CN114703115B - 一种变形假单胞菌fliS基因沉默菌株和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种变形假单胞菌fliS基因沉默菌株和用途。该变形假单胞菌fliS基因沉默菌株含有SEQ ID NO:11所示序列，具有使斜带石斑鱼的致病力下降的用途。

Description

一种变形假单胞菌fliS基因沉默菌株和用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种变形假单胞菌fliS基因沉默菌株和用途。
背景技术
变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼、斜带石斑鱼等海水养殖鱼类“内脏白点病”的病原菌，每年造成的直接经济损失超亿元。
fliS基因编码鞭毛出口伴侣FliS蛋白。早期研究表明，蛋白质FliS用于鞭毛蛋白的转录后控制，并引导蛋白质进入鞭毛III型分泌系统(fT3SS)。鞭毛丝的成功组装依赖于FliS蛋白，该蛋白阻止鞭毛蛋白的细胞质聚集并将鞭毛蛋白引导到fT3SS的细胞质侧。在fT3SS处，鞭毛蛋白FliS复合物与fT3SS跨膜蛋白FlhA(FlhA-C)的细胞质结构域相互作用。因此，FliS作为靶向因子，将其鞭毛蛋白引导至fT3SS的出口，以进行后续分泌。已有相关报道证实了fliS基因与果斑病菌菌株鞭毛丝的形成、游动性、菌膜形成能力、生长速率、菌落形态、致病性等均有调控作用，但该基因在变形假单胞菌生物学特性中的作用需要进一步明确。因此,探明变形假单胞菌fliS基因在病原-宿主互作中的功能能够揭示其对变形假单胞菌致病性的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种变形假单胞菌fliS基因沉默菌株Pseudomonasplecoglossicida fliS-RNAi。
为实现上述目的，本发明提供一种种变形假单胞菌fliS基因沉默菌株，其特征在于，含有SEQ ID NO:11所示序列。
进一步，将含有SEQ ID NO:11所示序列的重组载体导入变形假单胞菌感受态细胞，即得到变形假单胞菌fliS基因沉默菌株。
进一步，所述菌株为Pseudomonas plecoglossicida fliS-RNAi，2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2022078。
本发明还保护所述变形假单胞菌fliS基因沉默菌株具有使斜带石斑鱼的致病力下降的用途。
本发明保藏的菌株详细信息为：
菌株名称：Pseudomonas plecoglossicida fliS-RNAi，
保藏日期：2022年01月17日，
保藏单位：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，
保藏编号：CCTCC NO:M 2022078。
本发明通过基因沉默技术构建了一株变形假单胞菌fliS基因稳定沉默菌株，然后通过人工感染实验确定fliS基因稳定沉默菌株对斜带石斑鱼的致病性，并利用RNA-seq技术对野生毒株和fliS基因稳定沉默菌株感染后的斜带石斑鱼脾脏的转录进行分析，同时对宿主和病原菌的转录进行研究，从转录组层面探讨fliS基因在变形假单胞菌与斜带石斑鱼互作中的功能，进而揭示了fliS基因对变形假单胞菌毒力的影响。实施例验证了变形假单胞菌fliS基因稳定沉默菌株感染的斜带石斑鱼的死亡率为0％，而变形假单胞菌野生株感染后斜带石斑鱼的死亡率为100％，说明fliS基因是变形假单胞菌重要的毒力基因。
本发明所构建的变形假单胞菌fliS基因稳定沉默菌株对斜带石斑鱼的致病力极显著下降，而且能够引起感染脾脏中变形假单胞菌和斜带石斑鱼转录组发生显著变化，因此该菌株可用于研究变形假单胞菌的致病机理，特别是从病原-宿主互作以及物质运输角度研究变形假单胞菌的致病机理有着独特的优势。
附图说明
图1是野生型菌株和fliS-RNAi沉默菌株的毒力研究图。其中A：5株fliS-RNAi沉默株的fliS mRNA水平。B:野生型菌株和fliS-RNAi沉默菌株的成膜水平。C：野生型菌株和fliS-RNAi沉默菌株的趋化能力。D：野生型菌株和fliS-RNAi沉默菌株的菌落生长情况。
图2是野生型菌株和fliS-RNAi沉默菌株的生长曲线图。
图3是变形假单胞菌感染斜带石斑鱼脾脏的症状照片。
图4是不同感染组在6天时的斜带石斑鱼存活率结果图。
图5是感染野生菌株和fliS基因稳定高效沉默菌株的斜带石斑鱼的差异表达基因(DEGs)GO富集分析图。
图6是感染野生菌株和fliS基因稳定高效沉默菌株的斜带石斑鱼的差异表达基因(DEGs)KEGG富集分析图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。
实施例1：变形假单胞菌fliS基因沉默菌株的构建
