CN109825464A - 敲除t6ss-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供敲除T6SS‑1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗，属于动物疫苗技术领域，包含杀香鱼假单胞菌基因组其中一套VI型分泌系统基因簇的敲除株，其构建方法为：采用重叠PCR途径获得T6SS‑1基因簇上下游序列的拼接片段；将拼接片段连接到pK18mobSacB上构建成敲除载体及将敲除载体化转至感受态大肠埃希菌中，并通过接合的方式将敲除载体转移至杀香鱼假单胞菌细胞中，进行两次同源重组交换实现靶基因的敲除。本发明将T6SS‑1基因簇敲除而实现减毒的杀香鱼假单胞菌减毒疫苗，其相对于野生株毒力显著减弱，同时保留良好的免疫原性，对接种鱼类宿主具有良好的免疫保护作用，并且敲除株的毒力不发生回复。

Description

敲除T6SS-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗

技术领域

本发明属于动物疫苗技术领域，具体涉及敲除T6SS-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗。

背景技术

假单胞菌属细菌广泛分布于土壤、淡水、海水以及生物体中.生长温度范围较广，可在4～43℃生长，大多数菌的最适温度在30℃左右，生长最适pH值在7.0～8.5范围内。杀香鱼假单胞(Pseudomonas plecoglossicida)是一种革兰氏阴性菌，隶属于变形菌门、γ-变形菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科、假单胞菌属、恶臭假单胞菌组。该菌可感染多种重要的经济养殖鱼类，包括香鱼、大黄鱼等，其感染大黄鱼后可引起“内脏白点病”。该病在我国主要大黄鱼养殖区域均有流行，病原菌感染高峰期在每年秋冬降温期，发病高峰期在次年春季升温期间，具有流行区域广、感染性强、死亡率高、潜伏期较长和水温偏低(18～22℃)时发生等特点。患病的大黄鱼主要临床症状包括肝、脾、肾等会出现大小不一的白色结节性病灶，累计死亡率可高达40～50％，严重危害大黄鱼养殖业的发展。因此，香鱼假单胞菌作为致病菌对海水鱼类养殖生产已构成潜在威胁，应引起高度重视。目前，大黄鱼“内脏白点病”的预防主要以拌料投喂化学药物为主，尚未有商品化疫苗的使用。因此相关的水产疫苗研制工作可不容缓。

接种疫苗的基本目的是诱导鱼体产生免疫记忆，从而提高机体对入侵病原菌的抑制作用。鱼类疫苗种类繁多，从目前已知的鱼用疫苗来看，按其性质和成分可划分为单价疫苗、多价疫苗以及联用苗。按病原的性质种类又可以将其划分为病毒性疫苗、细菌性疫苗、寄生虫疫苗。第三种分类方式为制备工艺，疫苗被分为活疫苗、代谢产物疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗以及生物技术疫苗(包括基因工程亚单位疫苗和合成肽疫苗)。

基因敲除是一种基因修饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过改造令特定的基因功能丧失，并研究其可能对相关生命现象造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。通过基因敲除，既可以实现用正常基因敲除突变基因以进行性状的改良和遗传病的治疗，也可以用突变的基因敲除正常基因，以研究基因在发育和调控方面的作用。目前，用于基因敲除的方法主要有以下方法：(1)利用基因同源重组进行基因敲除；(2)利用随机插入突变进行基因敲除；(3)RNAi引起的基因敲除。其中，同源重组是多种生物体内普遍存在的一种生理现象，它是生物体用于纠正自身(DNA复制过程中产生)或因外界因素诱导所致DNA突变的一种内在机制，其在基因敲除中应用最为广泛。而细菌基因敲除技术的发展使得我们能对细菌基因组进行遗传改造，构建减毒疫苗菌株。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种相对于杀香鱼假单胞菌野生株毒力明显减弱，具有良好的免疫原性，对接种过疫苗株的大黄鱼具有较好的保护效果，毒力回复不发生回复的敲除T6SS-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

敲除T6SS-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗，包含杀香鱼假单胞菌基因组其中一套VI型分泌系统(T6SS-1)基因簇的敲除株，即为包含杀香鱼假单胞菌T6SS-1敲除株，大黄鱼致病杀香鱼假单胞菌菌株中具有两套具有活性的VI性分泌系统(T6SS-1和T6SS-2)，细菌的VI型分泌系统(T6SS)是一种接触性依赖分泌系统，该系统可能在细菌介导细菌对宿主毒力以及菌间竞争中发挥了重要作用，其中一个VI性分泌系统(T6SS-1)的缺失，可显著降低杀香鱼加单胞菌对大黄鱼的毒力水平，同时T6SS-1基因簇的完整功能涉及多个基因，所以通过敲除T6SS-1的减毒株作为疫苗候选株，可以最大程度的避免回复突变的可能性，保证接种动物的健康和安全。本发明杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗为将T6SS-1基因簇敲除而实现减毒的杀香鱼假单胞菌疫苗，其相对于杀香鱼假单胞菌野生株毒力明显减弱。表现在实验感染大黄鱼死亡率上，在宿主体内存活能力较野生株显著减弱。但同时T6SS-1敲除株仍具有较好的免疫原性，对接种过疫苗株的大黄鱼具有显著保护效果，并且敲除了多个基因，最大程度避免了毒力回复的可能性。

优选地，杀香鱼假单胞菌T6SS-1基因簇包含17个基因，其氨基酸序列如SEQ IDNO:9-25所示。即为基因tssA至tssM，参见图1所示。

优选地，敲除株通过敲除杀香鱼假单胞菌基因组其中一套VI型分泌系统(T6SS-1)，或敲除T6SS-1基因簇所包含的单个基因或其组合获得。

优选地，敲除株是通过杀香鱼假单胞菌T6SS-1基因簇敲除包含PK18mobSacB质粒和中间去掉T6SS-1编码基因簇同时保证阅读框不发生变化的T6SS-1基因簇上下游序列SEQID NO:7和SEQ ID NO:8。SEQ ID NO:7序列片段包含了T6SS-1基因簇上游序列和基因tssA的前3个密码子的编码序列，SEQ ID NO:8序列包含了T6SS-1基因簇下游序列和基因tssM的最后2个密码子的编码序列。

本发明的另外一个目的在于提供一种能够准确敲除杀香鱼假单胞菌T6SS-1基因簇的敲除载体及其构建方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

上述敲除杀香鱼假单胞菌T6SS-1基因簇用敲除载体，其特征在于：包含pK18mobSacB和构建的用于敲除基因用的pK18mobSacB-ΔT6SS-1质粒中包含的T6SS-1基因簇上下游序列SEQ ID NO:26-27。

上述敲除杀香鱼假单胞菌T6SS-1基因簇用敲除载体的构建方法，包括，

采用引物为SEQ ID NO:1-4所示序列的PCR扩增；

克隆至中间载体pMD18-T中进行增殖；以及

限制性内切酶XbaI和HindIII组合酶切后采用T4DNA连接酶连接制得。

本发明的最后一个目的在于提供一种敲除了多个基因，获得T6SS-1缺失的杀香鱼假单胞菌减毒疫苗株的敲除株的构建方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

上述敲除株的构建方法，采用双交换同源重组的方式对杀香鱼假单胞菌的T6SS-1基因簇进行敲除。

优选地，构建方法的具体步骤为：

采用重叠PCR途径获得T6SS-1基因簇上下游序列的拼接片段；

将上述拼接片段连接到pK18mobSacB上构建成敲除载体pK18mobSacB-ΔT6SS-1；及

将上述敲除载体pK18mobSacB-ΔT6SS-1化转至感受态大肠埃希菌S17-1/λpir中，并通过接合的方式将敲除载体转移至杀香鱼假单胞菌细胞中，进行两次同源重组交换实现靶基因的敲除，利用PCR方式筛选鉴定获得敲除株。

