TW202003000A - 組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含來自細菌菌株之鞭毛蛋白多肽之組成物及此等組成物治療疾病之用途。

Description

組成物
本發明處於包含來自細菌菌株之鞭毛蛋白多肽之組成物及此等組成物治療疾病之用途的領域中。
人類腸管據信在子宮內為無菌的，但在出生後即刻暴露於多種母體及環境微生物。此後，微生物定殖及演替之動態週期出現，該動態週期受如下因素影響：諸如遞送模式、環境、飲食及宿主基因型，所有該等因素尤其在早期生活期間影響腸道微生物區之組成。隨後，微生物區穩定且變得類似成人[1]。人類腸道微生物區含有超過500-1000種不同種系型，其基本上屬於兩個主要細菌門，擬桿菌門(Bacteroidete)及厚壁菌門(Firmicute)[2]。自人類腸道之細菌定殖產生之成功共生關係已得到廣泛多種代謝、結構、保護及其他有益功能。經定殖腸道之增強之代謝活性確保以其他方式不可消化之膳食組分隨著副產物之釋放而降解，為宿主提供重要營養物來源。類似地，腸道微生物區之免疫學重要性為公認的且在具有在引入共生細菌之後功能上重構之受損免疫系統之無菌動物中例示[3-5]。
與受微生物定殖本身影響[6-7]之分泌性腸IgA之產生成鮮明對比，T細胞發育及分化似乎需要由特定共生微生物定殖。梭菌(Clostridium)菌種且尤其形成芽孢之分節絲狀菌(SFB)似乎為腸及結腸Th1、Th17及Treg之分化及成熟之強效刺激物[8-9]。最新研究已證實其他腸道細菌，包括梭菌群IV及XIVa以及變更謝德拉微生物叢(Altered Schaedler Flora，ASF)之彼等，可誘導Treg重新產生，同時用脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis)單定殖可藉由促進Treg擴張來校正 無菌小鼠中之Th1/Th2不平衡[5][10-11]。此等資料推斷出其他常駐腸道細菌之重要免疫調控作用。顯然，共生細菌對T細胞分化路徑之影響為可變的且如先前所假設，可能受發現與特定細菌相關聯之一批TLR配位體影響[12]。舉例而言，SFB影響T細胞反應之機制當前未知，但新近基因體研究確認，鞭毛蛋白基因之存在表明經TLR5-鞭毛蛋白相互作用介導之先天性反應可能起作用[13-14]。
鞭毛蛋白為細菌鞭毛之主要組分之一。鞭毛為鞭狀附肢，其為細菌提供運動性且可充當感覺細胞器。細菌鞭毛蛋白之結構及組成已在模型生物體，諸如鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)及大腸桿菌(E.coli)中廣泛研究。鼠傷寒沙氏桿菌及大腸桿菌之鞭毛蛋白經由TLR5受體活化免疫系統，此舉引起多種促炎性及免疫反應基因之活化[15]。已提出，TLR5促效劑，諸如鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白可充當抗癌劑[16]。亦已提議經工程改造以表現創傷弧菌(Vibrio vulnifificus)鞭毛蛋白之鼠傷寒沙氏桿菌充當抗癌劑[17]。另外，已提出，來自鼠傷寒沙氏桿菌、霍亂弧菌(Vibrio cholera)及痢疾志賀桿菌(Shigella dysenteriae)之鞭毛蛋白肽當由已經遺傳修飾之腸細菌表現時可用於產生對抗諸如傷寒、霍亂及痢疾之感染性疾病之疫苗[18]。然而，來自細菌之其他菌種之鞭毛蛋白仍然不良特徵化且此種其他鞭毛蛋白可能具有不同作用或用途。
微生物區組成之巨大變化在諸如炎性腸病(IBD)之胃腸病症中已有文獻記載。舉例而言，梭菌群XIVa細菌之水準在IBD患者中降低，而大腸桿菌之數目增加，表明腸道內共生有機體與致病有機體之平衡的偏移[19-22]。令人感興趣地，此微生物生態失調亦與T效應細胞群體中之不平衡相關聯。
在某些細菌菌株對動物腸道可能具有之潛在正向作用之識別中，已提議各種菌株用於治療各種疾病(參見例如[23-26])。亦已提議主要包括乳桿菌(Lactobacillus)及雙叉桿菌(Bifidobacterium)菌株之某些菌株用於治療與腸無直接 關聯之各種炎性及自體免疫疾病(對於評述，參見[27]及[28])。然而，不同疾病與不同細菌菌株之間的關係及特定細菌菌株對腸道及在全身水準下以及對任何特定類型之疾病的確切作用不良特徵化。舉例而言，某些腸球菌(Enterococcus)菌種已牽涉於致癌中[29]。
已提出某些鏈球菌(Streptococcus)及範永氏球菌(Veillonella)菌株且在較小程度上腸球菌及乳桿菌菌株具有免疫調節作用，在試管內對不同細胞激素具有變化之作用。然而，不同疾病與不同細菌菌株之間的關係及特定細菌菌株對腸道及在全身水準下以及對任何特定類型之疾病的確切作用不良特徵化。
在此項技術中需要治療疾病之新方法。亦需要特徵化腸道細菌之潛在作用以便可開發新療法。
本發明者已開發用於治療及預防疾病之新療法。特別地，本發明者已鑑別來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽適用於療法中。如實施例中所證實，來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽可在顯著高於熟知TLR5促效劑鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白之水準下強有力地活化TLR5反應。
在較佳實施方案中，本發明提供用於療法中之來自鶉雞腸球菌(Enterococcus gallinarum)菌種之鞭毛蛋白多肽。在其他較佳實施方案中，鞭毛蛋白多肽來自以登錄號NCIMB 42488寄存於NCIMB之菌株。在較佳實施方案中，鞭毛蛋白多肽為SEQ ID NO：1。實施例顯示來自菌株MRx0518(以登錄號NCIMB 42488寄存之菌株)之鞭毛蛋白多肽與來自鶉雞腸球菌之其他菌株相比更強有力地活化TLR5反應。因此，來自菌株NCIMB 42488之鞭毛蛋白多肽尤其有效用於療法中。
在較佳實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽呈單體形式，允許該多肽與TLR5受體更有效地結合。
實施例顯示來自菌株NCIMB 42488之鞭毛蛋白多肽尤其有效活化TLR5反應。來自菌株NCIMB 42488之鞭毛蛋白多肽可不含D3結構域，且本發明者已指出在D2-D3區中觀測到不同鞭毛蛋白多肽之間的大多數序列變異。在較佳實施方案中，本發明提供來自腸球菌屬或鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽，其不含D3結構域。
在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽為細菌鞭毛裝配體之一部分。在某些實施方案中，本發明提供一種包含本發明之鞭毛蛋白多肽之細菌鞭毛裝配體。在較佳實施方案中，細菌鞭毛裝配體含有蛋白質FliL及FlaG。FliL及FlaG蛋白質存在於MRx0518之細菌鞭毛裝配體中。實施例顯示來自MRx0518之鞭毛蛋白多肽尤其有效活化TLR5反應。
本發明亦提供一種編碼用於療法中之來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列。在某些實施方案中，聚核苷酸序列編碼用於療法中之來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽。在較佳實施方案中，聚核苷酸序列編碼用於療法中之來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽。
在其他實施方案中，本發明提供一種表現來自腸球菌屬之重組鞭毛蛋白多肽之宿主細胞，其用於療法中。在其他實施方案中，本發明亦提供一種包含編碼來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之重組聚核苷酸序列之宿主細胞，其用於療法中。
本發明提供包含本發明之鞭毛蛋白多肽之組成物。本發明亦提供包含編碼本發明之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列之組成物。本發明亦提供一種表現本發明之鞭毛蛋白多肽之宿主細胞。另外，本發明亦提供包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼本發明之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列。
已知鼠傷寒沙氏桿菌(S.typhimurium)鞭毛蛋白對TLR5之活化抑制細胞增殖及腫瘤生長[48]。包含鶉雞腸球菌菌株之組成物有效治療及預防癌症 [50]。本發明者已令人驚訝地顯示來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽能夠刺激強TLR5反應，此可有助於腸球菌菌株之抗癌活性。因此，本發明者已顯示來自腸球菌屬且尤其來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽適用於療法中，且尤其有效治療及預防癌症。
在較佳實施方案中，包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物用於治療免疫原性腫瘤及/或實體腫瘤。在某些實施方案中，包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物用於治療或預防肺癌、乳癌、肝癌或結腸癌之方法中。包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物在癌症治療中可尤其有效減小腫瘤尺寸或預防腫瘤生長。
在較佳實施方案中，本發明之組成物係藉由注射，較佳地皮下或替代地靜脈內或腹膜內投予。
在某些實施方案中，例如當組成物包含本發明之宿主細胞時，本發明之組成物用於經口投藥。在某些實施方案中，本發明之組成物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
另外，本發明提供一種治療疾病之方法，其包含將包含來自腸球菌屬細菌菌株之鞭毛蛋白多肽之組成物投予有需要之患者。在較佳實施方案中，本發明提供一種治療或預防癌症之方法，其包含將包含來自腸球菌屬細菌菌株之鞭毛蛋白多肽之組成物投予有需要之患者。
本發明者已開發包含來自腸球菌屬，較佳來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之新組成物，其可用於刺激免疫系統且治療及預防疾病。本發明者已鑑別此等組成物可強效地活化免疫系統且可治療癌症，指示其可能能夠亦治療免疫系統之活化可能有用之其他疾病。
本發明因此提供一種包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於刺激個體中之免疫系統。
在其他態樣中，本發明提供一種包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療、預防或延遲免疫衰老。
在其他態樣中，本發明提供一種包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用作疫苗佐劑。
在其他態樣中，本發明提供一種包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於增強細胞療法，諸如CAR-T。
圖1：鞭毛蛋白之結構及鞭毛絲之橫剖面視圖及俯視圖。鞭毛絲由單一蛋白質鞭毛蛋白構成。TLR5識別區在D1結構域中且當鞭毛蛋白聚合成鞭毛絲時不可及。影像來自參考文獻[30]。
圖2：來自鶉雞腸球菌菌種及模型生物體鼠傷寒沙氏桿菌之24個鞭毛蛋白多肽之蛋白質序列比對。突出來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽之D0、D1及D2結構域及預測TLR5結合位點。
圖3：來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽與來自鶉雞腸球菌(E.gallinarum)菌種之23個鞭毛蛋白多肽之蛋白質序列比對。突出來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽之D0、D1及D2結構域及預測TLR5結合位點。
圖4：鞭毛裝配體之KEGG路徑圖。以灰色突出之基因存在於菌種中。
圖5：預測MRx0518鞭毛蛋白(FliCMRx0518)蛋白質結構與已知鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白蛋白質結構之比較。鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白蛋白質結構來自參考文獻[30]。
圖6：TLR5報導細胞之MRx0518活化。
圖7：TLR5報導細胞之菌株特異性活化。
圖8：在胰蛋白酶處理之後來自MRx0518及DSM100110之CFS之 TLR5反應。
圖9：a)用於在大腸桿菌中產生重組鞭毛蛋白之選殖策略；b)在SDS-PAGE凝膠上經純化之重組鞭毛蛋白FlaAMRx0518及FlaADSM100110之品質評估。
圖10：用來自MRx0518及DSM100110之FlaAMRx0518、FlaADSM100110及CFS進行TLR5活化之比較。
圖11：MRx0518flaA -突變體之表型特徵化。
圖12：用MRx0518flaA -突變體CFS進行之TLR5活化。
圖13： flaA突變策略。
圖14：MRx0518之電子顯微術。
圖15：來自MRx0518及DSM 100110之重組鞭毛蛋白對鼠類TLR5之活化。資料代表三個獨立重複實驗。
圖16：使用CLUTAL OMEGA 2.1版多重序列比對軟體進行之來自MRx0518及DSM 100110之鞭毛蛋白之序列比對。
圖17：運動性鶉雞腸球菌及酪黃腸球菌(E.casseliflavus)菌株對人類TLR5之活化。資料代表3個生物重複實驗之平均值及標準差。顯著性係藉由單因子ANOVA檢驗來評估-「a」表示p<0.0001。
圖18：MRx0518對NF-κB之活化。
圖19：在不添加細胞激素(無細胞激素)之情況下，使用來自MRx518及RPMI培養基之上清液作為對照，(A)T輔助細胞及(B)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)之群體中T細胞分化之誘導。
圖20：替代性flaA突變策略。
鞭毛蛋白
細菌鞭毛之主要組分鞭毛蛋白刺激包括哺乳動物、昆蟲及植物之多種生物體中之宿主防禦。細菌鞭毛蛋白之結構及組成已在模型生物體，諸如鼠傷寒沙氏桿菌及大腸桿菌中廣泛研究。然而，存在極有限之描述來自腸球菌屬且尤其來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白之可用資料。
鞭毛蛋白可作為單體蛋白質存在或可聚合形成鞭毛絲。沙氏桿菌(Salmonella)中之細菌鞭毛絲由約20,000個鞭毛蛋白蛋白質單位構成。鞭毛絲形成完全裝配之細菌鞭毛之一部分。
鞭毛蛋白一般含有3至4個結構域(D0、D1、D2及D3)，其中D0及D1結構域由自N端及C端之摺疊組成[31]。在鞭毛絲裝配期間，D0及D1結構域掩埋於鞭毛絲內且D2及/或D3結構域面向向外(圖1)。
已顯示保守結構域D1內之胺基酸基元為TLR5識別及相互作用所需要[32-33]。亦已顯示D0結構域影響TLR5信號傳導[34]。TLR5識別位點在鞭毛絲中一般不可及。鞭毛蛋白以其單體形式更有效地與TLR5相互作用，此係由於當裝配成絲時TLR5結合位點不可及[30]。鞭毛蛋白之中心區展示序列可變性且尚未廣泛研究，但應視為蛋白質之抗原性及免疫原性區。
D0及D1結構域為高度保守的，而D2及D3結構域更加可變[35]。圖2為來自腸球菌屬之鞭毛蛋白與廣泛研究之來自鼠傷寒沙氏桿菌之鞭毛蛋白之序列比對。來自鼠傷寒沙氏桿菌之鞭毛蛋白與來自腸球菌屬之鞭毛蛋白之間的大多數序列變異處於中心區(D2-D3結構域)內。在此區中亦觀測到不同鶉雞腸球菌菌株之間的大多數序列變異，例如在來自菌株MRx0518與DSM100110之鞭毛蛋白之間(圖3)。
鞭毛絲為細菌鞭毛之組分。已知涉及於細菌鞭毛裝配體中之基因在圖4中概述。加灰色陰影之彼等存在於鶉雞腸球菌中。鞭毛蛋白由FliC編碼，FliC在本文中亦可互換地稱作FlaA。
本發明提供一種來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽，其用於療法中。在某些實施方案中，本發明提供一種來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽，其用於療法中。在較佳實施方案中，本發明提供一種來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽，其用於療法中。實施例證實來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽可活化強TLR5反應，此顯示鞭毛蛋白多肽可適用於療法中，且尤其適用於治療癌症。
本發明提供一種來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防癌症之方法中。在某些實施方案中，本發明提供一種來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防癌症之方法中。在較佳實施方案中，本發明提供一種來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防癌症之方法中。實施例證實來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽能夠誘導強TLR5反應，其適用於治療及預防癌症。特別地，實施例顯示來自鶉雞腸球菌菌種且尤其來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽產生極高TLR5反應。
在較佳實施方案中，本發明提供一種來自鶉雞腸球菌菌種或酪黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus)菌種之鞭毛蛋白多肽，其用於療法中，尤其用於治療或預防癌症。在某些實施方案中，鞭毛蛋白多肽來自酪黃腸球菌菌種。在最佳實施方案中，鞭毛蛋白多肽來自鶉雞腸球菌菌種。
在實施例中測試來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽。MRx0518為以登錄號NCIMB 42488寄存之鶉雞腸球菌細菌之菌株。菌株MRx0518係由4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)於2015年11月16日以「腸球菌種(Enterococcus sp)」寄存於國際寄存機構NCIMB,Ltd.(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)且指定登錄號NCIMB 42488。
在某些實施方案中，本發明提供一種與來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽具有至少75%之序列一致性的鞭毛蛋白多肽，及此等多肽在療法中且尤 其治療或預防癌症之用途。實施例顯示此等鞭毛蛋白多肽尤其有效。特別地，本發明提供一種鞭毛蛋白多肽，其具有與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列。較佳地，本發明之鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1組成。在其他實施方案中，鞭毛蛋白多肽具有與SEQ ID NO：2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列。本發明之鞭毛蛋白多肽可包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2組成。實施例亦證實此等多肽為有用的。
在某些實施方案中，本發明提供一種鞭毛蛋白多肽，其與SEQ ID NO：3-42中之一者具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性。在較佳實施方案中，鞭毛蛋白多肽具有與SEQ ID NO：3-16中之一者具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列。在較佳實施方案中，鞭毛蛋白多肽來自鶉雞腸球菌菌種。
在較佳實施方案中，本發明之鞭毛蛋白結合TLR5，例如以至少10-2、至少10-3、至少10-4、至少10-5、至少10-6、至少10-7、至少10-8、至少10-9、至少10-10或至少10-11之KD值。與TLR5之結合可藉由此項技術中已知之任何適當方法來量測，包括電化學阻抗譜法(EIS)、掃描電化學顯微術(SECM)[36]或使用重組TLR5蛋白質之原生PAGE及凝膠過濾層析分析[37]。
本發明之鞭毛蛋白多肽可含有四個結構域D0、D1、D2及D3。在較佳實施方案中，鞭毛蛋白多肽不包含D3結構域。在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽由三個結構域D0、D1、D2組成。鶉雞腸球菌鞭毛蛋白多肽中D0、D1及D2結構域之位置示於圖3中。來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽(FliCMRx0518)之預測形狀示於圖5中。FliCMRx0518之預測結構係使用Phyre2工具產生，該工具基於與公開可用之結構之同源性預測蛋白質結構[38]，且用UCSF Chimera套裝產生圖形[39]。D3結構域之預測缺乏使得蛋白質結構與來自鼠傷寒沙氏桿菌SL1344(GenBank登錄號CBW17983)之鞭毛蛋白多肽相比發生構形變化。D3結構域之預測缺乏可使得TLR5識別位點更加暴露，促使鞭毛蛋白多肽活化TLR5反應之能力增加。D3結構域之預測缺乏亦可影響鞭毛蛋白多肽聚合成鞭毛絲之能力。鞭毛蛋白多肽以單體形式更有效地活化TLR5反應，因此防止或減少鞭毛蛋白多肽之聚合為有益的。
本發明之鞭毛蛋白多肽可含有D1結構域，其可為TLR5識別及相互作用所需要。在某些實施方案中，本發明提供一種具有D1結構域之鞭毛蛋白多肽，該D1結構域與SEQ ID NO：1中之殘基43-164及273-317具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性。在某些實施方案中，本發明提供一種在D1結構域中具有TLR5識別位點之鞭毛蛋白多肽。來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽中之TLR識別位點位於SEQ ID NO：1中之位置87-96及290-295處。在較佳實施方案中，鞭毛蛋白多肽之TLR5識別位點與SEQ ID NO：1中之殘基87-96及290-295具有至少99%、99.5%或99.9%之一致性。在其他較佳實施方案中，鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO：1中之殘基87-96及290-295之TLR5識別位點。
本發明之鞭毛蛋白多肽亦可含有D0結構域，其可影響TLR5信號傳導。在某些實施方案中，本發明提供一種具有D0結構域之鞭毛蛋白多肽，該D0結構域與SEQ ID NO：1中之殘基2-32及234-358具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之一致性。
本發明之鞭毛蛋白多肽亦可含有D2結構域。來自鼠傷寒沙氏桿菌與腸球菌屬之鞭毛多肽之間的大多數序列變異處於中心區(D2-D3結構域)內。實施例顯示來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽與來自鼠傷寒沙氏桿菌之鞭毛蛋白多肽相比能夠在更低劑量下產生更強TLR5反應。D2或D3結構域中之序列變 異可促成來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽活化TLR5反應之能力增加。本發明之鞭毛蛋白多肽亦含有D0結構域，其可影響TLR5信號傳導。在某些實施方案中，本發明提供一種具有D2結構域之鞭毛蛋白多肽，該D2結構域與SEQ ID NO：1中之殘基165-272具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之一致性。
鞭毛蛋白多肽可作為單體存在或以聚合形式作為鞭毛絲存在。此種絲為細菌鞭毛之一部分。在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽配置成鞭毛絲。本發明亦關於未配置成鞭毛絲之鞭毛蛋白多肽。在較佳實施方案中，鞭毛蛋白多肽呈其單體形式。鞭毛蛋白多肽之單體形式為有利的，此係由於其可與TLR5更強地相互作用。在實施方案中，本發明之鞭毛蛋白未經糖基化，以幫助其脫落並分解成單體形式。
在某些實施方案中，鞭毛蛋白多肽為細菌鞭毛之一部分。在某些實施方案中，鞭毛蛋白多肽為細菌鞭毛之一部分，該細菌鞭毛含有一或多種選自以下之蛋白質：FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA、FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ及FliS。在較佳實施方案中，細菌鞭毛裝配體含有FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA、FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ及FliS。在某些實施方案中，細菌鞭毛裝配體含有蛋白質FliL及FlaG。FliL為控制趨化期間鞭毛之旋轉方向之鞭毛基體相關蛋白，且FlaG與FlaF一起調控鞭毛蛋白裝配。FliL及FlaG蛋白質存在於MRx0518中。實施例顯示來自MRx0518之鞭毛蛋白多肽與來自另一鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽相比可活化更強TLR5反應。
本發明之鞭毛蛋白多肽可經重組表現，或其可自腸球菌細胞中分離。在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽未附著至腸球菌細胞。在某些 實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽在實質上不含細菌細胞之組成物中。
在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽已經熱處理，且視情況經變性。實施例證實此等鞭毛蛋白多肽仍為強力有效的。在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽熱穩定至80℃，例如在加熱至80℃後可維持活性持續例如40分鐘。在某些實施方案中，鞭毛蛋白多肽係由胰蛋白酶消化。換言之，在某些實施方案中，鞭毛蛋白多肽含有胰蛋白酶裂解位點。預測MRX518鞭毛蛋白含有36個胰蛋白酶裂解位點。
