CN111886018A - 组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含来自细菌菌株的鞭毛蛋白多肽的组合物和这些组合物在治疗疾病中的用途。

Description

组合物
技术领域
本发明属于包含来自细菌菌株的鞭毛蛋白多肽的组合物和这些组合物治疗疾病的用途的领域。
发明背景
人类肠道被认为在子宫中是无菌的，但是在出生之后它立即暴露于各种各样的母体和环境微生物。然后，发生动态时间段的微生物定殖和演替，这受到例如以下因素的影响：分娩方式、环境、饮食和宿主基因型，全部这些都影响肠道微生物群的组成，在早期生命期间尤其如此。随后，微生物群稳定化并且变得类似成人[1]。人类肠道微生物群含有超过500-1000种不同的种系型，它们基本上属于两种主要的细菌分类：拟杆菌门(Bacteroidete)和厚壁菌门(Firmicute)[2]。由人类肠道的细菌定殖产生的成功的共生关系已产生各种各样的代谢、结构、保护性和其它有益的功能。所定殖肠道的增强的代谢活动确保以其它方式难以消化的膳食组分随着副产物的释放而被降解，从而为宿主提供重要的营养物来源。类似地，肠道微生物群的免疫学重要性是公认的并且在具有在引入共生细菌后在功能上重构的受损免疫系统的无菌动物中示例[3-5]。
与受微生物定殖本身影响[6-7]的分泌性肠IgA的产生形成鲜明对比，T细胞发育和分化似乎需要由特定共生微生物定殖。梭菌(Clostridium)菌种并且特别是形成芽孢的分节丝状菌(SFB)似乎是肠和结肠Th1、Th17和Treg的分化和成熟的强效刺激物[8-9]。最新研究已证实其它肠道细菌，包括梭菌群IV和XIVa以及改良谢德拉微生物丛(AlteredSchaedler Flora，ASF)的那些，可诱导Treg重新产生，同时用脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)单定殖可通过促进Treg扩增来校正无菌小鼠中的Th1/Th2不平衡[5][10-11]。这些数据推断出其它常驻肠道细菌的重要免疫调控作用。显然，共生细菌对T细胞分化途径的影响是可变的并且如先前所假设，可能受发现与特定细菌相关联的一批TLR配体影响[12]。举例来说，SFB影响T细胞反应的机制目前未知，但新近基因组研究确认，鞭毛蛋白基因的存在表明通过TLR5-鞭毛蛋白相互作用介导的先天性反应可能起作用[13-14]。
鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要组分之一。鞭毛为鞭状附属物，其为细菌提供运动性并且可充当感官细胞器。细菌鞭毛蛋白的结构和组成已在模型生物体如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)中广泛研究。鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的鞭毛蛋白经由TLR5受体激活免疫系统，这导致多种促炎性和免疫反应基因的活化[15]。已提出，TLR5激动剂如鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白可充当抗癌剂[16]。还已提出被工程改造以表达创伤弧菌(Vibrio vulnifificus)鞭毛蛋白的鼠伤寒沙门氏菌充当抗癌剂[17]。另外，已提出，来自鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌(Vibrio cholera)和痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)的鞭毛蛋白肽当由已被遗传修饰的肠细菌表达时可用于产生针对例如伤寒、霍乱和痢疾的感染性疾病的疫苗[18]。然而，来自其它细菌菌种的鞭毛蛋白仍然缺乏良好表征并且这样的其它鞭毛蛋白可能具有不同的作用或用途。
微生物群组成的巨大变化在例如炎症性肠病(IBD)的胃肠病症中已有文献记载。举例来说，梭菌群XIVa细菌的水平在IBD患者中降低，而大肠杆菌的数目增加，表明肠道内共生有机体与致病有机体的平衡的偏移[19-22]。令人感兴趣的是，这种微生物生态失调也与T效应细胞群体中的不平衡相关联。
在某些细菌菌株对动物肠道可能具有的潜在正向作用的识别中，已提议多种菌株用于治疗各种疾病(参见例如[23-26])。此外，已提议主要包括乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株的某些菌株用于治疗与肠无直接关联的各种炎症性和自身免疫性疾病(对于评述，参见[27]和[28])。然而，不同疾病与不同细菌菌株之间的关系和特定细菌菌株对肠道和在全身水平下以及对任何特定类型的疾病的确切作用缺乏良好表征。举例来说，某些肠球菌(Enterococcus)菌种已牵涉于致癌中[29]。
已提出某些链球菌(Streptococcus)和韦荣氏球菌(Veillonella)菌株并且在较小程度上肠球菌和乳杆菌菌株具有免疫调节作用，在体外对不同细胞因子具有变化的作用。然而，不同疾病与不同细菌菌株之间的关系和特定细菌菌株对肠道和在全身水平下以及对任何特定类型的疾病的确切作用缺乏良好表征。
本领域中需要治疗疾病的新方法。也需要待表征的肠道细菌的潜在作用以便可开发新疗法。
发明内容
本发明人已开发用于治疗和预防疾病的新疗法。特别地，本发明人已鉴定来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽可用于疗法中。如实施例中所证实，来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽可在显著高于众所周知的TLR5激动剂鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的水平下强烈地激活TLR5反应。
在优选的实施方案中，本发明提供用于疗法中的来自鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)菌种的鞭毛蛋白多肽。在其它优选的实施方案中，鞭毛蛋白多肽来自以登录号NCIMB 42488保藏于NCIMB的菌株。在优选的实施方案中，鞭毛蛋白多肽是SEQ ID NO:1。实施例显示来自菌株MRx0518(以登录号NCIMB 42488保藏的菌株)的鞭毛蛋白多肽与来自鹑鸡肠球菌的其它菌株相比可更强烈地激活TLR5反应。因此，来自菌株NCIMB 42488的鞭毛蛋白多肽特别有效用于疗法中。
在优选的实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽呈单体形式，其允许所述多肽与TLR5受体更有效地结合。
实施例显示来自菌株NCIMB 42488的鞭毛蛋白多肽特别有效激活TLR5反应。来自菌株NCIMB 42488的鞭毛蛋白多肽可不含D3结构域，并且本发明人已指出在D2-D3区中观测到不同鞭毛蛋白多肽之间的大多数序列变异。在优选的实施方案中，本发明提供来自肠球菌属或鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽，其不含D3结构域。
在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽是细菌鞭毛装配体的一部分。在某些实施方案中，本发明提供一种包含本发明的鞭毛蛋白多肽的细菌鞭毛装配体。在优选的实施方案中，细菌鞭毛装配体含有蛋白质FliL和FlaG。FliL和FlaG蛋白质存在于MRx0518的细菌鞭毛装配体中。实施例显示来自MRx0518的鞭毛蛋白多肽特别有效激活TLR5反应。
本发明还提供一种编码用于疗法中的来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码用于疗法中的来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽。在优选的实施方案中，多核苷酸序列编码用于疗法中的来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽。
在其它实施方案中，本发明提供一种表达来自肠球菌属的重组鞭毛蛋白多肽的宿主细胞，其用于疗法中。在其它实施方案中，本发明还提供一种包含编码来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的重组多核苷酸序列的宿主细胞，其用于疗法中。
本发明提供包含本发明的鞭毛蛋白多肽的组合物。本发明还提供包含编码本发明的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列的组合物。本发明还提供一种表达本发明的鞭毛蛋白多肽的宿主细胞。另外，本发明还提供包含宿主细胞的组合物，其中所述宿主细胞包含编码本发明的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列。
已知鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)鞭毛蛋白对TLR5的激活抑制细胞增殖和肿瘤生长[48]。包含鹑鸡肠球菌菌株的组合物有效治疗和预防癌症[50]。本发明人已令人惊讶地证实来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽能够刺激强烈的TLR5反应，这可有助于肠球菌菌株的抗癌活性。因此，本发明人已表明来自肠球菌属并且特别是来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽可用于疗法中，并且特别有效治疗和预防癌症。
在优选的实施方案中，包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物用于治疗免疫原性肿瘤和/或实体肿瘤。在某些实施方案中，包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物用于治疗或预防肺癌、乳腺癌、肝癌或结肠癌的方法中。包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物在癌症治疗中可特别有效减小肿瘤尺寸或预防肿瘤生长。
在优选的实施方案中，本发明的组合物是通过注射，优选地皮下或替代地静脉内或腹膜内施用。
在某些实施方案中，例如当组合物包含本发明的宿主细胞时，本发明的组合物用于经口施用。在某些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
另外，本发明提供一种治疗疾病的方法，其包括将包含来自肠球菌属细菌菌株的鞭毛蛋白多肽的组合物施用于有需要的患者。在优选的实施方案中，本发明提供一种治疗或预防癌症的方法，其包括将包含来自肠球菌属细菌菌株的鞭毛蛋白多肽的组合物施用于有需要的患者。
本发明人已开发包含来自肠球菌属，优选来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的新组合物，其可用于刺激免疫系统并且治疗和预防疾病。本发明人已鉴定这些组合物可强效地激活免疫系统并且可治疗癌症，指示它们可能也能够治疗免疫系统的激活可能有用的其它疾病。
本发明因此提供一种包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于刺激受试者中的免疫系统。
在其它方面，本发明提供一种包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗、预防或延迟免疫衰老。
在其它方面，本发明提供一种包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用作疫苗佐剂。
在其它方面，本发明提供一种包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于增强细胞疗法，例如CAR-T。
附图说明
图1：鞭毛蛋白的结构和鞭毛丝的横剖面视图和俯视图。鞭毛丝由单一蛋白质鞭毛蛋白构成。TLR5识别区在D1结构域中并且当鞭毛蛋白聚合成鞭毛丝时不可及。图像来自参考文献[30]。
图2：来自鹑鸡肠球菌菌种和模型生物体鼠伤寒沙门氏菌的24个鞭毛蛋白多肽的蛋白质序列比对。突出显示了来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽的D0、D1和D2结构域和预测的TLR5结合位点。
图3：来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽与来自鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)菌种的23个鞭毛蛋白多肽的蛋白质序列比对。突出显示了来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽的D0、D1和D2结构域和预测的TLR5结合位点。
图4：鞭毛装配体的KEGG通路图。以灰色突出显示的基因存在于菌种中。
图5：预测的MRx0518鞭毛蛋白(FliCMRx0518)蛋白质结构与已知鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白蛋白质结构的比较。鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白蛋白质结构来自参考文献[30]。
图6：TLR5报告细胞的MRx0518激活。
图7：TLR5报告细胞的菌株特异性激活。
图8：在胰蛋白酶处理之后来自MRx0518和DSM100110的CFS的TLR5反应。
图9：a)用于在大肠杆菌中产生重组鞭毛蛋白的克隆策略；b)在SDS-PAGE凝胶上经纯化的重组鞭毛蛋白FlaAMRx0518和FlaADSM100110的质量评估。
图10：用来自MRx0518和DSM100110的FlaAMRx0518、FlaADSM100110和CFS进行TLR5激活的比较。
图11：MRx0518 flaA-突变体的表型表征。
图12：用MRx0518 flaA-突变体CFS进行的TLR5激活。
图13：flaA突变策略。
图14：MRx0518的电子显微术。
图15：来自MRx0518和DSM 100110的重组鞭毛蛋白对鼠类TLR5的激活。数据代表三个独立重复实验。
图16：使用CLUTAL OMEGA 2.1版多重序列比对软件进行的来自MRx0518和DSM100110的鞭毛蛋白的序列比对。
图17：运动性鹑鸡肠球菌和酪黄肠球菌(E.casseliflavus)菌株对人类TLR5的激活。数据代表3个生物重复实验的平均值和标准差。显著性是通过单因子ANOVA检验来评估，“a”表示p<0.0001。
图18：MRx0518对NF-κB的激活。
图19：在不添加细胞因子(无细胞因子)的情况下，使用来自MRx518和RPMI培养基的上清液作为对照，(A)T辅助细胞和(B)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的群体中T细胞分化的诱导。
图20：替代性flaA突变策略。
具体实施方式
鞭毛蛋白
细菌鞭毛的主要组分鞭毛蛋白刺激包括哺乳动物、昆虫和植物的多种生物体中的宿主防御。细菌鞭毛蛋白的结构和组成已在模型生物体如鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌中广泛研究。然而，存在极有限的描述来自肠球菌属并且特别是来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白的可用数据。
鞭毛蛋白可作为单体蛋白质存在或可聚合形成鞭毛丝。沙门氏菌(Salmonella)中的细菌鞭毛丝由约20,000个鞭毛蛋白蛋白质单位构成。鞭毛丝形成完全装配的细菌鞭毛的一部分。
鞭毛蛋白一般含有3-4个结构域(D0、D1、D2和D3)，其中D0和D1结构域由从N端和C端的折叠组成[31]。在鞭毛丝装配期间，D0和D1结构域掩埋于鞭毛丝内，其中D2和/或D3结构域面向外(图1)。
已显示保守结构域D1内的氨基酸基序为TLR5识别和相互作用所需要[32-33]。还已显示D0结构域影响TLR5信号传导[34]。TLR5识别位点在鞭毛丝中一般不可及。鞭毛蛋白以其单体形式更有效地与TLR5相互作用，这是由于当装配成丝时TLR5结合位点不可及[30]。鞭毛蛋白的中心区展示序列可变性并且尚未广泛研究，但应视为蛋白质的抗原性和免疫原性区。
D0和D1结构域是高度保守的，而D2和D3结构域更加可变[35]。图2是来自肠球菌属的鞭毛蛋白与广泛研究的来自鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白的序列比对。来自鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白与来自肠球菌属的鞭毛蛋白之间的大多数序列变异处于中心区(D2-D3结构域)内。在该区中也观测到不同鹑鸡肠球菌菌株之间的大多数序列变异，例如在来自菌株MRx0518与DSM100110的鞭毛蛋白之间(图3)。
鞭毛丝是细菌鞭毛的组分。已知涉及于细菌鞭毛装配体中的基因概述于图4中。加灰色阴影的那些存在于鹑鸡肠球菌中。鞭毛蛋白由FliC编码，FliC在本文中也可互换地称为FlaA。
本发明提供一种来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽，其用于疗法中。在某些实施方案中，本发明提供一种来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽，其用于疗法中。在优选的实施方案中，本发明提供一种来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽，其用于疗法中。实施例证实来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽可激活强烈的TLR5反应，其显示鞭毛蛋白多肽可用于疗法中，并且特别可用于治疗癌症。
本发明提供一种来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防癌症的方法中。在某些实施方案中，本发明提供一种来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防癌症的方法中。在优选的实施方案中，本发明提供一种来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防癌症的方法中。实施例证实来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽能够诱导强烈的TLR5反应，其可用于治疗和预防癌症。特别地，实施例显示来自鹑鸡肠球菌菌种并且尤其来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽产生极高TLR5反应。
在优选的实施方案中，本发明提供一种来自鹑鸡肠球菌菌种或酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)菌种的鞭毛蛋白多肽，其用于疗法中，特别是用于治疗或预防癌症。在某些实施方案中，鞭毛蛋白多肽来自酪黄肠球菌菌种。在最优选的实施方案中，鞭毛蛋白多肽来自鹑鸡肠球菌菌种。
在实施例中测试来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽。MRx0518是以登录号NCIMB42488保藏的鹑鸡肠球菌细菌的菌株。菌株MRx0518由4D Pharma Research Ltd.(LifeSciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)于2015年11月16日以“肠球菌种(Enterococcus sp)”保藏于国际保藏机构NCIMB,Ltd.(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)并且指定登录号NCIMB 42488。
在某些实施方案中，本发明提供一种与来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽具有至少75％序列同一性的鞭毛蛋白多肽，和这些多肽在疗法中并且特别是治疗或预防癌症的用途。实施例显示这些鞭毛蛋白多肽尤其有效。特别是，本发明提供一种鞭毛蛋白多肽，其具有与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。优选地，本发明的鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1或由SEQ IDNO:1组成。在其它实施方案中，鞭毛蛋白多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。本发明的鞭毛蛋白多肽可包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成。实施例也证实这些多肽是有用的。
在某些实施方案中，本发明提供一种鞭毛蛋白多肽，其与SEQ ID NO:3-42中的一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性。在优选的实施方案中，鞭毛蛋白多肽具有与SEQ ID NO:3-16中的一者具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。在优选的实施方案中，鞭毛蛋白多肽来自鹑鸡肠球菌菌种。
在优选的实施方案中，本发明的鞭毛蛋白结合TLR5，例如以至少10-2、至少10-3、至少10-4、至少10-5、至少10-6、至少10-7、至少10-8、至少10-9、至少10-10或至少10-11的KD值。与TLR5的结合可通过本领域中已知的任何适当方法来测量，包括电化学阻抗谱法(EIS)、扫描电化学显微术(SECM)[36]或使用重组TLR5蛋白的非变性PAGE和凝胶过滤色谱分析[37]。
本发明的鞭毛蛋白多肽可含有四个结构域D0、D1、D2和D3。在优选的实施方案中，鞭毛蛋白多肽不包含D3结构域。在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽由三个结构域D0、D1、D2组成。鹑鸡肠球菌鞭毛蛋白多肽中D0、D1和D2结构域的位置示于图3中。来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽(FliCMRx0518)的预测形状示于图5中。FliCMRx0518的预测结构使用Phyre2工具产生，所述工具基于与公开可用的结构的同源性预测蛋白质结构[38]，并且用UCSF Chimera程序包产生图形[39]。D3结构域的预测缺乏使得蛋白质结构与来自鼠伤寒沙门氏菌SL1344(GenBank登录号CBW17983)的鞭毛蛋白多肽相比发生构形变化。D3结构域的预测缺乏可使得TLR5识别位点更加暴露，这导致鞭毛蛋白多肽激活TLR5反应的能力增加。D3结构域的预测缺乏也可影响鞭毛蛋白多肽聚合成鞭毛丝的能力。鞭毛蛋白多肽以单体形式更有效地激活TLR5反应，因此防止或减少鞭毛蛋白多肽的聚合是有益的。
本发明的鞭毛蛋白多肽可含有D1结构域，其可为TLR5识别和相互作用所需要。在某些实施方案中，本发明提供一种具有D1结构域的鞭毛蛋白多肽，所述D1结构域与SEQ IDNO:1中的残基43-164和273-317具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的序列同一性。在某些实施方案中，本发明提供一种在D1结构域中具有TLR5识别位点的鞭毛蛋白多肽。来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽中的TLR识别位点位于SEQ ID NO:1中的位置87-96和290-295处。在优选的实施方案中，鞭毛蛋白多肽的TLR5识别位点与SEQ ID NO:1中的残基87-96和290-295具有至少99％、99.5％或99.9％的同一性。在其它优选的实施方案中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO:1中的残基87-96和290-295的TLR5识别位点。
本发明的鞭毛蛋白多肽也可含有D0结构域，其可影响TLR5信号传导。在某些实施方案中，本发明提供一种具有D0结构域的鞭毛蛋白多肽，所述D0结构域与SEQ ID NO:1中的残基2-32和234-358具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。
本发明的鞭毛蛋白多肽也可含有D2结构域。来自鼠伤寒沙门氏菌与肠球菌属的鞭毛多肽之间的大多数序列变异处于中心区(D2-D3结构域)内。实施例显示来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽与来自鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白多肽相比能够在更低剂量下产生更强的TLR5反应。D2或D3结构域中的序列变异可促成来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽激活TLR5反应的能力增加。本发明的鞭毛蛋白多肽也含有D0结构域，其可影响TLR5信号传导。在某些实施方案中，本发明提供一种具有D2结构域的鞭毛蛋白多肽，所述D2结构域与SEQ ID NO:1中的残基165-272具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。
鞭毛蛋白多肽可作为单体存在或以聚合形式作为鞭毛丝存在。这种丝是细菌鞭毛的一部分。在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽排列成鞭毛丝。本发明还涉及未排列成鞭毛丝的鞭毛蛋白多肽。在优选的实施方案中，鞭毛蛋白多肽呈其单体形式。鞭毛蛋白多肽的单体形式是有利的，这是由于它可与TLR5更强烈地相互作用。在实施方案中，本发明的鞭毛蛋白未被糖基化，以帮助其脱落并分解成单体形式。
在某些实施方案中，鞭毛蛋白多肽是细菌鞭毛的一部分。在某些实施方案中，鞭毛蛋白多肽是细菌鞭毛的一部分，所述细菌鞭毛含有一种或多种选自以下的蛋白质：FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA、FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ和FliS。在优选的实施方案中，细菌鞭毛装配体含有FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA、FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ和FliS。在某些实施方案中，细菌鞭毛装配体含有蛋白质FliL和FlaG。FliL是控制趋化期间鞭毛的旋转方向的鞭毛基体相关蛋白，并且FlaG与FlaF一起调控鞭毛蛋白装配。FliL和FlaG蛋白质存在于MRx0518中。实施例显示来自MRx0518的鞭毛蛋白多肽与来自另一鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽相比可激活更强烈的TLR5反应。
本发明的鞭毛蛋白多肽可被重组表达，或者它们可从肠球菌细胞中分离。在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽未附着至肠球菌细胞。在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽在基本上不含细菌细胞的组合物中。
在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽已被热处理，并且任选地被变性。实施例证实这些鞭毛蛋白多肽仍是强力有效的。在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽热稳定至80℃，例如在加热至80℃后可维持活性持续例如40分钟。在某些实施方案中，鞭毛蛋白多肽由胰蛋白酶消化。换句话说，在某些实施方案中，鞭毛蛋白多肽含有胰蛋白酶裂解位点。预测MRX518鞭毛蛋白含有36个胰蛋白酶裂解位点。
根据本发明的鞭毛蛋白多肽无需起到正常鞭毛蛋白多肽的作用以将其视为鞭毛蛋白多肽。根据本发明的鞭毛蛋白多肽可含有去除某些活性的突变或缺失。通常，本发明的鞭毛蛋白多肽是TLR5激动剂。在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽不能聚合成鞭毛丝。在其它实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽不能形成细菌鞭毛装配体的一部分。
在某些实施方案中，本发明的多肽并非鞭毛蛋白多肽。在优选的实施方案中，所述多肽与如上文所述的SEQ ID NO:1具有序列同一性，或包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成。
本发明还提供包含用于疗法中的来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物。在某些实施方案中，组合物包含用于疗法中的来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽。在优选的实施方案中，组合物包含用于疗法中的来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽。
在本发明的每个实施方案的替代性方面，本发明的鞭毛蛋白多肽属于酪黄肠球菌菌种。酪黄肠球菌非常类似于鹑鸡肠球菌并且也有鞭毛。
片段
如前述章节中所述，预期与实施例中测试的那些具有序列同一性的鞭毛蛋白多肽也可用于疗法中并由本发明涵盖。另外，也预期本发明的鞭毛蛋白多肽的片段是有用的。
优选地，任何片段的长度为至少7个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个或350个氨基酸。
