BR112018068739B1

BR112018068739B1 - Métodos para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade, semente de planta revestida e composição

Info

Publication number: BR112018068739B1
Application number: BR112018068739-1A
Authority: BR
Inventors: Brian M. Thompson; Jorg Augustin
Original assignee: Spogen Biotech Inc
Priority date: 2016-03-16
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2023-10-03
Also published as: EP3429347A4; MX2022008945A; US20240132417A1; US20240132418A1; AU2023226744A1; US20220135492A1; AU2021269338A1; US20230322642A1; US11124460B2; AU2017233034A1; EP3429347A1; CN109640649A; AU2023226725A1; US20220055961A1; IL295513A; CA3221941A1; IL295513B1; AU2023226740A1; IL304057A; AU2021269338B2

Abstract

métodos para promover a fitossanidade usando enzimas livres e microrganismos que superexpressam enzimas. métodos para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade usando enzimas livres ou microrganismos recombinantes que superexpressam enzimas são fornecidas. sementes de plantas revestidas com enzimas livres ou microrganismos recombinantes que superexpressam enzimas também são fornecidas. são fornecidas composições compreendendo um fertilizante e uma enzima ou um microrganismo recombinante que superexpressa uma enzima. enzimas modificadas tendo atividade de acc desaminase, microrganismos recombinantes que expressam as enzimas modificadas, sementes de plantas tratadas com as enzimas modificadas ou microrganismos recombinantes, e métodos para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade usando as enzimas modificadas ou microrganismos recombinantes também são fornecidos.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N° 62/309.426, depositado em 16 de março de 2016, cuja totalidade é aqui incorporada por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] Métodos para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade usando enzimas livres ou microrganismos recombinantes que superexpressam enzimas são fornecidos. Sementes de plantas tratadas com enzimas livres ou microrganismos recombinantes que superexpressam enzimas também são fornecidas. São fornecidas composições compreendendo um fertilizante e uma enzima ou um microrganismo recombinante que superexpressa uma enzima. Enzimas modificadas com atividade de ACC desaminase, microrganismos recombinantes que expressam as enzimas modificadas, sementes de plantas tratadas com as enzimas modificadas ou microrganismos recombinantes, e métodos para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade usando as enzimas modificadas ou microrganismos recombinantes também são fornecidos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Dentro da zona que circunda as raízes de uma planta existe uma região chamada rizosfera. Na rizosfera, bactérias, fungos e outros organismos competem para nutrientes e para se ligarem às estruturas das raízes da planta. Bactérias e fungos prejudiciais e benéficos podem ocupar a rizosfera. As bactérias, fungos e o sistema radicular da planta podem ser influenciados pelas ações das enzimas na rizosfera. O aumento do solo ou o tratamento de plantas com algumas destas enzimas teria efeitos benéficos sobre as populações globais de bactérias e fungos benéficos do solo, criaria um ambiente do solo global mais saudável para o crescimento das plantas, melhoraria o crescimento das plantas e proporcionaria a proteção de plantas contra certas patógenos bacterianos e fúngicos. O ambiente em torno das raízes de uma planta (a rizosfera) é uma mistura única de bactérias, fungos, nutrientes e raízes que tem qualidades diferentes das do solo nativo. A relação simbiótica entre estes organismos é única e pode ser alterada para melhor com a inclusão de proteínas exógenas.

[004] Assim, existe uma necessidade na técnica de um método para eficazmente dispensar enzimas e outras proteínas para as plantas. Além disso, existe uma necessidade na técnica de intensificar a resposta das plantas às enzimas e proporcionar benefícios ao agricultor.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Uma enzima é fornecida. A enzima compreende uma sequência de aminoácidos que codifica uma enzima com atividade de 1- aminociclopropano-1-carboxilato desaminase (ACC desaminase) e um peptídeo sinal. O peptídeo sinal resulta na secreção da enzima quando a enzima é expressa em um microrganismo. Microrganismos recombinantes que expressam a enzima também são fornecidos. São também fornecidas formulações compreendendo a enzima ou o microrganismo recombinante e um carreador agricolamente aceitável. Sementes de plantas tratadas com a enzima, o microrganismo recombinante ou a formulação também são fornecidas.

[006] Uma enzima com atividade de ACC desaminase é fornecida. A sequência de aminoácidos da enzima compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de uma D-cisteína desulfidrase de tipo selvagem ou enzima ACC desaminase a partir de uma bactéria do gênero Bacillus. A substituição de aminoácidos resulta em atividade aumentada de ACC desaminase em comparação com a ACC desaminase em comparação com a atividade de ACC desaminase da D-cisteína desulfidrase do tipo selvagem ou enzima ACC desaminase sob as mesmas condições. Microrganismos recombinantes que expressam a enzima também são fornecidos. São também fornecidas formulações compreendendo a enzima ou o microrganismo recombinante e um carreador agricolamente aceitável. Sementes de plantas tratadas com a enzima, o microrganismo recombinante ou a formulação também são fornecidas.

[007] Um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de qualquer uma das enzimas com atividade de ACC desaminase ou uma formulação compreendendo uma tal enzima e um carreador agricolamente aceitável para um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta.

[008] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de qualquer um dos microrganismos recombinantes que expressam uma enzima com atividade de ACC desaminase ou uma formulação compreendendo um tal microrganismo recombinante e um carreador agricolamente aceitável para um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta, ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta.

[009] Ainda outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de uma enzima livre a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma glucanase não- celulolítica, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas.

[010] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de duas ou mais enzimas livres a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta. As enzimas são independentemente selecionadas de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma mananase, uma pectinase, uma glucanase e uma ACC desaminase.

[011] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de uma enzima livre a uma planta ou a uma semente de planta. A enzima compreende uma glucanase. A aplicação da enzima à semente da planta compreende: (a) aplicar a enzima à semente da planta no momento da plantação; ou (b) revestir a semente da planta com a enzima.

[012] Ainda um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de uma enzima livre a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta. A enzima compreende uma glucanase. O método compreende ainda a aplicação de uma proteína expansina ao meio de crescimento de plantas, à planta, à semente da planta ou à área que circunda uma planta ou uma semente de planta.

[013] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de uma enzima livre a uma planta ou a uma semente de planta. A enzima compreende uma fitase.

[014] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende aplicar um fertilizante e uma enzima livre a um meio de crescimento de plantas, uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta, ou a uma planta ou semente de planta. A enzima livre compreende uma fitase.

[015] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende aplicar um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou semente de planta. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou da proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima e selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma mananase, uma pectinase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[016] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende aplicar um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou semente de planta. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da proteína ou enzima expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina.

[017] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende aplicar um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou semente de planta. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma fitase, uma mananase, uma pectinase, uma fosfatase ácida, e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[018] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende aplicar um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou semente de planta. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma fitase, uma mananase, uma pectinase, uma fosfatase ácida, e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não faz parte de uma proteína de fusão.

[019] Uma semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta é tratada com uma enzima livre. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma mananase, uma pectinase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma glucanase não-celulolítica, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas.

[020] Outra semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta é tratada com duas ou mais enzimas livres, em que as enzimas são independentemente selecionadas de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma mananase, uma pectinase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma glucanase e uma ACC desaminase.

[021] Uma semente de planta revestida é fornecida. A semente da planta é revestida com uma enzima livre. A enzima compreende uma glucanase.

[022] Uma semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta é tratada com uma enzima livre e uma proteína expansina. A enzima compreende uma glucanase.

[023] Uma semente de planta é fornecida. A semente da planta é revestida com um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma fitase, uma mananase, uma pectinase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[024] Outra semente de planta é fornecida. A semente da planta é revestida com um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou proteína expansina, em que a expressão da enzima é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo de tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina.

[025] No entanto, uma outra semente de planta é fornecida. A semente da planta é revestida com um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[026] Outra semente de planta é fornecida. A semente da planta é revestida com um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não faz parte de uma proteína de fusão.

[027] Uma composição é fornecida. A composição compreende um fertilizante e uma enzima ou uma proteína expansina. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas.

[028] Outra composição é fornecida. A composição compreende um fertilizante e um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[029] Ainda outra composição é fornecida. A composição compreende um fertilizante e um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina.

[030] Uma outra composição é fornecida. A composição compreende um fertilizante e um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[031] Uma outra composição é fornecida. A composição compreende um fertilizante e um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não faz parte de uma proteína de fusão.

[032] Os recursos da invenção são ainda definidos nas reivindicações anexas e na lista de modalidades fornecidas abaixo na Seção intitulada “MODALIDADES”. Outros objetos e recursos serão em parte aparentes, e em parte indicados a seguir.

DEFINIÇÕES

[033] Quando os artigos “um”, “uma”, “o”, “a” e “referido” e “referida” são usados aqui, eles significam “pelo menos um” ou “um ou mais”, salvo indicação em contrário.

[034] O termo “membro da família Bacillus cereus”, como é aqui usado, refere-se a qualquer espécie de Bacillus que seja capaz de produzir um exósporo. Assim, a família de bactérias Bacillus cereus inclui as espécies Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis e Bacillus toyoiensis. Os membros da família Bacillus cereus são também referidos na técnica como “Bacillus cereus senso lato”.

[035] Os termos “composição” e “formulação” são aqui usados indistintamente para se referir a uma mistura de duas ou mais substâncias químicas ou biológicas (por exemplo, uma mistura de uma enzima e um carreador agricolamente aceitável ou uma mistura de um microrganismo recombinante e um carreador agricolamente aceitável).

[036] Os termos “compreendendo”, “incluindo” e “com” têm a intenção de ser inclusivos e significam que pode haver outros elementos além dos elementos listados.

[037] O termo “foliar” aqui usado com relação à aplicação de enzimas ou microrganismos recombinantes a plantas significa que a enzima ou o microrganismo recombinante é aplicado a uma ou mais porções aéreas da planta, incluindo caules, folhas, frutos, flores, ou outras porções aéreas expostas da planta.

[038] O termo “enzima livre”, como aqui usado, refere-se a uma preparação de enzima que é substancialmente isenta de células intactas. O termo “enzima livre” inclui, mas não se limita a, extratos celulares brutos contendo uma enzima, enzima parcialmente purificada, substancialmente purificada ou purificada. As enzimas livres podem opcionalmente ser imobilizadas nem uma matriz ou suporte química(o) para permitir a liberação controlada da enzima. Preparações enzimáticas livres preferencialmente não incluem enzimas ligadas ao exósporo de um membro da família Bacillus cereus. As enzimas livres também preferencialmente não incluem enzimas ligadas ao exósporo de um esporo de membro da família Bacillus cereus intacto.

[039] O termo “proteína de fusão”, como é aqui usado, refere-se a uma proteína com uma sequência de polipeptídeos que compreende sequências derivadas de duas ou mais proteínas separadas. Uma proteína de fusão pode ser gerada por junção de uma molécula de ácido nucleico que codifica todo ou parte de um primeiro polipeptídeo com uma molécula de ácido nucleico que codifica todo ou parte de um segundo polipeptídeo para criar uma sequência de ácidos nucleicos que, quando expressada, produz um único polipeptídeo com propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais.

[040] O termo “taxa de germinação”, como usado aqui, refere-se ao número de sementes que germinam durante um período de tempo particular. Por exemplo, uma taxa de germinação de 85% indica que 85 de 100 sementes germinam durante um determinado período de tempo.

[041] O termo “glucanase”, como é aqui usado, refere-se a qualquer enzima que seja capaz de hidrolisar uma ligação glicosídica. O termo “glucanase não-celulolítica”, como aqui usado, refere-se a qualquer glucanase cuja atividade enzimática primária não é direcionada às subunidades da celulose ou da celulose como substrato. Uma glucanase não-celulolítica é preferencialmente incapaz de usar a celulose como substrato.

[042] O termo “imobilização” como usado aqui em referência à imobilização de uma enzima em uma matriz ou suporte refere-se à ligação da enzima à matriz ou suporte de modo que a enzima seja mantida na matriz ou no suporte ou liberada do suporte durante um período de tempo controlado, em vez de se dissipar no ambiente de maneira descontrolada.

[043] Os termos “sequência nativa”, “sequência de aminoácidos nativa”, “sequência de tipo selvagem” e “sequência de aminoácidos do tipo selvagem” são aqui usados indistintamente para se referirem a uma sequência de aminoácidos tal como existe em uma proteína de ocorrência natural.

[044] Os termos “superexpressar” e “superexpressão” como usados aqui em referência a microrganismos recombinantes significam que o microrganismo recombinante foi modificado de modo que o microrganismo recombinante expresse uma proteína (por exemplo, uma enzima) em um nível que é aumentado em comparação ao nível de expressão da mesma proteína, um microrganismo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições.

[045] Um “meio de crescimento de plantas” inclui qualquer material que seja capaz de suportar o crescimento de uma planta.

[046] Os termos “promover o crescimento de plantas” e “estimular o crescimento de plantas” são aqui usados indistintamente e referem-se à capacidade de intensificar ou aumentar pelo menos uma altura, um peso, um tamanho de folha, um tamanho de raiz, um tamanho de fruto ou um tamanho do caule, e/ou uma capacidade de aumentar o rendimento de proteína da planta e/ou aumentar o rendimento de cultivo.

[047] O termo “promoção de fitossanidade” refere-se a qualquer efeito benéfico na saúde de uma planta incluindo, mas não limitado a, taxa de germinação aumentada, germinação sincronizada aumentada, suscetibilidade diminuída a um patógeno, suscetibilidade diminuída a um estresse ambiental (por exemplo, seca, inundação, calor, congelamento, sal, metais pesados, pH baixo, pH alto ou uma combinação de qualquer um dos mesmos), rendimento de cultivo aumentado, nodulação da raiz aumentada e absorção de nutrientes aumentada e/ou conteúdo de nutrientes (por exemplo, absorção de açúcar aumentada ou conteúdo de açúcar ou captação de proteína aumentada ou conteúdo de proteína aumentada).

[048] O termo “rizosfera” é usado de forma intercambiável com “zona de raiz” para indicar aquele segmento do solo que envolve as raízes de uma planta e é influenciado por elas.

[049] O termo “parcialmente purificado”, como usado aqui em referência às enzimas, significa que uma preparação bruta da enzima (por exemplo, um lisado celular) foi submetida a procedimentos que removem pelo menos alguns componentes não enzimáticos (por exemplo, proteínas residuais, material de células mortas, água em excesso e/ou detritos celulares indesejados). Em uma preparação de enzima parcialmente purificada, a enzima compreende preferencialmente pelo menos 1% do conteúdo total de proteína na preparação, mais preferivelmente pelo menos 3% do conteúdo total de proteína na preparação, e ainda mais preferencialmente maior que 5% do conteúdo total da proteína na preparação.

[050] O termo “substancialmente purificado” como aqui usado em referência às enzimas significa que a preparação de enzima foi submetida a procedimentos que removem uma quantidade substancial de componentes não enzimáticos (por exemplo, proteínas residuais, material de células mortas, excesso de água, e/ou detritos celulares indesejados). Em uma preparação de enzima substancialmente purificada, a enzima compreende, preferencialmente, mais que 30% do conteúdo total de proteína na preparação, mais preferencialmente, maior que cerca de 40% do conteúdo total de proteína na preparação, e ainda mais preferencialmente maior que 50% do conteúdo total de proteína na preparação.

[051] O termo “quantidade sinergicamente eficaz”, como usado aqui, refere-se a uma quantidade de uma primeira substância (por exemplo, uma primeira enzima) que quando usada em combinação com uma segunda substância (por exemplo, uma segunda enzima) que produz um efeito biológico maior que a soma dos efeitos biológicos de cada uma das respectivas primeira e segunda substâncias quando usadas sozinhas.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS

[052] A presente invenção é geralmente direcionada a métodos que estimulam o crescimento das plantas e/ou promovem a fitossanidade. Os métodos compreendem a aplicação de enzimas livres, proteínas expansinas ou bactérias recombinantes que superexpressam enzimas a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma semente de planta. A presente invenção também é direcionada a sementes tratadas ou revestidas com enzimas livres ou bactérias recombinantes que superexpressam enzimas. A presente invenção também é direcionada a composições compreendendo um fertilizante e uma enzima ou bactéria recombinante que superexpressem uma enzima. O uso de enzimas livres ou de bactérias recombinantes que superexpressam enzimas para a dispensação de enzimas a plantas permite pequenas rajadas de atividade enzimática, que por sua vez fornecem um impacto seguro e de curta duração na planta, com materiais residuais limitados remanescentes em material de planta colhível. Alternativamente, em situações em que é desejado um efeito mais prolongado, as enzimas livres podem ser imobilizadas em uma matriz ou um suporte de modo a proporcionar uma liberação controlada das enzimas.

1. SEQUÊNCIAS DE ENZIMAS E PROTEÍNAS EXPANSINAS

[053] Para facilitar a referência, sequências ilustrativas para enzimas ACC desaminase de tipo selvagem e modificadas, bem como sequências para as outras enzimas e proteínas expansinas que podem ser usadas em conexão com os métodos, sementes e composições aqui descritas, são fornecidas abaixo. A. D-Cisteína Desulfidrase e ACC Desaminases

[054] Para facilitar a referência, as descrições das sequências de nucleotídeos ilustrativas de D-cisteína desulfidrase e 1-aminociclopropano-1- carboxilato desaminase (ACC desaminase) são fornecidas na Tabela 1 abaixo, juntamente com as SEQ ID NOs. A Tabela 2 abaixo fornece as sequências de aminoácidos correspondentes para as sequências de nucleotídeos listadas na Tabela 1. Tal como explicado em maiores detalhes abaixo, a mutação de certos aminoácidos em uma D-cisteína desulfidrase de tipo selvagem ou enzima ACC desaminase pode resultar em uma enzima com uma atividade de ACC desaminase aumentada em comparação com a atividade de ACC desaminase da enzima de tipo selvagem sob as mesmas condições.

[055] Na Tabela 1, SEQ ID NOs. 1-3 e 111 são sequências de nucleotídeos para enzimas do tipo selvagem que exibem atividade de ACC desaminase e D-cisteína desulfidrase, e SEQ ID NOs. 4-6 e 112 são sequências de nucleotídeos que codificam para versões correspondentes dessas enzimas com duas substituições de aminoácidos em relação à sequência do tipo selvagem que resultam em atividade da ACC desaminase aumentada. Assim, por exemplo, a SEQ ID NO: 1 fornece a sequência de nucleotídeos para uma enzima do tipo selvagem, e a SEQ ID NO: 4 fornece a sequência de nucleotídeos para a mesma enzima em que a sequência de nucleotídeos foi alterada para codificar uma enzima com duas substituições de aminoácidos em relação à enzima codificada pela SEQ ID NO: 1. De modo similar, a SEQ ID NO: 2 fornece fornece a sequência de nucleotídeos para uma enzima do tipo selvagem, e a SEQ ID NO: 5 fornece a sequência de nucleotídeos para a mesma enzima, em que a sequência de nucleotídeos foi alterada para codificar uma enzima com duas substituições de aminoácidos em relação à enzima codificada pela SEQ ID NO: 2. Da mesma forma, a SEQ ID NO: 3 é uma sequência de tipo selvagem e a SEQ ID NO: 6 fornece a sequência alterada correspondente, e SEQ ID NO: 111 é uma sequência do tipo selvagem e a SEQ ID NO: 112 fornece a sequência alterada correspondente.

[056] Na Tabela 2, SEQ ID NOs. 7 a 9 e 113 são sequências de aminoácidos para enzimas do tipo selvagem que exibem atividade de ACC desaminase desulfidrase e de D-cisteína desulfidrase, e SEQ ID NOs. 10-12 e 114 são sequências de aminoácidos para as versões correspondentes destas enzimas com duas substituições de aminoácidos em relação à sequência de tipo selvagem que resultam em atividade enzimática aumentada. Assim, a SEQ ID NO: 7 é uma sequência de tipo selvagem e a SEQ ID NO: 10 fornece a sequência de aminoácidos para a mesma enzima com as duas substituições de aminoácidos em relação à sequência do tipo selvagem. SEQ ID NOs. 8 e 11, 9 e 12, e 113 e 114 são relacionadas entre si da mesma maneira. Os aminoácidos substituídos são mostrados em SEQ ID NOs. 10-12 e 114 na Tabela 2, em texto em negrito e sublinhado.TABELA 1. SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS PARA DE D-CISTEÍNA DESULFIDRASE E ACC DESAMINASESTABELA 2. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA D-CISTEÍNA DESULFIDRASE E ACC DESAMINASES B. Fosfolipases

[057] Para facilitar a referência, as descrições de sequências de aminoácidos de fosfolipase ilustrativas são fornecidas na Tabela 3 abaixo, juntamente com as suas SEQ ID NOs.TABELA 3. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA FOSFOLIPASES

[058] As sequências de aminoácidos nativas das fosfolipases de SEQ ID NOs. 13, 14 e 15 incluem a sequência de peptídeos sinal MKKKVLALAAAITLVAPLQSVAFA (SEQ ID NO: 49) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido das SEQ ID NOs. 13, 14 e 15. Este peptídeo sinal não está incluído nas SEQ ID NOs. 13, 14 ou 15. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 49, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino das fosfolipases como definida em qualquer das SEQ ID NOs. 13, 14 e 15, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[059] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase de SEQ ID NO: 16 inclui o peptídeo sinal MKGKLLKGVLSLGVGLGALYSGTSAQAE (SEQ ID NO: 50) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 16. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 16. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 50, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase de SEQ ID NO: 16, ou no terminal amino como definido em qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[060] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase de SEQ ID NO: 17 inclui o peptídeo sinal MKKKVLALAAAITVVAPLQSVAFA (SEQ ID NO: 51) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 17. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 17. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 51, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase de SEQ ID NO: 17, ou o terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[061] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase de SEQ ID NO: 18 inclui o peptídeo sinal MKRKICKALICATLATSLWAGASTKVYAW (SEQ ID NO: 52) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 18. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 18. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 52, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase de SEQ ID NO: 18, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[062] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase de SEQ ID NO: 19 inclui o peptídeo sinal MLAGPLAAALPARATTGTPAFLHGVASGD (SEQ ID NO: 53) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 19. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 19. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 53, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase de SEQ ID NO: 19, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[063] A sequência de aminoácidos nativa da fosfolipase de SEQ ID NO: 115 inclui o peptídeo sinal MKKKVLALAAAITLVAPLQNVAFA (SEQ ID NO: 135) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 115. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 115. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 135, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfolipase de SEQ ID NO: 115, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.C. Lipases

[064] Para facilitar a referência, as descrições de sequências de aminoácidos de lipase ilustrativas são fornecidas na Tabela 4 abaixo, juntamente com as suas SEQ ID NOs.TABELA 4. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA LIPASES

[065] A sequência de aminoácidos nativos da lipase de SEQ ID NO: 21 inclui o peptídeo sinal MKFVKRRIIALVTILMLSVTSLFALQPSAKA (SEQ ID NO: 54) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 21. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 21. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 54, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da lipase de SEQ ID NO: 21, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[066] A sequência de aminoácidos nativa da lipase de SEQ ID NO: 118 inclui o peptídeo sinal MARTMRSRVVAGAVACAMSIAPFAGTTAVMTLATTHAAMAATAP (SEQ ID NO: 137) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 118. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 118. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 137, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluo no terminal amino da lipase de SEQ ID NO: 118, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas das proteínas expansinas aqui descritas.

[067] A sequência de aminoácidos nativa da lipase de SEQ ID NO: 119 inclui o peptídeo sinal MGIFDYKNLGTEGSKTLFADAMA (SEQ ID NO: 138) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 119. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 119. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 138, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino de SEQ ID NO: 119, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas. D. Xilanases

[068] Para facilitar a referência, as descrições de sequências ilustrativas de aminoácidos de xilanase são fornecidas na Tabela 5 abaixo, juntamente com as suas SEQ ID NOs.TABELA 5. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA XILANASES

[069] A sequência de aminoácidos nativa da xilanase de SEQ ID NO: 22 inclui o peptídeo sinal MCENLEMLNLSLAKTYKDYFKIGAAVTA (SEQ ID NO: 55) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 22. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 22. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 55, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da xilanase de SEQ ID NO: 22, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[070] A sequência de aminoácidos nativa da xilanase de SEQ ID NO: 23 inclui o peptídeo sinal MFKFKKNFLVGLSAALMSISLFSATASA (SEQ ID NO: 56)

[071] MFKFKKNFLVGLSAALMSISLFSATASA (SEQ ID NO: 56) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 23. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 23. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 56, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da xilanase de SEQ ID NO: 23, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[072] A sequência de aminoácidos nativa da xilanase de SEQ ID NO: 24 inclui o peptídeo sinal MRKKCSVCLWILVLLLSCLSGKSAYA (SEQ ID NO: 57) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 24. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 24. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 57, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da xilanase de SEQ ID NO: 24, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[073] A sequência de aminoácidos nativa da xilanase de SEQ ID NO: 25 inclui o peptídeo sinal MKLKKKMLTLLLTASMSFGLFGATSSA (SEQ ID NO: 58) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 25. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 25. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 58, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da xilanase de SEQ ID NO: 25, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas. E. Xilosidases

[074] Para facilitar a referência, as descrições de sequências de aminoácidos de xilosidase ilustrativas são fornecidas na Tabela 6 abaixo, juntamente com as suas SEQ ID NOs.TABELA 6. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA XILOSIDASES F. Lactonases

[075] Para facilitar a referência, as descrições de sequências ilustrativas de aminoácidos da lactonase são fornecidas na Tabela 7 abaixo, juntamente com as suas SEQ ID NOs.TABELA 7. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA LACTONASES G. Quitosanases

[076] Para facilidade de referência, as descrições de sequências de aminoácidos ilustrativos de quitosanase são fornecidas na Tabela 8 abaixo, juntamente com as SEQ ID NOs.TABELA 8. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA QUITOSANASES

[077] A sequência de aminoácidos nativa da quitosanase de SEQ ID NO: 29 inclui o peptídeo sinal MKISMQKADFWKKAAISLLVFTMFFTLMMSETVFA (SEQ ID NO: 59) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 29. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 29. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 59, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da quitosanase de SEQ ID NO: 29, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[078] A sequência de aminoácidos nativa da quitosanase de SEQ ID NO: 124 inclui o peptídeo sinal MHSQHRTARIALAVVLTAIPASLATAGVGYASTQASTAVK (SEQ ID NO: 139) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 124. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 124. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 139), ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da quitosanase de SEQ ID NO: 124, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas. H. Glucanases

[079] Para facilitar a referência, as descrições das sequências ilustrativas de aminoácidos da glucanase são fornecidas na Tabela 9 abaixo, juntamente com as SEQ ID NOs.TABELA 9. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA GLUCANASES

[080] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase de SEQ ID NO: 42 inclui o peptídeo sinal MKRSISIFITCLLITLLTMGGMIASPASA (SEQ ID NO: 60) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 42. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 42. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 60, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase de SEQ ID NO: 42, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[081] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase de SEQ ID NO: 43 inclui o peptídeo sinal MPYLKRVLLLLVTGLFMSLFAVTATASA (SEQ ID NO: 61) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 43. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 43. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 61, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase de SEQ ID NO: 43, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[082] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase de SEQ ID NO: 44 inclui o peptídeo sinal MKRSQTSEKRYRQRVLSLFLAVVMLASIGLLPTSKVQA (SEQ ID NO: 62) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 44. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 44. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 62, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase de SEQ ID NO: 44, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[083] A sequência de aminoácidos nativa da glucanase de SEQ ID NO: 45 inclui o peptídeo sinal MKPSHFTEKRFMKKVLGLFLVVVMLASVGVLPTSKVQA (SEQ ID NO: 63) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 45. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 45. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 63, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase de SEQ ID NO: 45, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[084] A sequência de aminoácidos nativos da glucanase de SEQ ID NO: 125 inclui o peptídeo sinal MFKKWKKFGISSLALVLVAAVAFTGWSAKASA (SEQ ID NO: 140) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 125. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 125. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 140, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da glucanase de SEQ ID NO: 125, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas. I. Proteases

[085] Para facilidade de referência, as descrições de sequências de aminoácidos de protease ilustrativas são fornecidas na Tabela 10 abaixo, juntamente com as suas SEQ ID NOs.TABELA 10. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA PROTEASES

[086] A sequência de aminoácidos nativa da protease de SEQ ID NO: 47 inclui o peptídeo sinal MKKGIIRFLLVSFVLFFALSTGITGVQA (SEQ ID NO: 64) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 47. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 47. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 64, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da protease de SEQ ID NO: 47, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[087] A sequência de aminoácidos nativa da protease de SEQ ID NO: 127 inclui o peptídeo sinal MVVFSKTAALVLGLSTAVSA (SEQ ID NO: 141) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 127. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 127. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 141, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da protease de SEQ ID NO: 127, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas. J. Mananases

[088] Para facilitar a referência, uma descrição de uma sequência de aminoácidos de mananase ilustrativa é fornecida na Tabela 11 abaixo, juntamente com a sua SEQ ID NO.TABELA 11. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS PARA UMA MANANASE

[089] A sequência de aminoácidos nativa da mananase de SEQ ID NO: 128 inclui o peptídeo sinal MAKLQKGTILTVIAALMFVILGSAAPKA (SEQ ID NO: 142) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 128. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 128. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 142, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da mananase de SEQ ID NO: 128, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas. K. Pectinases

[090] Para facilidade de referência, uma descrição de uma sequência de aminoácidos de pectinase ilustrativa é fornecida na Tabela 12 abaixo, juntamente com a sua SEQ ID NO.TABELA 12. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS PARA UMA PECTINASE

[091] A sequência de aminoácidos nativa da pectolase de SEQ ID NO: 129 inclui o peptídeo sinal MPSAKPLFCLATLAGAALAAP (SEQ ID NO: 143) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 129. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 129. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 143, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da pectolase de SEQ ID NO: 129, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas. L. Fosfatases Ácidas

[092] Para facilitar a referência, as descrições de sequências de aminoácidos ilustrativos de fosfatase ácida são fornecidas na Tabela 13 abaixo, juntamente com as SEQ ID NOs.TABELA 13. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA FOSFATASES ÁCIDAS

[093] A sequência de aminoácidos nativa da fosfatase ácida de SEQ ID NO: 130 inclui o peptídeo sinal MARGSMAAVLAVLAVAALRCAPAAA (SEQ ID NO: 144) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 130. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 130. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 144, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfatase ácida de SEQ ID NO: 130, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[094] A sequência de aminoácidos nativa da fosfatase ácida de SEQ ID NO: 131 inclui o peptídeo sinal MRGLGFAALSLHVLLCLANGVSSRRTSSYV (SEQ ID NO: 145) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 131. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 131. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 145, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fosfatase ácida de SEQ ID NO: 131, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas. M. Fitases

[095] Para facilidade de referência, as descrições de sequências ilustrativas de aminoácidos de fitase são fornecidas na Tabela 14 abaixo, juntamente com as suas SEQ ID NOs.TABELA 14. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA FITASES

[096] A sequência de aminoácidos nativa da fitase de SEQ ID NO: 132 inclui o peptídeo sinal MWWGSLRLLLLLAAAVAA (SEQ ID NO: 146) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 132. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 132. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 146, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fitase de SEQ ID NO: 132, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[097] A sequência de aminoácidos nativa da fitase de SEQ ID NO: 133 inclui o peptídeo sinal MWWGSLRLLLLLAAAVAA (SEQ ID NO: 146) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 133. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 133. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 146, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fitase de SEQ ID NO: 133, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas.

[098] A sequência de aminoácidos nativa da fitase de SEQ ID NO: 134 inclui o peptídeo sinal MGIWRGSLPLLLLAA (SEQ ID NO: 147) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 134. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 134. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 147, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da fitase de SEQ ID NO: 134, ou no terminal amino de qualquer uma das outras enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas. N. Proteínas Expansinas

[099] Para facilidade de referência, uma sequência ilustrativa de aminoácidos de expansina é fornecida na Tabela 15 abaixo, juntamente com a sua SEQ ID NOs.TABELA 15. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS PARA UMA EXPANSINA

[100] A sequência de aminoácidos nativa da proteína expansina de SEQ ID NO: 74 inclui o peptídeo sinal MKKIMSAFVGMVLLTIFCFSPQASA (SEQ ID NO: 68) no terminal amino de sequência, imediatamente precedendo o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 74. Este peptídeo sinal não está incluído na SEQ ID NO: 74. No entanto, o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 74, ou outro peptídeo sinal, pode opcionalmente ser incluído no terminal amino da protease de SEQ ID NO: 74, no terminal amino de qualquer uma das enzimas aqui descritas, ou no terminal amino de outra proteína expansina. O. Mutações que aumentam a atividade enzimática

[101] Em qualquer uma das enzimas aqui descritas, incluindo enzimas livres e enzimas que são expressas por um microrganismo recombinante, a enzima pode compreender pelo menos uma substituição de aminoácido em relação à sequência de uma sequência de tipo selvagem da mesma enzima, e em que a substituição de aminoácidos resulta na atividade aumentada da enzima em comparação com a atividade enzimática da enzima do tipo selvagem sob as mesmas condições.

II. ENZIMAS MODIFICADAS COM ATIVIDADE DE ACC DESAMINASE

[102] São fornecidas enzimas 1-aminocilopropano-1-carboxilato (ACC) desaminase modificadas. As ACC desaminases e as D-cisteína desulfidrases (DCD) frequentemente têm sequências de aminoácidos similares e podem ter atividades enzimáticas sobrepostas, podendo atuar no 1- aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) como na D-cisteína como substratos. Algumas enzimas têm apenas uma dessas atividades, enquanto outras são capazes de agir como ACC desaminases e como D-cisteína desulfidrase. As ACC desaminases clivam ACC em amônia e alfa-cetobutirato, enquanto as D- cisteína desulfidrases convertem D-cisteína em piruvato, H2S e amônia. O ACC é o precursor imediato do etileno, que pode causar efeitos indesejáveis nas plantas, se presentes em níveis altos.

[103] Assim, uma enzima com atividade de ACC desaminase aumentada seria benéfica para uso na agricultura, a fim de reduzir os níveis de ACC e, assim, reduzir os níveis de etileno. A aplicação de ACC desaminase a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta pode estimular o crescimento das plantas, promover a fitossanidade (por exemplo, aumentando a absorção de nutrientes) e retardar o amadurecimento dos frutos. Esses efeitos, por sua vez, levam ao aumento da produtividade, ao vigor da estação e à resistência das plantas aos estresses da estação inicial. As ACC desaminas também podem proteger as plantas de patógenos, bem como estresses abióticos.

[104] Como explicado em maiores detalhes abaixo, mutações podem ser feitas em enzimas que exibem atividade de D-cisteína desulfidrase e/ou ACC desaminase, a fim de aumentar a atividade de ACC desaminase da enzima. Além disso, as enzimas com atividade de ACC desaminase podem ser modificadas para incluir um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima quando é expressa em um microrganismo, permitindo uma produção e uma purificação mais fáceis da enzima. Tais modificações (mutações e a adição de um peptídeo sinal) podem ser usadas individualmente ou em combinação umas com as outras. Todas as plantas produzem ACC e respondem ao etileno, e assim tais enzimas ACC desaminases modificadas têm ampla aplicabilidade.

[105] As sequências de aminoácidos para três enzimas do tipo selvagem são fornecidas acima na Tabela 2 como SEQ ID NOs. 7 a 9 e 113. As sequências para as versões correspondentes destas enzimas do tipo selvagem que têm duas substituições de aminoácidos que resultam no atividade de ACC desaminase aumentada são fornecidas acima na Tabela 2 como SEQ ID NOs. 10-12 e 114.

[106] A ACC desaminase de ocorrência natural não é uma proteína secretada. As ACC desaminas são encontradas em muitos tipos de microrganismos, incluindo bactérias do Phyla Bacteriodetes, Firmicutes e Actinobacteria, e bactérias dos gêneros Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Bradyrhizobium, entre outras. No entanto, as ACC desaminases encontradas nestas bactérias são intracelulares, e têm exposição limitada ao substrato de ACC das plantas hospedeiras que elas colonizam.

[107] Uma ACC desaminase modificada é aqui fornecida que compreende um peptídeo sinal que resulta na secreção da ACC desaminase de um microrganismo no qual ela é expressada. Esta ACC desaminase pode ser expressa em um microrganismo, que pode depois ser aplicada a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta. A ACC desaminase é secretada pelo microrganismo onde entra em contato com o seu substrato. A ACC desaminase secretada é assim capaz de estimular o crescimento da planta e/ou promover a saúde da planta.

[108] Uma enzima é fornecida. A enzima compreende uma sequência de aminoácidos que codifica uma enzima com atividade de 1- aminociclopropano-1-carboxilato desaminase (ACC desaminase) e um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima quando a enzima é expressa em um microrganismo.

[109] A enzima com atividade de ACC desaminase pode compreender uma enzima de uma bactéria do gênero Bacillus.

[110] Em adição ou em alternativa, uma ou mais substituição(ões) de aminoácido(s) pode(m) ser introduzida(s) na sequência de aminoácidos de uma enzima ACC desaminase para aumentar a atividade enzimática.

[111] Uma enzima com atividade de ACC desaminase é fornecida. A sequência de aminoácidos da enzima compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de uma D-cisteína desulfidrase de tipo selvagem ou enzima ACC desaminase de uma bactéria do gênero Bacillus. A substituição de aminoácidos resulta na atividade de ACC desaminase aumentada em comparação com a atividade de ACC desaminase da D-cisteína desulfidrase de tipo selvagem ou enzima ACC desaminase sob as mesmas condições.

[112] A enzima compreendendo a pelo menos uma substituição de aminoácido pode ainda compreender um peptídeo sinal que resulta na secreção de enzima quando a enzima é expressa em um microrganismo.

[113] Para qualquer uma das enzimas que têm atividade de ACC desaminase, o microrganismo no qual a enzima é expressada pode compreender uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Pseudomonas, uma bactéria do gênero Rhizobium, uma bactéria do gênero Paenibacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, uma bactéria do gênero Paracoccus, uma bactéria do gênero Mesorhizobium, uma bactéria do gênero Bradyrhizobium, uma bactéria do gênero Actinobacter, uma bactéria do gênero Arthrobacter, uma bactéria do gênero Azotobacter, uma bactéria do gênero Azosprillium, uma bactéria metiltrófica facultativa pigmentada de rosa, um fungo micorrízico, um fungo do gênero Glomus, um fungo do gênero Trichoderma, um fungo do gênero Kluyera, um fungo do gênero Gliocladium, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[114] Por exemplo, o microrganismo pode compreender uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, uma bactéria do gênero Pseudomonas, uma bactéria do gênero Paenibacillus, ou uma combinação de qualquer das mesmas.

[115] Para qualquer uma das enzimas com atividade de ACC desaminase, a enzima pode compreender uma enzima Bacillus thuringiensis ou uma enzima Bacillus pseudomycoides.

[116] A enzima pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113, em que a enzima tem atividade de ACC desaminase.

[117] A enzima pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113, em que a enzima tem atividade de ACC desaminase.

[118] A enzima pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113, em que a enzima tem atividade de ACC desaminase.

[119] A enzima pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113, em que a enzima tem atividade de ACC desaminase.

[120] A enzima pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113, em que a enzima tem atividade de ACC desaminase.

[121] A enzima pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113, em que a enzima tem atividade de ACC desaminase.

[122] A enzima pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113, em que a enzima tem atividade de ACC desaminase.

[123] A enzima pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113, em que a enzima tem atividade de ACC desaminase.

[124] A enzima pode compreender duas substituições de aminoácidos em relação à sequência da D-cisteína desulfidrase ou enzima ACC desaminase de tipo selvagem, em que as substituições de aminoácidos resultam em uma atividade de ACC desaminase aumentada, em comparação com a atividade de ACC desaminase da enzima do tipo selvagem, sob as mesmas condições.

[125] Por exemplo, a sequência de aminoácidos da enzima pode compreender uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 de SEQ ID NO: 7 com um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo serina na posição 317 de SEQ ID NO: 7 com um resíduo de leucina.

[126] A sequência de aminoácidos da enzima pode compreender uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 de SEQ ID NO: 8, com um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo serina na posição 317 de SEQ ID NO: 8 com um resíduo de leucina.

[127] A sequência de aminoácidos da enzima pode compreender uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 de SEQ ID NO: 9 com um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo serina na posição 317 de SEQ ID NO: 9 com um resíduo de leucina.

[128] A sequência de aminoácidos da enzima pode compreender uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 de SEQ ID NO: 113 com um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 de SEQ ID NO: 113 com um resíduo de leucina.

[129] A enzima pode compreender qualquer uma das SEQ ID NOs. 10, 11, 12 ou 14.

[130] Quando a enzima com atividade de ACC desaminase compreende o peptídeo sinal, mas não compreende quaisquer substituições de aminoácidos em relação à sequência de uma enzima D-cisteína desulfidrase de tipo selvagem ou ACC desaminase, a ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113.

[131] Os peptídeos sinal que podem ser usados para modificar as enzimas com atividade de ACC desaminase são descritos mais adiante na Seção XII abaixo.

III. BACTÉRIAS RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM AS ENZIMAS MODIFICADAS COM ATIVIDADE DE ACC DESAMINASE E FORMULAÇÕES CONTENDO AS ENZIMAS MODIFICADAS OU AS BACTÉRIAS RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM AS ENZIMAS MODIFICADAS

[132] Os microrganismos recombinantes que expressam qualquer uma das enzimas descritas acima na Seção II são também fornecidos.

[133] Em qualquer um dos microrganismos recombinantes que expressam uma enzima descrita acima na Seção II, a expressão da enzima é preferencialmente aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob o mesmo condições.

[134] Os microrganismos adequados que podem ser usados para expressão das enzimas são descritos abaixo na Seção XIII.

[135] Formulações compreendendo um carreador agricolamente aceitável e qualquer uma das enzimas modificadas descritas acima na Secção II acima ou um microrganismo recombinante que expressa qualquer uma das enzimas modificadas são também fornecidas. Carreadores adequados que podem ser usados em tais formulações e componentes adicionais de formulação são descritos abaixo na Seção XVI.

