CN107099495A - 一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送工程菌株的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送的基因工程菌株的构建方法及其应用。构建方法是，将铜绿假单胞菌PAK菌株基因组中4种毒力因子exoS,exoT,exoY,ndk基因删除，使其对哺乳动物细胞无细胞毒性；进一步从染色体上删除抑制细菌III型分泌系统(T3SS)的popN基因，使其T3SS介导的蛋白质注入量显著提高，从而构建出工程菌株Δ5。本发明构建的工程菌株Δ5可用于对多种哺乳动物细胞系实施蛋白质递送，进行基因编辑，细胞重编程，蛋白质功能研究等工作。可实施递送的细胞类型广泛，包括人和鼠的皮肤细胞、肌细胞、肠道细胞、肝细胞、多能干细胞等。

Description

一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送工程菌株的构建方法及 应用
【技术领域】
本发明属于生物技术领域，涉及的是一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送的铜绿假单胞菌基因工程菌株的构建方法及其应用。
【背景技术】
目前应用最普遍的细胞内蛋白质导入技术是基于DNA/RNA的转染法，其2大缺陷是：①外源核酸片段有可能随机整合到基因组中而诱发癌变或其他不可预见的后果。②外源蛋白质的表达一旦启动无法有效地终止。如果能将兴趣分子直接以“蛋白质”的形式输送到靶细胞内，则可以克服以上缺点。首先，蛋白质导入避免了外源DNA/RNA带来的基因组不稳定性。其次，由于外源蛋白质进入细胞内会被胞内自身的蛋白酶降解，使其作用时间可控。目前蛋白质导入方法已见多项报道，如显微注射，转染试剂(TransfectionReagent)和蛋白转移结构域(ProteinTranslocationDomain)介导的蛋白导入法，但这些种方法的蛋白质递送效率都很低，而且转染试剂对靶细胞有很大毒性，后者则仅限于小分子量蛋白质的导入。此外，上述方法均涉及对目标蛋白的分离纯化，其操作繁琐且成本高，不适用于大规模生产。
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)属于假单胞菌科、假单胞菌属，革兰式阴性细菌。其分布广泛，在自然界(土壤、水和空气)、植物表面、人体的皮肤、肠道和呼吸道中均有分布。铜绿假单胞菌的III型蛋白分泌系统(TypeIIIsecretionsystem，T3SS)是其表面形成的一种针状复合物结构，可穿透真核细胞的细胞膜从而将细菌的毒素蛋白直接注入到靶细胞内，且不涉及细菌进入到靶细胞内，是自然界存在的一种高效的蛋白质注入机制。铜绿假单胞菌PAK菌株具有3种主要的毒素蛋白：ExoS，ExoT和ExoY，铜绿假单胞菌利用其T3SS将这些毒素蛋白注入靶细胞内有助于该菌在宿主环境中的存活。近年来发现ndk基因编码产物核苷二磷酸激酶(NDK)，是另一种通过T3SS注入到细胞中的毒力因子，NDK的注入可以被前3种主要的效应因子所抑制，在ExoS、ExoT和ExoY缺失的菌株中，NDK的注入量显著提高，并产生明显的细胞毒性。popN基因编码产物可以抑制细菌T3SS蛋白质注入，popN基因突变子在非诱导条件下便能够分泌效应蛋白,显示popN基因编码的蛋白对T3SS具有负调控作用。
【发明内容】
本发明的目的是构建一种无细胞毒性、且具有高T3SS活性的铜绿假单胞菌基因工程菌株，通过该菌的T3SS将外源蛋白质注入到哺乳动物细胞中，发明一种可应用于哺乳动物细胞蛋白质递送的工程菌株的构建方法及应用。
本发明的技术方案
一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送的基因工程菌株的构建方法，将铜绿假单胞菌PAK基因组中4个毒力因子基因exoS,exoT,exoY,ndk删除，使铜绿假单胞菌对哺乳动物细胞无细胞毒性，获得菌株Δ4；将菌株Δ4中抑制III型蛋白分泌系统(T3SS)的popN基因从染色体上删除，使菌株Δ4的T3SS介导的蛋白质注入量显著提高，最终获得工程菌株Δ5。
本发明同时提供了所述方法制备的铜绿假单胞菌基因工程菌株Δ5的应用：所述应用是指菌株Δ5能够用于对多种哺乳动物细胞系实施蛋白质递送；即通过将目标蛋白与菌株Δ5的T3SS分泌信号肽ExoS54融合表达于表达载体pExoS54中，当携带有该表达载体的Δ5菌株与哺乳动物细胞共同培养的时候，Δ5的T3SS被激活，目标蛋白与T3SS信号融合蛋白大量表达，在T3SS分泌信号肽ExoS54的引导下将目标蛋白高效地注入到哺乳动物细胞当中。