优选地，重叠PCR用引物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。

优选地，PCR方式筛选用引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQID NO:6。

本发明敲除株的构建方法首先设计两对引物，其序列分别为SEQ ID NO:1-4，分别扩增T6SS-1上下游各约800bp左右片段，由于两对引物中的内测交叠引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)有29个碱基的重叠，所以可以采用2条外侧引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4)对上述PCR产物进行交叠PCR，获得去除了T6SS-1基因簇序列的DNA片段。将PCR产物连接到T载体上，再经Xba I和Hind III酶切后，使用T4连接酶连接到经同样酶切的敲除载体pK18mobSacB，将连接产物转化大肠埃希菌S17-1/λpir，在含50μg/ml卡那霉素培养平板上筛选阳性克隆，对获得的阳性克隆进行PCR测序鉴定。将载体通过接合方式转移至受体菌中，采用含50μg/ml卡那霉素和35μg/ml氯霉素的平板进行筛选。将获得的整合体细菌(敲除质粒处于整合在受体菌基因组中的状态)转接到抗生素液体LB中培养，培养后涂布到含有10％蔗糖的LB平板进行第二次筛选，对获得的重组菌株进行PCR扩增(SEQ ID NO:5和SEQID NO:6)，PCR产物经琼脂糖电泳分析，筛选敲除株(若为T6SS-1敲除株将无扩增产物，野生型获得扩增产物片段大小为593bp)。筛选到的敲除株进行进一步的PCR(SEQ ID NO:7和SEQID NO:8)测序验证。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明中采用双交换同源重组的方式对杀香鱼假单胞菌的T6SS-1基因簇进行敲除，从而获得T6SS-1缺失的杀香鱼假单胞菌减毒疫苗株。菌株具有动物安全性，免疫效果试验结果证明本发明所构建的疫苗具有良好的免疫原性，对接种过疫苗株的大黄鱼具有较好的保护效果。

本发明采用了上述技术方案提供敲除T6SS-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1是杀香鱼假单胞菌T6SS-1基因簇基因排列示意图；

图2是T6SS-1基因簇敲除的过程示意图；

图3是野生型菌株、T6SS-1缺失突变株生长曲线。

具体实施方式

下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。

试剂材料：

一.实验中所用试剂

LB液体培养基：氯化钠1％、胰蛋白胨1％、酵母浸出物0.5％，121℃高压蒸汽灭菌；

LB固体培养基：氯化钠1％、胰蛋白胨1％、酵母浸出物0.5％、琼脂糖1.5％，121℃高压蒸汽灭菌；

Ex Taq DNA聚合酶：Takara公司产品；

限制性内切酶：NEB公司产品；

T4DNA连接酶：NEB公司产品；

DNA提取试剂盒：诺唯赞公司产品；

质粒提取试剂盒：Omega公司产品；

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：Omega公司产品；

PCR产物回收试剂盒：Omega公司产品；

各抗生素试剂：Solarbio公司产品；

引物合成和DNA片段测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；

卡那霉素培养基即在普通LB培养基上加入终浓度50μg/ml的卡那霉素；

氯霉素培养基即在普通LB培养基上加入终浓度35μg/ml的氯霉素；

氨苄青霉素培养基即在普通LB培养基上加入终浓度100μg/ml的氨苄青霉素。

二.所有主要仪器：

PCR仪：Bio-Rad T100；

恒温培养摇床：上海一恒THZ-100；

恒温金属浴：杭州米欧仪器有限公司；

恒温水浴：上海一恒DK-8D；

高温高压灭菌锅：YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器；

凝胶成像仪：Bio-Rad Universal Hood II；

电泳仪：上海天能EPS-300型电泳仪；

冷冻离心机：Eppendorf Centrifuge 5430R。

实施例1：

杀香鱼假单胞菌T6SS-1敲除株的构建

T6SS-1基因簇敲除的过程示意图参见图2，首先，采用重叠PCR途径获得T6SS-1基因簇上下游序列的拼接片段(中间去除T6SS-1的编码基因，保留首个基因tssA前3个密码子和末位基因tssM最后2两个密码子，保证阅读框不发生变化)，连接到pK18mobSacB(pK18mobSacB质粒特征参见“Gene”,1994年145卷第1期，69-73页)上构建成敲除载体pK18mobSacB-ΔT6SS-1，化转到感受态大肠埃希菌S17-1/λpir中，复制、增殖、提取质粒后，进行PCR及测序鉴定。具体步骤如下：

(1)重叠PCR：以T6SS-1上下游序列为模板设计两组引物P1和P2、P3和P4(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示，其中P2和P3有一段互补序列，然后分别进行PCR扩增反应，T6SS-1基因簇所包含的片段如SEQ NO ID:8所示；

其中，PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增反应条件设置为：

将上述两个PCR反应产物分别采用PCR产物回收试剂盒进行纯化，标记为PCR-UF和PCR-DF。因引物P2和P3有29bp长度的互补序列，所以再利用PCR-UF和PCR-DF为模板做交叠PCR，反应体系如下：

反应条件设置：

(2)将所得PCR产物电泳切胶回收，并取回收产物1μl、pMD-18T载体1μl、连接缓冲液5μl(含T4DNA连接酶)以及ddH₂O 3μl，混合后于16℃条件下过夜连接，化学转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素培养板上筛选阳性克隆，PCR测序鉴定。克隆成功的质粒标记为pMD-ΔT6SS-1；

将pMD-ΔT6SS-1和pK18mobSacB分别做双酶切，体系如下：

将两个酶切产物跑凝胶电泳回收(pMD-ΔT6SS-1酶切产物仅回收1.6kb片段)，分别标记为R1和R2。用R1和R2作底物进行酶连构建敲除载体，记为pK18mobSacB-ΔT6SS-1，具体反应体系如下：

反应条件：16℃金属浴过夜。

(3)将pK18mobSacB-ΔT6SS-1化转至感受态大肠埃希菌S17-1/λpir中，复制、增殖后提取质粒，进行酶切和PCR测序鉴定；

1)酶切体系：

2)PCR扩增反应体系：

PCR扩增反应条件：

3)PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，序列结果与基因组中序列片段比对。

参见图2第二个步骤，将经测序确认的敲除载体通过化转的方式转移至杀香鱼假单胞菌致病株中(野生株XSDHY-P，参见“Microbiology Resource Annoucements”,2018年第7卷第13期)，该菌株能在氯霉素平板上生长，但不能在含有卡那霉素的平板上生长，同时载体pK18mobSacB无法在杀香鱼假单胞菌中复制，因此只有当载体整合到野生株的染色体上，该菌株才能在抗生素选择性平板上生长，挑选单菌落进行PCR测序鉴定。鉴定正确后菌株记为整合株。

挑选单菌落做PCR鉴定，并同时送测序：

PCR扩增反应体系：

PCR扩增反应条件：

PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，序列结果与基因组中序列片段比对。

参见图2，为获得目标基因缺失敲除菌株，将鉴定后的整合株转接至无抗生素LB液体培养基中培养，培养后涂板筛选发生染色体内同源重组突变株。sacB基因菌的负筛选标记，带有sacB基因整合株在蔗糖培养基无法存活，所以生长出来的菌落均为发生了染色体内同源重组，丢失了载体序列的重组菌株。

染色体重组有两中可能的结果，其中一部分菌株可能产生目标基因敲除菌株，另一部分回复突变成野生型，可以通过PCR方式筛选鉴定获得敲除菌株，共两个PCR反应。

PCR扩增反应体系：

反应条件：

引物组合P1、P4所得琼脂糖电泳结果为敲除株条带为1.6kb左右，而野生型由于目标片段太长则无扩增产物；引物组合P5、P6所得琼脂糖电泳结果为敲除株无扩增条带，而野生型的扩增条带为约600bp。

获得的重组菌株进行PCR测序鉴定，引物P7、P8(SEQ ID NO:n和SEQ ID NO:m)分别为P1和P4的外围引物。

PCR扩增反应体系：

反应条件：

所得扩增产物的电泳条带约为2kb，而野生型由于目标片段太长则无扩增产物；PCR产物测序鉴定。

实施例2：

T6SS-1敲除株与野生型生物学表型的比较

以LB培养基分别培养T6SS-1敲除株(疫苗株)与野生株，绘制生长曲线，比较两者之间生长状态的差异。参见图3，T6SS-1敲除株与野生株生态趋势基本同步，均在18个小时培养后进入稳定期，但敲除株在进入稳定期时A₆₀₀值更低。

实施例3：

疫苗株与生野生株的毒力比较

采用注射感染原宿主(大黄鱼)模型评价疫苗株与野生株的毒力。分别收集指数生长期个菌株细菌细胞，设置4个浓度梯度，分别为2.0×10⁴、2.0×10³、2.0×10²、2.0×10¹CFU/尾，每组15尾大黄鱼(体重54.3±2.6g)，并设置PBS空白对照组。将调整好浓度的各细菌悬液通定量注射至大黄鱼腹腔内进行感染；感染水温设置在20±2℃，注射后连续观察2周，记录个动物死亡情况，使用统计学模型计算各菌株的半数致死量(LD50)，结果如表1所示。表1显示疫苗株的毒力较野生株显著地降低。毒力降低的原因可能与T6SS-1分泌系统相关联的某些效应因子能协助杀香鱼假单胞菌的免疫逃逸有关，但具体作用机制不明确。

表1.杀香鱼假单胞菌野生株与疫苗株的LD₅₀

菌株	描述	接种途径	LD<sub>50</sub>
				YSDHY-P	野生株	腹腔注射	3.1×10<sup>1</sup>CFU
YSDHY-P01	疫苗株	腹腔注射	1.9×10<sup>6</sup>CFU