优选的片段包含SEQ ID NO:1的以下多段氨基酸中的一者或多者：2-32、87-96、165-272、234-358、290-295，或包含与所述片段中的一者具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
优选的片段包含与SEQ ID NO:1的氨基酸165-272具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的序列。其它优选的片段包含与SEQ ID NO:1的氨基酸87-96、165-272或290-295或优选与SEQ ID NO:1的氨基酸87-96、165-272和290-295具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
根据本发明使用的片段将通常(i)与SEQ ID NO:1具有至少w％序列同一性，和/或(ii)包含来自SEQ ID NO:1的至少x个连续氨基酸的片段。w值为至少85(例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更大)。x值为至少7(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300)，并且片段将通常包括来自SEQ ID NO:1的表位。片段将通常能够结合至TLR5。
根据本发明使用的其它片段将通常(i)与SEQ ID NO:2具有至少w％序列同一性，和/或(ii)包含来自SEQ ID NO:2的至少x个连续氨基酸的片段。w值为至少85(例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更大)。x值为至少7(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300)，并且片段将通常包括来自SEQ ID NO:2的表位。片段将通常能够结合至TLR5。
根据本发明使用的其它片段将通常(i)与SEQ ID NO:3-42中的一者具有至少w％序列同一性，和/或(ii)包含来自SEQ ID NO:3-42中的一者的至少x个连续氨基酸的片段。w值为至少85(例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更大)。x值为至少7(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300)，并且片段将通常包括来自SEQID NO:3-42中的一者的表位。片段将通常能够结合至TLR5。
融合物
也预期包含本发明的鞭毛蛋白多肽的融合物可用于疗法中。因此，在某些实施方案中，本发明提供一种包含如上文所述的鞭毛蛋白多肽的融合多肽，任选地用于疗法中并且特别是用于治疗癌症。优选的融合搭配物包括靶向部分和旨在延长半衰期的部分。在某些实施方案中，本发明提供一种融合多肽，其包含如上文所述的鞭毛蛋白多肽和选自由以下组成的组的多肽：Fc区、转铁蛋白、白蛋白、重组PEG、高氨基酸聚合物、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物、类弹性蛋白肽或羧基末端肽[CTP；绒毛膜促性腺激素(CG)b链的羧基末端肽]。
本发明的鞭毛蛋白多肽也可融合或接合至非多肽部分以改善其特性和治疗效用。举例来说，在某些实施方案中，本发明提供如上文所述的鞭毛蛋白多肽，其共价连接至PEG或透明质酸。
本发明的鞭毛蛋白多肽可融合或接合至抗原，例如，以用作疫苗。在本发明的鞭毛蛋白附近呈递抗原可最大化其免疫刺激活性并进一步增强针对抗原产生的保护性免疫反应。另外，当抗原与本发明的鞭毛蛋白融合或接合时，制造和递送包含抗原和本发明的鞭毛蛋白的治疗剂可更有效率并且有效。因此，在某些实施方案中，本发明提供一种融合多肽，其包含如上文所述的鞭毛蛋白多肽和抗原。在其它实施方案中，本发明提供如上文所述的鞭毛蛋白多肽，其接合至抗原。
包括于本发明的融合物和接合物中的优选的抗原是病原体抗原和肿瘤抗原。抗原将引起对所述抗原具特异性的免疫反应，其将有效保护免受病原体感染或攻击肿瘤。抗原可以是例如肽或多糖。用于本发明的融合物和接合物的示例性抗原包括：病毒抗原，例如病毒表面蛋白；细菌抗原，例如蛋白质和/或糖抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；和肿瘤抗原。用于本发明的融合物和接合物的其它抗原包括糖蛋白和脂聚糖抗原、古细菌抗原、黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸化Tn(STn)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、威尔姆斯瘤基因(Wilms tumour gene)(WT1)、CA-125、前列腺特异性抗原(PSA)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)抗原、新抗原、致癌蛋白、类淀粉蛋白β、Tau、PCSK9和成瘾性物质，例如烟碱、酒精或鸦片剂。
本发明的融合多肽可包括介于鞭毛蛋白与抗原之间的接头序列。优选的接头序列包括包含(Gly4)n基序、(Gly4Ser)n基序和Ser(Gly4Ser)n基序的肽。接头序列的长度可为1-50个、1-30个、1-20个、5-20个、5-10个或10-20个氨基酸。接头序列将允许鞭毛蛋白和融合搭配物(例如抗原)执行其作用并且例如由免疫系统达及。因此，在某些实施方案中，本发明提供一种融合多肽，其包含如上文所述的鞭毛蛋白多肽、接头序列和抗原，例如来源于病原体的抗原、或肿瘤抗原。
本发明的鞭毛蛋白多肽当接合至例如多糖抗原的非多肽部分时可特别适用。合适的接合方法包括使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、对硝基苯甲酸、N-羟基丁二酰亚胺、S--NHS、EDC、CDAP或TSTU。
多核苷酸
本发明还提供一种编码用于疗法中的来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码用于疗法中的来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽。在优选的实施方案中，多核苷酸序列编码用于疗法中的来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽。实施例证实来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽可激活强烈的TLR5反应，因此编码这些鞭毛蛋白多肽的多核苷酸可适用于疗法中，并且特别适用于治疗癌症。
本发明还提供一种多核苷酸序列，其编码用于治疗或预防癌症的方法中的来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽。在某些实施方案中，本发明提供一种多核苷酸序列，其编码用于治疗或预防癌症的方法中的来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽。在优选的实施方案中，本发明提供一种多核苷酸序列，其编码用于治疗或预防癌症的方法中的来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽。实施例证实来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽能够诱导强烈的TLR5反应，其可用于治疗和预防癌症。特别是，实施例显示来自鹑鸡肠球菌菌种并且尤其来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽产生极高TLR5反应。
在优选的实施方案中，用于疗法中的本发明的多核苷酸编码SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的多肽序列。在其它优选的实施方案中，本发明的多核苷酸编码具有上文所述的特定D0、D1和/或D2序列的鞭毛蛋白，所述序列在实施例中显示是有用的。
在其它实施方案中，用于疗法中的本发明的多核苷酸编码SEQ ID NO:2，或与SEQID NO:2具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的多肽序列。在其它优选的实施方案中，本发明的多核苷酸编码具有上文所述的特定D0、D1和/或D2序列的鞭毛蛋白，所述序列在实施例中显示是有用的。
在其它实施方案中，用于疗法中的本发明的多核苷酸编码SEQ ID NO:3-42中的一者，或与SEQ ID NO:3-42中的一者具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的多肽序列。在其它优选的实施方案中，本发明的多核苷酸编码具有上文所述的特定D0、D1和/或D2序列的鞭毛蛋白，所述序列在实施例中显示是有用的。
根据本发明的核酸可采用各种形式(例如单链、双链、载体等)。本发明的核酸可为环状或分枝的，但通常将为线性的。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链与双链核苷酸聚合物。包含核酸的核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，例如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，例如2',3'-二脱氧核糖；和核苷酸间键联修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯和氨基磷酸酯。
核酸可以许多方式制备，例如通过全部或部分化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成)，通过使用核酸酶(例如限制酶)消化较长核酸，通过连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)，来自基因组或cDNA文库，等等。
本发明的核酸包含编码本发明的至少一个多肽，例如本发明的鞭毛蛋白多肽的序列。通常，本发明的核酸将呈重组形式，即，自然界中不存在的形式。举例来说，除编码至少鞭毛蛋白多肽的序列以外，核酸可包含一个或多个异源核酸序列(例如编码另一抗原的序列和/或控制序列，例如启动子或内部核糖体进入位点)。在这样的实施方案中，本发明的核酸编码如上文所论述的鞭毛蛋白多肽和抗原，例如病原体抗原或肿瘤抗原。任选地，核酸还编码接头序列。
宿主细胞
本发明还提供表达本发明的鞭毛蛋白多肽的宿主细胞，其用于疗法中。实施例证实表达本发明的肠球菌鞭毛蛋白的肠球菌菌株(例如MRx0518)可激活TLR5并且因此可具有强效治疗作用。表达本发明的鞭毛蛋白多肽的宿主细胞可适用于产生包括于治疗性组合物中的鞭毛蛋白多肽，或这样的宿主细胞可适用于施用于患者，其中所述宿主细胞表达鞭毛蛋白多肽以发挥直接治疗作用。
在优选的实施方案中，本发明的宿主细胞重组表达本发明的鞭毛蛋白多肽。换句话说，本发明的宿主细胞包含编码本发明的鞭毛蛋白多肽的异源多核苷酸序列。在某些实施方案中，宿主细胞不属于肠球菌属，不属于鹑鸡肠球菌菌种，或不属于菌株MRx0518。在优选的实施方案中，用于表达重组肠球菌鞭毛蛋白多肽的宿主细胞是大肠杆菌。
在替代性实施方案中，其中例如宿主细胞用于施用于患者，所述宿主细胞是益生菌菌株，例如乳杆菌和双歧杆菌菌株。
在某些实施方案中，宿主细胞包含编码来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列。在某些实施方案中，宿主细胞包含编码来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列。在优选的实施方案中，宿主细胞包含编码来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列。在某些实施方案中，宿主细胞包含载体，其中所述载体包含编码来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列。
在某些实施方案中，宿主细胞包含编码以下细菌鞭毛装配体基因中的一者或多者、优选全部的多核苷酸序列：FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA、FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ和FliS。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞表达以下多肽中的一者或多者、优选全部：FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA、FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ和FliS。在优选的实施方案中，宿主细胞包含编码包含FliL和FlaG的细菌鞭毛装配体的多核苷酸序列。在优选的实施方案中，本发明的宿主细胞表达多肽FliL和FlaG。
优选地，表达本发明的鞭毛蛋白多肽的任何细胞和特别是用于施用于患者的任何细胞可有效脱落鞭毛蛋白多肽。实施例证实这些细胞诱导更强烈的TLR5反应。鞭毛蛋白可在鞭毛装配期间经由其单体单元的泄漏而“主动”脱落。然而，在大多数情况下，单体鞭毛蛋白由脱离的鞭毛的主动降解而产生。鞭毛脱离可在机械应变之后或作为自主过程发生。在一些细菌菌种中，鞭毛蛋白被糖基化以增强丝稳定性并防止不受控的脱落，例如在奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)中[40]。在优选的实施方案中，由宿主细胞表达的鞭毛蛋白未被糖基化，以帮助其脱落并分解成单体形式。
在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽和/或细菌鞭毛装配体容易从宿主细胞脱落。
鞭毛蛋白多肽和/或鞭毛装配体的脱落容易性可通过以下方式确定：独立地使i)表达本发明的鞭毛蛋白的细胞和ii)表达来源于属于与本发明的鞭毛蛋白相同的细菌菌种的相同或不同菌株的参考鞭毛蛋白的一种或多种细胞(例如1种、2种、3种、4种、5种、10种或多于10种)a)使用各别细胞的1％接种体在静止期中生长18小时，然后b)在来自静止期的细胞的10％接种体生长的晚对数期中生长3小时。然后可使表达本发明的鞭毛蛋白的细胞的10ml培养物和表达参考鞭毛蛋白的细胞的10ml培养物在室温下以5000×g离心5分钟以移除细菌团块。然后可在无菌条件下过滤(0.22μm)所得上清液。在本发明的鞭毛蛋白多肽和/或细菌鞭毛装配体为良好脱落体的实施方案中，来源于表达本发明的鞭毛蛋白的细胞的上清液中的鞭毛蛋白的浓度将比来源于表达参考鞭毛蛋白的细胞的上清液中的鞭毛蛋白的浓度更高(例如1.5X或更高、2X或更高、3X或更高、4X或更高、5X或更高、7X或更高或10X或更高)。
在优选的实施方案中，本发明的宿主细胞将鞭毛蛋白多肽和/或鞭毛装配体释放至其环境中，其需要化学或物理破坏。在优选的实施方案中，在适合于表达鞭毛蛋白多肽的条件下培养本发明的宿主细胞使得鞭毛蛋白多肽从细胞释放至其环境中。实施例证实表达本发明的鞭毛蛋白多肽的细胞诱导更强烈的TLR5反应。在其它实施方案中，本发明的宿主细胞是细菌鞭毛装配体的良好脱落体。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞是细菌鞭毛丝的良好脱落体并且特别是鞭毛蛋白多肽的良好脱落体。在某些实施方案中，本发明的细菌鞭毛装配体主动脱落单体鞭毛蛋白。在某些实施方案中，本发明的鞭毛丝主动脱落单体鞭毛蛋白。单体鞭毛蛋白更有效地诱导TLR5反应。
在某些实施方案中，本发明提供一种获得本发明的鞭毛蛋白多肽或鞭毛装配体的方法，其包括培养表达本发明的鞭毛蛋白多肽或鞭毛装配体的细胞和培养所述鞭毛蛋白多肽或鞭毛装配体，而无需进行任何步骤以从细胞表面去除单独鞭毛蛋白多肽或鞭毛装配体。
鞭毛(或鞭毛蛋白)脱落过程目前不与特异性子组基因的表达相关联并且可能受环境条件极大影响。然而，已显示许多基因牵涉于鞭毛刚性和稳定性中。举例来说，在沙门氏菌中，已显示fliF和fliL突变体当在粘性培养基中生长时更易脱落鞭毛[41、42]。在两种情况下，鞭毛在远端杆体附近断裂[43]。因此，在优选的实施方案中，宿主细胞不表达fliF和/或fliL。在其它实施方案中，宿主细胞不表达fliL。
在某些实施方案中，本发明的宿主细胞已被热处理。实施例证实表达本发明的鞭毛蛋白多肽的细胞在热处理之后仍为强力有效的。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞热稳定至80℃，例如在加热至80℃后可维持活性持续例如40分钟。
本发明还提供通过在允许产生鞭毛蛋白多肽的条件下培养宿主细胞来产生本发明的鞭毛蛋白多肽以及回收由此产生的鞭毛蛋白多肽的方法。
在某些实施方案中，本发明的宿主细胞另外表达一种或多种抗原。一般来说，抗原将被重组表达并且对于宿主细胞将为异源的。抗原可以是与本发明的鞭毛蛋白多肽一起表达的融合多肽的一部分，或者宿主细胞可独立地表达来自不同开放阅读框的鞭毛蛋白和抗原。因此，本发明提供一种表达本发明的鞭毛蛋白多肽和异源抗原的宿主细胞。用于本发明的示例性抗原包括：病毒抗原，例如病毒表面蛋白；细菌抗原，例如蛋白质和/或糖抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；和肿瘤抗原。用于在宿主细胞中与本发明的鞭毛蛋白一起表达的其它抗原包括糖蛋白和脂聚糖抗原、古细菌抗原、黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸化Tn(STn)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、威尔姆斯瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特异性抗原(PSA)、爱泼斯坦-巴尔病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、类淀粉蛋白β、Tau、PCSK9和成瘾性物质，例如烟碱、酒精或鸦片剂。
载体、质粒和其它核酸
本发明的核酸可以是载体的一部分，即，被设计用于一种或多种细胞类型的转导/转染的核酸构建体的一部分。载体可以是例如被设计成用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”，或被设计成导致重组病毒或类病毒粒子产生的“病毒载体”。
替代地或另外，核酸的序列或化学结构与编码鞭毛蛋白多肽的天然存在的序列相比可被修饰。核酸分子的序列可被修饰，例如以增加核酸的表达或复制的功效，或提供额外稳定性或抗降解性。举例来说，核酸分子的序列可被密码子优化用于在所需宿主如哺乳动物(例如人类)细胞中表达。关于密码子使用的这种修饰可增加核酸的翻译功效和半衰期。poly A尾(例如具有约30个腺苷残基或更多)可附着至RNA的3'端以增加其半衰期。RNA的5'端可用具有结构m7G(5')ppp(5')N(帽0结构)的被修饰的核糖核苷酸或其衍生物加帽，所述核糖核苷酸或其衍生物可在RNA合成期间并入或可在RNA转录之后进行酶促工程改造(例如通过使用由mRNA三磷酸酶、鸟苷酸转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶组成的牛痘病毒加帽酶(VCE)，其催化N7-单甲基化帽0结构的构建)。帽0结构在维持RNA分子的稳定性和翻译功效中起重要作用。RNA分子的5'帽可由2'-O-甲基转移酶进一步修饰，其导致产生帽1结构(m7Gppp[m2'-O]N)，这可进一步增加翻译功效。
核酸可包含一种或多种核苷酸类似物或被修饰的核苷酸。如本文所用，“核苷酸类似物”或“被修饰的核苷酸”是指在核苷的含氮碱基(例如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))中或上含有一个或多个化学修饰(例如取代)的核苷酸。核苷酸类似物可在核苷的糖部分(例如核糖、脱氧核糖、被修饰的核糖、被修饰的脱氧核糖、六元糖类似物或开链糖类似物)或磷酸酯中或上含有其它化学修饰。核苷酸和被修饰的核苷酸和核苷的制备是本领域中众所周知的，例如获知于美国专利第4373071号、第4458066号、第4500707号、第4668777号、第4973679号、第5047524号、第5132418号、第5153319号、第5262530号、第5700642号，并且许多被修饰的核苷和被修饰的核苷酸可购得。
本发明还提供能够表达鞭毛蛋白多肽的重组表达载体。举例来说，本发明提供包含上文所提及的核酸分子中的任一者的重组表达载体。
本发明还提供已引入上文所提及的载体中的任一者的宿主细胞。本发明还提供通过在允许产生鞭毛蛋白多肽的条件下培养宿主细胞来产生本发明的鞭毛蛋白多肽以及回收由此产生的鞭毛蛋白多肽的方法。
包含编码鞭毛蛋白多肽的核酸序列的如本文所公开的组合物可以是基于核酸的治疗剂。
核酸可以是例如RNA(即，基于RNA的治疗剂)或DNA(即，基于DNA的治疗剂，例如质粒DNA治疗剂)。在某些实施方案中，基于核酸的治疗剂是基于RNA的治疗剂。在某些实施方案中，基于RNA的治疗剂包含自复制RNA分子。自复制RNA分子可以是源自α病毒的RNA复制子。
自复制RNA分子是本领域中众所周知的并且可通过使用来源于例如α病毒的复制元件并用编码所关注的蛋白质的核苷酸序列取代结构病毒蛋白而产生。自复制RNA分子通常是+链分子，其可在递送至细胞之后直接翻译，并且这种翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，所述聚合酶然后从所递送的RNA产生反义与有义转录物。因此，所递送的RNA导致多个子代RNA产生。这些子代RNA以及同线次基因组转录物可自身翻译以提供所编码的抗原(即，鞭毛蛋白多肽)的原位表达，或者可被转录以提供与所递送的RNA同义的其它转录物，所述转录物被翻译以提供抗原的原位表达。转录的该序列的总体结果是所引入的复制子RNA的数目的巨大扩增并且因此所编码的抗原变成细胞的主要多肽产物。
以这种方式实现自复制的其它合适系统是使用基于α病毒的复制子。这些复制子是+链RNA，其导致复制酶(或复制酶-转录酶)在递送至细胞之后翻译。复制酶被翻译为多聚蛋白质，其自动裂解以提供产生+链递送的RNA的基因组-链拷贝的复制复合物。这些-链转录物可自身转录以得到+链亲本RNA的其它拷贝并且也得到编码抗原的次基因组转录物。次基因组转录物的翻译由此导致抗原由被感染的细胞原位表达。合适的α病毒复制子可使用来自辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)、东部马脑炎病毒、委内端拉马脑炎病毒等的复制酶。可使用突变体或野生型病毒序列，例如VEEV的减弱TC83突变体已用于复制子中。
在某些实施方案中，本文所述的自复制RNA分子编码(i)可转录来自自复制RNA分子的RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)鞭毛蛋白多肽。聚合酶可以是α病毒复制酶，例如包含α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4中的一者或多者。
基于核酸的治疗剂可包含病毒或非病毒递送系统。递送系统(在本文中也称为递送运载体)可具有增强所编码的鞭毛蛋白多肽的免疫原性的辅助作用。举例来说，核酸分子可囊封于脂质体、无毒生物可降解聚合微粒或病毒复制子粒子(VRP)中，或与阳离子水包油乳液的粒子复合。在一些实施方案中，基于核酸的治疗剂包含阳离子纳米乳液(CNE)递送系统或脂质纳米粒子(LNP)递送系统。或者，基于核酸的治疗剂可包含病毒复制子粒子。在其它实施方案中，基于核酸的治疗剂可包含裸核酸，例如裸RNA(例如mRNA)，但经由LNP递送是优选的。
在某些实施方案中，基于核酸的治疗剂包含阳离子纳米乳液(CNE)递送系统。CNE递送系统及其制备方法在本领域中有所描述。在CNE递送系统中，编码抗原的核酸分子(例如RNA)与阳离子水包油乳液的粒子复合。阳离子水包油乳液可用于将例如RNA分子的带负电荷分子递送至细胞。乳液粒子包含油核心和阳离子脂质。阳离子脂质可与带负电荷分子相互作用，从而将所述分子锚定至乳液粒子。适用的CNE的更多细节可见于本领域中。
因此，在本发明的基于核酸的治疗剂中，编码鞭毛蛋白多肽的RNA分子可与阳离子水包油乳液的粒子复合。所述粒子通常包含在25C下呈液相的油核心(例如植物油或角鲨烯)、阳离子脂质(例如磷脂)并且任选地包含界面活性剂(例如脱水山梨糖醇三油酸酯、聚山梨醇酯80)；也可包括聚乙二醇。在一些实施方案中，CNE包含角鲨烯和阳离子脂质，例如1,2-二油酰氧基-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)。在一些优选的实施方案中，递送系统是非病毒递送系统，例如CNE，并且基于核酸的治疗剂包含自复制RNA(mRNA)。这可特别有效地引起体液和细胞免疫反应。优势还包括不存在限制性抗载体免疫反应和无基因组整合风险。
LNP递送系统和无毒生物可降解聚合微粒及其制备方法在本领域中有所描述。LNP是可囊封核酸分子(例如RNA)的非病毒体脂质体粒子。粒子可包括一些外部RNA(例如在粒子表面上)，但至少一半RNA(并且理想地全部)被囊封。脂质体粒子可例如由可为饱和或不饱和的两性离子、阳离子和阴离子脂质的混合物形成，所述脂质为例如DSPC(两性离子、饱和)、DlinDMA(阳离子、不饱和)和/或DMG(阴离子、饱和)。用于本发明的优选的LNP包括可形成脂质体的两亲脂质，任选地与至少一种阳离子脂质(例如DOTAP、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA等)组合。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的混合物特别有效。其它适用的LNP公开于本领域中。在一些实施方案中，LNP是RV01脂质体。
NF-κB
TLR信号通路以转录因子核因子κB(NF-kB)的激活为终点。NF-kB控制一系列炎性细胞因子基因(包括TNF-α)的表达。鞭毛蛋白诱导TLR5二聚，其随后募集MyD88并活化蛋白激酶，包括IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAK-M。这些激酶的活化导致促炎性细胞因子NF-kB的核定位[44]。
如实施例中所证实(图18)，本发明的组合物导致NF-κB的表达增加。因为本发明的组合物的施用增加促炎性细胞因子NF-κB的表达，所以本发明的组合物可用于刺激免疫反应。另外，本发明的组合物可用于治疗疾病，特别是以降低的免疫激活为特征的疾病和/或由增加的免疫反应可治疗的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加NF-κB的水平和/或活性而用作免疫刺激剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加NF-κB的水平和/或活性来治疗以降低的免疫激活为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加NF-κB的水平和/或活性来治疗由增加的免疫反应可治疗的疾病。
特别是，本发明的组合物可用于治疗以NF-κB的表达和/或活化降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗以NF-κB的表达和/或活化降低为特征的疾病。
NF-kB的活化对于引起先天性免疫反应和后续适应性免疫反应的发展是重要的。因此，TLR的激动剂，例如鞭毛蛋白，可能适用作佐剂以通过促进先天性与适应性免疫反应来治疗感染性疾病、过敏和肿瘤[44]。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗感染性疾病、过敏和/或肿瘤。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加NF-κB的水平和/或活性来治疗感染性疾病、过敏和/或肿瘤。
治疗癌症
Toll样受体(TLR)是主要在先天性免疫细胞上表达的膜结合受体，其在先天性与适应性免疫系统中起关键作用。TLR对特异性微生物病原体相关分子模式(PAMP)作出反应。TLR感知细菌细胞壁组分并且已知TLR5识别细菌鞭毛蛋白。鞭毛蛋白是TLR5的唯一已知的配体，其为在一系列人类细胞的表面上表达的受体蛋白，所述细胞包括上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)和T细胞[45-47]。细菌鞭毛蛋白对TLR5的活化导致多种促炎性和免疫反应基因活化[15]。
已知鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白对TLR5的活化抑制细胞增殖和肿瘤生长[48]。已显示被工程改造以分泌创伤弧菌鞭毛蛋白B(FlaB)的鼠伤寒沙门氏菌菌株通过TLR4和TLR5信号通路的两步活化来有效抑制小鼠模型中的肿瘤生长和转移并延长存活[49]。来自其它菌种的鞭毛蛋白多肽治疗癌症的功效是未知的。化合物激活TLR5反应的能力测定显示所述化合物可有效治疗癌症。
包含鹑鸡肠球菌菌株并且特别是包含菌株MRx0518的组合物有效治疗和预防癌症[50]。本发明人已令人惊讶地显示来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽能够刺激强烈的TLR5反应，这可有助于肠球菌菌株的抗癌活性。来自鹑鸡肠球菌的鞭毛蛋白多肽与来自鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白多肽具有大的序列相异性。实施例显示来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽相比于来自鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白多肽能够产生更强烈的TLR5反应。因此，本发明人已表明来自肠球菌属并且特别是来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽可用于疗法中，并且特别有效治疗和预防癌症。
