bakteriofagbibliotek ble preselektert for fjerning av bakteriofagkloner som reagerte med ubelagte, magnetiske kuler eller med anti-Ang-2-antistoffet fra geit. Ang-2-belagte magnetiske kuler ble så inkubert med bakteriofag fra biblioteket ved romtemperatur i 1,5 timer. Etter bakteriofagbmdmgstrinnet ble overflaten vasket 6 ganger med MPBS tilsatt tilnærmet 0,1 % Tween 20, fulgt av 6 gangers vask med PBS tilsatt tilnærmet 0,1 % Tween 20, fulgt av 2 gangers vask med PBS. Bundet bakteriofag ble først eluert med tilnærmet

100 ug/ml human Tie2-FC (R and D Systems, Minneapolis, MN) og så med tilnærmet 100 mM trietanolamin. Eluert bakteriofag ble infisert in i E. coli TG 1-celler, amplifisert og gjenvunnet for neste analyserande. Seleksjonstrykket ble økt i på hverandre følgende rander ved å innføre mer stringent vask og å redusere antall bakteriofag ført inn i seleksjonen. Etter 3 seleksjonsrunder ble 18 unike Ang-2-bindende Fab-kloner påvist, nær sagt alle av disse gjenkjente humant Ang-2, muse-Ang-2 og rotte-Ang-2, målt ved anvendelse av ELISA-affinitetsanalysen beskrevet ovenfor. Tilnærmet 10 % av disse bakteriofagene bandt også humant Ang-1. Disse klonene ble overført til IgG 1-antistoffer som beskrevet nedenfor.

For erholdelse av ytterligere unik bakteriofag, ble en ny analyserande utført med samme bibliotek, men en noe forskjellig fremgangsmåte. I denne fremgangsmåten ble humant Ang-2 bundet til Nunc maxisorp immunrør i NaHC03-buffer ved pH 9,6 og tilnærmet 4 °C over natten. Ang-2 ble bundet ved tilnærmet 1,5,0,74 og 0,3 ug/ml for analyserande 1,2 henholdsvis 3. Immunrøroverflaten ble blokkert ved anvendelse av tilnærmet 2 % melk i PBS (MPBS) før inkubering med tilnærmet 2 billioner bakteriofagpartikler (tilnærmet 50 kopier av hver unike bakteriofag i biblioteket) fira det samme bakteriofagfiremvisningsbibliotek som det vises til ovenfor (Target Quest) i tilnærmet 4 ml 2 % MPBS. Etter bakteriofaginkuberingstrinnet ble overflaten vasket 20 ganger med PBS tilsatt tilnærmet 0,1 % Tween 20, fulgt av 20 gangers vask med PBS. Bundet bakteriofag ble eluert ved anvendelse av 1 uM hAng-2 eller 1 uM human Tie2 (R and D Systems, beskrevet ovenfor). Eluert bakteriofag ble infisert inn i E. coli TG 1-celler (erholdt sammen med bakteriofagbiblioteket), amplifisert og gjenvunnet for neste analyserande. Seksten unike Ang-2-bindende Fab-kloner ble påvist ved PCR-amplifisering av all bakteriofag som bandt hAng-2 eller Tie2, og disse klonene ble analysert ved restriksjonskutting. DNA fra hver klon ble sekvensert.