根據本發明之鞭毛蛋白多肽無須起到正常鞭毛蛋白多肽之作用以將其視為鞭毛蛋白多肽。根據本發明之鞭毛蛋白多肽可含有去除某些活性之突變或缺失。一般而言，本發明之鞭毛蛋白多肽為TLR5促效劑。在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽不能聚合成鞭毛絲。在其他實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽不能形成細菌鞭毛裝配體之一部分。
在某些實施方案中，本發明之多肽並非鞭毛蛋白多肽。在較佳實施方案中，如上文所陳述，多肽與SEQ ID NO：1具有序列一致性，或包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1組成。
本發明亦提供包含用於療法中之來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物。在某些實施方案中，組成物包含用於療法中之來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽。在較佳實施方案中，組成物包含用於療法中之來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽。
在本發明之每個實施方案之替代性態樣中，本發明之鞭毛蛋白多肽屬於酪黃腸球菌菌種。酪黃腸球菌高度類似於鶉雞腸球菌且亦有鞭毛。
片段
如前述章節中所陳述，預期與實施例中測試之彼等具有序列一致性之鞭毛蛋白多肽亦適用於療法中且由本發明涵蓋。另外，亦預期本發明之鞭毛 蛋白多肽之片段為有用的。
較佳地，任何片段之長度為至少7個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個或350個胺基酸。
較佳片段包含SEQ ID NO：1之以下多段胺基酸中之一或多者：2-32、87-96、165-272、234-358、290-295，或包含與該等片段中之一者具有至少90%、92%、95%、98%或99%之序列一致性的序列。
較佳片段包含與SEQ ID NO：1之胺基酸165-272具有至少90%、92%、95%、98%或99%之序列一致性的序列。其他較佳片段包含與SEQ ID NO：1之胺基酸87-96、165-272或290-295，或較佳地與SEQ ID NO：1之胺基酸87-96、165-272及290-295具有至少90%、92%、95%、98%或99%之序列一致性的序列。
根據本發明使用之片段將通常(i)與SEQ ID NO：1具有至少w%之序列一致性，及/或(ii)包含來自SEQ ID NO：1之至少x個相連胺基酸之片段。w值為至少85(例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更大)。x值為至少7(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300)，且片段將通常包括來自SEQ ID NO：1之抗原決定基。片段將通常能夠結合至TLR5。
根據本發明使用之其他片段將通常(i)與SEQ ID NO：2具有至少w%之序列一致性，及/或(ii)包含來自SEQ ID NO：2之至少x個相連胺基酸之片段。w值為至少85(例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更大)。x值為至少7(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、 70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300)，且片段將通常包括來自SEQ ID NO：2之抗原決定基。片段將通常能夠結合至TLR5。
根據本發明使用之其他片段將通常(i)與SEQ ID NO：3-42中之一者具有至少w%之序列一致性，及/或(ii)包含來自SEQ ID NO：3-42中之一者的至少x個相連胺基酸之片段。w值為至少85(例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更大)。x值為至少7(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300)，且片段將通常包括來自SEQ ID NO：3-42中之一者的抗原決定基。片段將通常能夠結合至TLR5。
融合物
亦預期包含本發明之鞭毛蛋白多肽之融合物適用於療法中。因此，在某些實施方案中，本發明提供一種包含如上文所述之鞭毛蛋白多肽之融合多肽，視情況用於療法中且尤其用於治療癌症。較佳融合搭配物包括靶向部分及欲延長半衰期之部分。在某些實施方案中，本發明提供一種融合多肽，其包含如上文所述之鞭毛蛋白多肽及選自由以下組成之群組的多肽：Fc區、運鐵蛋白、白蛋白、重組PEG、高胺基酸聚合物、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸聚合物、類彈性蛋白肽或羧基端肽[CTP；絨毛膜促性腺激素(CG)b鏈之羧基端肽]。
本發明之鞭毛蛋白多肽亦可融合或接合至非多肽部分以改良其特徵及治療效用。舉例而言，在某些實施方案中，本發明提供如上文所述之鞭毛蛋白多肽，其共價連接至PEG或玻糖醛酸。
本發明之鞭毛蛋白多肽可融合或接合至抗原，例如，以用作疫苗。緊密接近本發明之鞭毛蛋白呈現抗原可使其免疫刺激活性達到最大且進一步增強針對抗原產生之保護性免疫反應。另外，當抗原與本發明之鞭毛蛋白融合或 接合時，製造及遞送包含抗原及本發明之鞭毛蛋白之治療劑可更有效率且有效。因此，在某些實施方案中，本發明提供一種融合多肽，其包含如上文所述之鞭毛蛋白多肽及抗原。在其他實施方案中，本發明提供如上文所述之鞭毛蛋白多肽，其接合至抗原。
包括於本發明之融合物及接合物中之較佳抗原為病原體抗原及腫瘤抗原。抗原將引出對該抗原具特異性之免疫反應，其將有效保護免受病原體感染或攻擊腫瘤。抗原可為例如肽或多醣。用於本發明之融合物及接合物之例示性抗原包括：病毒抗原，諸如病毒表面蛋白；細菌抗原，諸如蛋白質及/或醣抗原；真菌抗原；寄生蟲抗原；及腫瘤抗原。用於本發明之融合物及接合物之其他抗原包括醣蛋白及脂聚醣抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸化Tn(STn)、人端粒酶反轉錄酶(hTERT)、威爾姆斯瘤基因(Wilms tumour gene)(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)抗原、新抗原、致癌蛋白、類澱粉蛋白β、Tau、PCSK9及成癮性物質，例如菸鹼、酒精或鴉片劑。
本發明之融合多肽可包括介於鞭毛蛋白與抗原之間的連接子序列。較佳連接子序列包括包含(Gly4)n基元、(Gly4Ser)n基元及Ser(Gly4Ser)n基元之肽。連接子序列之長度可為1-50個、1-30個、1-20個、5-20個、5-10個或10-20個胺基酸。連接子序列將允許鞭毛蛋白及融合搭配物(例如抗原)執行其作用且例如由免疫系統達及。因此，在某些實施方案中，本發明提供一種融合多肽，其包含如上文所述之鞭毛蛋白多肽、連接子序列及抗原，諸如來源於病原體之抗原、或腫瘤抗原。
本發明之鞭毛蛋白多肽當接合至諸如多醣抗原之非多肽部分時可尤其適用。適合之接合方法包括使用碳二醯亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基丁二醯亞胺、S--NHS、EDC、CDAP或TSTU。
聚核苷酸
本發明亦提供一種編碼用於療法中之來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列。在某些實施方案中，聚核苷酸序列編碼用於療法中之來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽。在較佳實施方案中，聚核苷酸序列編碼用於療法中之來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽。實施例證實來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽可活化強TLR5反應，因此編碼此等鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸可適用於療法中，且尤其適用於治療癌症。
本發明亦提供一種聚核苷酸序列，其編碼用於治療或預防癌症之方法中之來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽。在某些實施方案中，本發明提供一種聚核苷酸序列，其編碼用於治療或預防癌症之方法中之來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽。在較佳實施方案中，本發明提供一種聚核苷酸序列，其編碼用於治療或預防癌症之方法中之來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽。實施例證實來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽能夠誘導強TLR5反應，其適用於治療及預防癌症。特別地，實施例顯示來自鶉雞腸球菌菌種且尤其來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽產生極高TLR5反應。
在較佳實施方案中，用於療法中之本發明之聚核苷酸編碼SEQ ID NO：1，或與SEQ ID NO：1具有75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的多肽序列。在其他較佳實施方案中，本發明之聚核苷酸編碼具有上文所陳述之特定D0、D1及/或D2序列之鞭毛蛋白，該等序列在實施例中顯示為有用的。
在其他實施方案中，用於療法中之本發明之聚核苷酸編碼SEQ ID NO：2，或與SEQ ID NO：2具有75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的多肽序列。在其他較佳實施方案中，本發明之聚核苷酸編碼具有上文所陳述之特定D0、D1及/或D2序列之鞭毛蛋白，該 等序列在實施例中顯示為有用的。
在其他實施方案中，用於療法中之本發明之聚核苷酸編碼SEQ ID NO：3-42中之一者，或與SEQ ID NO：3-42中之一者具有75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的多肽序列。在其他較佳實施方案中，本發明之聚核苷酸編碼具有上文所陳述之特定D0、D1及/或D2序列之鞭毛蛋白，該等序列在實施例中顯示為有用的。
根據本發明之核酸可採用各種形式(例如單股、雙股、載體等)。本發明之核酸可為環狀或分枝的，但一般將為線性的。
術語「聚核苷酸」或「核酸」包括單股與雙股核苷酸聚合物。包含核酸之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型核苷酸之經修飾形式。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯及胺基磷酸酯。
核酸可依許多方式製備，例如藉由全部或部分化學合成(例如DNA之亞磷醯胺合成)，藉由使用核酸酶(例如限制酶)消化較長核酸，藉由連接較短核酸或核苷酸(例如使用連接酶或聚合酶)，來自基因體或cDNA文庫，等等。
本發明之核酸包含編碼本發明之至少一個多肽，諸如本發明之鞭毛蛋白多肽之序列。典型地，本發明之核酸將呈重組形式，即，自然界中不存在之形式。舉例而言，除編碼至少鞭毛蛋白多肽之序列以外，核酸可包含一或多個異源核酸序列(例如編碼另一抗原之序列及/或控制序列，諸如啟動子或內部核糖體進入位點)。在此類實施方案中，本發明之核酸編碼如上文所論述之鞭毛蛋白多肽及抗原，諸如病原體抗原或腫瘤抗原。視情況，核酸亦編碼連接子序列。
宿主細胞
本發明亦提供表現本發明之鞭毛蛋白多肽之宿主細胞，其用於療法 中。實施例證實表現本發明之腸球菌鞭毛蛋白之腸球菌菌株(諸如MRx0518)可活化TLR5且因此可具有強效治療作用。表現本發明之鞭毛蛋白多肽之宿主細胞可適用於產生包括於治療性組成物中之鞭毛蛋白多肽，或此等宿主細胞可適用於投予患者，其中該等宿主細胞表現鞭毛蛋白多肽以發揮直接治療作用。
在較佳實施方案中，本發明之宿主細胞重組表現本發明之鞭毛蛋白多肽。換言之，本發明之宿主細胞包含編碼本發明之鞭毛蛋白多肽之異源聚核苷酸序列。在某些實施方案中，宿主細胞不屬於腸球菌屬，不屬於鶉雞腸球菌菌種，或不屬於菌株MRx0518。在較佳實施方案中，用於表現重組腸球菌鞭毛蛋白多肽之宿主細胞為大腸桿菌。
在替代性實施方案中，其中例如宿主細胞係用於投予患者，該宿主細胞為益生菌菌株，諸如乳桿菌及雙叉桿菌菌株。
在某些實施方案中，宿主細胞包含編碼來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列。在某些實施方案中，宿主細胞包含編碼來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列。在較佳實施方案中，宿主細胞包含編碼來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列。在某些實施方案中，宿主細胞包含載體，其中該載體包含編碼來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列。
在某些實施方案中，宿主細胞包含編碼以下細菌鞭毛裝配體基因中之一或多者、較佳全部之聚核苷酸序列：FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA、FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ及FliS。在某些實施方案中，本發明之宿主細胞表現以下多肽中之一或多者、較佳全部：FliD、FlgL、FlgK、FlgE、FliK、FlgD、FlgG、MotB、MotA、FliF、FliG、FliM、FliN、FlhA、FlhB、FliH、FliI、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliL、FliJ及FliS。在較佳實施方案中，宿主細胞包含編碼包 含FliL及FlaG之細菌鞭毛裝配體之聚核苷酸序列。在較佳實施方案中，本發明之宿主細胞表現多肽FliL及FlaG。
較佳地，表現本發明之鞭毛蛋白多肽之任何細胞及尤其用於投予患者之任何細胞有效脫落鞭毛蛋白多肽。實施例證實此等細胞誘導更強TLR5反應。鞭毛蛋白可在鞭毛裝配期間經由其單體單元之漏出而「主動」脫落。然而，在大多數情況下，單體鞭毛蛋白由脫離之鞭毛的主動降解而產生。鞭毛脫離可在機械應變之後或作為自主過程發生。在一些細菌菌種中，鞭毛蛋白經糖基化以增強絲穩定性且防止不受控之脫落，例如在奧奈達希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)中[40]。在較佳實施方案中，由宿主細胞表現之鞭毛蛋白未經糖基化，以幫助其脫落並分解成單體形式。
在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽及/或細菌鞭毛裝配體易於自宿主細胞脫落。
鞭毛蛋白多肽及/或鞭毛裝配體之脫落簡易性可藉由以下方式確定：獨立地使i)表現本發明之鞭毛蛋白之細胞及ii)表現來源於屬於與本發明之鞭毛蛋白相同之細菌菌種之相同或不同菌株之參考鞭毛蛋白的一或多種細胞(例如1種、2種、3種、4種、5種、10種或多於10種)a)使用各別細胞之1%接種體在靜止期中生長18小時，接著b)在來自靜止期之細胞之10%接種體生長之晚對數期中生長3小時。接著可使表現本發明之鞭毛蛋白之細胞之10ml培養物及表現參考鞭毛蛋白之細胞之10ml培養物在室溫下以5000×g離心5分鐘以移除細菌團塊。接著可在無菌條件下過濾(0.22μm)所得上清液。在本發明之鞭毛蛋白多肽及/或細菌鞭毛裝配體為良好脫落體之實施方案中，來源於表現本發明之鞭毛蛋白之細胞之上清液中的鞭毛蛋白之濃度將比來源於表現參考鞭毛蛋白之細胞之上清液中的鞭毛蛋白之濃度更高(例如1.5×或更高、2×或更高、3×或更高、4×或更高、5×或更高、7×或更高或10×或更高)。
在較佳實施方案中，本發明之宿主細胞將鞭毛蛋白多肽及/或鞭毛裝配體釋放至其環境中同時需要化學或物理破壞。在較佳實施方案中，在適合於表現鞭毛蛋白多肽之條件下培養本發明之宿主細胞使得鞭毛蛋白多肽自細胞釋放至其環境中。實施例證實表現本發明之鞭毛蛋白多肽之細胞誘導更強TLR5反應。在其他實施方案中，本發明之宿主細胞為細菌鞭毛裝配體之良好脫落體。在某些實施方案中，本發明之宿主細胞為細菌鞭毛絲之良好脫落體且尤其為鞭毛蛋白多肽之良好脫落體。在某些實施方案中，本發明之細菌鞭毛裝配體主動脫落單體鞭毛蛋白。在某些實施方案中，本發明之鞭毛絲主動脫落單體鞭毛蛋白。單體鞭毛蛋白更有效地誘導TLR5反應。
在某些實施方案中，本發明提供一種獲得本發明之鞭毛蛋白多肽或鞭毛裝配體之方法，其包含培養表現本發明之鞭毛蛋白多肽或鞭毛裝配體之細胞及培養該鞭毛蛋白多肽或鞭毛裝配體，而無需進行任何步驟以自細胞表面移除單獨鞭毛蛋白多肽或鞭毛裝配體。
鞭毛(或鞭毛蛋白)脫落過程當前不與特異性子組基因之表現相關聯且可能受環境條件極大影響。然而，已顯示許多基因涉及於鞭毛剛性及穩定性中。舉例而言，在沙氏桿菌中，已顯示fliF及fliL突變體當在黏性培養基中生長時更易脫落鞭毛[41、42]。在兩種情況下，鞭毛在遠端桿體附近斷裂[43]。因此，在較佳實施方案中，宿主細胞不表現fliF及/或fliL。在其他實施方案中，宿主細胞不表現fliL。
在某些實施方案中，本發明之宿主細胞已經熱處理。實施例證實表現本發明之鞭毛蛋白多肽之細胞在熱處理之後仍為強力有效的。在某些實施方案中，本發明之宿主細胞熱穩定至80℃，例如在加熱至80℃後可維持活性持續例如40分鐘。
本發明進一步提供藉由在允許產生鞭毛蛋白多肽之條件下培養宿主 細胞來產生本發明之鞭毛蛋白多肽及回收由此產生之鞭毛蛋白多肽之方法。
在某些實施方案中，本發明之宿主細胞另外表現一或多種抗原。一般而言，抗原將經重組表現且將對宿主細胞為異源的。抗原可為與本發明之鞭毛蛋白多肽一起表現之融合多肽之一部分，或宿主細胞可獨立地表現來自不同開放閱讀框架之鞭毛蛋白及抗原。因此，本發明提供一種表現本發明之鞭毛蛋白多肽及異源抗原之宿主細胞。用於本發明之例示性抗原包括：病毒抗原，諸如病毒表面蛋白；細菌抗原，諸如蛋白質及/或醣抗原；真菌抗原；寄生蟲抗原；及腫瘤抗原。用於在宿主細胞中與本發明之鞭毛蛋白一起表現之其他抗原包括醣蛋白及脂聚醣抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸化Tn(STn)、人端粒酶反轉錄酶(hTERT)、威爾姆斯瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾司坦-巴爾病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、類澱粉蛋白β-、Tau、PCSK9及成癮性物質，例如菸鹼、酒精或鴉片劑。
載體、質體及其他核酸
本發明之核酸可為載體之一部分，即，經設計用於一或多種細胞類型之轉導/轉染之核酸構築體之一部分。載體可為例如經設計用於在宿主細胞中表現核苷酸序列之「表現載體」，或經設計以使重組病毒或類病毒粒子產生之「病毒載體」。
替代地或另外，核酸之序列或化學結構與編碼鞭毛蛋白多肽之天然存在之序列相比可經修飾。核酸分子之序列可經修飾，例如以增加核酸之表現或複製之功效，或提供額外穩定性或抗降解性。舉例而言，核酸分子之序列可經密碼子優化用於在所需宿主，諸如哺乳動物(例如人類)細胞中表現。關於密碼子使用之此修飾可增加核酸之轉譯功效及半衰期。聚A尾(poly A tail)(例如具有約30個腺苷殘基或更多)可附著至RNA之3'末端以增加其半衰期。RNA之5' 末端可用具有結構m7G(5')ppp(5')N(帽0結構)之經修飾之核糖核苷酸或其衍生物加帽，該核糖核苷酸或其衍生物可在RNA合成期間併入或可在RNA轉錄之後經酶促工程改造(例如藉由使用由mRNA三磷酸酶、鳥苷酸轉移酶及鳥嘌呤-7-甲基轉移酶組成之牛痘病毒加帽酶(VCE)，其催化N7-單甲基化帽0結構之構築)。帽0結構在維持RNA分子之穩定性及轉譯功效中起重要作用。RNA分子之5'帽可由2'-O-甲基轉移酶進一步修飾，得以產生帽1結構(m7Gppp[m2'-O]N)，其可進一步增加轉譯功效。
核酸可包含一或多種核苷酸類似物或經修飾之核苷酸。如本文所用之「核苷酸類似物」或「經修飾之核苷酸」係指在核苷之含氮鹼基(例如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G))中或上含有一或多個化學修飾(例如取代)之核苷酸。核苷酸類似物可在核苷之糖部分(例如核糖、去氧核糖、經修飾之核糖、經修飾之去氧核糖、六員糖類似物或開鏈糖類似物)或磷酸酯中或上含有其他化學修飾。核苷酸及經修飾之核苷酸及核苷之製備在此項技術中為熟知的，例如獲知於美國專利第4373071號、第4458066號、第4500707號、第4668777號、第4973679號、第5047524號、第5132418號、第5153319號、第5262530號、第5700642號，且許多經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可購得。
本發明進一步提供能夠表現鞭毛蛋白多肽之重組表現載體。舉例而言，本發明提供包含上文所提及之核酸分子中之任一者之重組表現載體。
本發明進一步提供上文所提及之載體中之任一者已引入之宿主細胞。本發明進一步提供藉由在允許產生鞭毛蛋白多肽之條件下培養宿主細胞來產生本發明之鞭毛蛋白多肽及回收由此產生之鞭毛蛋白多肽之方法。
包含編碼鞭毛蛋白多肽之核酸序列之如本文所揭示之組成物可為基於核酸之治療劑。
核酸可為例如RNA(即，基於RNA之治療劑)或DNA(即，基於DNA之治療劑，諸如質體DNA治療劑)。在某些實施方案中，基於核酸之治療劑為基於RNA之治療劑。在某些實施方案中，基於RNA之治療劑包含自複製RNA分子。自複製RNA分子可為源自α病毒之RNA複製子。
自複製RNA分子在此項技術中為熟知的且可藉由使用來源於例如α病毒之複製元件且用編碼所關注之蛋白質之核苷酸序列取代結構病毒蛋白而產生。自複製RNA分子典型地為+股分子，其可在遞送至細胞之後直接轉譯，且此轉譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，該聚合酶接著自遞送之RNA產生反義與有義轉錄物。因此，遞送之RNA使得多個子系RNA產生。此等子系RNA以及同線次基因體轉錄物可自身轉譯以提供經編碼之抗原(即，鞭毛蛋白多肽)之原位表現，或可經轉錄以提供與遞送之RNA同義之其他轉錄物，該等轉錄物經轉譯以提供抗原之原位表現。轉錄之此序列之總體結果為所引入之複製子RNA之數目的極大擴增且因此經編碼之抗原變成細胞之主要多肽產物。
以此種方式達成自複製之其他適合系統為使用基於α病毒之複製子。此等複製子為+股RNA，其使得複製酶(或複製酶-轉錄酶)在遞送至細胞之後轉譯。複製酶經轉譯為多聚蛋白質，其自動裂解以提供形成+股遞送之RNA之基因體-股複本的複製複合物。此等-股轉錄物可自身轉錄以得到+股親本RNA之其他複本且亦得到編碼抗原之次基因體轉錄物。次基因體轉錄物之轉譯由此使得抗原由經感染之細胞原位表現。適合之α病毒複製子可使用來自辛德比病毒(Sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)、東部馬腦炎病毒、委內端拉馬腦炎病毒等之複製酶。可使用突變體或野生型病毒序列，例如VEEV之減弱TC83突變體已用於複製子中。
在某些實施方案中，本文所述之自複製RNA分子編碼(i)可轉錄來自自複製RNA分子之RNA之RNA依賴性RNA聚合酶及(ii)鞭毛蛋白多肽。聚合 酶可為α病毒複製酶，例如包含α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3及nsP4中之一或多者。
基於核酸之治療劑可包含病毒或非病毒遞送系統。遞送系統(在本文中亦稱作遞送運載體)可具有增強經編碼之鞭毛蛋白多肽之免疫原性的輔助作用。舉例而言，核酸分子可囊封於脂質體、無毒生物可降解聚合微粒或病毒複製子粒子(VRP)中，或與陽離子性水中油乳液之粒子複合。在一些實施方案中，基於核酸之治療劑包含陽離子性奈米乳液(CNE)遞送系統或脂質奈米粒子(LNP)遞送系統。或者，基於核酸之治療劑可包含病毒複製子粒子。在其他實施方案中，基於核酸之治療劑可包含裸核酸，諸如裸RNA(例如mRNA)，但經由LNP遞送為較佳的。
在某些實施方案中，基於核酸之治療劑包含陽離子性奈米乳液(CNE)遞送系統。CNE遞送系統及其製備方法在此項技術中描述。在CNE遞送系統中，編碼抗原之核酸分子(例如RNA)與陽離子性水中油乳液之粒子複合。陽離子性水中油乳液可用於將諸如RNA分子之帶負電荷分子遞送至細胞。乳液粒子包含油核心及陽離子性脂質。陽離子性脂質可與帶負電荷分子相互作用，從而將該分子錨定至乳液粒子。適用之CNE之更多細節可在此項技術中找到。
因此，在本發明之基於核酸之治療劑中，編碼鞭毛蛋白多肽之RNA分子可與陽離子性水中油乳液之粒子複合。該等粒子典型地包含在25C下呈液相之油核心(例如植物油或鯊烯)、陽離子性脂質(例如磷脂)且視情況包含界面活性劑(例如脫水山梨糖醇三油酸酯、聚山梨醇酯80)；亦可包括聚乙二醇。在一些實施方案中，CNE包含鯊烯及陽離子性脂質，諸如1,2-二油醯氧基-3-(三甲基銨基)丙烷(DOTAP)。在一些較佳實施方案中，遞送系統為非病毒遞送系統，諸如CNE，且基於核酸之治療劑包含自複製RNA(mRNA)。此可尤其有效地引出體液及細胞免疫反應。優點亦包括不存在限制性抗載體免疫反應及無基因體整合 風險。
LNP遞送系統及無毒生物可降解聚合微粒及其製備方法在此項技術中描述。LNP為可囊封核酸分子(例如RNA)之非病毒體脂質體粒子。粒子可包括一些外部RNA(例如在粒子表面上)，但至少一半RNA(且理想地全部)經囊封。脂質體粒子可例如由可為飽和或不飽和之兩性離子性、陽離子性及陰離子性脂質之混合物形成，該等脂質為例如DSPC(兩性離子性、飽和)、DlinDMA(陽離子性、不飽和)及/或DMG(陰離子性、飽和)。用於本發明之較佳LNP包括可形成脂質體之兩親性脂質，視情況與至少一種陽離子性脂質(諸如DOTAP、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA等)組合。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG及膽固醇之混合物尤其有效。其他適用之LNP在此項技術中揭示。在一些實施方案中，LNP為RV01脂質體。
NF-κB
TLR信號傳導路徑以轉錄因子核因子κB(NF-kB)之活化為終點。NF-kB控制一批炎性細胞激素基因(包括TNF-α)之表現。鞭毛蛋白誘導TLR5二聚，隨後募集MyD88且活化蛋白激酶，包括IRAK1、IRAK2、IRAK4及IRAK-M。此等激酶之活化促成促炎性細胞激素NF-kB之核定位[44]。
