CN109694840A - 一株变形假单胞菌abc转运蛋白基因沉默菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株，所述菌株为Pseudomonas plecoglossicida ABC‑shRNA‑RNAi，已于2018年11月12日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018771，本发明通过比较转录组学分析技术，结合RNA干扰这一定向高效的基因沉默技术，构建一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因（L321_23611）稳定沉默菌株，并对该菌株的毒力效果进行检测。所构建的变形假单胞菌L321_23611基因稳定沉默菌株不仅可用于研究变形假单胞菌的致病机理，还可用于研制变形假单胞菌的弱毒疫苗并为海水鱼“内脏白点病”的预防和治疗寻找新的靶点。

Description

一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体涉及一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株。
背景技术
变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼、斜带石斑鱼等海水养殖鱼类“内脏白点病”的病原菌，每年造成的直接经济损失超亿元。
ABC转运蛋白（ATP Binding Cassette transporters）是一个成员众多的膜蛋白超家族。从细菌到人类，它们通过细胞膜的渗透性屏障运输分子。运输的分子类型极其多样化，从离子、小到中型分子（糖、氨基酸、脂质、离子金属）到大且笨重的化合物（多肽、蛋白质、有机金属复合物和抗生素）。它们参与了许多重要的生理过程，如营养导入、细胞解毒、脂质稳态、信号转导、抗病毒防御和抗原表达。原核生物中，既存在向内转运蛋白又存在向外转运蛋白，这些蛋白在多种生理过程中都发挥着重要的作用。这些蛋白的失活会对细胞的生存产生致命的影响。许多ABC转运蛋白在特定条件下，对细菌的生存能力、毒性以及致病性有着重要的影响。ABC转运蛋白还可以介导铁的运输，这一作用对微生物的毒性有着重要的作用。
本发明通过比较转录组学分析技术，结合RNA干扰这一定向高效的基因沉默技术，构建一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因（L321_23611）稳定沉默菌株，并对该菌株的毒力效果进行检测。所构建的变形假单胞菌L321_23611基因稳定沉默菌株不仅可用于研究变形假单胞菌的致病机理，还可用于研制变形假单胞菌的弱毒疫苗并为海水鱼“内脏白点病”的预防和治疗寻找新的靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株，所述菌株为Pseudomonas plecoglossicida ABC-shRNA-RNAi，已于2018年11月12日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018771，地址为中国武汉，武汉大学。
本发明提供的这株变形假单胞菌L321_23611基因稳定沉默菌株是通过以下方法进行构建：
（1）通过比较转录组学分析技术，将筛选致病功能基因目标锁定L321_23611基因；所述的L321_23611基因序列如SEQ ID NO.1所示。
（2）合成shRNA，退火后连入pCM130/tac载体，通过电转技术导入变形假单胞菌感受态细胞，构建变形假单胞菌L321_23611基因稳定沉默菌株；利用QPCR技术，对沉默效果进行检验；所述的pCM130/tac载体是利用质粒pCM130加上启动子tac构成。
（3）利用人工感染实验，研究变形假单胞菌野生株、L321_23611基因沉默株的毒力，以及L321_23611基因沉默对变形假单胞菌及斜带石斑鱼基因表达的影响。
（4）通过基因测序和比对，本发明提供的菌株为一株变形假单胞菌L321_23611基因（ABC转运蛋白基因）稳定沉默菌株。
本发明的优点在于：
人工感染实验结果表明，变形假单胞菌L321_23611基因稳定沉默菌株的毒力显著低于变形假单胞菌野生株的毒力，具有研制减毒疫苗的潜力。
Dual RNA-seq分析结果表明，L321_23611基因的稳定沉默不仅能够显著影响变形假单胞菌的转录组表达，而且也能显著影响斜带石斑鱼的转录组表达，这说明变形假单胞菌L321_23611基因稳定沉默菌株可用于研究变形假单胞菌的致病机理，还可用于为海水鱼“内脏白点病”的预防和治疗寻找新的靶点。
附图说明
图1 斜带石斑鱼感染变形假单胞菌后的存活率图。
图2变形假单胞菌感染斜带石斑鱼组织示意图。
图3斜带石斑感染后脾脏组织的病症变化图。a组为阴性对照，仅注射PBS，b组为阳性对照，用变形假单胞菌野生株进行注射感染，c组为实验组，用L321_23611基因沉默株进行注射感染。
具体实施方式
实施例1
本发明实施例提供的变形假单胞菌L321_23611基因稳定沉默菌株的构建方法包括以下步骤：
S101：通过比较转录组学分析技术，对变形假单胞菌基因表达水平进行检测；利用组学技术，极大的缩小研究范围挑选出最具有研究价值的致病功能基因，ABC转运蛋白（ATPBinding Cassette transporters）是一个成员众多的膜蛋白超家族。许多ABC转运蛋白在特定条件下，对细菌的生存能力、毒性以及致病性有着重要的影响。ABC转运蛋白还可以介导铁的运输，这一作用对微生物的毒性有着重要的作用。转录组测序发现L321_23611基因在变形菌致病温度18°下显示显著高表达（L321_23611基因RNA的测序值18°为1，12°为0.9549，28°为0.3369），故将目标瞄准L321_23611基因；