选择基因沉默概率最高的前五个靶点，分别位于fliS基因的第237、157、126、193、63位碱基，设计出5对最佳的shRNA。根据这5对最佳的shRNA设计引物，再人工合成5对shRNA引物(序列如下)，将合成的5对shRNA引物进行离心(12000rpm，5min)，加入相应量的无菌ddH2O配制成100μM混合液；然后将配置好的退火体系：总体积为25μL；ddH2O：15μL；上游引物(引物的浓度为100μmol)：2.5μL；下游引物(引物的浓度为100μmol)：2.5μL；AnnealingBuffer for DNA Oligos(5X)：5μL，用PCR仪进行退火，反应条件为95℃起始，每8s下降0.1℃降至25℃(约90min)，直至降至16℃即可取出备用，得到5条shRNA，最后保存于-20℃冰箱。将得到的5条shRNA(通过BsrGI和NsiI双酶切)分别连入pCM130/tac(大肠杆菌pCM130质粒载体菌株购于百奥迈科公司，加上启动子tac构建得到pCM130/tac质粒)构建重组载体。
5对shRNA引物序列如下：
引物1：
F:
5’-TGCAGTCGCTGTCGCGACTATATTCAAGAGATATAGTCGCGACAGCGACTGCTTTTTTT-3’；
SEQ ID NO:1；
R:
5’-GTACAAAAAAAGCAGTCGCTGTCGCGACTATATCTCTTGAATATAGTCGCGACAGCGACTGCATGCA-3’；
SEQ ID NO:2；
引物2：
F:
5’-TGGGAAATCGCTGGAGAAATGCTTCAAGAGAGCATTTCTCCAGCGATTTCCCTTTTTTT-3’；
SEQ ID NO:3；
R:
5’GTACAAAAAAAGGGAAATCGCTGGAGAAATGCTCTCTTGAAGCATTTCTCCAGCGATTTCCCATGCA-3’；
SEQ ID NO:4；
引物3：
F:
5’-TGCATATCGAGGCCCAGCGTTATTCAAGAGATAACGCTGGGCCTCGATATGCTTTTTTT-3’；
SEQ ID NO:5；
R:
5’-GTACAAAAAAAGCATATCGAGGCCCAGCGTTATCTCTTGAATAACGCTGGGCCTCGATATGCATGCA-3’；
SEQ ID NO:6；
引物4：
F:
5’-TGCACTCAACAGCTGCCTTGATTTCAAGAGAATCAAGGCAGCTGTTGAGTGCTTTTTTT-3’；
SEQ ID NO:7；
R:
5’-GTACAAAAAAAGCACTCAACAGCTGCCTTGATTCTCTTGAAATCAAGGCAGCTGTTGAGTGCATGCA-3’；
SEQ ID NO:8；
引物5：
F:
5’-TGCCCTATGAGCTGGTTCTGGTTTCAAGAGAACCAGAACCAGCTCATAGGGCTTTTTTT-3’；
SEQ ID NO:9；
R:
5’-GTACAAAAAAAGCCCTATGAGCTGGTTCTGGTTCTCTTGAAACCAGAACCAGCTCATAGGGCATGCA-3’；
SEQ ID NO:10。
将上述得到的各重组载体分别电转导入变形假单胞菌感受态细胞，成功构建变形假单胞菌fliS基因稳定沉默菌株，分别命名为fliS-RNAi-237,fliS-RNAi-157,fliS-RNAi-126,fliS-RNAi-193,fliS-RNAi-63；引物1对应fliS-RNAi-237,引物2对应fliS-RNAi-157,引物3对应fliS-RNAi-126,引物4对应fliS-RNAi-193,引物5对应fliS-RNAi-63。
fliS-RNAi-126中插入的基因序列：
5’-TGCATATCGAGGCCCAGCGTTATTCAAGAGATAACGCTGGGCCTCGATATGCTTTTTTT-3’；SEQID NO:11。
分别提取构建成功的五对沉默菌株和野生菌株的RNA,并进行逆转录得到cDNA。以引物(F:5'-CAGGTGACGGTGCTGGACG-3'，SEQ ID NO:12；R:5'-GAAAGCGCGGGAGATGATG-3'，SEQID NO:13)作为内参基因，以得到的cDNA为模板，使用qRT-PCR法，分别检测不同菌株中基因的表达量，每个样品三个重复，实验数据用-2ΔΔCt法处理，挑选出沉默效率最高的菌株(fliS-RNAi-126菌株)；结果见图1，显示了5株fliS-RNAi菌株的沉默效果。其中，fliS-RNAi-126的沉默效果最好，达到89％，即为变形假单胞菌fliS基因稳定高效沉默株，作为后续实验的实验菌株。图2显示野生型菌株和fliS-RNAi沉默菌株的生长曲线。其中图1的A：5株fliS-RNAi沉默株的fliS mRNA水平。B:野生型菌株和fliS-RNAi沉默菌株的成膜水平。C：野生型菌株和fliS-RNAi沉默菌株的趋化能力。D：野生型菌株和fliS-RNAi沉默菌株的菌落生长情况。
将沉默效果最好的fliS-RNAi-126对应的菌株进行了保藏。保藏信息如下：
菌株名称：Pseudomonas plecoglossicida fliS-RNAi，
保藏日期：2022年01月17日，