IV. MÉTODOS PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DAS PLANTAS E/OU PROMOVER A FITOSSANIDADE

[136] Métodos para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade são fornecidos. Como descrito em maiores detalhes abaixo, os métodos compreendem a aplicação de uma enzima, proteína expansina ou um microrganismo recombinante que expressa uma enzima ou uma proteína expansina a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta.

[137] A aplicação das enzimas ou proteínas expansinas ou das bactérias recombinantes resulta preferencialmente na dispensação de níveis mais altos de enzima ou proteína expansina ao meio de crescimento de plantas, à planta, à semente da planta ou à área que circunda a planta ou semente da planta do que os níveis da enzima ou proteína expansina que seriam encontrados na natureza no meio de crescimento de plantas, da semente da planta, ou da área que circunda a planta ou a semente da planta. A. Enzimas modificadas com atividade de ACC desaminase

[138] Um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de qualquer uma das enzimas com atividade de ACC desaminase descrita acima na Seção II a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta. Alternativamente, o método pode compreender a aplicação de uma formulação compreendendo um carreador agricolamente aceitável e qualquer uma das enzimas com atividade de ACC desaminase descrita acima na Seção II a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta.

[139] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de qualquer um dos microrganismos recombinantes que expressam uma enzima com atividade de ACC desaminase descrita acima na Seção III a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta. Alternativamente, o método pode compreender a aplicação de uma formulação compreendendo um carreador agricolamente aceitável e qualquer um dos microrganismos recombinantes que expressam uma enzima com atividade de ACC desaminase descrita acima na Seção III a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta.

[140] Por exemplo, o método pode compreender a aplicação de qualquer uma das enzimas descritas na Seção II acima ao meio de crescimento de plantas, à planta, à semente de planta ou à área que circunda a planta ou à semente da planta.

[141] O método pode compreender a aplicação de enzima livre para o meio de crescimento de plantas, a planta, a semente de planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta.

[142] O método pode compreender a aplicação de qualquer um dos organismos recombinantes descritos acima na Seção III para o meio de crescimento de plantas, a planta, a semente de planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta.

[143] Os efeitos de qualquer uma das enzimas com atividade de ACC desaminase descrita nesta seção ou em outro local das plantas podem ser testados, por exemplo, por medições do aumento na massa da raiz, aumento na altura da planta, aumento no rendimento, aumento na nodulação, alterações na senescência foliar, alterações na germinação de sementes e atraso no amadurecimento dos frutos. B. Fosfolipases, lipases, xilanases, xilosidases, lactonases, quitosanases, glucanases, proteases, mananases, pectinases, e fosfatases ácidas, fitases, ACC desaminases e proteínas expansinas

1. ENZIMAS LIVRES

[144] Como descrito em maiores detalhes abaixo, métodos para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade envolvendo o uso de fosfolipases, lipases, xilosidases, lactonases, quitosanases, glucanases, proteases, mananases, pectinases, fosfatases ácidas, fitases, ACC desaminases, e/ou proteínas expansinas e/ou bactérias recombinantes que expressam tais enzimas ou proteínas expansinas são fornecidas.

[145] Um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de uma enzima livre a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma glucanase não-celulolítica, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas.

[146] A enzima é preferencialmente selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma mananase, uma pectinase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações uma das mesmas.

[147] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de duas ou mais enzimas livres a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta. As enzimas são independentemente selecionadas de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma mananase, uma pectinase, uma glucanase e uma ACC desaminase.

[148] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de uma enzima livre a uma planta ou a uma semente de planta. A enzima compreende uma glucanase. A aplicação da enzima à semente da planta compreende: (a) aplicar a enzima à semente da planta no momento da plantação; ou (b) revestir a semente da planta com a enzima.

[149] No método compreendendo a aplicação de uma enzima livre a uma planta ou semente de planta, em que a enzima compreende uma glucanase, o método pode compreender revestir a semente da planta com uma formulação de revestimento de sementes compreendendo a enzima e um carreador agricolamente aceitável.

[150] No método compreendendo a aplicação de uma enzima livre a uma planta ou semente de planta, em que a enzima compreende uma glucanase, o método pode ainda compreender a aplicação da enzima ou uma proteína expansina ao meio de crescimento de plantas ou a uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta. Por exemplo, o método pode compreender a aplicação da enzima ou da proteína expansina ao meio de crescimento de plantas. O método pode compreender a aplicação da enzima e da proteína expansina ao meio de crescimento de plantas.

[151] No entanto, outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de uma enzima livre a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta. A enzima compreende uma glucanase. O método compreende ainda a aplicação de uma proteína expansina ao meio de crescimento de plantas, à planta, à semente da planta ou à área que circunda uma planta ou a uma semente de planta.

[152] No método compreendendo a aplicação de uma enzima livre e uma proteína expansina, aplicando a enzima ou a proteína expansina à semente da planta compreende: (a) aplicação da enzima ou proteína expansina à semente da planta no momento da plantação; ou (b) revestir a semente da planta com a enzima ou proteína expansina. Por exemplo, o método pode compreender revestir a semente da planta com uma formulação de revestimento de sementes compreendendo um carreador agricolamente aceitável e a enzima, a proteína expansina, ou ambas, a enzima e a proteína expansina.

[153] Outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende a aplicação de uma enzima livre a uma planta ou a uma semente de planta. A enzima compreende uma fitase.

[154] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende aplicar um fertilizante e uma enzima livre a um meio de crescimento de plantas, a uma área que circunda uma planta ou a uma semente de planta, ou a uma planta ou semente de planta. A enzima livre compreende uma fitase.

2. MICRORGANISMOS RECOMBINANTES

[155] Um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende aplicar um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área que circunda uma planta ou a semente de planta. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma mananase, uma pectinase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[156] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende aplicar um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou semente de planta. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina.

[157] Um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende aplicar um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, a uma planta, a uma semente de planta ou a uma área que circunda uma planta ou semente de planta. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma fitase, uma mananase, uma pectinase, uma fosfatase ácida, e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[158] Ainda em um outro método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade é fornecido. O método compreende aplicar um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou semente de planta. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma fitase, uma mananase, uma pectinase, uma fosfatase ácida, e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não faz parte de uma proteína de fusão.

[159] Em qualquer um dos métodos, a enzima ou proteína expansina pode ser expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[160] Onde a enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante, o microrganismo recombinante pode ser um microrganismo formador de esporos.

[161] Em qualquer dos métodos que não os métodos em que a enzima não faz parte de uma proteína de fusão, a enzima ou proteína expansina pode ainda compreender um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina. Peptídeos sinal adequados são descritos na Seção XII abaixo.

[162] Em qualquer dos métodos, a enzima ou proteína expansina não está adequadamente ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[163] Em qualquer um dos métodos, a enzima ou proteína expansina não está adequadamente ligada ao exósporo de um esporo de membro da família Bacillus cereus intacto.

[164] Em qualquer um dos métodos que não os métodos que envolvem o uso de um peptídeo sinal, a enzima ou proteína expansina não é adequadamente parte de uma proteína de fusão. C. Vias para dispensação de enzimas, expansinas e/ou microrganismos recombinantes a plantas

[165] Em qualquer dos métodos aqui descritos, o método pode compreender a aplicação da enzima ou do microrganismo recombinante ao meio de crescimento de plantas. Por exemplo, a enzima ou o microrganismo recombinante pode ser aplicada(o) no sulco ou pode ser incluída(o) em uma emenda do solo. Alternativamente, ou adicionalmente, a enzima ou o microrganismo recombinante pode ser impregnada(o) em uma partícula seca, uma vermiculite ou outra matriz, um polímero plástico, um musgo de turfeiras ou uma mistura para vasos, antes da aplicação ao meio de crescimento de plantas. A enzima ou microrganismo recombinante pode também ser aplicado ao meio de crescimento de plantas através de uma fonte de água, uma linha de irrigação por gotejamento, uma aplicação líquida de difusão ao solo, ou uma aplicação seca de difusão ao solo.

[166] O meio de crescimento de plantas pode compreender ou consistir essencialmente em um fertilizante. A mistura do fertilizante e da enzima ou do microrganismo recombinante pode então ser aplicada ao solo ou a outro meio de crescimento de plantas usando a aplicação padrão de fertilizantes, métodos, incluindo aplicação de fertilizantes em sulcos, aplicação de fertilizantes 2 x 2, aplicação de fertilizantes de transmissão, impregnação de fertilizantes, linhas de irrigação por gotejamento, aplicações na superfície e similares.

[167] Em qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o método pode compreender a aplicação da enzima, da proteína expansina, ou do microrganismo recombinante na planta.

[168] Em qualquer um dos métodos descritos no presente, o método pode compreender a aplicação da enzima, da proteína expansina, ou do microrganismo recombinante nas raízes da planta.

[169] Em qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o método pode compreender a aplicação da enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo recombinante foliar.

[170] Em qualquer dos métodos aqui descritos, o método pode compreender aplicar a enzima, a proteína expansina ou o microrganismo recombinante na semente da planta.

[171] Quando o método compreende a aplicação da enzima, da proteína expansina, ou do microrganismo recombinante a uma semente de planta, aplicando a enzima, a proteína expansina, ou o organismo recombinante à semente da planta pode compreender: (a) aplicação da enzima, da proteína expansina, ou do organismo recombinante para a semente da planta no momento da plantação; ou (b) revestir a semente da planta com a enzima, a proteína expansina ou o organismo recombinante.

[172] Por exemplo, o método pode compreender o revestimento da semente de planta com uma formulação de revestimento de sementes compreendendo: um carreador agricolamente aceitável e a enzima, a proteína expansina, o microrganismo recombinante ou uma combinação dos mesmos.

V. SEMENTES DE PLANTAS

[173] Sementes de plantas tratadas com uma enzima, proteína expansina, ou um microrganismo recombinante que expressa uma enzima ou proteína expansina também são fornecidas. A. Sementes de plantas tratadas com enzimas modificadas com atividade de ACC desaminase

[174] Uma semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta é tratada com qualquer uma das enzimas com atividade de ACC desaminase descrita acima na Seção II. Alternativamente, a semente da planta é tratada com uma formulação compreendendo qualquer uma das enzimas com atividade de ACC desaminase descrita acima na Seção II e um carreador agricolamente aceitável.

[175] Uma outra semente da planta é fornecida. A semente da planta é tratada com qualquer um dos microrganismos recombinantes que expressam uma enzima com atividade de ACC desaminase descrita acima na Seção III. Alternativamente, a semente da planta é tratada com uma formulação compreendendo qualquer um dos microrganismos recombinantes que expressam uma enzima com atividade de ACC desaminase descrita acima na Seção III. B. Sementes de plantas tratadas com enzimas ou microrganismos recombinantes

[176] Sementes de plantas tratadas com enzimas, proteínas expansinas ou bactérias recombinantes são fornecidas.

1. ENZIMAS LIVRES

[177] Uma semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta é tratada com uma enzima livre. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma mananase, uma pectinase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma glucanase não-celulolítica, uma ACC desaminase e quaisquer combinações uma das mesmas.

[178] A enzima é preferencialmente selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma mananase, uma pectinase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações uma das mesmas.

[179] Uma outra semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta é tratada com duas ou mais enzimas livres, em que as enzimas são independentemente selecionadas de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma mananase, uma pectinase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma glucanase e uma ACC desaminase.

[180] Uma semente de planta tratada é fornecida. A semente da planta é tratada com uma enzima livre e uma proteína expansina. A enzima compreende uma glucanase.

[181] Uma semente de planta revestida é fornecida. A semente da planta é revestida com uma enzima livre. A enzima compreende uma glucanase.

2. MICRORGANISMOS RECOMBINANTES

[182] Uma semente de planta é fornecida. A semente da planta é revestida com um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, protease, uma fitase, uma mananase, uma pectinase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[183] Uma outra semente de planta é fornecida. A semente da planta é revestida com um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou proteína expansina, em que a expressão da enzima é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo de tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina.

[184] Uma outra semente da planta é fornecida. A semente da planta é revestida com um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[185] Ainda em outra semente de planta é fornecida. A semente da planta é revestida com um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não faz parte de uma proteína de fusão.

[186] Em qualquer uma das sementes, a enzima ou proteína expansina pode ser expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[187] Onde a enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante, o microrganismo recombinante pode ser um microrganismo formador de esporos.

[188] Em qualquer uma das sementes que não as sementes em que a enzima não faz parte de uma proteína de fusão, a enzima ou proteína expansina pode ainda compreender um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina. Peptídeos sinal adequados são descritos na Seção XII abaixo.

[189] Em qualquer uma das sementes, a enzima ou proteína expansina não é adequadamente ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[190] Em qualquer uma das sementes, a enzima ou proteína expansina não está adequadamente ligada ao exósporo de um esporo de membro da família Bacillus cereus intacto.

[191] Em qualquer uma das sementes que não as sementes que envolvem o uso de um peptídeo sinal, a enzima ou proteína expansina não é adequadamente parte de uma proteína de fusão. C. Sementes de plantas revestidas

[192] Para qualquer uma das sementes da planta, a semente da planta pode ser revestida com a enzima, o microrganismo recombinante, a proteína expansina, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[193] Por exemplo, a semente da planta pode ser revestida com a enzima e a proteína expansina.

[194] Qualquer das sementes de plantas pode ser revestida com uma formulação de revestimento de sementes compreendendo a enzima, o microrganismo recombinante, a proteína expansina, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos, e um carreador agricolamente aceitável.

VI. COMPOSIÇÕES

[195] Composições compreendendo um fertilizante e uma enzima ou proteína expansina, ou um microrganismo recombinante que superexpressa uma enzima ou uma proteína expansina, são fornecidas. A. Enzimas

[196] Uma composição é fornecida. A composição compreende um fertilizante e uma enzima ou uma proteína expansina. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas.

[197] A enzima compreende preferencialmente uma enzima livre. 8. Microrganismos Recombinantes

[198] Uma composição é fornecida. A composição compreende um fertilizante e um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[199] Outra composição é fornecida. A composição compreende um fertilizante e um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina.

[200] Ainda uma outra composição é fornecida. A composição compreende um fertilizante e um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[201] Uma outra composição é fornecida. A composição compreende um fertilizante e um microrganismo recombinante. O microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições. A enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas. A enzima ou proteína expansina não faz parte de uma proteína de fusão.

[202] Em qualquer das composições, a enzima ou proteína expansina pode ser expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[203] Onde a enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante, o microrganismo recombinante pode ser um microrganismo formador de esporos.

[204] Em qualquer das composições que não as composições em que a enzima não faz parte de uma proteína de fusão, a enzima ou proteína expansina pode ainda compreender um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina. Peptídeos sinal adequados são descritos na Seção XII abaixo.

[205] Em qualquer das composições, a enzima ou proteína expansina não está adequadamente ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[206] Em qualquer das composições, a enzima ou proteína expansina não está adequadamente ligada ao exósporo de um esporo de membro da família Bacillus cereus intacto.

[207] Em qualquer das composições que não as composições que envolvem o uso de um peptídeo sinal, a enzima ou proteína expansina não é adequadamente parte de uma proteína de fusão.

[208] Carreadores e agroquímicos adicionais

[209] Em qualquer das composições, a composição pode ainda compreender um carreador agricolamente aceitável, um agroquímico adicional, além do fertilizante, ou uma combinação dos mesmos. Carreadores e agroquímicos adequados são descritos na Seção XVI abaixo.

VII. ENZIMAS E PROTEÍNAS EXPANSINAS PARA USO COM OS MÉTODOS, SEMENTES DE PLANTAS OU COMPOSIÇÕES

[210] Fosfolipases, lipases, xilanases, xilosidases, lactonases, quitosanases, proteases, glucanases, proteínas expansinas, fitases, fosfatases ácidas, pectinases, mananases e ACC desaminases que são adequadas para uso em conexão com os métodos, as sementes e as composições são descritas abaixo. A. Fosfolipases

[211] A enzima pode compreender uma fosfolipase.

[212] As fosfolipases podem ser usadas para qualquer um dos fins estimuladores do crescimento de plantas ou promoção da fitossanidade aqui descritos, mas são especialmente adequados para estimular o crescimento de plantas, aumentar a absorção de nutrientes e/ou aumentar o desenvolvimento da raiz e a nodulação. O aumento da nodulação da raiz intensifica a capacidade da planta de formar relações simbióticas com microrganismos fixadores de nitrogênio no solo, resultando em captação de nitrogênio aumentada e taxas de crescimento aumentadas. Esses efeitos também levam à diminuição da suscetibilidade a estresses ambientais, como a seca.

[213] As fosfolipases são enzimas que possuem atividade específica em fosfolipídios, liberando ácidos graxos livres de fosfolipídios complexos. As fosfolipases podem ser quebradas em cinco classes principais: fosfolipase A, fosfolipase B, fosfolipase C, fosfolipase D e fosfolipase E. Cada uma dessas classes atua em tipos específicos de fosfolipídios.

[214] Quando a enzima compreende uma fosfolipase, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C, uma fosfolipase D, uma fosfolipase E, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[215] Por exemplo, a fosfolipase pode compreender uma fosfolipase A, uma fosfolipase C, uma fosfolipase D, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[216] Quando a fosfolipase compreende a fosfolipase A, a fosfolipase A pode compreender uma fosfolipase Al, uma fosfolipase A2 ou uma combinação das mesmas.

[217] A fosfolipase A2 pode compreender uma fosfolipase A2 do Grupo IIA, uma fosfolipase A2 do Grupo IIC, uma fosfolipase A2 do Grupo IID, uma fosfolipase A2 do Grupo IIE, uma fosfolipase A2 do Grupo IIF, uma fosfolipase A2 do Grupo III, uma fosfolipase A2 do Grupo IVA, uma fosfolipase A2 do Grupo IVB, uma fosfolipase A2 do Grupo IVC, uma fosfolipase A2 do Grupo IVD, uma fosfolipase A2 do Grupo IVE, uma fosfolipase A2 do Grupo VIF, uma fosfolipase A2 do Grupo V, uma fosfolipase A2 do Grupo VI, uma fosfolipase A2 do Grupo VII, uma fosfolipase A2 do Grupo X, uma fosfolipase A2 do Grupo XIIA, uma fosfolipase A2 do Grupo XIIB, uma fosfolipase A2 do Grupo XV, uma fosfolipase A2 do Grupo XVI ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[218] Quando a fosfolipase compreende a fosfolipase B, a fosfolipase B pode compreender uma fosfolipase B1.

[219] Quando a fosfolipase compreende a fosfolipase C, a fosfolipase C pode compreender uma fosfolipase C beta 1, uma fosfolipase C beta 2, uma fosfolipase C beta 3, uma fosfolipase C beta 4, uma fosfolipase C delta 1, uma fosfolipase C delta 3, uma fosfolipase C delta 4, uma fosfolipase C epsilon 1, uma fosfolipase C gama 1, uma fosfolipase C gama 2, uma fosfolipase C eta 1, uma fosfolipase C eta 2, uma fosfolipase C zeta 1, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[220] Quando a fosfolipase compreende a fosfolipase D, a fosfolipase D pode compreender uma fosfolipase Dl, uma fosfolipase D2, uma fosfolipase D membro 3, uma fosfolipase D membro 4, uma fosfolipase D membro 5, uma fosfolipase D membro 6, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[221] A fosfolipase pode compreender uma 1-alquil-2- acetilglicerofosfocolina esterase, uma fosfatidilinositol desacilase, uma fosfoinositida fosfolipase C, uma esfingomielina fosfodiesterase, uma esfingomielina fosfodiesterase D, uma N-alquilglicerofosfoetanolamina fosfodiesterase, uma glicoproteína fosfolipase C de superfície variante, uma glicosilfosfatidilinositol fosfolipase D, uma fosfolipase D hidrolisante de N- acetilfosfatidiletanolamina, uma fosfatidilinositol diacilglicerol-liase, uma glicosilfosfatidilinositol diacilglicerol-liase, um domínio de fosfolipase tipo patatina contendo proteína 2 (PNPLA2), um domínio de fosfolipase tipo patatina contendo proteína 3 (PNPLA3) ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[222] A fosfolipase pode compreender uma fosfolipase de Streptomyces (por exemplo, uma fosfolipase de Streptomyces chromofuscus tal como Streptomyces chromofuscus fosfolipase D), uma fosfolipase de Bacillus (por exemplo, uma fosfolipase de Bacillus cereus, tal como, fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus ou fosfolipase C específica de fosfatidilinositol de Bacillus cereus, ou uma fosfolipase de Bacillus thuringiensis), uma fosfolipase de Clostridium (por exemplo, uma fosfolipase de Clostridium perfringens, tal como, fosfolipase C de Clostridium perfringens), ou uma combinação de qualquer das mesmas.

[223] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 13-19 e 115-117.

[224] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 13-19 e 115-117.

[225] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 13-19 e 115-117.

[226] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 13-19 e 115-117.

[227] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 13-19 e 115-117.

[228] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 13-19 e 115-117.

[229] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 13-19 e 115-117.

[230] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 13-19 e 115-117.

[231] A fosfolipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 1319 e 115-117.

[232] Quando a fosfolipase compreende uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus (por exemplo, SEQ ID NO: 115), o método pode ainda compreender a aplicação de uma mananase (por exemplo, SEQ ID NO: 128) ou uma xiloglucanase (por exemplo, SEQ ID NO: 125) para o meio de crescimento de plantas, a planta, a semente da planta ou a área que circunda a planta ou a semente da planta.

[233] Quando a fosfolipase compreende uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus (por exemplo, SEQ ID NO: 115), a semente pode ser ainda tratada com uma mananase (por exemplo, SEQ ID NO: 128) ou uma xiloglucanase (por exemplo, SEQ. ID N 125).

[234] Quando a fosfolipase compreende uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus (por exemplo, SEQ ID NO: 115), a composição pode ainda compreender uma mananase (por exemplo, SEQ ID NO: 128) ou uma xiloglucanase (por exemplo, SEQ ID NO: 125).

[235] A fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus e a mananase podem estar presentes no método, na semente ou na composição em quantidades sinergicamente eficazes.

[236] A fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus e a xiloglucanase podem estar presentes no método, na semente ou na composição em quantidades sinergicamente eficazes. B. Lipases

[237] A enzima pode compreender uma lipase.

[238] As lipases são enzimas que têm atividade específica para lipídios, clivando cadeias de ácidos graxos de moléculas de polipeptídeos maiores, como triglicerídeos. As lipases podem ser usadas para qualquer dos fins estimuladores do crescimento de plantas ou de promoção da fitossanidade aqui descritas, mas são particularmente adequadas para estimular o crescimento das plantas e intensificar a absorção de nutrientes. Esses efeitos, por sua vez, levam a um aumento no rendimento das culturas, melhoram o vigor da cultura inicial e diminuem a suscetibilidade das plantas a estresses da estação inicial.

[239] A lipase pode compreender uma carboxil éster lipase, uma diacilglicerol lipase alfa, uma diacilglicerol lipase beta, uma lipase A, uma lipase hepática, uma lipase sensível a hormônio, uma lipase gástrica, uma lipase endotelial, um membro H da lipase, membro I da família lipase, membro J da família lipase, membro K da família lipase, membro M da família lipase, membro N da família lipase, lipase de lipoproteína, lipase de monoglicerídeo, proteína 2 relacionada à lipase pancreática, proteína 3 relacionada à lipase pancreática, uma acilglicerol lipase, uma galactolipase, uma lipoproteína lipase ou uma combinação de qualquer das mesmas.

[240] A lipase pode compreender uma lipase de Bacillus subtilis, uma lipase de Bacillus thuringiensis, uma lipase de Bacillus cereus, uma lipase de Bacillus clausii, uma lipase de Burkholderia cepacia, uma lipase de Burkholderia stearothermophilus, uma lipase de Pseudomonas, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[241] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 20, 21 e 118-120.

[242] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 20, 21 e 118-120.

[243] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 20, 21 e 118-120.

[244] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com compelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 20, 21 e 118-120.

[245] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 20, 21 e 118-120.

[246] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 20, 21 e 118-120.

[247] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 20, 21 e 118-120.

[248] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 20, 21 e 118-120.

[249] A lipase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 20, 21 e 118-120. C. Xilanases

[250] A enzima pode compreender uma xilanase.

[251] As xilanases atuam no polissacarídeo xilano, um açúcar comum encontrado nas plantas e no solo. As xilanases podem ser usadas como tratamento de sementes, dispensadas ao meio de crescimento de plantas (por exemplo, na aplicação em sulco ou como uma emenda do solo) ou aplicadas como um tratamento foliar nas plantas para gerar cadeias de açúcar menores que podem ser absorvidas pela planta ou usadas para alimentar o microbioma circundante.

[252] Quando a enzima compreende uma xilanase, a xilanase pode compreender uma beta-xilanase.

[253] Por exemplo, a beta-xilanase pode compreender uma glucoronoarabinoxilana endo-1,4-beta-xilanase, uma exo-1,4-beta-xilanase, uma endo-1,4-beta-xilanase ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[254] A xilanase pode compreender uma xilanase de Caldicellulosiruptor (por exemplo, uma xilanase de Caldicellulosiruptor saccharolyticus), uma xilanase de Bacillus (por exemplo, uma xilanase de Bacillus subtilis ou Bacillus stearothermophilus), uma xilanase de Neocallimastix (por exemplo, uma xilanase de Neocallimastix patriciarum), uma xilanase de Thermomyces (por exemplo, uma xilanase de Thermomyces lanuginosus), ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[255] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 22-25, 121 e 122.

[256] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 22-25, 121 e 122.

[257] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 22-25, 121 e 122.

[258] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 22-25, 121 e 122.

[259] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 22-25, 121 e 122.

[260] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 22-25, 121 e 122.

[261] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 22-25, 121 e 122.

[262] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 22-25, 121 e 122.

[263] A xilanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 2225, 121 e 122. D. Xilosidases

[264] A enzima pode compreender uma xilosidase.

[265] As xilosidases clivam moléculas únicas de xilose de fragmentos mais curtos de xilano, um polissacarídeo comum encontrado em plantas e no solo. As xilosidases podem ser usadas como tratamento de sementes, dispensadas ao meio de crescimento de plantas (por exemplo, via aplicação no sulco ou como uma emenda do solo) ou aplicadas como tratamento foliar nas plantas para gerar cadeias de açúcar menores que podem ser absorvidas pela planta ou usadas para alimentar o microbioma circundante.

[266] Por exemplo, a xilosidase pode compreender uma xilosidase de Caldicellulosiruptor saccharolyticus, uma xilosidase de Bacillus pumilus, ou uma combinação das mesmas.

[267] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou 123.

[268] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou 123.

[269] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou 123.

[270] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou 123.

[271] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou 123.

[272] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou 123.

[273] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou 123.

[274] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou 123.

[275] A xilosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou 123. E. Lactonases

[276] A enzima pode compreender uma lactonase.

[277] As lactonases podem ser usadas para qualquer um dos fins de estimulação do crescimento de plantas ou de promoção da fitossanidade aqui descritas, mas são especialmente adequadas para diminuir a susceptibilidade das plantas a patogênios. As lactonases também são descritas como acil- homoserina lactonases e são metaloenzimas produzidas por certas espécies de bactérias. Por exemplo, as lactonases podem ser encontradas em bactérias do Filo Bacteriodetes, Firmicutes, Actinobacteria, e em bactérias dos gêneros de Pseudomonas e Bacillus, assim como outras. Lactonases alvo e inativar homoserinas lactonas aciladas. As lactonases hidrolisam as ligações ésteres de pequenas moléculas tipo hormônio comumente conhecidas como lactonas de homoserina. Na hidrólise dessas ligações lactona, a lactonase atua para evitar que essas homoserinas lactonas se liguem a seus alvos regulados transcricionalmente e, assim, interfiram no sensoreação de quórum. No entanto, a secreção de lactonase a partir de bactérias de ocorrência natural que colonizam o solo ou as plantas é limitada e indutível, e assim seria desejável proporcionar níveis mais altos de lactonase ao ambiente de uma planta.

[278] Lactonases livres ou bactérias recombinantes que expressam lactonases podem ser aplicadas a plantas (por exemplo, foliarmente ou como tratamento de sementes) ou a um meio de crescimento de plantas de modo a reduzir os níveis de lactonas no ambiente. Sem estar vinculado a nenhuma teoria em particular, acredita-se que essa redução no nível de lactonas possa, por sua vez, levar à redução de doenças nas plantas, bem como a um aumento secundário no crescimento e no desenvolvimento das plantas.

[279] Quando expressdaa em um microrganismo recombinante, a adição de um sinal de secreção à lactonase permitiria ao micróbio secretar a lactonase no meio ambiente. Sinais de secreção adequados são descritos mais abaixo na Secção XII.

[280] Quando a enzima compreende uma lactonase, a lactonase pode compreender uma 1,4-lactonase, uma 2-pirona-4,6-dicarboxilato lactonase, uma 3-oxoadipato enol-lactonase, uma actinomicina lactonase, um desoxilimonato anel A-lactonase, uma gluconolactonase, uma L-ramnono-1,4- lactonase, uma limonina-anel D-lactonase, uma esteroide-lactonase, uma triacetato-lactonase, uma xilono-1,4-lactonase, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[281] A lactonase pode compreender uma lactonase de Bacillus (por exemplo, uma lactonase de Bacillus thuringiensis, uma lactonase de Bacillus pseudomycoides ou uma combinação das mesmas), uma lactonase de Agrobacterium, uma lactonase de Rhodococcus, uma lactonase de Streptomyces, uma lactonase de Arthrobacter, uma lactonase de Sphingomonas, uma lactonase de Pseudomonas, uma lactonase de Klebsiella, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[282] A lactonase pode compreender um AiiA.

[283] A lactonase é preferivelmente específica para uma molécula sinalizadora de lactona homoserina bacteriana.

[284] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou 28.

[285] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou 28.

[286] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou 28.

[287] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou 28.

[288] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou 28.

[289] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou 28.

[290] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou 28.

[291] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou 28.

[292] A lactonase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou 28. F. Quitosanases

[293] A enzima pode compreender uma quitosanase.

[294] As quitosanases podem ser usadas para qualquer um dos fins de promoção do crescimento de plantas ou de promoção da fitossanidade aqui descritas, mas são especialmente adequadas para aumentar a absorção de nutrientes e aumentar o crescimento das plantas. Isso, por sua vez, leva a um rendimento do cultivo aumentado, vigor do estação inicial melhorado e a suscetibilidade diminuída a estresses da estação inicial. As quitosanases também são úteis para proteger as plantas de patógenos.

[295] A quitosanase pode compreender uma exo-1,4-beta-D- glucosaminidase, uma endo-1,4-beta-d-glucosaminidase, ou uma combinação das mesmas.

[296] A quitosanase pode compreender uma quitosanase de Bacillus subtilis, uma quitosanase de Streptomyces, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[297] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 29 ou 124.

[298] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 29 ou 124.

[299] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 29 ou 124.

[300] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 29 ou 124.

[301] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 29 ou 124.

[302] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 29 ou 124.

[303] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 29 ou 124.

[304] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 29 ou 124.

[305] A quitosanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 29 ou 124. G. Proteases

[306] A enzima pode compreender uma protease.

[307] As proteases podem ser usadas para qualquer um dos fins de estimulação do crescimento de plantas ou de promoção da fitossanidade aqui descritas, mas são particularmente úteis para aumentar a absorção de nutrientes e estimular o crescimento das plantas. Isso, por sua vez, leva a um aumento no rendimento do cultivo, vigor da estação melhorado e suscetibilidade diminuída a estresses da estação inicial. As proteases também são úteis para proteger as plantas de patógenos.

[308] A protease pode compreender uma subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma peptidase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, uma termolisina, uma papaína, uma pepsina, uma tripsina, uma pronase, uma carboxilase, uma serina protease, uma glutamato protease, uma aspartato protease, uma cisteína protease, uma treonina protease, uma asparagina protease, uma histidina protease, uma metaloprotease ou uma combinação de qualquer das mesmas.

[309] Por exemplo, a protease pode compreender uma cisteína protease, uma serina protease, uma treonina protease, uma aspartato protease, uma asparagina protease, uma metaloprotease, uma glutamato protease ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[310] Por exemplo, a protease pode compreender uma metaloprotease, uma serina protease, uma aspartato protease, uma histidina protease ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[311] A protease preferencialmente não consiste em uma metionina aminopeptidase.

[312] A protease preferencialmente não compreende uma metionina aminopeptidase.

[313] A protease pode compreender uma protease de Bacillus (por exemplo, uma protease de Bacillus subtilis), uma protease de Aspergillus ou uma combinação das mesmas.

[314] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 46-48 e 127.

[315] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 46-48 e 127.

[316] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 46-48 e 127.

[317] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 46-48 e 127.

[318] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 46-48 e 127.

[319] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 46-48 e 127.

[320] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 46-48 e 127.

[321] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 46-48 e 127.

[322] A protease pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 46-48 e 127. H. Glucanases

[323] A enzima pode compreender uma glucanase.

[324] As glucanases podem ser usadas para qualquer um dos fins de estimulação do crescimento de plantas ou de promoção da fitossanidade aqui descritas, mas são particularmente úteis para aumentar a absorção de nutrientes e estimular o crescimento das plantas. Isso, por sua vez, leva a um rendimento do cultivo aumentada, vigor da estação inicial melhorado e a suscetibilidade diminuída a estresses da estação inicial. Glucanases também podem ser usadas para proteger as plantas de patógenos e para reduzir a suscetibilidade a um estresse ambiental em uma planta.

[325] As glucanases usam água para romper as ligações químicas entre as moléculas individuais de glicose, os glucanos, que são polissacarídeos de cadeia longa. Glucanos podem ser quebrados em dois tipos, alfa glucano, consistindo principalmente em cadeias alfa de moléculas de glicose, e beta glucanos, consistindo principalmente em cadeias beta de moléculas de glicose. Alfa glucanos comuns incluem dextranos, glicogênios, pululanos e amido. Os alfa glucanos geralmente incluem combinações de alfa 1,4; alfa 1,6 e/ou alfa 1,3 glucanos e ramificações. Glucanases que são específicas para clivar as ligações alfa são chamadas alfa-glucanases. As beta glucanases são específicas para ligações beta entre glucanos. Beta glucanos comuns incluem celulose, laminarina, lichenina, zimosan. Beta glucanos são comumente encontrados com ligações b1,3; b1,4 e/ou b1,6 entre moléculas de glicose. Glucanases podem ser “exo” ou “endo” dependendo da localização da clivagem do polissacarídeo. Alfa, beta, exo e endo-glucanases são todas eficazes para estimular o crescimento das plantas.

[326] A glucanase pode compreender uma endoglucanase, uma exoglucanase ou uma combinação das mesmas.

[327] A glucanase compreende uma alfa-glucanase, uma beta- glucanase ou uma combinação das mesmas.

[328] Quando a glucanase compreende uma alfa-glucanase, a alfa- glucanase pode compreender uma amilase, uma alfa-1,4-glucanase, uma alfa- 1,6-glucanase, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[329] Quando a glucanase compreende uma beta-glucanase, a beta-glucanase pode compreender uma endo-beta-glucanase, uma exo-beta- glucanase ou uma combinação das mesmas.

[330] A beta-glucanase pode compreender uma beta-1,3- glucanase, uma beta 1,3/1,4 glucanase, uma beta-1,4-glucanase, uma beta-1,6- glucanase, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[331] Por exemplo, a beta-glucanase pode compreender a beta- 1,3-glucanase, a beta-1,4-glucanase ou uma combinação das mesmas.

[332] A beta-1,3-glucanase pode compreender uma beta-1,3- endoglucanase.

[333] A beta-1,4-glucanase pode compreender uma beta-1,4- endoglucanase.

[334] A glucanase pode compreender uma celulase, uma glicosídeo hidrolase, um xiloglucano: xiloglucosil transferase, uma cicloheptaglucanase, uma oligoxiloglucana beta-glicosidase, uma ciclohexaglucanase, uma xiloglucanase, uma celulose 1,4-beta-celobiosidase, uma glucano endo-1,3-beta-D-glicosidase, uma ciclomaltodextrinase, um glucano 1,3-beta-glucosidase, um glucano endo-1,3-alfa-glucosidase, uma endo-1,3(4)-beta-glucanase, um exo-beta-1,4-glucanase, uma liquenase, uma laminarinase, uma glucano 1,4-beta-glucosidase, uma glucano endo-1,6-beta- glucosidase, uma glucano 1,3-alfa-glucosidase, uma amilopectinase, uma laminarinase, ou uma combinação de qualquer uma mas mesmas.

[335] A glucanase pode compreender uma glucanase não- celulolítica.

[336] Em qualquer um dos métodos, sementes ou composições em que a glucanase compreende uma glucanase não-celulolítica, a glucanase não- celulolítica pode compreender uma xiloglucanase, uma liquenase, uma amilase, uma amiloglucanase, uma amiloglucosidase, uma laminarinase, uma beta-1,3- glucanase, uma beta-1,6-glucanase, uma beta-1,3/1,4-glucanase, uma alfa-1,4- glucanase, uma alfa 1,6-glucanase, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[337] Quando a glucanase compreende uma xiloglucanase, a xiloglucanase pode compreender uma endo-beta-1,4-glucanase específica de xiloglucano, uma exo-beta-1,4-glucanase específica de xiloglucano, ou uma combinação das mesmas.

[338] A xiloglucanase pode compreender uma glucanase de Paenibacillus.

[339] Quando a glucanase compreende uma xiloglucanase (por exemplo, SEQ ID NO: 125), o método pode ainda compreender a aplicação de uma mananase (por exemplo, SEQ ID NO: 128) ao meio de crescimento de plantas, à planta, à semente de planta ou à área que circunda a planta ou a semente da planta.

[340] Quando a glucanase compreende uma xiloglucanase (por exemplo, SEQ ID NO: 125), a semente pode ser ainda tratada com uma mananase (por exemplo, SEQ ID NO: 128).

[341] Quando a glucanase compreende uma xiloglucanase (por exemplo, SEQ ID NO: 125), a composição pode ainda compreender uma mananase (por exemplo, SEQ ID NO: 128).

[342] A xiloglucanase e a mananase podem estar presentes no método, na semente ou na composição em quantidades sinergicamente eficazes.

[343] A glucanase pode compreender uma celulase.

[344] A glucanase pode compreender uma endocelulase, uma exocelulase ou uma combinação das mesmas.

[345] A glucanase pode compreender uma glucanase de Acidothermus, uma glucanase de Trichoderma, uma glucanase de Aspergillus, uma glucanase de Paenibacillus, uma glucanase de Helix, uma glucanase de Bacillus, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[346] Por exemplo, a glucanase pode compreender uma glucanase de Bacillus circulans, uma glucanase de Bacillus subtilis (por exemplo, uma endoglucanase de Bacillus subtilis ou uma beta-glucosidase de Bacillus subtilis), uma glucanase de Bacillus thuringiensis (por exemplo, uma endoglucanase de Bacillus thuringiensis ou uma beta-glucosidase de Bacillus thuringiensis), uma glucanase de Bacillus cereus (por exemplo, uma endoglucanase de Bacillus cereus ou uma beta-glucosidase de Bacillus cereus), uma glucanase de Trichoderma reesei (por exemplo, uma exocelulase de Trichoderma reesei ou uma beta-1,4-endoglucanase de Trichoderma reesi), uma glucanase de Bacillus clausii (por exemplo, uma endoglucanase de Bacillus clausii ou uma betaglucosidase de Bacillus clausii), uma gluconase de Helix pomatia (por exemplo, uma beta-1,3endoglucanase de Helix pomatia), uma glucanase de Acidothermus cellulolyticus (por exemplo, uma beta-1,4 endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus), ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[347] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 45, 125 e 126.

[348] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 45, 125 e 126.

[349] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 45, 125 e 126.

[350] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 45, 125 e 126.

[351] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 45, 125 e 126.

[352] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 45, 125 e 126.

[353] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 45, 125 e 126.

[354] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 45, 125 e 126.

[355] A glucanase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 45, 125 e 126.

[356] Quando uma glucanase é aplicada em uma formulação, ou quando uma semente é revestida com uma formulação de revestimento de sementes compreendendo uma glucanase, a formulação pode adequadamente compreender agroquímicos adicionais e/ou um inoculante microbiano. Por exemplo, a formulação pode compreender adequadamente um fungicida, um inseticida, um nematicida, um fertilizante, um hormônio de planta, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico ou uma combinação de qualquer um dos mesmos. Fungicidas, inseticidas, nematicidas, fertilizantes, hormônios de planta, inoculantes bacterianos e inoculantes fúngicos são descritos na Seção XVI abaixo. I. Fitases

[357] A enzima pode compreender uma fitase.

[358] As fitases atuam sobre os ácidos fíticos no solo, uma fonte de fosfato livre para o crescimento das plantas. As fitases removem os fosfatos selecionados dos ácidos fíticos, e os fosfatos liberados podem ser absorvidos pelas plantas próximas.

[359] Onde a enzima compreende uma fitase, a fitase pode compreender uma fitase de Triticum aestivum.

[360] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 132134.

[361] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 132134.

[362] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 132134.

[363] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 132134.

[364] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 132134.

[365] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 132134.

[366] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 132134.

[367] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 132134.

[368] A fitase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 132-134.

[369] A fitase pode compreender uma mistura de fitases compreendendo SEQ ID NOs. 132, 133 e 134. J. Fosfatases Ácidas

[370] A enzima pode compreender uma fosfatase ácida.

[371] As fosfatases ácidas atuam sobre formas de fosfatos insolúveis e menos solúveis no solo e liberam-nas para absorção pelas plantas.

[372] Quando a enzima compreende uma fosfatase ácida, a fosfatase ácida pode compreender uma fosfatase ácida de Triticum aestivum.

[373] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 130 ou 131.

[374] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 130 ou 131.

[375] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 130 ou 131.

[376] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 130 ou 131.

[377] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 130 ou 131.

[378] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 130 ou 131.

[379] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 130 ou 131.

[380] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 130 ou 131.

[381] A fosfatase ácida pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 130 ou 131.

[382] A fosfatase ácida pode compreender uma mistura de fosfatases ácidas compreendendo SEQ ID NOs. 130 e 131.

