CN108504582B

CN108504582B - 菌种及其筛选方法与在延缓叶片衰老中的应用

Info

Publication number: CN108504582B
Application number: CN201810338434.0A
Authority: CN
Inventors: 谭德冠; 张家明; 孙雪飘; 韩冰莹; 付莉莉; 马帅
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2038-04-16
Also published as: CN108504582A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及菌种及其筛选方法与在延缓叶片衰老中的应用。本发明提供了保藏编号为CGMCC No.15383的菌种，该菌种为来自橡胶树的内生真菌，经实验验证，能够延缓叶片衰老，将该菌种的发酵液添加入植物保存的基质，能够显著延长种质的保藏时间。实验表明，本发明提供的菌种能够显著提高微小无根萍在保存过程中的生物量、使其寿命延长七倍以上。

Description

菌种及其筛选方法与在延缓叶片衰老中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及菌种及其筛选方法与在延缓叶片衰老中的应用。

背景技术

叶片早衰是影响农作物产量的重要因素。在水稻、玉米、小麦、大豆、高粱、燕麦、木薯等作物中所做的大量实验结果表明，延缓叶片衰老可以延长叶片光合作用的时间，从而提高作物的产量和抵抗逆境的能力。作物本身可能会出现一些能保持叶片绿色的自然突变，有些突变体已被应用到作物育种中。通过系统筛选，已经获得了一些抗叶片早衰的高产品种，并实现商业化。抗衰老对于薯类作物也很重要。根据Cock等人的研究结果，木薯叶片寿命越长，块根产量越高，在叶片寿命为15～20周达到最理想的产量。然而，绝大多数木薯品种的叶片寿命远低于理想寿命。由于底部叶片过早衰老，植物需要消耗光合产物来产生新的叶片，取代衰老的叶片，因此，减少了向根部输送的能量，从而导致减产。关于调控叶片抗衰老的分子机制已有了许多综述。在利用自然突变体的同时，通过转基因技术将细胞分裂素合成酶基因转入植物也能延长叶片的寿命，并取得提高水稻和木薯产量的实验结果。另外，利用抗衰老的有益微生物(益生菌)可能也是延长叶片寿命的方法。然而，这方面的研究还很少。

浮萍是一种常见的水生植物，具有生长速度快，淀粉含量高，能分解、吸收、转化氮、磷和有机物，木质素含量极低以及纤维素较易转化为乙醇等诸多优点，在城市污水和农业、渔业废水处理以及生物质能源领域的应用前景广泛。因此，近年来，对浮萍科植物的研究越来越多。微小无根萍(Wolffia microscopica)是浮萍科植物37个物种中的1个种，也是目前已知最小的、生长最快的开花植物。这种植物原产于印度，在国内以无菌株系的形式离体保存在浮萍种质资源库中。其无菌株系在培养基中保存的时间较短，通常不超过一个月，否则会衰老死亡。一般通过每月继代培养一次的方法长期保存。其他浮萍物种则可以3个月左右继代培养一次。微小无根萍的这一特性可用来筛选抗衰老的微生物。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供菌种及其筛选方法与在延缓叶片衰老中的应用。本发明提供的菌种能够将叶片寿命延长7倍以上。

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.15383的菌种。

本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.15383的菌种在延缓叶片衰老中的应用。

本发明中，所述延缓叶片的衰老为延缓微小无根萍、木薯或橡胶的叶片衰老。

本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.15383的菌种在植物种质保存中的应用。

本发明中，所述植物种质保存的植物为微小无根萍、木薯或橡胶。

本发明还提供了延缓叶片衰老菌种的筛选方法，以微小无根萍为筛选模型植物。

本发明利用微小无根萍(学名为Wolffia microscopica)作为筛选模型植物，其利用了微小无根萍在MH培养基上存活时间短、容易早衰的特性；将待筛选的微生物与微小无根萍共培养，以不接种微生物的培养皿为对照。能使微小无根萍存活期显著延长的菌株为具有抗衰老活性的候选菌株。本发明采用该方法筛选获得了一株来自橡胶树的内生真菌，经实验证明能够将叶片寿命延长7倍以上，将其保藏于CGMCC，编号为CGMCC No.15383。