如實施例中所證實(圖18)，本發明之組成物使得NF-κB之表現增加。因為本發明之組成物之投藥增加促炎性細胞激素NF-κB之表現，所以本發明之組成物可適用於刺激免疫反應。另外，本發明之組成物可適用於治療疾病，尤其為由降低之免疫活化特徵化之疾病及/或由增加之免疫反應可治療之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物藉由增加NF-κB之水準及/或活性而用作免疫刺激劑。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加NF-κB之水準及/或活性來治療由降低之免疫活化特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加NF-κB之水準及/或活性來治療由增加之免疫反應可治療之 疾病。
特別地，本發明之組成物可適用於治療由NF-κB之表現及/或活化降低特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療由NF-κB之表現及/或活化降低特徵化之疾病。
NF-kB之活化對於引出先天性免疫反應及後續適應性免疫反應之發展為重要的。因此，TLR之促效劑，諸如鞭毛蛋白，可能適用作佐劑以藉由促進先天性與適應性免疫反應來治療感染性疾病、過敏及腫瘤[44]。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療感染性疾病、過敏及/或腫瘤。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加NF-κB之水準及/或活性來治療感染性疾病、過敏及/或腫瘤。
治療癌症
類鐸受體(Toll-like receptor，TLR)為主要在先天性免疫細胞上表現之膜結合受體，其在先天性與適應性免疫系統中起關鍵作用。TLR對特異性微生物病原體相關分子模式(PAMP)作出反應。TLR感知細菌細胞壁組分且已知TLR5識別細菌鞭毛蛋白。鞭毛蛋白為TLR5之唯一已知之配位體，其為在一系列人類細胞之表面上表現之受體蛋白，該等細胞包括上皮細胞、內皮細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)及T細胞[45-47]。細菌鞭毛蛋白對TLR5之活化使得多種促炎性及免疫反應基因活化[15]。
已知鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白對TLR5之活化抑制細胞增殖及腫瘤生長[48]。已顯示經工程改造以分泌創傷弧菌鞭毛蛋白B(FlaB)之鼠傷寒沙氏桿菌菌株經由TLR4及TLR5信號傳導路徑之兩步活化來有效抑制小鼠模型中之腫瘤生長及轉移且延長存活[49]。來自其他菌種之鞭毛蛋白多肽治療癌症之功效為未知的。檢定化合物活化TLR5反應之能力顯示該化合物可有效治療癌症。
包含鶉雞腸球菌菌株且尤其包含菌株MRx0518之組成物有效治療 及預防癌症[50]。本發明者已令人驚訝地顯示來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽能夠刺激強TLR5反應，此可有助於腸球菌菌株之抗癌活性。來自鶉雞腸球菌之鞭毛蛋白多肽與來自鼠傷寒沙氏桿菌之鞭毛蛋白多肽具有大序列相異性。實施例顯示來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽相比來自鼠傷寒沙氏桿菌之鞭毛蛋白多肽能夠產生更強TLR5反應。因此，本發明者已顯示來自腸球菌屬且尤其來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽適用於療法中，且尤其有效治療及預防癌症。
已顯示TLR5由許多不同癌症表現，包括乳癌、結腸直腸癌及胃癌。實施例顯示來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽能夠產生強TLR5反應。因此，在某些實施方案中，本發明提供來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防乳癌、結腸直腸癌或胃癌。在某些實施方案中，本發明提供包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療或預防乳癌、結腸直腸癌或胃癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在乳癌、結腸直腸癌或胃癌中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療乳癌。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療結腸直腸癌。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療胃癌。
在某些實施方案中，本發明提供包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療或預防TLR5相關癌症。
本發明提供來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防癌症。本發明亦提供鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防癌症。更佳地，本發明提供尤其具有序列SEQ ID NO：1之來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防癌症。
本發明亦提供包含本發明之鞭毛蛋白多肽之組成物。本發明亦提供包含編碼本發明之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列之組成物。本發明亦提供一種表現本發明之鞭毛蛋白多肽之宿主細胞。另外，本發明亦提供包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼本發明之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列。
在某些實施方案中，用本發明之組成物治療使得腫瘤尺寸減小或腫瘤生長減少。在某些實施方案中，本發明之組成物用於減小腫瘤尺寸或減少腫瘤生長。本發明之組成物可有效減少腫瘤尺寸或生長。在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療患有實體腫瘤之患者。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在癌症治療中減少或預防血管生成。本發明之組成物可對在血管生成中具有核心作用之免疫或炎性系統有作用。在某些實施方案中，本發明之組成物用於預防轉移。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防乳癌。參考文獻[50]證實腸球菌菌株具有對抗乳癌之強效作用，因此依照本申請案中之資料，本發明之鞭毛蛋白多肽可尤其有效對抗乳癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在乳癌治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施方案中，癌症為乳腺癌。在較佳實施方案中，癌症為IV期乳癌。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防肺癌。參考文獻[50]證實腸球菌菌株具有對抗肺癌之強效作用，因此依照本申請案中之資料，本發明之鞭毛蛋白多肽可尤其有效對抗肺癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在肺癌治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施方案中，癌症為肺癌。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防肝癌。參考文獻[50]證實腸球菌菌株具有對抗肝癌之強效作用，因此依照本申請案中之資料，本發明之鞭毛蛋白多肽可尤其有效對抗肝癌。在某些實施方案中，本發明之組 成物用於在肝癌治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施方案中，癌症為肝腫瘤(肝細胞癌)。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防結腸直腸癌。參考文獻[50]證實腸球菌菌株具有對抗結腸直腸癌之強效作用，因此依照本申請案中之資料，本發明之鞭毛蛋白多肽可尤其有效對抗結腸直腸癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在結腸直腸癌治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施方案中，癌症為結腸直腸腺癌。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防結腸癌。參考文獻[50]證實腸球菌菌株具有對抗結腸癌之強效作用，因此依照本申請案中之資料，本發明之鞭毛蛋白多肽可尤其有效對抗結腸癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在結腸癌治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施方案中，癌症為結腸腺癌。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防直腸癌。參考文獻[50]證實腸球菌菌株具有對抗直腸癌之強效作用，因此依照本申請案中之資料，本發明之鞭毛蛋白多肽可尤其有效對抗直腸癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在直腸癌治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施方案中，癌症為直腸腺癌。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療直腸癌。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防胃癌。已顯示胃癌表現高水準之TLR5且用鞭毛蛋白治療引出強效抗腫瘤活性[51]。實施例顯示本發明之鞭毛蛋白多肽能夠產生強TLR5反應，因此本發明之鞭毛蛋白多肽可尤其有效對抗胃癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在胃癌治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施方案中，癌症為胃腺癌。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白 多肽之組成物，其用於治療胃癌。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防黑色素瘤。已顯示來自鼠傷寒沙氏桿菌之鞭毛蛋白與主要組織相容性複合物II類限制之P10肽組合減少鼠類黑色素瘤模型中之肺轉移之數目[52]。實施例顯示本發明之鞭毛蛋白多肽相比鼠傷寒沙氏桿菌能夠產生更強TLR5反應，因此本發明之鞭毛蛋白多肽可尤其有效對抗黑色素瘤。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在黑色素瘤治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療黑色素瘤。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防神經母細胞瘤。已知鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白對TLR5之活化抑制細胞增殖及腫瘤生長[53]。實施例顯示本發明之鞭毛蛋白多肽相比鼠傷寒沙氏桿菌能夠產生更強TLR5反應，因此本發明之鞭毛蛋白多肽可尤其有效對抗神經母細胞瘤。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在神經母細胞瘤治療中減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長或減少血管生成。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療神經母細胞瘤。
在一些實施方案中，癌症為腸癌。在一些實施方案中，癌症為並非腸之身體部分之癌症。在一些實施方案中，癌症不為腸癌。在一些實施方案中，癌症不為結腸直腸癌。在一些實施方案中，癌症不為小腸癌。在一些實施方案中，治療或預防在除腸以外之部位處進行。在一些實施方案中，治療或預防在腸處以及除腸以外之部位處進行。
TLR5之表現已在包括多發性骨髓瘤[54]及急性髓樣白血病[55]之血液癌細胞系中偵測到。本發明者已在實施例中證實來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽尤其有效活化強TLR5反應。來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽因此可適用於治療 或預防表現TLR5之血液癌，諸如多發性骨髓瘤及急性髓樣白血病。因此，在某些實施方案中，本發明提供包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療或預防血液惡性病，諸如多發性骨髓瘤；急性及慢性白血病，諸如急性髓樣白血病、急性淋巴母細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病及急性單核細胞性白血病；淋巴瘤，諸如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma)；及骨髓發育不良症候群。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療急性髓樣白血病。
在某些實施方案中，本發明提供包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療或預防多發性骨髓瘤。在某些實施方案中，本發明提供包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療或預防急性髓樣白血病。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療多發性骨髓瘤。
各種TLR促效劑已在一大批腫瘤模型及臨床試驗中測試[56]。舉例而言，已顯示TLR5促效劑CBLB502促進T及B細胞淋巴瘤之小鼠模型中之腫瘤清除[57]。TLR5促效劑安托莫德(entolimod)(藥理學上優化之鞭毛蛋白衍生物)之全身投藥抑制小鼠模型中之結腸直腸細胞之肝轉移。在投予TLR5促效劑安托莫德之後，肝顯示最強TLR5活化反應[58]。本發明者已在實施例中證實來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽充當強TLR5促效劑。因此，來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽可尤其有效治療或預防T及B細胞淋巴瘤、結腸直腸癌及肝癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防T及B細胞淋巴瘤。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療T及B細胞淋巴瘤。
在其他實施方案中，本發明之組成物可適用於治療或預防轉移。在 其他實施方案中，本發明之組成物可適用於治療轉移癌。在其他實施方案中，本發明之組成物可適用於治療晚期癌症。在某些實施方案中，本發明提供包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療、減少或預防轉移。在某些實施方案中，本發明之組成物可減少或預防轉移性生長。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療或預防轉移。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療或預防轉移癌。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於治療或預防晚期癌症。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防癌瘤。
已顯示創傷弧菌鞭毛蛋白B(FlaB)經由TLR4及TLR5信號傳導路徑之兩步活化來有效抑制腫瘤生長。在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽可活化TLR4及TLR5信號傳導路徑。在其他實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽僅活化TLR5信號傳導路徑。
在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽可活化NFκB信號傳導路徑。在某些實施方案中，本發明之宿主細胞可活化TLR9信號傳導路徑。參考文獻[59]顯示鞭毛蛋白與TLR9促效劑含CpG寡去氧核苷酸之間的協同作用引起腫瘤抑制。在某些實施方案中，本發明之宿主細胞可活化TLR5及TLR9信號傳導路徑。在某些此類實施方案中，本發明之組成物包含含CpG寡去氧核苷酸或與含CpG寡去氧核苷酸組合投予。
本發明之組成物對癌症之治療作用可由促炎性機制介導。鞭毛蛋白對TLR5之活化起始促炎性信號級聯。參考文獻[59]顯示鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白與高免疫原性腫瘤之相互作用誘導Th1反應及Treg抑制，從而抑制腫瘤生長。相比之下，弱免疫原性腫瘤之生長速率不受鞭毛蛋白投藥所影響。因此， 在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽及組成物用於治療免疫原性腫瘤，尤其高免疫原性腫瘤。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在癌症治療中促進發炎。在較佳實施方案中，本發明之組成物用於在癌症治療中促進Th1發炎。Th1細胞產生IFNγ且具有強效抗癌作用[60]。在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療早期癌症，諸如尚未轉移之癌症，或0期或1期癌症。促進發炎可更有效對抗早期癌症[60]。
參考文獻[59]顯示在腫瘤移植之後鞭毛蛋白投藥顯著抑制抗原性腫瘤生長。鞭毛蛋白對腫瘤生長之不同作用與所誘導之免疫反應相關。在移植之後鞭毛蛋白投藥與增加之IFN-γ：IL-4比率及頻率減少之CD4+CD25+T調控細胞相關聯。因此，在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽及組成物增加IFN-γ：IL-4比率。在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽及組成物減少CD4+CD25+T調控細胞之頻率。在其他實施方案中，本發明之鞭毛蛋白多肽及組成物並不降低IFN-γ：IL-4比率且增加CD4+CD25+T細胞頻率。發炎可具有癌症抑制作用[60]，且正研究諸如TNFα之促炎性細胞激素作為癌症療法[61]。諸如TNF之基因的上調可指示本發明之組成物可適用於經由類似機制治療癌症。CXCR3配位體(CXCL9、CXCL10)及IFNγ可誘導基因(IL-32)之上調可指示本發明之組成物引出IFNγ型反應。IFNγ為可刺激殺腫瘤活性之強效巨噬細胞活化因子[62]，且例如CXCL9及CXCL10亦具有抗癌作用[63-65]。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於促進發炎以增強第二抗癌劑之作用。在某些實施方案中，癌症之治療或預防包含增加一或多種細胞激素之表現水準。舉例而言，在某些實施方案中，癌症之治療或預防包含增加IL-1β、IL-6及TNF-α中之一或多者之表現水準，例如IL-1β及IL-6、IL-1β及TNF-α、IL-6及TNF-α或IL-1β、IL-6及TNF-α全部三者。已知IL-1β、IL-6及TNF-α中之任一者之表現水準的增加指示癌症治療中之功效。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療先前已接受化學療法之患者。在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療尚未耐受化學療法治療之患者。本發明之組成物可尤其適合於此類患者。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於預防復發。本發明之組成物可適合於長期投藥。在某些實施方案中，本發明之組成物用於預防癌症進展。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療非小細胞肺癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療小細胞肺癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療鱗狀細胞癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療腺癌。在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療腺腫瘤、類癌腫瘤或未分化癌瘤。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療肝母細胞癌、膽管癌、膽管細胞囊腺癌或因病毒感染引起之肝癌。
在某些實施方案中，本發明之組成物用於治療侵入性管癌、原位管癌或侵入性小葉癌。
在其他實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性髓樣白血病、腎上腺皮質癌、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨腫瘤、骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤、腦幹神經膠質瘤、腦腫瘤、小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、神經管母細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、乳癌、支氣管腺瘤/類癌、伯奇氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、類癌腫瘤、子宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生病症、結腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、眼內黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、生殖細胞腫瘤、兒童視覺路徑及下視丘神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎細胞癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、間皮瘤、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、副甲狀腺癌、咽癌、垂體腺瘤、漿細胞贅瘤、前列腺癌、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、肉瘤、睪丸癌、甲狀腺癌或子宮癌。