已显示TLR5由许多不同癌症表达，包括乳腺癌、结肠直肠癌和胃癌。实施例显示来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽能够产生强烈的TLR5反应。因此，在某些实施方案中，本发明提供来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防乳腺癌、结肠直肠癌或胃癌。在某些实施方案中，本发明提供包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗或预防乳腺癌、结肠直肠癌或胃癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在乳腺癌、结肠直肠癌或胃癌中减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长或减少血管生成。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗乳腺癌。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗结肠直肠癌。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗胃癌。
在某些实施方案中，本发明提供包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗或预防TLR5相关癌症。
本发明提供来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防癌症。本发明还提供鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防癌症。更优选地，本发明提供特别是具有序列SEQ ID NO:1的来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防癌症。
本发明还提供包含本发明的鞭毛蛋白多肽的组合物。本发明还提供包含编码本发明的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列的组合物。本发明还提供一种表达本发明的鞭毛蛋白多肽的宿主细胞。另外，本发明还提供包含宿主细胞的组合物，其中所述宿主细胞包含编码本发明的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列。
在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗使得肿瘤尺寸减小或肿瘤生长减少。在某些实施方案中，本发明的组合物用于减小肿瘤尺寸或减少肿瘤生长。本发明的组合物可有效减小肿瘤尺寸或生长。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗具有实体肿瘤的患者。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在癌症治疗中减少或预防血管生成。本发明的组合物可对在血管生成中具有核心作用的免疫或炎性系统有作用。在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防转移。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防乳腺癌。参考文献[50]证实肠球菌菌株具有对抗乳腺癌的强效作用，因此依照本申请中的数据，本发明的鞭毛蛋白多肽可特别有效对抗乳腺癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在乳腺癌治疗中减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长或减少血管生成。在优选的实施方案中，癌症是乳腺癌。在优选的实施方案中，癌症是IV期乳腺癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防肺癌。参考文献[50]证实肠球菌菌株具有对抗肺癌的强效作用，因此依照本申请中的数据，本发明的鞭毛蛋白多肽可特别有效对抗肺癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在肺癌治疗中减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长或减少血管生成。在优选的实施方案中，癌症是肺癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防肝癌。参考文献[50]证实肠球菌菌株具有对抗肝癌的强效作用，因此依照本申请中的数据，本发明的鞭毛蛋白多肽可特别有效对抗肝癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在肝癌治疗中减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长或减少血管生成。在优选的实施方案中，癌症是肝细胞瘤(肝细胞癌)。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防结肠直肠癌。参考文献[50]证实肠球菌菌株具有对抗结肠直肠癌的强效作用，因此依照本申请中的数据，本发明的鞭毛蛋白多肽可特别有效对抗结肠直肠癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在结肠直肠癌治疗中减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长或减少血管生成。在优选的实施方案中，癌症是结肠直肠腺癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防结肠癌。参考文献[50]证实肠球菌菌株具有对抗结肠癌的强效作用，因此依照本申请中的数据，本发明的鞭毛蛋白多肽可特别有效对抗结肠癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在结肠癌治疗中减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长或减少血管生成。在优选的实施方案中，癌症是结肠腺癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防直肠癌。参考文献[50]证实肠球菌菌株具有对抗直肠癌的强效作用，因此依照本申请中的数据，本发明的鞭毛蛋白多肽可特别有效对抗直肠癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在直肠癌治疗中减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长或减少血管生成。在优选的实施方案中，癌症是直肠腺癌。在优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗直肠癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防胃癌。已显示胃癌表达高水平的TLR5并且用鞭毛蛋白治疗引起强效抗肿瘤活性[51]。实施例显示本发明的鞭毛蛋白多肽能够产生强烈的TLR5反应，因此本发明的鞭毛蛋白多肽可特别有效对抗胃癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在胃癌治疗中减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长或减少血管生成。在优选的实施方案中，癌症是胃腺癌。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗胃癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防黑色素瘤。已显示来自鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白与主要组织相容性复合物II类限制的P10肽组合减少鼠类黑色素瘤模型中的肺转移的数目[52]。实施例显示本发明的鞭毛蛋白多肽相比于鼠伤寒沙门氏菌能够产生更强烈的TLR5反应，因此本发明的鞭毛蛋白多肽可特别有效对抗黑色素瘤。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在黑色素瘤治疗中减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长或减少血管生成。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗黑色素瘤。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防神经母细胞瘤。已知鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白对TLR5的活化抑制细胞增殖和肿瘤生长[53]。实施例显示本发明的鞭毛蛋白多肽相比于鼠伤寒沙门氏菌能够产生更强烈的TLR5反应，因此本发明的鞭毛蛋白多肽可特别有效对抗神经母细胞瘤。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在神经母细胞瘤治疗中减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长或减少血管生成。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗神经母细胞瘤。
在一些实施方案中，癌症是肠癌。在一些实施方案中，癌症是非肠的身体部分的癌症。在一些实施方案中，癌症不是肠癌。在一些实施方案中，癌症不是结肠直肠癌。在一些实施方案中，癌症不是小肠癌。在一些实施方案中，治疗或预防在除肠以外的部位处进行。在一些实施方案中，治疗或预防在肠处以及除肠以外的部位处进行。
TLR5的表达已在包括多发性骨髓瘤[54]和急性髓样白血病[55]的血液癌细胞系中检测到。本发明人已在实施例中证实来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽特别有效激活强烈的TLR5反应。来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽因此可适用于治疗或预防表达TLR5的血液癌，例如多发性骨髓瘤和急性髓样白血病。因此，在某些实施方案中，本发明提供包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗或预防血液恶性病，例如多发性骨髓瘤；急性和慢性白血病，例如急性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病和急性单核细胞性白血病；淋巴瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)和非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma)；和骨髓发育不良综合征。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗急性髓样白血病。
在某些实施方案中，本发明提供包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗或预防多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，本发明提供包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗或预防急性髓样白血病。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗多发性骨髓瘤。
各种TLR激动剂已在广泛的一系列肿瘤模型和临床试验中测试[56]。举例来说，已显示TLR5激动剂CBLB502促进T和B细胞淋巴瘤的小鼠模型中的肿瘤清除[57]。TLR5激动剂安托莫德(entolimod)(药理学上优化的鞭毛蛋白衍生物)的全身施用抑制小鼠模型中的结肠直肠细胞的肝转移。在施用TLR5激动剂安托莫德之后，肝显示最强的TLR5激活反应[58]。本发明人已在实施例中证实来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽充当强TLR5激动剂。因此，来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽可特别有效治疗或预防T和B细胞淋巴瘤、结肠直肠癌和肝癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防T和B细胞淋巴瘤。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗T和B细胞淋巴瘤。
在其它实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或预防转移。在其它实施方案中，本发明的组合物可用于治疗转移癌。在其它实施方案中，本发明的组合物可用于治疗晚期癌症。在某些实施方案中，本发明提供包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗、减少或预防转移。在某些实施方案中，本发明的组合物可减少或预防转移性生长。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗或预防转移。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗或预防转移癌。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于治疗或预防晚期癌症。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防癌瘤。
已显示创伤弧菌鞭毛蛋白B(FlaB)通过TLR4和TLR5信号通路的两步激活来有效抑制肿瘤生长。在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽可激活TLR4和TLR5信号通路。在其它实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽仅激活TLR5信号通路。
在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽可激活NFκB信号通路。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可激活TLR9信号通路。参考文献[59]显示鞭毛蛋白与TLR9激动剂含CpG寡脱氧核苷酸之间的协同作用引起肿瘤抑制。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可激活TLR5和TLR9信号通路。在某些这样的实施方案中，本发明的组合物包含含CpG寡脱氧核苷酸或与含CpG寡脱氧核苷酸组合施用。
本发明的组合物对癌症的治疗作用可由促炎性机制介导。鞭毛蛋白对TLR5的活化起始促炎性信号级联。参考文献[59]显示鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白与高免疫原性肿瘤的相互作用诱导Th1反应和Treg抑制，从而抑制肿瘤生长。相比之下，弱免疫原性肿瘤的生长速率不受鞭毛蛋白施用所影响。因此，在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽和组合物用于治疗免疫原性肿瘤，特别是高免疫原性肿瘤。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在癌症治疗中促进发炎。在优选的实施方案中，本发明的组合物用于在癌症治疗中促进Th1发炎。Th1细胞产生IFNγ并且具有强效抗癌作用[60]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗早期癌症，例如尚未转移的癌症，或0期或1期癌症。促进发炎可更有效对抗早期癌症[60]。
参考文献[59]显示在肿瘤移植之后施用鞭毛蛋白显著抑制抗原性肿瘤生长。鞭毛蛋白对肿瘤生长的不同作用与所诱导的免疫反应相关。在移植之后施用鞭毛蛋白与IFN-γ:IL-4比率增加和CD4+CD25+T调控细胞频率减少相关联。因此，在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽和组合物增加IFN-γ:IL-4比率。在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽和组合物减少CD4+CD25+T调控细胞的频率。在其它实施方案中，本发明的鞭毛蛋白多肽和组合物并不降低IFN-γ:IL-4比率并且增加CD4+CD25+T细胞频率。发炎可具有癌症抑制作用[60]，并且正研究例如TNFα的促炎性细胞因子作为癌症疗法[61]。例如TNF的基因的上调可指示本发明的组合物可用于经由类似机制治疗癌症。CXCR3配体(CXCL9、CXCL10)和IFNγ可诱导基因(IL-32)的上调可指示本发明的组合物引起IFNγ型反应。IFNγ是可刺激杀肿瘤活性的强效巨噬细胞活化因子[62]，并且例如CXCL9和CXCL10也具有抗癌作用[63-65]。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于促进发炎以增强第二抗癌剂的作用。在某些实施方案中，癌症的治疗或预防包含增加一种或多种细胞因子的表达水平。举例来说，在某些实施方案中，癌症的治疗或预防包含增加IL-1β、IL-6和TNF-α中的一者或多者的表达水平，例如IL-1β和IL-6、IL-1β和TNF-α、IL-6和TNF-α或IL-1β、IL-6和TNF-α全部三者。已知IL-1β、IL-6和TNF-α中的任一者的表达水平的增加指示癌症治疗中的功效。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗先前已接受化学疗法的患者。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗尚未耐受化学疗法治疗的患者。本发明的组合物可特别适合于这样的患者。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防复发。本发明的组合物可适合于长期施用。在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防癌症进展。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗非小细胞肺癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗小细胞肺癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗鳞状细胞癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗腺癌。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗腺肿瘤、类癌肿瘤或未分化癌瘤。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗肝母细胞瘤、胆管癌、胆管细胞囊腺癌或因病毒感染引起的肝癌。
在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗侵入性管癌、原位管癌或侵入性小叶癌。
在其它实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、神经管母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、类癌肿瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾细胞癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、咽癌、垂体腺瘤、浆细胞赘瘤、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。
本发明的组合物当与其它治疗剂组合使用时可特别有效。本发明的组合物的免疫调节作用当与更直接抗癌剂组合时可为有效的。因此，在某些实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽(或编码多核苷酸或表达宿主细胞)和抗癌剂。在优选的实施方案中，抗癌剂是免疫检查点抑制剂、靶向抗体免疫疗法、CAR-T细胞疗法、溶瘤病毒或细胞生长抑制药。抗癌剂优选是可瑞达(Keytruda)(派姆单抗(pembrolizumab)，Merck)。在其它优选的实施方案中，组合物包含选自由以下组成的组的抗癌剂：伊沃(Yervoy)(伊匹单抗(ipilimumab)，BMS)；欧狄沃(Opdivo)(纳武单抗(nivolumab)，BMS)；MEDI4736(AZ/MedImmune)；MPDL3280A(Roche/Genentech)；替西木单抗(Tremelimumab)(AZ/MedImmune)；CT-011(匹利珠单抗(pidilizumab)，CureTech)；BMS-986015(利丽单抗(lirilumab)，BMS)；MEDI0680(AZ/MedImmune)；MSB-0010718C(Merck)；PF-05082566(Pfizer)；MEDI6469(AZ/MedImmune)；BMS-986016(BMS)；BMS-663513(乌瑞鲁单抗(urelumab)，BMS)；IMP321(Prima Biomed)；LAG525(Novartis)；ARGX-110(arGEN-X)；PF-05082466(Pfizer)；CDX-1127(伐立鲁单抗(varlilumab)，CellDex Therapeutics)；TRX-518(GITR Inc.)；MK-4166(Merck)；JTX-2011(Jounce Therapeutics)；ARGX-115(arGEN-X)；NLG-9189(吲哚莫德(indoximod)，NewLink Genetics)；INCB024360(Incyte)；IPH2201(Innate Immotherapeutics/AZ)；NLG-919(NewLink Genetics)；抗VISTA(JnJ)；帕多司他(Epacadostat)(INCB24360，Incyte)；F001287(Flexus/BMS)；CP 870893(宾州大学(University of Pennsylvania))；MGA271(Macrogenix)；依玛妥珠单抗(Emactuzumab)(Roche/Genentech)；加仑替尼(Galunisertib)(Eli Lilly)；乌洛鲁单抗(Ulocuplumab)(BMS)；BKT140/BL8040(Biokine Therapeutics)；巴维昔单抗(Bavituximab)(PeregrinePharmaceuticals)；CC 90002(Celgene)；852A(Pfizer)；VTX-2337(VentiRxPharmaceuticals)；IMO-2055(Hybridon，Idera Pharmaceuticals)；LY2157299(EliLilly)；EW-7197(韩国梨花女子大学(Ewha Women's University,Korea))；维罗非尼(Vemurafenib)(Plexxikon)；达拉非尼(Dabrafenib)(Genentech/GSK)；BMS-777607(BMS)；BLZ945(Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre)；优土新(Unituxin)(达妥昔单抗(dinutuximab)，United Therapeutics Corporation)；博林托(Blincyto)(博纳吐单抗(blinatumomab)，Amgen)；克玛泽(Cyramza)(雷莫芦单抗(ramucirumab)，Eli Lilly)；加扎瓦(Gazyva)(奥比妥珠单抗(obinutuzumab)，Roche/Biogen)；卡塞罗(Kadcyla)(阿多曲妥珠单抗美坦新(ado-trastuzumab emtansine)，Roche/Genentech)；帕罗嘉(Perjeta)(帕妥珠单抗(pertuzumab)，Roche/Genentech)；阿德曲司(Adcetris)(布伦妥昔单抗维多汀(brentuximab vedotin)，Takeda/Millennium)；奥泽拉(Arzerra)(奥法木单抗(ofatumumab)，GSK)；维克替比(Vectibix)(帕尼单抗(panitumumab)，Amgen)；阿瓦斯丁(Avastin)(贝伐单抗(bevacizumab)，Roche/Genentech)；爱必妥(Erbitux)(西妥昔单抗(cetuximab)，BMS/Merck)；百克沙(Bexxar)(托西莫单抗I131(tositumomab-I131)，GSK)；泽瓦林(Zevalin)(替坦异贝莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen)；坎帕斯(Campath)(阿仑单抗(alemtuzumab)，Bayer)；麦罗塔(Mylotarg)(吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumabozogamicin)，Pfizer)；赫塞汀(Herceptin)(曲妥珠单抗(trastuzumab)，Roche/Genentech)；美罗华(Rituxan)(利妥昔单抗(rituximab)，Genentech/Biogen)；弗洛西单抗(volociximab)(Abbvie)；恩凡珠单抗(Enavatuzumab)(Abbvie)；ABT-414(Abbvie)；埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)(Abbvie/BMS)；ALX-0141(Ablynx)；奥扎利单抗(Ozaralizumab)(Ablynx)；Actimab-C(Actinium)；Actimab-P(Actinium)；多克米拉珠单抗(Milatuzumab-dox)(Actinium)；Emab-SN-38(Actinium)；伊土莫单抗(Naptumonmab estafenatox)(Active Biotech)；AFM13(Affimed)；AFM11(Affimed)；AGS-16C3F(Agensys)；AGS-16M8F(Agensys)；AGS-22ME(Agensys)；AGS-15ME(Agensys)；GS-67E(Agensys)；ALXN6000(沙玛立珠单抗(samalizumab)，Alexion)；ALT-836(Altor Bioscience)；ALT-801(AltorBioscience)；ALT-803(Altor Bioscience)；AMG780(Amgen)；AMG 228(Amgen)；AMG820(Amgen)；AMG172(Amgen)；AMG595(Amgen)；AMG110(Amgen)；AMG232(阿德木单抗(adecatumumab)，Amgen)；AMG211(Amgen/MedImmune)；BAY20-10112(Amgen/Bayer)；利妥木单抗(Rilotumumab)(Amgen)；地诺单抗(Denosumab)(Amgen)；AMP-514(Amgen)；MEDI575(AZ/MedImmune)；MEDI3617(AZ/MedImmune)；MEDI6383(AZ/MedImmune)；MEDI551(AZ/MedImmune)；莫西妥莫单抗帕斯多克(Moxetumomab pasudotox)(AZ/MedImmune)；MEDI565(AZ/MedImmune)；MEDI0639(AZ/MedImmune)；MEDI0680(AZ/MedImmune)；MEDI562(AZ/MedImmune)；AV-380(AVEO)；AV203(AVEO)；AV299(AVEO)；BAY79-4620(Bayer)；拉安土单抗(Anetumab ravtansine)(Bayer)；万替珠单抗(vantictumab)(Bayer)；BAY94-9343(Bayer)；西罗珠单抗(Sibrotuzumab)(Boehringer Ingleheim)；BI-836845(BoehringerIngleheim)；B-701(BioClin)；BIIB015(Biogen)；奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)(Biogen/Genentech)；BI-505(Bioinvent)；BI-1206(Bioinvent)；TB-403(Bioinvent)；BT-062(Biotest)；BIL-010t(Biosceptre)；MDX-1203(BMS)；MDX-1204(BMS)；耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(BMS)；CAN-4(Cantargia AB)；CDX-011(Celldex)；CDX1401(Celldex)；CDX301(Celldex)；U3-1565(Daiichi Sankyo)；帕图单抗(patritumab)(Daiichi Sankyo)；替加珠单抗(tigatuzumab)(Daiichi Sankyo)；尼妥珠单抗(nimotuzumab)(DaiichiSankyo)；DS-8895(Daiichi Sankyo)；DS-8873(Daiichi Sankyo)；DS-5573(DaiichiSankyo)；MORab-004(Eisai)；MORab-009(Eisai)；MORab-003(Eisai)；MORab-066(Eisai)；LY3012207(Eli