[383] Em qualquer um dos métodos aqui descritos que envolvem o uso de uma fosfatase ácida, o método pode ainda compreender a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento de plantas, a planta, a semente da planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta.

[384] Em qualquer uma das sementes de plantas aqui descritas que são tratadas ou revestidas com uma fosfatase ácida, a semente pode ser ainda tratada ou revestida com uma segunda enzima.

[385] Qualquer uma das composições aqui descritas que compreendem uma fosfatase ácida pode ainda compreender uma segunda enzima.

[386] A segunda enzima pode compreender uma lipase, uma fosfolipase, uma glucanase, uma xilanase, uma pectinase, uma mananase, uma liquenase ou uma combinação de qualquer uma das mesmas. A lipase, a fosfolipase, a glucanase, a xilanase, a pectinase, a mananase ou a liquenase podem compreender qualquer uma das lipases, fosfolipases, glucanases, xilanases, pectinases, mananases ou liquenases aqui descritas. K. Pectinases

[387] A enzima pode compreender uma pectinase.

[388] As pectinases atuam na pectina e polissacarídeos relacionados para liberar pequenos açúcares. Os pequenos açúcares são por sua vez absorvidos pela planta como fontes de carbono e também podem alimentar os micróbios inerentes que cercam a planta.

[389] Quando a enzima compreende uma pectinase, a pectinase pode compreender uma pectolase.

[390] Por exemplo, a pectolase pode compreender uma pectolase de Aspergillus japonicus.

[391] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 129.

[392] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 129.

[393] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 129.

[394] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 129.

[395] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 129.

[396] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 129.

[397] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 129.

[398] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 129.

[399] A pectolase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 129. L. Mananases

[400] A enzima pode compreender uma mananase.

[401] As mananases atuam sobre os glucomananos e polissacarídeos relacionados para liberar pequenos açúcares. Os pequenos açúcares são por sua vez absorvidos pela planta como fontes de carbono e também podem alimentar os micróbios inerentes que circundam a planta.

[402] Quando a enzima compreende uma mananase, a mananase pode compreender uma mananase de Bacillus.

[403] A mananase pode compreender uma sequência amino com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 128.

[404] A mananase pode compreender uma sequência amino com pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 128.

[405] A mananase pode compreender uma sequência amino com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 128.

[406] A mananase pode compreender uma sequência amino com pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 128.

[407] A mananase pode compreender uma sequência amino com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 128.

[408] A mananase pode compreender uma sequência amino com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 128.

[409] A mananase pode compreender uma sequência amino com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 128.

[410] A mananase pode compreender uma sequência amino com pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 128.

[411] A mananase pode compreender uma sequência amino com 100% de identidade com a SEQ ID NO: 128. M. ACC desaminases

[412] A enzima pode compreender uma ACC desaminase.

[413] A ACC desaminase pode compreender qualquer uma das enzimas descritas acima na Seção II.

[414] A ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-12, 113 e 114.

[415] A ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-12, 113 e 114.

[416] A ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-12, 113 e 114.

[417] A ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-12, 113 e 114.

[418] A ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-12, 113 e 114.

[419] A ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-12, 113 e 114.

[420] A ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-12, 113 e 114.

[421] A ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-12, 113 e 114.

[422] A ACC desaminase pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 712, 113 e 114. N. Proteínas Expansina

[423] Proteínas Expansina ajudam paredes da planta em expansão durante o crescimento da planta. As expansinas são assim particularmente úteis em qualquer dos métodos para estimular o crescimento das plantas aqui descritas.

[424] A proteína expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 74.

[425] A proteína expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 74.

[426] A proteína expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 74.

[427] A proteína expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 74.

[428] A proteína expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 74.

[429] A proteína expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 74.

[430] A proteína expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 74.

[431] A proteína expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 74.

[432] A proteína expansina pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 100% de identidade com a SEQ ID NO: 74.

VIII. USO DE FERTILIZANTES E/OU BIOESTIMULANTES COM OS MÉTODOS, SEMENTES E COMPOSIÇÕES

[433] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o método pode ainda compreender a aplicação de um fertilizante, um bioestimulante, ou uma combinação dos mesmos para o meio de crescimento de plantas, a planta, a semente da planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta.

[434] Para qualquer uma das sementes de plantas aqui descritas, a semente da planta pode ser ainda tratada ou revestida com um fertilizante, um bioestimulante, ou uma combinação dos mesmos.

[435] Para qualquer um dos métodos, sementes ou composições aqui descritos, o fertilizante pode compreender nitrogênio, fosfato (por exemplo, monofosfato de amônio, difosfato de amônio, ortofosfato, ortopolifosfato, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos), potássio (por exemplo, acetato de potássio), zinco, ferro, selênio, boro, cobre ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[436] Por exemplo, o fertilizante pode compreender 12% de nitrogênio amoniacal e 58% de fosfato disponível.

[437] Fertilizantes adicionais que podem ser usados estão descritos na Seção XVI abaixo.

[438] O bioestimulante pode compreender um ácido giberélico, um ácido indol-3-butírico, uma cinetina, uma auxina, um homólogo ou derivado de auxina, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[439] Em qualquer um dos métodos ou sementes envolvendo o uso de um fertilizante e/ou um bioestimulante, a enzima compreende adequadamente uma fosfatase ácida, uma fosfolipase, uma mananase, uma glucanase, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas. A fosfatase ácida, fosfolipase, mananase ou glucanase pode compreender qualquer uma das fosfatases, fosfolipases, mananases ou glucanases aqui descritas.

IX. PREPARAÇÕES DE ENZIMA

[440] Em qualquer um do(a)s métodos, sementes, ou composições aqui descrito(a)s envolvendo o uso de uma enzima livre e/ou uma proteína expansina, a enzima ou proteína expansina pode compreender um extrato celular bruto contendo a enzima ou proteína expansina, uma enzima parcialmente purificada ou proteína expansina, ou uma enzima ou proteína expansina substancialmente purificada.

[441] Em qualquer um do(a)s métodos, sementes, ou composições aqui descrito(a)s envolvendo o uso de uma enzima livre e/ou uma proteína expansina, a enzima ou proteína expansina preferencialmente não compreende proteína enzima ou expansina ligada a exósporo de um membro da família Bacillus cereus.

[442] Em qualquer um do(a)s métodos, sementes, ou composições aqui descrito(a)s envolvendo o uso de uma enzima livre e/ou proteína expansina, a enzima ou proteína expansina não está preferencialmente ligada ao exósporo de um esporo de membro da família Bacillus cereus intacto.

X. IMOBILIZAÇÃO DA ENZIMA E/OU PROTEÍNA EXPANSINA

[443] Em qualquer um do(a)s métodos, sementes, ou composições aqui descrito(a)s compreendendo o uso de uma enzima livre e/ou uma proteína expansina, a enzima ou proteína expansina pode compreender enzima ou proteína expansina que é imobilizada sobre uma matriz ou suporte.

[444] A matriz ou o suporte pode compreender carvão vegetal, biocarvão, nanocarbono, agarose, alginato, celulose, um derivado de celulose, sílica, plástico, aço inoxidável, vidro, poliestireno, uma cerâmica, dolomita, uma argila, terra de diatomáceas, talco, um polímero, uma goma, um material dispersável em água ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[445] A imobilização da enzima ou proteína expansina na matriz ou no suporte, preferencialmente, resulta em uma liberação mais lenta da enzima ou proteína expansina no ambiente ou na planta ou semente da planta, em comparação com a taxa de liberação para a mesma enzima ou proteínas expansinas não imobilizada(s) sob as mesmas condições.

XI. MÉTODOS PARA PREPARAR ENZIMA LIVRE

[446] A enzima livre pode ser preparada por um número de métodos padrão de biologia molecular e bioquímica que são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, um gene que codifica uma enzima pode ser amplificado a partir do DNA cromossômico usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) e clonado em um vetor adequado (por exemplo, um vetor de plasmídeo). O vetor compreende adequadamente um sítio de clonagem múltipla no qual a molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser facilmente inserida. O vetor também contém adequadamente um marcador selecionável, tal como um gene de resistência a antibiótico, de modo que as bactérias transformadas, transfectadas ou conjugadas com o vetor possam ser prontamente identificadas e isoladas. Quando o vetor é um plasmídeo, o plasmídeo também compreende adequadamente uma origem de replicação. Alternativamente, o DNA codificador da proteína de enzima pode ser integrado ao DNA cromossômico do microrganismo hospedeiro.

[447] O hospedeiro pode então ser cultivado e enzima colhida das culturas. Pode ser usado um extrato celular bruto ou a enzima pode ser parcialmente ou substancialmente purificada usando técnicas bioquímicas padrão.

[448] Hospedeiros adequados para produção em larga escala de enzimas incluem, mas não estão limitados a, espécies de Bacillus (por exemplo, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Bacillus fusiformis, Bacillus cereus, ou Bacillus mycoides), Escherichia coli, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, espécies Streptomyces, espécies Klebsiella, espécies Mucor, espécies Rhizopus, espécies Mortierella, espécies Kluyveromyces, espécies Candida, Penicillium chrysogenum, espécies Trichoderma, Sacchromyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces pombe, e Candida utilitis.

[449] As enzimas podem ser usadas como coletadas a partir do caldo de fermentação completo ou parcialmente ou substancialmente purificadas a partir da cultura em batelada de fermentação.

[450] Alternativamente, as enzimas podem ser produzidas por triagem de microrganismos e seleção de microrganismos que expressam altos níveis da enzima. Isso pode ser feito por seleção inicial, enriquecimento e/ou triagem em meio nutricional que contém um substrato enzimático como fonte de nutrientes para os microrganismos. Muitas vezes, a seleção adicional é realizada usando meio nutricional diferencial que tem um indicador para demonstrar os níveis de enzima e a atividade das enzimas produzidas pelos microrganismos identificados. Esses microrganismos podem ser mutados e triados para isolados que produzem níveis intensificados dessas enzimas. Este microrganismo pode ser utilizado em grandes métodos de fermentação em batelada e contínuos para criar e secretar grandes quantidades de enzimas. Otimização do processo de fermentação e condições geralmente podem aumentar a produção dos microrganismos.

[451] As enzimas também podem ser produzidas em níveis altos usando linhas celulares eucarióticas, muitas das quais podem ser manipuladas para secretar altos níveis de enzimas, com as vantagens de diferentes níveis de modificações pós-traducionais críticas e redução em questões de produção de enzimas hospedeiras. Estes também podem ser escaláveis para vasos de escalas de produção de cultura de células maiores e enzimas purificadas e tratadas como acima. Exemplos de linhas celulares eucarióticas adequadas para a produção de enzimas incluem, mas não se limitam a: células de inseto derivadas de insetos, tais como, Bombyx mori, Mamestra brassicae, Spodoptera frugiperda, Trichoplusiani, ou Drosophila melanogaster; e linhas de células de vertebrados derivadas de um vertebrado tal como um camundongo, rato, hamster, humano ou cão.

[452] Outras fontes potenciais de enzimas incluem vetores de expressão de proteína livre de células, incluindo os derivados de origem animal, bacteriana, fúngica e de planta.

[453] Organismos transgênicos, tais como, plantas, coelho, camundongo, galinha ou sapos também podem ser usados para a produção de enzimas recombinantes. Por exemplo, as plantas podem ser manipuladas para superexpressar enzimas, e as enzimas podem então ser coletadas da planta e purificadas ou usadas como extrato bruto. Tais sistemas de produção permitem a expressão de baixo custo das enzimas e fornecem uma fonte de material para dispensação às plantas. Esses métodos têm a vantagem adicional de serem facilmente dimensionados e com o mínimo de esforço.

[454] Em cada um destes sistemas de produção, o rendimento e qualidade das enzimas desejadas pode ser melhorado através de processos de engenharia genética e formulação. Por exemplo, a engenharia genética poderia envolver a criação de cassetes de expressão de alto nível e sistemas de produção, remoção de genes de protease e degradativos do microrganismo de produção, otimização da enzima para estabilidade térmica e estabilidade a longo prazo, e intensificação da capacidade da enzima ou o microrganismo de produção para secretar enzima madura no meio para facilidade de coleta e uso. Além disso, as cepas de expressão podem ser usadas para induzir mutações pontuais que podem levar ao aumento da capacidade de produzir níveis adequados ou aumentados de enzimas. Em alguns casos, o microrganismo de produção também pode ser usado e dispensado na semente da planta, na vizinhança ao redor da planta, nas raízes da planta, ou perto da planta para obter o efeito desejado in situ na planta.

[455] Outras fontes de enzimas incluem a extração de animais, plantas, insetos, algas ou outros extratos biológicos. Fontes comuns de enzimas de escala industrial criadas e/ou purificadas desta maneira incluem tecidos internos de porcino e de bovinos, tais como, abomaso, fígado, mucosas, pâncreas, bem como fontes vegetais, tais como, Carica papaya. Outro exemplo seria a purificação de glucanases de cevada.

[456] Muitas fontes comerciais de enzimas vêm de tecidos que têm altos níveis de enzimas alvo que podem ser usados como está ou em formas purificadas para usos agrícolas.

XII. PEPTÍDEOS SINAL

[457] Qualquer peptídeo sinal pode ser usado para modificar qualquer uma das enzimas aqui descritas, de modo que a enzima será secretada a partir de um microrganismo hospedeiro no qual é expressada. O tipo de peptídeo sinal usado dependerá principalmente da identidade do microrganismo hospedeiro, uma vez que a maquinaria de secreção de diferentes microrganismos variará na sua capacidade de reconhecer peptídeos sinal específicos. As sequências de peptídeos sinal ilustrativas são apresentadas abaixo na Tabela 16, juntamente com as espécies bacterianas nas quais os peptídeos sinal são encontrados na natureza. Os peptídeos sinal resultarão na secreção de uma proteína à qual estão ligados no gênero de bactérias em que são encontrados, bem como em gêneros intimamente relacionados. Por exemplo, uma sequência sinal de Bacillus thuringiensis causará a secreção de uma proteína em bactérias do gênero Bacillus, bem como bactérias dos gêneros Paenibacillus e Lysinibacillus.

[458] Para facilidade de referência, as descrições de sequências de aminoácidos para peptídeos sinal ilustrativos que podem ser adicionados a qualquer uma das enzimas ou proteínas expansinas aqui descritas para causar a secreção da enzima ou proteínas expansinas de um microrganismo no qual é expressada são fornecidas abaixo na Tabela 16. Qualquer um dos peptídeos sinal listados na Tabela 16 abaixo pode ser adicionado ao terminal amino de qualquer uma das enzimas ou proteínas expansina aqui descritas para provocar a secreção da enzima ou proteína expansina.TABELA 16. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS PARA PEPTÍDEOS SINAL

[459] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-73, 135 e 137-147.

[460] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-73, 135 e 137-147.

[461] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-73, 135 e 137-147.

[462] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-73, 135 e 137-147.

[463] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-73, 135 e 137-147.

[464] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-73, 135 e 137-147.

[465] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-73, 135 e 137-147.

[466] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-73, 135 e 137-147.

[467] Por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-73, 135 e 137-147.

[468] Os peptídeos sinal adequados para uso em bactérias do gênero Bacillus, bactérias do gênero Paenibacillus ou bactérias do gênero Lysinibacillus são fornecidos nas SEQ ID NOs. 49-51, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[469] Assim, por exemplo, o peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-51, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[470] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-51, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[471] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-51, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[472] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-51, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[473] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-51,54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[474] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-51, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[475] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 98% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-51, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[476] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-51, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[477] O peptídeo sinal pode compreender uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 4951, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[478] Assim, por exemplo, quando o peptídeo sinal compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-51, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142, o microrganismo no qual a enzima ou proteína expansina é expressa adequadamente compreende uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Paenibacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, uma bactéria do gênero Pseudomonas, ou uma combinação de qualquer das mesmas.

[479] Por exemplo, o microrganismo pode compreender Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus cereus, Bacillus firmus, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus aryabbattai, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus flexus, Bacillus nealsonii, Bacillus pumulis, Bacillus licheniformis, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus sphericus, Lysinibacillus fusiformis, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[480] O microrganismo compreende preferencialmente Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus pseudomycoides, Bacillus mycoides, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus sphericus, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[481] O peptídeo sinal está preferencialmente presente no terminal amino da enzima ou proteína expansina.

XIII. MICRORGANISMOS RECOMBINANTES

[482] Os microrganismos recombinantes, formulações e composições contendo os microrganismos recombinantes, métodos para usar os microrganismos recombinantes, e sementes tratadas com os microrganismos recombinantes são descritos acima.

[483] Em qualquer de microrganismos, formulações, composições, métodos ou sementes recombinantes aqui descrito(a)s, a enzima ou proteína expansina pode ser expressa sob o controle de um promotor constitutivo.

[484] Em qualquer um de microrganismos, formulações, composições, métodos ou sementes recombinantes aqui descrito(a)s, a enzima ou proteína expansina pode ser expressa sob o controle de um promotor indutível.

[485] Para qualquer um de microrganismos, formulações, composições, métodos ou sementes recombinantes aqui descritos, o microrganismo recombinante pode compreender uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Paenibacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, um fungo do gênero Penicillium, uma bactéria do gênero Glomus, uma bactéria do gênero Pseudomonas, uma bactéria do gênero Arthrobacter, uma bactéria do gênero Paracoccus, uma bactéria do gênero Rhizobium, uma bactéria do gênero Bradyrhizobium, uma bactéria do gênero Azosprillium, uma bactéria do gênero Enterobacter, uma bactéria do gênero Escherichia, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[486] Quando o microrganismo recombinante compreende um microrganismo recombinante formador de esporos, o microrganismo recombinante formador de esporos pode compreender uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Paenibacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, um fungo do gênero Penicillium, um fungo do gênero Glomus, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[487] Para qualquer um de microrganismos, formulações, composições, métodos ou sementes recombinantes aqui descrito(a)s, o microrganismo recombinante compreende adequadamente uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Paenibacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[488] Por exemplo, o microrganismo recombinante pode compreender Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus aryabbattai, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus flexus, Bacillus nealsonii, Bacillus pumulis, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus sphericus, Lysinibacillus fusiformis, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[489] O microrganismo recombinante compreende adequadamente Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus pseudomycoides, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus sphericus, Lysinibacillus fusiformis, ou uma combinação dos mesmos.

[490] Para qualquer um de microrganismos recombinantes, formulações, métodos, ou sementes descrita(a)s no presente, o microrganismo recombinante pode compreender uma cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas, uma cepa endofítica de bactérias, ou uma cepa de bactérias que é para promoção de crescimento de plantas e endofítica.

[491] A cepa pode produzir uma toxina inseticida (por exemplo, uma toxina Cry), produzir um composto fungicida (por exemplo, uma β-1,3- glucanase, uma quitosanase, uma liticase, ou uma combinação dos mesmos), produzir um composto nematicida (por exemplo, uma toxina Cry), produzir um composto bactericida, ser resistente a um ou mais antibióticos, compreender um ou mais plasmídeos de replicação livre, ligar-se às raízes das plantas, colonizar as raízes das plantas, formar biopelículas, solubilizar nutrientes, secretar ácidos orgânicos ou combinações dos mesmos.

[492] Por exemplo, a cepa pode compreender: (a) Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL No B-50819), (b) Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL No B-50817), (c) Bacillus flexus BT054 (NRRL No B-50816), (d) Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL No B-50820), (e) Bacillus mycoides BT155 (NRRL No B-50921), (f) Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL No B-50822), (g) Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL No NRRL B-50821), (h) Bacillus mycoides EE118 (NRRL No B-50918), (i) Bacillus subtilis EE148 (NRRL No B-50927), (j) Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL No B-50920), (k) Bacillus mycoides EE141 (NRRL No B-50916), (l) Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No B-50922), (m) Bacillus cereus membro da família EE128 (NRRL No B- 50917), (n) Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL No B-50923), (o) Bacillus cereus membro da família EE349 (NRRL No B- 50928), (p) Bacillus subtilis EE218 (NRRL No B-50926), (q) Bacillus megaterium EE281 (NRRL No B-50925), (r) Bacillus cereus membro da família EE-B00377 (NRRL B- 67119); (s) Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), (t) Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), (u) Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), (v) Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), (w) Bacillus mycoides EE116 (NRRL No B-50919), (x) Bacillus cereus membro da família EE417 (NRRL No B- 50974), (y) Bacillus subtilis EE442 (NRRL No B-50975), (z) Bacillus subtilis EE443 (NRRL No B-50976), (aa) Bacillus cereus membro da família EE444 (NRRL No B- 50977), (bb) Bacillus subtilis EE405 (NRRL No B-50978), (cc) Bacillus cereus membro da família EE439 (NRRL No B- 50979), (dd) Bacillus megaterium EE385 (NRRL No B-50980), (ee) Bacillus cereus membro da família EE387 (NRRL No B- 50981), (ff) Bacillus circulans EE388 (NRRL No B-50982), (gg) Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL No B-50983), (hh) Bacillus cereus membro da família EE377 (NRRL No B- 67119), (ii) Bacillus mycoides EE363 (NRRL No B-67121), (jj) Bacillus pseudomycoides EE366 (NRRL No B-67120); (kk) Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No B-50924); (11) ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[493] Cada uma destas cepas foi depositada no Serviço de Pesquisa Agrícola (ARS) do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), com o endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, e são identificadas pelos números de depósito NRRL fornecidos em parênteses. As cepas (a)-(d), (f) e (g) foram depositadas em 11 de março de 2013. As cepas (e), (h)-(q), (w) e (kk) foram depositadas em 10 de março de 2014. As cepas (x)-(ff) foram depositadas em 10 de setembro de 2014. A cepa (gg) foi depositada em 17 de setembro de 2014. As cepas (r)-(v), (hh), (ii) e (jj) foram depositadas em 19 de agosto de 2015. Bacillus thuringiensis BT013A é também conhecido como Bacillus thuringiensis 4Q7.

[494] O isolamento e a caracterização destas cepas são descritos abaixo nos Exemplos. Sequências de RNA 16S de ribossoma parciais para cada uma destas cepas são fornecidas na listagem de sequências e resumidas abaixo na Tabela 17, juntamente com as suas SEQ ID NOs.TABELA 17. SEQUÊNCIAS DE RNA RIBOSSOMAL 16S PARCIAIS

[495] Um microrganismo endofítico pode ser usado para expressão das enzimas. Enquanto muitos microrganismos da rizosfera têm uma relação simbiótica com a planta, apenas um pequeno subconjunto desses microrganismos é capaz de ser internalizado na planta e crescer endofiticamente. Várias cepas de membros da família Bacillus cereus e várias cepas bacterianas de membro de família não Bacillus cereus foram isoladas a partir de mudas de milho e revelaram ter capacidade para crescer endofiticamente em plantas. Outros microrganismos endofíticos também seriam úteis incluindo, mas não limitados a endófitos bacterianos dos gêneros: Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium, Pseudomonas, Paenibacilllus, Enterobacter, Bacillus, Klebsiella, Arthrobacter, Lysinibacillus, Pantoea, Actinomyces, Streptomyces, Alcaligenes e Microbacterium. Endófitos fúngicos também podem ser usados, incluindo endófitos fúngicos dos gêneros: Neotyphodium, Gliocadium, Acremonium lolii, Clavicipitaceae, Ascomycetes, Idriella, Xylariaceous, Ascomycotina, Deuteromycotina, Aspergillus, Phomopsis, Wardomyces, Fusarium, Dreschrella, Pestalotia, Curvularia, Humicola, Nodulisporium e Penicillium.

[496] Muitos microrganismos podem colonizar, viver próximos, viver ou tornar-se endofíticos a uma planta. Estes microrganismos proporcionariam um mecanismo de dispensação útil de enzimas alvo para a planta, a semente, a vizinhança da planta ou o meio de crescimento de plantas. Microrganismos selecionados que podem colonizar as raízes ou tornarem-se endofíticos podem ser triados, modificados de forma recombinante para expressar ou superexpressar uma enzima e produzidos comercialmente e aplicados na semente, na planta ou na vizinhança ao redor da planta de modo que a cepa produza a enzimas alvo in situ (na ou perto da planta). Estes microrganismos podem também ser melhorados através de mutações pontuais ou através de engenharia genética para expressar enzimas alvo superiores ou novas para beneficiar as plantas. Mutações pontuais podem ser triadas por mutação do microrganismo hospedeiro, e seleção de mutantes com maiores níveis de expressão enzimática através de ensaios enzimáticos, ou usando meios seletivos que identifiquem cepas de expressão alta de enzima. Cepas comuns que são benéficas produtoras de enzimas, bem como espécies colonizadores/endofíticas incluem: Bacillus argri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus, Bacillus endorhythmos, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus firmus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus lentimorbus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus medusa, Bacillus metiens, Bacillus natto, Bacillus nigrificans, Bacillus popillae, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus sphearicus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatu, outras espécies de Bacillus ou uma combinação das mesmas mais aquelas listadas na categoria do gênero Bacillus no Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Primeira Ed. (1986), aqui incorporado por referência. Outras cepas potenciais poderiam incluir, mas não estão limitadas a: Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium, Pseudomonas, Paenibacilllus, Enterobacter, Bacillus, Klebsiella, Arthrobacter, Lysinibacillus, Pantoea, Actinomyces, Sacchromyces, Rhizobium, Bradyrhizobium, Candida, Streptomyces, Alcaligenes, Chromatiales, Rhizobium, Bradyrhizobium, Rhodospiralles, Rhizobiales, Rhizobacteracae e Microbacterium.

[497] Para qualquer um de métodos ou sementes aqui descritos, o microrganismo recombinante pode compreender uma mistura de dois ou mais que qualquer um dos microrganismos recombinantes aqui descritos.

[498] Para qualquer um de microrganismos, formulações, métodos ou sementes recombinantes aqui descritos, o microrganismo recombinante pode ser inativado. A inativação resulta em microrganismos incapazes de se reproduzir. A inativação de microrganismos pode ser vantajosa, por exemplo, porque permite a dispensação do microrganismo a uma planta ou a um meio de crescimento de plantas, reduzindo ou eliminando quaisquer efeitos prejudiciais que o microrganismo vivo possa ter em uma planta ou no ambiente. O microrganismo recombinante pode ser inativado por qualquer meio físico ou químico, por exemplo, por tratamento térmico, irradiação gama, irradiação de raios X, irradiação UV-A, irradiação UV-B ou tratamento com um solvente como gluteraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, alvejante, clorofórmio ou fenol, ou combinação de quaisquer dos mesmos.

XIV. MÉTODOS PARA PREPARAR MICRORGANISMOS RECOMBINANTES

[499] Os microrganismos recombinantes podem ser feitos usando métodos padrão de biologia molecular conhecidos na técnica. Por exemplo, um gene que codifica uma enzima pode ser amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR). Quando é usada uma sequência sinal, o gene que codifica para a enzima pode ser ligado a uma codificação de DNA para a sequência sinal. O gene pode então ser clonado em qualquer vetor adequado, por exemplo, um vetor de plasmídeo. O vetor compreende adequadamente um sítio de clonagem múltipla no qual a molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser facilmente inserida. O vetor também contém adequadamente um marcador selecionável, tal como um gene de resistência a antibiótico, de modo que as bactérias transformadas, transfectadas ou conjugadas com o vetor possam ser prontamente identificadas e isoladas. Quando o vetor é um plasmídeo, o plasmídeo também compreende adequadamente uma origem de replicação. Alternativamente, o DNA que codifica para a enzima ou proteína expansina pode ser integrado no DNA cromossômico do microrganismo hospedeiro.

XV. EFEITOS NAS PLANTAS

[500] Em qualquer um dos métodos descritos no presente, plantas cultivadas na presença da enzima, da proteína expansina, ou do microrganismo podem apresentar um crescimento aumentado em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima, da proteína expansina, ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[501] Para qualquer uma das sementes aqui descritas, plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com a enzima livre, a proteína expansina, ou o microrganismo podem apresentar crescimento aumentado em comparação com plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas com a enzima livre, a proteína expansina, ou o microrganismo, sob as mesmas condições.

[502] Para qualquer um dos métodos ou sementes aqui descritos, as sementes às quais a enzima ou o microrganismo foi aplicado podem exibir taxas de germinação aumentadas em comparação com sementes às quais a enzima ou o microrganismo não foi aplicada(o), sob as mesmas condições.

[503] Em qualquer um dos métodos descritos no presente, as plantas cultivadas na presença da enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo podem apresentar a absorção de nutrientes aumentada, em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima, da proteína expansina, ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[504] Para qualquer uma das sementes aqui descritas, plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com a enzima livre, a proteína expansina, ou o microrganismo pode apresentar aumento da absorção de nutrientes, em comparação com plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas com a enzima livre, a proteína expansina, ou o microrganismo, sob as mesmas condições.

[505] Em qualquer um dos métodos descritos no presente documento, plantas cultivadas na presença da enzima ou do microrganismo pode apresentar susceptibilidade diminuída a um patógeno, em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[506] Para qualquer uma das sementes aqui descritas, as plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com a enzima livre ou o microrganismo podem apresentar diminuição da suscetibilidade a um patógeno, em comparação com plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas com a enzima livre ou o microrganismo, sob as mesmas condições.

[507] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as plantas cultivadas na presença da enzima ou do microrganismo podem apresentar susceptibilidade diminuída a um estresse ambiental, em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[508] Para qualquer uma das sementes aqui descritas, as plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com a enzima livre ou o microrganismo podem apresentar suscetibilidade diminuída a um estresse ambiental, em comparação com plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas com a enzima livre ou o microrganismo, sob as mesmas condições.

[509] Por exemplo, as plantas podem apresentar diminuição da suscetibilidade à seca, inundação, calor, congelamento, sal, metais pesados, baixo pH, pH alto, ou uma combinação de qualquer deles.

[510] Em qualquer um dos métodos descritos no presente, plantas cultivadas na presença da enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo pode apresentar maior conteúdo de nutrientes, em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo, sob as mesmas condições.

[511] Para qualquer uma das sementes aqui descritas, as sementes tratadas com a enzima livre, a proteína expansina ou o microrganismo ou plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com a enzima livre, a proteína expansina, ou o microrganismo podem exibir um conteúdo de nutrientes aumentado em comparação com as sementes não tratadas com a enzima livre, a proteína expansina ou o microrganismo ou as plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas com a enzima livre, a proteína expansina ou o microrganismo, sob as mesmas condições.

[512] Por exemplo, o nutriente pode compreender um polissacarídeo, uma proteína, ácido fítico, um fosfato, um fosfolipídio, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[513] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, plantas cultivadas na presença da enzima ou o microrganismo pode apresentar aumento da nodulação da raiz, em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[514] Para qualquer uma das sementes aqui descritas, plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com a enzima livre ou o microrganismo pode apresentar nodulação da raiz aumentada, em comparação com plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas com a enzima livre ou o microrganismo, sob as mesmas condições.

[515] Em qualquer dos métodos aqui descritos, as plantas cultivadas na presença da enzima ou do microrganismo podem apresentar uma maturação mais lenta dos frutos em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[516] Para qualquer uma das sementes aqui descritas, as plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com a enzima livre ou o microrganismo podem apresentar um amadurecimento mais lento do que as plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas com a enzima livre ou o microrganismo, sob as mesmas condições.

[517] Em qualquer um dos métodos descritos no presente, plantas cultivadas na presença da enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo pode(m) apresentar maior rendimento do cultivo, em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima, da proteína expansina, ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[518] Para qualquer uma das sementes aqui descritas, plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com a enzima livre, a proteína expansina, ou o microrganismo podem apresentar maior rendimento de cultivo, em comparação com plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas com a enzima livre, a proteína expansina, ou o microrganismo, sob as mesmas condições.

[519] Em qualquer um dos métodos descritos no presente, as plantas cultivadas na presença da enzima ou o microrganismo pode apresentar senescência foliar alterada, em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[520] Para qualquer uma das sementes aqui descritas, as plantas cultivadas a partir de sementes tratadas com a enzima livre ou o microrganismo podem apresentar senescência foliar alterada, em comparação com plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas com a enzima ou o microrganismo, sob as mesmas condições.

[521] A senescência de folhas mais lentas pode levar a um maior nível de fotossíntese no final da estação, o que, por sua vez, leva a mais fotossintatos, mais preenchimento de grãos e um maior grão e/ou maior rendimento.

XVI. FORMULAÇÕES, COMPOSIÇÕES E CO-APLICAÇÃO DE AGROQUÍMICOS

[522] Em qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o método pode compreender a aplicação da enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo em uma formulação compreendendo um carreador agricolamente aceitável.

[523] Para qualquer uma das sementes aqui descritas, a semente pode ser revestida com uma formulação compreendendo a enzima livre, a proteína expansina, ou o microrganismo recombinante e um carreador agricolamente aceitável.

[524] Qualquer uma das composições aqui descritas pode compreender um carreador agricolamente aceitável.

[525] O carreador agricolamente aceitável pode compreender um dispersante, um tensoativo, um aditivo, água, um espessante, um agente antiaglomerante, um produto de degradação de resíduos, uma formulação de compostagem, uma aplicação granular, terra de diatomáceas, um óleo, um agente colorante, um estabilizante, um conservante, um polímero, um revestimento ou uma combinação dos mesmos.

[526] O aditivo pode compreender um óleo, uma goma, uma resina, uma argila, um polioxietileno glicol, um terpeno, um agente orgânico viscoso, um éster de ácido graxo, um álcool sulfatado, um sulfonato de alquila, um sulfonato de petróleo, um álcool sulfato, um alquil butano diamato de sódio, um poliéster de tiobutano dioato de sódio, um derivado de benzeno acetonitrila, um material proteináceo (por exemplo, um produto lácteo, farinha de trigo, farelo de soja, sangue, albumina, gelatina, farinha de alfafa, extrato de levedura ou uma combinação qualquer um dos mesmos).

[527] O espessante pode compreender um alquilssulfonato de cadeia longa de polietilenoglicol, um oleato de polioxietileno, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[528] O tensoativo pode compreender um óleo de petróleo pesado, um destilado pesado de petróleo, um poliol éster de ácido graxo, um éster de ácido graxo polietoxilado, um aril alquil polioxietileno glicol, um acetato de alquil amina, um sulfonato de alquil arila, um álcool polihídrico, fosfato de alquila, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[529] O tensoativo pode compreender um tensoativo não iônico.

[530] O agente antiformção de torta pode compreender um sal de sódio (por exemplo, um sal de sódio de monometil naftaleno sulfonato, um sal de sódio de dimetil naftaleno sulfonato, um sulfito de sódio, um sulfato de sódio, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos), um carbonato de cálcio, terra de diatomáceas, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[531] O carreador agricolamente aceitável pode compreender vermiculita, carvão vegetal, lama de prensa de carbonatação de fábrica de açúcar, casca de arroz, carboximetil celulose, turfa, perlita, areia fina, carbonato de cálcio, farinha, alúmen, um amido, polivinil pirrolidona ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[532] A formulação ou composição pode compreender uma formulação ou composição de revestimento de sementes, uma formulação ou composição líquida para aplicação a plantas ou a um meio de crescimento de plantas, ou uma formulação ou composição sólida para aplicação a plantas ou a um meio de crescimento de plantas.

[533] A formulação ou composição de revestimento de sementes pode compreender uma solução aquosa ou à base de óleo para aplicação em sementes ou uma formulação em pó ou granular para aplicação a sementes.

[534] A formulação ou composição líquida para aplicação a plantas ou a um meio de crescimento de plantas pode compreender uma formulação ou composição concentrada ou uma formulação ou composição pronta para uso.

[535] A formulação ou composição sólida para aplicação a plantas ou a um meio de crescimento de plantas pode compreender uma formulação ou composição granular ou um agente em pó.

[536] A formulação ou composição pode ainda compreender um agroquímico.

[537] Alternativamente ou adicionalmente, qualquer um dos métodos aqui descritos pode ainda compreender a aplicação de um agroquímico ao meio de crescimento de plantas, à planta, à semente da planta ou à área que circunda a planta ou a semente da planta.

[538] Qualquer das sementes de plantas aqui descritas podem ser ainda tratadas ou revestidas com um agroquímico.

[539] O agroquímico pode incluir um fertilizante, um material fertilizante de micronutrientes, um inseticida, um nematicida, um herbicida, uma emenda de crescimento de planta, um fungicida, um inseticida, um moluscicida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico, um hormônio de planta, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[540] O inoculante bacteriano pode compreender uma cepa promotora de crescimento de bactérias, uma cepa endofítica de bactérias, ou uma cepa de bactérias que é promotora de crescimento de plantas e endofítica.

[541] A cepa promotora de crescimento de bactérias pode produzir uma toxina inseticida (por exemplo, uma toxina Cry), produzir um composto fungicida (por exemplo, uma β-1,3-glucanase, uma quitosanase, uma liticase ou uma combinação das mesmas), produzir um composto nematicida (por exemplo, uma toxina Cry), produzir um composto bactericida, ser resistente a um ou mais antibióticos, compreender um ou mais plasmídeos de replicação livre, ligar-se às raízes das plantas, colonizar as raízes das plantas, formar biopelículas, solubilizar nutrientes, secretar ácidos orgânicos, ou combinações dos mesmos.

[542] A cepa promotora de crescimento de planta de bactérias pode compreender Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL N° B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL No B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL No B- 50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL No B-50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL No B-50921), Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL No B-50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL No NRRL B-50821), Bacillus mycoides EE118 (NRRL No B-50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL No B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL No B-50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL No B- 50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No B-50922), membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL No B-50917), Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL No B-50923), membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No B- 50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL No B-50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL No B-50925), membro da família Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B- 67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B- 67123), ou Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), Bacillus mycoides EE116 (NRRL No B-50919), membro da família Bacillus cereus EE417 (NRRL No B-50974), Bacillus subtilis EE442 (NRRL No B-50975), Bacillus subtilis EE443 (NRRL No B-50976), membro da família Bacillus cereus EE444 (NRRL No B-50977), Bacillus subtilis EE405 (NRRL No B-50978), membro da família Bacillus cereus EE439 (NRRL No B-50979), Bacillus megaterium EE385 (NRRL No B-50980), membro da família Bacillus cereus EE387 (NRRL No B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL No B-50982), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL No B-50983), membro da família Bacillus cereus EE377 (NRRL No B- 67119), Bacillus mycoides EE363 (NRRL No B-67121), Bacillus pseudomycoides EE366 (NRRL No B-67120), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No B-50924), ou uma combinação dos mesmos.

[543] O agroquímico pode compreender um fertilizante.

[544] O fertilizante pode incluir um fertilizante líquido ou um fertilizante seco.

[545] O agroquímico pode compreender um material fertilizante de micronutrientes, o material fertilizante de micronutrientes compreendendo ácido bórico, um borato, uma frita de boro, sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um deca-hidrato de tetraborato de sódio, um sulfato de ferro e um óxido de ferro, sulfato de ferro e amônio, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, ácido molibdico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[546] O agroquímico pode compreender um inseticida, o inseticida compreendendo um organofosfato, um carbamato, um piretróide, um acaricida, um alquil ftalato, ácido bórico, um borato, um flúor, enxofre, uma ureia substituída haloaromática, um éster de hidrocarboneto, um inseticida de base biológica, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[547] O agroquímico pode compreender um herbicida, o herbicida compreendendo um composto clorofenoxi, um composto nitrofenólico, um composto nitrocresólico, um composto de dipiridila, uma acetamida, um ácido alifático, uma anilida, uma benzamida, um ácido benzóico, um derivado do ácido benzoico, ácido anísico, um derivado de ácido anísico, um benzonitrila, dióxido de benzotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, cloropiridinila, um derivado de ciclohexenona, um derivado de dinitroaminobenzeno, um composto fluorodinitrotoluidina, isoxazolidinona, ácido nicotínico, isopropilamina, um derivado de isopropilamina, oxadiazolinona, um fosfato, um ftalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazol, um uracila, um derivado de ureia, endotal, clorato de sódio ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[548] O agroquímico pode compreender um fungicida, o fungicida compreendendo um benzeno substituído, um tiocarbamato, um etileno bis ditiocarbamato, uma tioftalidamida, um composto de cobre, um composto de organomercúrio, um composto de organoestanho, um composto de cádmio, anilazina, benomil, ciclohexamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxil, tiamimefon, triforina ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[549] O agroquímico pode compreender um inoculante fúngico, o inoculante fúngico compreendendo um inoculante fúngico da família Glomeraceae, um inoculante fúngico da família Claroidoglomeraceae, um inoculante fúngico da família Gigasporaceae, um inoculante fúngico da família Acaulosporaceae, um inoculante fúngico da família Sacculosporaceae, um inoculante fúngico da família Entrophosporaceae, um inoculante fúngico da família Pacidsporaceae, um inoculante fúngico da família Diversisporaceae, um inoculante fúngico da família Paraglomeraceae, um inoculante fúngico da família Archaeosporaceae, um inoculante fúngico da família Geosiphonaceae, um inoculante fúngico da família Ambisporaceae, um inoculante fúngico da família Scutellosporaceae, um inoculante fúngico da família Dentiscultataceae, um inoculante fúngico da família Racocetraceae, um inoculante fúngico do filo Basidiomycota, um inoculante fúngico do filo Ascomycota, um inoculante fúngico do filo Zygomycota, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[550] O agroquímico pode compreender um inoculante bacteriano, o inoculante bacteriano compreendendo um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Bradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inoculador bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospirillium, um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, um inoculante bacteriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gênero Paenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um inoculante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do gênero Alcaligenes, um inoculante bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um inoculante bacteriano do Nus Gliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella, ou uma combinação dos mesmos.