实施例4：

疫苗株免疫保护力评价

收集指数生长期的野生株并重悬在PBS缓冲液中，设置3个感染剂量：2.0×10⁴、2.0×10³CFU/尾大黄鱼；每个感染剂量组包含8尾经注射免疫3周大黄鱼(62.1±3.8g)，PBS对照组8尾大黄鱼的感染剂量为2.0×10³CFU/尾，统计注射感染1周内大黄鱼死亡情况，感染水温设置在20±2℃，结果如表2所示。表2显示，经接种杀香鱼假单胞菌免疫株后，大黄鱼对野生株感染的耐受水平显著提高，证明疫苗株的免疫接种对大黄鱼具有良好的免疫保护作用。

表2.杀香鱼假单胞菌疫苗株免疫效果

免疫接种组别	野生株剂量	死亡率(％)	存活率(％)
				YSDHY-P01	2.0×10<sup>3</sup>	0.0％	100.0％
YSDHY-P01	2.0×104	25.0％	75.0％
				PBS	2.0×103	87.5％	12.5％

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 敲除T6SS-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagacctct cccgttttca gg 22

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgtgtgtt tttgcaatga caagttagtt gggcacg 37

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actaacttgt cattgcaaaa acacacagca gtacaaagcg 40

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caagcatgtt gaggcgagtg g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgcgaaata ctcttgcagg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acggctactt gaaggtgtgg 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcgtcgaag cgaaacgggc attgt 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atagcgtgcg ggtcggttgg tcctt 25

<210> 9

<211> 1560

<212> DNA

<213> tssA基因(tssA)

<400> 9

ttatccttgc gacgctatcc ctccatgggt caagcgccag aaggccggca agtccattgc 60

caccaattgt tcactgccca aggccctgaa gccgccttca cggtattgca gcgtcaactc 120

cagcaatggc cgaagcaact caggctccca acggtccacg ccccgctcca gggcctcctg 180

aatgattaca tccagcacca accgtagttg cggcttcggg tcgaaacggt gcagcagctc 240

acactgagca cggcgcaggc gaaaacgatc acgaccagtg ctgagccctc ccaaatgcac 300

atgcaatgat tgcaatgcac tgtcaaggcg ccccattacc gcctcagcgc cggcctcgtc 360

gatcatcgcc ccgatggcgt caccccgctc agcctgcacg ggagcagggg atatcgcctc 420

caaccagctc agtgtggcac cgtcggcgaa tggcacaccc gatgcgaact tcaactcggc 480

caacccaggg aggcgcgcca tcaaatgccg cacctccaag acgacgctgg ccgcggctga 540

ccctccgtcc gggcctaact ccaacagcgc cgcatggcac acgcgattta gctcaagcca 600

atagggatag gtcagtaagc gagactcgca aaactgcaca atggccaacg ccgaccccgc 660

tgaccgtatc gcggcaaagg cctttacctg agaattcggt ggcggcggaa tacgcgtgat 720

gttctgctgc gccggaggct ccgcctccaa cgtcacccaa gccacttgtc gatttatccg 780

aaacaacatt gccggcgggt agtcgccctg aaggcccaat gggatcaagg cccccaatga 840

gtgcaagccc tcctctatgg ctcgcacaac ccctttcgca tccatattct cgggatgcac 900

acgcacaagt tcaggcgctg gcgctggggc cgagatcggc tcattgcact gcaagggcat 960

ctgctcatcc ccagacagag ccgatgaggg ctctgccgcc ggcgatgcca ccacgaggca 1020

ctcttgctca accggcaggc tcgccaaaca gcgtcgcaag cgaaagaatc ccggcgactg 1080

ggcatcacgc tcagaccaga tctcttcaag ggcatcccag tccgccagaa gcccttcgat 1140

acattccggc atcacaggat cgctaccttt actcaacgcg cgatccaacc aatcgagcat 1200

ccactcgatc tggccgcggc gtgcacgtac acgcgcctct ggcggagtaa gttcagccca 1260

atagtgctgc aacaaatcgc gcagcactcg gactccggaa cgcaagcctg ttacaccatg 1320

caacgaatac caagcgcata acaaccacac agctgcgccg agatccttac cctcctcacg 1380

cagcacactg acacacgagg tggatacttt cacccaatcg accgcctcac gcgcattaat 1440

gttattgagc ttttcaactt ctgcttgcgc cagtagataa gccgccccct cgcgcgcatc 1500

gacacctgct gccgatgggc ccgcaatcgc gacccggcca acttcatcat ccaataacat 1560

<210> 10

<211> 510

<212> DNA

<213> tssB基因(tssB)

<400> 10

tcactcatta ggttgttctc cttgcgctac gcccaactcc gccagcaaac gctcgcgcga 60

accctcatcg ctgaccagac cttgcagctg cttacgaaac tccggcaagt tccccagcgg 120

gcctttcagc gccttcaacg agttacgcaa cgcaataagc atttgaagtt ctggcacttg 180

ggcaacaact gaatcgggtt cgaaatcgct tagcgactca aactgcaaac gaacaggcag 240

acactcgtct tcgctgacgc tttcgcaaag acggttaggc actgccattt ccagcgtcaa 300

gccttgcgcc ttcatgactt cgccaaagtt gtctttgtcg acacgaatag gtttgatgtc 360

ttcaaccggc gtgctgtctt ccttcagcgt aaagtcaccc actaccagct gcttgagcgg 420

cagctcgacc tgctctttgg catcgccgat atcaggctta tatacaatgt ttacacgctc 480

tttgggcgca accgaaccgt cactcgccat 510

<210> 11

<211> 1485

<212> DNA

<213> tssC基因(tssC)

<400> 11

tcaagactta tcgagcttcc cgaccaaaga caatgtaaaa gatgcaccca tgtacttgaa 60

atgagggcga actttcaagc taacccgata ccaacccgga tcaccatcca catcgctcac 120

gatgacctgc gcctggcgca aaggacgctg gctgcggacg tccgcaacgg ggttatccat 180

gtctgccacg tattggcgaa tccacgtatt gagctcggac tcaagatcac ctcgctcttt 240

ccaggtacca atattttcgc gctgaataac tttgatatag tgagccaggc ggctgaccac 300

aaaaatataa ggcaactgtg tacccagctt ataattgagc tcagcggcct tgccttcttt 360

atcaccaccg aaatattttg gtttctggca cgagttcgcg gaaaagaacg ccgcgttatc 420

cgaattttta cgcatggtca agccgatgaa accttgctcc gccagctcaa actctcgacg 480

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gtaaatcggt aaatcaccga ccgcaccacc gccctgtggg ccaatgacgt tggcacacca 600

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cgtattctcc gcgtaaggtg tacgcagcag gaaattaggc agcgtcaacc cgacaaagcg 780

cgaatcatcg ctctcccgaa atgcattcca cttgatgtac tgagggcctt cgaacatcgc 840

cttcaggtct ttcagattgg gcaactcgga aaagctgtcg acgccaaaga actgtgggcc 900

cgctgctgcg ataaacggtg cgtgtgccat ggcaccgagg gcagcagcat attgcaaaag 960

cttgatgtcc tgctgacctg ggccgaacga atagttggcg atgatcgaac cgatcggttg 1020

cccgccaaac tgaccaaact cagcactgta caccgacttg tacaaacccg aacgggtaat 1080

ctctggcgca tcctcaaagt cctccagcag cttctgcttg gacacattga gaatttccaa 1140

tttattgttt tcacgaaaat ccgtgcgatc gaccaaaaac ttcaaagagc gccacgccga 1200

ctccaacgtc tgaaattgtc ggtcgtgcag aatcgcatcc acctgacggc agagcttggc 1260

atcgataccg gcaatcatct catcgatcaa acccgcactg actttctctg tttgccgtgc 1320

cggctccagc aactccgcca cgaacgcctc gagcccttga cgggtaaccg cgtacgcctc 1380

atcgtcaggc ttgatacggg cagcctcgac caattgatcg agcaaggtac ccgactcact 1440

cagttgttca gtggccgccg tcgcttctgt ttgcgcctca ctcat 1485

<210> 12

<211> 486

<212> DNA

<213> tssD基因(tssD)