Sekvensen som koder for det variable området i hver tungkjede fira hver bakteriofag ble amplifisert med komplementære primere. Primerne var utformet slik at de innførte et Hindlll-sete, et Xbal-sete, en Kozak-sekvens og en signalsekvens (det translaterte peptid er MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC, SEQ ID NO: 69) til den 5' ende av det variable området, mens et BsmBI-sete ble innført i PCR-produktets 3' ende. Som et eksempel på hvordan tungkjedene ble klonet, ble templat-bakteriofag-DNA for klon 544 (seq id no: 19) amplifisert ved anvendelse av primerne 2248-21 (GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TCA GGT CCA GCT GGT GCA G; seq id no: 70), som adderte de siste 7 aminosyrer av signalsekvensen, og 2502-31 (ATT ACG TCT CAC AGT TCG TTT GAT CTC CAC; seq id no: 71) som adderte BsmBI-setet til enden av det variable området. Det resulterende produkt ble amplifisert med primerne 2148-98 (CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TAT TGT GGT TGA GAG GTG CCA GAT; seq id no: 72) som adderte 9 aminosyrer til signalpeptidet (AQLLGLLLL; seq id no: 73), og 2502-31 og deretter 2489-36 (CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT CCC CGC TCA GCT CCT GGG; seq id no: 74) og 2502-31. Primer 2489-36 adderte fra 5' til 3' Hindlll-setet, Xbal-setet, Kozak-sekvensen og de første 6 aminosyrene i signalsekvensen. PCR-produktene ble kuttet Xbal og BsmBI og så klonet inn i en pattedyrekspresjonsvektor som inneholdt det konstante området fira humant IgGl. Denne vektoren inneholder en SV40-promoter og tillater DHFR-seleksjon.

Lettkjedene fra bakteriofagene var enten av kappa-klasse eller lambda-klasse. For hver lettkjede ble det utformet komplementære primere for innføring av, fra 5' til 3', et HindUI-sete et Xbal-sete, en Kozak-sekvens og en signalsekvens (beskrevet ovenfor). De kjedene som hadde feilfrie, kodende områder ble klonet som fullengdeprodukter. Som ett eksempel ble lettkjeden fra bakteriofagklon 536 (seq id no: 11) amplifisert som et fullengde kodende område ved anvendelse av primerne 2627-69 (GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TGA CAT TGT GAT GAC TCA GTC TCC; seq id no: 75) som adderte de siste 7 aminosyrene i signalsekvensen, og primer 2458-54 (CTT GTC GAC TTA TTA ACA CTC TCC CCT GTT G; seq id no: 76), som adderte et Sall-sete etter stoppkodonet. Dette PCR-produktet ble så amplifisert som angitt tidligere med ytterligere 5'-primere 2148-98 og 2489-36, paret med primer 2458-54, for å fullføre adderingen av signalsekvensen og kloningssetene. Fullengde-lettkjedene ble klonet som Xbal-Sall-fragmenter inn i pattedyrekspresjonsvektoren som er beskrevet ovenfor.

Visse lamda-kloner hadde feil i de konstante områdene ved sammenligning med den naturlige sekvens for humant konstant område. For å korrigere disse avvikene, ble det overført overlapp-PCR ved anvendelse av DNA som koder for et perfekt konstant lambda-område og det bakteriofagavledede, variable området. Disse klonene ble også klonet som Xbal-Sall-fragmenter som beskrevet ovenfor.

Dersom variable kappa-områder ble klonet separat fra de konstante områdene, ble et BsmBI-sete addert til PCR-produktets 3' ende. Etter kutting av PCR-produktet med Xbal og BsmBI ble det variable kappa-kjedeområdet klonet inn i en ekspresjonsvektor som inneholdt det humane, konstante kappa-området.

De parede lettkjede- og tungkjedekonstruksjonene fra hver av de konverterte bakteriofagene ble kotransfektert inn i CHO-celler ved anvendelse av Calcium Phosphate Transfection Kit (Invitrogen Corp.) generelt ifølge produsentens foreslåtte fremgangsmåte. Mediet ble skiftet 14-16 timer etter transfeksjonen, og cellene ble overført til vevsdyrkningsskåler for seleksjon etter tilnærmet 48 timer ifølge produsentens anbefalinger. Transfekterte celler ble isolert ved HT-seleksjon i tilnærmet 3 uker, hvoretter transfekterte CHO-cellekolonier ble trypsinbehandlet og slått sammen til en blanding av transfekterte celler.