[551] O agroquímico pode compreender uma quantidade eficaz de uma rizobactéria. As rizobactérias podem compreender bactérias do gênero Bradyrhizobium (por exemplo, Bradyrhizobium japonicum), bactérias do gênero Rhizobium (por exemplo, Rhizobium phaseoli, Rhizobium leguminosarum, ou uma combinação dos mesmos), ou uma combinação dos mesmos

[552] O agente agroquímico pode compreender um fungicida, o fungicida compreende aldimorfh, ampropylfos, ampropylfos potássico, andoprim, anilazina, azaconazol, azoxistrobina, benalaxil, benodanil, benomil, benzamacril, benzamacril-isobutil, bialafos, binapacril, bifenil, bitertanol, blasticidina S, boscalida, bromuconazol, bupirimato, butiobato, polissulfeto de cálcio, capsimicina, captafol, captan, carbendazim, carvone, quinometionato, clobentiazona, clorfenazol, cloroneb, cloropicrina, clorotalonil, clozolinato, clozilacon, cufraneb, cimoxanil, ciproconazol, ciprodinil, ciprofuram, debacarb, diclorofeno, diclobutrazol, diclofluanida, diclomezina, diclorano, dietofencarb, dimetirimol, dimetomorfo, dimoxistrobina, diniconazol, diniconazol M, dinocape, difenilamina, dipiritiona, ditalimfos, ditianona, dodemorf, dodina, drazoxolon, edifenfos, epoxiconazol, etaconazol, etirimol, etridiazol, famoxadon, fenapanil, fenarimol, fenbuconazol, fenfuram, fenitropan, fenpiclonil, fenpropidina, fenpropimorfo, acetato de fentina, hidróxido de fentina, ferbam, ferimzona, fluazinam, flumetover, fluoromida, fluquinconazol, flurprimidol, flusilazol, flusulfamida, flutolanil, flutriafol, folpete, fosetil alumínio, fosetil sódio, ftalida, fuberidazol, furalaxil, furametpir, furcarbonil, furconazol, furconazol-cis, furmeciclox, guazatina, hexaclorobenzeno, hexaconazol, himexazol, imazalil, imibenconazol, iminoctadina, albesilato de iminoctadina, triacetato de iminoctadina, iodocarb, iprobenfos (IBP), iprodiona, irumamicina, isoprotiolano, isovalediona, kasugamicina, cresoxim-metílico, preparações de cobre, tais como: hidróxido de cobre, naftenato de cobre, oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, óxido de cobre, oxina cobre e mistura bordeau, mancobre, mancozeb, maneb, meferimzona, mepanipirim, mepronil, metconazol, metassulfocarb, methfuroxam, metiram, metomeclam, metsulfovax, mildiomicina, miclobutanil, miclozolin, dimetilditiocarbamato de níquel, nitrotal-isopropil, nuarimol, ofurace, oxadixil, oxamocarb, ácido oxolínico, oxicarboxim, oxifentiina, paclobutrazol, pefurazoato, penconazol, pencicuron, fosdifen, pimaricina, piperalina, polioxina, polioxorim, probenazol, procloraz, procimidona, propamocarb, propanosina sódica, propiconazol, propineb, protiocinazol, pirazofos, pirifenox, pirimetanil, piroquilon, piroxifur, quinconazol, quintozeno (PCNB), enxofre e preparações de enxofre, tebuconazol, tecloftalam, tecnazeno, tetciclasis, tetraconazol, tiabendazol, ticiofeno, tifluzamida, tiofanato metílico, tioximida, tolclofos metílico, tolifluanida, triadimefon, triadimenol, triazbutil, triazóxido, triclamida, triciclazol, tridemorfe, trifloxistrobina, triflumizol, triforina, uniconazol, validamicina A, vinclozolina, viniconazol, zarilamida, zinebe, zirame e também Adaga G, OK- 8705, OK-8801, a-(1,1-dimetiletil)-(3-(2-fenoxietil)-1H-1,2,4-triazol-1-etiol, a-(2,4- diclorofenil)-[3-fluoro-3-propil-1H-1,2,4-triazol-1-etanol, a-2,4-diclorofenil)-[3- metoxi-a-metil-1H-1,2,4-triazol e -1-etanol, a-(5-metil-1,3-dioxan-5-il)-[3-[[4- (trifluorometil)-fenil]-metileno]-1H-1,2,4-triazol-1-etanol, (5RS,6RS)-6-hidroxi- 2,2,7,7-tetrametil-5-(1H-1,2,4-triazol-1-il)-3-octanona, (E)-a-(metoxiimino)-N- metil-2-fenoxi-fenilacetamida, 1-isopropil{2-metil-1-[[[1-(4-metilfenil)-etil]-amino]- carbonil]-propil}carbamato, 1-(2,4-diclorofenil)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-il)-etanona- O-(fenilmetil)-oxima, 1-(2-metil-1-naftalenil)-1H-pirrol- 2,5-diona, 1-(3,5- diclorofenil)-3-(2-propenil)-2,5- pirrolidindiona, 1-[(diiodometil)-sulfonil]-4-metil- benzeno, 1-[[2-(2,4-diclorofenil)-1,3-dioxolan-2-il]-metil]-1H-imidazol, 1-[[2-(4- clorofenil)-3-feniloxiranil]-metil]-1H-1,2,4-triazol, 1-[1-[2-[(2,4-diclorofenil)- metoxi]-fenil]-etenil]-1H-imidazol, 1-metil-5-nonil-2-(fenilmetil)-3-pirroIidinol, 2’,6’- dibromo-2-metil-4’- trifluorometoxi-4’-trifluorometil-1,3-tiazol-carboxililida, 2,2- dicloro-N-[1-(4-clorofenil)-etil]-1-etil-3-metil-ciclopropanocarboxamida, 2,6- dicloro-5-(metiltio)-4-pirimidinil-tiocianato, 2,6-dicloro-N-(4- trifluorometilbenzil)- benzamida, 2,6-dicloro-N-[[4-(trifluorometil)-fenil]-metil]-benzamida, 2-(2,3,3- triiodo-2-propenil)-2H-tetrazol, 2-[(1-metiletil)-sulfonil]-5-(triclorometil)-1,3,4- tiadiazol, 2-[[6-desoxi-4-O-(4-0-metil-(3-D-glicopiranosil)-A-glucopiranosil]- amino]-4-metoxi-1H-pirrol[2,3-d]pirimidina-5-carbonitrila, 2-aminobutano, 2- bromo-2-(bromometil)-pentanodinitrila, 2-cloro-N-(2,6-dimetilfenil)-N- (isotiocianatometil)-acetamida, 2-fenilfenol (OPP), 3,4-dicloro-1-[4- (difluorometoxi)-fenil]-pirrol-2,5-diona, 3,5-dicloro-N- [ciano[(1-metil-2-propinil)- oxi]-metil]-benzamida, 3-(1,1- dimetilpropil-1-oxo-1H-indeno-2-carbonitrila, 3-[2- (4-clorofenil)-5-etoxi-3-isoxazolidinil]-piridina, 4-cloro-2-ciano-N,N-dimetil-5-(4- metilfenil)-1H-imidazol-1-sulfonamida, 4-metil-tetrazol[1,5-a]quinazolin-5(4H)- ona, 8-(1,1-dimetiletil)-N-etil-N-propil-1,4-dioxaspiro[4,5]decano-2-metanamina, 8-hidroxiquinolina sulfato, hidrazida 9H-xanteno-2-[(fenilamino)-carbonil]-9- carboxílica, bis-(1-metiletil)-3-metil-4-[(3-metilbenzoil)-oxi]-2,5- tiofenodicarboxilato, cis-1-(4-clorofenil)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-il)-ciclo-heptanol, cloridrato de cis-4-[3-[4-(1,1- dimetilpropil)-fenil-2-metilpropil]-2,6-dimetil- morfolina, [(4-clorofenil)-azo]-cianoacetato de etila, bicarbonato de potássio, sal de sódio de metanetretratiol, 1-(2,3-di-hidro-2,2-dimetil-inden-1-il)-1H-imidazol- 5-carboxilato de metila, N-(2,6-dimetilfenil)-N-(5-isoxazolilcarbonil)-DL-alaninato de metila, N-(cloroacetil)-N-(2,6-dimetilfenil)-DL-alaninato de metila, N-(2,3- dicloro-4-hidroxifenil)-1-metil-ciclo-hexanocarboxamida, N-(2,6-dimetilfenil)-2- metoxi-N-(tetra- hidro-2-oxo-3-furanil)-acetamida, N-(2,6-dimetilfenil)-2-metoxi- N-(tetra-hidro-2-oxo-3-tienil)-acetamida, N-(2-cloro-4-nitrofenil)-4-metil-3-nitro- benzeno-sulfonamida, N-(4-ciclo-hexilfenil)-1,4,5,6-tetra-hidro-2-pirimidinamina, N-(4-hexilfenil)-1,4,5,6-tetra-hidro-2-pirimidinamina, N-(5-cloro-2-metilfenil)-2- metoxi-N-(2-oxo-3-oxazolidinil)-acetamida, N-(6-metoxi)-3-piridinil)- ciclopropanocarboxamida, N-[2,2,2-tricloro-1-[(cloroacetil)-amino]-etil]- benzamida, N-[3-cloro-4,5-bis(2-propiniloxi)-fenil]-N’-metoxi-metanimidamida, Sal de sódio de N-formil-N-hidroxi-DL-alanina, [2-(dipropilamino)-2-oxoetil]- etilfosforamidotioato de 0,0-dietila, 0-metil S-fenil fenilpropilfosforamidotioato, 1,2,3-benzotiadiazol-7-carbotioato de S-metila, e espiro[2H]-1-benzopirano- 2,1’(3’H)-isobenzofuran]-3’-ona, N-triclorometil)tio-4- ciclo-hexano-1,2- dicarboximida, diamida tetrametiltioperoxidicarbônica, N-2,6-dimetilfenil)-N- (metoxiacetil)-DL-alaninato de metila, 4-(2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-4-il)-1H- pirrol-3-carbonitrila, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[553] O agente agroquímico pode compreender um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, o inoculante bacteriano do gênero Bacillus compreendendo Bacillus argri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus, Bacillus endorhythmos, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus lentimorbus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus medusa, Bacillus metiens, Bacillus natto, Bacillus nigrificans, Bacillus popillae, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus sphearicus, Bacillus subespéc., Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatu, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[554] O agente agroquímico pode compreender um herbicida, o herbicida compreendendo 2,4-D, 2,4-DB, acetocloro, acifluorfeno, alacloro, ametrina, atrazina, aminopiralide, benefina, bensulfurona, bensulida, bentazona, bromacil, bromoxinil, butilato, carfentrazona, clorimuron, clorsulfuron, cletodim, clomazona, clopiralid, cloransulam, cicloato, DCPA, desmedifam, dicamba, diclobenil, diclofop, diclosulam, diflufenzopir, dimetenamida, diquat, diuron, DSMA, endotal, EPTC, etalfluralina, etofumesato, fenoxaprop, fluazifop-P, flucarbazona, flufenacete, flumetsulam, flumiclorac, flumioxazina, fluometuron, fluroxipir, fomesafen, foramsulfuron, glufosinato, glifosato, halosulfuron, hexazinona, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazaquin, imazetapir, isoxaben, isoxaflutol, lactofen, linuron, MCPA, MCPB, mesotriona, metolacloro- s, metribuzina, metsulfurom, molinato, MSMA, napropamida, naptalam, nicossulfuron, norflurazona, orizalina, oxadiazona, oxifluorfen, paraquat, ácido pelargônico, pendimetalina, fenmedifam, picloram, primisulfuron, prodiamina, prometrina, pronamida, propanil, prossulfuron, pirazon, piritiobac, quinclorac, quizalofop, rimssulfuron, setoxidim, siduron, simazina, sulfentrazona, sulfometuron, sulfosulfuron, tebutiuron, terbacil, tiazopir, tifenssulfuron, thiobencarb, tralcoxidim, trialato, triassulfuron, tribenuron, triclopir, trifluralina, triflussulfurona, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[555] O agente agroquímico pode compreender um fertilizante, o fertilizante compreendendo sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato e sulfato de amônio, cloreto de amônio, bissulfato de amônio, polissulfeto de amônio, tiossulfato de amônio, amônia aquosa, amônia anidra, polifosfato de amônio, sulfato de alumínio, nitrato de cálcio, nitrato de cálcio e amônio, sulfato de cálcio, magnesita calcinada, calcário calcítico, óxido de cálcio, nitrato de cálcio, calcário dolomítico, cal hidratada, carbonato de cálcio, difosfato de amônio, monofosfato de amônio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de potássio e magnésio, sulfato de potássio, nitratos de sódio, calcário magnesiano, magnésia, ureia, ureia-formaldeídos, nitrato de amônio de ureia, ureia revestida com enxofre, ureia revestida com polímero, isobutilideno diureia, K2SO4-2MgSO4, kainita, silvinita, kieserita, sais de Epsom, enxofre elementar, marga, conchas de ostras trituradas, farelo de peixe, tortas de prensa, estrume de peixe, farelo de sangue, fosfato de rocha, super fosfatatos, escória, farelo de osso, cinza de madeira, estrume, guano de morcego, musgo de turfeira, compostagem, areia verde, farelo de semente de algodão, farelo de penas, farelo de caranguejo, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[556] O agente agroquímico pode compreender um hormônio de planta, o hormônio de planta compreendendo uma giberelina, uma auxina, uma cinetina ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[557] As enzimas podem ser formuladas de várias maneiras. Objetivos comuns para produtos de enzima de formulação incluem intensificar a vida útil, preservar o produto de microrganismos e intensificar a atividade enzimática. Os produtos de enzima podem ser liofilizados para prolongar a vida útil da maior parte das enzimas por liofilização, secagem por pulverização ou de outro modo remoção do aspecto líquido do produto de enzima. Os produtos líquidos e liofilizados são frequentemente incorporados com aditivos, como tampões, estabilizadores, agentes antimicrobianos e aditivos de volume. Muitas vezes, as enzimas podem ser encapsuladas ou granuladas para tornar o produto final mais seguro e fácil de usar. Os produtos granulados podem ter vida útil intensificada e ter pouca atividade enzimática exposta à superfície externa dos grânulos. As enzimas podem também ser afixadas a plataformas orgânicas ou inorgânicas, tais como grânulos de plástico, dolomita, argilas, carvão vegetal, biocarvão, nanopartículas, alginatos, grânulos de sílica ajudam a ligá-los e mantê-los em uma forma fácil de usar. Frequentemente, as enzimas são imobilizadas em matrizes para permitir maior atividade e vida útil dos produtos de enzima. Matrizes comuns incluem carbono, nanocarbonos, agarose, alginatos, celulose e material celulósico, sílica, plástico, aço inoxidável, vidro, poliestireno e cerâmica.

[558] Muitas formulações das enzimas podem ser usadas para prolongar a atividade enzimática ou o vida útil dos produtos. Estes incluem, mas não estão limitados a conservantes, biocidas, estabilizadores, intensificadores de cor, redução de odores, tensoativos, detergentes, tampões, cofatores, íons e outras modificações na formulação para intensificar o desempenho das enzimas.

XVII. MEIO DE CRESCIMENTO DE PLANTAS

[559] Em qualquer um dos métodos descritos aqui envolvendo o uso de um meio de crescimento de plantas, o meio de crescimento de plantas pode compreender solo, água, uma solução aquosa, areia, cascalho, um polissacarídeo, palha, compostagem, musgo de turfeira, palha, toras, argila, farelo de soja, extrato de levedura ou uma combinação dos mesmos.

[560] O meio de crescimento de plantas pode compreender ou consistir essencialmente em um fertilizante.

[561] Além disso, o meio de crescimento de plantas pode ser suplementado com um substrato para uma enzima.

[562] O substrato pode compreender triptofano, um monofosfato de adenosina, um difosfato de adenosina, um trifosfato de adenosina (por exemplo, adenosina-3-trifosfato), um polifosfato, um farelo de proteína, um trimetafosfato, uma celulose, uma metilcelulose, uma quitina, um quitosano, um derivado de celulose, um fosfato, uma gordura, uma cera, um fosfolipídio, um ácido fítico ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

XVIII. PLANTAS

[563] Em qualquer um dos métodos acima relacionados com plantas, a planta pode ser uma dicotiledônea, uma monocotiledônea ou uma gimnosperma.

[564] Da mesma forma, para qualquer uma das sementes aqui descritas, a semente pode ser uma semente de uma dicotiledônea, uma monocotiledônea, ou uma gimnosperma.

[565] Por exemplo, quando a planta é uma dicotiledônea ou a semente é uma semente de uma dicotiledônea, a dicotiledônea pode ser selecionada do grupo que consiste em feijão, ervilha, tomate, pimenta, abóbora, alfafa, amêndoa, anis, maçã, damasco, mandioquinha, alcachofra, abacate, amendoim de bambara moído, beterraba, mexerica, pimenta preta, acácia negra, amora silvestre, mirtilo, laranja amarga, repolho-chinês castanha-do-brasil, fruta- pão, brócolis, fava, couve de Bruxelas, trigo mourisco, repolho, camelina, couve chinesa, cacau, melão, sementes de cominho, cardo, alfarroba, cenoura, castanha de caju, mandioca, mamona, couve-flor, aipo-rábano, salsão, cereja, castanha, grão de bico, chicória, pimenta, crisântemo, canela, cidra, clementina, cravo, trevo, café, noz-de-cola, colza, milho, algodão, semente de algodão, feijão-de-corda, crambe, oxicoco, agrião, pepino, groselha, fruta-do-conde, ervilha tuberosa, berinjela, endívia, erva-doce, feno-grego, figo, avelã, linho, gerânio, groselha, cabaça, uva, toranja, goiaba, cânhamo, semente de cânhamo, henna, lúpulo, fava, rábano, anil, jasmim, alcachofra-girassol, juta, couve, mafumeira, kenaf, couve-rábano, quincã, lavanda, limão, lentilha, lespedeza, alface, limão, alcaçuz, lichia, nespereira, tremoço, macadâmia, moscadeira, mandarim, beterraba branca, manga, nêspera, melão, hortelã, amoreira, mostarda, nectarina, semente de níger, noz-moscada, quiabo, azeite, ópio, laranja, mamão papaia, cherovia, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, noz pecã, caqui, ervilha-de-pombo, pistache, banana-da-terra, ameixa, romã, pomelo, semente de papoula, batata, batata doce, ameixa seca, abóbora, quebracho, marmelo, árvores do gênero Cinchona, quinoa, rabanete, rami, colza, framboesa, sálvia farinácea, ruibarbo, rosa, borracha, nabo, cártamo, esparceta, barba de bode, sapota, mikan, escorcioneira, gergelim, carité, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba, cana de açúcar, girassol, swede, pimentão, tangerina, chá, tefe, tabaco, tomate, trevo, tungue, nabo, urena, vicia, noz, melancia, erva-mate, barbarea, bolsa de pastor, agrião de jardim, agrião-de- jardim, agrião, campo centavo-agrião, anis estrelado, louro, loureiro, cassia, jamelão, endro, tamarindo, hortelã, orégano, alecrim, sálvia, graviola, centela, guanandi, melão de São Caetano, nogueira de Iguape, castanha do Taiti, manjericão, mirtilo, hibisco, maracujá, maçã estrela, sassafrás, cacto, erva de São João, salgueirinha-roxa, espinheiro, coentro, árvore-do-caril, kiwi, tomilho, abobrinha italiana, ulluco, jicama, waterleaf, maboqueiro, cajazeira, carambola, amaranto, wasabi, pimenta japonesa, ameixa amarela, mashua, mogno chinês, espinafre de Nova Zelândia, tetragônia, ugu, erva-de-São-Marcos, morugem, ciriguela, jambo-rosa, jambu, serralha, batata chinesa, salsinha, saramago, silene, ágata, cássia-de-sião, cardo leiteiro, pimpinela, groselha branca, salsola, salicornia, azeda, samambaia de renda prata, couve-galega, prímula, primavera, beldroegas, centonódia, terebinto, pé de alface, bétel selvagem, pimenta-de-são- tomé, erva santa, estragão, perrexil, cerefólio, agrião-de-horta, pimpinela- hortense, erva doce asteca, petasite, shisô, pimenta da água, perila, feijão verde, oca, dormideira, aipo chinês, manjericão de limão, manjericão tailandês, mimosa de água, cicely, palma-dracena, moringa, mauka, samambaia, erva dos arrozais, golfo, levístico, erva-pimenteira, maca, porongo, labe-labe, espinafre-da-água, erva-das-tetas, hortelã-pescado, espinafre okinawan, glinus lotoides, picão branco, chicória, rúcula, alcachofra de globo, chucho-de-vento, mitsuba, chipilín, salicórnia, falso-mangostão, ebolo, cabaça de hera, cardo de repolho, crambe maritima, chaya, huauzontle, mostarda-da-abissínia, árvore de espinafre, pé de ganso, erva-de-santa-maria, erva formigueira branca, celosia plumada, alcaparra, grelos, couve napa, mizuna, couve-lombarda, brócolis chinês, mostarda-castanha, bertalha, acelga, malva-branca, leucena, abutilon, páprica, semente de colorau, hortelã, segurelha-anual, manjerona, cominho, camomila, erva-cidreira, pimenta dioica, mirtilo, anona, amora-branca-silvestre, brunho, pitaia, durião, sabugueiro, goiaba-serrana, jaca, jamelão, jujuba, físalis, mangostão roxo, rambutão, groselha, cassis, salal, satsuma, ugli, feijão azuki, feijão preto, feijão-de-corda, feijão borlotti, feijão comum, feijão verde, feijão roxo, feijão-de-lima,, feijão-da-china, feijão branco, feijão carioca, feijão-da-espanha, ervilha da neve, ervilha-de-açúcar, brocoflor, brócoli, urtiga-comum, pimentão, endívia, rabanete, rabanete branco, sium sião, tatsoi, broccolini, rabanete preto, raiz de bardana, feijão de fava, brócoli rab, labe-labe, tremoço, chichá- fedorento, feijão-da-flórida, feijão alado, jão mexicano, mulga, aluman, acacia, acacia murrayana, acacia tetragonophylla, Acacia extensa, chia, faia americana, noz-de-iguape, colocíntida, mamoncillo, castanha-do-maí, mongongo, manga selvagem, noz do paraíso, e champedaque.

[566] Onde a planta é uma monocotiledônea ou a semente é uma semente de uma monocotiledônea, a monocotiledônea pode ser selecionada do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, arroz, cevada, milheto, banana, cebola, alho, espargos, azevém, painço, fonio, raishan, nipa, açafrão-da-terra, açafrão, gengibre do Laos, cebolinha, cardamomo, tamareira, abacaxi, chalota, alho-poró, cebolinha, castanha-d'água chinesa, alho poró selvagem, lágrimas de Job, bambu, painço de dedo, lentilha- d'água, orelha-de-elefante, espinafre taitiano, abacá, areca-bambu, mexoeira, noz de areca, milheto de vassoura, sorgo de vassoura, citronela, coco, inhame-coco, milho, taioba, durra, trigo duro, edo, Agave, espadana, gengibre, panasco, esparto, sorgo selvagem, sorgo guinea, cânhamo de Manila, henequen, milho híbrido, jowar, capim-limão, agave, pennisetum glaucum, Capim-pé-de-galinha-gigante, Capim-de-Cabra, milheto japonês, painço proso, maori, aveia, óleo de palma, palmeira macha brava, sagu-de- jardim, pessegueiro, sisal, sorgo, trigo de espelta, milho doce, sorgo doce, taro, tefe, rabo-de-gato, triticale, baunilha, trigo e inhame.

[567] Onde a planta é uma gimnosperma ou a semente é uma semente de uma gimnosperma, a gimnosperma pode ser de uma família selecionada do grupo consistindo em Araucariaceae, Boweniaceae, Cephalotaxaceae, Cupressaceae, Cycadaceae, Ephedraceae, Ginkgoaceae, Gnetaceae, Pinaceae, Podocarpaceae, Taxaceae, Taxodiaceae, Welwitschiaceae e Zamiaceae.

[568] As plantas e sementes de plantas aqui descritas podem incluir plantas transgênicas ou sementes de plantas, tais como cereais transgênicos (trigo, arroz), milho, soja, batata, algodão, tabaco, colza e fruteiras (frutos de maçãs, peras, citrinos e uvas). As plantas transgênicas preferidas incluem milho, soja, batata, algodão, tabaco e colza.

[569] Plantas e sementes transgênicas adequadas podem ser caracterizadas pela formação de toxinas na planta, especialmente do material genético de Bacillus thuringiensis (por exemplo, pelo gene CryIA (a), CrylA (b), CrylA (c), CryllA, CrylllA, CrylllB2, Cry9c, Cry2Ab, Cry3Bb, CryIF ou uma combinação dos mesmos). A formação de toxinas em plantas aumenta a resistência da planta a insetos, aracnídeos, nematóides, lesmas e caracóis (doravante referidos como “plantas Bt”). As plantas Bt, por exemplo, são comercialmente disponíveis sob o nome comercial YIELD GARD® (por exemplo milho, algodão, soja), Knock0ut® (por exemplo, milho), StarLink® (por exemplo, milho), Bollgard® (algodão), Nucotn® (algodão) e variedades de milho NewLeaf® (batata), variedades de algodão, variedades de soja e variedades de batata. Plantas de tolerância a herbicidas incluem plantas sob os nomes comerciais Roundup Ready® (tolerância ao glifosato, como milho, algodão, soja), Clearfield® (por exemplo, milho), Liberty Link® (tolerância a glufosinato, por exemplo colza), IMI® (com tolerância a imidazolinona) e STS® (tolerância a uma sulfonilureia, como milho).

[570] As sementes de plantas, como aqui descritas, podem ser geneticamente modificadas (por exemplo, qualquer semente que resulte em uma planta ou parte de planta geneticamente modificada que expresse tolerância a herbicida, tolerância a fatores ambientais, tais como, estresse hídrico, seca, vírus e produção de nitrogênio, ou resistência a toxinas bacterianas, de fungos ou insetos). Sementes geneticamente modificadas adequadas incluem as de cultivos de couves, vegetais, frutas, árvores, cultivos de fibras, cultivos de oleaginosas, cultivos de tubérculos, café, flores, leguminosas, cereais, bem como outras plantas das espécies monocotiledôneas e dicotiledôneas. De preferência, as sementes geneticamente modificadas incluem amendoim, tabaco, gramíneas, trigo, cevada, centeio, sorgo, arroz, colza, beterraba, girassol, tomate, pimenta, feijão, alface, batata e cenoura. Mais preferencialmente, as sementes geneticamente modificadas incluem algodão, soja e milhofield (doce, de campo, semente ou de pipoca).

[571] Plantas transgênicas particularmente úteis que podem ser tratadas de acordo com a invenção são plantas contendo eventos de transformação, ou uma combinação de eventos de transformação, que estão listados, por exemplo, nas bases de dados de várias agências reguladoras nacionais ou regionais (ver, por exemplo, http://gmoinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx e http://www.agbios.com/dbase.php).

[572] Tendo descrita a invenção em detalhe, será evidente que são possíveis modificações e variações sem sair do escopo da invenção definida nas reivindicações anexas.

EXEMPLOS

[573] Os seguintes exemplos não limitantes são fornecidos para ilustrar ainda mais a presente invenção.

EXEMPLO 1: ENDOGLUCANASE LIVRE EM MILHO, ESTUFA

[574] β-1,4 endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO: 30; comercialmente disponível da Sigma-Aldrich, St. Louis MO, como produto E2164) foi diluída em tampão de diluição de citrato para concentrações de 12,5 a 1600 mU/mL. O U (unidades ou unidades internacionais) de atividade de endoglucanase foi determinado pela quantidade de enzima que é necessária para a degradação de 1 μMol/min/mL de substrato em temperatura e condições ideais. Para cada grupo de tratamento, 18 sementes de milho comercial híbrido 6626RR da BECK, que contém um traço de tolerância ao glifosato, sem tratamento de sementes, foram colocadas em tubos cônicos de 50 mL. Cada tubo cônico foi submetido à vórtice e 18 μl de solução enzimática foram adicionados a cada tubo para uma concentração final de enzima de 0; 12,5 μU; 25 μU; 50 μU; 100 μU; 200 μU; 400 μU; 800 μU ou 1600 μU por semente de endoglucanase. Os tubos cônicos foram novamente submetidos a vórtice por 20 segundos para obter um revestimento uniforme em cada semente. As sementes foram deixadas secar durante 5 minutos e depois plantadas em vasos de 39,7 cm3 contendo solo superficial a uma profundidade de 2,54 cm, com 2 sementes por vaso. Após a plantação, 50 mL de água em temperatura ambiente foram adicionados a cada vaso para permitir a germinação. Os vasos foram mantidos em um ambiente de crescimento de plantas com luz artificial com um ciclo de luz/dia de 13/11 horas, e a uma faixa de temperatura de 21 °C de dia/15°C de noite. As plantas foram regadas quando necessário, e randomizadas em um ciclo de 3 dias para evitar quaisquer pontos frios dentro da sala. Ao final de 14 dias, mediu-se a altura das plantas de milho para cada tratamento, e normalizou-se até a altura das plantas de controle que foram revestidas nas sementes apenas com água.

[575] Este experimento foi repetido três vezes, e os valores médios através dos experimentos. Como pode ser visto na Tabela 18, o principal efeito da endoglucanase como um tratamento de sementes no 6626RR da BECK (um híbrido de milho com resistência a glifosato) está na faixa de 100-1600 μU/semente de atividade enzimática. Nesses valores, há um efeito perceptível e reprodutível no crescimento do milho. Valores abaixo de 50 μU por semente tiveram um efeito muito menor na taxa de crescimento do milho para este híbrido. Esses tratamentos com enzima funcionam bem como um tratamento autônomo nas lavouras.TABELA 18. EFEITOS DE ALTURA DO TRATAMENTO COM B-1,4 ENDOGLUCANASE COMO TRATAMENTO DE SEMENTES

EXEMPLO 2: ENDOGLUCANASE LIVRE EM MILHO, ESTUFA

[576] β-1,4 endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO: 30; comercialmente disponível da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto E2164) foi diluída em tampão de diluição de citrato para concentrações de 50 a 1200 mU/mL. O U da atividade de endoglucanase foi determinado pela quantidade de enzima necessária para decompor 1 μMol/min/mL de substrato em temperatura e condições ideais. Dezoito sementes de milho híbrido comercial 5140HR da BECK, que contém broca do milho HERCULEX (traço de proteção a insetos) e um traço de tolerância a glifosato, sem tratamento de sementes foram colocadas em tubos cônicos de 50 mL. Cada tubo cônico foi submetido a vórtice e 18 mL de solução enzimática foram adicionados a cada tubo para uma concentração final de enzima de 0, 50 μU, 100 μU, 200 μU, 400 μU, 600 μU, 800 μU ou 1200 μU por semente de endoglucanase. Os tubos cônicos foram novamente submetidos a vórtice durante 20 segundos para obter um revestimento uniforme em cada semente. As sementes foram deixadas secar durante 5 minutos e depois plantadas em vasos de 39,7 cm3 contendo solo superficial comercial a uma profundidade de 2,54 cm, com 2 sementes por vaso. Após a plantação, 50 mL de água em temperatura ambiente foram adicionados a cada vaso para permitir a germinação. Os vasos foram mantidos em um ambiente de crescimento de plantas em luz artifical com um ciclo de 13/11 horas de luz/dia, e a 21° de dia/15° de noite. As plantas foram regadas quando necessário, e randomizadas em um ciclo de 3 dias para evitar quaisquer pontos frios dentro do ambiente. Ao final de 14 dias, mediu-se a altura das plantas de milho para cada tratamento, e normalizou-se até a altura das plantas de controle que foram revestidas apenas com água. Cada tentativa foi replicada 3 vezes.

[577] Como pode ser visto na Tabela 19, o principal efeito da endoglucanase como tratamento de sementes 5140HR da BECK está na faixa de 600-1200 μU/semente de atividade enzimática. Nesses valores, há um efeito perceptível e reprodutível no crescimento do milho. Valores abaixo de 400 μU por semente tiveram um efeito menor na taxa de crescimento do milho neste híbrido. Esses tratamentos com enzima funcionam bem como um tratamento autônomo nas lavouras.TABELA 19. EFEITOS DE ALTURA DO TRATAMENTO COM B-1 ,4 ENDOGLUCANASE COMO UM TRATAMENTO DE SEMENTES

EXEMPLO 3: GLUCANASES E FOSFOLIPASES EM MILHO, CAMPO

[578] β-1,4 endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO: 30; comercialmente disponível de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto E2164), β-1,3-D-glucanase de Helix pomatia (SEQ ID NO: 126; comercialmente disponível em Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto 67138), β-1,4 endoglucanase “celulase” de Trichoderma reesi (SEQ ID NO: 36; comercialmente disponível em Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ, como produto ATCC26921), e exo-β-1,3-glucanase de Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 41; comercialmente disponível de Megazyme, Chicago, IL, como produto E-EXG5AO) foram diluídos em tampão de diluição de citrato para concentrações de 600 mU/mL (para a β-1,4-endoglucanase de Acidothermus e a β-1,4- endoglucanase de Trichoderma) ou 252 mU/mL (para a β-1,3-D-glucanase de Helix) de atividade. Este agrupamento continha várias atividades de celulase (glucanase celulolítica) e glucanase não-celulolítica, incluindo atividades de β- 1,4-endoglucanase e β-1,3-D-glucanase, respectivamente. O U da atividade enzimática foi determinado por uma quantidade de enzimas necessária para decompor 1 μMol/min/mL de substrato em temperatura e condições ideais. Fosfolipase C específica de fosfatidilisositol de Bacillus cereus (SEQ ID NO: 116; disponível comercialmente de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto P5524), fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus (SEQ ID NO: 115; comercialmente disponível de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO como produto P6621), fosfolipase C de Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 18; comercialmente disponível em Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto P7633) e fosfolipase D de Streptomyces chromofuscus (SEQ ID NO: 19; disponível comercialmente de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto P0065) foram diluídos em tampão de diluição de enzima citrato até uma concentração final de 2,5 U/mL (para a fosfatidilcolina Fosfolipase C de Bacillus, a Fosfolipase C de Clostridium, e a Fosfolipase D de Streptomyces) ou 100 U/mL (para o Fosfatidilinositol Fosfolipase C de Bacillus). Cada uma dessas fosfolipases tem diferentes atividades específicas para fosfolipídios e para diferentes sítios de clivagem para fosfolipídios. Sementes do milho comercial híbrido 6175YE da BECK, que contém HERCULEX (traços de proteção da lagarta e da broca do milho), MON810 (traço de resistência à broca do milho), traço de resistência à glufosinato e traço de tolerância a glifosato foram usados, sem tratamento de sementes. As sementes foram colocadas em um tratador em batelada com 400 sementes para cada tratamento. 400 μL de solução foram adicionados a cada batelada para uma concentração final de enzima de 600 μU/semente para a β-1,4-endoglucanase de Acidothermus e a β-1,4- endoglucanase de Trichoderma, 252 μU/semente para a β-1,3-D-glucanase da Helix, 100 mU/semente para a fosfolipase C específica de fosfatidilinositol ou 2,5 mU/semente para a Fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus e as sementes revestidas com fosfolipase C e D. Cada batelada foi deixada misturar durante 20 segundos para obter um revestimento uniforme em cada semente. Adicionalmente, estas sementes foram revestidas com embalagens comerciais de protioconazol, penflufeno, metalaxil e clotianidina (Tratamento de Semente com EVERGOL Energy/PONCHO, comercialmente disponível da Bayer CropScience) (“Base”). Cada ensaio foi replicado 3 vezes. As sementes foram deixadas secar durante 3 semanas, e depois plantadas em solo nativo em filas de 9,14 m separadas a 10,16 cm, a uma profundidade de 3,81 cm. As plantas foram medidas para a altura em 2 semanas após o plantio e normalizadas para a altura das plantas de controle que foram revestidas com sementes apenas com água com Base. Os resultados são mostrados na Tabela 16 abaixo.TABELA 20. EFEITOS DE ALTURA DE TRATAMENTOS COM GLUCANASES E FOSFOLIPASE COMO UM TRATAMENTO DE SEMENTES

[579] β-1,3-exoglucanase (Aspergillus oryzae; SEQ ID NO: 41; comercialmente disponível em Megazyme, Chicago, IL, como produto E- EXG5AO), fosfolipase C específica de fosfatidilinositol (Bacillus cereus; SEQ ID NO: 116; comercialmente disponível da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO como produto P6621), fosfolipase C específica da fosfatidilcolina (Bacillus cereus; SED ID NO: 115; comercialmente disponível da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto P5542), e fosfolipase D (Streptomyces chromofuscus; SEQ ID NO: 19; comercialmente disponível da Sigma-Aldrich como produto P8023) foram diluídos em água a 182 mU/mL (para β-1,3-exoglucanase), 100 U/mL (para o fosfolipase C específica de fosfatidilinositol) ou 2,5 U/mL (para a fosfolipase C e a fosfolipase D específicas de fosfatidilcolina). As enzimas foram aplicadas como tratamentos de sementes para milho (BECK'S 5828 YH) que contém traços HERCULEX (um traço de proteção para lagarta e traço de proteção para broca de milho), um traço de resistência a glufosinato e um traço de resistência para glifosato), usando os mesmos métodos descritos acima, plantados e permitidos crescer até a colheita. Os tratamentos de sementes foram feitos no topo de um tratamento de sementes de base contendo protioconazol, penflufeno, metalaxil e clotianidina (“Base”) e tratados como descrito na seção acima deste Exemplo. O rendimento dos cultivos tratados (quantificados como bushels/acre (Bu/Ac) ou toneladas métricas por hectare (MT/ha)) foi comparado com e normalizado para os cultivos desenvolvidos a partir de sementes tratadas com água. Cada tratamento foi realizado de forma independente pelo menos 4 vezes. Os tratamentos com sementes de milho usando estas enzimas livres resultaram em rendimento de milho aumentado em comparação com plantas de milho de controle que não receberam tratamento de sementes. A β-1,3-exoglucanase aumentou o rendimento de cultivo em aproximadamente 4%, a fosfolipase C específica do fosfatidilinositol aumentou o rendimento do cultivo aumentado em aproximadamente 3% e a fosfolipase D aumentou o rendimento do cultivo em aproximadamente 2%. O peso médio por orelha também aumentou para plantas de milho cultivadas a partir de sementes tratadas com estas três enzimas livres.Os resultados são mostrados na Tabela 21 abaixo.TABELA 21. GLUCANASES E FOSFOLIPASES APLICADAS COMO TRATAMENTO DE SEMENTES PARA AUMENTAR O RENDIMENTO NO MILHO

[580] Das fosfolipases e glucanases que foram testadas neste ensaio, a β-1,3-exoglucanase e a fosfolipase C específica de fosfatidilinositol de Bacillus cereus e fosfolipase D de Streptomyces tiveram as melhores respostas das plantas. Estes tratamentos com enzima trabalharam em múltiplos pacotes híbridos e de traços.

EXEMPLO 4: GLUCANASES NO MILHO, CAMPO

[581] β-1,4 endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO: 30; comercialmente disponível da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto E2164) foi diluída em tampão de diluição de citrato para concentrações de 200 mU/ml e 450 mU/mL de atividade. O U da atividade da endoglucanase foi determinado pela quantidade de enzimas necessária para decompor 1 μMol/min/mL de substrato em temperatura e condições ideais. 150 sementes de híbrido comercial 6175YE de BECK, que contém, HERCULEX (traço de proteção para lagarta e da broca do milho), MON810 (traço de resistência à broca do milho), traço de resistência à glufosinato e um traço de resistência a glifosato, sem tratamento de sementes foram colocadas em tubos cônicos de 50 mL com 50 sementes cada. Foram adicionados 50 μL de enzima a cada um dos tubos com 250 μL de suspensão contendo protioconazol, penflufeno, metalaxil e clotianidina (Tratamento de Semente EVERGOL Energy/PONCHO) (“Base”). Isto levou a uma concentração final de enzima de 200 μU/semente e 450 μU/semente. Os tubos foram submetidos em vórtice durante 20 segundos para obter um revestimento uniforme em cada semente. As sementes foram deixadas secar durante 3 semanas e depois plantadas em solo nativo em filas de 9,14 m separadas a 10,16 cm, a uma profundidade de 3,81 cm. As plantas foram medidas para a altura em 2 semanas após o plantio, e os resultados foram normalizados para a altura das plantas de controle que foram sementes revestidas apenas com água com Base (protonoconazol, penflufeno, metalaxil e clotianidina).

[582] Os ensaios foram repetidos três vezes, e os valores médios em todos os experimentos. Os dados na Tabela 22 abaixo mostram que a taxa de crescimento do milho para ambas as concentrações de β-1,4-endoglucanase foi aumentada em 2 semanas após o plantio. Nessas concentrações, há um efeito perceptível e reprodutível no crescimento do milho. Esses tratamentos com enzima funcionam bem como um pacote em cima do tratamento de Base em cultivos e em múltiplos híbridos e pacotes de traço.TABELA 22. EFEITOS DA ALTURA DE TRATAMENTO COM ENDOGLUCANASE COMO UM TRATAMENTO DE SEMENTES

EXEMPLO 5: FOSFOLIPASES EM MILHO, ESTUFA, ALTO ALCANCE

[583] Fosfolipase C específica de Fosfatidilcolina de Bacillus cereus (SEQ ID NO: 115; comercialmente disponível de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto P6621), fosfolipase C de Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 18; disponível comercialmente de Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, como produto P7633), e fosfolipase D de Streptomyces chromofuscus (SEQ ID NO: 19; disponível comercialmente de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto P0065) foram diluídos em 100 mM de tampão tris, pH 7,0 para concentrações entre 100 U/ml e 450 U/ml. Para cada grupo de tratamento, 18 sementes de milho comercial híbrido 6626RR de BECK, que contém um traço de tolerância a glifosato, sem tratamento de sementes, foram colocadas em tubos cônicos de 50 mL. Cada tubo cônico foi submetido a vórtice e 18 μl de solução enzimática foram adicionados a cada tubo para uma concentração final de enzima de 100 mU/mL, 200 mU/mL ou 450 mU/mL por semente de fosfolipase, e novamente submetida a vórtice durante 20 segundos para obter um revestimento uniforme em cada semente. As sementes foram deixadas secar durante 5 minutos e as sementes foram então plantadas em vasos de 42,24 cm3 (692,19 cm3) de solo superficial comercial a uma profundidade de 2,54 cm, com 2 sementes por vaso. Após o plantio, 50 mL de água em temperatura ambiente foram adicionados a cada vaso para permitir a germinação. Os vasos foram mantidos em um ambiente de crescimento de plantas com luz artificial com um ciclo de luz/dia de 13/11 horas e a uma faixa de temperatura de 21 °C de dia/15°C de noite. As plantas foram regadas quando necessário, e giradas em um ciclo de 3 dias para evitar quaisquer pontos frios dentro do ambiente. Ao final de 14 dias, mediu-se a altura das plantas de milho para cada tratamento, e normalizou-se até a altura das plantas de controle que foram revestidas apenas com água. Os experimentos foram realizados em triplicado.