<400> 12

ttacgttcga ttgcgaatat catcaaccgt tgaaatacca ccatcaaccc atgtatcagt 60

agtgacctta cagttaaaag taatacgctc catatgccct gacaacgcgt cctcattcga 120

cgcaccacta tccagaaact cttgacggtt agagattact ccaccctgaa gttttttggt 180

gtaaaagacc tcctctacgc ccttcttttt attgatccac atatattcca gcagcacctc 240

acaagcctca cccttattaa atgcctgaat caacagcggc gtagccggat cgagctcttt 300

gaccacggtg acacccttat gctgacgctg ggaaaccgct gtaccggttt gctggtgcac 360

cttaacttcg gactcgctaa ccacctcaaa cactcgaatt ttttctttat gaccctcttc 420

ttcgaccccc cctttaaact gcccttgtgc cgcgccagtt acggtcatat aaataggaaa 480

tgccat 486

<210> 13

<211> 420

<212> DNA

<213> tssE基因(tssE)

<400> 13

ttagcgcatc gacagcgaaa cacggccatc cgaagacact cgggtggcaa gatgtaaggg 60

catatcgcga tcgttgatcg aaacgacccc gctaaggcta aagctcagcg atagcacttc 120

ctgagcatct tcccccatga caatgcgcgg tgacttcagc cggggttcat agcgtgcgac 180

catgcgggta atgttttcga tcatttgaga cgtctcgcct gtaacaaaag aacctgcaag 240

gtttgtaaaa tcgggaacac caaattccgg gtcgatcaaa acagtaccct ggcgcgtatt 300

aagtatgcgt tgcaggtgct gtagaattga ttgcgtcaac acctctactt cgctcacacc 360

cgagcgctgt tgagaggttt cggatatcac gattcgctct agcagccgcc tatcgcgcat 420

<210> 14

<211> 1716

<212> DNA

<213> tssF基因(tssF)

<400> 14

tcaaagaatc cgctgcttgc ctatctttgc cggccatttc aacgtctcat aggtaacact 60

gtcgaaaaga ataaaagcgg taaaacaatt tattgcagcg cagccagcga agaactcatc 120

gagcaagcaa ccaaacagat aaaggctgcc gttgttgctg aaatgatccc cccggcagtc 180

aacccgaacg acgctaccat cgacgggcag tccgcgaatg aaccgtcgct cggtgctcac 240

cgacacgttt tcaattgaat cgatgagtcg ctggttgcca tcttgaacat gctcgcccag 300

cgtgggcagg tacagtgaca acaatgcttt caggtaaccg caatcagcca aacgaaagtg 360

attggtattg agttgcgaca gcactcgcca tagcaacctt gaatcgaacc ttggcggctg 420

gaacggcgta atacctcgaa tgttcttgaa ctcaagcctt ggcggcgcgt tatcacccgg 480

ttggcttaga tcccccagcc gcaagttctc cgccaacttg ccattggtgc acaatagccc 540

ggcagacaag gtgacttcac tgaggtcggc gtcgacgctg taaggaaggc tcaggtaatg 600

gtcatagccg tgcacgtcaa cgctcgatgc gcgaatggtg aggtggtaga catcacgcgc 660

ggcaaaagcg tcgaacggtt tgagccgctt ttcgatgcca ctggcggtgt agcaatcgac 720

cttcgtcacc gaatgaatac gtacactcac gcgctgccca tgatcaatcg gttgcacccg 780

gtactcggga tagcgatggt ccacttttat cgggtgcgcc tcatgctcga acaaattcac 840

tgccggcgtt accccgagca tgaaactgtt ggcgctcacc cctggcgccc actcgggcac 900

actgtcgaac gtcaggcgca cgctgaaggt accgtcgtca ccacgggctc gccactgtgt 960

aaacccggaa agctccatga atagaaactt ttctggcagc gcgaaatact cttgcaggta 1020

tcgatacgcc ggatgcgcat tatccggaaa cggcaacagg cccttgtcgt cgtcaaaacc 1080

cactgcacgc agatggtcag gcgttaactg cgtcaatggc tgacccgccg cgaaaataga 1140

aacattccgc aaatgaagtt gtaacaatcg cagcagcttg gcggcctcgg ccaaaccatc 1200

acctaaatac agcatcaggc tatccgccgc ccaaaggctg gggttggcgg tggtgaaccg 1260

aaaatccaga accaagctgc gcgcctcgcc gctggaaccg tcccagcgag tgctcacgag 1320

ctgcacaggc tgcaaatcga ccgccagcgt gctgcgaaag cgtaagcgct ggccatctac 1380

cggcaccgat gtgacttcgc aaccagcggc cacctgcatg ggctcctcca acggcatgcg 1440

cggctggagc tgcaccaagg tcatgcaggg caacggttgc aggtaatgcg ggtaaagcaa 1500

ctgggccaac ggctgaacga actcggaaaa atcatcatcc aaacgttggt gcaccatgcc 1560

ggtcaggaac gccacacctt caagtagccg ttcgacatcc gggtcgctgg cagcatctgc 1620

gcccagcaat ggggccaacg cggggttggc atgggagaac tcgtcagcca gctggcgtag 1680

acgtcccagt tcactttgat aatagcgatt gagcat 1716

<210> 15

<211> 1011

<212> DNA

<213> tssG基因(tssG)

<400> 15

tcatgacctg gcccctgtgc cggatagcga ccgattttca gtgctcaaca taaaactgac 60

ctcatcttta acgtgtgtcc cgccaagcca ggtattacga cctaagcggt ggcgatgcgc 120

gcccagtaca acaatttgac gctccacggc attgacgcaa atgaccaagc gcacccgtag 180

agacgcctgc agatacaaga acactgtctg ctgcagtttt ttgaatagcg cttgacccgg 240

cagcaactga tgaaagcgct cggcgcacaa tgggccaact cgaatctcca gcgcgccacg 300

tcgatcgacc acctcaacgc cgataacaga gtcctcaccg agcacaccac actgcacgcc 360

gagataagtt cgcgcgggct catcgatggc cacaggcatt tcaacgcacg gcactacttc 420

gaccgattta tcgtccagca ctgccctgag caattgttgc aaccccaacg ccgagcgcgg 480

atattggttg aacaaaccgg cgtaacgcag caaatcgatc gattgtgcgc gaacagtgga 540

gccggccccc gccaacccga gcaacgcgtg caagtaatgc aggcttttac ccccgggacg 600

ctcgctgatt gcactccaga tgcggtgctt ttgccaggcc cgaaactgca agggatataa 660

cgcggcatgc aagatatcga ggaagtcccg accggccgac gtgccttgca gttgctcgtc 720

aatcaagtct tccgtgtaga atgtcggcaa cggtgacgtc acgccgtaga ggccaaaaaa 780

gttagcgtct attcgataac gaccgtcgtc gctgcggtgt gtcctttcca tatcgcgctg 840

gggaaacccc aagcttaaat gcgcacgaat acgcacatta tcaaagaagg tttgttcact 900

tggaaaacgc aagcgcaata ggcgaaggaa ttgaaaaaaa ccatgctcgc ggccgttgcg 960

cagcagcggg tcattcaaag aatccgctgc ttgcctatct ttgccggcca t 1011

<210> 16

<211> 2736

<212> DNA

<213> tssH基因(tssH)