保藏单位：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，
保藏编号：CCTCC NO:M 2022078。
实施例2：变形假单胞菌fliS基因沉默菌株的毒力实验
变形假单胞菌fliS基因沉默菌株(以fliS-RNAi-126为例)、变形假单胞菌野生株和PBS(NaCl 0.8g、KCl 0.02g、Na2HPO4 0.36g、KH2PO4 0.024g、H2O 1L，PH 7.0)分别对三组斜带石斑鱼(购于福建省漳州市某养殖场)进行胸腔注射感染，菌株感染浓度为103cfu/g，每条鱼注射0.2mL，每组20尾鱼，然后继续正常暂养(在无致病性的实验室条件下，水温18±2℃)，并记录每天各组鱼的存活状况。
在注射后6d，分别对野生型菌株组(注射变形假单胞菌野生株的组别，附图中标记为野生株)、fliS基因稳定高效沉默株组(注射fliS-RNAi-126的组别，附图中标记为沉默株)和PBS组(注射PBS的组别，附图中标记为PBS)的生存率进行评估。注射野生型菌株后2天鱼的存活率为95％，6天时存活率为0％。PBS组和fliS基因稳定高效沉默株组斜带石斑鱼在整个实验期间均存活。与野生型菌株相比，用fliS基因沉默菌株注射的斜带石斑鱼表现出明显地不死亡(图4，图4中PBS与沉默株的结果重叠)。注射野生型菌株的斜带石斑鱼的脾脏表现出典型的症状(脾脏表面有许多白点覆盖)，但注射fliS基因沉默株的脾脏表面没有明显的白点(图3)。
实施例3：变形假单胞菌fliS基因沉默菌株的表达实验
利用RNA-seq技术对fliS基因沉默株和野生型变形假单胞菌感染后的斜带石斑鱼的脾脏进行转录组测序，比较分析fliS基因的沉默对变形假单胞菌和斜带石斑鱼基因表达的影响。
在感染的第四天进行采样，每组各采集18尾鱼，每6个脾脏混为一组，分别三个重复，分别命名为：flis_T_1、flis_T_2、flis_T_3、wt4d_1、wt4d_2、wt4d_3，保存于液氮当中。首先从采集到的脾脏组织中进行RNA的提取和纯化，并对质量进行严格控制，质量检测合格后使用上海美吉生物公司的Illumina Nova Seq测序平台进行测序。
(1)数据处理
由于原始数据含有大量干扰后续分析的错误序列，通过Trinity软件过滤掉原始测序数据中的错误序列从而得到高质量的测序数据(clean data)。
(2)转录组从头组装
使用Trinity软件对所有样本clean data进行从头组装，并对组装结果进行优化评估。
(3)样本表达量
使用RSEM软件计算基因的表达水平，通过计算FPKM值从而判断样本间的相互关系。
(4)差异表达基因分析
使用edgeR软件来计算基因差异表达，其显著差异表达基因的筛选标准为FDR≤0.05，|log2FC|≥1。
(5)GO功能注释
通过BLAST2GO软件对差异基因进行GO注释，统计出具有某个GO功能的基因列表及基因数目。
(6)GO富集分析
使用Goatools软件对差异基因进行GO功能显著性富集分析(校正后P<0.05)，从而发现差异表达基因显著相关的生物学功能。
(7)KEGG富集分析
使用KOBAS软件进行富集分析(校正后P<0.05)，从而得到不同处理条件下基因的免疫相关通路。
RNA-seq分析结果显示，在mRNA水平上，根据统计标准(|log2FC|≥1,FDR≤0.05)，共鉴定出52006个差异表达基因。在这些差异表达基因，与感染野生型菌株相比，感染fliS-RNAi菌株组的有13613个显著下调，38939个显著上调。GO分类和KEGG通路分析确定宿主斜带石斑鱼差异表达基因的生物学功能。图5显示了GO的前20个富集结果，结果表明含蛋白质复合物(protein-containing complex)富集到的mRNA最多，免疫系统过程(immune systemprocess)、对刺激的反应(response to stimulus)等富集到较多的mRNA。KEGG富集分析结果表明主要富集到了350个KEGG通路，显著富集到了12个通路。与免疫相关的通路有23个(图6)，如图6所示分别有Toll样受体信号通路、抗原加工与呈递、IL-17信号通路、Th1和Th2细胞分化、RIG-I样受体信号通路、造血细胞调控信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、C型凝集素受体信号通路、趋化因子信号通路、补体和凝血级联系统、Toll和Imd信号通路、Th17细胞分化、白细胞跨内皮迁移、血小板活化、NOD样受体信号通路、胞浆DNA传感通路、中性粒细胞胞外陷阱形成、肠道免疫网络用于IgA生产、自然杀伤细胞介导细胞毒性、Fcepsilon RI信号通路、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路、Fcγ受体介导吞噬作用，也显示DEGs在感染过程中与免疫高度相关，显著富集到了细胞因子-细胞因子受体相互作用。其中，在细胞因子-细胞因子受体相互作用富集的基因是最多。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