[584] Predominantemente, pode ser visto, na Tabela 23, que o efeito das enzimas fosfolipases C e D é melhor em valores iguais ou abaixo de 100 mU/semente. Nesses valores, há um efeito perceptível e reprodutível no crescimento do milho. Valores iguais ou acima de 200 mU/semente são prejudiciais ao crescimento do milho. Isto é verdade para ambas as enzimas fosfolipase C e D.TABELA 23. EFEITOS DE ALTURA DO TRATAMENTO COM FOSFOLIPASES COMO TRATAMENTO DE SEMENTES

EXEMPLO 6: RENDIMENTO DE SOJA2015, ENDOGLUCANASES E FOSFOLIPASES

[585] β-1,4 endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO: 30; comercialmente disponível de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto E2164), β-1,3-D-glucanase de Helix pomatia (SEQ ID NO: 126; disponível comercialmente de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto 67138), e β-1,4 endoglucanase “celulase” de Trichoderma reesi (SEQ ID NO: 36; comercialmente disponível em, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ) foram diluídas em água para concentrações de 600 mU/ml de atividade para as duas β-1,4 endoglucanases e 252 mU/ml para a β-1,3-D-glucanase. Este agrupamento continha várias atividades de glucanase celulolíticas e não celulolíticas, incluindo as atividades β-1,4-endoglucanase e β-1,3-D-glucanase. Fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus (SEQ ID NO: 115; comercialmente disponível de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto P6621), fosfolipase C de Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 18; comercialmente disponível de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto P7633) e fosfolipase C específica do fosfatidilinositol de Bacillus cereus (SEQ ID NO: 116; disponível comercialmente de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto P5524) foram diluídos em água até uma concentração final de 2,5 U/ml (para a fosfolipase C específica de Fosfatidilcolina de Bacillus e a Fosfolipase C de Clostridium) ou 100 U/ml (para a fosfolipase C específica de Fosfatidilinositol de Bacillus). Cada uma dessas fosfolipases tem diferentes atividades específicas para fosfolipídios e para diferentes sítios de clivagem para fosfolipídios. 720 sementes de soja híbrida comercial 294NR de BECK, que contêm um traço de resistência a nematóides (SCN-SB) e um traço de resistência a glifosato (ROUNDUP READY 1), com o pacote de tratamento de sementes de Base metalaxil e clotianidina (Base) foram colocadas em latas de tinta e revestidas com tratamento comercial de sementes (Base). Cada batelada foi misturada, e 720 μL de solução foram adicionados a cada batelada para obter as concentrações finais de enzima listadas na Tabela 24 abaixo. As sementes foram deixadas a secar por 3 semanas, e depois plantadas em solo nativo em fileiras de 9,14 m a uma distância de 6,35 cm, a uma profundidade de 3,81 cm. As plantas foram colhidas e o rendimento medido no cultivo. Cada tratamento foi replicado 4 vezes e plantado 4 vezes no campo. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 24 como uma porcentagem de peso sobre o tratamento de controle (Base).TABELA 24. AUMENTOS DE RENDIMENTO COMO UMA PORCENTAGEM DE CONTROLE

[586] Como pode ser visto na Tabela 24, todas as três glucanases levam a um aumento perceptível no rendimento nas plantas de soja, bem como o PC-PLC e PI-PLC de Bacillus cereus.

EXEMPLO 7: RENDIMENTO DO MILHO EM 2015, ENDOGLUCANASE

[587] β-1,4 endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO: 30 comercialmente disponível da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, como produto E2164) foi diluída em tampão de diluição de enzima citrato para concentrações de 250 e 600 mU/ml de atividade. Sementes de milho comercial híbrido 5828YH de BECK com pacote de tratamento de sementes de base (“Base”) de protonoconazol, penflufeno, metalaxil e clotianidina (EVERGOL Energy/PONCHO) foram colocadas no tratador de sementes com 250 sementes cada. Cada batelada foi misturada, e 250 mL de solução foram adicionados a cada tubo para uma concentração final de enzima de 200 ou 600 μU/semente para as sementes revestidas com endoglucanases. Cada batelada foi misturada novamente por 20 segundos para obter um revestimento uniforme em cada semente. As sementes foram deixadas secar durante 3 semanas e depois plantadas em solo nativo em fileiras de 9,14 m a uma distância de 6,35 cm, a uma profundidade de 3,81 cm. As plantas foram colhidas e o rendimento medido no cultivo. Cada tratamento foi replicado 4 vezes. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 25 como um peso de cultivo como um percentual sobre o peso de cultivo de tratamento de controle (normalizado).TABELA 25. AUMENTOS DE RENDIMENTO COMO UMA PORCENTAGEM DE CONTROLE

[588] Como pode ser visto na Tabela 25, ambas as taxas de endoglucanase de Acidothermus β-1,4 levam a um aumento no rendimento do milho.

EXEMPLO 8: ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS.

[589] Amostras de solo de rizosferas das plantas de batata mais saudável e mais resistente (Solanum tuberosum), abobrinha amarela (Cucurbita pepo), tomate (Solanum lycopersicum) e feijão-da-espanha (Phaseolus coccineus) foram coletadas, diluídas em água estéril, e espalhadas em placas de ágar nutriente. Isolados bacterianos que demonstraram altas taxas de crescimento e foram passíveis de serem passados e propagados foram selecionados para um estudo mais aprofundado. As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 1 g de NH4Cl, 0,50 g de NaCl, 0,15 g de MgSO4 7H2O, 0,013 g de CaCl2 2H2O e glicose 1 g, por L peso seco). Culturas de um dia para o outro (30°C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, o meio decantado e recolocado em suspensão em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de alface-repolhuda por tratamento foram plantadas a uma profundidade de 1 cm no solo superficial argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas no plantio em vasos de 4 cm com 0,5 μL de bactérias recolocadas em suspensão em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para dispensar as bactérias aos 3 in3 (49,16 cm3) de solo, bem como saturar o solo para germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 18 e 24°C (65-75°F) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. Após uma semana, as alturas das plantas e os diâmetros das folhas, bem como a saúde geral das plantas foram coletados. A triagem inicial de isolados de rizosfera resultou na obtenção de mais que 200 espécies distintas de bactérias e fungos da rizosfera das quatro plantas. Algumas das espécies bacterianas estão descritas na Tabela 26. As cepas identificadas são indicadas pelas suas próprias identificações bacterianas. Outras cepas são indicadas pelo seu número de identificação desconhecido. Inoculantes que deram resultados próximos ao controle (+/- 2%) não foram incluídos na tabela.TABELA 26

[590] As cepas bacterianas que produziram o maior efeito na saúde geral da planta e altura da planta no ensaio inicial de alface foram submetidas a uma identificação adicional. Cepas bacterianas foram cultivadas durante a noite em caldo Luria Bertani a 37°C, e culturas de um dia para o outro foram centrifugadas em uma centrífuga. O meio foi decantado e o sedimento bacteriano remanescente foi submetido a isolamento de DNA cromossômico usando o kit de Isolamento de DNA Cromossico Bacterico Qiagen. O DNA cromossômico foi submetido à amplificação por PCR das regiões de codificação de 16S rRNA usando os iniciadores E338F 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’ (SEQ ID NO: 108), E1099R A 5’-GGG TTG CGC TCG TTG C-3’ (SEQ ID NO: 109), e E1099R B 5’-GGG TTG CGC TCG TTA C-3’ (SEQ ID NO: 110). Os amplicons de PCR foram purificados usando um kit de purificação PCR da Promega e os amplicons resultantes foram diluídos e enviados para o DNA Core da University of Missouri para sequenciação de DNA. As sequências de DNA foram comparadas com a base de dados NCBI BLAST de isolados bacterianos, e o gênero e a espécie foram identificados por comparação direta com cepas conhecidas. As espécies identificadas de topo são indicadas na Tabela 26. Em muitos casos, as sequências de DNA de rRNA 16S só foram capazes de delinear o gênero da cepa bacteriana selecionada. Nos casos em que não houve uma identificação direta, análises bioquímicas adicionais, usando métodos padrão no campo, foram realizadas para diferenciar as cepas nos níveis de espécies e de deformação, e estão listadas na Tabela 27.TABELA 27

EXEMPLO 9: ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO DE PLANTAS ADICIONAIS.

[591] Amostras de solo de campos agrícolas perto de Gas, Kansas foram coletadas, diluídas em água estéril e espalhadas em placas de ágar nutriente. Isolados bacterianos que demonstraram altas taxas de crescimento e foram passíveis de serem passados e propagados foram selecionados para um estudo mais aprofundado. As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 1 g de NH4Cl, 0,50 g de NaCl, 0,15 g de MgSO4 7H2O, 0,013 g de CaCl2 2H20 e 1 g de glicose, por L de peso seco). Culturas de um dia para o outro (30°C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, o meio decantado e recolocado em suspensão em uma quantidade igual de água destilada. As sementes de milho foram revestidas com polímero de semente comercial misturado apenas com água (1,6 μL por semente total) ou polímero de semente comercial contendo cepas bacterianas selecionadas (1,6 μL por semente total). As sementes revestidas foram plantadas em vasos de 3 polegadas (7,62 cm) de diâmetro a uma profundidade de 1 polegada (2,54 cm) em solo superficial (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 18 e 24°C (65-75°F) com 11 horas de luz/dia e 50 ml de rega no plantio e a cada 3 dias. Após duas semanas, as alturas das plantas e os diâmetros das folhas, bem como a saúde geral das plantas foram coletadas. Para os ensaios de germinação e determinando o comprimento de raiz de 3 dias, as sementes foram revestidas como indicado acima e uniformemente dispersadas a 10 sementes por toalha de papel. As toalhas de papel foram molhadas com 10 ml de água, enroladas, colocadas em um pequeno saco de plástico e incubadas a 30 °C ou colocadas em um tapete térmico de germinação a 27-30°C (80 - 85°F). Medidas da raiz foram registradas após 3 dias. A triagem inicial de isolados de rizosfera resultou na obtenção de mais que 100 espécies distintas de bactérias e fungos da rizosfera. Algumas das espécies bacterianas são descritas na Tabela 28. As cepas identificadas são indicadas pelas suas próprias identificações bacterianas.TABELA 28

[592] As cepas bacterianas que produziram o maior efeito sobre a fitossanidade são descritas na Tabela 28. As cepas bacterianas foram crescidas durante a noite em caldo Luria Bertani a 37°C, e as culturas durante a noite foram centrifugadas em uma centrífuga. O meio foi decantado e o sedimento bacteriano remanescente foi submetido a isolamento de DNA cromossômico usando o kit de Isolamento de DNA Cromossico Bacterico Qiagen. O DNA cromossômico foi submetido à amplificação por PCR das regiões de codificação de 16S rRNA usando os iniciadores E338F 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’ (SEQ ID NO: 108), E1099R A 5’-GGG TTG CGC TCG TTG C-3’ (SEQ ID NO: 109), e E1099R B 5’-GGG TTG CGC TCG TTA C-3’ (SEQ ID NO: 110). Os amplicons de PCR foram purificados usando um kit de purificação de PCR da Promega, e os amplicons resultantes foram diluídos e enviados para o núcleo de DNA da University of Missouri para sequenciação de DNA. As sequências de DNA foram comparadas com a base de dados NCBI BLAST de isolados bacterianos, e o gênero e espécie foram identificados por comparação direta com cepas conhecidas. As espécies identificadas de topo são indicadas na Tabela 28. Em muitos casos, as sequências de DNA de rRNA 16S só foram capazes de delinear o gênero da cepa bacteriana selecionada. Nos casos em que não houve uma identificação direta, análises bioquímicas adicionais, usando métodos padrão no campo, foram realizadas para diferenciar as cepas nos níveis de espécies e de cepas, e as cepas diferenciadas estão listadas na Tabela 29.TABELA 29 wk = crescimento fraco ou baixo crescimento

EXEMPLO 10: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM ALFAFA.

[593] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 1 g de NH4Cl, 0,50 g de NaCl, 0,15 g de MgSO4 7H2O, 0,013 g de CaCl2 2H2O e 1 g de glicose, por L de peso seco). Culturas de um dia para o outro (30°C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, o meio decantado e as bactérias recolocadas em suspensão em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de alfafa revestidas com ZEBA foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 0,6 cm em solo superficial argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. ZEBA é um polímero à base de amido de milho superabsorvente usado como um revestimento de sementes de retenção de umidade. As sementes foram inoculadas no plantio com 0,5 μl de bactérias recolocadas em suspensão em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para dispensar as bactérias aos 3 in3 (49,16 cm3) de solo, bem como saturar o solo para germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 18 e 24°C (65-75°F) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. A alfafa foi deixada crescer durante 1 semana para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas sob as condições descritas. Cepas identificadas indicadas por suas próprias identificações bacterianas e dados de altura final estão listadas na Tabela 30.TABELA 30

EXEMPLO 11: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO DE PLANTAS EM PEPINOS.

[594] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 1 g de NH4Cl, 0,50 g de NaCl, 0,15 g de MgSO4 7H2O, 0,013 g de CaCl2 2H2O e 1 g de glicose, por L peso seco). Culturas de um dia para o outro (30) de cepas selecionadas foram centrifugadas, o meio decantado e recolocado em suspensão em igual quantidade de água destilada. Dez sementes de pepino foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 1 cm no solo superficial argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas no plantio com 0,5 μl de bactérias recolocadas em suspensão em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para dispensar as bactérias em 3 in3 (49,16 cm3) de solo, bem como saturar o solo para germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 18 e 24°C (65-75°F) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de rega a cada 3 dias. Os pepinos foram deixados crescer durante 2 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas nas condições descritas. Cepas identificadas indicadas por suas próprias identificações bacterianas e dados de altura final estão listadas na Tabela 31.TABELA 31

EXEMPLO 12: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM ABÓBORA AMARELA.

[595] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 1 g de NH4Cl, 0,50 g de NaCl, 0,15 g de MgSO4 7H2O, 0,013 g de CaCl2 2H2O e 1 g de glicose, por L peso seco). Culturas de um dia para o outro (30°C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, o meio decantado e recolocado em suspensão em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de abóbora foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 1 cm no solo superficial argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas no plantio com 0,5 μl de bactérias recolocadas em suspensão em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para dispensar as bactérias aos 3 in3 (49,16 cm3) de solo, bem como saturar o solo para germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 18 e 24°C (65-75°F) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. Permitiu- se que a abóbora crescesse durante 2 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas nas condições descritas. Cepas identificadas indicadas por suas próprias identificações bacterianas, dados de altura final e dados finais do diâmetro foliar (por expansão das duas folhas) estão listados na Tabela 32.TABELA 32

EXEMPLO 13: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM AZEVÉM.

[596] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 1 g de NH4Cl, 0,50 g de NaCl, 0,15 g de MgSO4 7H2O, 0,013 g de CaCl2 2H2O e 1 g de glicose, por L de peso seco). Culturas de um dia para o outro (30°C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, o meio decantado e recolocado em suspensão em uma quantidade igual de água destilada. Trinta sementes de azevém foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 0,3 cm em solo superficial argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas no plantio com 0,5 μl de bactérias recolocadas em suspensão em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para dispensar as bactérias aos 3 in3 (49,16 cm3) de solo, bem como saturar o solo para germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 18 e 24°C (65-75°F) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. O azevém foi deixado a crescer durante 1,5 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas nas condições descritas. Cepas identificadas indicadas por suas próprias identificações bacterianas e dados de altura estão listadas na Tabela 33.TABELA 33

EXEMPLO 14: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO DE PLANTAS EM MILHO.

[597] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 1 g de NH4Cl, 0,50 g de NaCl, 0,15 g de MgSO4 7H2O, 0,013 g de CaCl2 2H2O e 1 g de glicose, por L de peso seco). Culturas de um dia para o outro (30°C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, o meio decantado e recolocado em suspensão em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de milho foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 2,5 cm em solo superficial argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas no plantio com 0,5 μl de bactérias recolocadas em suspensão em água misturadas em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para dispensar as bactérias aos 3 in3 (49,16 cm3) de solo, bem como saturar o solo para germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 18 e 24°C (65-75°F) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. O milho foi deixado a crescer durante 2 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas nas condições descritas. Cepas identificadas indicadas por suas próprias identificações bacterianas e dados de altura final estão listadas na Tabela 34.TABELA 34

EXEMPLO 15: TESTE DE CEPAS BACTERIANAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM SOJAS.

[598] As cepas selecionadas foram cultivadas em meio mínimo (3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 1 g de NH4Cl, 0,50 g de NaCl, 0,15 g de MgSO4 7H2O, 0,013 g de CaCl2 2H2O, e 1 g de glicose, por L de peso seco, ou para Bradyrhizobium ou Rhizobium em meios de manitol de levedura). Culturas de um dia para o outro (30°C) de cepas selecionadas foram centrifugadas, o meio decantado e recolocado em suspensão em igual quantidade de água destilada. Dez sementes de soja foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 2,5 cm em solo superficial argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas no plantio com 0,5 μl de bactérias recolocadas em suspensão em água misturadas em 10 ml de H2O. Ao testar duas cepas bacterianas, 0,5 μl de cada bactéria recolocada em suspensão foram misturados em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para dispensar as bactérias aos 3 in3 (49,16 cm3) de solo, bem como saturar o solo para germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 18 e 24°C (65-75°F) com 11 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. A soja foi deixada crescer por 2 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas sob as condições descritas. Cepas identificadas indicadas pelas suas próprias identificações bacterianas e dados de altura final estão listados na Tabela 35. Coinoculação de cepas de bactérias na presente invenção com membros de Bradyrhizobium espéc. ou Rhizobium espéc. levar a um aumento no crescimento das plantas em comparação com qualquer inoculante sozinho.TABELA 35

EXEMPLO 16: MEMBROS DA FAMÍLIA DE BACILLUS CEREUS COM ATRIBUTOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO DE PLANTAS.

[599] Bacillus mycoides cepa BT155, Bacillus mycoides cepa EE118, Bacillus mycoides cepa EE141, Bacillus mycoides cepa BT46-3, membro da família de Bacillus cereus cepa EE349, Bacillus thuringiensis cepa BT013A, e Bacillus megaterium cepa EE281 foram cultivadas em caldo Luria Bertani em 37°C e culturas de um dia para o outro foram centrifugadas, o meio decantado e recolocado em suspensão em igual quantidade de água destilada. Vinte sementes de milho foram plantadas para cada tratamento a uma profundidade de 2,5 cm em solo superficial argiloso (Columbia, MO) que foi peneirado para remover grandes detritos. As sementes foram inoculadas no plantio com 0,5 μl de bactérias recolocadas em suspensão em água misturadas em 50 ml de H2O. Cinquenta ml de H2O foram suficientes para dispensar as bactérias aos 29 in3 (475,22 cm3) de solo, bem como saturar o solo para germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas a temperaturas entre 65-72°F com 13 horas de luz/dia e 5 ml de rega a cada 3 dias. As plântulas foram deixadas crescer durante 2 semanas para analisar a emergência e o crescimento inicial das plantas sob as condições descritas. Cepas identificadas indicadas por suas próprias identificações bacterianas e dados de altura final estão listadas na Tabela 36.TABELA 36

[600] Todas as bactérias promotoras do crescimento de plantas testadas tiveram um efeito benéfico na altura do milho às duas semanas nas condições descritas. A cepa EE128 do membro da família Bacillus cereus teve o maior efeito neste ensaio, dando um reforço maior que 14% na altura do milho.

EXEMPLO 17: ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CEPAS BACTERIANAS ENDOFÍTICAS DA FAMÍLIA BACILLUS CEREUS.

[601] O membro da família de Bacillus cereus 349, discutido acima no exemplo imediatamente precedente, foi encontrado para ter a capacidade de crescer endofiticamente. Vários outros membros da família Bacillus cereus que têm a capacidade de crescer endofiticamente também foram identificados: membro da família Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, Bacillus mycoides EE-B00363, Bacillus pseudomycoides EE -B00366, e membro da família de Bacillus cereus EE-B00377.

[602] Para obter estes membros da família Bacillus cereus adicionais, semente de milho híbrido comercial foi plantada em solo em vasos e permitiu o crescimento. As sementes de milho foram revestidas com um fungicida e um inoculante biológico. As plantas foram cultivadas sob luz artificial durante 14 horas por dia e o crescimento das plantas durante um período de 14 dias foi determinado. As plantas foram regadas a cada três dias ao longo do experimento. Após 14 dias, as plantas foram extraídas do solo e lavadas para remover o excesso de detritos. As plantas foram então invertidas, expostas a 5% de alvejante durante dez minutos, lavadas em água, expostas a peróxido de hidrogênio (10%) durante dez minutos, lavadas de novo em água e os talos divididos com uma lâmina de barbear estéril. As metades divididas dos talos foram colocadas viradas para baixo em placas de agar nutriente durante duas horas. Após duas horas, os talos foram removidos e as placas de ágar foram incubadas a 30°C durante 48 horas. Após 48 horas, as placas foram examinadas quanto à morfologia das colônias, e as colônias dos membros da família Bacillus cereus encontradas no interior da planta foram colhidas no ágar nutriente. Estes foram então cultivados durante a noite a 30°C em caldo de infusão de coração do cérebro, e centrifugados a 10.000 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido, e o sedimento foi congelado durante a noite a -20°C. O DNA cromossômico foi então extraído de cada clone, e a identidade de cada colônia verificada por PCR usando iniciadores de rRNA 16S e amplicons foi enviada para sequenciamento e identificação de DNA. As sequências de rRNA 16S para estas cepas são fornecidas acima na Tabela 17.

EXEMPLO 18: ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CEPAS BACTERIANAS ENDOFÍTICAS ADICIONAIS (MEMBROS DA FAMÍLIA NÃO BACILLUS CEREUS).

[603] As cepas bacterianas endofíticas Bacillus megaterium EE385, Bacillus espéc. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus subespéc. EE443 e Bacillus pumilus EE-B00143 foram isolados de plântulas de milho. Plântulas de milho com duas semanas de idade foram primeiro esterilizadas. As plantas foram extraídas do solo e lavadas para remover o excesso de detritos. As plantas foram então invertidas, expostas a 5% de alvejante durante dez minutos, lavadas em água, expostas a peróxido de hidrogênio (10%) durante dez minutos, e lavadas de novo em água. Os talos foram então divididos com uma lâmina de barbear estéril. As metades divididas dos talos foram colocadas viradas para baixo em placas de agar nutriente durante duas horas. Após duas horas, os talos das plantas foram removidos das placas, e as placas foram então incubadas a 30°C durante 48 horas. Colônias de Bacilli que foram endofíticas foram selecionadas para análise posterior. Estas cepas foram cultivadas em caldo de infusão de cérebro coração durante a noite a 30°C e as culturas submetidas à extração de DNA usando um kit de DNA cromossômico Qiagen. O DNA foi amplificado por PCR para obtenção do gene de rRNA 16S, o qual foi enviado para sequenciamento do DNA. As sequências resultantes foram pesquisadas pelo BLAST usando as bases de dados do NCBI para estabelecer a identidade das espécies Bacilli. As sequências de rRNA 16S são fornecidas acima na Tabela 17.

EXEMPLO 19: ACC DESAMINASE LIVRE EM MILHO, ESTUFA.

[604] A 1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminase (ACC desaminase) foi aplicada em uma aplicação foliar como pulverização a plantas de milho. Dois aminoácidos de D-cisteína desulfidrase de cepa IS5056 de Bacillus thuringiensis (SEQ ID NO: 113) foram mutados, resultando em um aumento modesto na atividade de ACC desaminase (1-aminociclopropano-1- carboxilato). Para além da sua atividade de D-cisteína desulfidrase, a D-cisteína desulfidrase nativa da cepa IS5056 de Bacillus thuringiensis tem uma atividade inerente da ACC desaminase. No entanto, para os fins do presente Exemplo e Exemplo 20 abaixo, a D-cisteína desulfidrase nativa da cepa IS5056 de Bacillus thuringiensis (SEQ ID NO: 113) será referida como uma “D-cisteína desulfidrase”. Uma vez que a versão mutada da enzima (SEQ ID NO: 114) aumentou a atividade da ACC desaminase, para os fins dos presentes exemplos, a enzima mutada será referida como uma “ACC desaminase”. As sequências com as mutações são fornecidas como SEQ ID NO: 112 (ácido nucleico) e SEQ ID NO: 114 (proteína). Na Tabela 2, as duas substituições de aminoácidos mostradas estão em negrito e texto sublinhado. A treonina na posição 290 de SEQ ID NO: 113 foi substituída com um resíduo de ácido glutâmico e o resíduo de serina na posição 317 de SEQ ID NO: 113 foi substituído com um resíduo de leucina usando técnicas de mutagênese de PCR padrão na técnica. Os genes que codificam a D-cisteína desaminase (SEQ ID NO: 111) e a ACC desaminase (SEQ ID NO: 112) foram então clonados no vetor pBC Gram positivo (uma versão miniaturizada do plasmídeo de ocorrência natural pBC16) sob o controle de um promotor de esporulação BclA. Os vetores foram então transformados em Bacillus thuringiensis. Após a esporulação em meio mínimo, que libera o conteúdo celular, incluindo as enzimas, todas as células foram removidas por filtração e as frações de enzima ativa restantes foram aplicadas às plantas. A atividade de ACC desaminase foi quantificada usando um ensaio padrão de dinitrofenol hidrazina (Li et al., A colorimetric assay of 1-aminocyclopropane-1- carboxylate (ACC) based on ninhydrin reaction for rapid screening of bacteria containing ACC deaminase, Lett Appl. Microbiol. 53(2):178-85 (2011).

[605] A enzima do tipo selvagem (SEQ ID NO: 113) e a enzima com as duas mutações pontuais (SEQ ID NO: 114) foram fornecidas como enzimas livres usando dispensação foliar a milho com 2 semanas de idade (5828 YH da BECK, Estágio de desenvolvimento V2 a V3) e plantas de soja com 4 semanas de idade (297NR da BECK, fase de desenvolvimento V2 a V3). O milho 5828 YH da BECK contém HERCULEX (traços de resistência à lagarta e de resistência à broca do milho), um traço de resistência ao glufosinato e um traço de resistência a glifosato. A soja 297NR da BECK contém um traço de resistência a nematóides (SCN-SB) e um traço de resistência a glifosato.

[606] Dezesseis plantas replicadas por ensaio foram individualmente tratadas usando aplicações foliares das enzimas D-cisteína desulfidrase e ACC desaminase e comparadas com um controle isolado de tensoativo (Controle). As atividades das enzimas de D-cisteína desulfidrase (SEQ ID NO: 113) e ACC desaminase (SEQ ID NO: 114) aplicada foliares foram padronizadas para o mesmo conteúdo de proteína e aplicadas usando taxas de uso consistentes como pulverização foliar contendo tensoativo não iônico a 0,1% (NIS) (ALLIGARE SURFACE, Alligare LLC), que foi usado para dispensação das enzimas a plantas de milho e soja a uma taxa de 10 ml/planta. A atividade da atividade da ACC desaminase é aqui descrita como 1 mU equivale a 1 nmol de produto/mg de proteína/hora a 30°C. A atividade inicial da D-cisteína desulfidrase para este ensaio é de 500 mU/ml e a atividade da ACC desaminase é de 2,124 mU/ml. Após a diluição em 10 ml/planta, a dispensação da enzima é de 2,5% do volume com uma concentração final de 12,5 mU/ml de atividade final por planta para D-cisteína desulfidrase e 53,1 mU/ml para ACC desaminase. O tensoativo ALLIGARE SURFACE contém uma mistura de alquilpolioxietileno, derivados de glicol, umectantes e auxiliares de formulação.

[607] Duas semanas após a aplicação foliar, as raízes foram colhidas das plantas de milho ou soja, enxaguadas com água, secas suavemente para remover qualquer excesso de água e foi determinado o peso da raiz fresca (gramas). O peso da raiz fresca para cada tratamento foi normalizado para controlar plantas tratadas apenas com o veículo contendo apenas meio mínimo e o tensoativo não iônico a 0,1%. Os resultados são mostrados nas Tabelas 37 e 38 abaixo.

[608] Como é mostrado na Tabela 37, a aplicação foliar de ACC desaminase no milho resultou em um aumento significativo (aproximadamente 12%) na massa fresca da raiz em comparação com plantas tratadas apenas com tratamento com tensoativo não iônico (*valor p = 0,015). Em contraste, a massa fresca média das raízes das plantas de milho que receberam a D-cisteína desulfidrase foi comparável a das plantas de controle que receberam o tratamento somente com tensoativo.

[609] Em plantas de soja (Tabela 38) tratadas com a D-cisteína desulfidrase, houve uma ligeira tendência para um aumento na massa de raízes 2 semanas após a aplicação foliar. Pelo contrário, as plantas de soja tratadas com ACC desaminase exibiram uma média de um aumento de 12% na massa de raízes em relação ao controle.

[610] Este estudo, analisando a monocotiledônea milho e a dicotiledônea soja, demonstra que a aplicação foliar de ACC desaminase (e em menor extensão, D-cisteína desulfidrase) pode levar diretamente ao aumento da massa radicular das plantas tratadas nas folhas em relação aos tratamentos de controle.TABELA 37. MASSA RADICULAR MÉDIA PARA PLANTAS DE MILHO TRATADAS COM UMA APLICAÇÃO FOLIAR DE ACC DESAMINASE EM COMPARAÇÃO COM PLANTAS DECONTROLETABELA 38. MASSA RADICULAR MÉDIA DE PLANTAS DE SOJA TRATADAS COM APLICAÇÃO FOLIAR DE ACC DESAMINASE EM COMPARAÇÃO COM PLANTAS DE CONTROLE

[611] A ACC desaminase (SEQ ID NO: 114) também foi aplicada como um tratamento em sulco (aplicado no solo) em arroz para a área em torno da semente de arroz híbrida, o que também resultou em aumento do crescimento da planta. A ACC desaminase (SEQ ID NO: 114) foi criada e purificada como descrito acima, nas concentrações iniciais acima, e distribuída a uma taxa de 8 fl oz/Ac (584,2 ml/hectare) de enzima para cada 2,5 galões de água/Ac (23,4 litros/hectare). A atividade final de 6,25 mU/ml foi criada após diluição em água para a D-cisteína desulfidrase e 52,1 mU/ml de atividade final para a ACC desaminase. O produto foi aplicado diretamente sobre a semente a uma taxa de 1 ml por semente, e deixado secar no solo antes que a semente fosse coberta com solo solto. Os resultados são mostrados na Tabela 39 abaixo. Uma altura média aumentada para 2 ensaios (36 plantas cada) de aproximadamente 131%, normalizados para o controle, foi observada para o tratamento no sulco usando o híbrido de arroz. Este estudo demonstra que a aplicação exógena da enzima ACC desaminase diretamente no solo impacta diretamente o crescimento e o vigor das plantas, aumentando a altura das plantas.TABELA 39. A ACC DESAMINASE PROPORCIONOU PROPRIEDADES DE PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO AO ARROZ QUANDO APLICADO COMO UM TRATAMENTO NO SULCO

EXEMPLO 20: ENZIMA LIVRE DE ACC DESAMINASE RETARDA A MATURAÇÃO DOS FRUTOS.

[612] A 1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminase (ACC desaminase) degrada o 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC), o precursor natural do etileno (C2H4), que estimula e regula o amadurecimento dos frutos. O etileno atua em níveis de traços ao longo da vida de uma planta, estimulando ou regulando o amadurecimento da fruta, a abertura das flores e a abscisão ou desintegração de frutos e folhas. O etileno é um hormônio de planta natural importante, usado na agricultura para forçar o amadurecimento dos frutos (Lin et al., Recent advances in ethylene research, Journal of Experimental Botany 60: 3311-3336 (2009)). O amadurecimento induzido por etileno é caracterizado por uma mudança de cor acelerada (acúmulo de pigmentos) e é acompanhado por um amolecimento da pele ou casca externa e da área da polpa interna à camada externa da fruta. Para determinar se a aplicação de ACC desaminase livre ou D- cisteína sulfidrase em frutos pode retardar o amadurecimento dos frutos, ambas as enzimas foram aplicadas em frutos de manga não amadurecidos.

[613] A ACC desaminase e a D-cisteína sulfidrase foram caracterizadas e tiveram as atividades descritas no Exemplo 19 acima. A sequência de ACC desaminase com duas mutações de aminoácidos descritas acima no Exemplo 19 (SEQ ID NO: 114) e a enzima D-cisteína desulfidrase nativa (SEQ ID NO: 113) foram expressas e fornecidas como enzimas livres usando os métodos descritos acima no Exemplo 19. Como notado acima no Exemplo 19, a enzima D-cisteína desulfidrase nativa (SEQ ID NO: 113) tem atividade de D-cisteína desulfidrase e ACC desaminase.

[614] Frutos de manga não amadurecidos (variedade comercialmente disponível, Keitt) foram tratados com as enzimas ACC desaminase ou D-cisteína desulfidrase e comparados com frutos de manga que foram tratados com água (controle) ou um controle isolado de filtrado sem enzimas (cepa de expressão sem qualquer enzima expressada). Quatro frutas foram usadas por grupo de tratamento. A(s) camada(s) externa(s) da manga foi completamente molhada usando 1 mL das enzimas livres (igual a uma concentração de proteína final de 10 μg/mL no filtrado). A atividade enzimática da ACC desaminase estimada para aplicação ao fruto na aplicação da D-cisteína desulfidrase para este ensaio foi de 500 mU/ml, e a atividade da ACC desaminase foi de 2,124 mU/ml. Os dois tratamentos de controle (filtrado ou apenas água) foram também aplicados em frutos de manga usando volumes de 1 mL. Os frutos de manga foram então colocados em sacos de plástico selados durante a noite. No dia seguinte, o excesso de líquido foi removido com uma toalha de papel e os frutos foram secos engarrafados. Os frutos secos de manga foram então colocados em um saco castanho selado (sacos separados usados para diferentes tratamentos) para intensificar a resposta de amadurecimento durante um período de 4 dias. A resposta de amadurecimento foi pontuada para suavização e mudança de cor em uma escala de 1 a 5 sendo 1 a menos amadurecida (sem alteração/mudança de cor /verde ou firme) e 5 a mais amadurecida (mudança de cor amaciada de verde para amarelo/rosa na coloração) com vários graus de maturação entre essas pontuações baixas e altas (2-4). As respostas de amadurecimento para o amaciamento e a alteração da cor foram então combinadas para resultar em uma “resposta total de maturação” em uma escala de 1 a 10, que foi usada para avaliar a eficácia do tratamento.

[615] Os dados são fornecidos na Tabela 40 abaixo e representam as pontuações médias para os frutos em cada grupo de tratamento. ACC desaminase e D-cisteína desulfidrase, aplicadas como tratamentos com enzima livres ao fruto da manga, resultaram em um amadurecimento retardado, em comparação com a água ou apenas com o filtrado, controlando os tratamentos após 4 dias. Tratamentos enzimáticos livres de ACC desaminase ou D-cisteína desulfidrase resultaram em efeitos similares na resposta geral de maturação com base no amolecimento e mudança de cor quando aplicados à manga. Estes resultados demonstram que ambos os tipos de enzimas podem ser usados como tratamentos de lavagem de frutas para retardar o amadurecimento dos frutos e podem ser úteis para aplicação em outros frutos economicamente importantes para prevenir o amadurecimento acelerado ou perdas de frutos de outros estresses.TABELA 40. AS ENZIMAS LIVRES DE ACC DESAMINASE E D-CISTEÍNA DESULFIDRASE RESULTARAM EM ATRASO NO AMADURECIMENTO EM FRUTOS DE MANGA

EXEMPLO 21: GLUCANASES E FOSFOLIPASES EM SEMENTES DE SOJA, CAMPO.

[616] β-1,4-endoglucanase (Acidothermus; SEQ ID NO: 30), β- 1,3-D-glucanase (Helix pomatia; SEQ ID NO: 126), específico do fosfatidilinositol fosfolipase C (Bacillus cereus; SEQ ID NO:116), e fosfolipase C específica de fosfatidilcolina (Bacillus cereus; SEQ ID NO:115) foram aplicadas como enzimas livres a semente de soja (294 NR da BECK). Enzimas livres foram diluídas em água para as concentrações (μU/semente ou mU/semente) listadas na Tabela 41 abaixo. A unidade (U) da atividade da enzima endoglucanase ou fosfolipase foi determinada pela quantidade de enzima que é necessária para quebrar 1 μmol/min/mL de substrato (1 U = 1 μmol substrato/min) em temperatura e condições ideais. Cada semente recebeu a quantidade de solução enzimática necessária para a atividade final dos tratamentos (1 μL/semente) e foi misturada aos tratamentos de sementes com metalaxil e clotianidina. A semente foi seca completamente e depois plantada no campo para aproximar as práticas padrão de profundidade de plantio e espaçamento entre fileiras (1,5 a 2 polegadas (3,8 a 5 cm)) para garantir o desenvolvimento normal das raízes e em média 150.000 plantas por acre (370.658 plantas por hectare) com larguras de fileiras de 30 polegadas (76,2 cm) e espaçamento de sementes de aproximadamente 7 a 8 sementes por pé (26 sementes por metro). O fertilizante foi aplicado conforme recomendado pelos testes de solo. Herbicidas foram aplicados para controle de ervas daninhas e suplementados com cultivo quando necessário.

[617] Três ensaios repetidos consistindo em 600 sementes cada foram conduzidos. O rendimento de soja foi medido em aproximadamente seis meses após a semeadura e é reportado na Tabela 41 abaixo como a variação absoluta em bushels/acre (Bu/Ac) ou toneladas métricas/hectare (MT/ha) em relação ao controle (somente água) e em porcentagem de rendimento normalizado para o controle. Aplicações de endoglucanases ou fosfolipases (β- 1,4-endoglucanase (Acidothermus), β-1,3-D-glucanase (Helix pomatia), fosfolipase C específico do fosfatidilinositol (Bacillus cereus), e fosfolipase C específico de fosfatidilcolina (Bacillus cereus) como tratamentos de sementes, todos resultaram em maior rendimento em comparação com a semente de controle (tratada com água). Das enzimas testadas, a fosfolipase C específica de fosfatidilcolina (Bacillus cereus) proporcionou o maior aumento no rendimento em relação ao controle, resultando em um aumento de mais que 8 Bu/Ac (mais que 0,5 MT/ha) ou um ganho de 145% no rendimento em relação ao semente de controle não tratada (ver Tabela 41).TABELA 41. GLUCANASES E FOSFOLIPASES APLICADAS COMO TRATAMENTO DE SEMENTES PARA AUMENTAR A PRODUTIVIDADE DA SOJA

EXEMPLO 22: FOSFOLIPASES LIVRES NA SEMENTE DE MILHO, ESTUFA.

[618] A fosfolipase C específica de fosfatidilcolina (PLC) de Bacillus cereus (SEQ ID NO: 115) foi diluída em água para concentrações de 20 mU/semente a 800 mU/atividade de semente (conforme listado na Tabela 42 abaixo). A unidade de atividade da enzima PLC foi determinada pela quantidade de enzima necessária para decompor 1 μmol/min/mL de substrato (1 U = 1 μmol substrato/min) em temperatura e condições ideais.

[619] Dois ensaios replicados consistindo em dezoito sementes cada de um híbrido comercial (milhos YH 5828 da BECK foram colocados em tubos cônicos de 50 mL. Cada tubo cônico foi submetido a vórtice e 18 μl de solução enzimática foram adicionados a cada tubo para alcançar uma concentração final enzimática de 20, 50, 100, 200, 400, 600 ou 800 mU de atividade de PLC aplicado por semente. Os tubos cônicos foram novamente submetidos a vórtice por 20 segundos para obter um revestimento uniforme em cada semente. As sementes foram secas por 5 minutos e então plantadas em vasos de 39,7 cm3 contendo solo superficial a 2,54 cm de profundidade, com 2 sementes por vaso. Após o plantio, 50 mL de água em temperatura ambiente foram adicionados a cada vaso para permitir a germinação. Os vasos foram mantidos em ambiente de crescimento com iluminação artificial recebendo um nível de luz de aproximadamente 300 μmol m-2 s-1 para um ciclo de luz/dia de 13/11 e uma faixa de temperatura de noite de 21 °C/15°C.

[620] A altura da planta foi calculada em média em 2 ensaios replicados usando 18 plantas por tentativa por grupo de tratamento. A diferença na altura das plantas após o tratamento das sementes usando a enzima PLC foi normalizada para as plantas de controle que receberam apenas um tratamento de água. As alterações na altura da planta estão representadas na Tabela 42 como uma porcentagem da altura média da planta normalizada para o controle e relatada com os desvios padrão (STDEV) para os dois ensaios. Como pode ser visto na Tabela 42, as atividades enzimáticas de PLC de 50 mU/semente a 600 mU/semente resultaram em aumentos significativos na altura (cm) de plantas de milho quando comparadas e normalizadas com as plantas de controle tratadas com água (não enzimáticas).TABELA 42. FOSFOLIPASE C (PLC) APLICADA COMO UM TRATAMENTO DE SEMENTESAO MILHO PARA PROMOVER O CRESCIMENTO

[621] Em um segundo experimento, titulações de Fosfolipase D necessários para atingir o crescimento ideal foram determinados. A fosfolipase D (PLD) de Acidovorax avenae (SEQ ID NO: 117) foi diluída em água para concentrações de 20 mU/semente a 800 mU/semente. A unidade de atividade da enzima PLD foi determinada pela quantidade de enzima que é necessária para quebrar 1 μmol/min/mL de substrato (1 U = 1 μmol substrato/min) em temperatura e condições ideais. Dois ensaios replicados foram conduzidos usando 18 plantas por ensaio por nível de atividade enzimática. Para cada grupo de tratamento em ambos os ensaios, 18 sementes de um híbrido comercial de milho (5828 YH da BECK) foram colocadas em tubos cônicos de 50 mL. Cada tubo cônico foi submetido a vórtice e 18 μL de solução de enzima foram adicionados a cada tubo para atingir uma concentração final de enzima de 20, 50, 100, 200, 400, 600 ou 800 mU por semente de PLD. As titulações de PLD variando de 20 mU/semente a 800 mU/semente foram aplicadas à semente de milho usando volumes de 1 μl para determinar o tratamento ideal de sementes PLD para promover o crescimento. Os tubos cônicos foram novamente submetidos a vórtice durante 20 segundos para obter um revestimento uniforme em cada semente. As sementes foram secas durante 5 minutos e depois plaqueadas em vasos de 39,7 cm3 contendo solo superior a uma profundidade de 2,54 cm, com 2 sementes por vaso. Após o plantio, 50 mL de água em temperatura ambiente foram adicionados a cada vaso para permitir a germinação. Os vasos foram mantidos em um ambiente de crescimento artificial iluminada recebendo um nível de luz de aproximadamente 300 μmol m-2 s-1 para um ciclo de 13/11 luz/dia e uma faixa de temperatura de 21 °C de dia/15°C à noite.