Lilly)；LY2875358(Eli Lilly)；LY2812176(Eli Lilly)；LY3012217(EliLilly)；LY2495655(Eli Lilly)；LY3012212(Eli Lilly)；LY3012211(Eli Lilly)；LY3009806(Eli Lilly)；西妥木单抗(cixutumumab)(Eli Lilly)；弗兰单抗(Flanvotumab)(Eli Lilly)；IMC-TR1(Eli Lilly)；雷莫芦单抗(Ramucirumab)(Eli Lilly)；他布鲁单抗(Tabalumab)(Eli Lilly)；扎木单抗(Zanolimumab)(Emergent Biosolution)；FG-3019(FibroGen)；FPA008(Five Prime Therapeutics)；FP-1039(Five Prime Therapeutics)；FPA144(Five Prime Therapeutics)；卡妥索单抗(catumaxomab)(Fresenius Biotech)；IMAB362(Ganymed)；IMAB027(Ganymed)；IIuMax-CD74(Genmab)；HuMax-TFADC(Genmab)；GS-5745(Gilead)；GS-6624(Gilead)；OMP-21M18(登西珠单抗(demcizumab)，GSK)；马帕木单抗(mapatumumab)(GSK)；IMGN289(ImmunoGen)；IMGN901(ImmunoGen)；IMGN853(ImmunoGen)；IMGN529(ImmunoGen)；IMMU-130(Immunomedics)；多克米拉珠单抗(Immunomedics)；IMMU-115(Immunomedics)；IMMU-132(Immunomedics)；IMMU-106(Immunomedics)；IMMU-102(Immunomedics)；依帕珠单抗(Epratuzumab)(Immunomedics)；克利瓦单抗(Clivatuzumab)(Immunomedics)；IPH41(Innate Immunotherapeutics)；达雷木单抗(Daratumumab)(Janssen/Genmab)；CNTO-95(英妥木单抗(Intetumumab)，Janssen)；CNTO-328(司妥昔单抗(siltuximab)，Janssen)；KB004(KaloBios)；莫加利珠单抗(mogamulizumab)(Kyowa HakkoKirrin)；KW-2871(依美昔单抗(ecromeximab)，Life Science)；索耐珠单抗(Sonepcizumab)(Lpath)；马妥昔单抗(Margetuximab)(Macrogenics)；恩比利珠单抗(Enoblituzumab)(Macrogenics)；MGD006(Macrogenics)；MGF007(Macrogenics)；MK-0646(达洛珠单抗(dalotuzumab)，Merck)；MK-3475(Merck)；Sym004(Symphogen/MerckSerono)；DI17E6(Merck Serono)；MOR208(Morphosys)；MOR202(Morphosys)；Xmab5574(Morphosys)；BPC-1C(恩斯图单抗(ensituximab)，Precision Biologics)；TAS266(Novartis)；LFA102(Novartis)；BHQ880(Novartis/Morphosys)；QGE031(Novartis)；HCD122(鲁卡木单抗(lucatumumab)，Novartis)；LJM716(Novartis)；AT355(Novartis)；OMP-21M18(登西珠单抗(Demcizumab)，OncoMed)；OMP52M51(Oncomed/GSK)；OMP-59R5(Oncomed/GSK)；万替珠单抗(Oncomed/Bayer)；CMC-544(奥英妥珠单抗(inotuzumabozogamicin)，Pfizer)；PF-03446962(Pfizer)；PF-04856884(Pfizer)；PSMA-ADC(Progenics)；REGN1400(Regeneron)；REGN910(耐西维单抗(nesvacumab)，Regeneron/Sanofi)；REGN421(恩替库单抗(enoticumab)，Regeneron/Sanofi)；RG7221、RG7356、RG7155、RG7444、RG7116、RG7458、RG7598、RG7599、RG7600、RG7636、RG7450、RG7593、RG7596、DCDS3410A、RG7414(帕萨妥珠单抗(parsatuzumab))、RG7160(英加妥珠单抗(imgatuzumab))、RG7159(欧宾珠单抗(obintuzumab))、RG7686、RG3638(奥纳珠单抗(onartuzumab))、RG7597(Roche/Genentech)；SAR307746(Sanofi)；SAR566658(Sanofi)；SAR650984(Sanofi)；SAR153192(Sanofi)；SAR3419(Sanofi)；SAR256212(Sanofi)；SGN-LIV1A(林妥珠单抗(lintuzumab)，Seattle Genetics)；SGN-CD33A(Seattle Genetics)；SGN-75(伏司妥珠单抗马佛多汀(vorsetuzumab mafodotin)，Seattle Genetics)；SGN-19A(Seattle Genetics)；SGN-CD70A(Seattle Genetics)；SEA-CD40(Seattle Genetics)；替坦异贝莫单抗(Spectrum)；MLN0264(Takeda)；盖尼塔单抗(ganitumab)(Takeda/Amgen)；CEP-37250(Teva)；TB-403(Thrombogenic)；VB4-845(Viventia)；Xmab2512(Xencor)；Xmab5574(Xencor)；尼妥珠单抗(nimotuzumab)(YM Biosciences)；卡鲁单抗(Carlumab)(Janssen)；NY-ESO TCR(Adaptimmune)；MAGE-A-10TCR(Adaptimmune)；CTL019(Novartis)；JCAR015(Juno Therapeutics)；KTE-C19 CAR(Kite Pharma)；UCART19(Cellectis)；BPX-401(Bellicum Pharmaceuticals)；BPX-601(Bellicum Pharmaceuticals)；ATTCK20(UnumTherapeutics)；CAR-NKG2D(Celyad)；Onyx-015(Onyx Pharmaceuticals)；H101(ShanghaiSunwaybio)；DNX-2401(DNAtrix)；VCN-01(VCN Biosciences)；Colo-Ad1(PsiOxusTherapeutics)；ProstAtak(Advantagene)；Oncos-102(Oncos Therapeutics)；CG0070(Cold Genesys)；Pexa-vac(JX-594，Jennerex Biotherapeutics)；GL-ONC1(Genelux)；T-VEC(Amgen)；G207(Medigene)；HF10(Takara Bio)；SEPREHVIR(HSV1716，VirttuBiologics)；OrienX010(OrienGene Biotechnology)；瑞莱新(Reolysin)(OncolyticsBiotech)；SVV-001(Neotropix)；卡卡塔克(Cacatak)(CVA21，Viralytics)；爱宁达(Alimta)(Eli Lilly)；顺铂(cisplatin)；奥沙利铂(oxaliplatin)；伊立替康(irinotecan)；亚叶酸(folinic acid)；甲氨蝶呤(methotrexate)；环磷酰胺；5-氟尿嘧啶；泽卡迪(Zykadia)(Novartis)；塔非拉(Tafinlar)(GSK)；赛可瑞(Xalkori)(Pfizer)；易瑞沙(Iressa)(AZ)；吉泰瑞(Gilotrif)(Boehringer Ingelheim)；特罗凯(Tarceva)(Astellas Pharma)；海乐卫(Halaven)(Eisai Pharma)；维利帕尼(Veliparib)(Abbvie)；AZD9291(AZ)；阿来替尼(Alectinib)(Chugai)；LDK378(Novartis)；金特斯匹(Genetespib)(Synta Pharma)；特根普玛L(Tergenpumatucel-L)(NewLink Genetics)；GV1001(Kael-GemVax)；替万替尼(Tivantinib)(ArQule)；癌得星(Cytoxan)(BMS)；安可平(Oncovin)(EliLilly)；阿德力霉素(Adriamycin)(Pfizer)；健择(Gemzar)(Eli Lilly)；希罗达(Xeloda)(Roche)；伊沙普(Ixempra)(BMS)；阿巴仙(Abraxane)(Celgene)；曲司他(Trelstar)(Debiopharm)；泰素帝(Taxotere)(Sanofi)；蕾莎瓦(Nexavar)(Bayer)；IMMU-132(Immunomedics)；E7449(Eisai)；塞莫多克(Thermodox)(Celsion)；康美曲(Cometriq)(Exellxis)；朗斯弗(Lonsurf)(Taiho Pharmaceuticals)；开普拓(Camptosar)(Pfizer)；UFT(Taiho Pharmaceuticals)；和TS-1(Taiho Pharmaceuticals)。
在其它优选的实施方案中，鞭毛蛋白多肽与已与其它鞭毛蛋白一起显示有用作用的含CpG寡脱氧核苷酸组合(同时或依序)施用[59]。
在一些实施方案中，来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽是本发明的组合物中的唯一治疗活性剂。
保护免受毒性化学品、病原体或放射线暴露侵害
在某些实施方案中，本发明提供一种来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽、优选地来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽、优选地来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽，其用于预防或治疗与毒性化学品、病原体或放射线暴露相关联的症状。可将本发明的鞭毛蛋白施用于有毒性化学品、病原体或放射线暴露风险的受试者或最近暴露于毒性化学品、病原体或放射线的受试者，例如先前暴露1、2、3、4或5小时的受试者。
人群突然暴露于化学品、病原体或放射线可能导致实质性发病。一种保护人群的策略是激活先天性宿主防御途径，特别是快速诱导细胞保护和/或抗微生物基因表达的那些。在本领域中的许多工作已集中于TLR4激动剂LPS/内毒素，然而，LPS施用可导致严重炎性病态，包括败血症或严重肺损伤。另外，LPS是上皮细胞的不良刺激剂，所述上皮细胞是与病原体或化学品攻击相互作用的第一细胞。
鞭毛蛋白在包括哺乳动物、昆虫和植物的多种生物体中刺激宿主防御。与LPS成对比，鞭毛蛋白是上皮细胞中的先天性免疫信号通路的强效激活剂，但一般已观测为例如巨噬细胞和树突状细胞的造血细胞的不良激活剂。已观测到鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白不刺激显著水平的“主要”促炎性细胞因子，例如TNF-α，所述细胞因子介导与LPS相关联的副作用。已观测到鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白激活小鼠中TLR5介导的先天性免疫，从而保护小鼠免受化学品、病原体或放射线暴露侵害[66]。
已显示鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的施用经由需要TLR5的机制保护免受放射线暴露侵害[66]。当在放射线之前2小时预防性地施用鞭毛蛋白时观测到最佳的保护，但如果在辐射后至多4小时施用鞭毛蛋白，则仍观测到显著程度的保护。实施例显示来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽相比于鼠伤寒沙门氏菌能够刺激更强烈的TLR5反应。因此，本发明人已表明来自肠球菌属并且特别是来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽可适用作放射防护剂。
本发明提供来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽，其用作放射防护剂。本发明还提供鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽，其用作放射防护剂。更优选地，本发明提供特别是具有序列SEQ ID NO:1的来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽，其用作放射防护剂。
还已显示用TLR5激动剂安托莫德治疗在以下全部三种主要类型的放射敏感性组织中减少放射线诱发的损伤：造血、胃肠和皮肤。还已显示其在头颈放射线的小鼠模型中减轻放射线诱发的上皮损伤[67]。实施例显示来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽充当强效TLR5激动剂。因此，本发明人已表明来自肠球菌属并且特别是来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽可适用于减少放射线诱发的损伤。在某些实施方案中，包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物用于减少造血、胃肠或皮肤组织中放射线诱发的损伤。在某些实施方案中，包含来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的组合物用于减少放射线诱发的上皮损伤。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于减少放射线诱发的损伤。
在某些实施方案中，可在放射疗法之前，优选地经口施用本发明的组合物。在某些实施方案中，可在放射疗法之后不久，优选地经口施用本发明的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物有待施用于最近已经历放射疗法或计划经历放射疗法的患者。
在优选的实施方案中，在辐射暴露之前施用来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽。在其它实施方案中，在放射线暴露之后，优选在暴露之后4小时内施用来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽。
治疗细菌感染
已显示鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的施用刺激对细菌感染的免疫反应。参考文献[68]显示鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白与抗生素的预防性鼻内施用保护小鼠免受呼吸道肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)细菌侵害，而参考文献[66]显示在鼠伤寒沙门氏菌感染之前2小时经口施用鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白可降低死亡率。鞭毛蛋白通过激活TLR5先天性免疫反应来诱导这些反应。实施例显示来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽相比于鼠伤寒沙门氏菌能够刺激更强烈的TLR5反应。因此，本发明人已表明来自肠球菌属并且特别是来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽可适用于治疗或预防细菌感染。
本发明提供来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防细菌感染。本发明还提供鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防细菌感染。更优选地，本发明提供特别是具有序列SEQ ID NO:1的来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防细菌感染。
在某些实施方案中，来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽与用于治疗细菌感染的抗生素组合使用。在某些实施方案中，来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽是用于治疗细菌感染的组合物中所用的唯一治疗剂。
疫苗佐剂
微生物组分可用作佐剂以增强不良免疫原性疫苗的免疫反应。已显示鞭毛蛋白充当用于细菌、病毒和寄生虫感染的疫苗中的佐剂，然而，大多数这些研究使用来自鼠伤寒沙门氏菌和创伤弧菌的鞭毛蛋白[15]。来自其它菌种并且特别是肠球菌种的鞭毛蛋白多肽充当疫苗佐剂的功效是未知的。
鞭毛蛋白通过经TLR5受体刺激先天性免疫反应来充当佐剂。本发明人已令人惊讶地表明来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽相比于鼠伤寒沙门氏菌能够刺激更强烈的TLR5反应。因此，本发明人已表明来自肠球菌属并且特别是来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽可用作疫苗佐剂。使用鞭毛蛋白多肽作为疫苗佐剂意味着鞭毛蛋白多肽用于例如通常通过增强对单独抗原的免疫反应来提供对抗感染物的保护或防止受感染物感染。
本发明提供来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽，其用作疫苗佐剂。本发明还提供鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽，其用作疫苗佐剂。更优选地，本发明提供特别是具有序列SEQID NO:1的来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽，其用作疫苗佐剂。
本发明还提供包含本发明的鞭毛蛋白多肽作为佐剂的疫苗组合物。在某些实施方案中，疫苗组合物用于治疗或预防细菌感染。在某些实施方案中，有待治疗或预防的细菌病原体是鼠疫耶氏菌(Y.pestis)、破伤风(tetanus)、肺炎链球菌、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)或结核分枝杆菌(M.tuberculosis)。在某些实施方案中，疫苗组合物用于治疗或预防病毒感染。在某些实施方案中，有待治疗或预防的病毒病原体是流感、HIV、狂犬病或口蹄疫病毒。在某些实施方案中，疫苗组合物用于治疗或预防寄生虫感染。在某些实施方案中，寄生虫是间日疟原虫(Plasmodium vivax)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)或柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)。在任何这样的实施方案中，组合物包含至少一种来自相关病原体的抗原。在优选的这些实施方案中，组合物包含融合或接合至至少一种来自相关病原体的抗原的本发明的鞭毛蛋白。在这样的实施方案中，本发明提供一种融合多肽，其包含本发明的鞭毛蛋白、任选的接头和来自病原体或寄生虫的抗原。
通过粘膜途径施用是具吸引力的疫苗施用途径。鞭毛蛋白是上皮细胞中的先天性免疫信号通路的强效活化剂，所述上皮细胞是遭遇由粘膜途径施用的药剂的首要细胞类型。鼠伤寒沙门氏菌和创伤弧菌鞭毛蛋白在针对流感、西尼罗病毒(West Nile virus)、大肠埃希氏菌、鼠疫耶氏菌(Yersinia pestis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)、链球菌种和恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的粘膜疫苗中已显示强效佐剂活性[15]。来自其它菌种的鞭毛蛋白多肽充当粘膜疫苗佐剂的功效是未知的。
鞭毛蛋白通过经TLR5受体刺激先天性免疫反应来充当佐剂。本发明人已令人惊讶地表明来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽相比于鼠伤寒沙门氏菌能够刺激更强烈的TLR5反应。因此，本发明提供来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽，其用作粘膜疫苗佐剂。在优选的实施方案中，本发明提供来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽，其用作粘膜疫苗佐剂。更优选地，本发明提供特别是具有序列SEQ ID NO:1的来自菌株MRx0518的鞭毛蛋白多肽，其用作粘膜疫苗佐剂。
在某些实施方案中，来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽在粘膜疫苗中使用以供治疗或预防细菌感染。在优选的实施方案中，细菌感染是大肠埃希氏菌、鼠疫耶氏菌、破伤风梭菌、空肠弯曲杆菌、链球菌种或恶性疟原虫。在某些实施方案中，来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽在粘膜疫苗中使用以供治疗或预防病毒感染。在优选的实施方案中，病毒感染是流感或西尼罗病毒。
本发明的组合物的施用可导致肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达增加。已知TNF-α对于疫苗反应是重要的。举例来说，已显示TNF-α在老年人群的流感疫苗接种中为有效疫苗反应所需要[69]。因为本发明的组合物的施用可增加TNF-α表达，所以本发明的组合物可用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加TNF-α的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作流感疗法中的疫苗佐剂。在某些实施方案中，本发明的组合物用于增强针对抗原的免疫反应。在某些实施方案中，本发明提供一种有待与抗原组合施用的组合物。在本发明的这些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白可融合或接合至抗原。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在即将疫苗接种之前或在疫苗接种之后立即施用于患者。
鹑鸡肠球菌和特别是菌株MRX518有鞭毛并且鞭毛蛋白可以是TLR5激动剂。TLR激动剂跨越一系列抗原类型正开发作为疫苗佐剂，特别是在老年人群中[70]。此外，MRX518是TLR5激动剂。因此，本发明的组合物可用作疫苗佐剂，特别是用于施用于可能具有降低的免疫系统活性的老年患者(例如年龄超过40岁、50岁、60岁、70岁或80岁)的疫苗。TLR5信号传导也在年龄相关的先天性免疫反应中起关键作用[71]。在某些实施方案中，组合物用于增强先天性免疫反应。尽管TLR5激动剂正开发作为疫苗佐剂，但这些全部来自已知病原体和/或是合成的。相比之下，本发明的组合物包含共生细菌。
本发明的组合物的施用可导致IL-6的表达增加。增加的Il-6表达已与许多疾病的疫苗反应相关联。举例来说，在向成人施用流感疫苗后由CD14+CD16-炎性单核细胞产生IL-6[72]，并且较高水平的IL-6与实现对流感疫苗的疫苗反应相关联[73]。此外，在注射AS03佐剂系统后产生Il-6[74]，并且在施用结核疫苗后显示小鼠中IL-6的下调降低辅助T细胞反应[75]。由于本发明的组合物的施用可增加IL-6表达，因此本发明的组合物可用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加IL-6的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作结核疗法中的疫苗佐剂。
此外，已显示IL-6和TNF-α表达与治疗性HIV疫苗[Huang等]、结核疫苗和披衣菌疫苗[76]的功效相关。Su等[77]表明IL-6或TNF-α与FMDV DNA疫苗的共同接种使得CD4+和CD8+T细胞对IFN-γ的表达增加、CD4+T细胞中IL-4的表达更高和抗原特异性细胞毒性反应更高。由于本发明的组合物的施用可增加IL-6和TNF-α表达，因此本发明的组合物可用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加TNF-α的水平和/或活性可用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加IL-6的水平和/或活性可用作疫苗佐剂。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物通过增加TNF-α和IL-6的水平和/或活性可用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作HIV疗法中的疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作披衣菌疗法中的疫苗佐剂。
本发明的组合物的施用可导致IL-1β的表达增加。Li等[78]显示佐剂氢氧化铝激活IL-1β的分泌，并且表明IL-β本身可充当佐剂。由于本发明的组合物的施用可增加IL-1β表达，因此本发明的组合物可用作疫苗佐剂。实施例显示本发明的组合物的施用可增加CD8+T细胞与Treg的比率。已显示佐剂刺激CD8+T细胞[79]，并且由于显示本发明的组合物的施用增加CD8+T细胞与Treg的比率，因此本发明的组合物可用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加CD8+T细胞与Treg的比率而用作疫苗佐剂。
本发明的组合物的施用可导致CXCR3配体CXCL9和CXCL10的表达或水平增加。例如ASO3、CpG、GLA-SE、αGalCer的已知佐剂全部增加CXCL9和10[80、81]，这表明本发明的组合物将有效作为佐剂。此外，CXCL9和10与IFNγ/Th1反应相关联并且促进抗体反应[82]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于促进针对抗原、特别是病原性或癌症抗原的抗体反应。此外，在接受所研究的疟疾疫苗的志愿者中CXCL9相比于IFN-γ为疫苗诱导的T细胞反应的更敏感量度[83]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于促进针对抗原、特别是病原性或癌症抗原的T细胞反应。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加CXCL9和CXCL10的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。在某些实施方案中，组合物用于保护免受疟疾侵害。
本发明的组合物的施用可导致IL-12p70的表达或水平增加。这种作用已与疫苗佐剂效率相关联并且已提议IL-12作为佐剂本身[84]，这表明本发明的组合物将有效作为佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加IL-12p70的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。
通常，当用作疫苗佐剂时，本发明的组合物将单独施用以向已独立地施用于患者的抗原提供佐剂作用。在某些实施方案中，经口施用本发明的组合物，而非经肠注射抗原。在替代性实施方案中，本发明的鞭毛蛋白可融合或接合至抗原。
本发明的组合物可用于增强对任何有用抗原的免疫反应。用于本发明的示例性抗原包括：病毒抗原，例如病毒表面蛋白；细菌抗原，例如蛋白质和/或糖抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；和肿瘤抗原。本发明特别适用于对抗以下的疫苗：流感病毒、HIV、钩虫、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、披衣菌、SARS冠状病毒、水痘带状疱疹病毒、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类乳头状瘤病毒等。在某些实施方案中，本发明的鞭毛蛋白融合或接合至这些抗原中的一者或多者。
与本发明的鞭毛蛋白一起使用的其它抗原包括糖蛋白和脂聚糖抗原。在某些实施方案中，抗原是古细菌抗原。示例性肿瘤相关抗原包括黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸化Tn(STn)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、威尔姆斯瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特异性抗原(PSA)、爱泼斯坦-巴尔病毒抗原、新抗原和致癌蛋白。
本发明的鞭毛蛋白也可用于增强对疫苗的反应，所述疫苗对抗非传染性疾病，例如阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)和其它神经退化性病症，在所述情况下用于本发明的抗原可以是类淀粉蛋白β或Tau。用于非传染性疾病的其它这样的抗原包括PCSK9(对于高胆固醇的治疗)。本发明的鞭毛蛋白也可用于增强对疫苗的反应，所述疫苗对抗成瘾性物质，例如烟碱、酒精或鸦片剂。
