CN112662608A

CN112662608A - 一株变形假单胞菌exbB基因稳定沉默菌株及应用

Info

Publication number: CN112662608A
Application number: CN202110152614.1A
Authority: CN
Inventors: 鄢庆枇; 唐艺; 赵玲敏; 黄力行; 覃映雪; 徐晓津; 马英; 郑江
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112662608B

Abstract

本发明通过基因沉默技术构建了一株变形假单胞菌exbB基因稳定高效沉默菌株，然后通过人工感染实验确定exbB基因稳定高效沉默菌株对斜带石斑鱼的致病性，并利用dual RNA‑seq技术对野生菌株和exbB基因稳定高效沉默菌株感染后的斜带石斑鱼脾脏的转录组数据进行分析，同时对宿主和病原菌的转录组数据进行研究，从转录组层面探讨exbB基因在变形假单胞菌与斜带石斑鱼互作中的功能，进而揭示了exbB基因对变形假单胞菌毒力的影响，尤其是从物质运输角度对变形假单胞菌毒力的影响。本发明所构建的菌株对斜带石斑鱼的致病力极显著下降，而且能够引起感染脾脏中变形假单胞菌和斜带石斑鱼转录组数据发生显著变化。

Description

一株变形假单胞菌exbB基因稳定沉默菌株及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体涉及一株具有研究变形假单胞菌致病机理价值的菌株。

背景技术

变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼、斜带石斑鱼等海水养殖鱼类“内脏白点病”的病原菌，每年造成的直接经济损失超亿元。exbB基因编码TonB系统的激活因子(TonB-ExbB -ExbD)。早期研究表明，ExbB是ExbB -ExbD-TonB 复合物中最丰富的蛋白，能够稳定TonB和ExbD。TonB系统由固定在细胞膜上的ExbB-ExbD和周质蛋白TonB组成，它为依赖 TonB的外膜受体 (TBDTs)提供能量，并支持重要营养物质的积极运输，包括铁、血红蛋白、维生素B12和碳水化合物。铁在细菌致病性和宿主防御机制中发挥着重要作用，但这一作用往往被低估。在细菌-宿主相互作用中，对铁的争夺对感染结果至关重要。已有相关报道证实了TonB系统与菌株的毒力相关，但关于exbB基因的报道较少。因此, 探明变形假单胞菌exbB基因在病原-宿主互作中的功能能够揭示其对变形假单胞菌致病性的意义。

本发明通过基因沉默技术构建了一株变形假单胞菌exbB基因稳定高效沉默菌株，然后通过人工感染实验确定exbB基因稳定高效沉默菌株对斜带石斑鱼的致病性，并利用dual RNA-seq技术对野生毒株和exbB基因稳定高效沉默菌株感染后的斜带石斑鱼脾脏的转录组数据进行分析，同时对宿主和病原菌的转录组数据进行研究，从转录组层面探讨exbB基因在变形假单胞菌与斜带石斑鱼互作中的功能，进而揭示了exbB基因对变形假单胞菌毒力的影响，尤其是从物质运输角度对变形假单胞菌毒力的影响。本发明所构建的变形假单胞菌exbB基因稳定高效沉默菌株对斜带石斑鱼的致病力极显著下降，而且能够引起感染脾脏中变形假单胞菌和斜带石斑鱼转录组数据发生显著变化，因此该菌株可用于研究变形假单胞菌的致病机理，特别是从病原-宿主互作以及物质运输角度研究变形假单胞菌的致病机理有着独特的优势。

发明内容

本发明的主要目的是提供一株变形假单胞菌exbB基因稳定高效沉默菌株，揭示exbB基因在转录组层面对变形假单胞菌毒力的影响，明确了该菌株的应用范围；

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供的这株变形假单胞菌exbB基因稳定高效沉默菌株的构建技术路线及其功能，

一株变形假单胞菌exbB基因稳定沉默菌株，所述菌株命名为Pseudomonas plecoglossicida exbB-RNAi已于2019年10月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019878，中国典型培养物保藏中心地址为中国武汉，武汉大学。