[622] A altura da planta (em cm) foi calculada em média em 2 ensaios replicados usando 18 plantas por tentativa por tratamento. A altura das plantas geradas a partir de sementes tratadas com PLD foi normalizada para controle e representada como uma porcentagem da altura média da planta normalizada para plantas de controle não tratadas com enzima (água) e é reportada na Tabela 43 abaixo com os desvios padrão (STDEV) para a 2 tentativas.

[623] Como se pode observar na Tabela 43, a fosfolipase D aplicada à semente de milho teve um efeito positivo no crescimento da planta a cada nível de atividade enzimática testado. Em cada caso, plantas tratadas com PLD como uma semente tiveram uma altura aumentada em comparação com plantas de controle.TABELA 43. FOSFOLIPASE D (PLD) APLICADA COMO UM TRATAMENTO DE SEMENTES AO MILHO PARA PROMOVER O CRESCIMENTO

EXEMPLO 23: FOSFOLIPASES E XILOGLUCANASES LIVRES EM MILHO E SOJA, FOLIAR,ESTUFA.

[624] Xiloglucanase livre (SEQ ID NO: 125; Paenibacillus sp.) e fosfolipase D (SEQ ID NO: 117; Acidovorax avenae) foram aplicadas como tratamentos foliares usando as concentrações de enzima como descrito na Tabela 44 (abaixo) para milho híbrido de 2 semanas de idade. (5828 YH da BECK) com 0,1% de tensoativo não iônico (ALLIGARE SURFACE) usando um frasco de spray e fornecendo 10 ml/planta. A altura média das plantas foi normalizada para as plantas de controle que receberam uma aplicação foliar de água mais tensoativo sozinho. Os tratamentos com xiloglucanase e fosfolipase D aplicados como pulverização foliar a plantas de milho resultaram em aumento da altura da planta em comparação com as plantas de controle (Tabela 44). A xiloglucanase aplicada a uma taxa de uso foliar de 600 μU/ml e a fosfolipase D aplicada a uma taxa foliar de 200 μU/ml às plantas de milho apresentaram os maiores aumentos no crescimento das plantas, resultando em aumentos de 106,5% e 111,1%, respectivamente, em relação a plantas de controle.TABELA 44. TRATAMENTO FOLIAR DE MILHO USANDO XILOGLUCANASE E FOSFOLIPASE D COMO ENZIMAS LIVRES PARA PROMOVER O CRESCIMENTO EM PLANTAS DE MILHO

[625] Em outro experimento, a fosfolipase D (PLD) de Acidovorax foi aplicada como um tratamento de sementes de semente de soja (BECK'S 297NR) usando 1 μL de volumes equivalentes a 600 mU/semente e 800 mU/semente final atividades fornecidas por cada semente (estas atividades foram selecionadas para testes em soja com base nas titulações descritas acima no Exemplo 22 para o milho). As atividades de PLD de 600 mU/semente e 800 mU/semente foram aplicadas como tratamento de sementes à semente de soja e resultaram em impactos positivos na taxa de crescimento das plantas.

[626] Sementes tratadas foram plantadas e deixadas crescer em estufa. Quando as plantas atingiram o estágio de desenvolvimento de V2 a V3, mediram-se as contagens totais de biomassa, biomassa de raízes e nodulação. O estágio V2 a V3 é o estágio inicial de desenvolvimento da formação de nódulos. A iniciação do nódulo se inicia nas plântulas de soja tão logo os pelos radiculares estejam presentes nas raízes primárias ou ramificadas. A fixação do nitrogênio começa cerca de 2 a 3 semanas após a infecção inicial do rizóbio. As plantas de soja formaram as primeiras folhas trifoliadas no estágio V1 a V2 e foram medidas no pico estimado para fixação de nitrogênio. A nodulação efetiva das raízes da soja resulta em maior rendimento e maior produção de sementes de qualidade, proteína e óleo por acre.

[627] Dois experimentos independentes foram realizados (18 plantas replicadas por ensaio por grupo de tratamento). Os dados das plantas tratadas com PLD foram normalizados para controlar plantas criadas a partir de sementes testemunhas tratadas com água.

[628] O PLD aplicado como tratamento de sementes usando 800 mU por semente de soja resultou em aumentos significativos na biomassa total e na biomassa das raízes em comparação com as plantas cultivadas a partir de sementes de controle tratadas com água que não receberam a enzima livre de PLD (Tabela 45).

[629] O tratamento com PLD também aumentou a contagem de nodulação nas raízes das plantas. Ambos os tratamentos de sementes, com 600 mU ou 800 mU de atividade de PLD, resultaram em aumento da nodulação em comparação com controles não tratados, com o tratamento de 800mU quase dobrando o número de nódulos nas raízes de plantas de soja.TABELA 45. EFEITOS DA BIOMASSA DO TRATAMENTO COM FOSFOLIPASE D COMO TRATAMENTO DE SEMENTES DE SOJA

EXEMPLO 24: ENZIMAS LIVRES EM MILHO, CAMPO.

[630] As enzimas xiloglucanase, xilanase, quitosanase, liquenase, xilosidase, protease e lipase livres foram diluídas em água para os níveis de atividade listados na Tabela 46 abaixo. As sementes de milho híbrido (5828 YH da BECK) foram tratadas com 1 μL de solução de enzima livre por semente para atingir as atividades por semente (1 U = 1μmol de substrato/min) como mostrado na Tabela 46 abaixo. As sementes foram secas completamente e plantadas em 4 fileiras de 24’ (7,3 m) por tratamento, com espaçamento de sementes de 1,72 sementes/pé/fileira (5,64 sementes/metro/fileira). Canteiros de campo em cada local foram preparados usando métodos convencionais ou de lavoura de conservação para plantações de milho. Herbicidas foram aplicados para controle de ervas daninhas e suplementados com cultivo quando necessário. Cada tentativa foi repetida 4 vezes. O tratamento de sementes foi aplicado a todos os tratamentos, incluindo o protioconazol, penflufeno, metalaxil e clotianidina.

[631] Após a colheita, a mudança absoluta em bushels por acre (Bu/Ac) ou toneladas métricas por hectare foi medido para cada tratamento enzimático livre e normalizado para o rendimento das plantas de controle (água) não tratada (Tabela 46, abaixo). O controle de sementes de milho foi em média de 162 Bu/Ac (10,17 TM/ha). O tratamento das sementes com liquenase, protease ou lipase resultou nos maiores aumentos na produção de milho nas plantas de controle. O tratamento com liquenase mostrou os maiores aumentos de produtividade em comparação com plantas de controle com um aumento médio de 22 Bu/Ac (1,39 MT/ha), o que equivale a um aumento de 114% quando normalizado para plantas de controle de milho.TABELA 46. AUMENTO DO RENDIMENTO USANDO ENZIMAS LIVRES APLICADAS EMMILHO

[632] Em um segundo experimento, enzimas livres (endoglucanase, exoglucanase, quitosanase, protease e fitase) foram aplicadas via aplicação foliar ao milho (5140 HR Híbrido da BECK) em 4 locais em todo o Centro-Oeste no estágio de desenvolvimento V5-V8, que tem o traço de resistência à raiz e traço da raiz HERCULEX. Para permitir um revestimento uniforme das folhas da planta, todos os tratamentos com enzima e o controle foram adicionalmente tratados com um agente tensoativo não iônico (ALLIGARE SURFACE) fornecido a uma concentração final de 0,1%. Mudanças absolutas em bushels/acre (Bu/Ac) (e valores equivalentes em MT/ha) são reportadas nas plantas de controle e também relatadas no rendimento conforme normalizado para as plantas de controle (“controle com água/tensoativo”) (Tabela 47). Os resultados dos tratamentos foliares usando enzimas livres são relatados como o rendimento absoluto Bu/Ac (ou MT/ha) e a mudança absoluta no rendimento para os rendimentos ajustados (Bu/Ac ou MT/ha) normalizados para a comparação das plantas de controle ao longo do 4 repetições (Tabela 47). Houve aumentos positivos no rendimento das plantas tratadas com enzima em comparação com as plantas de controle (plantas tratadas apenas com água e agente tensoativo). A fitase aplicada como tratamento foliar resultou no maior aumento global no rendimento (~ 24 Bu/Ac (~ 1,51 MT/ha) mudança de rendimento absoluto em relação ao controle).TABELA 47. AUMENTO DO RENDIMENTO USANDO ENZIMAS LIVRES APLICADAS COMO TRATAMENTO FOLIAR EM MILHO

EXEMPLO 25: LIPASES EM SEMENTE DE MILHO, ESTUFA.

[633] Um experimento foi conduzido para determinar se as lipases aplicadas como tratamento de sementes ao milho também promoviam o crescimento das plantas. A lipase (Pseudomonas fluorescens; SEQ ID NO: 119) foi dilua em água para concentrações que proporcionaram uma atividade de 3000 e 6000 de lipase por semente. A lipase foi aplicada usando 3.000 μU/semente e 6.000 μU/semente de atividade a semente de milho (Variedade do Milho da BECK 5828 YH) usando 1 μL de enzima por semente para atingir as atividades como relatadas por semente. As sementes foram secas durante 5 minutos e depois plantadas em vasos de 39,7 cm3 contendo solo superficial de uma profundidade de 2,54 cm, com 2 sementes por vaso. Após o plantio, 50 mL de água em temperatura ambiente foram adicionados a cada vaso para permitir a germinação. Os vasos foram mantidos em um ambiente de crescimento com iluminação artificial recebendo um nível de luz de aproximadamente 300 μmol m- 2 s-1 para um ciclo 13/11 luz/dia e uma temperatura de 21 °C de dia/15°C à noite. Ao final de 2 semanas, quando todas as plantas atingiram o estágio de desenvolvimento de V2 a V3, a altura das plantas de milho tratadas com lipase foi medida e normalizada até a altura das plantas de controle que foram tratadas apenas com água.

[634] O experimento foi replicado duas vezes com 18 plantas por grupo de tratamento (e 3 repetições por grupo de tratamento) e os valores médios entre os experimentos e são relatados na Tabela 48 junto com os desvios padrão (STDEV). A lipase aplicada como uma enzima livre usando 3000 μU e 6000 μU de atividade por semente resultou em um aumento médio na altura da planta de aproximadamente 106% e 103%, respectivamente.TABELA 48. EFEITOS DA ALTURA DO TRATAMENTO COM LIPASE COMO UM TRATAMENTO DE SEMENTES DE MILHO

EXEMPLO 26: LIPASE OU FOSFOLIPASE EM MILHO, ESTUFA NO SULCO.

[635] Lipase (Burkholderia cepacia) aplicado como um tratamento no sulco foi usado para determinar se a aplicação de lipase como uma enzima livre para a área em torno de uma semente de milho resultaria em benefícios de crescimento positivo em fase inicial para uma planta de milho. A enzima lipase (Burkholderia cepacia, SEQ ID NO: 118) foi diluída em água para os níveis de atividade listados na Tabela 49 abaixo. Sementes de milho (6626 RR da BECK) foram plantadas em vasos de 39,7 cm3 contendo solo superficial de uma profundidade de 2,54 cm, com 2 sementes por vaso. Após o plantio, mas antes de cobrir a semente, aplicou-se 1 μL de volumes de enzima lipase com atividades variando de 2 μU a 200 μU por área no sulco que circunda uma semente. Um subconjunto de sementes foi tratado em vez disso com β-1,4-endoglucanase (Acidothermus cellulolyticus; SEQ ID NO: 30) aplicada a uma atividade de 1000 μU no sulco da área que circunda a semente. Os vasos foram mantidos em um ambiente de crescimento artificial iluminada recebendo um nível de luz de aproximadamente 300 μmol m-2 s-1 para um ciclo 13/11 luz/dia e uma temperatura de 21°C dia/15°C à noite. Após aproximadamente duas semanas, quando as plantas atingiram o estágio de desenvolvimento de V2 a V3, sua altura foi medida e normalizada para controlar as plantas que receberam apenas água. As plantas tratadas com lipase foram ainda comparadas com as que receberam β-1,4-endoglucanase (Acidothermus).

[636] O experimento foi repetido para um total de dois ensaios (18 plantas por tentativa por grupo de tratamento). A altura média das plantas para os tratamentos em ambos os ensaios, normalizada para controle, é relatada com desvios padrão (DESVPAD) (Tabela 49). A lipase aplicada usando 20 μU por semente como um tratamento no sulco no milho resultou no maior aumento na altura da planta em comparação com as outras atividades de lipase aplicadas como tratamentos no sulco. A β-1,4-endoglucanase aplicada como um tratamento enzimático livre no sulco também resultou em mudanças positivas na altura da planta e teve efeitos promotores de crescimento relatados em plantas de milho. A lipase aplicada a 20 μL por área (por ml de volume em água) que circunda uma semente foi comparável à semente tratada no sulco que recebeua β-1,4-endoglucanase.TABELA 49. TITULAÇÃO DA LIPASE E EFEITO DA B-1,4-ENDOGLUCANASE APLICADA COMO UM TRATAMENTO NO SULCO NA ÁREA QUE CIRCUNDA UMA SEMENTE DE MILHO PARA PROMOVER O CRESCIMENTO

[637] Em um segundo experimento, fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus (SEQ ID NO: 115) foi aplicada com um fertilizante (SF) contendo 12% de nitrogênio amoniacal e 58% de fosfato disponível (derivado de monofosfato de amônio) usando os métodos em sulco diretos como descritos acima para as sementes de milho (5828 YH da BECK). A enzima foi aplicada a uma taxa de aplicação de 8 Fl oz/Ac (584,2 ml/hectare) ou aproximadamente 1200 mU para a área que circunda a uma semente. Este tratamento resultou em um aumento médio na média da altura da planta em 3 ensaios replicados de 105%, conforme normalizado para o controle que usou água e apenas o tratamento com fertilizantes. Os resultados são mostrados naTabela 50 abaixo. TABELA 50. ALTURA DE PLANTA USANDO UM TRATAMENTO EM SULCO USANDO ENZIMA LIVRE FOSFOLIPASE C PARA MILHO

EXEMPLO 27: FOSFATASE ÁCIDA EM ABÓBORA E MILHO, EM SULCO.

[638] Os efeitos da fosfatase ácida (isoladamente ou em combinação com lipase, β-xilanase, petoilase, mananase, liquenase ou xilanase) no crescimento da planta foram testados. Enzimas livres compreendendo fosfatase ácida (Triticum aestivum, uma mistura de duas isoformas diferentes com as sequências aqui fornecidas pelas SEQ ID NOs. 130 e 131, comercialmente disponíveis na Sigma- Aldrich, St. Louis MO, como produto número P3627), sozinha ou em combinação com lipase (Pseudomonas fluorescens, SEQ ID NO: 119), β-xilanase (Neocallimastix patriciarum, SEQ ID NO: 122), pectolase (Aspergillus, SEQ ID NO: 129), mananase (Bacillus sp., SEQ ID NO: 128), liquenase (Bacillus subtilis, SEQ ID NO: 43) ou xilanase (Thermomyces lanuginosus, SEQ ID NO: 121) foram aplicados aos níveis de atividade listados na Tabela 51 usando aplicações diretas no sulco à área que circunda as sementes de abóbora usando o mesmo métodos como descrito acima no Exemplo 26 (abóbora híbrido Ambassador, comercialmente disponível de Park Seed como produto 05298). Os tratamentos com enzima foram fornecidos para sementes de abóbora contendo um tratamento de sementes (Thiram) e fornecidos juntamente com fertilizantes (SF) contendo 12% de nitrogênio amoniacal e 58% de fosfato disponível. Os tratamentos isolados de enzimas e fertilizantes no sulco foram aplicados usando as taxas de uso de aplicação listadas como unidades de atividade por ml de volume na Tabela 51 abaixo, e dispensados a 1 ml por semente ao solo em torno da semente. A altura da planta foi determinada para 2 ensaios com 18 plantas medidas por cada ensaio por tratamento. Os dados estão relatados na Tabela 51, abaixo, e fornecem a mudança percentual na altura da planta para sementes de abóbora recebendo o tratamento com enzima livre em sulcos em comparação com a semente de controle (controle de fertilizante sozinho). O tratamento enzimático livre de fosfatase ácida sozinho exibiu, em média, um aumento de 49,6% na altura da planta em comparação com as plantas de controle. A semente de abóbora que recebeu o tratamento enzimático no sulco livre, compreendendo fosfatase ácida combinada com enzimas lipase, β-xilanase, pectolase, mananase, liquenase ou xilanase, aumentou a altura das plantas em comparação com a água e a abóbora tratada com fertilizante. O tratamento no sulco usando apenas a enzima fosfatase ácida resultou no maior aumento percentual médio no crescimento global, representado pelo aumento na altura da planta em comparação com a combinação da fosfatase ácida com outras enzimas (lipase, β-xilanase, pectolase, mananase, liquenase ou xilanase).TABELA 51. MUDANÇA NA ALTURA DA PLANTA COM UM TRATAMENTO NO SULCO PARA ABÓBORA APLICADA USANDO UMA APLICAÇÃO DE FOSFATASE ÁCIDA E ENZIMASLIVRES

[639] Em outro experimento, enzimas livres compreendendo fosfatase ácida (Triticum aestivum, uma mistura de duas isoformas com as sequências fornecidas aqui por SEQ ID NOs. 130 e 131), fosfolipase C específica de fosfatidilcolina (Bacillus cereus; SEQ ID NO: 115), ou β-1,4- endoglucanase (Acidothermus cellulolyticus; SEQ ID NO: 30) foram aplicados usando tratamento direto no sulco na área que circunda a semente de milho híbrida (5828 YH da BECK) nas taxas listadas na Tabela 52 abaixo. Os tratamentos no sulco foram fornecidos juntamente com um bioestimulante de hormônio (CYTOPLEX, comercialmente disponível da Miller Chemical & Fertilizer, LLC) que contém um extrato de planta marinha, cinetina, ácido giberélico e ácido indol-3-butírico a 2 fl oz/Ac (146,2 ml/hectare). A altura das plantas foi determinada para 2 ensaios com 18 plantas medidas em cada ensaio por grupo de tratamento. Os dados, na Tabela 52 abaixo, são relatados como a mudança percentual na altura da planta para sementes de milho recebendo o tratamento em sulcos usando as enzimas livres em comparação com as sementes de controle (apenas hormônios bioestimulantes). O tratamento enzimático isento de fosfatase ácida exibiu, em média, um aumento de 16% e 8% na altura das plantas em comparação com as plantas de controle para as taxas de uso de 300 mU/ml e 600 mU/ml, respectivamente, aplicadas no sulco por área de semente. A altura de plantas em milho cultivado a partir de sementes tratadas em sulco com fosfolipase C e β-1,4- endoglucanase também resultou em aumentos na altura das plantas em relação à semente tratada apenas com o hormônio bioestimulante. A taxa de uso de 300 mU/ml aplicada para cada uma das enzimas livres: fosfatase ácida, fosfolipase C e β-1,4-endoglucanase resultou em aumentos de aproximadamente 2 vezes na altura da planta sobre a taxa de uso de 600 mU/ml aplicada no sulco por área das sementes. Cada uma das três enzimas combinadas com os tratamentos com hormônio bioestimulante aumentaram a altura das plantas em relação os controles sozinhos do hormônio bioestimulante.TABELA 52. MUDANÇAS NA ALTURA DA PLANTA USANDO UM TRATAMENTO NO SULCO PARA O MILHO APLICADO USANDO UMA APLICAÇÃO DE FOSFATASE ÁCIDA,FOSFOLIPASE C E B-1,4-ENDOGLUCANASE EM COMBINAÇÃO COM UM BIOESTIMULANTE

[640] Enzimas livres compreendendo fosfatase ácida (Triticum aestivum, uma mistura de duas isoformas diferentes com as sequências aqui fornecidas por SEQ ID NOs. 130 e 131) ou fosfolipase C específica de fosfatidilcolina (Bacillus cereus; SEQ ID NO: 115) foram aplicadas usando aplicações em sulco direto para a área circundando sementes de milho híbrido (5828 YH da BECK). O tratamento no sulco com as enzimas foi combinado com um tratamento com um hormônio bioestimulante (CYTOPLEX, comercialmente disponível da Miller Chemical & Fertilizer, LLC) contendo um extrato de planta marinha, cinetina, ácido giberélico e ácido indol-3-butírico. Os tratamentos com enzima em sulcos foram aplicados usando taxas de uso de aplicação de 2, 4 e 8 oz Fl. por área das sementes (59,14, 118,29 e 236,59 ml por área das sementes). A altura da planta foi determinada para 2 ensaios com 18 plantas medidas por cada tentativa. Os dados são apresentados na Tabela 53 abaixo como a alteração percentual na altura da planta para sementes de milho recebendo o tratamento em sulco usando as enzimas fosfatase ácida ou fosfolipase C em comparação com as sementes de controle (bioestimulante isolado). O tratamento com enzima livre de fosfatase ácida aumentou a altura das plantas em comparação com as plantas de controle para as taxas de uso de 2, 4 e 8 oz Fl. (59,14, 118,29 e 236,59 ml) aplicado por área da semente (aproximadamente 150 mU/ml, 300 mU/ml e 600 mU/ml por área da semente), com 4 oz Fl. (118,29 ml) resultando em um aumento de 8,3% em relação às plantas de controle para a taxa de uso de 300 mU/ml. No tratamento de sulco de milho cultivado com fosfolipase C resultou em aumento da altura da planta em comparação com o milho cultivado usando o controle bioestimulante sozinho quando aplicado usando taxa de uso de 2 e 4 oz Fl. (59,14 e 118,29 ml) por área de semente (aproximadamente igual a 150 e 300 mU por área de semente, respectivamente a taxa de uso de oz de 4 oz Fl. (118,29 ml) foi preferida para o crescimento das plantas, resultando em um aumento de 11,4% na altura da planta em relação ao controle do bioestimulante isolado. O controle apenas bioestimulante resultou em plantas de milho com taxas de crescimento menores em comparação com o tratamento apenas com água.TABELA 53. MUDANÇAS NA ALTURA DA PLANTA USANDO UM TRATAMENTO NO SULCO PARA MILHO APLICADO USANDO UMA APLICAÇÃO DE FOSFATASE ÁCIDA OU FOSFOLIPASE C, EM COMBINAÇÃO COM UM BIOESTIMULANTE

EXEMPLO 28: PROTEASE OU XILOSIDASE EM MILHO, EM SULCO.

[641] Protease A (Aspergillus saitoi; SEQ ID NO: 127) e xilosidase (Bacillus pumilus; SEQ ID NO: 123) foram aplicadas ao milho como tratamentos com enzima livres em sulcos, e os efeitos na altura e no crescimento das plantas foram examinados. Para ambas as enzimas protease A e xilosidase, foram usados métodos similares como descrito acima no Exemplo 26 para os tratamentos com lipase em sulco com milho. Tratamentos no sulco (1 ml por semente) foram aplicados na área que circunda a semente de milho (5828 YH da BECK) após o plantio do milho, mas antes de cobrir a semente com solo solto. Os tratamentos em sulcos usando protease A e xilosidase foram distribuídos em volumes de 1 μL equivalentes a 428 μU^rea de atividade de semente para protease e 714 μU^rea de semente (por ml) de atividade para xilosidase. A protease A e a xilosidase resultaram no aumento da altura das plantas quando normalizadas para o controle das plantas (tratamento somente com água). Os resultados são mostrados na Tabela 54 abaixo.TABELA 54. ALTURA DA PLANTA USANDO UM TRATAMENTO NO SULCO PARA MILHO TRATADO COM PROTEASE A OU XILOSIDASE

EXEMPLO 29: XILANASE OU XILOSIDASE EM MILHO E SEMENTE DE SOJA, ESTUFA.

[642] Enzimas livres foram aplicadas como tratamentos de sementes para milho e soja. Xilanases derivadas de Thermomyces lanuginosus (SEQ ID NO: 121) ou Neocallimastix patriciarum (SEQ ID NO: 122) e xilosidase derivadas de Bacillus pumilus (SEQ ID NO: 123) foram aplicadas em sementes de milho (5828 NR da BECK) e soja (297 NR da BECK) em tubos cônicos usando volumes de 2 μL equivalentes às atividades de 600 μU por semente para as xilanases (Thermomyces lanuginosus; Neocallimastix patriciarum) e 714μU por semente para a xilosidase (Bacillus pumilus). Dois conjuntos separados de sementes de milho e soja foram tratados com β-1,4-endoglucanase (Acidothermus cellulolyticus; SEQ ID NO: 30) a 1000 μU de atividade/semente. As sementes foram deixadas secar após o revestimento e plantadas em solo superficial comercial como descrito acima no Exemplo 1. No final de 14 dias, a variação percentual média na altura da planta em comparação com controles com água foi determinada para dois ensaios replicados para milho e um ensaio para soja com 12 plantas por tentativa. Mudanças na altura média da planta (cm) foram comparadas às plantas de controle, assim como plantas de milho e soja cultivadas a partir de sementes tratadas com β-1,4-endoglucanase (Acidothermus) que resultou em um aumento no crescimento das plantas quando aplicado como tratamento de sementes para milho e soja. A mudança percentual média na altura da planta, conforme normalizado para os tratamentos de controle com água, é relatada na Tabela 55 abaixo, com o desvio padrão da média da média (STDEV) para os dois ensaios conduzidos em milho e soja.

[643] As xilanases (Thermomyces lanuginosus; Neocallimastix patriciarum) aplicadas como tratamento de sementes para sementes de milho e soja em atividades de 600 μU/semente resultaram em aumento de altura nas plantas em comparação com as plantas de controle. O tratamento com xilanase (Thermomyces lanuginosus) aplicado a sementes de milho resultou, em média, em um aumento de 9% na altura de plantas para o milho e um aumento médio de 12% para a soja. O tratamento com β-xilanase (Neocallimastix patriciarum) aplicado a sementes de milho resultou em um aumento médio de 4% na altura de plantas para o milho. A xilosidase (Bacillus pumilus) aplicada como tratamento de sementes a sementes de milho e soja a 714 μU/semente resultou em um aumento aproximado de 911% para plantas de milho e soja em comparação com as plantas de controle. O impacto positivo na altura das plantas para os tratamentos com xilanase e xilosidase aplicados como tratamentos com enzima livres para sementes de milho e soja foi comparável ou melhor que β-1,4- endoglucanase (Acidothermus) para as plantas de milho e soja. Após duas semanas, a altura das plantas foi medida e normalizada para plantas que receberam apenas tratamento com fertilizantes.Tabela 55. Milho e soja tratados com endo-1,4-β-xilanase, endoglucanase e xilosidase como tratamentos de sementes

EXEMPLO 30: ENZIMAS LIVRES E TITULAÇÃO DE ATIVIDADES PARA TRATAMENTO DE SEMENTES E TRATAMENTO EM SULCO EM MILHO E SOJA.

[644] Liquenase (Bacillus subtilis, comercialmente disponível de Megazyme como produto E-LICHN; SEQ ID NO: 43), xiloglucanase (espécies Paenibacillus, comercialmente disponíveis de Megazyme, como produto E- XEGP; SEQ ID NO: 125), β- xilanase (Bacillus stearothermophilus, comercialmente disponível de Megazyme como produto E-XYNBS; SEQ ID NO: 25), mananase (espécies de Bacillus, comercialmente disponível de Megazyme como produto E-BMABS; SEQ ID NO: 128), lipase (Burkholderia stearothermophilus, comercialmente disponível na Sigma-Aldrich, como produto 534641; SEQ ID NO: 120), pectolase (Aspergillus japonicus, comercialmente disponível da Sigma-Aldrich, como produto P3026; SEQ ID NO: 129) e β-1,4- endoglucanase (Acidothermus cellulolyticus, comercialmente disponível da Sigma-Aldrich, como produto E2164; SEQ ID NO: 30) foram diluídos em água para atingir os níveis de atividade como listado abaixo na Tabela 56. Alíquotas (1 μL) destas preparações foram usadas para tratar sementes na experimentos descritos abaixo neste exemplo e no Exemplo 31.TABELA 56. TITULAÇÕES DE ENZIMAS USADAS PARA DETERMINAR AS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS IDEAIS COMO TRATAMENTO DE SEMENTES PARA SEMENTES DE MILHO E SOJA PARA PROMOVER O CRESCIMENTO EM PLANTAS

[645] As titulações das seis enzimas livres (liquenase, xiloglucanase, xilanase, mananase, lipase e pectolase) foram testadas para determinar as atividades ideais que promovem o crescimento quando usadas como tratamento de sementes em milho (5828 YH da BECK) e soja (297 NR da BECK). As atividades de titulação que foram determinadas como óptimas para uso como tratamento de sementes para as seis enzimas estão listadas na Tabela 57 abaixo (listadas como atividade enzimática livre por semente). Os experimentos foram conduzidos sob as mesmas condições ambientais em um ambiente de crescimento controlado como descrito no Exemplo 29. As mudanças percentuais na altura média das plantas foram determinadas para as seis enzimas usadas como um tratamento de sementes aplicadas a sementes de milho ou soja (Tabela 57, abaixo). A altura média da planta para cada uma das seis enzimas foi normalizada para a das plantas cultivadas a partir de sementes que receberam um tratamento de controle da água e registradas como uma alteração percentual (Tabela 57). Adicionalmente, os tratamentos com enzimas livres aplicados à semente de milho incluíram e foram comparados ao tratamento com a enzima livre da β-1,4-endoglucanase porque esta enzima já havia mostrado promover o crescimento quando aplicado como tratamento de sementes em plantas de milho (ver Exemplos 1- 4, 7, 26 e 29, acima).

[646] Todas as seis enzimas livres (liquenase, xiloglucanase, β- xilanase, mananase, lipase e pectolase), quando usadas como tratamento de sementes em seus níveis de atividade otimizados em milho e soja, aumentaram a altura das plantas em comparação com plantas de controle crescidas a partir de sementes tratadas sem enzimas. Os resultados são mostrados na Tabela 57 abaixo. A enzima livre de β-1,4-endoglucanase aplicada a sementes de milho resultou em um aumento na altura de plantas para o milho, conforme normalizado para as plantas de controle. Quando as variedades de milho e soja foram consideradas, a mananase resultou nos maiores aumentos na altura das plantas, conforme normalizado para as plantas de controle (aumento de 107% no milho e aumento de 110% na soja).TABELA 57. EFEITOS DE ALTURA DE ENZIMAS LIVRES APLICADAS COMO TRATAMENTO DE SEMENTES A PLANTAS DE MILHO E SOJA

[647] As titulações de quatro das mesmas enzimas (liquenase, xiloglucanase, mananase e pectolase, listadas na Tabela 56 acima) foram realizadas para determinar as atividades ideais para uso como um tratamento no sulco em milho (5828 YH da BECK) para promover crescimento d plantas. Cada titulação de enzima foi otimizada para o potencial de crescimento (Tabela 58) e foi diretamente aplicada à área que circunda uma semente usando 1 ml de água por semente imediatamente antes da conclusão do plantio e cobrindo a semente com o solo. Duas semanas após o plantio, a altura da planta foi medida e normalizada até a altura das plantas que não receberam tratamento enzimático, mas receberam apenas um controle da água. Esse experimento foi repetido em três ensaios com 18 plantas por experimento e as medições foram feitas em média nos ensaios para gerar uma mudança percentual na altura média das plantas de milho (em comparação com o controle). Os dados são apresentados na Tabela 58 para as quatro enzimas livres: liquenase, xiloglucanase, mananase e pectolase. As enzimas livres de liquenase, xiloglucanase e petoilase aumentaram o milho em altura em comparação com o controle somente com água quando aplicado como tratamento em sulco na área que circunda as sementes de milho.TABELA 58. EFEITOS DE ALTURA DE ENZIMAS LIVRES APLICADAS COMO TRATAMENTO NO SULCO QUE CIRCUNDA SEMENTES DE MILHO

[648] As titulações das mesmas seis enzimas livres (liquenase, xiloglucanase, xilanase, mananase, lipase e pectolase, listadas acima na Tabela 56) foram realizadas para determinar as atividades ideais para aplicação como tratamentos de sementes em soja (297 NR da BEC). As atividades (μU/semente) são reportadas para cada enzima na Tabela 59 abaixo. Três ensaios com 18 plantas por ensaio foram conduzidos e medidos quanto a alterações na biomassa total, biomassa de rebento e nodulação. Os experimentos foram conduzidos sob as mesmas condições ambientais em um ambiente de crescimento controlado como descrito no Exemplo 6 acima. Em alguns experimentos, um grupo adicional de sementes foi tratado com β-1,4- endoglucanase (1000 μU/semente). Alterações na biomassa total, biomassa do rebento, biomassa das raízes e nodulação são relatadas na Tabela 59 abaixo como alterações percentuais (%), conforme normalizadas para as sementes de soja que não receberam um tratamento com enzima livre (controle tratado com água).TABELA 59. ENZIMAS LIVRES APLICADAS COMO UM TRATAMENTO DE SEMENTES PARA PROMOVER O CRESCIMENTO EM PLANTAS DE SOJA

EXEMPLO 31: ENZIMAS LIVRES USADAS COMO TRATAMENTO DE SEMENTES PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE ABOBRINHA.

[649] As enzimas liquenase, xiloglucanase, xilanase, lipase livres descritas acima no Exemplo 30 e β-1,4-endoglucanase (Acidothermus cellulolyticus, SEQ ID NO: 30) foram aplicadas como tratamentos de sementes a uma taxa ideal como determinado por uma série de titulação e aplicada a sementes de abobrinha (abobrinha sem estrias, comercialmente disponível de Park Seed) usando volumes de 1 μl das enzimas com as atividades como relatadas em μU/semente (Tabela 60). O rendimento total da semente tratada com enzima livre com liquenase, xiloglucanase, xilanase, lipase e β-1,4- endoglucanase é relatado na Tabela 60 como o peso total do fruto da abobrinha colhida, normalizado para o controle, e é calculada a média para duas colheitas concluídas no mês de agosto (Columbia, Missouri). Tratamentos com enzima livres aplicados à semente de abobrinha usando liquenase (700 μU/semente), xilanase (3000 μU/semente) e lipase (50 μU/semente) apresentaram aumentos de rendimento positivos em comparação com o tratamento de controle. Os aumentos no rendimento total colhível para plantas de abobrinha usando os tratamentos de semente de enzima livre para liquenase, xilanase e lipase mostraram vantagens de rendimento total similares como β-1,4-endoglucanase (1000 μU/semente).TABELA 60. TABELA: RENDIMENTO DE ABOBRINHA APÓS TRATAMENTO DE SEMENTES DE ABOBRINHA COM ENZIMAS LIVRES

EXEMPLO 32: SINERGIA DE MÚLTIPLAS ENZIMAS NO MILHO, NO SULCO.

[650] Mananase (Bacillus sp.; SEQ ID NO: 128), xiloglucanase (Paenibacillus sp., SEQ ID NO: 125), fosfolipase C específica de fosfatidilcolina (Bacillus cereus, SEQ ID NO: 115) e xilosidase (Bacillus pumilus; SEQ ID NO: 123) foram aplicadas ao milho (BECK'S 5828 YH) como tratamentos com enzima livres em sulcos, e os efeitos na altura e no crescimento das plantas foram examinados. Os tratamentos com enzima, incluindo combinações de enzimas, são descritos na Tabela 61. Para todas as enzimas livres, foram usados métodos similares como descrito acima no Exemplo 26 para os tratamentos em sulco em lipase com milho. Resumidamente, tratamentos em sulco foram aplicados na área que circunda a semente de milho após o plantio do milho, mas antes de cobrir a semente com solo solto. Cada tratamento foi aplicado em um volume de 1 ml por semente, que incluía tanto a(s) enzima(s) como um fertilizante contendo ortopolifosfato e acetato de potássio. Os tratamentos no sulco usando cada enzima foram dispensados em taxas de 300 mU/área de atividade de semente para fosfolipase C específica de mananase e fosfatidilcolina, 500 mU/área de semente para xiloglucanase e 714 mU/área de semente (por ml) de atividade para xilosidase. As enzimas foram dispensadas às sementes em volumes de 1 ml por área de semente, contendo tanto a(s) enzima(s) como o fertilizante. Foram usadas 54 sementes por tratamento, divididas em 3 repetições de 18 plantas cada. Após cerca de duas semanas, as alturas das plantas foram medidas e normalizadas para controlar plantas tratadas apenas com fertilizante.

[651] Os resultados são mostrados na Tabela 61 abaixo. Mananase ou xiloglucanase sozinha não resultou em aumentos significativos de altura. A fosfolipase C e a xilosidase aplicadas isoladamente levaram a um aumento na altura das plantas. Surpreendentemente, as combinações de fosfolipase C e mananase ou xiloglucanase levaram a aumentos sinérgicos na altura da planta em comparação com qualquer tratamento sozinho. A combinação de mananase e xiloglucanase também foi mais eficaz do que a enzima sozinha.TABELA 61. ALTURA DA PLANTA USANDO TRATAMENTO EM SULCO PARA MILHO TRATADO COM MANANASE LIVRE, XILOGLUCANASE, XILOSIDASE, FOSFOLIPASE C OU COMBINAÇÕES DAS MESMAS

EXEMPLO 33: EFEITOS ADITIVOS DE MÚLTIPLAS ENZIMAS NA POLPA, NO SULCO.

[652] Mananase (Bacillus sp.; SEQ ID NO: 128), liquenase (Bacillus subtilis, SEQ ID NO: 43), fosfatase ácida (Triticum aestivum, uma mistura de duas isoformas diferentes com as sequências aqui fornecidas por SEQ ID NOs. 130 e 131), pectolase (Aspergillus japonicus, SEQ ID NO: 129), β-xilanase (Neocallismastix patriciarum, SEQ ID NO: 122), e β-xilanase (Bacillus stearothermophilius, SEQ ID NO: 25) foram aplicadas à abóbora híbrida Ambassador (comercialmente disponível de Park Seed como produto 05298) como tratamentos com enzima livre nos sulcos, e os efeitos na altura e no crescimento das plantas foram examinados. Para todas as enzimas livres, foram usados métodos similares como descrito acima no Exemplo 26 para os tratamentos em sulco em lipase com milho. Resumidamente, os tratamentos em sulco foram aplicados à área que circunda a semente de abóbora após o plantio da abóbora, mas antes de cobrir a semente com solo solto. Cada tratamento foi aplicado em um volume de 1 ml por semente, que incluía a(s) enzima(s) e um fertilizante contendo monofosfato de amônio. Tratamentos no sulco usando cada enzima foram dispensados em taxas de 300 mU/área de atividade de semente para mananase, 600 mU/área de semente para liquenase, 30 mU/área de semente para pectolase, 35 pU/área de semente para fosfatase ácida e 1500 mU/área de semente para ambas as β-xilanases. As enzimas foram dispensadas às sementes em volumes de 1 ml por área de semente, contendo a(s) enzima(s) e o fertilizante. Após duas semanas, a altura das plantas foi medida e normalizada para plantas que receberam apenas tratamento com fertilizantes.

[653] Os resultados são mostrados na Tabela 62 abaixo. A fosfatase ácida sozinha resultou em aumento de altura sobre o controle do fertilizante sozinho, e esse efeito foi ligeiramente melhor quando a liquenase foi aplicada junto com a fosfatase ácida. Um grande aumento foi observado quando a combinação fertilizante/fosfatase ácida foi adicionalmente aumentada com a pectolase, a mananase ou qualquer das xilanases. Estas carboidrato hidrolases n-celulolíticas adicionam uma altura de planta significativa em combinação com a fosfatase ácida como um mecanismo dispensado no solo.TABELA 62. ALTURA DA PLANTA USANDO UM TRATAMENTO NO SULCO PARA ABÓBORA TRATADA COM MANANASE, XILANASE, FOSFATASE ÁCIDA, PECTOLASE, LIQUENASE LIVRES OU COMBINAÇÕES DAS MESMAS

MODALIDADES

[654] Para uma ilustração adicional, modalidades adicionais não limitativas da presente divulgação são apresentadas abaixo.

[655] A modalidade 1 é uma enzima compreendendo uma sequência de aminoácidos que codifica uma enzima com atividade de 1- aminociclopropano-1-carboxilato desaminase (ACC desaminase) e um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima quando a enzima é expressa em um microrganismo.

[656] A modalidade 2 é a enzima da modalidade 1, em que a enzima que tem atividade de ACC desaminase compreende uma enzima de uma bactéria do gênero Bacillus.

[657] A modalidade 3 é uma enzima com atividade de ACC desaminase, em que a sequência de aminoácidos da enzima compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de uma D- cisteína desulfidrase de tipo selvagem ou enzima ACC desaminase de uma bactéria do gênero Bacillus, e em que a substituição de aminoácidos resulta no atividade de ACC desaminase aumentada em comparação com a atividade de ACC desaminase da D-cisteína desulfidrase de tipo selvagem ou enzima ACC desaminase sob as mesmas condições.

[658] A modalidade 4 é a enzima da modalidade 3, em que a enzima compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima quando a enzima é expressa em um microrganismo.

[659] A modalidade 5 é a enzima de qualquer uma das modalidades 1, 2 e 4, em que o microrganismo compreende uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Pseudomonas, uma bactéria do gênero Rhizobium, uma bactéria do gênero Paenibacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, uma bactéria do gênero Paracoccus, uma bactéria do gênero Mesorhizobium, uma bactéria do gênero Bradyrhizobium, uma bactéria do gênero Actinobacter, uma bactéria do gênero Arthrobacter, uma bactéria do gênero Azotobacter, uma bactéria do gênero Azosprillium, uma bactéria metiltrófica facultativa pigmentada de rosa, um fungo micorrízico, um fungo do gênero Glomus, um fungo do gênero Trichoderma, um fungo do gênero Kluyera, um fungo do gênero Gliocladium, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[660] A modalidade 6 é a enzima da modalidade 5, em que o microrganismo compreende uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, uma bactéria do gênero Pseudomonas, uma bactéria do gênero Paenibacillus, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[661] A modalidade 7 é a enzima de qualquer uma das modalidades 1-6, em que a enzima compreende uma enzima Bacillus thuringiensis ou uma enzima Bacillus pseudomycoides.