Kondisjonert medium i liten skala ble oppsamlet etter 48 timer og analysert for antistoffproduksjon ved Western-blotanalyse og anvendelse av enten anti-humant Fc-antistoff, anti-humant kappa-antistoff eller anti-humant lamda-antistoff. De selekterte cellepopulasj onene ble så dyrket videre under selektivt press og anvendelse av standard vevsdyrkningssterilteknikk inntil det ble erholdt tilstrekkelig mange celler til å inokulere fire

850 cm<2>rulleflasker med 2xl0<7>levedyktige celler hver og fremstille nedfrosne lagercellelinjer ved anvendelse av DMSO. Etter utsåingene ble cellene dyrket i rulleflasker med DMEM-medium (Gibco/BRL, Inc.) tilsatt tilnærmet 10 % serum, glutamin og ikke-essensielle aminosyrer. Cellene ble dyrket i to til tre dager inntil en konfluens på tilnærmet 80 % ble oppnådd. På dette tidspunkt ble mediet i rulleflaskene byttet til en serumfri mediumblanding (50 % DMEM, 50 % F12, Gibco)

tilsatt glutamin og ikke-essensielle aminosyrer. Kondisjonert medium ble høstet etter sju dager, og friskt serumfritt medium ble tilsatt for ytterligere én eller to høstinger.

Antistoffer ble renset ved protein G-affinitetskromatografi direkte fra kondisjonert medium ved anvendelse av standardfremgangsmåter. Eluering fra protein G-kolonnen ble oppnådd ved anvendelse av buffer med lav pH (tilnærmet pH 3), hvoretter det eluerte antistoffprotein ble nøytralisert ved anvendelse av IM Tris, pH 8,5 og så oppkonsentrert ved anvendelse av oppkonsentreringsceller for sentrifugering med 10 kD grenseverdi. Bufferen i den oppkonsentrerte antistoffløsningen ble så endret til PBS.

Trettien antistoffer er dannet, og alle består av 2 tungkjeder og 2 lettkjeder (kappa eller lambda) som angitt i den påfølgende tabell 2.

De påfølgende fire tabeller beskriver sekvenser og sekv. id. nr. for tungkjeden og lettkjeden (kappa og lamda) i de 31 anti-Ang-2-antistoffene som er overført fra bakteriofag til fullengde IgG 1-antistoffer. De komplementaritetsbestemmende områder (CDR) i de monoklonale antistoffene ble utledet ved anvendelse av databasen VB ASE, som anvender teknikken som beskrives av Kabat et al. i Sequences of Proteins of Immunological Interest (NIH Publication nr. 91-3242, U.S. Dept. Health and Human Services, 5. utgave. Fab-områdene ble sammenstilt i sekvensene i databasen som hadde den nærmeste kimcellelinjesekvens (se http:// www. mrc-cpe. cam. ac. ul^ imt- doc/ restricted/ ALIGNMENTS. htrnl') og så sammenlignet visuelt med slike sekvenser. CDR for hvert av de variable områdene (fra tungkjede eller lettkjede) gis i tabell 7.

Sytten av antistoffene og et negativt kontroll-IgGl (betegnet RDB1) ble analysert ved anvendelse av affinitets- og nøytraliserings-ELISA (som beskrevet i eksempel 3 ovenfor) så vel som BIAcore-nøytraliseringsanalysen for å bestemme deres affinitetsegenskaper, nøytraliseringsegenskaper og spesifisitet. Resultatene gis nedenfor (tabell 8) og ble beregnet ved anvendelse av standardfremgangsmåter.

To antistoffer, klon 536 og klon 545, ble evaluert ved anvendelse av BIAcore-analysen som er beskrevet ovenfor. Antistoffbindingen ble bestemt som beskrevet ovenfor for BIAcore-analysen, hvor en lavere Kdangir høyere affinitet, og resultatene er gitt i den påfølgende tabell 9.