<400> 16

tcagacgggc gtcactgtct ctgcatttgc tgcagggcta gcggtgacaa cgcctgcatt 60

gtcggcctcc acaacaaccg gatcgacgcg ctcgacagcc gtgatcaacc actcgcccgt 120

cgggctcact gcaaccgtca gcgtgcacag cggtcgctgc tgcgcaatgg ccgccaacag 180

ggcctcggaa agccgcgggg tgagactttt acgcaagatg taatcgatat tgcgcgcacc 240

actttccact tccgtacagc gctcggcaat gaccgtggcg acctcttcgg cgaagctcag 300

gttgacccgc gatgtccacc aaaggcgttc ggtcagacgc gccaacttca gccgcacaat 360

ctcttccaat tgcgcgcccg ccagggtgaa atagggcaca atcgtcattc gcgccaataa 420

tgcaggcttg aagtattgag acagccgtgg gcgaacatgc tcgaccagcg cttccgcgtc 480

tggacgtgcg cctgcgcaac gcgcttgaat ttcatcactg gccaagttgc tggtcagcag 540

aatcacggtg tttctgaagt cgatctgccg cccctcgcca tctgtcaaaa agcccttgtc 600

gaatacctgg tagaaaatat tcactacttc caagtgcgcc ttttccactt catccagcaa 660

cacgaccgaa taagggcgtt tgcgcacggc ttcggtcaac atgccaccct cgccgaaacc 720

gacataccct gcaggcgaac cgaccaaacg gctgacggtg tgcttttctt gatactcgct 780

catgttcacg gtaatcaacg cctgctcgcc gccgaacaat tgctctgcca gcgccagcgc 840

tgtttcggtc ttgccgactc ccgagggccc gaccagcaag aagaccccca acggctgctg 900

agggtcacgc aagcccgatt gggcaacttt aatgacctcg gcaatctgct ccacggcggc 960

ttcctggccg cagatacgct gcttgaggtg gctggccagc gccagcaggc catcagaggc 1020

atcacgctga accttaccta acggtatccc cgtccagtcc gagaccacct gggcaatcgt 1080

gtcgggaccg acctcggtaa agagcaaagg ctcgtcgccc tgcaacgtcg ccagtgcatc 1140

gcgagcctgt tcgagctcca tctggtgtgc gtcgagcgag cccagcgctg tgctgccgtc 1200

accggcctgc ttgagcgttg cgaggttggt gcgcgcctcc agcacccgca tcgccgcctg 1260

ccgttcattg gcccagcgcg cctccagagc atccacagcc ccctcaatgt gcgcttgctc 1320

atcggctatg gtttccaggc gctgaggttc gatcgggaag ccgtcggcct ggtcccgctc 1380

caacgccgcc cgttcacgca tcaggcccga aagctgtcgc tccagacgtt ccagttgcgc 1440

aggtttgata ccaaggccaa tgcgcacgcg ggcactggcc gtatcgagca ggtccaccgc 1500

cttgtccggt agcaaccggc cggtgatgta tcgatcggac aactcagccg ccgcaacgat 1560

ggcatcatca cgcacgctga ccccatggac cttttcataa tgccctttga gccctcgcag 1620

aatgtgcact gcagtgccga cactgggctc atccagcttg accagctgaa agcgtctggc 1680

cagcgccggg tccttctcga aatacttttt atattccgac caggttgttg cggcgatggt 1740

gcgcagttca ccacgggcca acgcaggctt gagcaggttg gccgcatccg agccacccgc 1800

cgccccgcct gcgccgatca acatgtgtgc ttcatcgata aacaagacca ccggtgtggt 1860

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ggcgcctgcc tcaagtgccc ccagatccag gctgagcagg cgtgtgccct ggagaaacgc 1980

cggcacgttg ccctcattga tcaacagcgc caagccctcg accactgccg acttgccaac 2040

acccggctca cccactgcaa tagggttgtt cttgcgacga cgcgcgagaa tatcgatcat 2100

ctgacgcact tcgtcatcgc gcccgaagac ggggtcgatt ttcccctgcc gggccttctc 2160

ggtaaggtct tcgcaaaagc gtgcgatttg gttttctgcg acagcgccct cgacagggtt 2220

ggcggccccg gccgcactgt gcaaaatgtc caagggccct tcgcttgagc tggccaccag 2280

cgcggcgaat tcggcggtca acgcgtctac ggaaatgcgt ttgaacactg cactgtaacg 2340

agcaccggcg gtgtagtagc ttgcgcgcga caccagcgcc aacagcagcg atccgccgcg 2400

gatacgtcca cagcccaaaa ccagcgagct gatcaaccag gcatcctgca cccactcggt 2460

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atctgcatcg cgctcctcaa gcatttggcg aagcatatgg tcgatagata tttcataatg 2640

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ttttgcgaaa agcggtttta gttcaacttg aatcat 2736

<210> 17

<211> 2493

<212> DNA

<213> tssI基因(tssI)

<400> 17

tcataacagc ggattgagca gcacggcggc catgcgcggt gcctgagcaa cctcgccggc 60

gactacgccc gccgcatgca caacaccact ggcaataccc gcggccgtct gcaccgtgcc 120

cttggttacc atcgacgcct tcaccacctc ctcgccgacc atcaactctg gcgccatggg 180

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cgagtccccg gctttgagct ttttggccac agcacaattg gcggcgcaga agacgtcacc 300

gtccaccgtc aatttgcccg tgacacgcac gtcggacttc aacgtcagga cagaggagga 360

gccgatcacg atgcctgctg gcgtcaacgt gatttcatgt gaaccgcagc tgatgttgac 420

caaggccgca ccgctgatct tgagcgtggc ggcagtcatg gagcgcgtca ccgaagtctc 480

catcagggca acgttctcct ctcgcttggc caccgcgatt tcctcctcgg ccgcgatcag 540

gcgggtgtga cccaactcga tggaccgggt gcctgggttg attaccaacg tggttttagg 600

gccgaggatg ttcaaatcca gcgttttcag gcggccgttg atctgcgttt tggaaatacc 660

cgccgagact tcggtttcaa ccatcgcggt cttgagctcg gtagacaccg tgtctgccct 720

caaggtcggg atgaaactgc cccagttctt gccagcccag gtcgagcttg ccaattccga 780

ggaaggcaca ctgccattga cgccgatcgt cagcgaataa atgccaggca ctgcctgatg 840

atgtgaggaa gatgaaaact gcagatgcgc atcggtattc aaccgcgcac cacagacatc 900

cccatgacct agggtcagcg tgctgttgcc ggcgggtgcg ccaagcttga gcagcccagc 960

ggacgaactg tcgtccatgg ccaagtagtg tccacccgca gtggaaatgc cactttgtgt 1020

cgagttcccc tcgttcacca tgttggcgtt ttccgaattc ggcacactgc caatgatgat 1080

tggcctatcg ggatcaccgc ccaagaacga gaccaaaacc tccgttccct tgagcaaagg 1140

aaaatgcata ccatgcccgc tgccactgga gggactcgcc aggcgtaacc atgcggagcc 1200

gcgggttgct tttgcctcac cacgtatgaa gggaaagctg accttgtaac gcccatgttt 1260

gtcgagcaat ggccggctcg aatcgccatc gccgtcgacg actgcactga tcaccccctg 1320

tacatagggc cgaggcgtta cgcaggggct acggaactgt acgtcgtccg gcaaggcaat 1380

gaaccgcgtg ctgaaaacaa aatcgccttg ggtgtcatgc cttacagcag cgtgtcctcg 1440

caacggttgc tgaccctcgt gcttgacctc gatcacctgg taaaggctgt tgaaagccgg 1500

ctggggatga tccgacaatt gcatcggata ccccgcacgc aaaccacagg cttggcccga 1560

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accctctttg ttggagccga agtgctcccc gaacagccga tagtcaccct gaaaagcggc 1680

tgaggcgcta gcggacgccg cagtggcgac cgaagcggac gcacgcagtc gcagatgcgc 1740

ccccgccccg gaaaagtcct gcagagtaac cttctgggtg cggttgacca tctgccggtt 1800

gaacgtttgg gctaccgccc cctttacatc ggtcgccagt ccgctatgca ccgggcggta 1860

accgacggcc accggctttt gcggctgata tcggcgctct gcgcacaaca ccaacgcctc 1920

atggctgtca tgctgctcga aaaaataata aacaccgtag tactccagca gccgtgaaag 1980

aaacgcaaag ctggtttctt cgaactggca ggtaaagctc accgggcgct gcacgatgtc 2040

atccgaccct aaccgaatgt caaaatcgta ctgagcacct gggctgcccc cccggccgct 2100

gccttcgttg accatgccaa tttctttgag aaccagacga atcaggtccg caaggctctt 2160

gtctaaccag atttcggaaa agcaatactg gcgcaacaac gccacgcgcg gttccaatac 2220

tgcgcggtaa taggaaaact gagcatcact gtccagctgc atcacttccg tgacgatacc 2280

gtggtagcga tgcggtaagc cttgcttgtc taacagcgtg aaacacgctg gtttcccaag 2340

catcttctcc tcattcagcg atggatcagg cgtggccaga aaaatttcaa aacgataaag 2400

tttcgacaag gcttcctcac cctgccattt aaagacctgc aggtcttttt tttgcaatgc 2460

gctactactg aaactacaag taagagtatc cat 2493

<210> 18

<211> 2622

<212> DNA

<213> DVB73_06765位点(DVB73_06765)