[662] A modalidade 8 é a enzima da modalidade 7, em que a enzima compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113 e tem atividade de ACC desaminase.

[663] A modalidade 9 é a enzima de qualquer uma das modalidades 3-8, em que a sequência de aminoácidos da enzima compreende duas substituições de aminoácidos relativamente à sequência da enzima D- cisteína desulfidrase do tipo selvagem ou ACC desaminase, em que as substituições de aminoácidos resultam na atividade da ACC desaminase aumentada em comparação com a atividade de ACC desaminase da enzima do tipo selvagem sob as mesmas condições.

[664] A modalidade 10 é a enzima de qualquer uma das modalidades 3-9, em que a sequência de aminoácidos da enzima compreende: uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 de SEQ ID NO: 7 com um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 de SEQ ID NO: 7 com um resíduo de leucina; uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 de SEQ ID NO: 8 com um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 de SEQ ID NO: 8 com um resíduo de leucina; uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 de SEQ ID NO: 9 com um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 de SEQ ID NO: 9 com um resíduo de leucina; ou uma substituição do resíduo de treonina na posição 290 de SEQ ID NO: 113 com um resíduo de ácido glutâmico e uma substituição do resíduo de serina na posição 317 de SEQ ID NO: 113 com um resíduo de leucina.

[665] A modalidade 11 é a enzima de qualquer uma das modalidades 3 a 10, em que a enzima compreende ou consiste em SEQ ID NO: 10, 11, 12 ou 114.

[666] A modalidade 12 é a enzima da modalidade 1 ou 2, em que a enzima compreende uma sequência de aminoácidos com 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-9 e 113.

[667] A modalidade 13 é um microrganismo recombinante que expressa a enzima de qualquer uma das modalidades 1-12.

[668] A modalidade 14 é o microrganismo recombinante da modalidade 13, em que a expressão da enzima é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima em um microrganismo de tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições.

[669] A modalidade 15 é uma formulação compreendendo uma enzima de qualquer uma das modalidades 1 a 12 ou um microrganismo recombinante da modalidade 13 ou 14 e um carreador agricolamente aceitável.

[670] A modalidade 16 é uma semente de planta tratada com uma enzima de qualquer uma das modalidades 1-12, um microrganismo recombinante da modalidade 13 ou 14, ou uma formulação da modalidade 15.

[671] A modalidade 17 é um método para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade, compreendendo a aplicação da enzima de qualquer uma das modalidades 1-12, o microrganismo recombinante da modalidade 13 ou 14, ou a formulação da modalidade 15 meio de crescimento, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta.

[672] A modalidade 18 é o método da modalidade 17, em que o método compreende aplicar a enzima de qualquer uma das modalidades 1-12 ao meio de crescimento de plantas, à planta, à semente de planta ou à área que circunda a planta ou a semente da planta.

[673] A modalidade 19 é o método da modalidade 17 ou 18, em que o método compreende a aplicação de enzima livre ao meio de crescimento de plantas, à planta, à semente da planta ou à área que circunda a planta ou a semente da planta.

[674] A modalidade 20 é o método de qualquer uma das modalidades 17-19, em que o método compreende aplicar o microrganismo recombinante da modalidade 13 ou 14 ao meio de crescimento de plantas, à planta, à semente de planta ou à área que circunda a planta ou a semente da planta.

[675] A modalidade 21 é um método para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade compreendendo a aplicação de uma enzima livre a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta, em que a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma glucanase não-celulolítica, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas.

[676] A modalidade 22 é um método para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade compreendendo a aplicação de duas ou mais enzimas livres a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou semente de planta, as enzimas são selecionadas independentemente de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma mananase, uma pectinase, uma glucanase e uma ACC desaminase.

[677] A modalidade 23 é um método para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade compreendendo a aplicação de uma enzima livre a uma planta ou semente de planta, em que a enzima compreende uma glucanase, e em que a aplicação da enzima à semente da planta compreende: a) aplicar a enzima à semente da planta no momento da plantação; ou (b) revestir a semente da planta com a enzima.

[678] A modalidade 24 é o método da modalidade 23, em que o método compreende o revestimento da semente de planta com uma formulação de revestimento de sementes compreendendo a enzima e um carreador agricolamente aceitável.

[679] A modalidade 25 é o método da modalidade 23 ou 24, em que o método compreende ainda a aplicação da enzima ou de uma proteína expansina ao meio de crescimento de plantas ou a uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta.

[680] A modalidade 26 é o método da modalidade 25, em que o método compreende ainda a aplicação da enzima ou da proteína expansina ao meio de crescimento de plantas.

[681] A modalidade 27 é o método da modalidade 26, em que o método compreende ainda a aplicação da enzima e da proteína expansina ao meio de crescimento de plantas.

[682] A modalidade 28 é um método para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade compreendendo a aplicação de uma enzima livre a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta, em que a enzima compreende uma glucanase e o método compreende ainda a aplicação de uma proteína expansina ao meio de crescimento de plantas, planta, semente da planta ou a área que circunda uma planta ou uma semente de planta.

[683] A modalidade 29 é o método da modalidade 28, em que a aplicação da enzima ou da proteína expansina à semente de planta compreende: (a) aplicação da enzima ou proteína expansina à semente da planta no momento do plantio; ou (b) revestir a semente da planta com a enzima ou a proteína expansina.

[684] Modalidade 30 é o método da modalidade 29, em que o método compreende o revestimento da semente da planta com uma formulação de revestimento de sementes compreendendo: a enzima, a proteína expansina ou a enzima e a proteína expansina; e um carreador agricolamente aceitável.

[685] A modalidade 31 é um método para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade, compreendendo a aplicação de uma enzima livre a uma planta ou a uma semente de planta, em que a enzima compreende uma fitase.

[686] A modalidade 32 é um método para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade, compreendendo a aplicação de um fertilizante e uma enzima livre a um meio de crescimento de plantas, uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta ou a uma planta ou semente de planta, em que a enzima livre compreende uma fitase.

[687] A modalidade 33 é um método para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade, compreendendo a aplicação de um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou semente de planta, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma mananase, uma pectinase, um protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[688] A modalidade 34 é um método para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade, compreendendo a aplicação de um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina.

[689] A modalidade 35 é um método para estimular o crescimento de plantas e/ou promover a fitossanidade, compreendendo aplicar um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou semente de planta, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma fitase, uma mananase, uma pectinase, uma fosfatase ácida, e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[690] A modalidade 36 é um método para estimular o crescimento das plantas e/ou promover a fitossanidade, compreendendo: aplicar um microrganismo recombinante a um meio de crescimento de plantas, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou semente de planta, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma fitase, uma mananase, uma pectinase, uma fosfatase ácida, e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina não faz parte de uma proteína de fusão.

[691] A modalidade 37 é uma semente de planta revestida com um microrganismo recombinante, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma fitase, uma mananase, uma pectinase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase, e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[692] A modalidade 38 é uma semente de planta revestida com um microrganismo recombinante, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou proteína expansina, em que a expressão da enzima aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo de tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina.

[693] A modalidade 39 é uma semente de planta revestida com um microrganismo recombinante, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[694] A modalidade 40 é uma semente de planta revestida com um microrganismo recombinante, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma glucanase, uma protease, uma mananase, uma pectinase, uma fitase, fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina não faz parte de uma proteína de fusão.

[695] A modalidade 41 é uma composição compreendendo um fertilizante e uma enzima ou uma proteína expansina, em que a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas.

[696] A modalidade 42 é uma composição da modalidade 41, em que a enzima compreende uma enzima livre.

[697] A modalidade 43 é uma composição compreendendo um fertilizante e um microrganismo recombinante, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada a partir de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase, e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[698] A modalidade 44 é uma composição compreendendo um fertilizante e um microrganismo recombinante, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase, e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina.

[699] A modalidade 45 é uma composição compreendendo um fertilizante e um microrganismo recombinante, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma ACC desaminase, e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[700] A modalidade 46 é uma composição compreendendo um fertilizante e um microrganismo recombinante, em que: o microrganismo recombinante expressa uma enzima ou uma proteína expansina, em que a expressão da enzima ou proteína expansina é aumentada em comparação com o nível de expressão da enzima ou proteína expansina em um microrganismo do tipo selvagem do mesmo tipo sob as mesmas condições; a enzima é selecionada a partir de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma mananase, uma pectinase, uma quitosanase, uma protease, uma fosfatase ácida, uma fitase, uma glucanase, uma desaminase ACC, e quaisquer combinações das mesmas; e a enzima ou proteína expansina não faz parte de uma proteína de fusão.

[701] A modalidade 47 é a composição de qualquer uma das modalidades 41-46, em que a composição compreende ainda um carreador agricolamente aceitável, um agroquímico adicional ou uma combinação dos mesmos.

[702] A modalidade 48 é o método de qualquer uma das modalidades 34-36, a semente de qualquer uma das modalidades 38-40, ou a composição de qualquer uma das modalidades 44-47, em que a enzima ou proteína expansina é expressa durante o crescimento vegetativo do microrganismo recombinante.

[703] A modalidade 49 é o método da modalidade 33 ou 48, a semente da modalidade 37 ou 48 ou a composição de qualquer uma das modalidades 43, 47 e 48, em que o microrganismo recombinante compreende um microrganismo recombinante formador de esporos.

[704] A modalidade 50 é o método de qualquer uma das modalidades 33, 35, 48 e 49, a semente de qualquer uma das modalidades 37, 39, 48 e 49, ou a composição de qualquer uma das modalidades 43 e 45- 49, em que a enzima ou proteína expansina compreende ainda um peptídeo sinal que resulta na secreção da enzima ou proteína expansina.

[705] A modalidade 51 é a enzima de qualquer uma das modalidades 1, 2 e 4-12, o microrganismo recombinante da modalidade 13 ou 14, a formulação da modalidade 15, o método de qualquer uma das modalidades 17-20, 34, e 50, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 38 e 50, ou a composição de qualquer uma das modalidades 44, 47 e 50, em que o peptídeo sinal compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75 %, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-73, 135 e 137-147.

[706] A modalidade 52 é a enzima, o microrganismo recombinante, a formulação, o método, a semente ou a composição da modalidade 51, em que o peptídeo sinal compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs. 49-51, 54, 56-73, 135, 139, 140 e 142.

[707] A modalidade 53 é a enzima de qualquer uma das modalidades 1, 2, 4-12, 51, 52, o microrganismo recombinante de qualquer uma das modalidades 13, 14, 51 e 52, o método de qualquer uma das modalidades 17-20, 34 e 50-52, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 38 e 5052, ou a composição de qualquer uma das modalidades 44, 47 e 50-52, em que o peptídeo sinal está presente no terminal amino da enzima ou proteína expansina.

[708] A modalidade 54 é a enzima, microrganismo recombinante, formulação, método, semente ou composição da modalidade 52 ou 53, em que o microrganismo compreende uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Paenibacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, uma bactéria do gênero Pseudomonas, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[709] A modalidade 55 é a enzima, microrganismo recombinante, formulação, método, semente ou composição da modalidade 54, em que o microrganismo compreende Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus cereus, Bacillus firmus, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus aryabbattai, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus flexus, Bacillus nealsonii, Bacillus pumulis, Bacillus licheniformis, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus sphericus, Lysinibacillus fusiformis, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[710] A modalidade 56 é a enzima, o microrganismo recombinante, a formulação, o método, a semente ou a composição da modalidade 55, em que o microrganismo compreende Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus pseudomycoides, Bacillus mycoides, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus fusiformis, Lysinibacillus sphericus, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[711] A modalidade 57 é o método de qualquer uma das modalidades 33, 34, 36 e 48-56 ou a semente de qualquer uma das modalidades 37, 38, 40 e 48-56, ou a composição de qualquer uma das modalidades 43, 44 e 46-56, em que a enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus recombinante.

[712] A modalidade 58 é o método da modalidade 35 ou 57, a semente da modalidade 39 ou 57, ou a composição da modalidade 45 ou 57, em que a enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um esporo do membro da família Bacillus cereus intacto.

[713] A modalidade 59 é o método de qualquer uma das modalidades 33, 35, 48, 49, 57 e 58, a semente de qualquer uma das modalidades 37, 39, 48, 49, 57 e 58, ou a composição de qualquer uma das modalidades 43, 45, 47-49, 57 e 58, em que a enzima ou proteína expansina não faz parte de uma proteína de fusão.

[714] A modalidade 60 é o método de qualquer uma das modalidades 17-22, 25-30, 32-36 e 48-59, em que o método compreende aplicar a enzima, a proteína expansina ou o microrganismo recombinante ao meio de crescimento da planta.

[715] A modalidade 61 é o método da modalidade 60, em que o meio de crescimento de plantas compreende um fertilizante.

[716] A modalidade 62 é o método da modalidade 60, em que o meio de crescimento de plantas consiste essencialmente de um fertilizante.

[717] A modalidade 63 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36 e 48-62, em que o método compreende aplicar a enzima, a proteína expansina ou o microrganismo recombinante à planta.

[718] A modalidade 64 é o método da modalidade 63, em que o método compreende a aplicação da enzima, da proteína expansina ou do microrganismo recombinante às raízes da planta.

[719] A modalidade 65 é o método da modalidade 63 ou 64, em que o método compreende aplicar a enzima, a proteína expansina ou o microrganismo recombinante foliarmente.

[720] A modalidade 66 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36 e 48-65, em que o método compreende aplicar a enzima, a proteína expansina ou o microrganismo recombinante à semente da planta.

[721] A modalidade 67 é o método da modalidade 66, em que aplicar a enzima, a proteína expansina ou o organismo recombinante à semente de planta compreende: (a) aplicar a enzima, a proteína expansina ou o organismo recombinante à semente de planta no momento do plantio; ou (b) revestir a semente da planta com a enzima, a proteína expansina ou o organismo recombinante.

[722] A modalidade 68 é o método da modalidade 67, em que o método compreende o revestimento da semente de planta com uma formulação de revestimento de sementes compreendendo: a enzima, a proteína expansina, o microrganismo recombinante ou uma combinação dos mesmos; e um carreador agricolamente aceitável.

[723] A modalidade 69 é uma semente de planta tratada com uma enzima livre, em que a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma mananase, uma pectinase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma glucanase não-celulolítica, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas.

[724] A modalidade 70 é o método de qualquer uma das modalidades 21 e 60-68, ou a semente de planta da modalidade 69, em que a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma mananase, uma pectinase, uma lactonase, uma quitosanase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma ACC desaminase e quaisquer combinações das mesmas.

[725] A modalidade 71 é uma semente de planta tratada com duas ou mais enzimas livres, em que as enzimas são independentemente selecionadas de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma lactonase, uma quitosanase, uma mananase, uma pectinase, uma protease, uma fitase, uma fosfatase ácida, uma glucanase e uma ACC desaminase.

[726] A modalidade 72 é uma semente de planta revestida com uma enzima livre, em que a enzima compreende uma glucanase.

[727] A modalidade 73 é uma semente de planta tratada com uma enzima livre e uma proteína expansina, em que a enzima compreende uma glucanase.

[728] A modalidade 74 é a semente de planta de qualquer uma das modalidades 16, 69-71 e 73, em que a semente de planta é revestida com a enzima, o microrganismo recombinante, a proteína expansina ou uma combinação de qualquer dos mesmos.

[729] A modalidade 75 é a semente de planta da modalidade 74, em que a semente de planta é revestida com a enzima e a proteína expansina.

[730] A modalidade 76 é a semente de planta de qualquer uma das modalidades 72, 74 e 75, em que a semente de planta é revestida com uma formulação de revestimento de sementes compreendendo a enzima, o microrganismo recombinante, a proteína expansina ou uma combinação dos mesmos, e um carreador agricolamente aceitável.

[731] A modalidade 77 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 33-36, e 48-68, e 70, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69-71, e 74 -76, ou a composição de qualquer uma das modalidades 51-59, em que a enzima compreende a fosfolipase.

[732] A modalidade 78 o método, a semente ou a composição da modalidade 77, em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase C, uma fosfolipase D, uma fosfolipase E ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[733] A modalidade 79 o método, a semente ou a composição da modalidade 78, em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase A, uma fosfolipase C, uma fosfolipase D ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[734] A modalidade 80 é o método, a semente ou a composição da modalidade 78, em que: a fosfolipase compreende a fosfolipase A, a fosfolipase A compreendendo uma fosfolipase A1, uma fosfolipase A2, ou uma combinação das mesmas; a fosfolipase compreende a fosfolipase B, a fosfolipase B compreendendo uma fosfolipase B1; a fosfolipase compreende a fosfolipase C, a fosfolipase C compreendendo uma fosfolipase C beta 1, uma fosfolipase C beta 2, uma fosfolipase C beta 3, uma fosfolipase C beta 4, uma fosfolipase C delta 1, uma fosfolipase C delta 3, uma fosfolipase C delta 4, uma fosfolipase C epsilon 1, uma fosfolipase C gama 1, uma fosfolipase C gama 2, uma fosfolipase C eta 1, uma fosfolipase C eta 2, uma fosfolipase C zeta 1, ou uma combinação de quaisquer das mesmas; ou a fosfolipase compreende a fosfolipase D, a fosfolipase D compreendendo uma fosfolipase D1, uma fosfolipase D2, um membro D de fosfolipase 3, um membro D de fosfolipase 4, um membro D de fosfolipase 5, um membro D de fosfolipase 6, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[735] A modalidade 81 é o método, a semente ou a composição da modalidade 80, em que a fosfolipase A compreende a fosfolipase A2, a fosfolipase A2 compreendendo uma fosfolipase A2 do Grupo IIA, uma fosfolipase A2 do Grupo IIC, uma fosfolipase A2 do Grupo IID, uma fosfolipase A2 do Grupo IIE, uma fosfolipase A2 do Grupo IIF, uma fosfolipase A2 do Grupo III, uma fosfolipase A2 do Grupo IVA, uma fosfolipase A2 do Grupo IVB, uma fosfolipase A2 do Grupo IVC, uma fosfolipase A2 do Grupo IVD, uma fosfolipase A2 do Grupo IVE, uma fosfolipase A2 do Grupo FIV, uma fosfolipase A2 do Grupo V, uma fosfolipase A2 do Grupo VI, uma fosfolipase A2 do Grupo VII, uma fosfolipase A2 do Grupo X, uma fosfolipase A2 do Grupo XIIA, uma fosfolipase A2 do Grupo XIIB, uma fosfolipase A2 do Grupo XV, uma fosfolipase A2 do Grupo XVI, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[736] A modalidade 82 é o método, a semente ou a composição da modalidade 77, em que a fosfolipase compreende uma 1-alquil-2- acetilglicerofosfocolina esterase, uma fosfatidilinositol desacilase, uma fosfoinositida fosfolipase C, uma esfingomielina fosfodiesterase, uma esfingomielina fosfodiesterase D, uma alquilglicerofosfoetanolamina fosfodiesterase, uma glicoproteína fosfolipase C de superfície variante, uma glicosilfosfatidilinositol fosfolipase D, uma fosfolipase D de hidrólise de N- acetilfosfatidiletanolamina, um fosfatidilinositol diacilglicerol liase, um glicosilfosfatidilinositol diacilglicerol liase, um domínio de fosfolipase tipo patatina contendo proteína 2 (PNPLA2), um domínio de fosfolipase tipo patatina contendo proteína 3 (PNPLA3), ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[737] A modalidade 83 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 77-82, em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase de Streptomyces, uma fosfolipase de Bacillus, uma fosfolipase de Clostridium, uma fosfolipase de Acidovorax ou uma combinação de quaisquer uma das mesmas.

[738] A modalidade 84 é o método, a semente, ou a composição de realização 83, em que a fosfolipase de Streptomyces compreende uma fosfolipase de Streptomyces chromofuscus, em que a fosfolipase de Bacillus compreende uma fosfolipase específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus, ou uma fosfolipase específica de fosfatidilinositol de Bacillus cereus, ou em que a fosfolipase de Clostridium perfringens compreende uma fosfolipase C de Clostridium perfringens.

[739] A modalidade 85 é o método, a semente, ou a composição de realização 83, em que a fosfolipase de Streptomyces chromofuscus compreende fosfolipase D de Streptomyces chromofuscus, em que a fosfolipase de Bacillus cereus compreende fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus, fosfolipase C específica de fosfatidilinositol de Bacillus cereus, ou em que a fosfolipase de Clostridium perfringens compreende a fosfolipase C de Clostridium perfringens.

[740] A modalidade 86 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 77-85, em que a fosfolipase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 13-19 e 115-117.

[741] A modalidade 87 é o método, a semente ou a composição da modalidade 77, em que a fosfolipase compreende uma fosfolipase C específica de fosfatidilcolina de Bacillus cereus e em que: o método compreende ainda a aplicação de uma mananase ou de uma xiloglucanase ao meio de crescimento de plantas, planta, semente da planta ou área que circunda a planta ou a semente da planta; a semente é ainda tratada com uma mananase ou uma xiloglucanase; ou a composição compreende ainda uma mananase ou uma xiloglucanase.

[742] A modalidade 88 o método, a semente ou a composição da modalidade 87, em que a fosfolipase C e a mananase estão presentes em quantidades sinergicamente eficazes.

[743] A modalidade 89 é o método, a semente ou a composição da modalidade 87, em que a fosfolipase C e a xiloglucanase estão presentes em quantidades sinergicamente eficazes.

[744] A modalidade 90 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 33-36, 48-68, 70 e 77-89, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69-71, e 74-89, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59 e 77-89, em que a enzima compreende a lipase.

[745] A modalidade 91 é o método, a semente ou a composição da modalidade 90, em que a lipase compreende uma lipase de éster carboxílico, uma diacilglicerol lipase alfa, uma diacilglicerol lipase beta, uma lipase A, uma lipase hepática, uma lipase sensível a hormônio, uma lipase gástrica, uma lipase endotelial, um membro H de lipase, um membro I de família de lipase, um membro J de família de lipase, um membro K de família de lipase, um membro M de família de lipase, um membro N de família de lipase, uma lipase de lipoproteína, uma monoglicerídeo lipase, uma proteína 2 relacionada com a lipase pancreática, uma proteína 3 relacionada com a lipase pancreática, uma acilglicerol lipase, uma galactolipase, uma lipoproteína lipase ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[746] A modalidade 92 é o método, a semente ou a composição da modalidade 90 ou 91, em que a lipase compreende uma lipase de Bacillus subtilis, uma lipase de Bacillus thuringiensis, uma lipase de Bacillus cereus, uma lipase de Bacillus clausii, uma lipase de Burkholderia cepacia, uma lipase de Burkholderia stearothermophilus, uma lipase de Pseudomonas, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[747] A modalidade 93 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 90-92, em que a lipase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 20, 21 e 118-120.

[748] A modalidade 94 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 33-36, 48-68, 70 e 77-93, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69-71, e 74-93, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59 e 77-93, em que a enzima compreende a xilanase.

[749] A modalidade 95 é o método, a semente ou a composição da modalidade 94, em que a xilanase compreende uma beta-xilanase.

[750] A modalidade 96 é o método, a semente ou a composição da modalidade 95, em que a beta-xilanase compreende uma glucuronoarabinoxilano endo-1,4-beta-xilanase, uma exo-1,4-beta-xilanase, uma endo-1,4-beta-xilanase, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[751] A modalidade 97 é o método, a semente, ou a composição de qualquer uma das modalidades 94-96, em que a xilanase compreende uma xilanase de Caldicellulosiruptor, uma xilanase de Bacillus, uma xilanase de Neocallimastix, uma xilanase de Thermomyces, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[752] A modalidade 98 é o método, a semente ou a composição da modalidade 97, em que a xilanase de Caldicellulosiruptor compreende uma xilanase de Calcharicellulosiruptor saccharolyticus, em que a xilanase de Bacillus compreende uma xilanase de Bacillus subtilis ou Bacillus stearothermophilus, em que a xilanase de Neocallimastix compreende uma xilanase de Neocallimastix patriciarum, ou em que a xilanase de Thermomyces compreende uma xilanase de Thermomyces lanuginosus.

[753] A modalidade 99 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 94-98, em que a xilanase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 22-25, 121 e 122.

[754] A modalidade 100 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 33-36, 46-68, 70 e 77-93, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69-71, e 74-93, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59 e 77-93, em que a enzima compreende a xilosidase.

[755] A modalidade 101 é o método, a semente, ou a composição da modalidade 100, em que o xilosidase compreende uma xilosidase de Caldicellulosiruptor saccharolyticus, uma xilosidase Bacillus pumilus, ou uma combinação das mesmas.

[756] A modalidade 102 é o método, a semente ou a composição da modalidade 100 ou 101, em que a xilosidase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou 123.

[757] A modalidade 103 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 33-36, 48-68, 70 e 77-102, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-49, 69-71 e 74 a 102, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59 e 77-102, em que a enzima compreende a lactonase.

[758] A modalidade 104 é o método, a semente, ou a composição da modalidade 103, em que o lactonase compreende uma 1,4-lactonase, uma 2- pirona-4,6-dicarboxilato lactonase, uma 3-oxoadipata enol-lactonase, uma actinomicina lactonase, uma desoxilimonato anel-a-lactonase, uma gluconolactonase, uma L-rhamnono-1,4-lactonase, uma limonina-anel D- lactonase, uma esteroide-lactonase, uma triacetato-lactonase, uma xylono-1,4- lactonase, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[759] A modalidade 105 é o método, a semente, ou a composição de realização 103 ou 104, em que o lactonase compreende uma lactonase de Bacillus, uma lactonase de Agrobacterium, uma lactonase de Rhodococcus, uma lactonase Streptomyces, uma lactonase de Arthrobacter, uma lactonase Sphingomonas, uma lactonase de Pseudomonas, uma lactonase de Klebsiella, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[760] A modalidade 106 é o método, a semente ou a composição da modalidade 105, em que a lactonase compreende uma lactonase de Bacillus thuringiensis, uma lactonase de Bacillus pseudomycoides ou uma combinação das mesmas.

[761] A modalidade 107 é o método, a semente ou a composição da modalidade 106, em que a lactonase compreende um AiiA.

[762] A modalidade 108 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 103-107, em que a lactonase é específica para uma molécula de sinalização de lactona homoserina bacteriana.

[763] A modalidade 109 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 103-108, em que a lactonase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 27 ou 28.

[764] A modalidade 110 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 33-36, 48-68, 70 e 77-109, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69-71, e 74-109, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59 e 77-109, em que a enzima compreende a quitosanase.

[765] A modalidade 111 é o método, a semente ou a composição da modalidade 110, em que a quitosanase compreende uma exo-1,4-beta-D- glucosaminidase, uma endo-1,4-beta-d-glucosaminidase ou uma combinação das mesmas.

[766] A modalidade 112 é o método, a semente ou a composição da modalidade 110 ou 111, em que a quitosanase compreende uma quitosanase de Bacillus subtilis, uma quitosanase de Streptomyces ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[767] A modalidade 113 é o método, a semente ou a composição da modalidade 112, em que a quitosanase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 29 ou 124.

[768] A modalidade 114 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 33-36, 48-68, 70 e 77-113, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69-71. e 74-113, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59 e 77-113, em que a enzima compreende a protease.

[769] A modalidade 115 o método, a semente ou a composição da modalidade 114, em que a protease compreende uma subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma protease, uma peptidase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, uma termolisina, uma papaína, uma pepsina, uma tripsina, uma pronase, uma carboxilase, uma serina protease, uma glutamato protease, uma aspartato protease, uma cisteína protease, uma treonina protease, uma asparagina protease, uma histidina protease, uma metaloprotease ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[770] A modalidade 116 é o método, a semente ou a composição da modalidade 114 ou 115, em que a protease compreende uma cisteína protease, uma serina protease, uma treonina protease, uma aspartato protease, uma asparagina protease, uma metaloprotease, uma glutamato protease, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[771] A modalidade 117 é o método, a semente ou a composição da modalidade 114 ou 115, em que a protease compreende uma metaloprotease, uma serina protease, uma aspartato protease, uma histidina protease ou uma combinação de quaisquer uma das mesmas.

[772] A modalidade 118 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 114-117, em que a protease não consiste em uma metionina aminopeptidase.

[773] A modalidade 119 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 114-118, em que a protease não compreende uma metionina aminopeptidase.

[774] A modalidade 120 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 114-119, em que a protease compreende uma protease de Bacillus, uma protease de Aspergillus ou uma combinação das mesmas.

[775] A modalidade 121 é o método, a semente ou a composição da modalidade 120, em que a protease de Bacillus compreende uma protease de Bacillus subtilis.

[776] A modalidade 122 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 114-121, em que a protease compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 46-48 e 127.

[777] A modalidade 123 é o método de qualquer uma das modalidades 21-30, 33-36, 48-68 e 77-122, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69 e 71- 122, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59 e 77-122, em que a enzima compreende a glucanase.

[778] A modalidade 124 o método, a semente ou a composição da modalidade 123, em que a glucanase compreende uma endoglucanase, uma exoglucanase ou uma combinação das mesmas.

[779] A modalidade 125 é o método, a semente ou a composição da modalidade 123 ou 124, em que a glucanase compreende uma alfa- glucanase, uma beta-glucanase ou uma combinação das mesmas.

[780] A modalidade 126 é o método, a semente ou a composição da modalidade 125, em que a glucanase compreende a alfa-glucanase, a alfa- glucanase compreendendo uma amilase, uma alfa-1,4-glucanase, uma alfa-1,6- glucanase, ou uma combinação de qualquer das mesmas.

[781] A modalidade 127 é o método, a semente ou a composição da modalidade 125, em que a glucanase compreende a beta-glucanase, a beta- glucanase compreendendo uma endo-beta-glucanase, uma exo-beta-glucanase ou uma combinação das mesmas.

[782] A modalidade 128 é o método, a semente ou a composição da modalidade 125, em que a glucanase compreende a beta-glucanase, a beta- glucanase compreendendo uma beta-1,3-glucanase, uma beta 1,3/1,4 glucanase, uma beta-1,4-glucanase, uma beta-1,6-glucanase ou uma combinação de qualquer das mesmas.

[783] A modalidade 129 o método, a semente ou a composição da modalidade 128, em que a beta-glucanase compreende a beta-1,3-glucanase, a beta-1,4-glucanase ou uma combinação das mesmas.

[784] A modalidade 130 o método, a semente ou a composição da modalidade 128 ou 129, em que a beta-1,3-glucanase compreende uma beta- 1,3-endoglucanase ou em que a beta-1,4-glucanase compreende uma beta-1,4- endoglucanase.

[785] A modalidade 131 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 123-125, em que a glucanase compreende uma celulase, uma glicosídeo hidrolase, um xiloglucano: xiloglucosiltransferase, uma cicloheptaglucanase, uma oligoxiloglucano beta-glicosidase, uma ciclohexaglucanase, uma xiloglucanase, uma celulose 1,4-beta-cellobiosidase, um glucano endo-1,3-beta-D-glucosidase, uma ciclomaltodextrinase, uma glucano 1,3-beta-glucosidase, uma glucano endo-1,3-alfa-glucosidase, uma endo-1,3(4)-beta-glucanase, uma exo-beta-1,4-glucanase, uma liquenase, uma laminarinase, uma glucano 1,4-beta-glucosidase, um glucano endo-1,6-beta- glucosidase, uma glucano-1,3-alfa-glucosidase, uma amilopectinase, uma laminarinase ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[786] A Modalidade 132 é o método, a semente ou a composição da modalidade 123, em que a glucanase compreende uma glucanase não- celulolítica.

[787] A modalidade 133 é o método de qualquer uma das modalidades 21 e 60-68, a semente de qualquer uma das modalidades 69 e 7476, ou o método, semente ou composição da modalidade 132, em que a glucanase não-celulolítica compreende uma xiloglucanase, uma liquenase, uma amilase, uma amiloglucanase, uma amiloglucosidase, uma laminarinase, uma beta-1,3-glucanase, uma beta-1,6-glucanase, uma beta-1,3/1,4-glucanase, uma alfa -1,4-glucanase, uma alfa-1,6-glucanase ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[788] A modalidade 134 é o método, a semente ou a composição da modalidade 131 ou 133, em que a xiloglucanase compreende uma endo-beta- 1,4-glucanase específica de xiloglucano, uma exo-beta-1,4-glucanase específica de xiloglucano, ou uma combinação das mesmas.

[789] A modalidade 135 é o método, a semente ou a composição da modalidade 133 ou 134, em que a xiloglucanase compreende uma glucanase de Paenibacillus.

[790] A modalidade 136 é o método, a semente, ou a composição de qualquer uma das modalidades 133-135, em que a glucanase compreende uma xiloglucanase e em que: o método compreende ainda a aplicação de uma mananase ao meio de crescimento de plantas, planta, semente da planta ou área que circunda a planta ou a semente da planta; a semente é ainda tratada com uma mananase; ou a composição compreende ainda uma mananase.

[791] A modalidade 137 é o método, a semente, ou a composição da modalidade 136, em que a xiloglucanase e a mananase estão presentes em quantidades sinergicamente eficazes.

[792] A modalidade 138 é o método, a semente ou a composição da modalidade 131, em que a glucanase compreende a celulase.

[793] A modalidade 139 é o método, a semente ou a composição da modalidade 138, em que a glucanase compreende uma endocelulase, uma exocelulase ou uma combinação das mesmas.

[794] A modalidade 140 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 123-139, em que a glucanase compreende uma glucanase de Acidothermus, uma glucanase de Trichoderma, uma glucanase de Aspergillus, uma glucanase de Paenibacillus, uma glucanase de Helix, uma glucanase de Bacillus, ou uma combinação de qualquer das mesmas.

[795] A modalidade 141 é o método, a semente ou a composição da modalidade 140, em que a glucanase compreende uma glucanase de Bacillus circulans, uma glucanase de Bacillus subtilis, uma glucanase de Bacillus thuringiensis, uma glucanase de Bacillus cereus, uma glucanase de Trichoderma reesei, uma glucanase de Bacillus clausii, uma glucanase de Helix pomatia, uma glucanase de Acidothermus cellulolyticus, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[796] A modalidade 142 é o método, a semente ou a composição da modalidade 141, em que a glucanase compreende uma endoglucanase de Bacillus subtilis, uma endoglucanase de Bacillus thuringiensis, uma endoglucanase de Bacillus cereus, uma endoglucanase de Bacillus clausii, uma exocelulase de Trichoderma reesei, uma beta-1,4-endoglucanase de Trichoderma reesi, uma beta-glucosidase de Bacillus subtilis, uma betaglucosidase de Bacillus thuringiensis, uma beta-glucosidase de Bacillus cereus, uma beta-glucosidase de Bacillus clausii, uma beta-1,4 endoglucanase de Acidothermus celulolyticus, uma beta-1,3-endoglucanase Helix pomatia, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[797] A modalidade 143 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 123-142, em que a glucanase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 30 a 45, 125 e 126.

[798] A modalidade 144 é o método de qualquer uma das modalidades 25-30, 33-36, 48-68 e 77-143, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59 e 73-143, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59 e 77-143, em que a proteína expansina compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 74.

[799] A modalidade 145 é o método de qualquer uma das modalidades 22, 31-36, 48-68, 70 e 77-144, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69-71, e 74-144, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59 e 77-144, em que a enzima compreende a fitase.

[800] A modalidade 146 é o método, a semente ou a composição da modalidade 145, em que a fitase compreende uma fitase Triticum aestivum.

[801] A modalidade 147 é o método, a semente ou a composição da modalidade 145 ou 146, em que a fitase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade, ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 132-134.

[802] A modalidade 148 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 33-36, 48-68, 70 e 77-147, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69, 71 e 74-147, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59 e 77-147, em que a enzima compreende a fosfatase ácida.

[803] A modalidade 149 é o método, a semente ou a composição da modalidade 148, em que a fosfatase ácida compreende uma fosfatase ácida de Triticum aestivum.

[804] A modalidade 150 é o método, a semente ou a composição da modalidade 148 ou 149, em que a fosfatase ácida compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 130 ou 131.

[805] A modalidade 151 é o método, ou a semente, ou a composição de qualquer uma das modalidades 148-150, em que a fosfatase ácida compreende uma mistura de fosfatases ácidas compreendendo SEQ ID NOs. 130 e 131.

[806] A modalidade 152 é o método de qualquer uma das modalidades 148-151, em que o método compreende ainda a aplicação de uma segunda enzima ao meio de crescimento de plantas, à planta, à semente da planta ou à área que circunda a planta ou a semente da planta.

[807] A modalidade 153 é a semente de qualquer uma das modalidades 148-151, em que a semente é ainda tratada ou revestida com uma segunda enzima.

[808] A modalidade 154 é a composição de qualquer uma das modalidades 148-151, em que a composição compreende ainda uma segunda enzima.

[809] A modalidade 155 é o método da modalidade 152, a semente da modalidade 153 ou a composição da modalidade 154, em que a segunda enzima compreende uma lipase, uma fosfolipase, uma glucanase, uma xilanase, uma pectinase, uma mananase, uma liquenase, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[810] A modalidade 156 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 33-36, 48-68, 70, 77-152 e 155, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69 71, 74-151, 153 e 155, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59, 77-151, 154 e 155, em que a enzima compreende a pectinase.

[811] A modalidade 157 é o método, a semente ou a composição da modalidade 155 ou 156, em que a pectinase compreende uma pectolase.

[812] A modalidade 158 o método, a semente ou a composição da modalidade 157, em que a pectolase compreende uma pectolase de Aspergillus japonicus.

[813] A modalidade 159 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 155-158, em que a pectolase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 129.

[814] A modalidade 160 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 33-36, 48-68, 70, 77-152 e 155-159, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69-71, 74-151, 153 e 155-159, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59, 77-151 e 154-159, em que a enzima compreende a mananase.

[815] A modalidade 161 é o método, a semente ou a composição da modalidade 155 ou 160, em que a mananase compreende uma mananase de Bacillus.

[816] A modalidade 162 é o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 155, 160 e 161, em que a mananase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 128.

[817] A modalidade 163 é o método de qualquer uma das modalidades 21, 22, 34, 48-68, 70, 77-152, e 155-162, a semente de qualquer uma das modalidades 37-40, 48-59, 69-71, 74-151, 153 e 155-162, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59, 77-151 e 154-162, em que a enzima compreende a ACC desaminase.

[818] A modalidade 164 é o método, a semente ou a composição da modalidade 163, em que a ACC desaminase compreende uma enzima de qualquer uma das modalidades 1 a 12.

[819] A modalidade 165 é o método, a semente ou a composição da modalidade 163, em que a ACC desaminase compreende uma sequência de aminoácidos com compelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade, ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs. 7-12, 113 e 114.

[820] A modalidade 166 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152 e 155-165, em que o método compreende ainda a aplicação de um fertilizante, um bioestimulante, ou uma combinação dos mesmos com o meio de crescimento de planta, a planta, a semente da planta, ou a área que circunda a planta ou a semente da planta.

[821] A modalidade 167 é a semente de qualquer uma das modalidades 16, 37-40, 48-59, 69-151, 153 e 155-165, em que a semente é posteriormente tratada ou revestida com um fertilizante, um bioestimulante ou uma combinação dos mesmos.

[822] A modalidade 168 é o método da modalidade 32 ou 166, a semente da modalidade 167, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59, 77-151 e 154-165, em que o fertilizante compreende nitrogênio, fosfato, potássio, zinco, ferro, selênio, boro, cobre ou uma combinação de quaisquer um dos mesmos.

[823] A modalidade 169 é o método, a semente ou a composição da modalidade 168, em que o fosfato compreende monofosfato de amônio, difosfato de amônio, ortofosfato, ortopolifosfato ou uma combinação de qualquer dos mesmos; ou em que o potássio compreende acetato de potássio.

[824] A modalidade 170 é o método, a semente ou a composição da modalidade 168, em que o fertilizante compreende 12% de nitrogênio amoniacal e 58% de fosfato disponível.

[825] A modalidade 171 é o método de qualquer uma das modalidades 166 e 168-170, ou a semente de qualquer uma das modalidades 167-170, em que o bioestimulante compreende um ácido giberélico, um ácido indol-3-butírico, uma cinetina, uma auxina, um homólogo ou derivado de auxina, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[826] A modalidade 172 é o método de qualquer uma das modalidades 166 e 168-171, ou a semente de qualquer uma das modalidades 167-171, em que a enzima compreende uma fosfatase ácida, uma fosfolipase, uma mananase, uma glucanase ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[827] A modalidade 173 é o método de qualquer uma das modalidades 17-32, 60-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-172, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 69-151, 153, 155-165 e 167-172, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41, 42, 47, 77-151, 154-165 e 168-170, em que a enzima ou proteína expansina compreende um extrato celular bruto contendo a enzima ou proteína expansina.

[828] A modalidade 174 é o método de qualquer uma das modalidades 17-32, 60-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-172, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 69-151, 153, 155-165 e 167-172, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41, 42, 47, 77-151, 154-165 e 168-170, em que a enzima ou proteína expansina compreende uma enzima ou proteína expansina parcialmente purificada.

[829] A modalidade 175 é o método de qualquer uma das modalidades 17-32, 60-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-172, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 69-151, 153 155-165 e 167-172, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41, 42, 47, 77-151, 154-165 e 168-170, em que a enzima ou proteína expansina compreende uma enzima ou proteína expansina substancialmente purificada.

[830] A modalidade 176 é o método de qualquer uma das modalidades 17-32, 60-68, 70, 77-152, 155-166, e 168-175, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 69-151, 153 , 155-165 e 167-175, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41, 42, 47, 77-151, 154-165, 168-170 e 173-175, em que a enzima ou proteína expansina não compreende enzima ou proteína expansina ligada a exósporo de um membro da família Bacillus cereus.