本发明中，所述筛选的培养基为MH培养基；所述筛选的温度为26℃；光照强度为2000lx。

本发明还提供了一种延缓叶片衰老的制剂，包括保藏编号为CGMCC No.15383的菌种发酵液。

所述延缓叶片衰老的制剂中还包括纯净水，其中，所述保藏编号为CGMCCNo.15383的菌种发酵液的体积分数为10％～30％。

所述菌种发酵液的制备方法为，将保藏编号为CGMCC No.15383的菌种接种至MH培养基，26℃发酵7-20天。

延缓植物叶片衰老的方法为，将所述菌种发酵液给予植物，所述给予的方式为叶面喷施、灌根。

本发明还提供了一种植物种质的保存基质，包括基础培养基和保藏编号为CGMCCNo.15383的菌种发酵液。

本发明中，所述植物为微小无根萍；所述基础培养基为MH培养基、E培养基、N培养基或SH培养基；所述菌种发酵液的体积分数为10％～30％。

所述植物种质保存基质的制备方法为：将保藏编号为CGMCC No.15383的菌种以液体MH培养基发酵培养1周以上，去除菌丝，将发酵液经灭菌后添加到已灭菌的MH培养基中至发酵液的体积分数为10％～30％，倒平板制得保存基质。

或者，所述植物种质保存基质的制备方法为：将保藏编号为CGMCC No.15383的菌种以液体MH培养基发酵培养1周以上，去除菌丝，将发酵液添加到MH培养基中至发酵液的体积分数为10％～30％，灭菌后倒平板制得保存基质。

本发明还提供了一种植物种质的保存方法，以本发明所述的保存基质保存植物种质。

本发明实施例中，所述植物种质保存的方法适用于微小无根萍、木薯或橡胶。

具体的，保存方法为：将微小无根萍接种至本发明所述的保存基质，26℃，2000lx光照培养。

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.15383的菌种，该菌种为来自橡胶树的内生真菌，经实验验证，能够具有延缓叶片衰老的作用，将该菌种的发酵液添加入植物保存的基质，能够显著延长种质的保藏时间。实验表明，本发明提供的菌种能够显著提高微小无根萍在保存过程中的生物量、使其寿命延长七倍以上。

生物保藏说明

生物材料：ITBB2-31；分类命名：Aspergillus sclerotiorum，已于2018年1月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.15383。

附图说明

图1示具有抗衰老活性的菌株CGMCC No.15383对微小无根萍培养寿命的影响；图中微小无根萍在种质资源库中的保存编号为2001；其中图1-A示微小无根萍在3种不同温度下单独培养(对照)与共培养的代表性培养皿；图1-B示对照与处理在三种温度下微小无根萍干物质重量的差异显著性测验；

图2示将抗衰老菌株CGMCC No.15383的发酵液加入MH培养基中培养微小无根萍株系2001和2008后30天的培养结果；其中，发酵液分别进行高温(121℃)灭菌(autoclaved),或者过滤灭菌(filter-sterilized)，然后按比例添加到MH培养基中；

图3示微小无根萍2001和2008在添加10％CGMCC No.15383发酵液的MH培养基(MH+FM)中培养7个月的存活情况，MH培养基为对照；

图4示CGMCC No.15383发酵液延缓木薯和橡胶树叶片衰老的作用，其中4-a示不同植物叶片经不同浓度发酵液处理后，在25℃黑暗培养15天后的情况，图4-b示不同叶片在上述处理后叶绿素浓度。

具体实施方式

本发明提供了菌种及其筛选方法与在延缓叶片衰老中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，微小无根萍2001和2008来自德国耶拿大学(Jena University)KlausAppenroth教授的浮萍种质资源库，在中国热带农业科学院热带生物技术研究所的浮萍种质资源库也有保存。

所采用的培养基包括MH培养基、E培养基、N培养基和SH培养基。

MH培养基，具体配方如下：NH₄NO₃ 80mg/L，KNO₃ 506mg/L，KH₂PO₄136mg/L，MgSO₄.7H₂O 493mg/L，Ca(NO₃)₂.4H₂O 954mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄.H₂O 16.9mg/L，ZnSO4.7H₂O 8.6mg/L，CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O 0.25mg/L，KI 0.83mg/L，CoCl2.6H₂O 0.025mg/L，FeSO₄.7H₂O 27.8mg/L，Na₂EDTA37.3g/L，蔗糖10g/L，琼脂粉6g/L，pH＝5.7。