<400> 18

tcaggcacgg gcaagatcct cccgtatccg gcagcgcgtc agcaatgcat gatcaagtcg 60

aacctgcgta ccacgcacgg catcggtaaa cgccgcatgc aagttgctac cgctgaggtc 120

cacgccatca agcgttacct tgcgcaagct ggcctccatg agatttgcac cgagccaaca 180

ggcacgcgtg agatcactcc cggtgaaatc cgcaccgcgg gcgctcaagc gattgccatt 240

gcttgcactc aggtcgcaaa ggctgaacaa cgcacggtca agacaagcac cgcgcaaact 300

cgcccctgtt agactcgcgc catcaagact tgcattggac aggttggcct gatcgaagca 360

ggcagcggac agccggctca tctgatcgac gcgcaggtca ttcaaattgg caccgcgagc 420

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attcaaggcg tgagcagtac agctctgcca ctggctgccg accaggcttg cctgctgtgc 540

gcagacagca tcaagcacgc agctcagcaa gcgtacgcca tgcaactgcg cctcggtgaa 600

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gcttgcctcg gcgaaacttg agtcctcggc atacccaacg ttgatcgacg cgccgtcgaa 720

cagccccctc tccagatcac agcgctggaa aaacgcgcca tcaaggcacg cccgctgcag 780

gcgcacctca ttcatggcgc aatcgataaa cacacactcg cgcaaatctg ccgcagtcag 840

ggtgcaaccc tgcaactgac agccctcgaa ctggctagtg cgcaaatcag cattgctcaa 900

gtcgagtgca gacaagtcaa ggtttacaaa tcgctgcccc gccaatgagt tacccgcctg 960

gtaaaccgcc tggacccgct cacgagtcca gtcggcaggc acctgcactt caccttgcgg 1020

cgcggtcgtc gcagcggggg taatggccgc cagttcctct cgtgccgcat caaccttgga 1080

gcggatctct gcctccagtt cattggcgcg aagcaaaccg gccgccagac tggcgcgcaa 1140

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catacccgca atatcggggc gcgacggtgg tttgaacgac gcaggatcaa aggccacacc 1440

tagcttcgcg gtcagtgcct tcacggcatc cacagcttgc gtaaaaccgt tggccacttc 1500

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tggcatggcc tctgggtcga tctgctcgtc gatctgcacc tcgtccgcac cgggactgac 1620

ccacagatgt cggacccatg cctgacccga gacgactgga tcgtcggcca actcgcaaac 1680

cagccccaga gcagtgatat cggtcgcgtc cggatcccga accggtattt gtactcgata 1740

gagcaacagc agccgctggg catcggggaa cagccaaatg gtgtccaaat ccagatgcgc 1800

ttcttcaacc gaatccgggc gctcctggaa ctcgacgaac aaccgcggcc gatggcccgg 1860

caggcacccc tcaaggcgcg gcagatgcgg atgcataccc gtcacggacc acgcctcatc 1920

gccacgccag tactggtcat ggcattggtc ctgggccacc tcatcgaacc agcgtgggtc 1980

tacatccagc ggcggccaag gcgcacggtg ggcggtccat tgcgcatcca gcgttcccag 2040

aaaaccggcg cgcgcggcac tgtaaggtgg caatggcagg aaagtggcgg gcgcgggctg 2100

gtcggcagga tgcagtgccg ggcaccccgc ggcctcgata ggcgccacga cgctgccctc 2160

gaatgccttg ggatcgagct gatacccctg accgatgggg ttgtcggcat acatctcgcc 2220

cccgaaggta ttctccaggg tcagaggcag cgactcgagc cttcccttcg ccacagcgcg 2280

ccaacctaaa agatgcttgt tccacgaacg cggagggaac gcatgcaagc acttgtgcct 2340

ggcccctacc tggacccgga cttccatacc cgcaccctgg gcatcgttca gcgcatacgc 2400

ctggccgtga acggcaaagg tccccgtgcg tttcttcagg ccgcgatcaa acgcctggcc 2460

tgcaaaacgc tgcgttaccc acacccaagc gtcttcggtg gcaaacacct caccagtgtc 2520

gctgtccacc agcaagccaa cagtgaccac caggcattct gattcaggtg accgatagcg 2580

agcggtcagc agcagacctt taccatcaat tttatgttgc at 2622

<210> 19

<211> 951

<212> DNA

<213> DVB73_06760位点(DVB73_06760)

<400> 19

ttacaaagtc gggacccagc tcaacgccgc ctgacgctct cggtcagcag ggcataccgc 60

ctcacagttg ctgtggtgcc aggaacaatc gctcagctca gcgccattga agtcggcacc 120

cgccaagtcc gcagccataa acgaggcgtg acaaagctgc gcaccatcaa aactggcgta 180

tcgcaaaaaa gcctcgtcaa acgaactgga ggcaaggttc gcccctgcaa agttgctgcc 240

ttccaggtgg gcctgggtaa aatttgcaaa tggcatttgc gcccgggtga acagacactg 300

cgtaaaccga gccagattga agttcaggcc ttctccctgg ctgagataaa gggacgtcat 360

cgtcgcgacg gcctgtgaaa aatcaacacc gttgaaggta cattcctcaa gcgcgcagtt 420

ctgcagcata gaagccgtaa attttgcgtt ttcaagacgg caagcattga aacgcgcttg 480

tatataggtc gcgtcaacgc ccaggagcgc agccagcacg cagccccccc attgacagcg 540

agtcattgtc gagcgctgca gatcaaggca ggagaactgg ccttcaatga cttccaagcc 600

ttccaggcgc gcgcctacca aacgtgtcga gtctccgacg cagcgcaacc accgcccgtg 660

atcaaggctt gcgccagcaa agtcggcttg gtcaagtttg caatcgctca ggtaccagtt 720

cagcgctgtg cagttgctga aattcgcttg agaaagatca caggaaatcc atgtgcaatg 780

ctcgaaccga gcgccctcca ggttggcccc gcgaaggctc acccgctcca gacgcacgtt 840

gtccagcacg atgtcggtta aatccgcacc gctcagatcc aggtcgcata caagcggttg 900

ggataacaat tctctgagtt gcgcagcctt ggcggtatca ggcacgggca a 951

<210> 20

<211> 648

<212> DNA

<213> DVB73_06755位点(DVB73_06755)

<400> 20

ctaccccagg ttgatacgtg gaccgcgcag tgtgacgctc acctgcgaaa gcagatccac 60

tgtctcgcca cgcaggctga agtctttgct cacgcgctgg cgcacagacc ctgcgctcaa 120

ctcttcgtgg ccttggacat gtcgtcggct atcaccgtac tcggcacgat gacgaataac 180

ctgctggtgc tgatgcaggg aattgtcgtg acgttcaagc cagcagctat cagcgcgttc 240

accactgatg cgcaagttcc cgcagacgac ctgggcctga tcgaccagcg atgtcacagc 300

atgcgcttgc acggccagtg tcgggccggc gttgagcgcg agtccatcac gggcctcgat 360

gctcaatgca ccgctgggca ggctcacgcg cagatctccc gcgatacgca gctccccaac 420

ctgtgcctgg ccgcgttcca gaacactaag aatgaagcct tcgtcacctg ccagcgaaac 480

cagaacacaa tcaccaacag caggttgcag caggcaaccg actgcgggct tcaaccagta 540

gcgatgccct tcgccgctga ccatgccgaa acggtgcccg tcgaaggcgt tgatccgcgc 600

atggcacagc ctaaccgggc cattgcgaac gggctgagca tcattcat 648

<210> 21

<211> 408

<212> DNA

<213> DVB73_06750位点(DVB73_06750)

<400> 21

tcatccaagc accatgactt gcgtctggct tggcgcactg accagtccca tcgtattggg 60

cggagagccg ttgtgggtgg tctggcaggt cactcgaacg gcgggctttc cgccaacctt 120

gacctgcagg ctgccgttga cgaaggtcat ctcccccatg atcttggcgc tcacgacccc 180

tcccccgaca ccggcctgat caccgttggt ggtcgtcacc ttgctcatct ggttcatcgc 240

tggcatgcct gcaaccaaga catcccgcac caggcctccc ggatctgcca tgctggtgtc 300

ggcgagattg ggatagggca ccggtatctg ccctgcaggg ttcggcgtct ggcagacatc 360

cggggcggtg gaatttgcct tggcccctcc gctattgagc atgaacat 408

<210> 22

<211> 618

<212> DNA

<213> tssJ基因(tssJ)

<400> 22

ttactgcccc tcgccggaca ggcgaacttc gccttccctg ggctgaatgg gcgtcggtgc 60

tgacaggcca ctttgcgaac ctcgcagcaa gccatcagcc cccacccaca gatcgatcgc 120

aatgggttgt gggctggcct gccaggttct actgaaaaaa ccacttgagg tgacatcgac 180

accaatctgg tacagcttcg cactgcgcgc ggggtcaaga tgcgcgtagc cggcggcgat 240

gccgaccatc cgtgtgccct ccaggcgcgg caaagtgatc cgctgattct cacctggttg 300

aaggaacact cgcgtcaggc ccaccatccc ctcgggagca ctttctgaaa gcaacaagtt 360

gctcagttgc tgtgaacttc caacactatt ggcaaacaca ttgttttgct cgagctgagc 420

cacgactacc agcaggctat gggcttgccc atcgtactgg ttgagatcag gaacaacggt 480

aaagtccagt tcaatggcac cttcggcgta actccatttg aggtcgttga gcgcttgctg 540

ttcaggcgta agccccttgc tcgaacaacc tgtcaggagc agcaccgcca tgactgcccc 600

atagatgcta tgggtcat 618

<210> 23

<211> 1386

<212> DNA

<213> tssK基因(tssK)