本发明还提供以下的用途：(i)抗原的水性制剂；和(ii)包含来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽的组合物，其用于制造用以提高患者中的免疫反应的药物。
通过这些方法和用途提高的免疫反应通常将包括抗体反应，优选地保护性抗体反应。
刺激免疫系统
本发明的组合物可引起免疫刺激。由于本发明的组合物的施用可具有免疫刺激作用，因此本发明的组合物可用于治疗疾病，特别是以降低的免疫激活为特征的疾病和由增加的免疫反应可治疗的疾病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于刺激免疫系统。在某些实施方案中，本发明的组合物用于通过刺激免疫系统来治疗疾病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于促进免疫反应。
本发明的组合物可用于治疗以细胞群体中Treg的百分比增加为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或预防以细胞群体中Treg的百分比增加为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或预防以细胞群体中CD4+CD25+CD127-细胞的百分比增加为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过降低细胞群体中Treg的百分比来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于减少Treg对免疫反应的抑制。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过Treg的选择性降低来刺激免疫反应。在一个实施方案中，本发明的组合物用于免疫刺激，其中本发明的组合物减少Treg的数目或百分比。
本发明的组合物可用于治疗以CD8/Treg和/或经活化的CD8/Treg细胞的比率降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以CD8/Treg细胞的比率降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以经活化的CD8/Treg细胞的比率降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加CD8/Treg细胞的比率来刺激免疫反应。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加经活化的CD8/Treg细胞的比率来刺激免疫反应。
本发明的组合物可用于治疗以B细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以B细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以CD19+CD3-细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加细胞群体中B细胞的数目或百分比来治疗或预防疾病，其中B细胞的数目或百分比的增加引起免疫刺激。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加B细胞的数目或百分比来刺激免疫反应。
本发明的组合物可用于治疗以CD8 T细胞毒性细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以CD8 T细胞毒性细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加细胞群体中CD8 T细胞毒性细胞的数目或百分比来治疗或预防疾病，其中CD8 T细胞毒性细胞的数目或百分比的增加引起免疫刺激。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加CD8 T细胞毒性细胞的数目或百分比来刺激免疫反应。
本发明的组合物可用于治疗以CD8+活化细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以CD8+活化细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加细胞群体中CD8+活化细胞的数目或百分比来治疗或预防疾病，其中CD8+活化细胞的数目或百分比的增加引起免疫刺激。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加CD8+活化细胞的数目或百分比来刺激免疫反应。
本发明的组合物的施用可导致例如促炎性细胞因子的促炎性分子的表达增加。在施用本发明的组合物后可显示表达水平增加的促炎性分子的实例包括IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β和IL-6。由于本发明的组合物的施用可增加促炎性分子的表达，因此本发明的组合物可用于治疗以例如促炎性细胞因子的促炎性分子的表达降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以促炎性分子的表达和/或活性降低为特征的疾病，特别是以促炎性细胞因子的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β和/或IL-6的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-23、TNF-α、IL-1β和/或IL-6的表达和/或活性来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β和/或IL-6的表达和/或活性来促进免疫反应。
本发明的组合物的施用可导致IL-1β的表达增加。IL-1β是促炎性细胞因子[85]。IL-1β的产生和分泌由炎性体调控，所述炎性体是与发炎反应的激活相关联的蛋白质复合物[86]。由于本发明的组合物的施用可增加IL-1β的表达，因此本发明的组合物可用于治疗以IL-1β的表达降低为特征的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以IL-1β的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-1β的表达和/或活性来治疗或预防疾病。
本发明的组合物的施用可导致IL-23的表达增加。IL-23已与发炎相关联[87、88]。所提出的IL-23在免疫反应中的功能包括促进CD4+记忆T细胞的增殖和促进由树突状细胞(DC)分泌IFN-γ[89]。由于本发明的组合物的施用可增加IL-23的表达，因此本发明的组合物可用于治疗以IL-23的表达降低为特征的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以IL-23的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-23的表达和/或活性来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-23的表达和/或活性来促进免疫反应。
本发明的组合物的施用可导致肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达增加。TNF-α是已知涉及于各种信号通路中以促进细胞死亡的促炎性细胞因子。TNF-α通过结合至其同源受体TNFR-1来起始凋亡，这引起凋亡途径中的裂解事件级联[90]。TNF-α也可经由RIP激酶依赖性机制来触发坏死[91]。由于本发明的组合物的施用可增加TNF-α表达，因此本发明的组合物可用于治疗疾病，特别是用于治疗或预防以TNF-α的表达降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗以降低的TNF-α表达为特征的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以TNF-α的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物可用于通过增加TNF-α的表达和/或活性来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加TNF-α的表达和/或活性来促进免疫反应。
本发明的组合物的施用可导致IL-6的表达增加。IL-6是一种促炎性细胞因子，其在发炎期间产生，并促进初始CD4+T细胞分化和CD8+T细胞分化成细胞毒性T细胞[92]。由于本发明的组合物的施用可增加IL-6的表达，因此本发明的组合物可用于治疗以IL-6的表达降低为特征的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以IL-6的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-6的表达和/或活性来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-6的表达和/或活性来促进免疫反应。
Bettelli等[93]报道IL-6抑制Treg的产生。本发明的组合物可增加IL-6的表达，因此本发明的组合物可通过增加IL-6的表达来选择性地减少Treg的数目或百分比。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加IL-6的表达用于免疫刺激。在另一个实施方案中，本发明的组合物通过减少Treg的数目或百分比用于免疫刺激。
实施例也证实本发明的组合物促进T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞的分化。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物用于刺激T辅助细胞和/或细胞毒性T淋巴细胞的分化。
细胞疗法
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法
本发明的组合物的施用可导致IL-6的表达增加。增加的Il-6表达已与对慢性淋巴细胞白血病的CD19 CAR-T疗法的反应相关。血清IL-6的增加与CAR-T细胞扩增相关联，而IL-6的抑制与CAR-T细胞增殖的抑制相关联[94]。由于本发明的组合物的施用可增加IL-6表达，因此本发明的组合物可用于细胞疗法，特别是CAR-T细胞疗法。在一个实施方案中，本发明的组合物用于细胞疗法中。在一个实施方案中，本发明的组合物用于CAR-T细胞疗法中。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗慢性淋巴细胞白血病。
已显示Treg的选择性耗尽增强细胞毒性淋巴细胞的功效[95]。CAR-T细胞是细胞毒性淋巴细胞的子组，并且因此认为Treg的选择性耗尽在CAR-T细胞疗法中有效。由于本发明的组合物的施用可使Treg耗尽，因此本发明的组合物可用于细胞疗法，特别是CAR-T细胞疗法。
因此，本发明的组合物可用于细胞疗法，特别是增强对细胞疗法的反应。
间充质干细胞(MSC)疗法
已报道间充质干细胞(MSC)疗法具有免疫刺激特性。当MSC用LPS处理时，MSC上调促炎性细胞因子IL-6和IL-8，这引起增加的B细胞增殖[96]。因此，由于本发明的组合物可增加IL-6的表达，因此它们可用于与MSC细胞疗法组合。
干细胞移植疗法
已报道在干细胞移植疗法中替代使用未分化干细胞，在移植之前使干细胞在一定程度上分化可为有益的。举例来说，Heng等[97]报道干细胞的心肌源性分化通过具有较高植入效率、增强的肌细胞再生和增加的心功能恢复可以是有益的。由于本发明的组合物的施用可起始未分化神经母细胞瘤细胞中的神经元分化，因此本发明的组合物可用于干细胞移植疗法中的干细胞分化。
造血干细胞移植
造血干细胞移植是通常来源于骨髓、外周血或脐带血的多能造血干细胞的移植。已显示在同种异体造血干细胞移植之前肠道经肠球菌(鹑鸡肠球菌和酪黄肠球菌)定殖可由于非复发死亡率降低而使患者的2年存活率显著提高[98]。因此，实施例中所示的免疫调节作用可用于造血干细胞移植疗法。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于提高造血干细胞移植后和特别是同种异体造血干细胞移植后的存活率。
本发明的组合物可用于与同种异体造血干细胞移植组合。本发明的组合物可实现加强对同种异体造血干细胞移植的成功患者反应。在某些实施方案中，在造血干细胞移植之前施用本发明的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物用于施用于计划接受造血干细胞移植的患者。在某些实施方案中，在造血干细胞移植之后施用本发明的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物用于施用于已接受造血干细胞移植的患者。
免疫衰老
Fulop等[99]鉴定Treg细胞数目的增加和B细胞数目的减少与适应性免疫系统的老化相关联。因此，本发明的组合物可用于预防或延迟免疫衰老。在一个实施方案中，本发明的组合物用于预防免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于延迟以Treg细胞数目的增加为特征的免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于延迟以B细胞数目的减少为特征的免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于延迟以Treg细胞数目的增加和B细胞数目的减少为特征的免疫衰老。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过减少Treg细胞数目来延迟免疫衰老。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加B细胞数目来延迟免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于通过减少Treg细胞数目和增加B细胞数目来延迟免疫衰老。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗由免疫衰老引起的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过延迟和/或预防免疫衰老来治疗老化相关疾病。
此外，已提议疫苗佐剂可攻克免疫衰老[100]。由于本发明的组合物适合用作疫苗佐剂，因此本发明的组合物可用于预防或延迟免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物作为疫苗佐剂用于延迟和/或预防免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物用作疫苗佐剂，其中组合物延迟和/或预防免疫衰老。
与免疫衰老相关联的疾病包括心血管疾病、例如阿尔茨海默病和帕金森病(Parkinson's disease)的神经退化性疾病、癌症、2型糖尿病[101]和自身免疫病症[102]。
施用模式
优选地，本发明的组合物通过注射，优选地皮下或替代地静脉内或腹膜内施用。关于适合于通过注射施用的组合物的更多细节在下一章节中提供。在替代性实施方案中，本发明的组合物有待施用于胃肠道。已知免疫系统由胃肠道中细菌和细菌蛋白的存在来调节。本发明的组合物是经口施用的，但它们可经直肠、鼻内或经颊或舌下途径施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物可作为泡沫剂、作为喷雾剂或凝胶施用。
在某些实施方案中，本发明的组合物可作为栓剂如直肠栓剂施用，例如以可可油(可可脂)、合成硬脂肪(例如苏博瑞(suppocire)、威特索(witepsol))、甘油明胶、聚乙二醇或皂甘油组合物的形式。
在某些实施方案中，将本发明的组合物经由管，例如鼻胃管、口胃管、胃管、空肠造口管(J管)、经皮内镜胃造瘘(PEG)或口，例如可进入胃、空肠的胸壁口和其它合适的进入口施用于胃肠道。
本发明的组合物可一次性施用，或其可作为治疗方案的一部分依序施用。在某些实施方案中，本发明的组合物有待每日施用。
在本发明的某些实施方案中，根据本发明的治疗伴随着患者的肠道微生物群的评估。
可将本发明的组合物施用于已诊断出患有癌症或已鉴定为处于癌症风险中的患者。组合物也可作为预防措施施用以预防健康患者中的癌症发展。
可将本发明的组合物施用于已鉴定为具有异常肠道微生物群的患者。举例来说，患者可具有减少的或不存在肠球菌种、特别是鹑鸡肠球菌的定殖。
通常，本发明的组合物用于治疗人类，但其可用于治疗动物，包括单胃哺乳动物，例如家禽、猪、猫、犬、马或兔。本发明的组合物可用于增强动物的生长和性能。如果施用于动物，则可使用经口管饲。
组合物
通常，本发明的组合物包含来自肠球菌属并且特别是来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽。
在优选的实施方案中，本发明的组合物被囊封以能够将鞭毛蛋白递送至肠。囊封保护组合物免于降解直至递送于目标位置处，所述降解通过例如用化学或物理刺激(例如压力)、酶促活性或可由pH变化触发的物理崩解而破坏。可使用任何适当的囊封方法。示例性囊封技术包括截留于多孔基质内，附着或吸附于固体载体表面上，通过絮凝或用交联剂自聚集，和机械容纳于微孔膜或微胶囊后。
组合物因此可为药学上可接受的。它们通常将包括除鞭毛蛋白多肽(或核酸)以外的组分，例如它们通常包括一种或多种药物载体和/或赋形剂。
可将组合物以水性形式施用于人类。然而，在这样的实施方案中，在施用之前，组合物可能已呈非水性形式。举例来说，尽管一些治疗剂以水性形式制造，然后也以水性形式填充和分配并施用，但其它治疗剂在制造期间冻干并且在使用时重构成水性形式。因此，本发明的组合物可经干燥，例如冻干制剂。
组合物可包括防腐剂，例如硫柳汞(thiomersal)或2-苯氧基乙醇。然而，治疗剂优选应基本上不含(即，小于5μg/ml)汞剂材料，例如不含硫柳汞。不含汞的治疗剂更为典型。无防腐剂的治疗剂特别有利。
为改良热稳定性，组合物可包括温度保护剂。这些试剂的更多细节提供于下文。
为控制张力，通常包括生理盐，例如钠盐。通常使用氯化钠(NaCl)，其可在1与20mg/ml之间存在，例如约10±2mg/ml NaCl。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
组合物通常将具有介于200mOsm/kg与400mOsm/kg之间、更常介于240至360mOsm/kg之间的摩尔渗透压浓度，并且将更通常处于290至310mOsm/kg的范围内。
组合物可包括一种或多种缓冲剂。典型缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；丁二酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂将通常包括于5至20mM的范围内。
组合物的pH值通常将介于5.0与8.1之间，并且更通常介于6.0与8.0，例如6.5与7.5之间，或介于7.0与7.8之间。
组合物通常是无菌的。组合物也通常是无热原质的，例如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，例如每剂量<0.1EU。组合物通常无麸质。
组合物可包括用于单次施用的材料，或者可包括用于多次施用的材料(即，‘多剂量’试剂盒)。包括防腐剂在多剂量配置中是典型的。作为多剂量组合物中包括防腐剂的替代(或除此以外)，组合物可容纳于具有用于移出材料的无菌转接器的容器中。
通常以约0.5ml的剂量体积施用人类蛋白治疗剂，但可将半剂量(即，约0.25ml)施用于儿童。
本发明的组合物也可包含一种或多种免疫调节剂。通常，免疫调节剂中的一者或多者包括一种或多种佐剂。佐剂可包括下文进一步论述的TH1佐剂和/或TH2佐剂。
组合物可制备成可注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可制备适合于在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式(例如冻干组合物或喷雾冷冻干燥的组合物)。可制备组合物用于局部施用，例如作为软膏、乳膏或粉末。可制备组合物用于经口施用，例如作为片剂或胶囊、作为喷雾剂或作为糖浆(任选地经调味)。可制备组合物用于肺部施用，例如作为吸入剂、使用细粉或喷雾剂。组合物可制备成栓剂或子宫托。可制备组合物用于经鼻、经耳或经眼施用，例如作为滴剂。组合物可呈试剂盒形式，其被设计成使得组合的组合物在即将施用于哺乳动物之前重构。这样的试剂盒可包含一种或多种呈液体形式的抗原和一种或多种冻干抗原。在某些实施方案中，存在于组合物中的本发明的鞭毛蛋白可融合或接合至一种或多种抗原。
在组合物将要在使用前实时制备(例如在组分以冻干形式呈现的情况下)并且作为试剂盒呈现的情况下，所述试剂盒可包含两个小瓶，或者其可包含一个待填充注射器和一个小瓶，其中注射器的内含物用于在注射之前再活化小瓶的内含物。
用作治疗剂的组合物包含免疫学上有效量的多肽或编码核酸，以及任何其它组分(视需要)。‘免疫学上有效量’意指将所述量以单次剂量或作为系列的一部分施用于个体可有效用于治疗或预防。该量根据以下而变：有待治疗的个体的健康和身体状况，年龄，有待治疗的个体的分类群(例如非人类灵长类动物、灵长类动物等)，个体的免疫系统合成抗体的能力，所需保护程度，疫苗制剂，主治医生对医疗情况的评估和其它相关因素。预期所述量将处于可通过常规试验确定的相对较宽范围内。在组合物中包括超过一种抗原的情况下，则两种抗原可以彼此相同的剂量或以不同剂量存在。
如上文所提及，组合物可包括温度保护剂，并且该组分可特别适用于加佐剂的组合物(特别是含有例如铝盐的矿物佐剂的那些)。如参考文献103中所述，可将液体温度保护剂添加至水性疫苗组合物中以降低其凝固点，例如以使凝固点降至低于0℃。因此，组合物可在低于0℃但高于其凝固点下储存，以抑制热分解。温度保护剂还允许组合物凝固，同时保护矿物盐佐剂免于在冷冻和解冻之后聚结或沉积，并且也可在例如高于40℃的高温下保护组合物。初始水性疫苗与液体温度保护剂可混合以使得液体温度保护剂构成最终混合物的1-80体积％。合适的温度保护剂对于人类施用应为安全的，易混溶/可溶于水中，并且不应破坏组合物中的其它组分(例如抗原和佐剂)。实例包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适的PEG可具有在200至20,000Da范围内的平均分子量。在一个实施方案中，聚乙二醇可具有约300Da的平均分子量(‘PEG-300’)。
本发明提供一种组合物，其包含：(i)一种或多种鞭毛蛋白多肽；和(ii)温度保护剂。该组合物可通过混合以下形成：(i)包含一种或多种抗原的水性组合物与(ii)温度保护剂。混合物然后可在例如低于0℃、0℃至20℃、20℃至35℃、35℃至55℃或更高温度下储存。混合物可以液体或冷冻形式储存。混合物可为冻干的。或者，组合物可通过混合以下形成：(i)包含一种或多种抗原的经干燥组合物与(ii)包含温度保护剂的液体组合物。因此，组分(ii)可用于使组分(i)重构。
组合物可经口施用并且可呈片剂、胶囊或粉末形式。其它成分(例如维生素C)可作为除氧剂和益生元基质包括在内以改善递送和/或部分或全部定殖和体内存活。
本发明的组合物包括治疗有效量的本发明的鞭毛蛋白多肽。鞭毛蛋白多肽的治疗有效量足以对患者发挥有益作用。
本发明的组合物可包含药学上可接受的赋形剂或载体。这些合适的赋形剂的实例可见于参考文献[104]中。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在医药领域中是众所周知的并且描述于例如参考文献[105]中。合适载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可关于预期施用途径和标准医药惯例来选择。药物组合物可包含以下作为载体、赋形剂或稀释剂或除此以外还包含以下：任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂布剂、增溶剂。合适的粘合剂的实例包括淀粉；明胶；天然糖，例如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂；天然和合成胶，例如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠；羧甲基纤维素；和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂可在药物组合物中提供。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。
在一些实施方案中，组合物包含超过一种来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽，其用于治疗或预防癌症。在某些实施方案中，组合物包含具有SEQ ID NO:1的鞭毛蛋白多肽和至少一种来自肠球菌属的其它鞭毛蛋白多肽。在某些实施方案中，组合物包含具有SEQ ID NO:1的鞭毛蛋白多肽和至少一种来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽。在某些实施方案中，组合物包含具有SEQ ID NO:1的鞭毛蛋白多肽和至少一种选自由SEQ ID NO 2-42组成的组的鞭毛蛋白多肽。在一些实施方案中，组合物可包含至少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、20种、25种、30种、35种、40种或45种来自肠球菌属并且特别是来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽。在一些实施方案中，本发明的组合物包含少于50种来自相同菌种(例如少于45种、40种、35种、30种、25种、20种、15种、12种、10种、9种、8种、7种、6种、5种、4种或3种菌株)内的鞭毛蛋白多肽，并且任选地不含来自任何其它菌种的鞭毛蛋白多肽。在一些实施方案中，本发明的组合物包含1至40种、1至30种、1至20种、1至19种、1至18种、1至15种、1至10种、1至9种、1至8种、1至7种、1至6种、1至5种、1至4种、1至3种、1至2种、2至50种、2至40种、2至30种、2至20种、2至15种、2至10种、2至5种、6至30种、6至15种、16至25种或31至50种来自相同菌种内的鞭毛蛋白多肽，并且任选地不含来自任何其它菌种的鞭毛蛋白多肽。
在本发明的组合物包含超过一种鞭毛蛋白多肽的一些实施方案中，个别鞭毛蛋白多肽可用于独立、同时或依序施用。举例来说，组合物可包含所有鞭毛蛋白多肽，或鞭毛蛋白多肽可独立地储存并且独立地同时或依序施用。在一些实施方案中，超过一种鞭毛蛋白多肽独立地储存，但在使用前混合在一起。
根据本发明使用的组合物可能需要或可能不需要营销核可。
本发明的组合物可包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：如本发明中所用的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：如本发明中所用的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症是乳腺癌。在优选的实施方案中，癌症是乳腺癌。在优选的实施方案中，癌症是IV期乳腺癌。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：如本发明中所用的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症是肺癌。在优选的实施方案中，癌症是肺癌。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：如本发明中所用的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症是肝癌。在优选的实施方案中，癌症是肝细胞瘤(肝细胞癌)。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：本发明的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症是结肠癌。在优选的实施方案中，癌症是结肠直肠腺癌。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：本发明的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症是癌瘤。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：本发明的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症是非免疫原性癌症。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：本发明的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症是免疫原性癌症。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：本发明的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症选自由非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、腺癌、腺肿瘤、类癌肿瘤、未分化癌瘤组成的组。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：本发明的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症选自由肝母细胞瘤、胆管癌、胆管细胞囊腺癌或因病毒感染引起的肝癌组成的组。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：本发明的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症选自由侵入性管癌、原位管癌或侵入性小叶癌组成的组。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含：本发明的鞭毛蛋白多肽；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中当施用于有需要的受试者时所述鞭毛蛋白多肽的量足以治疗病症；并且其中所述病症选自由以下组成的组：急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、神经管母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾细胞癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、咽癌、垂体腺瘤、浆细胞赘瘤、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。