E培养基，具体配方如下：KNO₃ 1,515mg/L，KH₂PO₄ 680mg/L，MgSO₄.7H₂O 493mg/L，Ca(NO₃)₂.4H₂O 1181mg/L，H₃BO₃ 2.86mg/L，MnCl₂.4H₂O 3.62mg/L，ZnSO4.7H₂O 0.22mg/L，CuSO₄.5H₂O 0.08mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O 0.12mg/L，FeCl₃.6H₂O 5.4mg/L，EDTA8.77g/L，tartaric acid,3mg/L，蔗糖10g/L，琼脂粉6g/L，pH＝5.7。

N培养基，具体配方如下：KNO₃ 809mg/L，KH₂PO₄ 20.42mg/L，MgSO₄.7H₂O 246.5mg/L，Ca(NO₃)₂.4H₂O 236.15mg/L，H₃BO₃ 0.31mg/L，MnCl₂·4H₂O 2.57mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O0.047mg/L，FeCl₃·6H₂O 6.76mg/L，Na₂EDTA9.31g/L，蔗糖10g/L，琼脂粉6g/L，pH＝5.7。

SH培养基，具体配方如下：KNO₃ 1250mg/L，NH₄H₂PO₄ 150mg/L，MgSO₄.7H₂O 200mg/L，CaCl₂·2H₂O 100mg/L，H₃BO₃ 2.5mg/L，MnSO₄.H₂O 5mg/L，ZnSO4.7H₂O 0.5mg/L，CuSO₄.5H₂O 0.1mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O 0.05mg/L，KI 0.5mg/L，CoCl2.6H₂O 0.05mg/L，FeCl₃·6H₂O 70.2mg/L，Na₂EDTA 96.8g/L，蔗糖10g/L，琼脂粉6g/L，pH＝5.7。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

将微小无根萍接种在MH培养基上，同时接种待筛微生物菌株在远离微小无根萍的培养皿边缘，将浮萍与微生物共培养，以不接种微生物的培养皿为对照。26℃培养室培养，光照强度为2000lx。能使微小无根萍存活期显著延长的菌株为具有抗衰老活性的候选菌株。将候选菌株用液体MH培养基发酵培养1周以上，去除菌丝，将发酵液添加到MH培养基中，经灭菌配制成平板培养基。在平板上接种微小无根萍，以不添加发酵液的平板培养基为对照，筛选能使微小无根萍存活期显著延长的微生物菌株(图1)。最终筛选获得一株橡胶树的内生真菌，命名为ITBB2-31，保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No.15383。

实施例2

保藏编号为CGMCC No.15383的菌种经液体MH培养基发酵一周，弃除菌丝取发酵液，添加入未加热灭菌的MH固体培养基溶液至发酵液体积为10％、20％、30％、40％、50％；经121℃高压灭菌20分钟，制得种质保存基质。另设置不添加发酵液的MH固体培养基为对照。

两个微小无根萍株系2001和2008接种到上述培养基中，放置于26℃培养室培养，光照强度为2000lx。每种培养基进行5次重复，每天观察一次浮萍的生长状况。培养30天后，统计各处理的的微小无根萍的生物量。然后继续培养，观察各处理微小无根萍的叶片保持绿色的时间。结果如表1：

表1发酵液高温高压灭菌后对微小无根萍抗衰老实验结果

注肩标不同字母表示存在统计学差异，p<0.05。

结果表明：菌株ITBB2-31的发酵液能显著延长微小浮萍的存活时间。两个微小无根萍株系2001和2008在所有添加了ITBB2-31发酵液的培养基中，都保持旺盛生长，而在没有添加(0％)发酵液的培养基中，微小无根萍在培养20天时，大部分个体白化死亡，30天时全部衰老死亡(图2)。因此，ITBB2-31的抗衰老的活性物质已经分泌到培养基中，而且是耐高温的物质。从培养30天各处理生物量分析，添加发酵液与不添加发酵液的处理间存在显著差异，p<0.05。

将微小无根萍接种到添加10％发酵液的MH培养基中长期培养，一直培养到7个月，培养物仍然保持绿色。说明培养物的寿命延长了7倍以上(图3)。

实施例3

保藏编号为CGMCC No.15383的菌种经液体MH培养基发酵一周，弃除菌丝取发酵液，用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，然后加入已经121℃高压灭菌20分钟的MH固体培养基溶液至发酵液体积为10％、20％、30％、40％、50％，制得种质保存基质。另设置不添加发酵液的MH固体培养基为对照。

两个微小无根萍株系2001和2008接种到上述培养基中，放置于26℃培养室培养，光照强度为2000lx。每种培养基进行5次重复，每天观察一次浮萍的生长状况。培养30天后，统计各处理的的微小无根萍的生物量。然后继续培养，观察各处理微小无根萍的叶片保持绿色的时间。结果如表2：