本發明之組成物當與其他治療劑組合使用時可尤其有效。本發明之組成物之免疫調節作用當與更直接抗癌劑組合時可為有效的。因此，在某些實施方案中，本發明提供一種組成物，其包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽(或編碼聚核苷酸或表現宿主細胞)及抗癌劑。在較佳實施方案中，抗癌劑為免疫檢查點抑制劑、靶向抗體免疫療法、CAR-T細胞療法、溶瘤病毒或細胞生長抑制藥。抗癌劑較佳為可瑞達(Keytruda)(帕博利珠單抗(pembrolizumab)，Merck)。在其他較佳實施方案中，組成物包含選自由以下組成之群組的抗癌劑：伊沃(Yervoy)(伊匹單抗(ipilimumab)，BMS)；歐狄沃(Opdivo)(納武單抗(nivolumab)，BMS)；MEDI4736(AZ/MedImmune)；MPDL3280A(Roche/Genentech)；替西木單抗(Tremelimumab)(AZ/MedImmune)；CT-011(匹利珠單抗(pidilizumab)，CureTech)；BMS-986015(利麗單抗(lirilumab)，BMS)；MEDI0680(AZ/MedImmune)；MSB-0010718C(Merck)；PF-05082566(Pfizer)；MEDI6469(AZ/MedImmune)；BMS-986016(BMS)；BMS-663513(烏瑞魯單抗(urelumab)，BMS)；IMP321(Prima Biomed)；LAG525(Novartis)；ARGX-110(arGEN-X)；PF-05082466(Pfizer)；CDX-1127(伐立魯單抗(varlilumab)，CellDex Therapeutics)；TRX-518(GITR Inc.)；MK-4166(Merck)；JTX-2011(Jounce Therapeutics)；ARGX-115(arGEN-X)；NLG-9189(吲哚莫德(indoximod)，NewLink Genetics)；INCB024360(Incyte)；IPH2201(Innate Immotherapeutics/AZ)；NLG-919(NewLink Genetics)；抗VISTA(JnJ)；帕多司他(Epacadostat)(INCB24360，Incyte)；F001287(Flexus/BMS)；CP 870893(賓州大學(University of Pennsylvania))；MGA271(Macrogenix)；依瑪妥珠單抗(Emactuzumab)(Roche/Genentech)；高路瑟尼(Galunisertib)(Eli Lilly)；烏洛魯單抗(Ulocuplumab)(BMS)；BKT140/BL8040(Biokine Therapeutics)；巴維昔單抗(Bavituximab)(Peregrine Pharmaceuticals)；CC 90002(Celgene)；852A(Pfizer)；VTX-2337(VentiRx Pharmaceuticals)；IMO-2055(Hybridon，Idera Pharmaceuticals)；LY2157299(Eli Lilly)；EW-7197(韓國梨花女子大學(Ewha Women's University,Korea))；維羅非尼(Vemurafenib)(Plexxikon)；達拉非尼(Dabrafenib)(Genentech/GSK)；BMS-777607(BMS)；BLZ945(Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre)；優土新(Unituxin)(達妥昔單抗(dinutuximab)，United Therapeutics Corporation)；博林托(Blincyto)(博納吐單抗(blinatumomab)，Amgen)；克瑪澤(Cyramza)(雷莫蘆單抗(ramucirumab)，Eli Lilly)；加紮瓦(Gazyva)(奧比妥珠單抗(obinutuzumab)，Roche/Biogen)；卡塞羅(Kadcyla)(阿多曲妥珠單抗美坦新(ado-trastuzumab emtansine)，Roche/Genentech)；帕羅嘉(Perjeta)(帕妥珠單抗(pertuzumab)，Roche/Genentech)；阿德曲司(Adcetris)(布倫妥昔單抗維多汀(brentuximab vedotin)，Takeda/Millennium)；奧澤拉(Arzerra)(奧法木單抗(ofatumumab)，GSK)；維克替比(Vectibix)(帕尼單抗(panitumumab)，Amgen)；阿瓦斯丁(Avastin)(貝伐單抗(bevacizumab)，Roche/Genentech)；愛必妥(Erbitux)(西妥昔單抗(cetuximab)，BMS/Merck)；百克沙(Bexxar)(托西莫單抗I131(tositumomab-I131)，GSK)；澤瓦林(Zevalin)(替坦異貝莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen)；坎帕斯(Campath)(阿侖單抗(alemtuzumab)，Bayer)；麥羅塔(Mylotarg)(吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，Pfizer)；赫塞汀(Herceptin)(曲妥珠單抗(trastuzumab)，Roche/Genentech)；美羅華(Rituxan)(利妥昔單抗(rituximab)，Genentech/Biogen)；弗洛西單抗(volociximab)(Abbvie)；恩凡珠單抗(Enavatuzumab)(Abbvie)；ABT-414(Abbvie)；埃羅妥珠單抗(Elotuzumab) (Abbvie/BMS)；ALX-0141(Ablynx)；奧紮利單抗(Ozaralizumab)(Ablynx)；Actimab-C(Actinium)；Actimab-P(Actinium)；多克米拉珠單抗(Milatuzumab-dox)(Actinium)；Emab-SN-38(Actinium)；伊土莫單抗(Naptumonmab estafenatox)(Active Biotech)；AFM13(Affimed)；AFM11(Affimed)；AGS-16C3F(Agensys)；AGS-16M8F(Agensys)；AGS-22ME(Agensys)；AGS-15ME(Agensys)；GS-67E(Agensys)；ALXN6000(沙瑪立珠單抗(samalizumab)，Alexion)；ALT-836(Altor Bioscience)；ALT-801(Altor Bioscience)；ALT-803(Altor Bioscience)；AMG780(Amgen)；AMG 228(Amgen)；AMG820(Amgen)；AMG172(Amgen)；AMG595(Amgen)；AMG110(Amgen)；AMG232(阿德木單抗(adecatumumab)，Amgen)；AMG211(Amgen/MedImmune)；BAY20-10112(Amgen/Bayer)；利妥木單抗(Rilotumumab)(Amgen)；地諾單抗(Denosumab)(Amgen)；AMP-514(Amgen)；MEDI575(AZ/MedImmune)；MEDI3617(AZ/MedImmune)；MEDI6383(AZ/MedImmune)；MEDI551(AZ/MedImmune)；莫西妥莫單抗帕斯多克(Moxetumomab pasudotox)(AZ/MedImmune)；MEDI565(AZ/MedImmune)；MEDI0639(AZ/MedImmune)；MEDI0680(AZ/MedImmune)；MEDI562(AZ/MedImmune)；AV-380(AVEO)；AV203(AVEO)；AV299(AVEO)；BAY79-4620(Bayer)；拉安土單抗(Anetumab ravtansine)(Bayer)；萬替珠單抗(vantictumab)(Bayer)；BAY94-9343(Bayer)；西羅珠單抗(Sibrotuzumab)(Boehringer Ingleheim)；BI-836845(Boehringer Ingleheim)；B-701(BioClin)；BIIB015(Biogen)；奧比妥珠單抗(Obinutuzumab)(Biogen/Genentech)；BI-505(Bioinvent)；BI-1206(Bioinvent)；TB-403(Bioinvent)；BT-062(Biotest)；BIL-010t(Biosceptre)；MDX-1203(BMS)；MDX-1204(BMS)；耐昔妥珠單抗(Necitumumab)(BMS)；CAN-4(Cantargia AB)；CDX-011(Celldex)；CDX1401(Celldex)；CDX301(Celldex)；U3-1565(Daiichi Sankyo)；帕圖單抗(patritumab)(Daiichi Sankyo)；替 加珠單抗(tigatuzumab)(Daiichi Sankyo)；尼妥珠單抗(nimotuzumab)(Daiichi Sankyo)；DS-8895(Daiichi Sankyo)；DS-8873(Daiichi Sankyo)；DS-5573(Daiichi Sankyo)；MORab-004(Eisai)；MORab-009(Eisai)；MORab-003(Eisai)；MORab-066(Eisai)；LY3012207(Eli Lilly)；LY2875358(Eli Lilly)；LY2812176(Eli Lilly)；LY3012217(Eli Lilly)；LY2495655(Eli Lilly)；LY3012212(Eli Lilly)；LY3012211(Eli Lilly)；LY3009806(Eli Lilly)；西妥木單抗(cixutumumab)(Eli Lilly)；弗蘭單抗(Flanvotumab)(Eli Lilly)；IMC-TR1(Eli Lilly)；雷莫蘆單抗(Ramucirumab)(Eli Lilly)；他布魯單抗(Tabalumab)(Eli Lilly)；紮木單抗(Zanolimumab)(Emergent Biosolution)；FG-3019(FibroGen)；FPA008(Five Prime Therapeutics)；FP-1039(Five Prime Therapeutics)；FPA144(Five Prime Therapeutics)；卡妥索單抗(catumaxomab)(Fresenius Biotech)；IMAB362(Ganymed)；IMAB027(Ganymed)；HuMax-CD74(Genmab)；HuMax-TFADC(Genmab)；GS-5745(Gilead)；GS-6624(Gilead)；OMP-21M18(登西珠單抗(demcizumab)，GSK)；馬帕木單抗(mapatumumab)(GSK)；IMGN289(ImmunoGen)；IMGN901(ImmunoGen)；IMGN853(ImmunoGen)；IMGN529(ImmunoGen)；IMMU-130(Immunomedics)；多克米拉珠單抗(Immunomedics)；IMMU-115(Immunomedics)；IMMU-132(Immunomedics)；IMMU-106(Immunomedics)；IMMU-102(Immunomedics)；依帕珠單抗(Epratuzumab)(Immunomedics)；克利瓦單抗(Clivatuzumab)(Immunomedics)；IPH41(Innate Immunotherapeutics)；達雷木單抗(Daratumumab)(Janssen/Genmab)；CNTO-95(英妥木單抗(Intetumumab)，Janssen)；CNTO-328(司妥昔單抗(siltuximab)，Janssen)；KB004(KaloBios)；莫加利珠單抗(mogamulizumab)(Kyowa Hakko Kirrin)；KW-2871(依美昔單抗(ecromeximab)，Life Science)；索耐珠單抗(Sonepcizumab)(Lpath)；馬妥昔單抗(Margetuximab)(Macrogenics)；恩比利珠單抗(Enoblituzumab)(Macrogenics)；MGD006 (Macrogenics)；MGF007(Macrogenics)；MK-0646(達洛珠單抗(dalotuzumab)，Merck)；MK-3475(Merck)；Sym004(Symphogen/Merck Serono)；DI17E6(Merck Serono)；MOR208(Morphosys)；MOR202(Morphosys)；Xmab5574(Morphosys)；BPC-1C(恩斯圖單抗(ensituximab)，Precision Biologics)；TAS266(Novartis)；LFA102(Novartis)；BHQ880(Novartis/Morphosys)；QGE031(Novartis)；HCD122(魯卡木單抗(lucatumumab)，Novartis)；LJM716(Novartis)；AT355(Novartis)；OMP-21M18(登西珠單抗(Demcizumab)，OncoMed)；OMP52M51(Oncomed/GSK)；OMP-59R5(Oncomed/GSK)；萬替珠單抗(Oncomed/Bayer)；CMC-544(奧英妥珠單抗(inotuzumab ozogamicin)，Pfizer)；PF-03446962(Pfizer)；PF-04856884(Pfizer)；PSMA-ADC(Progenics)；REGN1400(Regeneron)；REGN910(耐西維單抗(nesvacumab)，Regeneron/Sanofi)；REGN421(恩替庫單抗(enoticumab)，Regeneron/Sanofi)；RG7221、RG7356、RG7155、RG7444、RG7116、RG7458、RG7598、RG7599、RG7600、RG7636、RG7450、RG7593、RG7596、DCDS3410A、RG7414(帕薩妥珠單抗(parsatuzumab))、RG7160(英加妥珠單抗(imgatuzumab))、RG7159(歐賓珠單抗(obintuzumab))、RG7686、RG3638(奧納珠單抗(onartuzumab))、RG7597(Roche/Genentech)；SAR307746(Sanofi)；SAR566658(Sanofi)；SAR650984(Sanofi)；SAR153192(Sanofi)；SAR3419(Sanofi)；SAR256212(Sanofi)；SGN-LIV1A(林妥珠單抗(lintuzumab)，Seattle Genetics)；SGN-CD33A(Seattle Genetics)；SGN-75(伏司妥珠單抗馬佛多汀(vorsetuzumab mafodotin)，Seattle Genetics)；SGN-19A(Seattle Genetics)；SGN-CD70A(Seattle Genetics)；SEA-CD40(Seattle Genetics)；替坦異貝莫單抗(Spectrum)；MLN0264(Takeda)；蓋尼塔單抗(ganitumab)(Takeda/Amgen)；CEP-37250(Teva)；TB-403(Thrombogenic)；VB4-845(Viventia)；Xmab2512(Xencor)；Xmab5574(Xencor)；尼妥珠單抗(nimotuzumab)(YM Biosciences)；卡 魯單抗(Carlumab)(Janssen)；NY-ESO TCR(Adaptimmune)；MAGE-A-10 TCR(Adaptimmune)；CTL019(Novartis)；JCAR015(Juno Therapeutics)；KTE-C19 CAR(Kite Pharma)；UCART19(Cellectis)；BPX-401(Bellicum Pharmaceuticals)；BPX-601(Bellicum Pharmaceuticals)；ATTCK20(Unum Therapeutics)；CAR-NKG2D(Celyad)；Onyx-015(Onyx Pharmaceuticals)；H101(Shanghai Sunwaybio)；DNX-2401(DNAtrix)；VCN-01(VCN Biosciences)；Colo-Ad1(PsiOxus Therapeutics)；ProstAtak(Advantagene)；Oncos-102(Oncos Therapeutics)；CG0070(Cold Genesys)；Pexa-vac(JX-594，Jennerex Biotherapeutics)；GL-ONC1(Genelux)；T-VEC(Amgen)；G207(Medigene)；HF10(Takara Bio)；SEPREHVIR(HSV1716，Virttu Biologics)；OrienX010(OrienGene Biotechnology)；瑞萊新(Reolysin)(Oncolytics Biotech)；SVV-001(Neotropix)；卡卡塔克(Cacatak)(CVA21，Viralytics)；愛甯達(Alimta)(Eli Lilly)；順鉑(cisplatin)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；伊立替康(irinotecan)；醛葉酸(folinic acid)；胺甲喋呤(methotrexate)；環磷醯胺；5-氟尿嘧啶；澤卡迪(Zykadia)(Novartis)；塔非拉(Tafinlar)(GSK)；賽可瑞(Xalkori)(Pfizer)；易瑞沙(Iressa)(AZ)；吉泰瑞(Gilotrif)(Boehringer Ingelheim)；特羅凱(Tarceva)(Astellas Pharma)；海樂衛(Halaven)(Eisai Pharma)；維利帕尼(Veliparib)(Abbvie)；AZD9291(AZ)；阿來替尼(Alectinib)(Chugai)；LDK378(Novartis)；金特斯匹(Genetespib)(Synta Pharma)；特根普瑪L(Tergenpumatucel-L)(NewLink Genetics)；GV1001(Kael-GemVax)；替萬替尼(Tivantinib)(ArQule)；癌得星(Cytoxan)(BMS)；安可平(Oncovin)(Eli Lilly)；阿德力黴素(Adriamycin)(Pfizer)；健擇(Gemzar)(Eli Lilly)；希羅達(Xeloda)(Roche)；伊沙普(Ixempra)(BMS)；阿巴仙(Abraxane)(Celgene)；曲司他(Trelstar)(Debiopharm)；泰素帝(Taxotere)(Sanofi)；蕾莎瓦(Nexavar)(Bayer)；IMMU-132(Immunomedics)；E7449(Eisai)；塞莫多克(Thermodox)(Celsion)；康美曲 (Cometriq)(Exellxis)；朗斯弗(Lonsurf)(Taiho Pharmaceuticals)；開普拓(Camptosar)(Pfizer)；UFT(Taiho Pharmaceuticals)；及TS-1(Taiho Pharmaceuticals)。
在其他較佳實施方案中，鞭毛蛋白多肽與已與其他鞭毛蛋白一起顯示有用作用之含CpG寡去氧核苷酸組合(同時或依序)投予[59]。
在一些實施方案中，來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽為本發明之組成物中之唯一治療活性劑。
保護免受毒性化學品、病原體或放射線暴露侵害
在某些實施方案中，本發明提供一種來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽、較佳來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽、較佳來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽，其用於預防或治療與毒性化學品、病原體或放射線暴露相關聯之症狀。可將本發明之鞭毛蛋白投予處於毒性化學品、病原體或放射線暴露風險下之個體或最近暴露於毒性化學品、病原體或放射線之個體，例如先前暴露1、2、3、4或5小時之個體。
人群突然暴露於化學品、病原體或放射線可能導致實質性發病。一種保護人群之策略為活化先天性宿主防禦路徑，尤其快速誘導細胞保護及/或抗微生物基因表現之彼等。在此領域中之許多工作已集中於TLR4促效劑LPS/內毒素，然而，LPS投藥可導致嚴重炎性病態，包括敗血症或嚴重肺損傷。另外，LPS為上皮細胞之不良刺激劑，該等上皮細胞為與病原體或化學品攻擊相互作用之第一細胞。
鞭毛蛋白在包括哺乳動物、昆蟲及植物之多種生物體中刺激宿主防禦。與LPS成對比，鞭毛蛋白為上皮細胞中之先天性免疫信號傳導路徑之強效活化劑，但一般已觀測到為諸如巨噬細胞及樹突狀細胞之造血細胞之不良活化劑。已觀測到鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白不刺激顯著水準之「主要」促炎性細胞激素，諸如TNF-α，該等細胞激素介導與LPS相關聯之副作用。已觀測到鼠傷 寒沙氏桿菌鞭毛蛋白活化小鼠中TLR5介導之先天性免疫，保護小鼠免受化學品、病原體或放射線暴露侵害[66]。
已顯示鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白之投藥經由需要TLR5之機制保護免受放射線暴露侵害[66]。當在放射線之前2小時預防性地投予鞭毛蛋白時觀測到最佳保護，但若在輻射之後至多4小時投予鞭毛蛋白，則仍觀測到顯著程度之保護。實施例顯示來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽相比鼠傷寒沙氏桿菌能夠刺激更強TLR5反應。因此，本發明者已顯示來自腸球菌屬且尤其來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽可適用作放射防護劑。
本發明提供來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽，其用作放射防護劑。本發明亦提供鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽，其用作放射防護劑。更佳地，本發明提供尤其具有序列SEQ ID NO：1之來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽，其用作放射防護劑。
亦已顯示用TLR5促效劑安托莫德治療在以下全部三種主要類型之放射敏感性組織中減少放射線誘發之損傷：造血、胃腸及皮膚。亦已顯示其在頭頸放射線之小鼠模型中減輕放射線誘發之上皮損傷[67]。實施例顯示來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽充當強效TLR5促效劑。因此，本發明者已顯示來自腸球菌屬且尤其來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽可適用於減少放射線誘發之損傷。在某些實施方案中，包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物用於減少造血、胃腸或皮膚組織中放射線誘發之損傷。在某些實施方案中，包含來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之組成物用於減少放射線誘發之上皮損傷。在較佳實施方案中，本發明提供一種包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於減少放射線誘發之損傷。
在某些實施方案中，可在放射療法之前，較佳經口投予本發明之組成物。在某些實施方案中，可在放射療法之後即刻，較佳經口投予本發明之組 成物。在某些實施方案中，本發明之組成物有待投予最近已經歷放射療法或計劃經歷放射療法之患者。
在較佳實施方案中，在輻射暴露之前投予來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽。在其他實施方案中，在放射線暴露之後，較佳在暴露之後4小時內投予來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽。
治療細菌感染
已顯示鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白之投藥刺激對細菌感染之免疫反應。參考文獻[68]顯示鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白與抗生素之預防性鼻內投藥保護小鼠免受呼吸道肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)細菌侵害，而參考文獻[66]顯示在鼠傷寒沙氏桿菌感染之前2小時鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白之經口投藥降低死亡率。鞭毛蛋白藉由活化TLR5先天性免疫反應來誘導此等反應。實施例顯示來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽相比鼠傷寒沙氏桿菌能夠刺激更強TLR5反應。因此，本發明者已顯示來自腸球菌屬且尤其來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽可適用於治療或預防細菌感染。
本發明提供來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防細菌感染。本發明亦提供鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防細菌感染。更佳地，本發明提供尤其具有序列SEQ ID NO：1之來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防細菌感染。
在某些實施方案中，來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽與用於治療細菌感染之抗生素組合使用。在某些實施方案中，來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽為用於治療細菌感染之組成物中所用之唯一治療劑。
疫苗佐劑
微生物組分可用作佐劑以增強不良免疫原性疫苗之免疫反應。已顯示鞭毛蛋白充當用於細菌、病毒及寄生蟲感染之疫苗中之佐劑，然而，大多數 此等研究使用來自鼠傷寒沙氏桿菌及創傷弧菌之鞭毛蛋白[15]。來自其他菌種且尤其腸球菌種之鞭毛蛋白多肽充當疫苗佐劑之功效為未知的。
鞭毛蛋白藉由經TLR5受體刺激先天性免疫反應來充當佐劑。本發明者已令人驚訝地顯示來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽相比鼠傷寒沙氏桿菌能夠刺激更強TLR5反應。因此，本發明者已顯示來自腸球菌屬且尤其來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽可適用作疫苗佐劑。使用鞭毛蛋白多肽作為疫苗佐劑意指鞭毛蛋白多肽用於例如一般藉由增強對單獨抗原之免疫反應來提供對抗感染物之保護或防止受感染物感染。
本發明提供來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽，其用作疫苗佐劑。本發明亦提供鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽，其用作疫苗佐劑。更佳地，本發明提供尤其具有序列SEQ ID NO：1之來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽，其用作疫苗佐劑。
本發明亦提供包含本發明之鞭毛蛋白多肽作為佐劑之疫苗組成物。在某些實施方案中，疫苗組成物用於治療或預防細菌感染。在某些實施方案中，有待治療或預防之細菌病原體為鼠疫耶氏桿菌(Y.pestis)、破傷風(tetanus)、肺炎鏈球菌、大腸桿菌(Escherichia coli)或結核分枝桿菌(M.tuberculosis)。在某些實施方案中，疫苗組成物用於治療或預防病毒感染。在某些實施方案中，有待治療或預防之病毒病原體為流感、HIV、狂犬病或口蹄疫病毒。在某些實施方案中，疫苗組成物用於治療或預防寄生蟲感染。在某些實施方案中，寄生蟲為間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、亞力瘧原蟲(Plasmodium yoelii)或盲腸型球蟲(Eimeria tenella)。在任何此類實施方案中，組成物包含至少一種來自相關病原體之抗原。在較佳此類實施方案中，組成物包含融合或接合至至少一種來自相關病原體之抗原的本發明之鞭毛蛋白。在此類實施方案中，本發明提供一種融合多肽，其包含本發明之鞭毛蛋白、視情況存在之連接子及來自病原體或寄生蟲之抗原。
經黏膜途徑投藥為具吸引力之疫苗投藥途徑。鞭毛蛋白為上皮細胞中之先天性免疫信號傳導路徑之強效活化劑，該等上皮細胞為遭遇由黏膜途徑投予之藥劑的首要細胞類型。鼠傷寒沙氏桿菌及創傷弧菌鞭毛蛋白在針對流感、西尼羅病毒、大腸桿菌、鼠疫耶氏桿菌(Yersinia pestis)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、空腸彎曲桿菌(C.jejuni)、鏈球菌種及惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)之黏膜疫苗中已顯示強效佐劑活性[15]。來自其他菌種之鞭毛蛋白多肽充當黏膜疫苗佐劑之功效為未知的。