S102：利用Thermo-fisher Scientific 公司在线shRNA设计工具（http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.dodesignOption=shrna&pid=708587103220684543），设计并合成shRNA，然后使用退火缓冲液退火形成双链shRNA。shRNA序列F:5’-TGCAACTATGGCGAAGTGTTCGTTCAAGAGACGAACACTTCGCCATAGTTGCTTTTTTT-3’，R:5’-GTACAAAAAAAGCAACTATGGCGAAGTGTTCGTCTCTTGAACGAACACTTCGCCATAGTTGCATGCA-3’，从百奥迈科公司购买原始质粒pCM130加上去的启动子tac，构成pCM130/tac质粒。买使用限制性内切酶BsrGI和 NsiI双酶切pCM130/tac质粒使其线性化，然后使用T4连接酶将线性化质粒和双链shRNA连接。将重组质粒先热击转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃扩大培养，测序成功后提取重组质粒，电击转化进变形假单胞菌感受态细胞中，18℃条件下扩大培养。此菌株即为变形假单胞菌L321_23611基因沉默突变株。所述变形假单胞菌L321_23611基因沉默突变株为Pseudomonas plecoglossicida ABC-shRNA-RNAi，已于2018年11月12日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018771。
使用qRT-PCR技术，对沉默效果进行检验，上游引物序列（5’-3’’）为：GCGACGGTCTTCCAGGCTTCT ，下游引物序列（5’-3’’）为：GCTGGCTGAACTTGACCTTGCTG； 检验结果与转录组测序结果一致，感染后L321_23611基因表达量上调；
S103：利用人工感染实验，对变形假单胞菌野生株和L321_23611基因沉默株的毒力进行对比。
L321_23611基因沉默株、变形假单胞菌野生株和PBS（NaCl 0.8g、KCl 0.02g、Na2HPO4 0.36g、 KH2PO4 0.024g、H2O 1L）分别对三组斜带石斑鱼进行胸腔注射感染，菌株感染浓度为103cfu/g，每条鱼注射0.2 mL，每组20尾鱼，然后继续正常暂养，并记录每天各组鱼的存活状况。
变形假单胞菌L321_23611基因沉默株与野生株感染斜带石斑鱼后，斜带石斑鱼的存活情况如图1所示，与野生株相比，沉默株推迟一天出现死亡现象；在第五天时，沉默株的死亡率比野生株的死亡率降低了32%；野生株的斜带石斑鱼在第六天时全部死亡，而沉默株的实验用鱼在第七天后不再出现死亡现象。
解剖经过变形假单胞菌注射感染后的斜带石斑鱼，变形假单胞菌感染斜带石斑鱼组织示意图如图2所示，观察后发现，在头肾、体肾、肝脏和脾脏中，内脏白点最明显的部位是脾脏。对脾脏部位的跟踪拍摄，结果如图3所示，a组为PBS注射，为阴性对照，脾脏没有发生明显病变，属于正常脾脏状态；b组为野生株注射 ，为阳性对照，脾脏从第三天开始出现白点现象，症状逐渐严重，第六天该组实验用鱼全部死亡。c组为沉默株注射，为实验组，脾脏出现白点现象的时间比野生株推迟一天，症状也是逐渐严重，但总体而言，症状没有阳性对照组的症状严重。
在对变形假单胞菌进行斜带石斑鱼活体感染的过程中发现，沉默株相比于野生株的死亡时间有所推迟，在实验结束时，野生株的试验用鱼全部死亡，而沉默株的试验用鱼最终存活率为8%，同时阴性对照组的所有试验用鱼全部存活。感染过程中对主要感染器官——脾脏进行跟踪观察，发现阴性对照没有明显的病变现象，野生株的脾脏在第三天时出现白点症状并逐渐严重，而沉默株的病变现象相对于野生株而言，出现的时间较晚，症状较轻。实验结果与他人的研究成果相互印证，证明变形假单胞菌确实对斜带石斑鱼有致病性，L321_23611基因对该细菌的致病性有显著影响。
S104：利用dual RNA-seq技术对L321_23611基因沉默株和野生株变形假单胞菌感染后的斜带石斑鱼的脾脏进行转录组测序，比较分析L321_23611基因的沉默对变形假单胞菌和斜带石斑鱼基因表达的影响。
通过转录组测序对变形假单胞菌与斜带石斑鱼进行了大规模的转录组学分析，从而研究二者之间的互作过程。我们总共测得4914个变形假单胞菌的差异基因，183843个斜带石斑鱼的差异基因，通过对这些差异基因进行GO富集分析和KEGG富集分析。将细菌中的差异基因富集到KEGG通路上，结果发现，按照第一大分类方式，差异基因按数量分别富集到了新陈代谢（Metabolism，65%）、遗传信息处理（Genetic Information Processing，11%）、人类疾病（Human Diseases，11%）、环境信息处理（Environmental InformationProcessing，7%）、细胞过程（Cellular Processes，4%）、生物系统（Organismal Systems，2%）六大生化代谢途径中。对病原菌而言，聚集到新陈代谢上的差异基因数目具有显著优势，说明了L321_23611基因在进行跨膜运输过程中在各种物质转运上扮演重要角色。
表1细菌差异表达基因KEGG显著性富集结果
将宿主的差异基因富集到KEGG通路上，结果发现，按照第一大分类方式，差异基因按数量依次富集到了新陈代谢（31.69%）、人类疾病（22.77%）、生物系统（22.46%）、环境信息处理（10.46%）、遗传信息处理（6.15%）、细胞过程（4.92%）六大生化代谢途径。对宿主而言，聚集到信号转导和免疫系统上的差异基因具有显著优势，证明病原菌在进入宿主体内后，引起了宿主的应激反应，宿主调动体内的各项防御措施，抵制病原菌对其产生的影响。