步骤一：通过比较转录组学分析发现exbB基因在变形假单胞菌脾脏内高表达；

步骤二：合成shRNA引物，退火后连入pCM130/tac载体，通过电转技术导入变形假单胞菌感受态细胞，构建变形假单胞菌exbB基因稳定沉默菌株；利用qRT-PCR技术验证各菌株的沉默效果；

步骤三：用相同剂量的变形假单胞菌野生株和exbB基因沉默株分别感染斜带石斑鱼，明确exbB基因对变形假单胞菌毒力的影响。

步骤四：利用dual RNA-seq技术对exbB基因沉默株和野生株变形假单胞菌感染后的斜带石斑鱼的脾脏进行转录组测序，比较分析exbB基因的沉默对变形假单胞菌和斜带石斑鱼基因表达的影响。

通过基因测序和比对，本发明提供的菌株为一株变形假单胞菌exbB基因稳定沉默菌株，揭示了exbB基因对变形假单胞菌毒力的影响以及在病原-宿主互作中的功能。

exbB基因序列如下（SEQ ID NO.1）：

ATGACACGTACTCAACCTTCCGCTTCGCCAACCCCGTCGCGCGCCTGGCGCGCCATCGCCGCGCTGATGTTCAGCCTGGTGCTGGCCCCGGTGGCCATGGCCGATGAGCCAACTGCCAACGCCAGCGCACCCGCTGCCGCCACCGCTCCGGCAGCCCCGGCCGCCGAAGGCCAGGCACCTGCCGGCGACGCCCAGGCTGCCGTTGCGGCCGACGCCCCGGTAGTGGTGGACCCGGCCACCGAAGCGCTGGTCGAGGACACCTCCCTGGGCATGGCCCACGACCTGTCCCCTTGGGGCATGTACAAGAACGCCGACGTGGTGGTGAAGGCCGTGATGATCGGCCTGGCCATCGCCTCGATCATCACCTGGACCATCTGGATCGCCAAAGGCTTCGAACTGATGGGCGCCAAGCGTCGGCTGCGTGGCGAGATCGCCCTGCTGAAGAAGTCCGCCACCCTCAAGGAAGCCAGCGACCACTCCAACAAGGAAGGCACCCTGGCCCATACCTTGGTCCACGATGCCCTCGAAGAGATGCGCCTGTCGGCCAACGCCCGCGAAAAGGAAGGTATCAAGGAGCGCGTCAGCTTCCGCCTGGAGCGCCTGGTTCACGCCAGCGGCCGTAACATGAGCAGCGGCACCGGCGTGCTGGCCACCATTGGTTCCACCGCACCGTTCGTCGGTCTGTTCGGTACCGTCTGGGGCATCATGAACAGCTTCATCGGCATCGCCAAGACCCAGACCACCAACCTGGCCGTGGTTGCTCCAGGCATCGCCGAGGCCTTGCTGGCCACCGCTCTGGGCCTGGTCGCGGCAATCCCGGCCGTGGTCATCTACAACGTCTTCGCCCGCTCCATCGCCGGCTACAAGGCGCAGGTTTCCGACGCATCGGCACAGGTCCTGCTGCTGGTCAGCCGTGACCTAGACCACCAGGGTAGCGAGCGCGCTGCCCCGCACATGGTG。

本发明的优点在于：

变形假单胞菌exbB基因稳定沉默菌株感染的斜带石斑鱼的死亡率为70%，而变形假单胞菌野生株感染后斜带石斑鱼的死亡率为100%，说明exbB基因是变形假单胞菌重要的毒力基因。

Dual RNA-seq分析结果表明，exbB基因的稳定高效沉默不仅能够显著影响变形假单胞菌的转录组表达，而且也能显著影响斜带石斑鱼的转录组表达，这说明变形假单胞菌exbB基因稳定沉默菌株可用于病原-宿主互作以及物质运输角度研究变形假单胞菌的致病机理。