核酸(例如基于核酸的治疗剂)的剂量可具有≤100μg核酸，例如10至100μg，例如约10μg、25μg、50μg、75μg或100μg，但可观察到低得多的水平的表达；例如使用≤1微克/剂、≤100纳克/剂、≤10纳克/剂、≤1纳克/剂等。类似地，蛋白质抗原的剂量可具有≤100μg蛋白质，例如10至100μg，例如约10μg、25μg、50μg、75μg或100μg。多肽可以约0.1至10mg/kg体重的剂量施用。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以单次剂量或更优选以重复剂量施用。优选地，重复剂量大约每2天、5天、10天、7天、10天或15天施用。在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述组合物以每公斤受试者体重100微克、200微克、300微克、400微克、500微克、1毫克、2毫克、5毫克、10毫克、20毫克、30毫克、50毫克、100毫克、200毫克或500毫克的剂量施用。合适的单位剂量包括1mg、2mg、5mg、10mg、20mg、30mg、50mg、100mg、200mg、500mg、1000mg、100至500mg、500至1000mg、200至400mg、500至750mg、750至1000mg。
在某些实施方案中，本发明提供包含本发明的宿主细胞的上述药物组合物。例如用于成年人的宿主细胞的合适日剂量可为约1×103个至约1×1011个菌落形成单位(CFU)；例如约1×107至约1×1010CFU；在另一个实例中约1×106至约1×1010CFU。
在某些实施方案中，组合物含有宿主细胞，其量以组合物重量计为约1×106至约1×1011CFU/g；例如约1×108至约1×1010CFU/g。剂量可为例如1g、3g、5g和10g。在一些实施方案中，组合物包含活宿主细胞与已杀灭的宿主细胞的混合物。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述组合物是通过选自由经口、经直肠、皮下、经鼻、经颊、舌下、皮下、静脉内和肌肉内组成的组的方法施用的。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其包含选自由乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇和山梨糖醇组成的组的载体。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其包含选自由乙醇、甘油和水组成的组的稀释剂。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其包含选自由以下组成的组的赋形剂：淀粉、明胶、葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其还包含防腐剂、抗氧化剂和稳定剂中的至少一者。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其包含选自由苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯组成的组的防腐剂。
在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中当组合物在约4℃或约25℃下储存于密封容器中并且所述容器置于具有50％相对湿度的气氛中时，如以菌落形成单位测量的至少80％的细菌菌株在至少约1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年的时段后仍存在。
在一些实施方案中，本发明的组合物在包含如本文所述的组合物的密封容器中提供。在一些实施方案中，密封容器是袋或瓶。在一些实施方案中，本发明的组合物在包含如本文所述的组合物的注射器中提供。
在一些实施方案中，本发明的组合物可作为药物制剂提供。举例来说，组合物可作为片剂或胶囊提供。在一些实施方案中，胶囊是明胶胶囊(“gel-cap”)。
在一些实施方案中，本发明的组合物是经口施用的。经口施用可涉及吞咽，以使得化合物进入胃肠道，和/或经颊、经舌或舌下施用，由此化合物直接从口进入血流。
适于经口施用的药物制剂包括固体塞、固体微粒、半固体和液体(包括多相或分散系统)，例如片剂；含有多颗粒或纳米颗粒、液体(例如水溶液)、乳液或粉末的软或硬胶囊；糖锭(包括液体填充糖锭)；咀嚼锭；凝胶；快速分散剂型；膜剂；卵形剂；喷雾剂；和经颊/粘膜粘附贴片。
在一些实施方案中，药物制剂是肠溶制剂，即，抗胃制剂(例如对胃部pH值具抗性)，其适于通过经口施用将本发明的组合物递送至肠。当组合物的细菌或另一种组分对酸敏感，例如倾向于在胃部条件下降解时，肠溶制剂可特别适用。
在一些实施方案中，肠溶制剂包含肠衣。在一些实施方案中，制剂是肠衣剂型。举例来说，制剂可为肠衣片剂或肠衣胶囊等。肠衣可以是常规肠衣，例如用于经口递送的片剂、胶囊等的常规包衣。制剂可包含膜衣，例如肠溶聚合物(例如酸不溶性聚合物)的薄膜层。
在一些实施方案中，肠溶制剂本质上是肠溶的，例如在无需肠衣的情况下抗胃。因此，在一些实施方案中，制剂是不包含肠衣的肠溶制剂。在一些实施方案中，制剂是由热胶凝材料制成的胶囊。在一些实施方案中，热胶凝材料是纤维素材料，例如甲基纤维素、羟甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素(HPMC)。在一些实施方案中，胶囊包含不含有任何成膜聚合物的外壳。在一些实施方案中，胶囊包含外壳并且所述外壳包含羟丙基甲基纤维素并且不包含任何成膜聚合物(例如参见[106])。在一些实施方案中，制剂本质上是肠溶胶囊(例如来自Capsugel的
Figure BDA0002690205610000681
)。
在一些实施方案中，制剂是软胶囊。软胶囊是如下胶囊：由于胶囊外壳中存在的软化剂，例如甘油、山梨糖醇、麦芽糖醇和聚二乙醇的添加，所述胶囊可具有一定弹性和软度。软胶囊可例如在明胶或淀粉的基础上产生。基于明胶的软胶囊可购自各种供货商。取决于例如经口或经直肠的施用方法，软胶囊可具有各种形状，它们可以是例如圆形、椭圆形、长椭圆形或鱼雷形。软胶囊可通过常规工艺，例如通过谢勒工艺(Scherer process)、阿克胶工艺(Accogel process)或液滴或吹制工艺来产生。
通则
除非另有指示，否则本发明的实践将采用在本领域的技能范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。这些技术在文献中全面解释。参见例如参考文献[107]和[108-114]等。
术语“包含”涵盖“包括”以及“组成”，例如“包含”X的组合物可排他地由X组成或者可包括额外事物，例如X+Y。
关于数值x的术语“约”是任选的并且是指例如x±10％。
词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。
术语“来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽”涵盖展现免疫刺激特性，例如可有效激活TLR5反应的野生型鞭毛蛋白多肽和突变型鞭毛蛋白多肽。术语“鞭毛蛋白多肽”也涵盖展现免疫刺激特性，例如可有效激活TLR5反应的野生型鞭毛蛋白多肽和突变型鞭毛蛋白多肽的片段。
提及两个蛋白质序列之间的序列同一性百分比是指当比对时，所述百分比的氨基酸残基在比较两个序列时是相同的。这种比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域中已知的软件程序确定，例如参考文献[115]中所述的那些。优选的方法使用蛋白质序列的MUSCLE比对并且可用Geneious(78.02％成对同一性)、Blossom62得分矩阵、阈值＝1进行。
提及两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比是指当比对时，所述百分比的核苷酸在比较两个序列时是相同的。这种比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域中已知的软件程序确定，例如参考文献[116]的章节7.7.18中所述的那些。优选的比对是通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜寻算法使用空位开放罚分12和空位扩展罚分2、BLOSUM矩阵62进行仿射空位搜寻来确定。史密斯-沃特曼同源性搜寻算法在参考文献[117]中公开。
通常，除非另有指定(例如关于片段)，否则序列同一性是在参考序列(例如SEQ IDNO:1)的整个长度上而非在查询序列的整个长度上计算。因此，较短和无关的序列不被视为与本发明的序列具有高序列同一性。
除非另有规定，否则包含众多步骤的工艺或方法可在方法开始或结束时包括额外步骤，或者可包括额外中间步骤。此外，适当时，步骤可组合、省略或以替代性次序进行。
本文描述本发明的各种实施方案。应了解，各实施方案中指定的特征可与其它指定特征组合，以提供另外的实施方案。特别是，本文中突出强调为合适、典型或优选的实施方案可彼此组合(除非所述实施方案相互排斥)。
本发明的实施方式
实施例1-MRx0518对TLR5报告细胞的激活
概述
本研究测试细菌菌株MRx0518激活TLR5报告细胞的功效。
TLR5激活测定
HEK-Blue TLR5细胞是用人类TLR5基因和可诱导SEAP(分泌型胚胎碱性磷酸酶)报告基因共转染的HEK293细胞。将SEAP基因置于融合至五个NF-κB和AP-1结合位点的IFN-β最小启动子的控制下。用TLR5配体的刺激激活NF-κB和AP-1，这诱导SEAP产生。碱性磷酸酶的水平由此与TLR5活性相关。
·材料
报告细胞系：HEK-Blue hTLR5(Invivogen,hkb-htlr5)
细胞生长培养基：补充有10％(v/v)FBS(Sigma,F9665)、4mM L-谷氨酰胺(Sigma,G7513)、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素(Sigma,P4333)、100ug/ml诺莫欣(normocin)(Invivogen,ant-nr-1)和选择性抗生素杀稻瘟菌素(30ug/ml,Invivogen,ant-bl-05)和泽欣(zeocin)(100ug/ml,Invivogen,ant-zn-1)的DMEM(Sigma,D6171)
无抗生素培养基：补充有10％(v/v)FBS和4mM L-谷氨酰胺的DMEM
·细菌生长条件
细菌生长条件：在37℃下于厌氧条件下使所有鹑鸡肠球菌MRx0518培养物在酵母提取物-酪蛋白水解物-脂肪酸(YCFA)培养液(E&O Laboratories,UK)中生长。
静止期MRx0518细胞：使菌株MRx0518的16至18小时培养物在上文所述的条件下使用MRx0518细胞的1％接种体生长，在-80℃下作为工作细胞库冷冻储存。
晚对数期MRx0518细胞：使菌株MRx0518的3小时(大约)培养物在上文所述的条件下使用静止期MRx0518细胞的10％接种体生长。
·程序
用两个剂量10:1(3×105个细菌)或100:1(3×106个细菌)的以下处理物进行TLR5激活测定：
-活MRx0518细菌
-热杀灭MRx0518细菌
-来自MRx0518的CFS
用20ng/ml和5ng/ml浓度的超纯FLA-ST进行阳性对照。用不含报告细胞的无抗生素培养基进行阴性对照以对由除报告细胞外的任何事物产生碱性磷酸酶作对照。用YCFA和水进行两个额外对照。对于所有处理，进行三次重复实验。
·制备活的和无细胞上清液(CFS)MRx0518
晚对数期MRx0518细胞在室温下以5000×g离心5分钟之后，活的和CFS处理物均从所述细胞的一个10ml培养物制备。将细菌团块在PBS(Sigma,D8537)中洗涤一次并再悬浮于无抗生素培养基中，达到1.4×108CFU/ml(2倍稀释)和1.4×107CFU/ml(20倍稀释)的估算密度。收集细菌上清液，在无菌条件下过滤(0.22um)，并使用H2O(Sigma,W3500)进行10倍和20倍稀释以提供上文所概述的细菌悬浮液的等同物。CFS含有脱落至上清液中的MRx0518鞭毛。
·制备热杀灭(HK)细胞
独立地，通过在80℃下将晚对数期MRx0518细胞的10ml培养物培育40分钟来产生HK细胞。离心(上文所述的条件)之后，弃去培养物上清液并且将细胞团块在PBS(Sigma,D8537)中洗涤一次并再悬浮于无抗生素培养基中，达到1.4×108CFU/ml(2倍稀释)和1.4×107CFU/ml(20倍稀释)的估算密度。一旦制备，在使用前就将所有处理物储存于冰上。对于所有活的和热杀灭的MRx0518细胞制剂确定每毫升的活细胞计数。
·制备阳性对照
在H2O中以200ng/ml或50ng/ml制备已知TLR5激动剂，鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(超纯，FLA-ST超纯，来自Invitrogen，tlrl-epsitfla)。
·TLR5测定条件
将20μl适当处理物(细菌细胞、无细胞上清液、阳性对照配体、重组鞭毛蛋白、阴性对照例如YCFA、无抗生素培养基、H2O、PBS)一式两份或一式三份涂于96孔细胞培养板(Sigma,CLS3596)中。将180μl报告细胞悬浮液添加至各孔中，得到200ul的最终体积和3×104的HEK-blue TLR5细胞最终浓度。在37℃、5％CO2下培育测定物22小时。
在培育之后，将20μl测定物添加至新96孔板中的180μl Quantiblue(Invivogen,rep-qb1)基质中并在37℃、5％CO2下培育2小时。使含Quantiblue板在获取655nm光密度读数的微量板读取器(Bio-Rad,iMark)上成像。从技术性重复实验求取结果的平均值，然后在此后求取独立实验的平均值以向最终图形提供数据。
结论
用活的和热灭活的MRx0518处理引起中间水平和高水平的TLR5反应。这些数据显示MRx0518菌株能够诱导TLR5反应并且该反应不由热灭活消除。这些数据表明来自肠球菌属的鞭毛蛋白和特别是MRx0518鞭毛蛋白可引起TLR5反应并且鞭毛蛋白是热稳定的。
在用MRx0518-CFS处理后观测到最高水平的TLR5活性并且甚至比已知TLR5激动剂FLA-ST更高(图6)。CFS含有脱落至上清液中的MRx0518鞭毛。这些数据显示来自肠球菌属并且特别是来自MRx0518的鞭毛蛋白产生非常强烈的TLR5反应，并且因此可用于疗法中，特别是用于治疗癌症。这些数据也显示MRx0518有效地使其鞭毛蛋白脱落至上清液中。
实施例2-CFS对TLR5的激活对于MRx0518特别强烈
概述
本研究测试了使用CFS的TLR5激活在菌株之间是否有变化。MRx0518与DSM100110都是有鞭毛的鹑鸡肠球菌菌株。进行研究以观测来自这两种菌株的CFS是否引起TLR5反应。
TLR5激活测定
进行如实施例1中所述的TLR5测定。
·程序
用两个剂量10:1和100:1的以下处理物进行TLR5激活测定：
-MRx0518-CFS
-DSM100110-CFS
用无抗生素培养基、YCFA和水进行三个阴性对照。用20ng/ml浓度的超纯FLA-ST进行阳性对照。对于所有处理，进行三个重复实验。
结论
MRx0518-CFS能够刺激高TLR5反应。DSM100110-CFS也以100:1的MOI产生TLR5反应，但所述反应相对于MRx0518-CFS降低。这些数据显示尽管来自两种菌株的上清液引起免疫刺激反应，但该反应在菌株之间有变化。这些数据是令人惊讶的，因为菌株MRx0518与DSM100110都是有鞭毛的鹑鸡肠球菌菌株。MRx0518-CFS与DSM100110-CFS相比产生更高的TLR5反应，这可能是因为MRx0518与其它鹑鸡肠球菌菌株相比使其鞭毛蛋白脱落至上清液中的能力改善，使其特别适用于疗法中。
这些数据表明来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽可有效用于治疗或预防癌症，特别是与TLR5相关的癌症，例如乳腺癌、结肠直肠癌和胃癌。
实施例3-胰蛋白酶处理后的TLR5激活
概述
本研究测试了MRx0518-CFS对TLR5的激活是否具有胰蛋白酶依赖性。
TLR5激活测定
进行如实施例1中所述的TLR5测定。
·程序
用单独或与胰蛋白酶组合的两个剂量10:1和100:1的以下处理物进行TLR5激活测定：
-MRx0518-CFS
-DSM100110-CFS
-YCFA
对于所有处理，进行三个重复实验。
在37℃、5％CO2下，用500μg/ml胰蛋白酶(0.22um过滤，Sigma，T3924)或相等体积的胰蛋白酶媒介物(汉克氏平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution)，FisherScientific，1175129)作为假消化对照来消化CFS，持续1小时。在培育之后，将消化和假消化的CFS样品用FBS补充至10％(v/v)的最终浓度以抑制胰蛋白酶活性。
用无抗生素培养基、HBSS和水进行三个阴性对照。用20ng/ml浓度的超纯FLA-ST进行阳性对照。
结论
MRx0518-CFS对TLR5的激活通过用胰蛋白酶处理而消除(图8)。这些数据显示TLR5反应由MRx0518-CFS中的蛋白质激活。这些蛋白质由胰蛋白酶降解消除了TLR5反应。MRx0518鞭毛蛋白(FlaAMRx0518)含有36个胰蛋白酶裂解位点，其中一些位于TLR5相互作用结构域中。
实施例4-用经纯化的鞭毛蛋白激活TLR5
概述
本研究测试了经纯化的MRx0518和DSM100110鞭毛蛋白的刺激概况。
重组鞭毛蛋白的产生
克隆策略的概要示于图9a中。使用限制酶消化将MRx0518和DSM100110鞭毛蛋白的全长基因克隆至重组表达构建体pQE-30(其具有N末端6xHis标签)中以产生pQE-30-FlaAMRx0518和pQE-30-FlaADSM100110构建体。使用本领域中众所周知的菌落PCR、限制酶消化和DNA测序技术来鉴定阳性菌落。
在大肠杆菌细胞中表达重组鞭毛蛋白FlaAMRx0518和FlaADSM100110并且使用固定化金属亲和色谱法和咪唑洗脱来纯化，接着除去内毒素(见下表)。这得到具有最低内毒素水平的高纯度制剂。使用SDS-PAGE凝胶确认蛋白质的尺寸和纯度(图9b)。
Figure BDA0002690205610000761
对经纯化的重组FlaAMRx0518和FlaADSM100110蛋白质的剂量反应
进行如实施例1中所述的TLR5测定。
·程序
用以下处理物进行TLR5激活测定：
·5、1、0.2、0.04和0.008ng/ml浓度的重组纯化FlaAMRx0518
·5、1、0.2、0.04和0.008ng/ml浓度的重组纯化FlaADSM100110
用5ng/ml浓度的FLA媒介物进行阴性对照，并且用20ng/ml浓度的超纯FLA-ST进行阳性对照。对于每个处理，进行三个重复实验。
结论
重组FlaAMRx0518与FlaADSM100110均可激活TLR5反应。图10比较了用不同剂量的重组FlaAMRx0518和FlaADSM100110与实施例3和4中所述的处理物对TLR5的激活。在5ng/ml的浓度下，两种重组鞭毛蛋白均可产生比由以更高浓度(20ng/ml)使用的众所周知的TLR5激动剂FLA-ST产生的反应更高的TLR5反应。这些数据显示来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽比鼠伤寒沙门氏菌更有效地激活TLR5反应。已知来自鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白多肽通过TLR5激活来抑制肿瘤生长。这些数据因此表明来自鹑鸡肠球菌的鞭毛蛋白多肽比来自鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白多肽更有效地治疗或预防癌症。
FlaAMRx0518和FlaADSM100110具有不同的免疫刺激概况。在1ng/ml和0.2ng/ml的浓度下，FlaAMRx0518产生约为FlaADSM100110五倍的更强效TLR5反应。MRx0518与DSM100110都是高度相关的菌株。两者都是有鞭毛的鹑鸡肠球菌菌株，然而，其表达具有不同免疫刺激概况的根本上不同的鞭毛蛋白。FlaAMRx0518是强TLR5激活剂的令人惊讶的发现显示该鞭毛蛋白多肽特别有效治疗或预防癌症。
这些实施例证实来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽是TLR5激动剂。TLR5激动剂已牵涉于治疗T和B细胞淋巴瘤中。因此，来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽可特别有效治疗或预防T和B细胞淋巴瘤。
已显示TLR5激活可改善放射线诱发的组织损伤。实施例显示来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽是TLR5反应的强激活剂。因此，来自肠球菌属并且特别是来自鹑鸡肠球菌菌种的鞭毛蛋白多肽可特别有效改善放射线诱发的组织损伤。
实施例5-MRx0518 flaA-突变体的产生
概述
产生破坏鞭毛蛋白基因的MRx0518插入突变体。
实验条件
将flaA的内部片段克隆至载体pORI19(repA-)中。将所得载体flaAMRx0518int-pORI19转化至MRx0518中并且使用同源重组将插入物整合至细菌基因组中(参见图13)。
针对em基因的存在并且使用PCR来筛选阳性菌落并使用测序进一步确认。使用运动性测定对突变体的表型分析也确认插入突变体MRx0518 flaA-。插入物含有来自pORI19载体的红霉素抗性。图11显示MRx0518 flaA-突变体与野生型相比在补充有20μg/ml红霉素的BBL运动性琼脂上是非运动性的。
实施例6-TLR5激活在MRx0518突变体中消除
概述
测试来自MRx0518 flaA-突变体的CFS激活TLR5反应的能力。
TLR5激活测定
进行如实施例1中所述的TLR5测定。
·程序
用两个剂量10:1和100:1的以下处理物进行TLR5激活测定：
-MRx0518-CFS
-MRx0518 flaA--CFS
用5ng/ml和20ng/ml浓度的超纯FLA-ST进行阳性对照。用两个剂量10:1和100:1的YFCA进行阴性对照。对于所有处理，进行三个重复实验。
结论
MRx0518-CFS刺激TLR5反应的能力在MRx0518 flaA-突变体中消除(图12)。这些数据显示鞭毛蛋白多肽为MRx0518-CFS激活TLR5反应所必需。
实施例7-MRx0518的表征
概述
细菌形态如尺寸、伞毛/鞭毛/菌毛的存在或不存在或细胞外基质的存在影响运动性与粘附性并且因此在细菌的表征中是重要的。
在电子显微镜水平(扫描和透射)下检查MRx0518培养物以允许在比通过常规光学显微术方法所允许的分辨率和放大率更高的分辨率和放大率下显现细菌结构。
方法
·透射电子显微术
在密封的埃普多夫管(Eppendorf)中从厌氧罩直接接收处于指数期的MRx0518细菌培养物的等分试样。将培养物固定于新制冰冷的含2.5％戊二醛的0.1M二甲胂酸钠(pH7.2)中。将埃普多夫管缓缓倒置多次，然后置于冰上并使其固定3至5分钟。固定之后，使细菌短暂离心成团块并再悬浮于密理纯水(milli pure water)中。使用玻璃移液管将一滴经固定的培养物施加至弗姆瓦(Formvar)涂布的300目Cu网格。使细菌沉降并吸附约1至2分钟并且使用惠特曼(Whatman)第3号滤纸从网格去除过量溶液。将10μl 2％乙酸氧铀施加至网格持续数秒并且如上文使用滤纸通过毛细管作用去除。使网格完全干燥，然后在kV变化的Philips CM100 TEM中检查。
·扫描电子显微术
获取来自与上文相同的培养物的等分试样用于SEM分析。如上文固定细菌，但不成团。在即将通过使用Luer-Lok注射器将经固定的细菌推送至SPI细孔过滤器(25mm直径，0.2um孔径)上之前，用0.01％聚赖氨酸对所述过滤器进行预处理。此后通过过滤器缓缓推送1ml密理纯水。将过滤器切割成一定尺寸并通过一系列乙醇溶液(50％、70％、90％和3×100％)脱水。然后通过渐增浓度的六甲基二硅氮烷(HMDS 25％、50％、75％，于乙醇中)依序浸渍过滤器，并且使用100％HMDS进行最终脱水步骤。使其蒸发过夜。对过滤器进行临界点干燥并用10nm金钯涂布，然后在Zeiss EVO MA10扫描电子显微镜中检查。
结论
在电子显微镜水平下的两种显现方法均显示MRx0518具有鞭毛(图14)。TEM与SEM分析均显示MRx0518具有鞭毛(实线白色箭头)。细胞尺寸范围介于1至2μm之间。外膜囊泡的存在仅在MRx0518的SEM影像中明显可见。SEM影像显示似乎为外膜囊泡者(白色虚线箭头)。
实施例8-来自鹑鸡肠球菌菌株MRx0518和DSM100110的重组鞭毛蛋白对鼠类TLR5的激活
概述
MRx0518是从人类样品分离的细菌菌株，而DSM 100110来源于鼠类。测试来自鹑鸡肠球菌菌株MRx0518和DSM 100110的重组鞭毛蛋白激活鼠类TLR5的能力。
方法
如实施例4中所述产生重组纯化MRx0518(FliCMRx0518)和DSM 100110(FliCDSM100110)。
进行如实施例1中所述的TLR5测定。用以下处理物进行TLR5激活测定：
-5、1、0.2、0.04和0.008ng/ml浓度的重组纯化FliCMRx0518
-5、1、0.2、0.04和0.008ng/ml浓度的重组纯化FliCDSM100110
进行三个独立重复实验。
结论
FliCMRx0518与FliCDSM100110均活化鼠类TLR5，并且在任何剂量的FliCMRx0518与FliCDSM100110之间活化水平不存在差异(图15)。这种作用不同于FliCMRx0518和FliCDSM100110对人类TLR5的激活所观测的结果。如实施例4图10中所示，在1ng/ml和更低浓度下FliCMRx0518可比FliCDSM100110更高水平地刺激人类TLR5。不受任何特定理论约束，来自不同鹑鸡肠球菌菌株的重组鞭毛蛋白对人类和鼠类TLR5的不同激活概况可归因于FliCMRx0518与FliCDSM100110之间的序列差异以及人类与鼠类TLR5之间的结合位点可变性。
如图3中所示，本发明人已指出在D2-D3区中观测到不同鞭毛蛋白多肽之间的大多数序列变异。FliCMRx0518与FliCDSM100110的序列比对显示D2-D3结构域中的大变异(图16)。所述比对是使用CLUTAL OMEGA 1.2.4版多重序列比对软件进行。
实施例9-来源于人类的运动性鹑鸡肠球菌和酪黄肠球菌菌株的免疫刺激能力
概述
评估来源于人类的运动性鹑鸡肠球菌和酪黄肠球菌菌株体外激活人类TLR5的能力。
方法
·所测试的细菌菌株
Figure BDA0002690205610000811
Figure BDA0002690205610000821
MRX和测试菌株从来自4D Pharma菌种保存中心的四个供体(供体编号F00、F14、F19和F22)中的一者分离。
·TLR5测定条件
在YCFA培养液(E&O Laboratories,Bonnybridge,Scotland,UK)中培养细菌菌株直至其到达静止生长期。通过以5,000×g离心5分钟来分离细胞和上清液。使上清液穿过0.22μm过滤器并在水中稀释。
常规地在补充有10％FBS、4mM L-谷氨酰胺、4.5mg/ml葡萄糖、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/ml NormocinTM(InvivoGen)、30μg/ml杀稻瘟菌素(InvivoGen)和100μg/ml泽欣(InvivoGen)的DMEM中培养HEK-BlueTM-hTLR5细胞(InvivoGen,San Diego,CA,USA)，达到90％密度。在37℃和5％CO2下培养细胞系。除非另有规定，否则所有试剂均由Sigma-Aldrich,Gillingham,England,UK供应。
对于共同培养，将生长至90％密度的细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma-Aldrich)洗涤一次并以140,000个细胞/毫升的密度再悬浮于不含抗生素的生长培养基中。将上清液以100:1的感染复数(MOI)当量添加至细胞中。测定阳性对照鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(FLA-ST)(InvivoGen)以20ng/ml使用。在37℃下于5％CO2气氛中将细胞与上清液一起培育22小时。添加QUANTI-BlueTM(InvivoGen)，将板再培育2小时并记录655nm下的光学密度。对于所有菌株进行三个独立生物重复实验。
图18中的数据代表三个独立重复实验。
结论
所测试的鹑鸡肠球菌和酪黄肠球菌菌株的所有上清液与未经处理的对照相比均能够强效地激活TLR5反应。在所测试的三个酪黄肠球菌菌株当中，发现测试6强烈地激活TLR5反应，而测试5和DSM25781引起不太强效的TLR5反应。
