CN110938578A - 哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应用。该细胞株为Vibrio harveyi flrB‑RNAi，于2019年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2019316。所述哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株可用于制备防治哈维氏弧菌的药物或疫苗。实验表明本发明的哈维氏弧菌flrB基因沉默株能有效降低哈维氏弧菌粘附能力，对防治鱼病有重要意义。

Description

哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应用。
背景技术
近年来，在中国沿海地区，如福建，浙江和广东，大黄鱼养殖业发展迅速。然而，随着繁殖规模的扩大，各种传染病的发生频率越来越高，尤其是由哈维氏弧菌引起的疾病。哈维氏弧菌(Vibiro harveyi)是一种重要的条件致病菌，是海洋生物的严重病原体，它是导致笼养亚洲鲈鱼死亡的重要病原体。
抗生素是目前水产动物细菌性疾病治疗的主要手段，随着抗生素在治疗细菌性疾病中广泛应用，产生细菌耐药性、导致药物残留等缺点。而大黄鱼自身抵抗力日益降低，病害问题日趋严重，给大黄鱼养殖业带来了较大的损失。因此研究与开发生物药物或者疫苗对防治鱼病有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株及其应用。
本发明是这样实现的：
本发明首先提供了一种哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株，为Vibrio harveyiflrB-RNAi，于2019年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO： M2019316。
本发明还提供了所述的哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株的应用，将所述哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株用于制备防治哈维氏弧菌的药物或疫苗。
本发明具有如下优点：实验表明本发明的哈维氏弧菌flrB基因沉默株能有效降低哈维氏弧菌粘附能力，对防治鱼病有重要意义。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为生物膜形成实验结果。
图2为粘附实验结果。
图3为运动性实验结果。
图4为哈维氏弧菌鞭毛图。
具体实施方式
实施例1构建哈维氏弧菌flrB基因沉默株
哈维氏弧菌flrB基因沉默株的构建方法，包括以下步骤：
1)设计并合成哈维氏弧菌flrB基因特异性shRNA：
F:5-GATCCGCTTGCTACAGTCTCGTATCATTCAAGAGATGATACGAGACTGTAGCAAGCTTTTTTGCATG-3
R:5'-CAAAAAAGCTTGCTACAGTCTCGTATCATCTCTTGAATGATAC GAGACTGTAGCAAGCG-3'
2)将所述shRNA退火形成双链RNA；
退火反应体系为：
Figure RE-GDA0002362279370000021
退火程序：
95℃ 2min
每8s下降0.1℃，降至25℃ 约90min
4℃ Forever
3)提取pACYC184质粒并用BamHI和SpHI酶进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳后纯化回收线性化的质粒。
4)步骤2)所述双链RNA与步骤3)所述回收产物利用T4连接酶进行连接，并热激转化至大肠杆菌DH5α中。利用含有34mg/mL氯霉素的LB 培养基平板筛选，筛选获得的菌株进行测序验证，测序所得序列含有特异性 shRNA即为连接成功。
连接反应步骤如下：
A、按以下体系配制连接反应混合液：
线性质粒 2μL
shRNA 5μL
Solution I 7μL
B、16℃反应3小时后立即用于转化实验。
5)从步骤4)所述大肠杆菌SM10与野生株哈维氏弧菌进行接合实验，供受比例为5:1(将重组载体导入菌株是制备沉默株的难点，将供受体菌比例控制在合适的比例，可以提高导入的成功率。但是导入过程并非完全可控，导入成功还需要一定的偶发性，因此该沉默株的构建过程并不是可重复实现的)制备哈维氏弧菌flrB基因沉默株，同时，将原始pACYC184质粒接合转化进入哈维氏弧菌制备对照菌株。根据pACYC184质粒携带的氯霉素抗性，用含34mg/mL氯霉素的TCBS平板筛选携带pACYC184质粒的哈维氏弧菌，16s rRNA测序后经NCBI比对确定筛选所得菌株为哈维氏弧菌。
实施例2生物膜形成实验
先将过夜培养的哈维氏弧菌cheA基因沉默株和对照株的OD550调整到0.2左右，并将100μl菌液加入96孔酶标板。28℃孵育24h后，用无菌PBS洗脱两次除去未粘附于孔板上的菌，60℃烘干后加入 125ul 0.1％结晶紫室温染色15min，之后再用PBS洗三次孔，加入200uL 33％(v/v)冰乙酸，用酶标仪测OD590。实验重复两次，每组实验作三次平行。
生物膜形成实验结果：稳定沉默的菌株flrB-RNAi的生物膜形成能力显著降低，野生株OD590值为0.68，cheA基因沉默株为0.33。如图1所示。
实施例3粘附实验
将大黄鱼粘液(20μL)均匀地加入载玻片(22mm×22mm)中并在室温下用甲醇固定20分钟。使用无菌PBS将细菌悬浮液调节至OD 600＝0.3 (3.0×10 8CFU/mL)的终浓度。将200μL细菌悬浮液均匀涂布在涂有粘液的载玻片上，然后在28℃下孵育2小时，用PBS洗涤三次。用4％甲醇固定细菌30分钟，细菌用1％结晶紫染色3分钟。然后在光学显微镜(× 1000)下检查载玻片，选择20个显微镜视野，计数细菌。无菌PBS用作阴性对照，对照菌株V.harveyi用作阳性对照。每组进行三次试验。
粘附实验结果：野生株粘附量为1081.22cells/field of view，沉默株为458.67cells/field of view。如图2所示。
实施例4运动性实验
将过夜培养的哈维氏弧菌在LB中调节至OD600＝0.3，将1μL悬浮液滴加到LB平板(0.3％琼脂)上，并将平板在28℃温育24小时，对照菌株 V.harveyi用作阳性对照。测量菌落直径。每组进行三次独立的生物学重复。
运动性结果：野生株菌落直径22.17mm，沉默株为12.36mm。如图3所示。
实施例5鞭毛合成能力实验
用透射电子显微镜观察哈维氏弧菌鞭毛。将野生型哈维氏弧菌及flrB 基因沉默株，进行三次纯化培养，使用无菌牙签轻轻刮取平板上的菌落，并重悬于无菌PBS中，将铜网置于菌悬液中5min，转移到2.5％戊二醛中固定 5min，用去离子水清洗铜网两次，于1％钨酸中染色1min，自然干燥，用透射电子显微镜观察细菌鞭毛。每个样品随机选择6个图像并使用Osiris 4.0 软件测量鞭毛长度。每组进行三次独立的生物学重复。
野生株的鞭毛长度为4.77μm，沉默株为2.49μm。如图4所示。
由实施例2-5可以看出，粘附实验结果中，沉默株能力下降，其余均为与粘附相关的功能，沉默株能力也同时下降了。其中鞭毛合成能力实验中，由于flrb基因是鞭毛基因，沉默株鞭毛合成能力降低，说明沉默结果可信，此外，鞭毛是细菌的运动器官，可以调节粘附能力，鞭毛缺失导致粘附能力等其他功能的下降。以上均说明了本发明的哈维氏弧菌flrB基因沉默株能有效降低哈维氏弧菌粘附能力，可用于制备防治哈维氏弧菌的药物或疫苗。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (2)

1.一种哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株，其特征在于：为Vibrio harveyi flrB-RNAi，于2019年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2019316。
2.如权利要求1所述的哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株的应用，其特征在于：所述哈维氏弧菌flrB基因沉默细胞株用于制备防治哈维氏弧菌的药物或疫苗。
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