附图说明

图1：野生型菌株和exbB-RNAi菌株的毒力研究。(A)：5株exbB-RNAi沉默株的exbBmRNA水平。(B))野生型菌株和exbB基因稳定高效沉默菌株的生长曲线。(C)：不同感染组斜带石斑鱼的动态存活率。(D)：不同感染组斜带石斑鱼脾脏的症状。(E)：与野生型变形假单胞菌感染组相比，exbB基因稳定高效沉默菌株感染组的脾脏病原载量。

图2：脾脏中斜带石斑鱼和变形假单胞菌的转录分析。(A)：基于edgeR分析exbB基因稳定高效沉默菌株和野生型菌株感染斜带石斑鱼的脾RNA池的火山图。(B)：变形假单胞菌的火山图。图中每个点代表一个特定的基因。(C)：斜带石斑鱼差异表达基因热图。（D）：变形假单胞菌差异表达基因热图。

图3：感染野生菌株和exbB基因稳定高效沉默菌株的斜带石斑鱼的差异表达基因(DEGs)分析。(A)：DEGs的GO富集分析。(B)：代谢通路图。(C)：DEGs的KEGG通路富集分析。(D):PI3K-Akt信号通路中DEGs表达的热图。

图4：变形假单胞菌差异表达基因(DEGs)分析(A) :GO富集结果。(B): KEGG通路富集结果气泡图。富集因子表示基因集中注释到通路的基因数(样本数)与所有基因注释到通路的基因数(背景数)之比。富集因子越大，富集程度就越大。

具体实施方式

本发明实施例提供的变形假单胞菌exbB基因稳定高效沉默菌株的构建及其功能研究的方法包括以下步骤：

S101：用比较转录组学技术分析变形假单胞菌在斜带石斑鱼脾脏内的基因表达情况，发现exbB基因特异性高表达，就将目标锁定exbB基因；

S102：针对exbB基因序列利用Thermo-fisher Scientific 公司在线shRNA设计工具（http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/），利用在线shRNA设计工具设计并合成了5对shRNA引物，分别连入pCM130/tac构建重组载体，然后将各重组载体分别电转导入变形假单胞菌感受态细胞，成功构建变形假单胞菌exbB基因稳定沉默菌株；利用qRT-PCR技术，引物为（F:5'- AGAACGCCGACGTGGTGGTG-3'；R:5'-TCGCTGGCTTCCTTGAGGGTGG-3'）对沉默效果进行检验；图1A显示了5株exbB -RNAi菌株的沉默效果。其中，exbB -RNAi-382的沉默效果最好，达到89.3%，即为变形假单胞菌exbB基因稳定高效沉默株。

5对shRNA引物序列如下：

引物1：

F:5’-TGATCGCCAAAGGCTTCGAACTTTCAAGAGAAGTTCGAAGCCTTTGGCGATCTTTTTTT-3’；

R:5’-GTACAAAAAAAGATCGCCAAAGGCTTCGAACTTCTCTTGAAAGTTCGAAGCCTTTGGCGATCATGCA-3’；

引物2：

F:5’-TGCCAAAGGCTTCGAACTGATGTTCAAGAGACATCAGTTCGAAGCCTTTGGCTTTTTTT-3’；

R:5’-GTACAAAAAAAGCCAAAGGCTTCGAACTGATGTCTCTTGAACATCAGTTCGAAGCCTTTGGCATGCA-3’；

引物3：

F:5’-TGGGCATCATGAACAGCTTCATTTCAAGAGAATGAAGCTGTTCATGATGCCCTTTTTTT-3’;

R:5’-GTACAAAAAAAGGGCATCATGAACAGCTTCATTCTCTTGAAATGAAGCTGTTCATGATGCCCATGCA-3';

引物4：

F: 5’-TGGCATCATGAACAGCTTCATCTTCAAGAGACATTGCGCTTGAAGAAGTGCCTTTTTTT-3’;

R:5’-GTACAAAAAAAGGCATCATGAACAGCTTCATCTCTCTTGAACATTGCGCTTGAAGAAGTGCCATGCA-3’;

引物5：

F: 5’-TGCATCATGAACAGCTTCATCGTTCAAGAGACGATGAAGCTGTTCATGATGCTTTTTTT-3’;