鞭毛蛋白藉由經TLR5受體刺激先天性免疫反應來充當佐劑。本發明者已令人驚訝地顯示來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽相比鼠傷寒沙氏桿菌能夠刺激更強TLR5反應。因此，本發明提供來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽，其用作黏膜疫苗佐劑。在較佳實施方案中，本發明提供來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽，其用作黏膜疫苗佐劑。更佳地，本發明提供尤其具有序列SEQ ID NO：1之來自菌株MRx0518之鞭毛蛋白多肽，其用作黏膜疫苗佐劑。
在某些實施方案中，來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽在黏膜疫苗中使用以供治療或預防細菌感染。在較佳實施方案中，細菌感染為大腸桿菌、鼠疫耶氏桿菌、破傷風梭菌、空腸彎曲桿菌、鏈球菌種或惡性瘧原蟲。在某些實施方案中，來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽在黏膜疫苗中使用以供治療或預防病毒感染。在較佳實施方案中，病毒感染為流感或西尼羅病毒。
本發明之組成物之投藥可使得腫瘤壞死因子α(TNF-α)之表現增加。已知TNF-α對於疫苗反應為重要的。舉例而言，已顯示TNF-α在老年人群之流感疫苗接種中為有效疫苗反應所需要[69]。因為本發明之組成物之投藥可增加TNF-α表現，所以本發明之組成物可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物藉由增加TNF-α之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物在 流感療法中用作疫苗佐劑。在某些實施方案中，本發明之組成物用於增強針對抗原之免疫反應。在某些實施方案中，本發明提供一種有待與抗原組合投予之組成物。在本發明之此類實施方案中，本發明之鞭毛蛋白可融合或接合至抗原。在某些實施方案中，本發明之組成物用於在即將疫苗接種之前或在疫苗接種之後即刻投予患者。
鶉雞腸球菌及尤其菌株MRX518有鞭毛且鞭毛蛋白可為TLR5促效劑。TLR促效劑跨越一系列抗原類型正開發作為疫苗佐劑，尤其在老年人群中[70]。又，MRX518為TLR5促效劑。因此，本發明之組成物可適用作疫苗佐劑，尤其用於投予可能具有降低之免疫系統活性之老年患者(例如超過40歲、50歲、60歲、70歲或80歲)之疫苗。TLR5信號傳導亦在年齡相關之先天性免疫反應中起關鍵作用[71]。在某些實施方案中，組成物用於增強先天性免疫反應。儘管TLR5促效劑正開發作為疫苗佐劑，但此等全部來自已知病原體及/或為合成的。相比之下，本發明之組成物包含共生細菌。
本發明之組成物之投藥可使得IL-6之表現增加。增加之Il-6表現已與許多疾病之疫苗反應相關聯。舉例而言，在向成人投予流感疫苗之後IL-6由CD14+CD16-炎性單核細胞產生[72]，且較高水準之IL-6與達成對流感疫苗之疫苗反應相關聯[73]。此外，Il-6在注射AS03佐劑系統之後產生[74]，且在投予結核疫苗之後顯示小鼠中IL-6之下調降低輔助T細胞反應[75]。因為本發明之組成物之投藥可增加IL-6表現，所以本發明之組成物可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物藉由增加IL-6之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物在結核療法中用作疫苗佐劑。
此外，已顯示IL-6及TNF-α表現與治療性HIV疫苗[Huang等人]、結核疫苗及披衣菌疫苗[76]之功效相關。Su等人[77]顯示IL-6或TNF-α與FMDV DNA疫苗之共同接種使得CD4+及CD8+ T細胞對IFN-γ之表現增加、CD4+ T細胞中IL-4之表現更高及抗原特異性細胞毒性反應更高。因為本發明之組成物之投藥可增加IL-6及TNF-α表現，所以本發明之組成物可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物藉由增加TNF-α之水準及/或活性可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物藉由增加IL-6之水準及/或活性可適用作疫苗佐劑。在特定實施方案中，本發明之組成物藉由增加TNF-α及IL-6之水準及/或活性可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物在HIV療法中用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物在披衣菌療法中用作疫苗佐劑。
本發明之組成物之投藥可使得IL-1β之表現增加。Li等人[78]顯示佐劑氫氧化鋁活化IL-1β之分泌，且表明IL-β本身可充當佐劑。因為本發明之組成物之投藥可增加IL-1β表現，所以本發明之組成物可適用作疫苗佐劑。實施例顯示本發明之組成物之投藥可增加CD8+ T細胞與Treg之比率。已顯示佐劑刺激CD8+ T細胞[79]，且因為顯示本發明之組成物之投藥增加CD8+ T細胞與Treg之比率，所以本發明之組成物可適用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物用作疫苗佐劑。在一個實施方案中，本發明之組成物藉由增加CD8+ T細胞與Treg之比率而用作疫苗佐劑。
本發明之組成物之投藥可使得CXCR3配位體CXCL9及CXCL10之表現或水準增加。諸如ASO3、CpG、GLA-SE、αGalCer之已知佐劑全部增加CXCL9及10[80、81]，表明本發明之組成物作為佐劑將有效。又，CXCL9及10與IFNγ/Th1反應相關聯且促進抗體反應[82]。在某些實施方案中，本發明之組成物用於促進針對抗原，尤其病原性或癌症抗原之抗體反應。又，在接受所研究之瘧疾疫苗之自願者中CXCL9相比IFN-γ為疫苗誘導之T細胞反應之更敏感量度[83]。在某些實施方案中，本發明之組成物用於促進針對抗原，尤其病原 性或癌症抗原之T細胞反應。在一個實施方案中，本發明之組成物藉由增加CXCL9及CXCL10之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。在某些實施方案中，組成物用於保護免受瘧疾侵害。
本發明之組成物之投藥可使得IL-12p70之表現或水準增加。此作用已與疫苗佐劑效率相關聯且已提議IL-12作為佐劑本身[84]，表明本發明之組成物作為佐劑將有效。在一個實施方案中，本發明之組成物藉由增加IL-12p70之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。
一般而言，當用作疫苗佐劑時，本發明之組成物將單獨投予以為已獨立地投予患者之抗原提供佐劑作用。在某些實施方案中，經口投予本發明之組成物，而非經腸注射抗原。在替代性實施方案中，本發明之鞭毛蛋白可融合或接合至抗原。
本發明之組成物可用於增強對任何有用抗原之免疫反應。用於本發明之例示性抗原包括：病毒抗原，諸如病毒表面蛋白；細菌抗原，諸如蛋白質及/或醣抗原；真菌抗原；寄生蟲抗原；及腫瘤抗原。本發明尤其適用於對抗以下之疫苗：流感病毒、HIV、鉤蟲、B型肝炎病毒、單純疱疹病毒、狂犬病、呼吸道融合性病毒、細胞巨大病毒、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、披衣菌、SARS冠狀病毒、水痘帶狀疱疹病毒、肺炎鏈球菌、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、艾司坦-巴爾病毒、人類乳突狀瘤病毒等。在某些實施方案中，本發明之鞭毛蛋白融合或接合至此等抗原中之一或多者。
與本發明之鞭毛蛋白一起使用之其他抗原包括醣蛋白及脂聚醣抗原。在某些實施方案中，抗原為古細菌抗原。例示性腫瘤相關抗原包括黑色素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸化Tn(STn)、人端粒酶反轉錄酶(hTERT)、威爾姆斯瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原 (PSA)、艾司坦-巴爾病毒抗原、新抗原及致癌蛋白。
本發明之鞭毛蛋白亦可適用於增強對疫苗之反應，該等疫苗對抗非傳染性疾病，諸如阿茲海默氏病及其他神經退化性病症，在該情況下用於本發明之抗原可為類澱粉蛋白β或Tau。用於非傳染性疾病之其他此類抗原包括PCSK9(對於高膽固醇之治療)。本發明之鞭毛蛋白亦可適用於增強對疫苗之反應，該等疫苗對抗成癮性物質，例如菸鹼、酒精或鴉片劑。
本發明亦提供以下之用途：(i)抗原之水性製劑；及(ii)包含來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽之組成物，其用於製造用以提高患者中之免疫反應之藥物。
藉由此等方法及用途提高之免疫反應一般將包括抗體反應，較佳為保護性抗體反應。
刺激免疫系統
本發明之組成物可引起免疫刺激。因為本發明之組成物之投藥可具有免疫刺激作用，所以本發明之組成物可適用於治療疾病，尤其為由降低之免疫活化特徵化之疾病及由增加之免疫反應可治療之疾病。在某些實施方案中，本發明之組成物用於刺激免疫系統。在某些實施方案中，本發明之組成物用於藉由刺激免疫系統來治療疾病。在某些實施方案中，本發明之組成物用於促進免疫反應。
本發明之組成物可適用於治療由細胞群體中Treg之百分比增加特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物可適用於治療或預防由細胞群體中Treg之百分比增加特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物可適用於治療或預防由細胞群體中CD4+CD25+CD127-細胞之百分比增加特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由降低細胞群體中Treg之百分比來治療或預防疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於減少Treg 對免疫反應之抑制。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由Treg之選擇性降低來刺激免疫反應。在一個實施方案中，本發明之組成物用於免疫刺激，其中本發明之組成物減少Treg之數目或百分比。
本發明之組成物可適用於治療由CD8/Treg及/或經活化之CD8/Treg細胞之比率降低特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由CD8/Treg細胞之比率降低特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由經活化之CD8/Treg細胞之比率降低特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加CD8/Treg細胞之比率來刺激免疫反應。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加經活化之CD8/Treg細胞之比率來刺激免疫反應。
本發明之組成物可適用於治療由B細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由B細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由CD19+CD3-細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加細胞群體中B細胞之數目或百分比來治療或預防疾病，其中B細胞之數目或百分比的增加引起免疫刺激。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加B細胞之數目或百分比來刺激免疫反應。
本發明之組成物可適用於治療由CD8 T細胞毒性細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由CD8 T細胞毒性細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加細胞群體中CD8 T細胞毒性細胞之數目或百分比來治療或預防疾病，其中CD8 T細胞毒性細胞之數目或百分比的增加引起免疫刺激。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加CD8 T細胞毒性細胞之數目或百分比來刺激免疫反應。
本發明之組成物可適用於治療由CD8+經活化細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由CD8+經活化細胞之數目或百分比減少特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加細胞群體中CD8+經活化細胞之數目或百分比來治療或預防疾病，其中CD8+經活化細胞之數目或百分比的增加引起免疫刺激。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加CD8+經活化細胞之數目或百分比來刺激免疫反應。
本發明之組成物之投藥可使得諸如促炎性細胞激素之促炎性分子之表現增加。在投予本發明之組成物後可顯示表現水準增加之促炎性分子之實例包括IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β及IL-6。因為本發明之組成物之投藥可增加促炎性分子之表現，所以本發明之組成物可適用於治療由諸如促炎性細胞激素之促炎性分子之表現降低特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由促炎性分子之表現及/或活性降低特徵化之疾病，尤其為由促炎性細胞激素之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在特定實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β及/或IL-6之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加IL-23、TNF-α、IL-1β及/或IL-6之表現及/或活性來治療或預防疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β及/或IL-6之表現及/或活性來促進免疫反應。
本發明之組成物之投藥可使得IL-1β之表現增加。IL-1β為促炎性細胞激素[85]。IL-1β之產生及分泌由炎性體調控，該炎性體為與發炎反應之活化相關聯之蛋白質複合物[86]。因為本發明之組成物之投藥可增加IL-1β之表現，所以本發明之組成物可適用於治療由IL-1β之表現降低特徵化之疾病。在特定實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由IL-1β之表現及/或活性降低特徵 化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加IL-1β之表現及/或活性來治療或預防疾病。
本發明之組成物之投藥可使得IL-23之表現增加。IL-23已與發炎相關聯[87、88]。IL-23在免疫反應中所提出之功能包括促進CD4+記憶T細胞之增殖及促進由樹突狀細胞(DC)分泌IFN-γ[89]。因為本發明之組成物之投藥可增加IL-23之表現，所以本發明之組成物可適用於治療由IL-23之表現降低特徵化之疾病。在特定實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由IL-23之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加IL-23之表現及/或活性來治療或預防疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加IL-23之表現及/或活性來促進免疫反應。
本發明之組成物之投藥可使得腫瘤壞死因子α(TNF-α)之表現增加。TNF-α為已知涉及於各種信號傳導路徑中以促進細胞死亡之促炎性細胞激素。TNF-α藉由結合至其同族受體TNFR-1來起始凋亡，此舉引起凋亡路徑中之裂解事件級聯[90]。TNF-α亦可經由RIP激酶依賴性機制來觸發壞死[91]。因為本發明之組成物之投藥可增加TNF-α表現，所以本發明之組成物可適用於治療疾病，尤其用於治療或預防由TNF-α之表現降低特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療由降低之TNF-α表現特徵化之疾病。在特定實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由TNF-α之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物可適用於藉由增加TNF-α之表現及/或活性來治療或預防疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加TNF-α之表現及/或活性來促進免疫反應。
本發明之組成物之投藥可使得IL-6之表現增加。IL-6為促炎性細胞激素，其在發炎期間產生，且促進初始CD4+ T細胞分化及CD8+ T細胞分化成細胞毒性T細胞[92]。因為本發明之組成物之投藥可增加IL-6之表現，所以本發 明之組成物可適用於治療由IL-6之表現降低特徵化之疾病。在特定實施方案中，本發明之組成物用於治療或預防由IL-6之表現及/或活性降低特徵化之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加IL-6之表現及/或活性來治療或預防疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加IL-6之表現及/或活性來促進免疫反應。
Bettelli等人[93]報導IL-6抑制Treg之產生。本發明之組成物可增加IL-6之表現，因此本發明之組成物可藉由增加IL-6之表現來選擇性地減少Treg之數目或百分比。在一個實施方案中，本發明之組成物藉由增加IL-6之表現用於免疫刺激。在另一個實施方案中，本發明之組成物藉由減少Treg之數目或百分比用於免疫刺激。
實施例亦證實本發明之組成物促進T輔助細胞及細胞毒性T淋巴細胞之分化。因此，在某些實施方案中，本發明之組成物用於刺激T輔助細胞及/或細胞毒性T淋巴細胞之分化。
細胞療法 嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)療法
本發明之組成物之投藥可使得IL-6之表現增加。增加之Il-6表現已與對慢性淋巴細胞白血病之CD19 CAR-T療法之反應相關。血清IL-6之增加與CAR-T細胞擴張相關聯，而IL-6之抑制與CAR-T細胞增殖之抑制相關聯[94]。因為本發明之組成物之投藥可增加IL-6表現，所以本發明之組成物可適用於細胞療法，尤其CAR-T細胞療法。在一個實施方案中，本發明之組成物用於細胞療法中。在一個實施方案中，本發明之組成物用於CAR-T細胞療法中。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療慢性淋巴細胞白血病。
已顯示Treg之選擇性耗盡增強細胞毒性淋巴細胞之功效[95]。CAR-T細胞為細胞毒性淋巴細胞之子組，且因此據信Treg之選擇性耗盡在 CAR-T細胞療法中有效。因為本發明之組成物之投藥可使Treg耗盡，所以本發明之組成物可適用於細胞療法，尤其CAR-T細胞療法。
因此，本發明之組成物可適用於細胞療法，尤其增強對細胞療法之反應。
間質幹細胞(MSC)療法
已報導間質幹細胞(MSC)療法具有免疫刺激特性。當MSC經LPS處理時，MSC上調促炎性細胞激素IL-6及IL-8，此引起增加之B細胞增殖[96]。因此，因為本發明之組成物可增加IL-6之表現，所以其可適用於與MSC細胞療法組合。
幹細胞移植療法
已報導在幹細胞移植療法中替代使用未分化幹細胞，在移植之前使幹細胞在一定程度上分化可為有益的。舉例而言，Heng等人[97]報導幹細胞之心肌源性分化藉由具有較高植入效率、增強之肌細胞再生及增加之心功能恢復可為有益的。因為本發明之組成物之投藥可起始未分化神經母細胞瘤細胞中之神經元分化，所以本發明之組成物可適用於幹細胞移植療法中之幹細胞分化。
造血幹細胞移植
造血幹細胞移植為通常來源於骨髓、外周血或臍帶血之多能造血幹細胞之移植。已顯示在同種異體造血幹細胞移植之前腸道經腸球菌(鶉雞腸球菌及酪黃腸球菌)定殖由於非復發死亡率降低而使患者之2年存活率顯著提高[98]。因此，實施例中所示之免疫調節作用可適用於造血幹細胞移植療法。在某些實施方案中，本發明之組成物可適用於提高造血幹細胞移植之後及尤其同種異體造血幹細胞移植之後的存活率。
本發明之組成物可適用於與同種異體造血幹細胞移植組合。本發明之組成物可實現加強對同種異體造血幹細胞移植之成功患者反應。在某些實施 方案中，在造血幹細胞移植之前投予本發明之組成物。在某些實施方案中，本發明之組成物用於投予計劃接受造血幹細胞移植之患者。在某些實施方案中，在造血幹細胞移植之後投予本發明之組成物。在某些實施方案中，本發明之組成物用於投予已接受造血幹細胞移植之患者。
免疫衰老
Fulop等人[99]鑑別Treg細胞數目之增加及B細胞數目之減少與適應性免疫系統之老化相關聯。因此，本發明之組成物可用於預防或延遲免疫衰老。在一個實施方案中，本發明之組成物用於預防免疫衰老。在另一個實施方案中，本發明之組成物用於延遲由Treg細胞數目之增加特徵化之免疫衰老。在另一個實施方案中，本發明之組成物用於延遲由B細胞數目之減少特徵化之免疫衰老。在另一個實施方案中，本發明之組成物用於延遲由Treg細胞數目之增加及B細胞數目之減少特徵化之免疫衰老。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由減少Treg細胞數目來延遲免疫衰老。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由增加B細胞數目來延遲免疫衰老。在另一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由減少Treg細胞數目及增加B細胞數目來延遲免疫衰老。在一個實施方案中，本發明之組成物用於治療由免疫衰老引起之疾病。在一個實施方案中，本發明之組成物用於藉由延遲及/或預防免疫衰老來治療老化相關疾病。
此外，已提議疫苗佐劑可攻克免疫衰老[100]。因為本發明之組成物適合用作疫苗佐劑，所以本發明之組成物可適用於預防或延遲免疫衰老。在另一個實施方案中，本發明之組成物作為疫苗佐劑用於延遲及/或預防免疫衰老。在另一個實施方案中，本發明之組成物用作疫苗佐劑，其中組成物延遲及/或預防免疫衰老。
與免疫衰老相關聯之疾病包括心血管疾病、諸如阿茲海默氏病及帕金森氏病(Parkinson's disease)之神經退化性疾病、癌症、2型糖尿病[101]及自體 免疫病症[102]。
投藥模式
較佳地，本發明之組成物藉由注射，較佳皮下或替代地靜脈內或腹膜內投予。關於適合於藉由注射投予之組成物之更多細節在下一章節中提供。在替代性實施方案中，本發明之組成物有待投予胃腸道。已知免疫系統係由胃腸道中細菌及細菌蛋白之存在來調節。本發明之組成物經口投予，但其可經直腸、鼻內或經由經頰或舌下途徑投予。
在某些實施方案中，本發明之組成物可作為泡沫劑、作為噴霧劑或凝膠投予。
在某些實施方案中，本發明之組成物可作為栓劑，諸如直腸栓劑投予，例如以可可油(可可脂)、合成硬脂肪(例如蘇博瑞(suppocire)、威特索(witepsol))、甘油明膠、聚乙二醇或皂甘油組成物之形式。
在某些實施方案中，將本發明之組成物經由管，諸如鼻胃管、口胃管、胃管、空腸造口管(J管)、經皮內鏡胃造瘺(PEG)或口，諸如可進入胃、空腸之胸壁口及其他適合之進入口投予胃腸道。
本發明之組成物可一次性投予，或其可作為治療方案之一部分依序投予。在某些實施方案中，本發明之組成物有待每日投予。
在本發明之某些實施方案中，根據本發明之治療伴隨患者之腸道微生物區之評估。
可將本發明之組成物投予已診斷出患有癌症或已鑑別為處於癌症風險下之患者。亦可作為預防措施投予組成物以預防健康患者中之癌症發展。
可將本發明之組成物投予已鑑別為具有異常腸道微生物區之患者。舉例而言，患者可具有減少之或不存在腸球菌種、尤其鶉雞腸球菌之定殖。
一般而言，本發明之組成物用於治療人類，不過其可用於治療動物， 包括單胃哺乳動物，諸如家禽、豬、貓、犬、馬或兔。本發明之組成物可適用於增強動物之生長及效能。若投予動物，則可使用經口管飼。
組成物
一般而言，本發明之組成物包含來自腸球菌屬且尤其來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽。
在較佳實施方案中，本發明之組成物經囊封以能夠將鞭毛蛋白遞送至腸。囊封保護組成物免於降解直至遞送於目標位置處，該降解係經由例如用化學或物理刺激(諸如壓力)、酶促活性或可由pH值變化觸發之物理崩解而破壞。可使用任何適當囊封方法。例示性囊封技術包括截留於多孔基質內、附著或吸附於固體載體表面上、藉由絮凝或用交聯劑自聚集及機械容納於微孔膜或微膠囊中。
組成物由此可為醫藥學上可接受的。其通常將包括除鞭毛蛋白多肽(或核酸)以外之組分，例如其典型地包括一或多種醫藥載劑及/或賦形劑。
可將組成物以水性形式投予人類。在此類實施方案中，在投藥之前，然而，組成物可能已呈非水性形式。舉例而言，儘管一些治療劑以水性形式製造，接著亦以水性形式填充及分配並投予，但其他治療劑在製造期間凍乾且在使用時復原成水性形式。因此，本發明之組成物可經乾燥，諸如凍乾調配物。
組成物可包括防腐劑，諸如硫柳汞(thiomersal)或2-苯氧基乙醇。然而，治療劑較佳應實質上不含(即，小於5μg/ml)汞劑材料，例如無硫柳汞。不含汞之治療劑更為典型。無防腐劑之治療劑尤其有利。
為改良熱穩定性，組成物可包括溫度保護劑。該等試劑之更多細節提供於下文。
為控制張力，典型地包括生理鹽，諸如鈉鹽。一般使用氯化鈉(NaCl)，其可在1與20mg/ml之間存在，例如約10±2mg/ml NaCl。可存在之其他鹽包 括氯化鉀、磷酸二氫鉀、脫水磷酸氫二鈉、氯化鎂、氯化鈣等。
組成物一般將具有介於200mOsm/kg與400mOsm/kg之間、更常介於240至360mOsm/kg之間的滲透壓度，且將更典型地處於290至310mOsm/kg之範圍內。
組成物可包括一或多種緩衝劑。典型緩衝劑包括：磷酸鹽緩衝劑；Tris緩衝劑；硼酸鹽緩衝劑；丁二酸鹽緩衝劑；組胺酸緩衝劑(尤其具有氫氧化鋁佐劑)；或檸檬酸鹽緩衝劑。緩衝劑將典型地包括於5至20mM之範圍內。
組成物之pH值一般將介於5.0與8.1之間，且更典型地介於6.0與8.0，例如6.5與7.5之間，或介於7.0與7.8之間。
組成物典型地為無菌的。組成物亦典型地為無熱原質的，例如每劑量含有<1EU(內毒素單位，標準量度)，例如每劑量<0.1EU。組成物通常無麩質。