所注入的目标蛋白可以为转录因子，酶(如核酸酶TALEN，Cas9，Cre重组酶)，疫苗，结构蛋白，或毒力因子等。
所述的细菌感染细胞的最佳条件是：随着感染系数(MOI)和侵染时间的增加，蛋白质的注入量也相应增加；当MOI为50，侵染4h，为最合适的条件。
所述的工程菌株Δ5能够应用于各种哺乳动物细胞系，包括人和鼠的皮肤细胞、肌细胞、肠道细胞、肝细胞、免疫细胞、胚胎干细胞和诱导性多能干细胞(iPS细胞)。
所述的工程菌株Δ5适用于多领域研究工作，包括干细胞定向分化，细胞重编程，细胞基因编辑，蛋白质功能研究。
本发明的有益效果
本发明利用基因改造的铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统作为一种蛋白质递送的工具，能够简单、高效地将外源蛋白质注入到哺乳动物细胞内，不涉及DNA/RNA随机整合导致的基因组不稳定性，且适合大规模生产。
【附图说明】
图1.基因敲除方法示意图。
图2.LDH法检测菌株Δ5对多种哺乳动物细胞系的细胞毒性。
图3.表达载体pExoS54-mApple的构建。
图4.WesternBlot检测Δ5菌株对HeLa细胞的mApple蛋白注入量。
图5.免疫荧光检测Δ5菌株对HeLa细胞的mApple蛋白递送。
图6.Flowcytometry检测Δ5菌株对HeLa细胞的mApple蛋白注入效率。
【具体实施方式】
本发明使用的菌种和质粒
野生型铜绿假单胞菌PAK为实验室保存；铜绿假单胞菌Δ4(PAK背景下敲除染色体上的exoS、exoT、exoY和ndk基因)和Δ5(Δ4背景下敲除popN基因)为本研究构建；大肠杆菌DH5α/λpir用于分子克隆，本实验室保存；大肠杆菌S17-1/λpir用于接合转移，本实验室保存；基因敲除载体pEX18Tc，融合蛋白表达载体pExoS54，本实验室保存。
本发明使用的哺乳动物细胞
Hela，A549，鼠胚胎干细胞(mESC)J1和人胚胎干细胞(hESC)H9均为本实验室保存。
本发明使用的试剂
DNAMarker、限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP来自于Takara公司；T4DNA连接酶(Promega)、酵母提取物物(Yeastextract)和胰蛋白胨(Tryptone)购自英国Oxoid公司；蔗糖(Sucrose)和二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品；琼脂糖购自BIOWEST；琼脂粉(Bacto-agar)、四环素和卡那霉素购自自生工生物工程(上海)股份有限公司；基因组提取试剂盒(EasyPureGenomicDNAExtractionKit)为全氏金公司产品；质粒小提试剂盒(PlasmidMiniPrepKit)为美国Axygen公司产品；DNA纯化试剂盒(DNAclean&Concentrator)和DNA胶回收试剂盒(ZymocleanGelDNARecoveryKit)为美国Zymoresearch公司产品。乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒购自Promega公司。
基因敲除质粒的构建
1)以PAK菌株基因组DNA为模板，PCR扩增得到exoS、exoT、exoY、ndk和popN的上下游1-kb左右的同源臂片段。在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物的大小及大致浓度，并切胶回收同源臂DNA片段。
2)取上述PCR产物，分别用合适的限制性内切酶进行酶切，然后克隆到具有相应粘性末端的pEX18Tc质粒上，连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂布在含110μg/mL四环素(Tc)的LB平板上筛选转化子，PCR和质粒酶切对转化子进行鉴定，得到基因敲除质粒pEX18Tc-exoS、pEX18Tc-exoT、pEX18Tc-exoY、pEX18Tc-ndk和pEX18Tc-popN。
基因敲除菌株的构建
提取保存在大肠杆菌DH5a中的基因敲除质粒pEX18Tc-exoS、pEX18Tc-exoT、pEX18Tc-exoY、pEX18Tc-ndk和pEX18Tc-popN，使用化学转化的方法将质粒分别转化到大肠杆菌S17感受态细胞中。运用接合转移的方法将S17中的基因敲除质粒转入到PAK菌株中，对PAK基因组中的exoS、exoT、exoY、ndk和popN基因进行逐一敲除。以exoS为例具体操作如下(exoT、exoY、ndk和popN基因敲除方法同exoS)：