表2宿主差异表达基因KEGG显著性富集结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
<120> 一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaagatgt tgaaaaccac cctggcagtc ctgaccgctg ccgccgcact gggcgccgtg 60
agcactgccc aggccggcgc cacactcgat gcggtaaaga agaagggctt cgtccagtgt 120
ggcgtgagcg acggtcttcc aggcttctcg gtccctgatg cgcagggcaa gatcgtcggt 180
atcgatgccg atgtctgccg cgccgtggct gctgccgtgt tcggcgacgc cagcaaggtc 240
aagttcagcc agctcaacgc caaggagcgc ttcaccgcct tgcaatccgg cgaagtcgac 300
gtgctgtcgc gcaacaccac ctggaccagc tcgcgcgatg ccggcatggg cctggtgttc 360
gccggcgtca cctactacga cggcgttggc ttcctggtca acaagaagct cggcgtctcc 420
agcgccaagg aactcgatgg cgcgaccatc tgcatccagg ccggtaccac caccgaactg 480
aacgtgtccg acttcttccg tgccaacggc ctgaaataca ccccgatcac cttcgacacc 540
tccgacgaaa gcgccaagtc gctggaatcg ggccgttgcg acgtgctgac ctcggacaag 600
tcgcagctgt tcgcccagcg ctccaagctg gccgcaccga ccgagtatgt ggtgctgccg 660
gagaccatct ccaaggaacc gctgggcccg gtggtgcgca agggcgacga ggaatggttc 720
agcatcgtca agtggaccct gttcgccatg ctcaatgccg aagaggcggg catcacctcg 780
aagaacgtcg aggccgaagc caagggcacc aagaacccgg acgtcgctcg cctgctcggt 840
gccgacggtg aatacggcaa ggacctgaaa ctgcccaagg actgggtggt gcagatcgtc 900
aagcaggtcg gcaactatgg cgaagtgttc gagaagaacc tgggccagag caccgacctg 960
aagatcgacc gtggcatgaa cgccctgtgg aacaacggcg gcatccagta cgcgccacct 1020
gtgcgctga 1029
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcaactatg gcgaagtgtt cgttcaagag acgaacactt cgccatagtt gcttttttt 59
<210> 3
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtacaaaaaa agcaactatg gcgaagtgtt cgtctcttga acgaacactt cgccatagtt 60
gcatgca 67
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcgacggtct tccaggcttc t 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctggctgaa cttgaccttg ctg 23

Claims (5)

1.一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株，其特征在于：所述菌株为Pseudomonas plecoglossicida ABC-shRNA-RNAi，已于2018年11月12日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018771。
2.如权利要求1所述的一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括如下：
（1）通过比较转录组学分析技术，将筛选致病功能基因目标锁定L321_23611基因；
（2）合成shRNA，退火后连入pCM130/tac载体，通过电转技术导入变形假单胞菌感受态细胞，构建变形假单胞菌L321_23611基因稳定沉默菌株；利用QPCR技术，对沉默效果进行检验，最终获得所述的变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株。
3.根据权利要求2所述的一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株的构建方法，其特征在于：所述的L321_23611基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株的构建方法，其特征在于：所述的pCM130/tac载体是利用质粒pCM130加上启动子tac构成。
5.如权利要求1所述的一株变形假单胞菌ABC转运蛋白基因沉默菌株在制备预防和治疗海水鱼内脏白点病制剂中的应用。
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