R:5’-GTACAAAAAAAGCATCATGAACAGCTTCATCGTCTCTTGAACGATGAAGCTGTTCATGATGCATGCA-3’。

S103：利用人工感染实验，对变形假单胞菌野生株和exbB基因稳定高效沉默株的毒力进行对比。

exbB基因稳定高效沉默株、变形假单胞菌野生株和PBS（NaCl 0.8g、KCl 0.02g、Na₂HPO₄0.36g、 KH₂PO₄ 0.024g、H₂O 1L，PH 7.0）分别对三组斜带石斑鱼进行胸腔注射感染，菌株感染浓度为10³cfu/g，每条鱼注射0.2 mL，每组20尾鱼，然后继续正常暂养（在无致病性的实验室条件下，水温18±2℃），并记录每天各组鱼的存活状况。

在注射后8 d，分别对野生型菌株组、exbB基因稳定高效沉默株组和PBS组的生存率进行评估。注射野生型菌株后2dpi时鱼的存活率为77%，5.5dpi时存活率为0%。PBS组斜带石斑鱼在整个实验期间均存活。变形假单胞菌野生菌株的生长速率和菌浓度在培养的24小时（LB培养基，温度18℃）略高于exbB基因稳定高效沉默株（图1B）。与野生型菌株相比，用exbB基因沉默株注射的斜带石斑鱼在死亡时间上表现出明显的延迟和明显的减少（图1C）。注射野生型菌株的斜带石斑鱼的脾脏表现出典型的症状(脾脏表面有许多白点覆盖)，但注射exbB基因沉默株的脾脏表面没有明显的白点(图1D)。野生型毒株与exbB-RNAi毒株感染斜带石斑鱼脾脏内的菌株丰度随时间变化差异较大。总体上，5个时间点细菌丰度比值均小于100%，其中1dpi上两组菌株丰度最接近（图1E）。

S104：利用dual RNA-seq技术对exbB基因稳定高效沉默株和野生株变形假单胞菌感染后的斜带石斑鱼的脾脏进行转录组测序，比较分析exbB基因的沉默对变形假单胞菌和斜带石斑鱼基因表达的影响。

Dual RNA-seq分析结果显示，在mRNA水平上，根据统计标准 (|log2 fold change| ≥1, padj ≤0.05)，斜带石斑鱼共鉴定出1029个差异表达基因。在这些差异表达基因，与感染野生型菌株相比，感染exbB-RNAi菌株组的有535个显著下调，674个显著上调(图2)。变形假单胞菌共获得63个差异表达基因，其中有3个显著上调。它们分别是:L321_RS02705、L321_RS06615和L321_RS12310。这些差异基因的具体表达如图2D所示。

GO分类和KEGG通路分析确定宿主斜带石斑鱼差异表达基因的生物学功能。图3A显示了GO的前20个富集结果。图3B显示了GO DAG图，结果显示了对多种免疫相关和蛋白结合相关的GO项的富集。KEGG富集分析结果也显示DEGs在感染过程中与免疫高度相关，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、ECM受体相互作用和PI3K-Akt信号通路。其中，在PI3K-Akt信号通路最富集的基因是最多。

利用比较转录组的结果进行GO和KEGG富集分析，确定DEG的生物学功能，分析病原菌在感染过程中转录组的变化。图4A为排名前10位DEG的GO项。与野生菌株组相比，富集到大量与鞭毛及鞭毛运输相关的GO项：细菌型鞭毛部分、纤毛或鞭毛依赖的细胞运动、细胞或亚细胞成分的运动、细胞运动、古生菌型或细菌型鞭毛依赖的细胞运动；药物转运，药物跨膜转运。还有一些GO项与蛋白质合成和代谢有关。KEGG分析结果如图4B所示。KEGG富集结果表明，鞭毛组装途径富集，且富集意义显著。与野生菌株组相比，细菌分泌系统途径富集的基因均下调。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 一株变形假单胞菌exbB基因稳定沉默菌株及应用