組成物可包括用於單次投藥之材料，或可包括用於多次投藥之材料(即，『多劑量』套組)。包括防腐劑在多劑量配置中為典型的。替代多劑量組成物中包括防腐劑(或除此以外)，組成物可容納於具有用於移出材料之無菌轉接器之容器中。
典型地以約0.5ml之劑量體積投予人蛋白治療劑，不過可將半劑量(即，約0.25ml)投予兒童。
本發明之組成物亦可包含一或多種免疫調控劑。通常，免疫調控劑中之一或多者包括一或多種佐劑。佐劑可包括下文進一步論述之TH1佐劑及/或TH2佐劑。
組成物可製備成可注射劑，作為液體溶液或懸浮液。亦可製備適合於在注射前溶解或懸浮於液體媒劑中之固體形式(例如凍乾組成物或噴霧冷凍乾燥之組成物)。可製備組成物用於局部投予，例如作為軟膏、乳膏或粉末。可製 備組成物用於經口投予，例如作為錠劑或膠囊、作為噴霧劑或作為糖漿(視情況經調味)。可製備組成物用於肺部投予，例如作為吸入劑、使用細粉或噴霧劑。組成物可製備成栓劑或子宮托。可製備組成物用於經鼻、經耳或經眼投予，例如作為滴劑。組成物可呈套組形式，其經設計以使得組合之組成物在正要投予哺乳動物之前復原。此等套組可包含一或多種呈液體形式之抗原及一或多種凍乾抗原。在某些實施方案中，存在於組成物中之本發明之鞭毛蛋白可融合或接合至一或多種抗原。
在組成物將要在使用前即時製備(例如在組分以凍乾形式呈現之情況下)且作為套組呈現之情況下，該套組可包含兩個小瓶，或其可包含一個待填充注射器及一個小瓶，其中注射器之內含物用於在注射之前再活化小瓶之內含物。
用作治療劑之組成物包含免疫學上有效量之多肽或編碼核酸，以及任何其他組分(視需要)。『免疫學上有效量』意指將彼量以單次劑量或作為系列之一部分投予個體有效用於治療或預防。此量視以下而變：有待治療之個體之健康及身體狀況、年齡、有待治療之個體之分類群(例如非人類靈長類動物、靈長類動物等)、個體之免疫系統合成抗體之能力、所需保護程度、疫苗之配方、治療醫師對醫療情況之評估及其他相關因素。預期該量將處於可經由常規試驗確定之相對較寬範圍內。在組成物中包括多於一種抗原之情況下，則兩種抗原可以彼此相同之劑量或以不同劑量存在。
如上文所提及，組成物可包括溫度保護劑，且此組分可尤其適用於加佐劑之組成物(尤其含有諸如鋁鹽之礦物佐劑之彼等)。如參考文獻103中所述，可將液體溫度保護劑添加至水性疫苗組成物中以降低其凝固點，例如以使凝固點降至低於0℃。因此，組成物可在低於0℃但高於其凝固點下儲存，以抑制熱分解。溫度保護劑亦允許組成物凝固，同時保護礦物鹽佐劑免於在冷凍及 解凍之後聚結或沈積，且亦可在例如高於40℃之高溫下保護組成物。初始水性疫苗與液體溫度保護劑可混合以使得液體溫度保護劑構成最終混合物之1-80體積%。適合之溫度保護劑對於人類投藥應為安全的，易混溶/可溶於水中，且不應破壞組成物中之其他組分(例如抗原及佐劑)。實例包括甘油、丙二醇及/或聚乙二醇(PEG)。適合之PEG可具有在200至20,000Da範圍內之平均分子量。在一個實施方案中，聚乙二醇可具有約300Da之平均分子量(『PEG-300』)。
本發明提供一種組成物，其包含：(i)一或多種鞭毛蛋白多肽；及(ii)溫度保護劑。此組成物可藉由混合以下形成：(i)包含一或多種抗原之水性組成物與(ii)溫度保護劑。混合物接著可在例如低於0℃、0℃至20℃、20℃至35℃、35℃至55℃或更高溫度下儲存。混合物可以液體或冷凍形式儲存。混合物可為凍乾的。或者，組成物可藉由混合以下形成：(i)包含一或多種抗原之經乾燥組成物與(ii)包含溫度保護劑之液體組成物。因此，組分(ii)可用於使組分(i)復原。
組成物可經口投予且可呈錠劑、膠囊或粉末形式。其他成分(諸如維生素C)可作為去氧劑及益生元基質包括在內以改善遞送及/或部分或全部定殖及活體內存活。
本發明之組成物包括治療有效量之本發明之鞭毛蛋白多肽。鞭毛蛋白多肽之治療有效量足以對患者發揮有益作用。
本發明之組成物可包含醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。此等適合之賦形劑之實例可見於參考文獻[104]中。用於治療用途之可接受之載劑或稀釋劑在醫藥技術中為熟知的且描述於例如參考文獻[105]中。適合載劑之實例包括乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇、山梨糖醇及其類似物。適合稀釋劑之實例包括乙醇、甘油及水。醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑之選擇可鑒於預期投藥途徑及標準醫藥慣例來選擇。醫藥組成物可包含以下作為載劑、賦形劑或稀釋劑或除此以外亦包含以下：任何適合之黏合劑、潤滑劑、懸 浮劑、包覆劑、增溶劑。適合黏合劑之實例包括澱粉；明膠；天然糖，諸如葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、β-乳糖、玉米甜味劑；天然及合成膠，諸如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉；羧甲基纖維素；及聚乙二醇。適合潤滑劑之實例包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉及其類似物。防腐劑、穩定劑、染料及甚至調味劑可在醫藥組成物中提供。防腐劑之實例包括苯甲酸鈉、山梨酸及對羥基苯甲酸酯。亦可使用抗氧化劑及懸浮劑。
在一些實施方案中，組成物包含多於一種來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽，其用於治療或預防癌症。在某些實施方案中，組成物包含具有SEQ ID NO：1之鞭毛蛋白多肽及至少一種來自腸球菌屬之其他鞭毛蛋白多肽。在某些實施方案中，組成物包含具有SEQ ID NO：1之鞭毛蛋白多肽及至少一種來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽。在某些實施方案中，組成物包含具有SEQ ID NO：1之鞭毛蛋白多肽及至少一種選自由SEQ ID NO 2-42組成之群組的鞭毛蛋白多肽。在一些實施方案中，組成物可包含至少3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、20種、25種、30種、35種、40種或45種來自腸球菌屬且尤其來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽。在一些實施方案中，本發明之組成物包含少於50種來自相同菌種(例如少於45種、40種、35種、30種、25種、20種、15種、12種、10種、9種、8種、7種、6種、5種、4種或3種菌株)之鞭毛蛋白多肽，且視情況不含來自任何其他菌種之鞭毛蛋白多肽。在一些實施方案中，本發明之組成物包含1至40種、1至30種、1至20種、1至19種、1至18種、1至15種、1至10種、1至9種、1至8種、1至7種、1至6種、1至5種、1至4種、1至3種、1至2種、2至50種、2至40種、2至30種、2至20種、2至15種、2至10種、2至5種、6至30種、6至15種、16至25種或31至50種來自相同菌種之鞭毛蛋白多肽，且視情況不含來自任何其他菌種之鞭毛蛋白多肽。
在本發明之組成物包含多於一種鞭毛蛋白多肽之一些實施方案中，個別鞭毛蛋白多肽可用於獨立、同時或依序投藥。舉例而言，組成物可包含所有鞭毛蛋白多肽，或鞭毛蛋白多肽可獨立地儲存且獨立地同時或依序投予。在一些實施方案中，多於一種鞭毛蛋白多肽獨立地儲存，但在使用前混合在一起。
根據本發明使用之組成物可能需要或可能不需要行銷核可。
本發明之組成物可包含醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：如本發明中所用之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：如本發明中所用之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症為乳癌。在較佳實施方案中，癌症為乳腺癌。在較佳實施方案中，癌症為IV期乳癌。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：如本發明中所用之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症為肺癌。在較佳實施方案中，癌症為肺癌。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：如本發明中所用之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症為肝癌。在較佳實施方案中，癌症為肝腫瘤(肝細胞癌)。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：本發明之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症為結腸癌。在 較佳實施方案中，癌症為結腸直腸腺癌。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：本發明之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症為癌瘤。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：本發明之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症為非免疫原性癌症。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：本發明之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症為免疫原性癌症。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：本發明之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症選自由非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞癌、腺癌、腺腫瘤、類癌腫瘤、未分化癌瘤組成之群組。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：本發明之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症選自由肝母細胞癌、膽管癌、膽管細胞囊腺癌或因病毒感染引起之肝癌組成之群組。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：本發明之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症選自由侵入性 管癌、原位管癌或侵入性小葉癌組成之群組。
在某些實施方案中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含：本發明之鞭毛蛋白多肽；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中當投予有需要之個體時該鞭毛蛋白多肽之量足以治療病症；且其中該病症選自由以下組成之群組：急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性髓樣白血病、腎上腺皮質癌、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨腫瘤、骨肉瘤/惡性纖維組織細胞瘤、腦幹神經膠質瘤、腦腫瘤、小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、神經管母細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、乳癌、支氣管腺瘤/類癌、伯奇氏淋巴瘤、類癌腫瘤、子宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生病症、結腸癌、皮膚T細胞淋巴瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、眼內黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、生殖細胞腫瘤、兒童視覺路徑及下視丘神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤、腎細胞癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、間皮瘤、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、副甲狀腺癌、咽癌、垂體腺瘤、漿細胞贅瘤、前列腺癌、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、肉瘤、睪丸癌、甲狀腺癌或子宮癌。
核酸(例如基於核酸之治療劑)之劑量可具有
Figure 108109387-A0202-12-0065-158
100μg核酸，例如10至100μg，諸如約10μg、25μg、50μg、75μg或100μg，但可觀察到低得多之水準之表現，例如使用
Figure 108109387-A0202-12-0065-159
1微克/劑、
Figure 108109387-A0202-12-0065-160
100奈克/劑、
Figure 108109387-A0202-12-0065-161
10奈克/劑、
Figure 108109387-A0202-12-0065-162
1奈克/劑等。類似地，蛋白質抗原之劑量可具有
Figure 108109387-A0202-12-0065-163
100μg蛋白質，例如10至100μg，諸如約10μg、25μg、50μg、75μg或100μg。多肽可以約0.1至10毫克/公斤體重之劑量投予。
在某些實施方案中，本發明之醫藥組成物可以單次劑量或更佳以重複劑量投予。較佳地，重複劑量大約每2天、5天、10天、7天、10天或15天 投予。在某些實施方案中，本發明提供上述醫藥組成物，其中該組成物以每公斤個體體重100微克、200微克、300微克、400微克、500微克、1毫克、2毫克、5毫克、10毫克、20毫克、30毫克、50毫克、100毫克、200毫克或500毫克之劑量投予。適合之單位劑量包括1mg、2mg、5mg、10mg、20mg、30mg、50mg、100mg、200mg、500mg、1000mg、100至500mg、500至1000mg、200至400mg、500至750mg、750至1000mg。
在某些實施方案中，本發明提供包含本發明之宿主細胞之上述醫藥組成物。用於例如成年人之宿主細胞之適合日劑量可為約1×103個至約1×1011個菌落形成單位(CFU)；例如約1×107至約1×1010CFU；在另一個實例中約1×106至約1×1010CFU。
在某些實施方案中，組成物含有宿主細胞，其量以組成物重量計為約1×106至約1×1011CFU/g；例如約1×108至約1×1010CFU/g。劑量可為例如1g、3g、5g及10g。在一些實施方案中，組成物包含活宿主細胞與已殺滅之宿主細胞之混合物。
在某些實施方案中，本發明提供上述醫藥組成物，其中該組成物係藉由選自由經口、經直腸、皮下、經鼻、經頰、舌下、皮下、靜脈內及肌肉內組成之群組的方法投予。
在某些實施方案中，本發明提供上述醫藥組成物，其包含選自由乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇及山梨糖醇組成之群組的載劑。
在某些實施方案中，本發明提供上述醫藥組成物，其包含選自由乙醇、甘油及水組成之群組的稀釋劑。
在某些實施方案中，本發明提供上述醫藥組成物，其包含選自由以下組成之群組的賦形劑：澱粉、明膠、葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、β- 乳糖、玉米甜味劑、阿拉伯膠、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉及氯化鈉。
在某些實施方案中，本發明提供上述醫藥組成物，其進一步包含防腐劑、抗氧化劑及穩定劑中之至少一者。
在某些實施方案中，本發明提供上述醫藥組成物，其包含選自由苯甲酸鈉、山梨酸及對羥基苯甲酸酯組成之群組的防腐劑。
在某些實施方案中，本發明提供上述醫藥組成物，其中當組成物在約4℃或約25℃下儲存於密封容器中且容器置於具有50%相對濕度之氛圍中時，如以菌落形成單位量測之至少80%之細菌菌株在至少約1個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年之時段後仍保留。
在一些實施方案中，本發明之組成物在包含如本文所述之組成物之密封容器中提供。在一些實施方案中，密封容器為袋或瓶。在一些實施方案中，本發明之組成物在包含如本文所述之組成物之注射器中提供。
在一些實施方案中，本發明之組成物可作為醫藥調配物提供。舉例而言，組成物可作為錠劑或膠囊提供。在一些實施方案中，膠囊為明膠膠囊(「gel-cap」)。
在一些實施方案中，本發明之組成物經口投予。經口投藥可涉及吞咽，以使化合物進入胃腸道，及/或經頰、經舌或舌下投藥，由此化合物直接自口進入血流。
適合於經口投藥之醫藥調配物包括固體塞、固體微粒、半固體及液體(包括多相或分散系統)，諸如錠劑；含有多顆粒或奈米顆粒、液體(例如水溶液)、乳液或粉末之軟或硬膠囊；口含錠(包括液體填充之口含錠)；咀嚼錠；凝膠；快速分散劑型；膜劑；卵形劑；噴霧劑；及頰/黏膜黏附貼片。
在一些實施方案中，醫藥調配物為腸溶調配物，即，抗胃調配物(例 如對胃部pH值具抗性)，其適合於藉由經口投藥將本發明之組成物遞送至腸。當組成物之細菌或另一種組分對酸敏感，例如傾向於在胃部條件下降解時，腸溶調配物可尤其適用。
在一些實施方案中，腸溶調配物包含腸衣。在一些實施方案中，調配物為包覆腸衣之劑型。舉例而言，調配物可為包覆腸衣之錠劑或包覆腸衣之膠囊，或其類似物。腸衣可為習用腸衣，例如用於經口遞送之錠劑、膠囊或其類似物之習用包衣。調配物可包含膜衣，例如腸溶聚合物(例如酸不溶性聚合物)之薄膜層。
在一些實施方案中，腸溶調配物本質上為腸溶的，例如在無需腸衣之情況下抗胃。因此，在一些實施方案中，調配物為不包含腸衣之腸溶調配物。在一些實施方案中，調配物為由熱膠凝材料製成之膠囊。在一些實施方案中，熱膠凝材料為纖維素材料，諸如甲基纖維素、羥甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素(HPMC)。在一些實施方案中，膠囊包含不含有任何成膜聚合物之外殼。在一些實施方案中，膠囊包含外殼且外殼包含經丙基甲基纖維素且不包含任何成膜聚合物(例如參見[106])。在一些實施方案中，調配物本質上為腸溶膠囊(例如來自Capsugel之Vcaps®)。
在一些實施方案中，調配物為軟膠囊。軟膠囊為如下膠囊：歸因於膠囊外殼中存在之軟化劑，諸如甘油、山梨糖醇、麥芽糖醇及聚二乙醇的添加，該等膠囊可具有一定彈性及軟度。軟膠囊可例如在明膠或澱粉之基礎上產生。基於明膠之軟膠囊可購自各種供應商。視諸如經口或經直腸之投藥方法而定，軟膠囊可具有各種形狀，其可為例如圓形、橢圓形、長橢圓形或魚雷形。軟膠囊可藉由習用製程，諸如藉由謝勒製程(Scherer process)、阿克膠製程(Accogel process)或液滴或吹煉製程來產生。
通則
除非另有指示，否則本發明之實踐將採用在此項技術之技能範圍內之化學、生物化學、分子生物學、免疫學及藥理學之習用方法。此等技術在文獻中全面解釋。參見例如參考文獻[107]及[108-114]等。
術語「包含」涵蓋「包括」以及「組成」，例如「包含」X之組成物可排他地由X組成或可包括額外事物，例如X+Y。
關於數值x之術語「約」為視情況存在的且意指例如x±10%。
字詞「實質上」不排除「完全」，例如「實質上不含」Y之組成物可完全不含Y。必要時，字詞「實質上」可自本發明之定義省略。
術語「來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽」涵蓋展現免疫刺激特性，例如可有效活化TLR5反應之野生型鞭毛蛋白多肽及突變鞭毛蛋白多肽。術語「鞭毛蛋白多肽」亦涵蓋展現免疫刺激特性，例如可有效活化TLR5反應之野生型鞭毛蛋白多肽及突變鞭毛蛋白多肽之片段。
提及兩個蛋白質序列之間的百分比序列一致性意指當比對時，彼百分比之胺基酸殘基在比較兩個序列中為相同的。此比對及百分比同源性或序列一致性可使用此項技術中已知之軟體程式確定，例如參考文獻[115]中所述之彼等。較佳方法使用蛋白質序列之MUSCLE比對且可用Geneious(78.02%成對一致性)、Blossom62得分矩陣、閾值=1進行。
提及兩個核苷酸序列之間的百分比序列一致性意指當比對時，彼百分比之核苷酸在比較兩個序列中為相同的。此比對及百分比同源性或序列一致性可使用此項技術中已知之軟體程式確定，例如參考文獻[116]之章節7.7.18中所述之彼等。較佳比對係藉由史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜尋演算法使用空位開放罰分12及空位擴展罰分2、BLOSUM矩陣62進行仿射空位搜尋來確定。史密斯-沃特曼同源性搜尋演算法在參考文獻[117]中揭示。
一般而言，除非另有指定(例如關於片段)，否則序列一致性在參考序 列(例如SEQ ID NO：1)之整個長度上且不在查詢序列之整個長度上計算。因此，較短及無關之序列不視為與本發明之序列具有高序列一致性。
除非另有規定，否則包含眾多步驟之製程或方法可在方法開始或結束時包含額外步驟，或可包含額外中間步驟。又，適當時，步驟可組合、省略或以替代性次序進行。
本文描述本發明之各種實施方案。應瞭解，各實施方案中指定之特徵可與其他指定特徵組合，以提供其他實施方案。特別地，本文中突出強調為適合、典型或較佳之實施方案可彼此組合(除非該等實施方案相互排斥)。
實施本發明之方式 實施例1-MRx0518對TLR5報導細胞之活化 概述
本研究測試細菌菌株MRx0518活化TLR5報導細胞之功效。
TLR5活化檢定
HEK-Blue TLR5細胞為用人類TLR5基因及可誘導性SEAP(分泌胚胎鹼性磷酸酶)報導基因共轉染之HEK293細胞。將SEAP基因置於融合至五個NF-κB及AP-1結合位點之IFN-β最小啟動子之控制下。用TLR5配位體之刺激活化NF-κB及AP-1，此誘導SEAP產生。鹼性磷酸酶之水準由此與TLR5活性相關。
˙ 材料 報導細胞系：HEK-Blue hTLR5(Invivogen,hkb-htlr5)
細胞生長培養基：補充有10%(v/v)FBS(Sigma,F9665)、4mM L-麩醯胺(Sigma,G7513)、100U/ml青黴素及100μg/ml鏈黴素(Sigma,P4333)、100μg/ml諾莫欣(normocin)(Invivogen,ant-nr-1)及選擇性抗生素殺稻瘟菌素(30μg/ml,Invivogen,ant-bl-05)及澤欣(zeocin)(100μg/ml,Invivogen,ant-zn-1)之 DMEM(Sigma,D6171)
無抗生素培養基：補充有10%(v/v)FBS及4mM L-麩醯胺之DMEM ˙ 細菌生長條件
細菌生長條件：在37℃下於厭氧條件下使所有鶉雞腸球菌MRx0518培養物在酵母提取物-酪蛋白水解物-脂肪酸(YCFA)培養液(E&O Laboratories,UK)中生長。
靜止期MRx0518細胞：使菌株MRx0518之16至18小時培養物在上文所述之條件下使用MRx0518細胞之1%接種體生長，在-80℃下作為工作細胞庫冷凍儲存。
晚對數期MRx0518細胞：使菌株MRx0518之3小時(大約)培養物在上文所述之條件下使用靜止期MRx0518細胞之10%接種體生長。
˙ 程序
用兩個劑量-10：1(3×105個細菌)或100：1(3×106個細菌)之以下處理物進行TLR5活化檢定：
- 活MRx0518細菌
- 熱殺滅MRx0518細菌
- 來自MRx0518之CFS
用20ng/ml及5ng/ml濃度之超純FLA-ST進行陽性對照。用不含報導細胞之無抗生素培養基進行陰性對照以對由除報導細胞外之任何事物產生鹼性磷酸酶作對照。用YCFA及水進行兩個額外對照。對於所有處理，進行三次重複實驗。
˙ 製備活的及無細胞上清液(CFS)MRx0518
晚對數期MRx0518細胞在室溫下以5000×g離心5分鐘之後，活的及CFS處理物均自該等細胞之一個10ml培養物製備。將細菌團塊在PBS(Sigma, D8537)中洗滌一次且再懸浮於無抗生素培養基中，達到1.4×108CFU/ml(2倍稀釋)及1.4×107CFU/ml(20倍稀釋)之估算密度。收集細菌上清液，在無菌條件下過濾(0.22μm)，且使用H2O(Sigma,W3500)進行10倍及20倍稀釋以提供上文所概述之細菌懸浮液之等效物。CFS含有脫落至上清液中之MRx0518鞭毛。
˙ 製備熱殺滅(HK)細胞
獨立地，藉由在80℃下將晚對數期MRx0518細胞之10ml培養物培育40分鐘來產生HK細胞。離心(上文所述之條件)之後，棄去培養物上清液且將細胞團塊在PBS(Sigma,D8537)中洗滌一次且再懸浮於無抗生素培養基中，達到1.4×108CFU/ml(2倍稀釋)及1.4×107CFU/ml(20倍稀釋)之估算密度。一旦製備，在使用前將所有處理物儲存於冰上。對於所有活的及熱殺滅之MRx0518細胞製劑確定每毫升之活細胞計數。
˙ 製備陽性對照
在H2O中以200ng/ml或50ng/ml製備已知TLR5促效劑，鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白(超純，FLA-ST超純，來自Invitrogen，tlrl-epsitfla)。
˙ TLR5檢定條件
將20μl適當處理物(細菌細胞、無細胞上清液、陽性對照配位體、重組鞭毛蛋白，陰性對照，例如YCFA、無抗生素培養基、H2O、PBS)一式兩份或一式三份塗於96孔細胞培養盤(Sigma,CLS3596)中。將180μl報導細胞懸浮液添加至各孔中，得到200μl之最終體積及3×104之HEK-blue TLR5細胞最終濃度。在37℃、5% CO2下培育檢定物22小時。
在培育之後，將20μl檢定物添加至新96孔盤中之180μl Quantiblue(Invivogen,rep-qb1)基質中且在37℃、5% CO2下培育2小時。使含Quantiblue盤在獲取655nm光密度讀數之微量盤讀取器(Bio-Rad,iMark)上成像。自技術性重複實驗求取結果之平均值，接著在此後求取獨立實驗之平均值以為最終圖形 提供資料。
結論
用活的及熱滅活之MRx0518處理引起中間水準及高水準之TLR5反應。此等資料顯示MRx0518菌株能夠誘導TLR5反應且此反應不由熱滅活消除。此等資料表明來自腸球菌屬之鞭毛蛋白及尤其MRx0518鞭毛蛋白可引出TLR5反應且鞭毛蛋白為熱穩定的。