福建天马饲料有限公司
<120> 一种变形假单胞菌fliS基因沉默菌株和用途
<130> JMDXL-22003-CNI
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcagtcgct gtcgcgacta tattcaagag atatagtcgc gacagcgact gcttttttt 59
<210> 2
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtacaaaaaa agcagtcgct gtcgcgacta tatctcttga atatagtcgc gacagcgact 60
gcatgca 67
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgggaaatcg ctggagaaat gcttcaagag agcatttctc cagcgatttc ccttttttt 59
<210> 4
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtacaaaaaa agggaaatcg ctggagaaat gctctcttga agcatttctc cagcgatttc 60
ccatgca 67
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgcatatcga ggcccagcgt tattcaagag ataacgctgg gcctcgatat gcttttttt 59
<210> 6
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtacaaaaaa agcatatcga ggcccagcgt tatctcttga ataacgctgg gcctcgatat 60
gcatgca 67
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgcactcaac agctgccttg atttcaagag aatcaaggca gctgttgagt gcttttttt 59
<210> 8
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtacaaaaaa agcactcaac agctgccttg attctcttga aatcaaggca gctgttgagt 60
gcatgca 67
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgccctatga gctggttctg gtttcaagag aaccagaacc agctcatagg gcttttttt 59
<210> 10
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtacaaaaaa agccctatga gctggttctg gttctcttga aaccagaacc agctcatagg 60
gcatgca 67
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgcatatcga ggcccagcgt tattcaagag ataacgctgg gcctcgatat gcttttttt 59
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caggtgacgg tgctggacg 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaaagcgcgg gagatgatg 19

Claims (3)

1.一种变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）fliS基因沉默菌株，其特征在于，将含有SEQ ID NO:11所示序列的shRNA表达载体导入变形假单胞菌感受态细胞，即得到变形假单胞菌fliS基因沉默菌株。
2.如权利要求1所述变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）fliS基因沉默菌株，其特征在于，所述菌株为Pseudomonas plecoglossicida fliS-RNAi，2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2022078。
3.权利要求1所述变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）fliS基因沉默菌株在制备使斜带石斑鱼的致病力下降的药物中的用途，所述使斜带石斑鱼的致病力下降是指与野生型变形假单胞菌对斜带石斑鱼的致病力相比。
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