<130> 13

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacacgta ctcaaccttc cgcttcgcca accccgtcgc gcgcctggcg cgccatcgcc 60

gcgctgatgt tcagcctggt gctggccccg gtggccatgg ccgatgagcc aactgccaac 120

gccagcgcac ccgctgccgc caccgctccg gcagccccgg ccgccgaagg ccaggcacct 180

gccggcgacg cccaggctgc cgttgcggcc gacgccccgg tagtggtgga cccggccacc 240

gaagcgctgg tcgaggacac ctccctgggc atggcccacg acctgtcccc ttggggcatg 300

tacaagaacg ccgacgtggt ggtgaaggcc gtgatgatcg gcctggccat cgcctcgatc 360

atcacctgga ccatctggat cgccaaaggc ttcgaactga tgggcgccaa gcgtcggctg 420

cgtggcgaga tcgccctgct gaagaagtcc gccaccctca aggaagccag cgaccactcc 480

aacaaggaag gcaccctggc ccataccttg gtccacgatg ccctcgaaga gatgcgcctg 540

tcggccaacg cccgcgaaaa ggaaggtatc aaggagcgcg tcagcttccg cctggagcgc 600

ctggttcacg ccagcggccg taacatgagc agcggcaccg gcgtgctggc caccattggt 660

tccaccgcac cgttcgtcgg tctgttcggt accgtctggg gcatcatgaa cagcttcatc 720

ggcatcgcca agacccagac caccaacctg gccgtggttg ctccaggcat cgccgaggcc 780

ttgctggcca ccgctctggg cctggtcgcg gcaatcccgg ccgtggtcat ctacaacgtc 840

ttcgcccgct ccatcgccgg ctacaaggcg caggtttccg acgcatcggc acaggtcctg 900

ctgctggtca gccgtgacct agaccaccag ggtagcgagc gcgctgcccc gcacatggtg 960

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaacgccga cgtggtggtg 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgctggctt ccttgagggt gg 22

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgatcgccaa aggcttcgaa ctttcaagag aagttcgaag cctttggcga tcttttttt 59

<210> 5

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtacaaaaaa agatcgccaa aggcttcgaa cttctcttga aagttcgaag cctttggcga 60

tcatgca 67

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgccaaaggc ttcgaactga tgttcaagag acatcagttc gaagcctttg gcttttttt 59

<210> 7

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtacaaaaaa agccaaaggc ttcgaactga tgtctcttga acatcagttc gaagcctttg 60

gcatgca 67

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgggcatcat gaacagcttc atttcaagag aatgaagctg ttcatgatgc ccttttttt 59

<210> 9

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtacaaaaaa agggcatcat gaacagcttc attctcttga aatgaagctg ttcatgatgc 60

ccatgca 67

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggcatcatg aacagcttca tcttcaagag acattgcgct tgaagaagtg ccttttttt 59

<210> 11

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtacaaaaaa aggcatcatg aacagcttca tctctcttga acattgcgct tgaagaagtg 60

ccatgca 67

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgcatcatga acagcttcat cgttcaagag acgatgaagc tgttcatgat gcttttttt 59

<210> 13

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtacaaaaaa agcatcatga acagcttcat cgtctcttga acgatgaagc tgttcatgat 60

gcatgca 67

Claims

1.一株变形假单胞菌exbB基因稳定高效沉默菌株，其特征在于，所述菌株命名为Pseudomonas plecoglossicida exbB-RNAi已于2019年10月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019878。

2.一种如权利要求1所述沉默菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）通过比较转录组学分析，筛选得到感染过程中脾脏内表达量显著提高的exbB基因；

（2）针对exbB基因序列设计并合成shRNA引物，退火后连入pCM130/tac载体，通过电转技术导入变形假单胞菌感受态细胞，构建变形假单胞菌exbB基因稳定沉默菌株；利用qRT-PCR技术验证各菌株的沉默效果；最终获得变形假单胞菌exbB基因稳定高效沉默菌株。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述exbB基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种如权利要求1所述菌株在研究变形假单胞菌的致病机理中的应用。