在用MRx0518-CFS處理之後觀測到最高水準之TLR5活性且甚至比已知TLR5促效劑FLA-ST更高(圖6)。CFS含有脫落至上清液中之MRx0518鞭毛。此等資料顯示來自腸球菌屬且尤其來自MRx0518之鞭毛蛋白產生極強TLR5反應，且因此可適用於療法中，尤其治療癌症。此等資料亦顯示MRx0518有效地使其鞭毛蛋白脫落至上清液中。
實施例2-CFS對TLR5之活化對於MRx0518尤其強烈 概述
本研究測試使用CFS之TLR5活化在菌株之間是否有變化。MRx0518與DSM100110均為有鞭毛之鶉雞腸球菌菌株。進行研究以觀測來自此兩種菌株之CFS是否引起TLR5反應。
TLR5活化檢定
進行如實施例1中所述之TLR5檢定。
˙ 程序
用兩個劑量-10：1及100：1之以下處理物進行TLR5活化檢定：
- MRx0518-CFS
- DSM100110-CFS
用無抗生素培養基、YCFA及水進行三個陰性對照。用20ng/ml濃度之超純FLA-ST進行陽性對照。對於所有處理，進行三個重複實驗。
結論
MRx0518-CFS能夠刺激高TLR5反應。DSM100110-CFS亦以100：1之MOI產生TLR5反應，不過該反應相對於MRx0518-CFS降低。此等資料顯示儘管來自兩種菌株之上清液引出免疫刺激反應，但此反應在菌株之間有變化。此等資料為令人驚訝的，此係由於菌株MRx0518與DSM100110均為有鞭毛之鶉雞腸球菌菌株。MRx0518-CFS與DSM100110-CFS相比產生更高TLR5反應，此可能係因為MRx0518與其他鶉雞腸球菌菌株相比使其鞭毛蛋白脫落至上清液中之能力改善，使其尤其適用於療法中。
此等資料表明來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽可有效用於治療或預防癌症，尤其與TLR5相關聯之癌症，諸如乳癌、結腸直腸癌及胃癌。
實施例3-胰蛋白酶處理之後的TLR5活化 概述
本研究測試MRx0518-CFS對TLR5之活化是否為胰蛋白酶依賴性的。
TLR5活化檢定
進行如實施例1中所述之TLR5檢定。
˙ 程序
用單獨或與胰蛋白酶組合之兩個劑量-10：1及100：1之以下處理物進行TLR5活化檢定：
- MRx0518-CFS
- DSM100110-CFS
- YCFA
對於所有處理，進行三個重複實驗。
在37℃、5% CO2下，用500μg/ml胰蛋白酶(0.22μm過濾，Sigma， T3924)或等效體積之胰蛋白酶媒劑(漢克氏平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution)，Fisher Scientific，1175129)作為假消化對照來消化CFS，持續1小時。在培育之後，將消化及假消化之CFS樣品用FBS補充至10%(v/v)之最終濃度以抑制胰蛋白酶活性。
用無抗生素培養基、HBSS及水進行三個陰性對照。用20ng/ml濃度之超純FLA-ST進行陽性對照。
結論
MRx0518-CFS對TLR5之活化藉由用胰蛋白酶處理而消除(圖8)。此等資料顯示TLR5反應係由MRx0518-CFS中之蛋白質活化。此等蛋白質由胰蛋白酶降解消除TLR5反應。MRx0518鞭毛蛋白(FlaAMRx0518)含有36個胰蛋白酶裂解位點，其中一些位於TLR5相互作用結構域中。
實施例4-用經純化之鞭毛蛋白活化TLR5 概述
本研究測試經純化之MRx0518及DSM100110鞭毛蛋白之刺激型態。
產生重組鞭毛蛋白
選殖策略之概要示於圖9a中。使用限制酶消化將MRx0518及DSM100110鞭毛蛋白之全長基因選殖至重組表現構築體pQE-30(其具有N端6xHis標籤)中以產生pQE-30-FlaAMRx0518及pQE-30-FlaADSM100110構築體。使用此項技術中熟知之菌落PCR、限制酶消化及DNA定序技術來鑑別陽性菌落。
在大腸桿菌細胞中表現重組鞭毛蛋白FlaAMRx0518及FlaADSM100110且使用固定金屬親和層析及咪唑洗提來純化，繼而移除內毒素(見下表)。此得到具有最低內毒素水準之高純度製劑。使用SDS-PAGE凝膠確認蛋白質之尺寸及純度(圖9b)。
Figure 108109387-A0202-12-0076-1
對經純化之重組FlaA MRx0518 及FlaA DSM100110 蛋白質之劑量反應
進行如實施例1中所述之TLR5檢定。
˙ 程序
用以下處理物進行TLR5活化檢定：
˙5、1、0.2、0.04及0.008ng/ml濃度之重組經純化之FlaAMRx0518
˙5、1、0.2、0.04及0.008ng/ml濃度之重組經純化之FlaADSM100110
用5ng/ml濃度之FLA媒劑進行陰性對照，且用20ng/ml濃度之超純FLA-ST進行陽性對照。對於各處理，進行三個重複實驗。
結論
重組FlaAMRx0518與FlaADSM100110均可活化TLR5反應。圖10比較用不同劑量之重組FlaAMRx0518及FlaADSM100110與實施例3及4中所述之處理物對TLR5之活化。在5ng/ml之濃度下，兩種重組鞭毛蛋白均可產生比由以更高濃度(20ng/ml)使用之熟知TLR5促效劑FLA-ST產生之反應更高的TLR5反應。此等資料顯示來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽比鼠傷寒沙氏桿菌更有效地活化TLR5反應。已知來自鼠傷寒沙氏桿菌之鞭毛蛋白多肽經由TLR5活化抑制腫瘤生長。此等資料因此表明來自鶉雞腸球菌之鞭毛蛋白多肽比來自鼠傷寒沙氏桿菌之鞭毛蛋白多肽更有效地治療或預防癌症。
FlaAMRx0518及FlaADSM100110具有不同免疫刺激型態。在1ng/ml及0.2 ng/ml之濃度下，FlaAMRx0518產生約為FlaADSM100110五倍之更強效TLR5反應。MRx0518與DSM100110均為高度相關之菌株。兩者均為有鞭毛之鶉雞腸球菌菌株，然而，其表現具有不同免疫刺激型態之根本上不同之鞭毛蛋白。FlaAMRx0518為強TLR5活化劑之令人驚訝之發現顯示此鞭毛蛋白多肽尤其有效治療或預防癌症。
此等實施例證實來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽為TLR5促效劑。TLR5促效劑已牽涉於治療T及B細胞淋巴瘤中。因此，來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽可尤其有效治療或預防T及B細胞淋巴瘤。
已顯示TLR5活化改善放射線誘發之組織損傷。實施例顯示來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽為TLR5反應之強活化劑。因此，來自腸球菌屬且尤其來自鶉雞腸球菌菌種之鞭毛蛋白多肽可尤其有效改善放射線誘發之組織損傷。
實施例5-產生MRx0518 flaA - 突變體 概述
形成破壞鞭毛蛋白基因之MRx0518插入突變體。
實驗條件
將flaA之內部片段選殖至載體pORI19(repA -)中。將所得載體flaA MRx0518int-pORI19轉型至MRx0518中且使用同源重組將插入物整合至細菌基因體中(參見圖13)。
針對em基因之存在且使用PCR來篩選陽性菌落且使用定序進一步確認。使用運動性檢定對突變體之表型分析亦確認插入突變體MRx0518 flaA -。插入物含有來自pORI19載體之紅黴素抗性。圖11顯示MRx0518 flaA -突變體與野生型相比在補充有20μg/ml紅黴素之BBL運動性瓊脂上為非運動性的。
實施例6-TLR5之活化在MRx0518突變體中消除 概述
測試來自MRx0518 flaA -突變體之CFS活化TLR5反應之能力。
TLR5活化檢定
進行如實施例1中所述之TLR5檢定。
˙ 程序
用兩個劑量- 10：1及100：1之以下處理物進行TLR5活化檢定：
- MRx0518-CFS
- MRx0518 flaA --CFS
用5ng/ml及20ng/ml濃度之超純FLA-ST進行陽性對照。用兩個劑量- 10：1及100：1之YFCA進行陰性對照。對於所有處理，進行三個重複實驗。
結論
MRx0518-CFS刺激TLR5反應之能力在MRx0518 flaA -突變體中消除(圖12)。此等資料顯示鞭毛蛋白多肽為MRx0518-CFS對TLR5反應之活化所必需。
實施例7-MRx0518之特徵化 概述
細菌形態，諸如尺寸、傘毛/鞭毛/菌毛之存在或不存在或細胞外基質之存在影響運動性與黏附性且因此在細菌之特徵化中為重要的。
在電子顯微鏡水準(掃描及透射)下檢查MRx0518培養物以允許在比藉由習用光學顯微術方法所允許之解析度及放大率更高之解析度及放大率下顯現細菌結構。
方法 ˙ 透射電子顯微術
在經密封之埃普多夫管(Eppendorf)中自厭氧罩直接接收處於指數期之MRx0518細菌培養物之等分試樣。將培養物固定於新製冰冷的含2.5%戊二醛 之0.1M二甲胂酸鈉(pH 7.2)中。將埃普多夫管緩緩倒置多次，隨後置於冰上且使其固定3至5分鐘。固定之後，使細菌短暫離心成團且再懸浮於密理純水(milli pure water)中。使用玻璃移液管將一滴經固定之培養物施加至弗姆瓦(Formvar)塗佈之300目Cu網格。使細菌沈降並吸附約1至2分鐘且使用惠特曼(Whatman)第3號濾紙自網格移除過量溶液。將10μl 2%乙酸氧鈾施加至網格持續數秒且如上文使用濾紙藉由毛細管作用移除。使網格完全乾燥，隨後在kV變化之Philips CM100 TEM中檢查。
˙ 掃描電子顯微術
獲取來自與上文相同之培養物之等分試樣用於SEM分析。如上文固定細菌，但不成團。在即將經由使用Luer-Lok注射器將經固定之細菌推送至SPI細孔過濾器(25mm直徑，0.2μm細孔尺寸)上之前，用0.01%聚離胺酸對過濾器進行預處理。此後經由過濾器緩緩推送1ml密理純水。將過濾器切割成一定尺寸且經由一系列乙醇溶液(50%、70%、90%及3×100%)脫水。接著經由漸增濃度之六甲基二矽氮烷(HMDS 25%、50%、75%，於乙醇中)依序浸漬過濾器，且使用100% HMDS進行最終脫水步驟。使其蒸發隔夜。對過濾器進行臨界點乾燥且用10nm金鈀塗佈，隨後在Zeiss EVO MA10掃描電子顯微鏡中檢查。
結論
在電子顯微鏡水準下之兩種顯現方法均顯示MRx0518具有鞭毛(圖14)。TEM與SEM分析均顯示MRx0518具有鞭毛(實線白色箭頭)。細胞尺寸範圍介於1至2μm之間。外膜囊泡之存在僅在MRx0518之SEM影像中明顯可見。SEM影像顯示似乎為外膜囊泡之事物(白色虛線箭頭)。
實施例8-來自鶉雞腸球菌菌株MRx0518及DSM100110之重組鞭毛蛋白對鼠類TLR5之活化 概述
MRx0518為自人類樣品分離之細菌菌株，而DSM 100110來源於鼠類。測試來自鶉雞腸球菌菌株MRx0518及DSM 100110之重組鞭毛蛋白活化鼠類TLR5之能力。
方法
如實施例4中所述產生重組經純化之MRx0518(FliCMRx0518)及DSM 100110(FliCDSM100110)。
進行如實施例1中所述之TLR5檢定。用以下處理物進行TLR5活化檢定：
- 5、1、0.2、0.04及0.008ng/ml濃度之重組經純化之FliCMRx0518
- 5、1、0.2、0.04及0.008ng/ml濃度之重組經純化之FliCDSM100110
進行三個獨立重複實驗。
結論
FliCMRx0518與FliCDSM100110均活化鼠類TLR5，且在任何劑量之FliCMRx0518與FliCDSM100110之間活化水準不存在差異(圖15)。此作用不同於FliCMRx0518及FliCDSM100110對人類TLR5之活化所觀測之結果。如實施例4圖10中所示，在1ng/ml及更低濃度下FliCMRx0518可比FliCDSM100110更高水準地刺激人類TLR5。不受任何特定理論約束，來自不同鶉雞腸球菌菌株之重組鞭毛蛋白對人類及鼠類TLR5之不同活化型態可歸因於FliCMRx0518與FliCDSM100110之間的序列差異以及人類與鼠類TLR5之間的結合位點可變性。
如圖3中所示，本發明者已指出在D2-D3區中觀測到不同鞭毛蛋白多肽之間的大多數序列變異。FliCMRx0518與FliCDSM100110之序列比對顯示D2-D3結構域中之大變異(圖16)。該比對係使用CLUTAL OMEGA 1.2.4版多重序列比對軟體進行。
實施例9-來源於人類之運動性鶉雞腸球菌及酪黃腸球菌菌珠之免疫刺激能力 概述
評估來源於人類之運動性鶉雞腸球菌及酪黃腸球菌菌株試管內活化人類TLR5之能力。
方法 ˙ 所測試之細菌菌株
Figure 108109387-A0202-12-0081-2
MRX及測試菌株自來自4D Pharma菌種保存中心之四個供體(供體編號F00、F14、F19及F22)中之一者分離。
˙ TLR5檢定條件
在YCFA培養液(E&O Laboratories,Bonnybridge,Scotland,UK)中培養細菌菌株直至其到達靜止生長期。藉由以5,000×g離心5分鐘來分離細胞及上清液。使上清液穿過0.22μm過濾器且在水中稀釋。
常規地在補充有10% FBS、4mM L-麩醯胺、4.5mg/ml葡萄糖、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、100μg/ml NormocinTM(InvivoGen)、30μg/ml殺稻瘟菌素(InvivoGen)及100μg/ml澤欣(InvivoGen)之DMEM中培養HEK-BlueTM-hTLR5細胞(InvivoGen,San Diego,CA,USA)，達到90%密度。在 37℃及5% CO2下培養細胞系。除非另有規定，否則所有試劑均由Sigma-Aldrich,Gillingham,England,UK供應。
對於共同培養，將生長至90%密度之細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(Sigma-Aldrich)洗滌一次且以140,000個細胞/毫升之密度再懸浮於不含抗生素之生長培養基中。將上清液以100：1之感染複數(MOI)當量添加至細胞中。檢定陽性對照鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白(FLA-ST)(InvivoGen)以20ng/ml使用。在37℃下於5% CO2氛圍中將細胞與上清液一起培育22小時。添加QUANTI-BlueTM(InvivoGen)，將盤再培育2小時且記錄655nm下之光密度。對於所有菌株進行三個獨立生物重複實驗。
圖18中之資料代表三個獨立重複實驗。
結論
所測試之鶉雞腸球菌及酪黃腸球菌菌株之所有上清液菌與未經處理之對照相比均能夠強效地活化TLR5反應。在所測試之三個酪黃腸球菌菌株當中，發現測試6強有力地活化TLR5反應，而測試5及DSM25781引出不太強效之TLR5反應。
實施例10-MRx518對NF-κB之活化
研究細菌菌株MRx0518活化NF-κB之能力。結果呈現於圖18中。MRx0518上清液為NF-κB之最強效活化劑。NF-κB之活化在用胰蛋白酶處理之後消除。
此等資料顯示來自腸球菌屬且尤其來自MRx0518之鞭毛蛋白產生極強NF-κB反應，且因此可適用於療法中。
實施例11-T細胞分化
在試管內對外周血單核細胞(PBMC，Stemcell，目錄號：70025)探索MRx0518誘導T細胞分化之能力。
方法
將PBMC以400,000/孔塗於用抗CD3(Ebioscience，CD3單株抗體(OKT3純系)，功能級，目錄號16-0037-81)塗盤之96孔盤中之每孔50μl cRPMI培養基中(cRPMI含有RPMI 1640(+L-Glut,21875-034)2mM最終濃度儲備液200mM；10% HI FBS(Gibco life technologies,10082-147)；50μm巰基乙醇(Gibco life technologies,21985-023)；及1%青黴素/鏈黴素(P4333,10mg/ml))。接著將MRx518上清液添加至各孔中(4,000,000，於100微升/孔中)。使上清液穿過0.22μm過濾器且在共同培養中適當稀釋。
在37℃培育箱中3天後，移出細胞且再懸浮於含有PMA(Sigma，目錄號P8139)、離子黴素(Ionomycin)(Sigma，目錄號I3909)及GolgiSTOP(BD，目錄號554724)之培養基中持續5小時。PMA儲備液為含1mg/ml之DMSO，將其進一步稀釋成100μg/ml(各樣品需要含50ng/ml之cRPMI)，離子黴素儲備液為含1mM之DMSO(使用含1μM之cRPMI)，且GolgiStop濃度以4μl/6ml使用。
接著使細胞經受流動式細胞量測術染色：在洗滌之後，在室溫下於黑暗中將細胞與來自Miltenyi biotec之Viobility 405/520可固定染料(1微升/樣品)+人類Fc嵌段(目錄號564219，1微升/樣品)一起在PBS中培育10分鐘。接著在室溫下於黑暗中將表面抗體(各2μl)直接添加至孔中持續10分鐘-CD3-APC-Vio 770(Miltenyi，目錄號130-113-136)、CD4-VioBlue(Miltenyi，目錄號130-114-534)及CD25-VioBright FITC(Miltenyi，目錄號130-113-283)。接著將細胞在PBS中洗滌兩次且在室溫下以300g快速離心5分鐘。
接著使用eBioscience FoxP3轉錄因子染色緩衝液固定並滲透細胞(目錄號00-5523)。在eBioscience方案之後，使用1×濃縮液及3×稀釋液製備滲透/ 固定緩衝液。在室溫下將細胞固定1小時，接著在1×滲透洗滌液中洗滌兩次且在室溫下以300g快速離心5分鐘。將以下細胞內染色或轉錄因子抗體添加至含樣品之滲透洗滌液(1×)中在室溫下於黑暗中持續45分鐘或在冰箱中隔夜(至多18小時)，繼而使用滲透洗滌液(300μl)洗滌抗體兩次且再懸浮於PBS(250μl)中以在細胞計數器上擷取：
Figure 108109387-A0202-12-0084-3
˙抗IFNy-PE Vio770人類抗體(Miltenyi，目錄號130-114-025)
˙抗IL10-PE人類抗體(Miltenyi，目錄號130-112-728)
˙抗IL17a-APC人類抗體(Miltenyi，目錄號130-099-202)
˙抗RoRyt-PE人類抗體(Miltenyi，目錄號130-103-837)
˙抗Tbet-APC人類抗體(Miltenyi，目錄號130-098-655)
˙Foxp3單株抗體(236A/E7)，Pe cy7(ebioscience)，目錄號25-4777-41
結論
如圖19中可見，MRx518上清液(SP 518)可誘導T輔助細胞及細胞毒性T細胞之分化。
實施例12-產生鶉雞腸球菌MRx0518鞭毛蛋白基因插入突變體
本實施例提供與實施例5相比用於滅活鞭毛蛋白基因之替代性策略。藉由同源性驅動之自殺質體pORI19插入來破壞fliC基因(參見圖20)。藉由DNA定序來確認pORI19插入fliC基因內且試管內確認所得突變體菌株之非運動性表型。
方法
使用非複製性質體pORI19(Emr repA- Ori+；選殖載體[118])形成鞭毛蛋白插入突變體。使用引子DC020(SEQ ID NO：43： CCCGGGGGATCCGCGGTAAATGTTGCTAAAGCATCATCG)及DC021(SEQ ID NO：44：ACGACGGTCGACCCACAGCATCTTAGGGCGTATGCG)擴增鶉雞腸球菌MRx0518 fliC基因之內部片段且選殖至pORI19中。根據製造商之說明書使用限制酶及Quick連接酶(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)。藉由化學轉型[118]在大腸桿菌EC101中繁殖此構築體且使用Genopure Plasmid Maxi套組(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)自500ml培養物分離。使用0.3M乙酸鈉pH 5.2及乙醇將經分離之質體DNA濃縮至20μl。
藉由使細菌培養物在次抑制濃度之甘胺酸中生長成功地產生電轉感受態細胞，繼而用變溶菌素及溶菌酶處理以進一步弱化細胞壁肽聚醣層。開發用以製備鶉雞腸球菌MRx0518電轉感受態細胞之方案，該方案自先前公開之方法[119]修改。簡言之，使鶉雞腸球菌MRx0518在補充有0.5M蔗糖及3%(w/v)甘胺酸(Sigma-Aldrich)之GM17培養液中生長18小時。接著將細胞用0.5M蔗糖及10%(v/v)甘油洗滌兩次，且在37℃下用10μg/ml溶菌酶及10U/ml變溶菌素(Sigma-Aldrich)處理30分鐘。接著藉由用10μg質體DNA電穿孔使鶉雞腸球菌MRx0518細胞轉型且在BHI培養液中回收，隨後塗於選擇性BHI瓊脂上。使用引子DC047(SEQ ID NO：45：CCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAACGAG)及DC048(SEQ ID NO：46：GATGCAGTTTATGCATCCCTTAAC)針對em基因之存在篩選陽性菌落。藉由PCR擴增及定序(GATC Biotech,Konstanz,Germany)使用引子DC013(SEQ ID NO：47：CCGATAAATAGTAGCAGAGGGAAACC)及DC014(SEQ ID NO：48：GGCTGAATATCCATCAGAGCTTCCTC)確認成功轉型體之質體插入。
使用補充有0.005%(w/v)氯化2,3,5-三苯基四銼(BD,Sparks,MD,USA)之BBLTM運動性測試培養基在試管內評估鞭毛蛋白插入突變體之運動性。簡言之，將新鮮菌落針刺接種於20ml平衡培養基中且在37℃下在厭氧條件下 培育48小時。所有檢定均一式三份進行。
序列
SEQ ID NO：1-來自鶉雞腸球菌MRx0518之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：2-來自鶉雞腸球菌DSM100110之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：3-來自鶉雞腸球菌MRx0554之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：4-來自鶉雞腸球菌MRx0556之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：5-來自鶉雞腸球菌MRx1548之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：6-來自鶉雞腸球菌MRx1650之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：7-來自鶉雞腸球菌MRx1763之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：8-來自鶉雞腸球菌MRx1766之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：9-來自鶉雞腸球菌MRx1775之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：10-來自鶉雞腸球菌MRx1886之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：11-來自鶉雞腸球菌2A8之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：12-來自鶉雞腸球菌9402之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：13-來自鶉雞腸球菌A6981之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：14-來自鶉雞腸球菌MRx1649之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：15-來自鶉雞腸球菌EG2之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：16-來自鶉雞腸球菌SKF1之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：17-來自酪黃腸球菌DSM 7370之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：18-來自酪黃腸球菌1a6A之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：19-來自酪黃腸球菌3h10B之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：20-來自酪黃腸球菌14-MB-W-14之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：21-來自酪黃腸球菌ATCC12755之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：22-來自酪黃腸球菌DSM4841之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：23-來自酪黃腸球菌DSM20680之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：24-來自酪黃腸球菌EC10之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：25-來自酪黃腸球菌EC20之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：26-來自酪黃腸球菌EC30之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：27-來自酪黃腸球菌F1129之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：28-來自酪黃腸球菌F1129F 46之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：29-來自酪黃腸球菌NBRC 100478之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：30-來自酪黃腸球菌PAVET15之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：31-來自酪黃腸球菌NLAE-zl-G268之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：32-來自酪黃腸球菌NLAE-zl-C414之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：33-來自鶉雞腸球菌FDAARGOS-163之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：34-來自酪黃腸球菌MRx0858之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：35-來自酪黃腸球菌DSM25781之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：36-來自鶉雞腸球菌DSM28564之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：37-來自鶉雞腸球菌DSM28565之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：38-來自鶉雞腸球菌F1213F 228之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：39-來自鶉雞腸球菌DSM20718之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：40-來自鶉雞腸球菌DSM20628之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：41-來自鶉雞腸球菌NBRC100675之鞭毛蛋白多肽