[831] A modalidade 177 é o método, a semente ou a composição da modalidade 176, em que a enzima ou proteína expansina não está ligada ao exósporo de um esporo membro da família Bacillus cereus intacta.

[832] A modalidade 178 é o método de qualquer uma das modalidades 17-32, 60-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-177, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 69-151, 153, 155-165 e 167-177, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41, 42, 47, 77-151, 154-165, 168-170 e 173-177, em que a enzima ou proteína expansina compreende enzima ou proteína expansina que é imobilizada em uma matriz ou um suporte.

[833] A modalidade 179 é o método, a semente ou a composição da modalidade 178, em que a matriz ou o suporte compreende carvão, biocarvão, nanocarbono, agarose, alginato, celulose, um derivado de celulose, sílica, plástico, aço inoxidável, vidro, poliestireno, uma cerâmica, dolomite, uma argila, terra de diatomáceas, talco, um polímero, uma goma, um material dispersável em água ou uma combinação de qualquer dos mesmos.

[834] A modalidade 180 é o método, a semente ou a composição da modalidade 178 ou 179, em que imobilizar a enzima ou proteína expansina na matriz ou no suporte resulta em uma liberação mais lenta da enzima ou proteína expansina no ambiente ou na planta ou na semente da planta em comparação com a taxa de liberação para a mesma enzima não imobilizada ou proteína expansina sob as mesmas condições.

[835] A modalidade 181 é o microrganismo recombinante de qualquer uma das modalidades 13, 14 e 51-56, a formulação de qualquer uma das modalidades e realização 15 e 51-56, o método de qualquer uma das modalidades 17-20, 33-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-172, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 37-40, 48-59, 77-151, 153, 155-165 e 167 -172, ou a composição de qualquer uma das modalidades 34-59, 77-151, 154-165 e 168-172, em que a enzima ou proteína expansina é expressada no microrganismo recombinante sob o controle de um promotor constitutivo.

[836] A modalidade 182 é o microrganismo recombinante de qualquer uma das modalidades 13, 14 e 51-56, a formulação de qualquer uma das modalidades e realização 15 e 51-56, o método de qualquer uma das modalidades 7-20, 33-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-172, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 37-40, 48-59, 77-151, 153, 155-165 e 167 -172, ou a composição de qualquer uma das modalidades 34-59, 77-151, 154-165 e 168-172, em que a enzima ou proteína expansina é expressada no microrganismo recombinante sob o controle de um promotor indutível.

[837] A modalidade 183 é o microrganismo recombinante de qualquer uma das modalidades 13, 14, 51-56, 181 e 182, a formulação de qualquer uma das modalidades 15, 51-56, 181 e 182, o método de qualquer uma das modalidades 17-20, 33-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166, 168-172, 181 e 182, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 37-40, 48-59, 77-151, 153, 155-165, 167-172, 181 e 182, ou a composição de qualquer uma das modalidades 43-59, 77-151, 154-165, 168-172, 181 e 182, em que o microrganismo recombinante compreende uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Paenibacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, um fungo do gênero Penicillium, uma bactéria do gênero Glomus, uma bactéria do gênero Pseudomonas, uma bactéria do gênero Arthrobacter, uma bactéria do gênero Paracoccus, uma bactéria do gênero Rhizobium, uma bactéria do gênero BradyRhizobium, uma bactéria do gênero Azosprillium, uma bactéria do gênero Enterobacter, uma bactéria do gênero Escherichia, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[838] A modalidade 184 é o método de qualquer uma das modalidades 49-51, 53, 57-68, 70 e 77-152, 155-166, 168-172 e 181-183 ou a semente de qualquer uma das modalidades 49-51, 53, 57-59 e 77-151, 153, 155-165, 167-172 e 181-183, ou a composição de qualquer uma das modalidades 49-51, 53, 57-59, 77- 151, 154-165, 168-172 e 181-183, em que o microrganismo recombinante formador de esporos compreende uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Paenibacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, um fungo do gênero Penicillium, um fungo do gênero Glomus, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[839] A modalidade 185 é o microrganismo recombinante de qualquer uma das modalidades 13, 14, 51-56 e 181-183, a formulação de qualquer uma das modalidades 15, 51-56 e 181-183, o método de qualquer uma das modalidades 17-20, 33-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166, 168-172 e 181183, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 37-40, 48-59, 77-151, 153, 155-165, 167-172 e 181-183, ou a composição de qualquer uma das modalidades 43-59, 77-151, 154-165, 168-172 e 181-183, em que o microrganismo recombinante compreende uma bactéria do gênero Bacillus, uma bactéria do gênero Paenibacillus, uma bactéria do gênero Lysinibacillus, ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[840] A modalidade 186 é o microrganismo recombinante, a formulação, o método, a semente ou a composição da modalidade 185, em que o microrganismo recombinante compreende Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus aryabbattai, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus flexus, Bacillus nealsonii, Bacillus pumulis, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus sphericus, Lysinibacillus fusiformis, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[841] A modalidade 187 é o microrganismo recombinante, formulação, o método, a semente ou a composição da modalidade 186, em que o microrganismo recombinante compreende Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus pseudomicidos, Lysinibacillus macroides, Lysinibacillus sphericus, Lysinibacillus fusiformis, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[842] A modalidade 188 é o microrganismo recombinante de qualquer uma das modalidades 13, 14, 51-56 e 181-187, a formulação de qualquer uma das modalidades 15, 51-56 e 181-187, o método de qualquer uma das modalidades 17-20, 33-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166, 168-172 e 181187, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 37-40, 48-59, 77-151, 153, 155-165, 167-172 e 181-187, ou a composição de qualquer uma das modalidades 43-59, 77-151, 154-165, 168-172 e 181-187, em que o microrganismo recombinante compreende uma cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas, uma cepa endofítica de bactérias ou uma cepa de bactérias que é promotora de crescimento de planta e endofítica.

[843] A modalidade 189 é o microrganismo recombinante de qualquer uma das modalidades 13, 14, 51-56 e 181-188, a formulação de qualquer uma das modalidades 15, 51-56 e 181-188, o método de qualquer uma das modalidades 17-20, 33-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166, 168-172 e 181- 188, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 37-40, 48-59, 77-151, 153, 155-165, 167-172 e 181-188, ou a composição de qualquer uma das modalidades 43-59, 77-151, 154-165, 168-172 e 181-188, em que o microrganismo recombinante é inativado.

[844] A modalidade 190 é a enzima de qualquer uma das modalidades 1, 2, 5-8, 51-56, o microrganismo recombinante de qualquer uma das modalidades 13, 14, 51-56, 181-183 e 185-189, a formulação de qualquer uma das modalidades 15, 51-56, 181-183 e 185-189, o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168- 189, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 37-40, 48-59, 69-151, 153, 155-165 e 167-189, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59, 77151, 154-165, 168-172 e 181-189, em que a enzima compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de uma sequência de tipo selvagem da mesma enzima, e em que a substituição de aminoácidos resulta em atividade aumentada da enzima em comparação com a atividade enzimática da enzima do tipo selvagem sob as mesmas condições.

[845] A modalidade 191 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-190, em que as plantas cresceram na presença da enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo exibe crescimento aumentado em comparação com plantas crescidas na ausência da enzima, da proteína expansina ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[846] A modalidade 192 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-191, em que as sementes às quais a enzima ou o microrganismo foi aplicada(o) exibem taxas de germinação aumentadas em comparação com as sementes para as quais a enzima ou o microrganismo não foi aplicada(o), sob as mesmas condições.

[847] A modalidade 193 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-192, em que as plantas cresceram na presença da enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo exibe maior absorção de nutrientes em comparação com plantas crescidas na ausência da enzima, da proteína expansina ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[848] A modalidade 194 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-193, em que as plantas cultivadas na presença da enzima ou do microrganismo exibem diminuição suscetibilidade a um patógeno em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[849] A modalidade 195 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-194, em que as plantas cultivadas na presença da enzima ou do microrganismo exibem suscetibilidade diminuída a um estresse ambiental em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[850] A modalidade 196 é o método da modalidade 195, em que o estresse ambiental compreende seca, inundação, calor, congelação, sal, metais pesados, pH baixo, pH alto ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[851] A modalidade 197 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-196, em que as plantas cresceram na presença da enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo exibe um conteúdo de nutrientes aumentado em comparação com plantas crescidas na ausência da enzima, da proteína expansina ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[852] A modalidade 198 é o método da modalidade 197, em que o nutriente compreende um polissacarídeo, uma proteína, ácido fítico, um fosfato, um fosfolipídio ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[853] A modalidade 199 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-198, em que as plantas cultivadas na presença da enzima ou do microrganismo exibem nodulação da raiz aumentada em comparação com plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[854] A modalidade 200 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-199, em que as plantas cultivadas na presença da enzima ou do microrganismo exibem amadurecimento dos frutos mais lento em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[855] A modalidade 201 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-200, em que as plantas cultivadas na presença da enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo exibe maior rendimento de colheita quando comparado com plantas crescidas na ausência da enzima, da proteína expansina ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[856] A modalidade 202 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-201, em que as plantas cultivadas na presença da enzima ou do microrganismo apresentam senescência foliar alterada em comparação com as plantas cultivadas na ausência da enzima ou do microrganismo, sob as mesmas condições.

[857] A modalidade 203 é o método de qualquer uma das modalidades 17-36, 48-68, 70, 77-152, 155-166 e 168-202, em que o método compreende aplicar a enzima, a proteína expansina, ou o microrganismo em uma formulação compreendendo um carreador agricolamente aceitável.

[858] A modalidade 204 é a formulação de qualquer uma das modalidades 15, 51-56, 181-183, e 185-190, o método de qualquer uma das modalidades 24-27, 30, 60-68, 77-152, 155 -166 e 168-203, ou a semente de qualquer uma das modalidades 16, 76-151, 153, 155-165 e 167-190, ou a composição de qualquer uma das modalidades 47-59, 77-151, 154-165, 168172 e 181-190, em que o carreador agricolamente aceitável compreende um dispersante, um tensoativo, um aditivo, água, um espessante, um agente antiaglomerante, um produto de quebra de resíduos, uma formulação de compostagem, uma aplicação granular, terra de diatomáceas, um óleo, um agente de coloração, um estabilizador, um conservante, um polímero, um revestimento ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[859] A modalidade 205 é a formulação, o método, a semente ou a composição da modalidade 204, em que o carreador agricolamente aceitável compreende um aditivo, e o aditivo compreende um óleo, uma goma, uma resina, uma argila, um polioxietilenoglicol, um terpeno, um orgânico viscídico, um éster de ácido graxo, um álcool sulfatado, um sulfonato de alquila, um sulfonato de petróleo, um sulfato de álcool, um alquil butano diamato de sódio, um poliéster de tiobutano dioato de sódio, um derivado de benzeno acetonitrila, um material proteináceo ou uma combinação de qualquer um dos mesmos; o carreador agricolamente aceitável compreende um espessante, e o espessante compreende um alquilssulfonato de cadeia longa de polietileno glicol, um oleato de polioxietileno, ou uma combinação de qualquer dos mesmos; o carreador agricolamente aceitável compreende um tensoativo, e o tensoativo compreende um óleo de petróleo pesado, um destilado de petróleo pesado, um éster de ácido graxo de poliol, um éster de ácido graxo polietoxilado, um aril alquil polioxietileno glicol, um acetato de alquil amina, um alquil aril sulfonato, um álcool poli-hídrico, um fosfato de alquila ou uma combinação de qualquer dos mesmos; ou o carreador agricolamente aceitável compreende um agente antiaglomerante e o agente antiformção de torta compreende um sal de sódio, um carbonato de cálcio, terra de diatomáceas ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[860] A modalidade 206 é a formulação, o método, a semente ou a composição da modalidade 204, em que o tensoativo compreende um tensoativo não iônico.

[861] A modalidade 207 é a formulação, o método, a semente ou a composição da modalidade 205, em que o aditivo compreende um material proteináceo, e o material proteináceo compreende um produto lácteo, farinha de trigo, farinha de soja, sangue, albumina, gelatina, farelo de alfafa, extrato de levedura ou uma combinação de quaisquer dos mesmos; ou o agente antiaglomerante compreende um sal de sódio, e o sal de sódio compreende um sal de sódio de monometil naftaleno sulfonato, um sal de sódio de dimetil naftaleno sulfonato, um sulfito de sódio, um sulfato de sódio ou uma combinação de qualquer dos mesmos.

[862] A modalidade 208 é a formulação de qualquer uma das modalidades 15, 51-56, 181-183, 185-190, e 204-207, o método de qualquer uma das modalidades 24-27, 30, 60-68, 77 -152, 155-166 e 168-207, a semente de qualquer uma das modalidades 16, 76-151, 153, 155-165 e 167-190 e 204207, ou a composição de qualquer uma das modalidades 47-59, 77-151, 154165, 168-172 e 181-190, e 204-207, em que o carreador aceitável em agricultura compreende vermiculita, carvão vegetal, lama da prensa de carbonatação da fábrica de açúcar, casca de arroz, carboximetil celulose, turfa, perlita, areia fina, carbonato de cálcio, farinha, alúmen, um amido, talco, polivinil pirrolidona ou uma combinação de qualquer dos mesmos.

[863] A modalidade 209 é a formulação de qualquer uma das modalidades 15, 51-56, 181-183, 185-190, e 204-208, o método de qualquer uma das modalidades 24-27, 30, 60-68, 77 -152, 155-166 e 168-208, ou a semente de qualquer uma das modalidades 16, 76-151, 153, 155-165 e 167-190 e 204208, ou a composição de qualquer uma das modalidades 47-59, 77-151, 154165, 168-172 e 181-190 e 204-208, em que a formulação ou composição compreende uma formulação ou composição de revestimento de sementes, uma formulação ou composição líquida para aplicação a plantas ou um meio de crescimento de plantas, ou uma formulação ou composição sólida para aplicação a plantas ou a um meio de crescimento de plantas.

[864] A modalidade 210 é a formulação, o método, a semente ou composição da modalidade 209, em que a formulação ou a composição de revestimento de sementes compreende uma solução aquosa ou à base de óleo para aplicação em sementes ou uma formulação em pó ou granular para aplicação em sementes.

[865] A modalidade 211 é a formulação, o método, a semente ou a composição da modalidade 209, em que a formulação ou a composição líquida para aplicação a plantas ou a um meio de crescimento de plantas compreende uma formulação ou composição concentrada ou uma formulação ou composição pronta para uso.

[866] A modalidade 212 é a formulação, o método, a semente ou a composição da modalidade 209, em que a formulação ou composição sólida para aplicação a plantas ou a um meio de crescimento de plantas compreende uma formulação ou composição granular ou um agente em pó.

[867] A modalidade 213 é a formulação de qualquer uma das modalidades 15, 51-56, 181-183, 185-190, e 204-212, o método de qualquer uma das modalidades 203-212, ou a semente de qualquer um dos modalidades 16, 76-151, 153, 155-165 e 167-190 e 204-212, em que a formulação compreende ainda um agroquímico; o método de qualquer uma das modalidades 324-27, 30, 60-68, 77-152, 155-166 e 168-212, em que o método compreende ainda a aplicação de um agroquímico ao meio de crescimento de plantas, a planta, a semente da planta ou a área que circunda a planta ou a semente da planta; ou a composição de qualquer uma das modalidades 47-59, 77-151, 154-165, 168172 e 181-190, e 204-212, em que o agroquímico compreende um fertilizante, um material fertilizante de micronutrientes, um inseticida, um nematicida, um herbicida, uma emenda de crescimento de planta, um fungicida, um inseticida, um moluscicida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico, um hormônio de planta ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[868] A modalidade 214 é a formulação, o método, a semente ou a composição da modalidade 213, em que o inoculante bacteriano compreende uma cepa de bactérias promotoras de crescimento de plantas, uma cepa de bactérias endofíticas ou uma cepa de bactérias que é promotora crescimento de plantas e endofítica.

[869] A modalidade 215 é o microrganismo recombinante, o método, a semente ou a composição da modalidade 188 ou da formulação, do método, da semente ou da composição da modalidade 214, em que a cepa de bactérias produz uma toxina inseticida, produz um composto fungicida, produz um composto nematicida, produz um composto bactericida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos que se replicam livremente, liga-se às raízes das plantas, coloniza as raízes das plantas, forma biopelículas, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos ou uma combinação dos mesmos.

[870] A modalidade 216 é o microrganismo, a formulação, o método, a semente ou a composição recombinante da modalidade 215, em que a toxina inseticida compreende uma toxina Cry; em que o composto fungicida compreende uma β-1,3-glucanase, uma quitosanase, uma liticase ou sua combinação das mesmas; ou em que o composto nematicida compreende uma toxina Cry.

[871] A modalidade 217 é o microrganismo, a formulação, o método, a semente ou a composição recombinante de qualquer uma das modalidades 214-216, em que a cepa compreende Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL No B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL No B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL No B-50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL No B- 50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL No B-50921), Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL No B-50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL No NRRL B- 50821), Bacillus mycoides EE118 (NRRL No B-50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL No B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL No B-50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL No B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No B- 50922), membro da família de Bacillus cereus EE128 (NRRL No B-50917), Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL No B-50923), membro da família de Bacillus cereus EE349 (NRRL No B-50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL No B- 50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL No B-50925), membro da família de Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE- B00366 (NRRL B-67120), Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), or Bacillus thuringiensis EE- B00184 (NRRL B-67122), Bacillus mycoides EE116 (NRRL No B-50919), membro da família de Bacillus cereus EE417 (NRRL No B-50974), Bacillus subtilis EE442 (NRRL No B-50975), Bacillus subtilis EE443 (NRRL No B-50976), membro da família de Bacillus cereus EE444 (NRRL No B-50977), Bacillus subtilis EE405 (NRRL No B-50978), membro da família de Bacillus cereus EE439 (NRRL No B-50979), Bacillus megaterium EE385 (NRRL No B-50980), membro da família de Bacillus cereus EE387 (NRRL No B-50981), Bacillus circulans EE388 (N RRL No B-50982), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL No B-50983), membro da família de Bacillus cereus EE377 (NRRL No B-67119), Bacillus mycoides EE363 (NRRL No B-67121), Bacillus pseudomycoides EE366 (NRRL No B-67120), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No B-50924), ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[872] A modalidade 218 é a formulação, o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 213-217, em que o agroquímico compreende um fertilizante, e o fertilizante compreende um líquido ou um fertilizante seco; em que o agroquímico compreende um fertilizante, e o fertilizante compreende um líquido ou fertilizante seco, em que o agroquímico compreende um material fertilizante de micronutrientes compreende ácido bórico, um borato, uma frita de boro, sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um tetraborato de sódio deca-hidratado, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, um sulfato de ferro e amônio, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, ácido molibdico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, um frita de zinco, fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação de quaisquer dos mesmos; em que o agroquímico compreende um inseticida, e o inseticida compreende um organofosfato, um carbamato, um piretróide, um acaricida, um alquil ftalato, ácido bórico, um borato, um fluoreto, enxofre, uma ureia substituída haloaromática, um éster de hidrocarboneto, um inseticida de base biológica, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos; em que o agroquímico compreende um herbicida, e o herbicida compreende um composto clorofenoxi, um composto nitrofenólico, um composto nitrocresólico, um composto dipiridila, uma acetamida, um ácido alifático, um anilida, uma benzamida, um ácido benzoico, um derivado de ácido benzoico, ácido anísico, um derivado de ácido anísico, uma benzonitrila, dióxido de benzotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, cloropiridinila, um derivado de ciclohexenona, um derivado de dinitroaminobenzeno, um composto fluorodinitrotoluidina, isoxazolidinona, ácido nicotínico, isopropilamina, um derivado de isopropilamina, oxadiazolinona, um fosfato, um ftalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazol, um uracila, um derivado de ureia, endotal, clorato de sódio ou uma combinação de quaisquer dos mesmos; em que o agroquímico compreende um fungicida, e o fungicida compreende um benzeno substituído, um tiocarbamato, um bisditiocarbamato de etileno, uma tioftalidamida, um composto de cobre, um composto organomercúrio, um composto organoestanho, um composto de cádmio, anilazina, benomil, ciclohexamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxil, tiamimefon, triforina, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos; em que o agroquímico compreende um inoculante fúngico e o inoculante fúngico compreende um inoculante fúngico da família Glomeraceae, um inoculante fúngico da família Claroidoglomeraceae, um inoculante fúngico da família Gigasporaceae, um inoculante fúngico da família Acaulosporaceae, um inoculante fúngico da família Sacurusporaceae, um inoculante fúngico da família Entrophosporaceae, um inoculante fúngico da família Pacidsporaceae, um inoculante fúngico da família Diversisporaceae, um inoculante fúngico da família Paraglomeraceae, um inoculante fúngico da família Archaeosporaceae, um inoculante fúngico da família Geosiphonaceae, um inoculante fúngico da família Ambisporaceae, um inoculante fúngico da família Scutellosporaceae, um inoculante fúngico da família Dentiscultataceae, um inoculante fúngico da família Racocetraceae, um inoculante fúngico do filo Basidiomycota, um inoculante fúngico do filo Ascomycota, um fungo inoculante do filo Zygomycota, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos; ou em que o agroquímico compreende um inoculante bacteriano e o inoculante bacteriano compreende um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Bradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inoculante bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospirillium, um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, um inoculante bacteriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gênero Paenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um inoculante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do gênero Alcaligenes, um inoculador bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um inoculante bacteriano do Gênero Gliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[873] A modalidade 219 é o método de qualquer uma das modalidades 32, 61, 62, 166 e 168-170, a semente de qualquer uma das modalidades 167-170, ou a composição de qualquer uma das modalidades 4159, 77 -151, 154-165, 168-172, 181-190 e 204-218, em que o fertilizante compreende um líquido ou um fertilizante seco.

[874] A modalidade 220 é o método de qualquer uma das modalidades 32, 61, 62, 166 e 168-170, e 219, a semente de qualquer uma das modalidades 167-170 e 219, ou a composição de qualquer uma das modalidades 41-59, 77-151, 154-165, 168-172, 181-190 e 204-219, em que o fertilizante compreende um material fertilizante de micronutrientes e o material fertilizante de micronutrientes compreende ácido bórico, um borato, uma frita de boro, um sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um tetraborato de sódio decahidratado, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, sulfato de ferro e amônio, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, ácido molibdico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[875] A modalidade 221 é a formulação, o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 213-218, em que o agroquímico compreende um fungicida, e o fungicida compreende aldimorfh, ampropylfos, ampropylfos potássico, andoprim, anilazina, azaconazol, azoxistrobina, benalaxil, benodanil, benomil, benzamacril, benzamacrilisobutil, bialafos, binapacril, bifenil, bitertanol, blasticidina S, boscalida, bromuconazol, bupirimato, butiobato, polisssulfito de cálcio, capsimicina, captafol, captan, carbendazim, carvone, quinometionato, clobentiazona, clorfenazol, cloroneb, cloropicrina, clorotalonil, clozolinato, clozilacon, cufraneb, cimoxanil, ciproconazol, ciprodinil, ciprofuram, debacarb, diclorofeno, diclobutrazol, diclofluanida, diclomezina, diclorano, dietofencarb, dimetirimol, dimetomorfe, dimoxistrobina, diniconazol, diniconazol-M, dinocape, difenilamina, dipiritiona, ditalimfos, ditianona, dodemorf, dodina, drazoxolon, edifenfos, epoxiconazol, etaconazol, etirimol, etridiazol, famoxadon, fenapanil, fenarimol, fenbuconazol, fenfuram, fenitropano, fenpiclonil, fenpropidina, fenpropimorfo, acetato de fentina, hidróxido de fentina, ferbam, ferimzona, fluazinam, flumetover, fluoromida, fluquinconazol, flurprimidol, flusilazol, flusulfamida, flutolanil, flutriafol, folpete, fosetil alumínio, fosetil sódio, ftalida, fuberidazol, furalaxil, furametpir, furcarbonil, furconazol, furconazol-cis, furmeciclox, guazatina, hexaclorobenzeno, hexaconazol, himexazol, imazalil, imibenconazol, iminoctadina, iminoctadina alvesilato, triacetato de iminoctadina, iodocarb, iprobenfos (IBP), iprodiona, irumamicina, isoprotiolano, isovalediona, casugamicina, cresoxim-metílico, preparações de cobre, tais como: hidróxido de cobre, naftenato de cobre, oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, óxido de cobre, oxina-cobre e mistura bordeau, mancobre, mancozeb, maneb, meferimzona, mepanipirim, mepronil, metconazol, metassulfocarb, methfuroxam, metiram, metomeclam, metsulfovax, mildiomicina, miclobutanil, miclozolin, dimetilditiocarbamato de níquel, nitrotal- isopropil, nuarimol, ofurace, oxadixil, oxamocarb, ácido oxolínico, oxicarboxim, oxifentiina, paclobutrazol, pefurazoato, penconazol, pencicuron, fosdifen, pimaricina, piperalina, polioxina, polioxorim, probenazol, procloraz, procimidona, propamocarb, propanosina sódica, propiconazol, propineb, protiocinazol, pirazofos, pirifenox, pirimetanil, piroquilon, piroxifur, quinconazol, quintozeno (PCNB), enxofre e preparações de enxofre, tebuconazol, tecloftalam, tecnazeno, tetciclasis, tetraconazol, tiabendazol, ticiofeno, tifluzamida, tiofanato metílico, tioximida, tolclofos metílico, tolifluanida, triadimefon, triadimenol, triazbutil, triazóxido, triclamida, triciclazol, tridemorfe, trifloxistrobina, triflumizol, triforina, uniconazol, validamicina A, vinclozolina, viniconazol, zarilamida, zinebe, zirame e também Dagger G, OK-8705, OK-8801, a-(1,1-dimetiletil)-(3-(2-fenoxietil)-1H- 1,2,4-triazol-1-etiol, a-(2,4-diclorofenil)-[3-fluoro-3-propil-1H-1,2,4-triazol-1- etanol, a-2,4-diclorofenil)-[3-metoxi-a-metil-1H-1,2,4-triazol e -1-etanol, a-(5- metil-1,3-dioxan-5-il)-[3-[[4-(trifluorometil)-fenil]-metileno]-1H-1,2,4-triazol-1- etanol, (5RS,6RS)-6-hidroxi-2,2,7,7-tetrametil-5-(1H-1,2,4-triazol-1-il)-3- octanona, (E)-a-(metoxiimino)-N-metil-2-fenoxi-fenilacetamida, 1-isopropil{2- metil-1-[[[1-(4-metilfenil)-etil]-amino]-carbonil]-propil}carbamato, 1-(2,4- diclorofenil)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-il)-etanona-O-(fenilmetil)-oxima, 1-(2-metil-1- naftalenil)-1H-pirrol- 2,5-diona, 1-(3,5-diclorofenil)-3-(2-propenil)-2,5- pirrolidindiona, 1-[(diiodometil)-sulfonil]-4-metil-benzeno, 1-[[2-(2,4-diclorofenil)- 1,3-dioxolan-2-il]-metil]-1H-imidazol, 1-[[2-(4- clorofenil)-3-feniloxiranil]-metil]- 1H-1,2,4-triazol, 1-[1-[2-[(2,4-diclorofenil)-metoxi]-fenil]-etenil]-1H-imidazol, 1- metil-5-nonil-2-(fenilmetil)-3-pirrolidinol, 2’,6’-dibromo-2-metil-4’- trifluorometoxi- 4’-trifluorometil-1,3-tiazol-carboxililida, 2,2-dicloro-N-[1-(4-clorofenil)-etil]-1-etil-3- metil-ciclopropanocarboxamida, 2,6-dicloro-5-(metiltio)-4-pirimidinil-tiocianato, 2,6-dicloro-N-(4- trifluorometilbenzil)-benzamida, 2,6-dicloro-N-[[4- (trifluorometil)-fenil]-metil]-benzamida, 2-(2,3,3-triiodo-2-propenil)-2H-tetrazol, 2- [(1-metiletil)-sulfonil]-5-(triclorometil)-1,3,4-tiadiazol, 2-[[6-desoxi-4-O-(4-0-metil- (3-D-glicopiranosil)-A-glucopiranosil]-amino]-4-metoxi-1H-pirrol[2,3-d]pirimidina- 5-carbonitrila, 2-aminobutano, 2-bromo-2-(bromometil)-pentanodinitrila, 2-cloro- N-(2,6-dimetilfenil)-N-(isotiocianatometil)-acetamida, 2-fenilfenol (OPP), 3,4- dicloro-1-[4-(difluorometoxi)-fenil]-pirrol-2,5-diona, 3,5-dicloro-N- [ciano[(1-metil- 2-propinil)-oxi]-metil]-benzamida, 3-(1,1- dimetilpropil-1-oxo-1H-indeno-2- carbonitrila, 3-[2-(4-clorofenil)-5-etoxi-3-isoxazolidinil]-piridina, 4-cloro-2-ciano- N,N-dimetil-5-(4-metilfenil)-1H-imidazol-1-sulfonamida, 4-metil-tetrazol[1,5- a]quinazolin-5(4H)-ona, 8-(1,1-dimetiletil)-N-etil-N-propil-1,4- dioxaspiro[4,5]decano-2-metanamina, 8-hidroxiquinolina sulfato, hidrazida 9H- xanteno-2-[(fenilamino)-carbonil]-9-carboxílica, bis-(1-metiletil)-3-metil-4-[(3- metilbenzoil)-oxi]-2,5-tiofenodicarboxilato, cis-1-(4-clorofenil)-2-(1H-1,2,4-triazol- 1-il)-ciclo-heptanol, cloridrato de cis-4-[3-[4-(1,1- dimetilpropil)-fenil-2- metilpropil]-2,6-dimetil-morfolina, [(4-clorofenil)-azo]-cianoacetato de etila, bicarbonato de potássio, sal de sódio de metanetretratiol, 1-(2,3-di-hidro-2,2- dimetil-inden-1-il)-1H-imidazol-5-carboxilato de metila, N-(2,6-dimetilfenil)-N-(5- isoxazolilcarbonil)-DL-alaninato de metila, N-(cloroacetil)-N-(2,6-dimetilfenil)-DL- alaninato de metila, N-(2,3-dicloro-4-hidroxifenil)-1-metil-ciclo- hexanocarboxamida, N-(2,6-dimetilfenil)-2-metoxi-N-(tetra- hidro-2-oxo-3- furanil)-acetamida, N-(2,6-dimetilfenil)-2-metoxi-N-(tetra-hidro-2-oxo-3-tienil)- acetamida, N-(2-cloro-4-nitrofenil)-4-metil-3-nitro-benzeno-sulfonamida, N-(4- ciclo-hexilfenil)-1,4,5,6-tetra-hidro-2-pirimidinamina, N-(4-hexilfenil)-1,4,5,6- tetra-hidro-2-pirimidinamina, N-(5-cloro-2-metilfenil)-2-metoxi-N-(2-oxo-3- oxazolidinil)-acetamida, N-(6-metoxi)-3-piridinil)-ciclopropanocarboxamida, N- [2,2,2-tricloro-1-[(cloroacetil)-amino]-etil]-benzamida, N-[3-cloro-4,5-bis(2- propiniloxi)-fenil]-N’-metoxi-metanimidamida, Sal de sódio de N-formil-N-hidroxi- DL-alanina, [2-(dipropilamino)-2-oxoetil]-etilfosforamidotioato de 0,0-dietila, 0- metil S-fenil fenilpropilfosforamidotioato, 1,2,3-benzotiadiazol-7-carbotioato de S-metila, e espiro[2H]-1-benzopirano-2,1’(3’H)-isobenzofuran]-3’-ona, N- triclorometil)tio-4- ciclo-hexano-1,2-dicarboximida, diamida tetrametiltioperoxidicarbônica, N-2,6-dimetilfenil)-N-(metoxiacetil)-DL-alaninato de metila, 4-(2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-4-il)-1H-pirrol-3-carbonitrila, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[876] A modalidade 222 é a formulação, método, semente ou composição de qualquer uma das modalidades 213-218 e 221, em que o agroquímico compreende um inoculante bacteriano do gênero Bacillus e o inoculante bacteriano do gênero Bacillus compreende Bacillus argri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus, Bacillus endorthmos, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus lentimorbus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus medusa, Bacillus metiens Bacillus natto, Bacillus nigrificans, Bacillus popillae, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus sphearicus, subespéc. Bacillus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatu, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[877] A modalidade 223 é a formulação, o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 213-218, 221 e 222, em que o agroquímico compreende um herbicida, e o herbicida compreende 2,4-D, 2,4- DB, acetocloro, acifluorfen, alacloro, ametrina, atrazina, aminopiralide, benefina, bensulfuron, bensulida, bentazona, bromacil, bromoxinil, butilato, carfentrazona, clorimuron, clorsulfuron, cletodim, clomazone, clopiralid, cloransulam, cicloato, DCPA, desmedifam, dicamba, diclobenil, diclofop, diclosulam, diflufenzopir, dimetenamida, diquat, diuron, DSMA, endotal, EPTC, etalfluralina, etofumesato, fenoxaprop, fluazifop-P, flucarbazona, flufenacete, flumetsulam, flumiclorac, flumioxazina, fluometuron, fluroxipir, fomesafen, foramsulfuron, glufosinato, glifosato, halosulfuron, hexazinona, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazaquin, imazetapir, isoxabeno, isoxaflutol, lactofen, linuron, MCPA, MCPB, mesotriona, metolacloro-s, metribuzina, metssulfuron, molinato, MSMA, napropamida, naptalam, nicossulfuron, norflurazon, orizalina, oxadiazon, oxifluorfen, paraquat, ácido pelargônico, pendimetalina, fenmedifam, picloram, primisulfuron, prodiamina, prometrina, pronamida, propanil, prossulfuron, pirazon, piritiobac, quinclorac, quizalofop, rimssulfuron, setoxidim, siduron, simazina, sulfentrazona, sulfometuron, sulfosulfuron, tebutiuron, terbacil, tiazopir, tifenssulfuron, tiobencarb, tralcoxidim, trialato, triassulfuron, tribenuron, triclopir, trifluralina, triflussulfuron, ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[878] A modalidade 224 é o método de qualquer uma das modalidades 32, 61, 62, 166 e 168-170, 219 e 220, a semente de qualquer uma das modalidades 167-170, 219 e 220, a composição de qualquer uma das modalidades 41-59, 77-151, 154-165, 168-172, 181-190 e 204-220, ou a formulação, o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades e 213-223, em que o fertilizante compreende sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato e sulfato de amônio, cloreto de amônio, bissulfato de amônio, polissulfeto de amônio, tiossulfato de amônio, amônia aquosa, amônia anidra, polifosfato de amônio, sulfato de alumínio, nitrato de cálcio, nitrato de amônio e cálcio, sulfato de cálcio, magnesita calcinada, calcário calcítico, óxido de cálcio, nitrato de cálcio, calcário dolomítico, cal hidratada, carbonato de cálcio, difosfato de amônio, monofosfato de amônio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio e potássio, sulfato de potássio, nitratos de sódio, calcário magnesiano, magnésia, ureia, ureia-formaldeídos, nitrato de amônio de ureia, ureia revestida com enxofre, ureia revestida com polímero, isobutilideno diureia, K2SO4-2MgSO4, cainita, silvinita, Kieserite, sais de Epsom, enxofre elementar, marga, conchas de ostras moídas, farelo de peixe, tortas de prensa, estrume de peixe, farelo de sangue, fosfato de rocha, super fosfatatos, escória, farelo de osso, cinza de madeira, estrume, guano de morcego, musgo de turfeira, compostagem, areia verde, farelo de semente de algodão, farelo de penas, farelo de caranguejo, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[879] A modalidade 225 é a formulação, o método, a semente ou a composição de qualquer uma das modalidades 213-224, em que o hormônio de planta compreende uma giberelina, uma auxina, uma cinetina ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

[880] A modalidade 226 é o método de qualquer uma das modalidades 17-22, 25-46, 48-68, 70 e 77-152, 155-166 e 167-225, compreendendo ainda suplementar o meio de crescimento de plantas com um substrato para uma enzima.

[881] A modalidade 227 é o método da modalidade 226, em que o substrato compreende triptofano, um monofosfato de adenosina, um difosfato de adenosina, um trifosfato de adenosina (por exemplo, adenosina-3-trifosfato), um polifosfato, um farelo de proteína, um trimetafosfato, uma celulose, uma metilcelulose, uma quitina, um quitosano, um derivado de celulose, um fosfato, uma gordura, uma cera, um fosfolipídeo, um ácido fítico ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

[882] Em vista do exposto, será visto que os vários objetos da invenção são alcançados e outros resultados vantajosos alcançados.

[883] Como podem ser feitas várias alterações nas enzimas acima, organismos recombinantes, métodos e sementes, sem se afastar do escopo da invenção, pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima seja interpretada como ilustrativa e não em um sentido limitante.

Claims

1. MÉTODO PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DE PLANTAS E/OU PROMOVER A FITOSSANIDADE, caracterizado por compreender aplicar uma enzima livre a um meio de crescimento de planta, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta, em que a enzima é selecionada a partir de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma mananase, uma protease, uma glucanase não-celulolítica, uma xiloglucanase, uma liquenase ou uma ACC desaminase, em que: quando a enzima compreender uma mananase, o método compreende ainda a aplicação de uma fosfolipase, uma fosfatase ácida, ou uma xiloglucanase.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender aplicar a enzima livre a uma semente de planta, em que a enzima compreende uma glucanase não-celulolítica, e em que a aplicação da enzima à semente da planta compreende: (a) aplicar a enzima à semente da planta no momento do plantio; ou (b) revestir a semente da planta com a enzima.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender aplicar uma enzima livre a um meio de crescimento de planta, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta, em que a enzima compreende uma glucanase não- celulolítica.

4. MÉTODO PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO DE PLANTAS E/OU PROMOVER A FITOSSANIDADE, caracterizado por compreender aplicar uma enzima livre a um meio de crescimento de planta, uma planta, uma semente de planta ou uma área que circunda uma planta ou uma semente de planta, em que a enzima é selecionada a partir de uma fosfolipase, uma xilosidase, uma mananase, uma fosfatase ácida ou uma xiloglucanase, e em que o método compreende ainda aplicar um fertilizante ao meio de crescimento de planta, à planta, à semente da planta ou à área que circunda uma planta ou uma semente de planta.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 4, caracterizado pela aplicação da enzima ser ainda definida como: aplicar uma solução aquosa ou à base de óleo compreendendo a enzima; aplicar uma formulação em pó compreendendo a enzima; ou aplicar uma formulação granular compreendendo a enzima.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 4, caracterizado pela promoção da fitossanidade ser ainda definida como: aumento da taxa de germinação; aumento da germinação síncrona; diminuição da suscetibilidade a um patógeno; diminuição da suscetibilidade a um estresse ambiental; aumento do rendimento das culturas; aumento da nodulação radicular; ou aumento da absorção de nutrientes e/ou o conteúdo de nutrientes.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 4, caracterizado pela aplicação da enzima livre a um meio de crescimento vegetal, uma planta, uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou uma semente de planta compreender ainda a aplicação de um agroquímico ou um carreador agricolamente aceitável.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela aplicação da enzima livre a um meio de crescimento vegetal, uma planta, uma semente de planta ou uma área circunvizinha a uma planta ou a uma semente de planta compreender a aplicação de duas ou mais enzimas livres.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo agroquímico compreender um inseticida, um nematicida, um herbicida, um aditivo de crescimento de plantas, um fungicida, um moluscicida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico, um hormônio vegetal ou uma combinação dos mesmos.

10. SEMENTE DE PLANTA REVESTIDA com uma enzima livre, caracterizada pela enzima ser selecionada a partir de uma fosfolipase, uma lipase, uma xilanase, uma xilosidase, uma mananase, uma protease, uma glucanase não-celulolítica, uma xiloglucanase, uma liquenase, uma ACC desaminase, e combinações de quaisquer das mesmas, em que: quando a enzima compreender uma mananase, o revestimento da semente da planta compreende ainda uma fosfolipase, uma fosfatase ácida ou uma xiloglucanase.

11. SEMENTE, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pela enzima compreender uma glucanase não-celulolítica.

12. SEMENTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizada pelo revestimento da semente de planta compreender ainda um carreador agricolamente aceitável, um agroquímico adicional ou uma combinação dos mesmos.

13. SEMENTE, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo revestimento compreender duas ou mais enzimas livres.

14. SEMENTE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo agroquímico compreender um inseticida, um nematicida, um herbicida, um aditivo de crescimento de plantas, um fungicida, um moluscicida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico, um hormônio vegetal ou uma combinação dos mesmos.

15. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender: (a) um fertilizante e uma enzima livre, em que a enzima livre é selecionada a partir de uma fosfolipase, uma xilosidase, uma mananase, uma fosfatase ácida, uma xiloglucanase, em que quando a enzima compreender uma mananase, a composição compreende ainda uma fosfolipase, uma fosfatase ácida ou uma xiloglucanase; ou (b) um tensoativo e uma enzima livre, em que a enzima é selecionada de uma fosfolipase, uma quitosanase, uma protease, uma glucanase não-celulolítica, uma xiloglucanase ou uma ACC desaminase.

16. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender um fertilizante e uma fosfatase ácida ou uma fosfolipase, e compreender ainda um material fertilizante de micronutrientes, em que o material fertilizante de micronutrientes compreende um quelato.

17. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender um fertilizante e uma fosfatase ácida ou uma fosfolipase, e ainda compreender um conservante.

18. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fertilizante compreender nitrogênio, fosfato, potássio, zinco, ferro, selênio, boro, cobre, ácido bórico, um borato, uma frita de boro, sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um tetraborato de sódio deca- hidratado, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, sulfato de ferro amônio, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, ácido molibdico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação de quaisquer dos mesmos.

19. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender ainda um bioestimulante, um carreador agricolamente aceitável, um agroquímico adicional ou uma combinação dos mesmos.

20. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela enzima compreender a fosfolipase.

21. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pela fosfolipase compreender uma fosfolipase C, uma fosfolipase A, uma fosfolipase B, uma fosfolipase D ou uma combinação de quaisquer das mesmas.

22. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender duas ou mais enzimas livres.

23. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo agroquímico compreender um inseticida, um nematicida, um herbicida, um aditivo de crescimento de plantas, um fungicida, um moluscicida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico, um hormônio vegetal ou uma combinação dos mesmos.