<400> 23

tcatgcgcag acaaccatca gctcaactct aagatcatcg ggttcatctg gcaggaacag 60

ggccacctgg cgctcgcgct gcacgtgatc ccaagcctca ctaaccgttt caagacggaa 120

atattccgcg tccgacgccc tcggcaaacc ttgcggcggt gtctgcaggt ggatcaactc 180

caccccgggt aaggcacggg cgaccatcgc acccagggag cccggcgtgc cgagcttgcc 240

attacaaggc aaggtttctg cgagccaggc accaccgcgc tggctgtgag ccaccaggaa 300

gtaacgatgc cgcgcaccaa aaaatgcgtc tggcaggtca gcctgctggt agcccccctg 360

caggtgcagg cgcaccacca tttcagagcc gacgttgatg tcgctcaaca tttggccgat 420

caacgcgatc agttcgatga tgatcaggcc cgcgtcactg tggttatagc cacgaatcaa 480

agaacgcccg tccggcgctt caccggacga gtcgcagcga tcggaaaatt ggctcaactc 540

actcaccaat tggtgtagag aggaatagat ctgcaaaaga gaaacctgcg gggcgttgag 600

aaaatgtgtc agcaaggggc catagcgatt aaggacattg agggctagca ggcgattgag 660

ctgtgtgcca ttgacctccc cgtagctgcc gcctggagct agcttgaaca ccgaaagctg 720

gcgcgcgcgc cccagcagct cgttgcgtag atcacgtagc ctttgctcga ggatgggtgc 780

gccagccaaa ttgaggcatg gcggcacgta ccatgcggca ggacgaagac gatccccctc 840

cagctccaac cggagaatcg gcaacaactc atacgccccc aagtgctcca gctcttcctc 900

ccagaacaag cgcagcacgt aggacatggc gcgtacatgc gccggcgatg ccacgctgaa 960

ctgatcgctc accacttcag gttccgcagc aacgacaaac cgagcttcag cctgcgcacc 1020

atcactcaac gtttcaaaca cctgggcgtt tttcccatcc ggggataacc gccgcagccc 1080

cacataaagc gtgcgtccgc cgccaacgaa ttccccaagg tccagactgc gtgcctgcaa 1140

catcgaatta ccgggatact ccaccaacgt cccctcggcg aagcgcaccg aaagttgatc 1200

gagttgacat tgtcgagcac cgagcgcgct ttcgttgatt gccagcgaaa tcacccccca 1260

tggataggga tgtagcaact cgacagtacg actcaggcga tgttcaagca ctgcatcgtt 1320

ttgttggaaa tgctggggct gcagaaacag gccctgatgc caatacaaca tttgattagt 1380

attcat 1386

<210> 24

<211> 669

<212> DNA

<213> tssL基因(tssL)

<400> 24

ttaaaacccc ctcaccagca gaagaaattt ttgccctaac agcaaatcaa aatattcata 60

caacccgcag agcaggagca acggaaccac cgtgagcagg gttagagcca gatcggaaag 120

gccgcgacgg ttaaggcgcg agcgctgcgg aagcaggtat tgagcgtgcg caaacaaggg 180

gctggagcca tctgtcaggg gcaccttgtt ttccgccaat atctgcctca ggcacgcgcg 240

gcgataacgc accagctcaa cgctcgggcg agtagcgaat gcaccttgaa aaccgctcaa 300

caatgccaag ccaaagacct ctctcacacc ctggctgtct gctggcaatg cctccaaccg 360

ctgaaagaat tcgacacctg cccgccccgt cgaaaaataa cgctgttgta aaggtgcctg 420

ccgccatgac gcagcgccac accaagaggt tgtcaacgcg gcttcgtcca tccaggcaac 480

gagagcaaac atggcctcgt taatctgcgc atctggaaaa cgttgttcgc gagcggtcgc 540

cgccgcactg tcgagcgatg acaccaacag cggggtcaac gtctcgaacg tttgtacagg 600

gtcagccaag ccgcgcttgg tagcagagaa aacgggcagc cagcaggcag caaaacggtg 660

aaccatcat 669

<210> 25

<211> 3933

<212> DNA

<213> tssM基因(tssM)