SEQ ID NO：42-來自鶉雞腸球菌DSM24841之鞭毛蛋白多肽
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<213> 鶉雞腸球菌MRx0518
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Figure 108109387-A0202-12-0092-4
Figure 108109387-A0202-12-0093-5
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Figure 108109387-A0202-12-0094-6
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Figure 108109387-A0202-12-0096-9
Figure 108109387-A0202-12-0097-10
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<213> 鶉雞腸球菌MRx0556
<400> 4
Figure 108109387-A0202-12-0097-11
Figure 108109387-A0202-12-0098-12
Figure 108109387-A0202-12-0099-13
<210> 5
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌MRx1548
<400> 5
Figure 108109387-A0202-12-0099-14
Figure 108109387-A0202-12-0100-16
<210> 6
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌MRx1650
<400> 6
Figure 108109387-A0202-12-0100-15
Figure 108109387-A0202-12-0101-17
Figure 108109387-A0202-12-0102-18
<210> 7
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌MRx1763
<400> 7
Figure 108109387-A0202-12-0102-19
Figure 108109387-A0202-12-0103-20
Figure 108109387-A0202-12-0104-21
<210> 8
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌MRx1766
<400> 8
Figure 108109387-A0202-12-0104-22
Figure 108109387-A0202-12-0105-23
<210> 9
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌MRx1775
<400> 9
Figure 108109387-A0202-12-0106-24
Figure 108109387-A0202-12-0107-25
<210> 10
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌MRx1886
<400> 10
Figure 108109387-A0202-12-0107-26
Figure 108109387-A0202-12-0108-27
Figure 108109387-A0202-12-0109-28
<210> 11
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌2A8
<400> 11
Figure 108109387-A0202-12-0109-29
Figure 108109387-A0202-12-0110-30
<210> 12
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌9402
<400> 12
Figure 108109387-A0202-12-0111-31
Figure 108109387-A0202-12-0112-33
<210> 13
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌A6981
<400> 13
Figure 108109387-A0202-12-0112-32
Figure 108109387-A0202-12-0113-34
Figure 108109387-A0202-12-0114-35
<210> 14
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌MRx1649
<400> 14
Figure 108109387-A0202-12-0114-36
Figure 108109387-A0202-12-0115-37
Figure 108109387-A0202-12-0116-38
<210> 15
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌EG2
<400> 15
Figure 108109387-A0202-12-0116-39
Figure 108109387-A0202-12-0117-41
<210> 16
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌SKF1
<400> 16
Figure 108109387-A0202-12-0117-40
Figure 108109387-A0202-12-0118-42
Figure 108109387-A0202-12-0119-43
<210> 17
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌DSM 7370
<400> 17
Figure 108109387-A0202-12-0119-44
Figure 108109387-A0202-12-0120-45
Figure 108109387-A0202-12-0121-46
<210> 18
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌1a6A
<400> 18
Figure 108109387-A0202-12-0121-47
Figure 108109387-A0202-12-0122-48
<210> 19
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌3h10B
<400> 19
Figure 108109387-A0202-12-0123-49
Figure 108109387-A0202-12-0124-50
<210> 20
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌14-MB-W-14
<400> 20
Figure 108109387-A0202-12-0124-51
Figure 108109387-A0202-12-0125-52
Figure 108109387-A0202-12-0126-53
<210> 21
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌ATCC12755
<400> 21
Figure 108109387-A0202-12-0126-54
Figure 108109387-A0202-12-0127-55
Figure 108109387-A0202-12-0128-56
<210> 22
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌DSM4841
<400> 22
Figure 108109387-A0202-12-0128-57
Figure 108109387-A0202-12-0129-58
<210> 23
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌DSM20680
<400> 23
Figure 108109387-A0202-12-0129-59
Figure 108109387-A0202-12-0130-60
Figure 108109387-A0202-12-0131-62
<210> 24
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌EC10
<400> 24
Figure 108109387-A0202-12-0131-63
Figure 108109387-A0202-12-0132-64
Figure 108109387-A0202-12-0133-65
<210> 25
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌EC20
<400> 25
Figure 108109387-A0202-12-0133-66
Figure 108109387-A0202-12-0134-67
<210> 26
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌EC30
<400> 26
Figure 108109387-A0202-12-0135-68
Figure 108109387-A0202-12-0136-69
<210> 27
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌F1129
<400> 27
Figure 108109387-A0202-12-0136-70
Figure 108109387-A0202-12-0137-71
Figure 108109387-A0202-12-0138-72
<210> 28
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌F1129F 46
<400> 28
Figure 108109387-A0202-12-0138-73
Figure 108109387-A0202-12-0139-75
<210> 29
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌NBRC 100478
<400> 29
Figure 108109387-A0202-12-0140-76
Figure 108109387-A0202-12-0141-77
<210> 30
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌PAVET15
<400> 30
Figure 108109387-A0202-12-0141-78
Figure 108109387-A0202-12-0142-79
Figure 108109387-A0202-12-0143-80
<210> 31
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌NLAE-zl-G268
<400> 31
Figure 108109387-A0202-12-0143-81
Figure 108109387-A0202-12-0144-82
Figure 108109387-A0202-12-0145-83
<210> 32
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌NLAE-zl-C414
<400> 32
Figure 108109387-A0202-12-0145-84
Figure 108109387-A0202-12-0146-86
<210> 33
<211> 360
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌FDAARGOS-163
<400> 33
Figure 108109387-A0202-12-0146-85
Figure 108109387-A0202-12-0147-87
Figure 108109387-A0202-12-0148-88
<210> 34
<211> 360
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌MRx0858
<400> 34
Figure 108109387-A0202-12-0148-89
Figure 108109387-A0202-12-0149-90
Figure 108109387-A0202-12-0150-91
<210> 35
<211> 361
<212> PRT
<213> 酪黃腸球菌DSM25781
<400> 35
Figure 108109387-A0202-12-0150-94
Figure 108109387-A0202-12-0151-95
<210> 36
<211> 361
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌DSM28564
<400> 36
Figure 108109387-A0202-12-0152-96
Figure 108109387-A0202-12-0153-97
<210> 37
<211> 361
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌DSM28565
<400> 37
Figure 108109387-A0202-12-0153-99
Figure 108109387-A0202-12-0154-100
Figure 108109387-A0202-12-0155-101
<210> 38
<211> 358
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌F1213F 228
<400> 38
Figure 108109387-A0202-12-0155-103
Figure 108109387-A0202-12-0156-104
<210> 39
<211> 352
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌DSM20718
<400> 39
Figure 108109387-A0202-12-0157-105
Figure 108109387-A0202-12-0158-107
<210> 40
<211> 352
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌DSM20628
<400> 40
Figure 108109387-A0202-12-0158-106
Figure 108109387-A0202-12-0159-108
Figure 108109387-A0202-12-0160-109
<210> 41
<211> 352
<212> PRT
<213> 鶉雞腸球菌NBRC100675
<400> 41
Figure 108109387-A0202-12-0160-111
Figure 108109387-A0202-12-0161-112
<210> 42
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鶉雞腸球菌DSM24841
<400> 42
Figure 108109387-A0202-12-0162-113
Figure 108109387-A0202-12-0163-114
<210> 43
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC020引子
<400> 43
Figure 108109387-A0202-12-0163-115
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC021引子
<400> 44
Figure 108109387-A0202-12-0164-116
<210> 45
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC047引子
<400> 45
Figure 108109387-A0202-12-0164-117
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC048引子
<400> 46
Figure 108109387-A0202-12-0164-118
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DC013引子
<400> 47
Figure 108109387-A0202-12-0164-119
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> DC014引子
<400> 48
Figure 108109387-A0202-12-0165-121

Claims (51)

  1. 一種來自腸球菌( Enterococcus)屬之鞭毛蛋白多肽，其用於療法中。
  2. 如申請專利範圍第1項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽係來自鶉雞腸球菌( Enterococcus gallinarum)菌種。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽係來自以登錄號NCIMB 42488寄存於NCIMB之菌株。
  4. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO：1。
  6. 如申請專利範圍第1項至第3項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽與SEQ ID NO：2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽包含SEQ ID NO：2。
  8. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽與SEQ ID NO：3-42中之一者具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性。
  9. 如申請專利範圍第8項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽具有與SEQ ID NO：3-16中之一者具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性的序列。
  10. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽不含D3結構域。
  11. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽呈單體形式。
  12. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽含有與SEQ ID NO：1中之殘基87-96及290-295至少99%、99.5%或99.9%一致之TLR5識別位點。
  13. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其中該鞭毛蛋白多肽為細菌鞭毛裝配體之一部分。
  14. 一種鞭毛蛋白多肽之片段，其用於療法中，其中該鞭毛蛋白多肽如申請專利範圍第1項至第12項中任一項所定義，且其中該片段之長度為至少7個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個或350個胺基酸。
  15. 如申請專利範圍第14項之供使用之鞭毛蛋白多肽之片段，其中該片段與SEQ ID NO：1具有至少85%之序列一致性及/或(ii)包含來自SEQ ID NO：1之至少7個相連胺基酸之片段。
  16. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之鞭毛蛋白多肽，其接合至抗原，諸如病原體抗原或腫瘤抗原。
  17. 一種包含鞭毛蛋白多肽之融合多肽，其用於療法中，其中該鞭毛蛋白多肽如申請專利範圍第1項至第15項中任一項所定義。
  18. 如申請專利範圍第17項之融合多肽，其包含抗原，諸如病原體抗原或腫瘤抗原。
  19. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：1之以下多段胺基酸中之一者或一或多者：2-32、87-96、165-272、234-358、290-295，或包含與該等片段中之一者具有至少90%、92%、95%、98%或99%之序列一致性的序列。
  20. 如申請專利範圍第19項之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：1 中之胺基酸165-272之序列90%、92%、95%、98%或99%之序列一致性。
  21. 如申請專利範圍第19項之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：1中之胺基酸87-96、165-272及290-295之序列90%、92%、95%、98%或99%之序列一致性。
  22. 如申請專利範圍第19項至第21項之多肽，其進一步包含免疫刺激區。
  23. 如申請專利範圍第22項之多肽，其中該免疫刺激區為TLR4或TLR5活化區。
  24. 如申請專利範圍第19項至第23項之多肽，其中該多肽為鞭毛蛋白多肽。
  25. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之多肽，其中該多肽為細菌鞭毛裝配體之一部分。
  26. 如申請專利範圍第25項之多肽，其中該多肽為鞭毛蛋白多肽。
  27. 如前述申請專利範圍中任一項之供使用之多肽，其中該多肽另外包含一或多種抗原。
  28. 一種編碼來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之聚核苷酸序列，其用於療法中。
  29. 如申請專利範圍第28項之供使用之聚核苷酸序列，其中該鞭毛蛋白多肽如申請專利範圍第2項至第27項中任一項所定義。
  30. 如申請專利範圍第29項之供使用之聚核苷酸序列，其中所編碼之多肽序列與SEQ ID NO：1具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%之序列一致性，或為SEQ ID NO：1。
  31. 一種表現來自腸球菌屬之重組鞭毛蛋白多肽之宿主細胞，其用於療法中。
  32. 一種包含編碼來自腸球菌屬之鞭毛蛋白多肽之重組聚核苷酸序列之宿主細胞，其用於療法中。
  33. 如申請專利範圍第31項或第32項之供使用之宿主細胞，其中該鞭毛蛋白多肽如申請專利範圍第2項至第27項中任一項所定義。
  34. 一種載體或質體，其包含如申請專利範圍第28項至第30項之聚核苷酸序列。
  35. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第34項之載體或質體。
  36. 如申請專利範圍第35項之宿主細胞，其另外表現異源抗原，諸如病原體抗原或腫瘤抗原。
  37. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之鞭毛蛋白多肽、如申請專利範圍第14項或第15項之鞭毛蛋白多肽之片段、如申請專利範圍第17項或第18項之融合多肽、如申請專利範圍第19項至第27項之多肽、如申請專利範圍第27項至第29項之聚核苷酸、如申請專利範圍第31項至第33項及第35項中任一項之宿主細胞或如申請專利範圍第34項之載體，該組成物用於療法中。
  38. 如申請專利範圍第37項之供使用之組成物，其用於治療或預防癌症之方法中。
  39. 如申請專利範圍第38項之供使用之組成物，其中該組成物係用於治療免疫原性腫瘤。
  40. 如申請專利範圍第38項或第39項之供使用之組成物，其中該組成物係用於治療或預防肺癌、乳癌、肝癌或結腸癌之方法中。
  41. 如申請專利範圍第37項至第40項中任一項之供使用之組成物，其中該組成物係用於減小腫瘤尺寸、減少腫瘤生長、預防轉移或預防血管生成之方法中。
  42. 如申請專利範圍第37項之供使用之組成物，其用於刺激個體中之免疫系統。
  43. 如申請專利範圍第37項之供使用之組成物，其用於治療、預防或延遲免疫衰老。
  44. 如申請專利範圍第37項之供使用之組成物，其用作疫苗佐劑。
  45. 如申請專利範圍第37項之供使用之組成物，其用於增強細胞療法，諸如CAR-T。
  46. 如申請專利範圍第37項至第44項中任一項之供使用之組成物，其中該組成物增加NF-κB之水準及/或活性。
  47. 如申請專利範圍第37項至第46項中任一項之供使用之組成物，其中該組成物係用於經口投藥。
  48. 如申請專利範圍第37項至第46項中任一項之供使用之組成物，其中該組成物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
  49. 一種治療疾病之方法，其包含將包含來自腸球菌屬細菌菌株之鞭毛蛋白多肽之組成物投予有需要之患者。
  50. 一種治療或預防癌症之方法，其包含將包含來自腸球菌屬細菌菌株之鞭毛蛋白多肽之組成物投予有需要之患者。
  51. 一種治療或預防與降低之免疫刺激相關聯之疾病或病狀之方法，其包含將來自腸球菌屬細菌菌株之鞭毛蛋白多肽投予有需要之患者。
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