实施例10-MRx518对NF-κB的激活
研究细菌菌株MRx0518激活NF-κB的能力。结果呈现于图18中。MRx0518上清液是NF-κB的最强效激活剂。NF-κB的激活在用胰蛋白酶处理后消除。
这些数据显示来自肠球菌属并且特别是来自MRx0518的鞭毛蛋白产生非常强的NF-κB反应，并且因此可用于疗法中。
实施例11-T细胞分化
在体外对外周血单核细胞(PBMC，Stemcell，目录号：70025)探索MRx0518诱导T细胞分化的能力。
方法
将PBMC以400,000/孔涂于用抗CD3(Ebioscience，CD3单克隆抗体(OKT3克隆)，功能级，目录号16-0037-81)涂布的96孔板中的每孔50μl cRPMI培养基中(cRPMI含有RPMI1640(+L-Glut,21875-034)2mM最终浓度，储备液200mM；10％HI FBS(Gibco lifetechnologies,10082-147)；50μm巯基乙醇(Gibco life technologies,21985-023)；和1％青霉素/链霉素(P4333,10mg/ml))。然后将MRx518上清液添加至各孔中(4,000,000，于100微升/孔中)。使上清液穿过0.22μm过滤器并在共同培养中适当稀释。
在37℃培育箱中3天后，移出细胞并再悬浮于含有PMA(Sigma，目录号P8139)、离子霉素(Ionomycin)(Sigma，目录号I3909)和GolgiSTOP(BD，目录号554724)的培养基中持续5小时。PMA储备液为1mg/ml(在DMSO中)，将其进一步稀释成100ug/ml(每个样品需要50ng/ml(在cRPMI中))，离子霉素储备液为1mM(在DMSO中)(使用1μM(在cRPMI中))，并且GolgiStop浓度以4μl/6ml使用。
然后使细胞经受流式细胞术染色：
在洗涤后，在室温下于黑暗中将细胞与来自Miltenyi biotec的Viobility 405/520可固定染料(1微升/样品)+人类Fc嵌段(目录号564219，1微升/样品)一起在PBS中培育10分钟。然后在室温下于黑暗中将表面抗体(各2μl)直接添加至孔中持续10分钟，即CD3-APC-Vio 770(Miltenyi，目录号130-113-136)、CD4-VioBlue(Miltenyi，目录号130-114-534)和CD25-VioBright FITC(Miltenyi，目录号130-113-283)。然后将细胞在PBS中洗涤两次并在室温下以300g快速离心5分钟。
然后使用eBioscience FoxP3转录因子染色缓冲液固定并渗透细胞(目录号00-5523)。在eBioscience方案之后，使用1×浓缩液和3×稀释剂制备渗透/固定缓冲液。在室温下将细胞固定1小时，然后在1×渗透洗涤液中洗涤两次并在室温下以300g快速离心5分钟。将以下细胞内染色或转录因子抗体添加至含样品的渗透洗涤液(1×)中在室温下于黑暗中持续45分钟或在冰箱中过夜(长达18小时)，接着使用渗透洗涤液(300μl)洗涤抗体两次并再悬浮于PBS(250μl)中以在细胞计数器上获取：
细胞内标志物 转录因子
2ul IL10-PE 5.5ul FoxP3-PE-Cy7
2ul IFNy-PE Vio770 9ul Tbet-APC
10ul IL17a-APC 9ul RoRyt-PE
·抗IFNy-PE Vio770人类抗体(Miltenyi，目录号130-114-025)
·抗IL10-PE人类抗体(Miltenyi，目录号130-112-728)
·抗IL17a-APC人类抗体(Miltenyi，目录号130-099-202)
·抗RoRyt-PE人类抗体(Miltenyi，目录号130-103-837)
·抗Tbet-APC人类抗体(Miltenyi，目录号130-098-655)
·Foxp3单克隆抗体(236A/E7)，Pe cy7(ebioscience)，目录号25-4777-41
结论
如图19中可见，MRx518上清液(SP 518)可诱导T辅助细胞和细胞毒性T细胞的分化。
实施例12-鹑鸡肠球菌MRx0518鞭毛蛋白基因插入突变体的产生
本实施例提供与实施例5相比用于灭活鞭毛蛋白基因的替代性策略。通过同源性驱动的自杀质粒pORI19插入来破坏fliC基因(参见图20)。通过DNA测序来确认pORI19插入fliC基因内并且体外确认所得突变体菌株的非运动性表型。
方法
使用非复制性质粒pORI19(Emr repA-Ori+；克隆载体[118])产生鞭毛蛋白插入突变体。使用引物DC020(SEQ ID NO:43：CCCGGGGGATCCGCGGTAAATGTTGCTAAAGCATCATCG)和DC021(SEQ ID NO:44：ACGACGGTCGACCCACAGCATCTTAGGGCGTATGCG)扩增鹑鸡肠球菌MRx0518fliC基因的内部片段并克隆至pORI19中。根据制造商的说明书使用限制酶和Quick连接酶(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)。该构建体通过化学转化[118]在大肠杆菌EC101中繁殖并使用Genopure Plasmid Maxi试剂盒(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)从500ml培养物中分离。使用0.3M乙酸钠pH 5.2和乙醇将分离的质粒DNA浓缩至20μl。
通过使细菌培养物在次抑制浓度的甘氨酸中生长而成功地产生电感受态细胞，接着用变溶菌素和溶菌酶处理以进一步弱化细胞壁肽聚糖层。开发用以制备鹑鸡肠球菌MRx0518电感受态细胞的方案，所述方案从先前公开的方法[119]修改。简言之，使鹑鸡肠球菌MRx0518在补充有0.5M蔗糖和3％(w/v)甘氨酸(Sigma-Aldrich)的GM17培养液中生长18小时。然后将细胞用0.5M蔗糖和10％(v/v)甘油洗涤两次，并且在37℃下用10μg/ml溶菌酶和10U/ml变溶菌素(Sigma-Aldrich)处理30分钟。然后通过用10μg质粒DNA电穿孔使鹑鸡肠球菌MRx0518细胞转化并在BHI培养液中回收，然后涂于选择性BHI琼脂上。使用引物DC047(SEQ ID NO:45：CCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAACGAG)和DC048(SEQ ID NO:46：GATGCAGTTTATGCATCCCTTAAC)针对em基因的存在筛选阳性菌落。通过PCR扩增和测序(GATCBiotech,Konstanz,Germany)使用引物DC013(SEQ ID NO:47：CCGATAAATAGTAGCAGAGGGAAACC)和DC014(SEQ ID NO:48：GGCTGAATATCCATCAGAGCTTCCTC)确认成功转化株的质粒插入。
使用补充有0.005％(w/v)氯化2,3,5-三苯基四唑鎓(BD,Sparks,MD,USA)的BBLTM运动性测试培养基在体外评估鞭毛蛋白插入突变体的运动性。简言之，将新鲜菌落针刺接种于20ml平衡培养基中并在37℃下在厌氧条件下培育48小时。所有测定均一式三份进行。
序列
SEQ ID NO:1-来自鹑鸡肠球菌MRx0518的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:2-来自鹑鸡肠球菌DSM100110的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:3-来自鹑鸡肠球菌MRx0554的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:4-来自鹑鸡肠球菌MRx0556的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:5-来自鹑鸡肠球菌MRx1548的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:6-来自鹑鸡肠球菌MRx1650的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:7-来自鹑鸡肠球菌MRx1763的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:8-来自鹑鸡肠球菌MRx1766的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:9-来自鹑鸡肠球菌MRx1775的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:10-来自鹑鸡肠球菌MRx1886的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:11-来自鹑鸡肠球菌2A8的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:12-来自鹑鸡肠球菌9402的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:13-来自鹑鸡肠球菌A6981的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:14-来自鹑鸡肠球菌MRx1649的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:15-来自鹑鸡肠球菌EG2的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:16-来自鹑鸡肠球菌SKF1的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:17-来自酪黄肠球菌DSM 7370的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:18-来自酪黄肠球菌1a6A的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:19-来自酪黄肠球菌3h10B的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:20-来自酪黄肠球菌14-MB-W-14的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:21-来自酪黄肠球菌ATCC12755的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:22-来自酪黄肠球菌DSM4841的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:23-来自酪黄肠球菌DSM20680的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:24-来自酪黄肠球菌EC10的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:25-来自酪黄肠球菌EC20的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:26-来自酪黄肠球菌EC30的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:27-来自酪黄肠球菌F1129的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:28-来自酪黄肠球菌F1129F 46的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:29-来自酪黄肠球菌NBRC 100478的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:30-来自酪黄肠球菌PAVET15的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:31-来自酪黄肠球菌NLAE-zl-G268的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:32-来自酪黄肠球菌NLAE-zl-C414的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:33-来自鹑鸡肠球菌FDAARGOS-163的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:34-来自酪黄肠球菌MRx0858的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:35-来自酪黄肠球菌DSM25781的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO:36-来自鹑鸡肠球菌DSM28564的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：37-来自鹑鸡肠球菌DSM28565的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：38-来自鹑鸡肠球菌F1213F 228的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：39-来自鹑鸡肠球菌DSM20718的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：40-来自鹑鸡肠球菌DSM20628的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：41-来自鹑鸡肠球菌NBRC100675的鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：42-来自鹑鸡肠球菌DSM24841的鞭毛蛋白多肽
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序列表
<110> 4D制药研究有限公司(4D PHARMA RESEARCH LIMITED)
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355 360
<210> 7
<211> 360
<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌MRx1763 (Enterococcus gallinarum MRx1763)
<400> 7
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<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌MRx1766 (Enterococcus gallinarum MRx1766)
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65 70 75 80
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195 200 205
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210 215 220
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<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌MRx1775 (Enterococcus gallinarum MRx1775)
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<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌MRx1886 (Enterococcus gallinarum MRx1886)
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355 360
<210> 11
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<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌2A8 (Enterococcus gallinarum 2A8)
<400> 11
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<211> 360
<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌9402 (Enterococcus gallinarum 9402)
<400> 12
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355 360
<210> 13
<211> 360
<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌A6981 (Enterococcus gallinarum A6981)
<400> 13
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195 200 205
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210 215 220
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<210> 14
<211> 360
<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌MRx1649 (Enterococcus gallinarum MRx1649)
<400> 14
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210 215 220
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225 230 235 240
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<210> 15
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<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌EG2 (Enterococcus gallinarum EG2)
<400> 15
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210 215 220
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Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn
340 345 350
Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly
355 360
<210> 16
<211> 360
<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌SKF1 (Enterococcus gallinarum SKF1)
<400> 16
Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser
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65 70 75 80
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Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Asp Asp Asp Arg Ser Ala Ile Asn Lys
100 105 110
Glu Tyr Thr Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Arg Asn Asn Thr
115 120 125
Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Thr Gly Glu Gly Asn Asp Ala Lys
130 135 140
Ser Phe Thr Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser Val
145 150 155 160
Ser Ile Lys Asn Met Ser Ser Thr Val Leu Asp Val Lys Gly Leu Asp
165 170 175
Leu Thr Gln Ala Phe Ser Thr Ser Glu Ile Ala Ala Ala Lys Asp Lys
180 185 190
Ala Val Ala Ala Ala Phe Ile Ala Asp Thr Thr Thr Lys Tyr Ala Ala
195 200 205
Asp Gly Lys Val Asp Ala Ala Ala Gly Lys Thr Ala Ala Asp Leu Gln
210 215 220
Thr Ala Ile Gly Thr Ala Ala Asp Asp Ala Ala Glu Ala Thr Ala Gln
225 230 235 240
Lys Thr Tyr Asp Asp Ala Leu Ala Thr Phe Thr Ala Ser Asp Glu Gly
245 250 255
Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Thr Ala Ile Val Glu Asn Asn Pro
260 265 270
Ile Thr Lys Ile Asp Lys Ala Ile Lys Ala Val Ser Ala Gln Arg Ala
275 280 285
Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu
290 295 300
Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp
305 310 315 320
Val Asp Met Ala Gln Glu Met Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile Leu
325 330 335
Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn
340 345 350
Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly
355 360
<210> 17
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黄肠球菌DSM 7370 (Enterococcus casseliflavus DSM 7370)
<400> 17
Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser
20 25 30
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65 70 75 80
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355 360
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<212> PRT
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<400> 18
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65 70 75 80
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115 120 125
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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<212> PRT
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<400> 19
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<213> 酪黄肠球菌14-MB-W-14 (Enterococcus casseliflavus 14-MB-W-14)
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<213> 酪黄肠球菌DSM20680 (Enterococcus casseliflavus DSM20680)
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<210> 24
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黄肠球菌EC10 (Enterococcus casseliflavus EC10)
<400> 24
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210 215 220
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<210> 25
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黄肠球菌EC20 (Enterococcus casseliflavus EC20)
<400> 25
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Lys Asp Lys Ala Val Ala Thr Ala Phe Lys Ala Asp Ala Thr Thr Lys
195 200 205
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355 360
<210> 26
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黄肠球菌EC30 (Enterococcus casseliflavus EC30)
<400> 26
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1 5 10 15
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Ala Gln Lys Thr Tyr Asp Asp Ala Leu Ala Thr Phe Thr Ala Ser
245 250 255
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260 265 270
Ile Thr Lys Ile Asp Glu Ala Ile Lys Ala Val Ser Ala Gln Arg Ala
275 280 285
Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu
290 295 300
Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp
305 310 315 320
Val Asp Met Ala Gln Glu Met Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile Leu
325 330 335
Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn
340 345 350
Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly
355 360
<210> 27
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黄肠球菌F1129 (Enterococcus casseliflavus F1129)
<400> 27
Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Leu Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile
35 40 45
Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln
85 90 95
Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Asp Asp Asp Arg Ser Ala Ile Asn Lys
100 105 110
Glu Tyr Thr Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Asn Thr Thr
115 120 125
Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Thr Gly Glu Gly Asp Asp Ala Lys
130 135 140