EKSEMPEL 5

Undersøkelser av terapeutisk effektivitet ved anvendelse av anti- Ang- 2- antistoffer

Farmokokinetikken til protein G-rensede polyklonale anti-Ang-2-antistoffer fra kanin ble undersøkt i mus. Tjuefire mus ble behandlet med polyklonalt anti-Ang-2-antistoff fra kanin (1 mg/mus). Fire behandlede mus ble avlivet på hvert av de påfølgende tidspunkt etter injeksjon av antistoff: 1 time, 6 timer, 1 dag, 3 dager, 7 dager og 14 dager.

Resultatene viste at total-IgG fra kanin hadde en serumhalveringstid i sirkulasjonen på tilnærmet 19 dager, mens anti-Ang-2-IgG-bestanddelen av total-IgG hadde en halveringstid på tilnærmet 8 dager.

For å anslå den terapeutiske virkning ble mus (10 dyr/gruppe) som bar A431-tumor-xenotransplantater gitt 10 doser (tilnærmet 10 mg IgG pr mus pr dose) intraperitonealt av protein G-renset polyklonalt anti-mAng-2-antistoff på dag 1,5, 6,7, 8,12,13,14,15 og 18 etter xenotransplantasjonen. Tumorstørrelsen ble målt på 7, 12,15,19 og 21. Kroppsvekten ble målt på dag 0,7,15 og 21 og ble ikke påvirket av behandlingen. Resultatene viste at polyklontalt anti-Ang-2-antistoff inhiberte veksten av xenotransplantert A431-tumor med tilnærmet 50 %, med p=0,008 sammenlignet med kontrolldyr tilført ikke-immunrenset polyklonalt antiserum (10 mg IgG pr mus pr dose) og bærerstoff (PBS) ved gjentatte målinger ANOVA.

For å analysere virkningen av fullt ut humane monoklonale anti-Ang-2-antistoffer in vivo ble mus (10 dyr/gruppe) som bar A431 -tumor-xenotransplantater behandlet intraperitonealt med anti-Ang-2-antistoff fra klon 533, 537 eller 544, eller med negative kontroller med PBS eller humant IgG 1-kappa. Dosen var tilnærmet 420 ug protein pr mus for den første dosen, tilnærmet 140 ug protein pr mus for hver av de neste tre dosene og tilnærmet 55 ug protein pr mus for hver av de neste fire dosene, for i alt 8 doser pr mus. Tumorvolum og kroppsvekt ble målt to ganger ukentlig. Ved undersøkelsens avslutning ble dyrene avlivet og serum oppsamlet for måling av antistoffhivået ved ELISA. Tumorer og et utvalg av normale vev ble oppsamlet fra alle grupper.

Det ble funnet bemerkelsesverdige forskjeller i tumorvekst mellom de anti-Ang-2-behandlede gruppene og kontrollgruppene, som vist i figur 1. Alle tre behandlinger med anti-Ang-2 inhiberte tumorveksten sammenlignet med kontrollene (p< 0,005 sammenlignet med hlgGl- kontrollen for alle behandlinger ved anvendelse av gjentatt måling-ANOVA for alle tre antistoffer). I motsetning til dette fortsatte tumorene i kontrollgruppene å vokse med mye større hastighet.

EKSEMPEL 6

Epitopkartlegging

Fullengde (aminosyre 1-495), N-terminale (aminosyre 1-254) og C-terminale (aminosyre 255-495) humane Ang-2 (hAng-2)-proteiner ble klonet inn i en CMV-drevet pattedyrekspresjonsvektor med C-teminale 6xHis-merkelapper. De tre resulterende konstruksjoner pluss en vektorkontroll ble forbigående uttrykt i 293T-celler. Kondisjonert medium ble så oppsamlet fra de transfekterte cellene, og ekspresjonsnivået for Ang-2 i mediet ble estimert ved anti-6xhis-ELISA og Western blotting.