表2过滤除菌的发酵液对微小无根萍抗衰老实验结果

注肩标不同字母表示存在统计学差异，p<0.05。

结果表明：菌株ITBB2-31的发酵液能显著延长微小浮萍的存活时间。两个微小无根萍株系2001和2008在所有添加了ITBB2-31发酵液的培养基中，都保持旺盛生长，而在没有添加(0％)发酵液的培养基中，微小无根萍在培养20天时，大部分个体白化死亡，30天时全部死亡(图2)。但是，当发酵液浓度太高(40-50％)时，浮萍的生物量与低浓度添加量相比有所下降，表明发酵液中还含有抑制浮萍生长的物质。而在实例2中，将发酵液高温处理后，这种抑制作用不明显，所以，抑制生长的物质不耐高温(图2)。从培养30天各处理生物量分析，添加低浓度发酵液与不添加发酵液的处理间存在显著差异，p<0.05。

实施例4

保藏编号为CGMCC No.15383的菌种经液体MH培养基发酵一周，弃除菌丝取发酵液，用蒸馏水稀释至浓度为10vol％，20vol％，30vol％三种浓度，121℃高压灭菌20分钟，制备成抗衰老试剂。将试剂喷施到木薯和橡胶树试管苗叶片以及野外田间所采集的橡胶树叶片上，以喷水的叶片为对照。将各处理的叶片放置在培养皿中保湿，置于黑暗中25℃培养15天。利用黑暗条件诱导叶片衰老。共做3个重复。结果表明，不管是试管苗还是大田橡胶树，所采集的叶片经过喷施抗衰老试剂后，叶片衰老明显减缓，而且，在10％～30％浓度范围内，抗衰老试剂浓度越高，诱导衰老15天后，叶片剩余叶绿素浓度越高，说明抗衰老效果越好(图4)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种菌种，其特征在于，其为保藏编号为CGMCC No.15383的Aspergillus sclerotiorum菌种。

2.保藏编号为CGMCC No.15383的菌种在延缓叶片衰老中的应用，所述叶片为微小无根萍、木薯或橡胶的叶片。

3.保藏编号为CGMCC No.15383的菌种在植物种质保存中的应用；所述植物为微小无根萍、木薯或橡胶。

4.一种延缓叶片衰老的制剂，其特征在于，包括保藏编号为CGMCC No.15383的菌种发酵液。

5.一种植物种质的保存基质，其特征在于，包括基础培养基和保藏编号为CGMCCNo.15383的菌种发酵液。

6.根据权利要求5所述的保存基质，其特征在于，所述植物为微小无根萍；所述基础培养基为MH培养基、N培养基或SH培养基；所述菌种发酵液的体积分数为10%;

所述MH培养基具体配方为：NH₄NO₃ 80 mg/L，KNO₃ 506 mg/L，KH₂PO₄ 136 mg/L，MgSO₄·7H₂O 493 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 954 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 16.9 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，KI 0.83 mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，Na₂EDTA 37.3 g/L，蔗糖 10 g/L，琼脂粉6 g/L，pH=5.7;

所述N 培养基具体配方为： KNO₃ 809 mg/L，KH₂PO₄ 20.42 mg/L，MgSO₄·7H₂O 246.5mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 236.15 mg/L，H₃BO₃ 0.31 mg/L，MnCl₂·4H₂O 2.57 mg/L， Na₂MoO₄·2H₂O 0.047 mg/L， FeCl₃·6H₂O 6.76 mg/L，Na₂EDTA 9.31 g/L，蔗糖 10g/L，琼脂粉 6 g/L，pH=5.7;

所述SH培养基具体配方为：KNO₃ 1250 mg/L，NH₄H₂PO₄ 150 mg/L，MgSO₄·7H₂O 200 mg/L，CaCl₂·2H₂O 100 mg/L，H₃BO₃ 2.5 mg/L，MnSO₄·H₂O 5 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5 mg/L，CuSO₄.5H₂O 0.1 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.05 mg/L，KI 0.5 mg/L，CoCl₂·6 H₂O 0.05 mg/L，FeCl₃·6H₂O 70.2 mg/L，Na₂EDTA 96.8 g/L，蔗糖 10g/L，琼脂粉 6 g/L，pH=5.7。

7.一种植物种质的保存方法，其特征在于，以权利要求5~6任一项所述的保存基质保存植物种质。