Ser Phe Thr Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser Val
145 150 155 160
Ser Ile Asn Asn Met Ser Ser Ser Ala Leu Lys Val Lys Gly Leu Asp
165 170 175
Leu Thr Gln Ala Ile Asp Thr Ser Asp Ala Lys Ala Val Ala Ala Ala
180 185 190
Lys Asp Lys Ala Val Ala Thr Ala Phe Lys Ala Asp Ala Thr Thr Lys
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<213> 酪黄肠球菌F1129F 46 (Enterococcus casseliflavus F1129F 46)
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<212> PRT
<213> 酪黄肠球菌NLAE-zl-C414 (Enterococcus casseliflavus NLAE-zl-C414)
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<213> 鹑鸡肠球菌FDAARGOS-163 (Enterococcus gallinarum FDAARGOS-163)
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<400> 34
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210 215 220
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<210> 35
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<212> PRT
<213> 酪黄肠球菌DSM25781 (Enterococcus casseliflavus DSM25781)
<400> 35
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225 230 235 240
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<210> 37
<211> 361
<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌DSM28565 (Enterococcus gallinarum DSM28565)
<400> 37
Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile
35 40 45
Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser
50 55 60
Asn Ala Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu
65 70 75 80
Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln
85 90 95
Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Thr Asp Asp Arg Glu Ala Ile Ser Lys
100 105 110
Glu Phe Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Thr Thr Thr
115 120 125
Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Gly Glu Lys
130 135 140
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145 150 155 160
Val Lys Ile Gly Asp Met Gly Ala Lys Ala Leu Gly Val Asp Ala Leu
165 170 175
Lys Leu Glu Glu Ala Lys Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ala Lys Lys Val
180 185 190
Glu Thr Ala Phe Leu Asp Ala Ala Asn Ser Asp Lys Tyr Asp Ala Asp
195 200 205
Gly Lys Ile Asp Ala Ser Ala Gly Lys Thr Ala Ala Glu Leu Lys Asp
210 215 220
Ala Ile Glu Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys
225 230 235 240
Thr Tyr Asp Ala Ala Leu Glu Thr Phe Lys Ala Ser Thr Asn Gly Gln
245 250 255
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260 265 270
Ser Thr Val Ser Lys Ile Asp Glu Ala Ile Lys Thr Val Ser Ala Gln
275 280 285
Arg Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn
290 295 300
Asn Leu Gly Thr Thr Gln Glu Asn Leu Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile
305 310 315 320
Arg Asp Val Asp Met Ala Gln Glu Met Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn
325 330 335
Ile Leu Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met
340 345 350
Pro Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln
355 360
<210> 38
<211> 358
<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌F1213F 228 (Enterococcus gallinarum F1213F 228)
<400> 38
Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile
35 40 45
Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser
50 55 60
Asn Ala Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu
65 70 75 80
Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln
85 90 95
Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Thr Asp Asp Arg Glu Ala Ile Ser Lys
100 105 110
Glu Phe Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Thr Thr Thr
115 120 125
Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Gly Glu Lys
130 135 140
Ala Ser Phe Ile Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser
145 150 155 160
Val Lys Ile Gly Asp Met Gly Ala Lys Ala Leu Gly Val Asp Ala Leu
165 170 175
Lys Leu Glu Glu Ala Lys Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ala Lys Lys Val
180 185 190
Glu Thr Ala Phe Leu Ala Gly Thr Glu Thr Tyr Asp Ala Asp Gly Lys
195 200 205
Ile Asp Ala Ser Gly Thr Lys Ala Ser Asp Leu Gln Thr Ala Ile Ala
210 215 220
Asn Ala Thr Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys Thr Tyr Asp
225 230 235 240
Ala Ala Leu Glu Ser Phe Lys Ala Ser Ala Asn Gly Gln Thr Ala Ile
245 250 255
Ala Thr Ala Lys Thr Glu Val Glu Glu Asp Ala Lys Asn Ser Thr Val
260 265 270
Ser Lys Ile Asp Glu Ala Ile Lys Thr Val Ser Ala Gln Arg Ala Asp
275 280 285
Leu Gly Ala Ala Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly
290 295 300
Thr Thr Gln Glu Asn Leu Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp Val
305 310 315 320
Asp Met Ala Gln Glu Met Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile Leu Ser
325 330 335
Gln Ala Ala Thr Ser Met Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn Ser
340 345 350
Val Leu Ser Leu Leu Gln
355
<210> 39
<211> 352
<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌DSM20718 (Enterococcus gallinarum DSM20718)
<400> 39
Met Arg Ile Asn Thr Asn Val Ser Ala Leu Asn Thr Tyr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile
35 40 45
Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser
50 55 60
Asn Ala Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu
65 70 75 80
Asn Glu Thr His Ser Ile Leu Gly Arg Met Arg Asp Leu Ala Val Gln
85 90 95
Ser Ser Asn Gly Thr Leu Ser Thr Asp Asp Arg Glu Ala Ile Ser Lys
100 105 110
Glu Phe Ser Ala Leu Ser Asp Glu Ile Asp Arg Ile Ser Thr Thr Thr
115 120 125
Glu Phe Asn Thr Lys Ser Leu Leu Lys Gly Gly Glu Ser Gly Glu Lys
130 135 140
Ala Ser Phe Ile Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Met Ser
145 150 155 160
Val Lys Ile Gly Asp Met Gly Ala Lys Ala Leu Gly Val Asp Ala Leu
165 170 175
Lys Leu Glu Glu Ala Gly Asp Glu Glu Lys Val Thr Asn Lys Ala Phe
180 185 190
Thr Asp Asn Thr Asn Leu Lys Tyr Asp Ala Ala Thr Gly Ala Ile Asp
195 200 205
Asn Ser Gly Ser Thr Gly Lys Thr Ala Thr Glu Leu Lys Asp Ala Ile
210 215 220
Thr Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys Ala Tyr
225 230 235 240
Asp Ala Ala Leu Glu Ala Tyr Lys Asn Ser Asp Glu Gly Lys Ala Glu
245 250 255
Leu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ile Asp Asn Ala
260 265 270
Ile Lys Ala Val Ser Ala Gln Arg Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gln Asn
275 280 285
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290 295 300
Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala Gln Glu Met
305 310 315 320
Met Ser Phe Thr Lys Ser Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ala Thr Ser Met
325 330 335
Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln
340 345 350
<210> 40
<211> 352
<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌DSM20628 (Enterococcus gallinarum DSM20628)
<400> 40
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1 5 10 15
Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile
35 40 45
Ser Glu Lys Met Lys Gly Gln Ile Gly Gly Leu Ser Gln Ala Lys Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Thr Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys Ala Tyr
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
<210> 41
<211> 352
<212> PRT
<213> 鹑鸡肠球菌NBRC100675 (Enterococcus gallinarum NBRC100675)
<400> 41
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1 5 10 15
Thr Ala Ala Asn Ala Ser Lys Ser Asn Ser Leu Ser Lys Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Met Arg Ile Asn Lys Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Thr Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys Ala Tyr
225 230 235 240
Asp Ala Ala Leu Glu Ala Tyr Lys Asn Ser Asp Glu Gly Lys Ala Glu
245 250 255
Leu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ile Asp Asn Ala
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ser Glu Ala Asn Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala Gln Glu Met
305 310 315 320
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325 330 335
Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln
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<210> 42
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 鹑鸡肠球菌DSM24841
<400> 42
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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180 185 190
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195 200 205
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Thr Asn Ala Ala Asp Asp Thr Ala Lys Ala Ala Ala Gln Lys Ala Tyr
225 230 235 240
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Leu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ile Asp Asn Ala
260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
Leu Ala Gln Ala Asn Ser Met Pro Asn Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln
340 345 350
<210> 43
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DCO20引物
<400> 43
cccgggggat ccgcggtaaa tgttgctaaa gcatcatcg 39
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DC021引物
<400> 44
acgacggtcg acccacagca tcttagggcg tatgcg 36
<210> 45
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DC047引物
<400> 45
ccaaattaaa gagggttata atgaacgag 29
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DC048引物
<400> 46
gatgcagttt atgcatccct taac 24
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DC013引物
<400> 47
ccgataaata gtagcagagg gaaacc 26
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> DC014引物(DC014 primer)
<400> 48
ggctgaatat ccatcagagc ttcctc 26
PCT/RO/134表
Figure 0000011

Claims (51)

1.一种来自肠球菌(Enterococcus)属的鞭毛蛋白多肽，所述鞭毛蛋白多肽用于疗法中。
2.根据权利要求1所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽是来自鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)菌种。
3.根据权利要求1或权利要求2所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽是来自以登录号NCIMB 42488保藏于NCIMB的菌株。
4.根据任何前述权利要求所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽与SEQ IDNO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性。
5.根据任何前述权利要求所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽包含SEQID NO:1。
6.根据权利要求1-3所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性。
7.根据任何前述权利要求所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽包含SEQID NO:2。
8.根据权利要求1-3中任一项所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽与SEQID NO:3-42中的一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性。
9.根据权利要求8所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽具有与SEQ IDNO:3-16中的一者具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。
10.根据任何前述权利要求所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽不含D3结构域。
11.根据任何前述权利要求所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽呈单体形式。
12.根据任何前述权利要求所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽含有与SEQ ID NO:1中的残基87-96和290-295具有至少99％、99.5％或99.9％同一性的TLR5识别位点。
13.根据任何前述权利要求所述使用的鞭毛蛋白多肽，其中所述鞭毛蛋白多肽是细菌鞭毛装配体的一部分。
14.一种鞭毛蛋白多肽的片段，所述鞭毛蛋白多肽的片段用于疗法中，其中所述鞭毛蛋白多肽是根据权利要求1-12中任一项所定义，并且其中所述片段的长度为至少7个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个或350个氨基酸。
15.根据权利要求14所述使用的鞭毛蛋白多肽的片段，其中所述片段与SEQ ID NO:1具有至少85％序列同一性和/或(ii)包含来自SEQ ID NO:1的至少7个连续氨基酸的片段。
16.根据任何前述权利要求所述使用的鞭毛蛋白多肽，所述鞭毛蛋白多肽接合至抗原，例如病原体抗原或肿瘤抗原。
17.一种包含鞭毛蛋白多肽的融合多肽，所述融合多肽用于疗法中，其中所述鞭毛蛋白多肽是根据权利要求1-15中任一项所定义。
18.如权利要求17所述的融合多肽，所述融合多肽包含抗原，例如病原体抗原或肿瘤抗原。
19.一种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1的以下多段氨基酸中的一者或者一者或多者：2-32、87-96、165-272、234-358、290-295，或者包含与所述片段中的一者具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性的序列。
20.如权利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1中的氨基酸165-272的序列具有90％、92％、95％、98％或99％的序列同一性。
21.如权利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1中的氨基酸87-96、165-272和290-295的序列具有90％、92％、95％、98％或99％的序列同一性。
22.如权利要求19-21所述的多肽，所述多肽还包含免疫刺激区。
23.如权利要求22所述的多肽，其中所述免疫刺激区是TLR4或TLR5激活区。
24.如权利要求19-23所述的多肽，其中所述多肽是鞭毛蛋白多肽。
25.根据任何前述权利要求所述使用的多肽，其中所述多肽是细菌鞭毛装配体的一部分。
26.如权利要求25所述的多肽，其中所述多肽是鞭毛蛋白多肽。
27.根据任何前述权利要求所述使用的多肽，其中所述多肽另外包含一种或多种抗原。
28.一种编码来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列用于疗法中。
29.根据权利要求28所述使用的多核苷酸序列，其中所述鞭毛蛋白多肽是根据权利要求2-27中任一项所定义。
30.根据权利要求29所述使用的多核苷酸序列，其中所编码的多肽序列与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性，或者是SEQ ID NO:1。
31.一种表达来自肠球菌属的重组鞭毛蛋白多肽的宿主细胞，所述宿主细胞用于疗法中。
32.一种包含编码来自肠球菌属的鞭毛蛋白多肽的重组多核苷酸序列的宿主细胞，所述宿主细胞用于疗法中。
33.根据权利要求31或32所述使用的宿主细胞，其中所述鞭毛蛋白多肽是根据权利要求2-27中任一项所定义。
34.一种载体或质粒，所述载体或质粒包含根据权利要求28-30所述的多核苷酸序列。
35.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求34所述的载体或质粒。
36.如权利要求35所述的宿主细胞，所述宿主细胞另外表达异源抗原，例如病原体抗原或肿瘤抗原。
37.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-13中任一项所述的鞭毛蛋白多肽、根据权利要求14或权利要求15所述的鞭毛蛋白多肽的片段、根据权利要求17或18所述的融合多肽、根据权利要求19-27所述的多肽、根据权利要求27-29所述的多核苷酸、根据权利要求31-33和35中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求34所述的载体，所述组合物用于疗法中。
38.根据权利要求37所述使用的组合物，所述组合物用于治疗或预防癌症的方法中。
39.根据权利要求38所述使用的组合物，其中所述组合物用于治疗免疫原性肿瘤。
40.根据权利要求38或39所述使用的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防肺癌、乳腺癌、肝癌或结肠癌的方法中。
41.根据权利要求37-40中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物用于减小肿瘤尺寸、减少肿瘤生长、预防转移或预防血管生成的方法中。
42.根据权利要求37所述使用的组合物，所述组合物用于刺激受试者中的免疫系统。
43.根据权利要求37所述使用的组合物，所述组合物用于治疗、预防或延迟免疫衰老。
44.根据权利要求37所述使用的组合物，所述组合物用作疫苗佐剂。
45.根据权利要求37所述使用的组合物，所述组合物用于增强细胞疗法，例如CAR-T。
46.根据权利要求37-44中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物增加NF-κB的水平和/或活性。
47.根据权利要求37-46中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物用于经口施用。
48.根据权利要求37-46中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
49.一种治疗疾病的方法，所述方法包括将包含来自肠球菌属细菌菌株的鞭毛蛋白多肽的组合物施用于有需要的患者。
50.一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将包含来自肠球菌属细菌菌株的鞭毛蛋白多肽的组合物施用于有需要的患者。
51.一种治疗或预防与降低的免疫刺激相关的疾病或疾患的方法，所述方法包括将来自肠球菌属细菌菌株的鞭毛蛋白多肽施用于有需要的患者。
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