Bindingsepitopen for anti-Ang-2-antistoffer og peptistoffer ble bestemt ut fra deres evne til å binde de tre versjonene av humant hAng-2 ved ELISA ifølge følgende fremgangsmåte: en 96-brønners analyseplate med høy bindingsaffinitet ble belagt med

100 ul kondisjonert medium pr brønn og inkubert ved 37 °C i 1 time. Kondisjonert medium ble avsugt og platen blokkert med 200 ul/brønn 5% BSA i PBS ved romtemperatur i 1 time. Blokkeringsløsningen ble så avsugd. 100 ul/brønn med antistoff, peptistoff eller Tie2-Fc ble tilsatt ved 1 ug/ml i 1 % BSA i PBS og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Brønnene ble vasket 4 ganger med 200 (il 0,1 % Tween i PBS. 100 (il/brønn av HRP-konjugert anti-humant-IgG eller anti-muse-IgG fra geit ble tilsatt, og platen ble inkubert ved romtemperatur i 45 minutter. Platene ble så vasket 4 ganger med 200 ul 0,1 % Tween i PBS. 100 ul/brønn av TMB-substrat ble så tilsatt. O.D. ble avlest ved 370 nm.

Resultatene gis i figur 2A, figur 2B og figur 2C.

Claims (15)

1. Isolert humanisert eller humant antistoff,karakterisert vedat det omfatter en tungkjede variabel region og en lettkjede variabel region, hvori nevnte tungkjede variabel region omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 11 som ikke har mer enn fem aminosyresubstitusj oner, og nevnte lettkjede variabel region omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 12 som ikke har mer enn to aminosyresubstitusj oner, og hvor antistoffet nøytraliserer eller inhiberer interaksjonen mellom angiopoietin-2 (Ang-2) og Tie-2.

2. Isolert antistoff ifølge krav 1, hvor det har en enkelt aminosyresubstitusj on i SEQ ID NO: 11, hvori enkelt-aminosyresubstitusjonen er i hvilken som helst av CDR1, CDR2 og CDR3, og hvori antistoffet har en enkelt aminosyresubstitusj on i SEQ ID NO: 12, hvori enkelt-aminosyresubstitusjonen er i hvilken som helst av CDR1, CDR2 og CDR3.

3. Isolert antistoff ifølge kravene 1 eller 2, hvor antistoffet er monoklonalt.

4. Isolert antistoff ifølge kravene 1-3, hvor antistoffet er fullstendig humant.

5. F armasøytisk blanding,karakterisert vedat den omfatter det isolerte humaniserte eller humane antistoffet ifølge krav 4 og et farmasøytisk akseptabelt formuleringsmiddel.

6. Nukleinsyremolekyl,karakterisert vedat det koder for antistoffet ifølge hvilke som helst av kravene 1 -4.

7. Vektor,karakterisert vedat den omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 6.

8. Isolert vertscelle,karakterisert vedat den inneholder vektoren ifølge krav 7.

9. Konjugat,karakterisert vedat det omfatter antistoffet ifølge hvilke som helst av kravene 1-4.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff,karakterisert vedat den omfatter a) transformere en vertscelle med i det minste ett nukleinsyremolekyl ifølge krav 6; b) uttrykke nukleinsyremolekylet i vertscellen; og c) isolere antistoffet, hvori vertscellen ikke er en human celle.

11. Anvendelse av et antistoff ifølge hvilke som helst av kravene 1-4 for fremstilling av et medikament for inhibering av uønsket angiogenese..

12. Anvendelse av et antistoff ifølge hvilke som helst av kravene 1-4 for fremstilling av et medikament for behandling av kreft.

13. Anvendelse av et antistoff ifølge hvilke som helst av kravene 1-4 for fremstilling av et medikament for inhibering av angiopoietin-2-aktivitet.

14. Anvendelse av et antistoff ifølge hvilke som helst av kravene 1-4 for fremstilling av et medikament for behandling av minst én av okular neovaskulær sykdom, hemangioblastom, hemangiom, inflammatorisk sykdom, kroniske inflammasjonsforstyrrelser, endometriose, neoplastisk sykdom, beinrelatert sykdom eller psoriasis.

15. Anvendelse av et antistoff ifølge hvilke som helst av kravene 1-4 og et kjemoterapeutisk middel for fremstilling av et medikament for behandling av kreft.