<400> 25

tcattgcctg gcgccagctg gagacgctaa acgtgcaggc gtaacattga gtttggcgat 60

aacgtcatta agcgctttgc gtgcaccagc attatcggca agacccgcca cccatagccg 120

ttgcaagttc tggccgagag gggccggaac gggctcgctg cgcgtttcat aacccatcgc 180

ctgcaactgg accagtagct ttctgacacg agcgtcaccc gcaaagaccc ccagctccac 240

ctcgtgcagg cgttgtggcg ccccctcggt tacagcagga ggacgtcgcc agcaccaggc 300

gatttgcttg ggcggcaaca cctcagccaa tcctcgtcca gtaacgcccc ccccgcccgc 360

gcgactgacc tgttgcgcag ctccctgctc gtccagcatc gccaactgcg tttctatcgt 420

cttgagctga cccgccaagg cgctcagctg ttgctctacc tgatcgattt gagcataacg 480

ctccagcaag ccgttctcgc cctgttgccg atagttcaac tgaatagagg ttaaattttc 540

acttcccatc caattgcgct ggttcggaaa gtcatcgggc gtgaaggtat gctggccgcc 600

atggaatgta cgaagaaaat cgatgaaggc acgatcaccg gtccagtggc gagccaactt 660

gaacgcggaa aatgtcactt ccaaagaaac gtgactacac ccctgaggtg cccacaaaaa 720

agtggcactg gtggggaaat tgtaattatc cagaaccgtc gaacgtccat tgcattgcac 780

agtcaagcgg gtctgtcgag gcaactgccg ggcacccaaa ttaacctggg acgctgtggt 840

ggaaagctcc accacagcgc tgactgcctg taaggccgcc agcttttgtt ggccttcgag 900

tcgcgcgcct tgcaatacct tctgttcgtt ttccaatgcc tgtttttttt gctcccgggt 960

agcgtctgca atctgccgtc tgcgggcctg actagcgtcg tcattttgaa cgtgccgcat 1020

gcgattgagg tacgcataga atgccccgtt gagtggcacc tcgacgccga gcgcctcacg 1080

agggctgtaa cggtgaacca gacgctgagt gaacgtttta acagaaccgt tcatgaaagt 1140

agggagcgca ccccgttcac tgtaaagcag agcgttgacg acaagcggat catccacacc 1200

ctcgataacg ccaagtaact caccattcca ttcccgttgt agctgacacg ccgcaatttg 1260

cccagcgtag cgcacactga aatccagagc cccggtagcc aagcgccaaa ccacgtcctc 1320

attcgcgtta caacccttaa aggaacggac cagtttctca cgcagatcgt aggcaaccca 1380

caaaggtgcc gacgtggcct gtgggtcact cgcaaaactc caggtatcaa gggcaacctg 1440

aaatgcctgg gcgtcatttt ttttcaaatc atccgtcacg gcggccatca cctgctgaaa 1500

tttcaacatc aacttagcct gggccaactc agtacgtaac tgaccgaccc cctccgcaac 1560

gtccccgccg tcggcgatac ctttgagcac gtctccgccc atgctattgg tcacagcgag 1620

gtttcgcagg acgccagagg tgtcatgcaa atcactttgg ctcgccaggt tgatcagtcg 1680

atcgacctct actacccggc ttgcccaacc ggcccgccga gcaggggcga tcagctcgaa 1740

acgctcggca gcacgttgca acagcttgag atacggatcg tccttcgtcc ccactgcatt 1800

cagggcctgg cgccaatcct cctgactgct caaacgggtt tcgtcattca gcaaaaagcg 1860

ttgaataaac tgataccagg cactttgcgc atccgcctcg tactcgttca gcaaccgcgc 1920

ctgctgatcg ctccatcgtg gttgatcgcg atgcgcttga gcgagctcgt tcagcaactt 1980

gaggacagcg tgatggccga gcgaggtata agcgcctggc agcgtgacag aaggcgctgc 2040

ttcatctgcc cagtattcgc caaggcgcat gggcggcagg ctgccgtgct gctccgccca 2100

agcaaccaac cagctagcag agcgattatc cagggcgatg ctgcccaatt gcgacagcgc 2160

gtgtgcacgc tgacggcgca gctcacccag atcctgttgc caatccagat agttaacata 2220

caactcgtca gcgccggtcc attgctcggc gccgggcatt gcaggggagc tgcatgcctg 2280

ataaagcatg ccccagtcag gaagctcgtg agtatcgtgt aacggctggt tctgcaagcg 2340

ggcatcgagc aggttgattt gcctgacgta gaattctaca taggcggcaa ttagccgcgg 2400

gtcatcgctg gtgagtgctt gctgaagtcc ccttaccagc agaccctcaa aaatcggact 2460

acgtatctgc tcatcgaaca gccgtacaaa gtgcgcacga ttatcgtctc gaaggcgctc 2520

gaagtacccg gcatacggca accatcgctt agggccactc aaggcttgtt cagagaggct 2580

ggtgatgacc tgactcaaac gctgcagtgt ttcgtgcgtc ccgtctaatt cgtcgctaac 2640

ttcatacgcc cacggcaggg gcgattctgc gagaaatgtc gaaatgacat gctgagaccg 2700

attatagcca tagatcatca gcccgccact tgcaatgcac acgcccaacc aagcgatgat 2760

cgcggcctgg ccgacaggca gccagcgacg ccagctggtg acgttcagat acgcataccg 2820

ttgtgcaggt aacacctgac tcaacagctg ttggctgaac cagccttcta cctgcccatc 2880

gtcaagcgtt gctcgagcag tcaagaacaa gccacctagc agcggtaact catagtaagg 2940

actgcccgcg aacgcaggca gcaacagctg ctccaggcga gggcgcagac tggctacaca 3000

ttccggcaac tcaaataccg aatcatcggg caggtggcgc atgccctgct cgatacgcag 3060

ttccgacagc cgctcaacca gacccgacat catgtcgtcc agaaacacag cggcagaact 3120

ttcgctacgc tggttcaaca aaccaacagg ttgctcgcgc tcaaccggtg tcaggcccga 3180

actccattgg ctaaagcccg gcaaggcttc cgcgcccgtg aggatgatgt aaatcggcag 3240

gcgcgccttg gaaatcttca ccagttcatc gacgcgttgc cgcaagtgct gcccctgctc 3300

aagcaattgc tcatggctgc cactcagcag ctgcccgcaa tcgacgacca tgacaacccc 3360

attcagtggc tctcgccgac gagaacggcg cagccagtaa agcaaacgtt tccactcagc 3420

gttattgcca gtgctcccct cgacagcctt gcccagaggc tgaaccacaa cactctgttc 3480

gagaaaccac cagcccactg cgctggcatc atccgtctgc tgatcggtcg gcgatagtgc 3540

ggacgttaag ccgcactggt tcaataggcc attcgtgcca cgagcgcctt cacccagcaa 3600

caaaaaccat ggcaacgcat acaagggcga atgcagcgtt cccaagcgcg accggtacag 3660

ttttcgtaac cctgcgaccc agtcgcgatc aacgttggca acggtatcgt gctgtgcctt 3720

ggagcgctca cctttcaaac gccggcgcaa ttgccaggca tgcagccgcc tgaccgtcca 3780

acggccgaac acaatcaaca ggagggtgcc gacaaggagg ggggcaatgt accaaagtgg 3840

ccagttctgg aagagcacca gcgcccagaa caacaccccc aaggcaaccc cgagcgccac 3900

gacaagaaaa gcaatgccga tattcaggag cat 3933

<210> 26

<211> 764

<212> DNA

<213> T6SS-1上游序列(T6SS-1)

<400> 26

caagcatgtt gaggcgagtg gccatttgga ttggcctcgc ggtactgaca gcgcagaccg 60

gtcgagtggt gctttgttgc gcaaaatctt gcgtgagctt cgggaaaatg gcattgcgca 120

aagagatatt gataacaaga gtgcaatgct ggcgcagctt gaaaaagtag ccacgatgaa 180

aaaggcggcg agttttaaaa ttggcccatt agtgatgggg gcactccagg cagcgcttgc 240

agctgggcaa ggtatcatgg gtgcggttac agggcccaag gtagatccat tggctaaagt 300

ggcgggtcct gtatcgactg gcgccagtgt agtgaaacac agcaacactg ctctgggggc 360

ggtcacaccg gtgatcaatg gggctgttca atatcatggc gagttagcgc aggcgcaggt 420

gcaggaggaa gaatacagcg ctacgagtac gcagcggcgc gcagataaaa gtgccgagta 480

tgtgcgtgat ctcgagcgca gctggcaaga gtcagtagaa cttttgaagg aagctgccaa 540

gatcgaactt agcggttacc aggccgcagg tcgtatctag ggattcagac gcccagccgc 600

catgcgcgga ctgggcgtca gcttgtgtgg gaaggtttgt gccttactag cggttaccct 660

gatatggctg cataaaagca tgcgacgggt ataagggcac gttgctgaag acgaatattt 720

tagggtgctg ggtgaaattc gctttgtact gctgtgtgtt tttg 764

<210> 27

<211> 790

<212> DNA

<213> T6SS-1下游序列(T6SS-1)

<400> 27

caatgacaag ttagttgggc acggtcatgt acgaggtcat tgacgtgcat cgtggaatta 60

cccattgcac tgcgaccagt tttaacagcg gtgaagacgg atttctataa caatgcccgt 120

ttcgcttcga cgccagcagg cggctgctgg cgttcgaaaa tttccatgct gtcgcgaggc 180

tcgatcgcag gtcgaggtat gaacgattgt ttattcaggg ttggaatgaa cgttctcggt 240

gaatcttgta accggtctat tgagttcaat tatggttttt catgatgtca gtgttctggt 300

tcttgacgat gatggattcc agcgcgcagt cgcgtccgaa acactgcgcc agttagggtg 360

tactcaggtg ttggcggctt gcagtggtag cgaagcgttg gaaatgttgc agacttatgg 420

cgccgtaaat atcgtacttt gcgatttacg catggagggt gtggacggtc tggagttctt 480

gcaacgcgcc gctcagcgtc gcttcctgga tgcggtgatc atcagcagtg cgctatctgc 540

cgacctgcgt agcgtcgtcc ggcagatcat ccccttgttg ggtttgaggg tgctggggga 600

tgtgggaaag cccctgcgcg gtaagtccct ggacttgttg ctggaaagtt atgtgagcga 660

aaccaagaag ccgccaacgg gagcgttttt cgaagcggtc ggtgagcatg aaatgcgcca 720

ggcaatcgag gctgggcata tgcatgcgta ttatcagccc aaattcaacc tgaaaacggg 780

agaggtctgc 790

Claims (10)

1.敲除T6SS-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗，其特征在于：包含杀香鱼假单胞菌基因组其中一套VI型分泌系统(T6SS-1)基因簇的敲除株。

2.根据权利要求1所述的敲除T6SS-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗，其特征在于：所述杀香鱼假单胞菌T6SS-1基因簇包含17个基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9-25所示。

3.根据权利要求1或2所述的敲除T6SS-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗，其特征在于：所述敲除株通过敲除杀香鱼假单胞菌基因组其中一套VI型分泌系统(T6SS-1)，或敲除T6SS-1基因簇所包含的单个基因或其组合获得。

4.根据权利要求1或3所述的敲除T6SS-1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗，其特征在于：所述敲除株是通过杀香鱼假单胞菌T6SS-1基因簇敲除包含PK18mobSacB质粒和中间去掉T6SS-1编码基因簇同时保证阅读框不发生变化的T6SS-1基因簇上下游序列SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8。

5.权利要求1或2或3或4所述的敲除杀香鱼假单胞菌T6SS-1基因簇用敲除载体，其特征在于：包含pK18mobSacB和构建的用于敲除基因用的pK18mobSacB-ΔT6SS-1质粒中包含的T6SS-1基因簇上下游序列SEQ ID NO:26-27。

6.权利要求5所述的敲除杀香鱼假单胞菌T6SS-1基因簇用敲除载体的构建方法，其特征在于：包括，

采用引物为SEQ ID NO:1-4所示序列的PCR扩增；

克隆至中间载体pMD18-T中进行增殖；以及

限制性内切酶XbaI和HindIII组合酶切后采用T4DNA连接酶连接制得。

7.权利要求1或2或3或4所述的敲除株的构建方法，其特征在于：采用双交换同源重组的方式对杀香鱼假单胞菌的T6SS-1基因簇进行敲除。

8.根据权利要求7所述的敲除株的构建方法，其特征在于：所述构建方法的具体步骤为：

采用重叠PCR途径获得T6SS-1基因簇上下游序列的拼接片段；

将所述拼接片段连接到pK18mobSacB上构建成敲除载体pK18mobSacB-ΔT6SS-1；及

将所述敲除载体pK18mobSacB-ΔT6SS-1化转至感受态大肠埃希菌S17-1/λpir中，并通过接合的方式将敲除载体转移至杀香鱼假单胞菌细胞中，进行两次同源重组交换实现靶基因的敲除，利用PCR方式筛选鉴定获得敲除株。

9.根据权利要求8所述的敲除株的构建方法，其特征在于：所述重叠PCR用引物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。

10.根据权利要求8所述的敲除株的构建方法，其特征在于：所述PCR方式筛选用引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。