1)挑取新鲜划线培养的S17/pEX18Tc-exoS单菌落，接种于2mL含有5μg/mLTc的新鲜无菌L-Broth培养基中，37℃，180rpm振荡过夜培养；同时，挑取新鲜划线培养的PAK单菌落，接种于2mL新鲜无菌L-Broth培养基中，42℃，180rpm振荡过夜培养；
2)次日分别以1:50的比例，转接过夜培养的S17/pEX18Tc-exoS和PAK到5mL含有Tc5或不含有抗生素的L-Broth培养基中，S17/pEX18Tc-exoS于37℃，180rpm振荡培养至对数期(OD600＝0.6-0.8)，PAK于42℃振荡培养到对数期(OD600＝0.8-1.0)；
3)使用紫外分光光度计，测定并记录S17/pEX18Tc-exoS和PAK的OD600的数值；
4)分别将S17/pEX18Tc-exoS和PAK培养液，使用1.5mL离心管于16000g离心1min，收集菌体，弃去上清。加入1mLL-Broth，使用移液器吹散，于16000g离心1min，弃去上清，收集菌体，重复一次，然后将菌体重悬到1mLL-Broth中；
5)在无菌试管中，将S17/pEX18Tc-exoSdeletion和PAK以细菌个数比为10:1－5:1的比例混合，调整总菌量少于3×109CFU；
6)连接好膜结合用真空抽滤装置，向装置中加满75％的酒精杀菌，待所有酒精过滤到真空装置中的锥形瓶后，再次向装置中加满75％的酒精洗涤一次。最后向装置中加满无菌水洗涤两次，待无菌水全部真空过滤到锥形瓶后，用无菌镊子取一张0.45μm孔径的无菌的硝酸纤维素膜，小心地置于该装置的装膜位置，重新安装好真空抽滤装置；
7)将步骤5中的混合菌液，使用移液器转移到真空过滤装置中，真空过滤菌液到锥形瓶中，使混合好的S17/pEX18Tc-exoS和PAK存留在硝酸纤维素膜上；
8)用无菌镊子小心地将硝酸纤维素膜存有混合菌的一面朝上放于NutrientAgar培养基平板上，将培养皿正置于37℃培养箱，静置培养7-16h；
9)将硝酸纤维素膜使用无菌镊子小心地转移到一个无菌试管中，向试管中加入1mLL-Broth，漩涡振荡洗涤硝酸纤维素膜；
10)将硝酸纤维素膜的洗脱培养基转移到1.5mL的无菌离心管中，使用无菌的L-Broth系列稀释到10-2；
11)分别从原始洗下的菌液，稀释到10-1和10-2的离心管中各取100μL涂布于含有适当抗生素的平板上(Tc50Kan25)，于37℃培养箱静置培养24-48h；
12)挑取抗生素平板上长出的可能的单交换的单菌落，接种到1mL无抗生素的L-Broth培养基中，37℃，180rpm振荡培养8h左右，使其浓度达到109CFU/mL；
13)使用新鲜无菌无抗生素的L-Broth培养基，以1:10的比例，系列稀释步骤12中的培养液到细菌细胞浓度为104CFU/mL；
14)分别从104，105，106CFU/mL离心管中各取100μL菌液，涂布到包含和不包含终浓度为7.5％蔗糖的L-Agar培养基平板上，于37℃培养箱静置过夜培养；
15)次日比较含有蔗糖的培养基平皿和不含有蔗糖的培养基平皿上的菌落数，含有蔗糖的平皿上出现的菌落数应该明显少于不含有蔗糖平板上的菌落数。最佳结果应为蔗糖平板上出现10-100个菌落，而不含蔗糖的平板上出现更多的菌落；
16)从含有7.5％蔗糖的培养基平皿上挑选单菌落，进一步于终浓度为7.5％蔗糖的L-Agar培养基平皿上纯化；
17)将筛选到的双交换菌落，分别以单交换菌落和野生型菌株PAK的培养液为对照，进行菌液PCR验证和抗生素抗性检测。
菌株Δ5的细胞毒性检测
挑取新鲜培养的Δ5单菌落接种到LB培养基中，37℃振荡过夜培养；次日按照1:50的比例接种于新鲜的LB培养基中，37℃传代培养至对数期，OD600为1.0左右；然后取1mL菌液，12000g离心1min收集菌体，弃去上清，再重悬于1mL的1×PBS中，在含有5％FBS和无抗生素的DMEM培养基中，以MOI＝50，感染细胞。共培养4h后，用乳酸脱氢酶(LDH)释放检测的方法，比较野生型菌株和基因工程菌株对哺乳动物细胞的毒性。
荧光蛋白mApple递送菌株的构建
PCR扩增mApple基因，克隆到表达载体pExoS54中，使待注入的目标蛋白(mApple)与T3SS分泌信号肽ExoS54相融合，构建成表达载体pExoS54-mApple。将该表达载体电转化入铜绿假单胞菌Δ5菌株，构建成mApple递送菌株Δ5/pExoS54-mApple。该菌株在接触到靶细胞后，其T3SS被激活，细菌大量表达ExoS54-mApple融合蛋白，该融合蛋白可通过T3SS注入到靶细胞当中。
融合蛋白注入量的检测
挑取新鲜菌落Δ5/pExoS54-mApple接种到LB培养基中，37℃振荡过夜培养；次日按照1:50的比例接种于新鲜的LB培养基中，37℃传代培养至OD600为1.0左右。然后取1mL菌液，12000g离心1min收集菌体，弃去上清，1×PBS洗涤1次，重悬于含有5％FBS和无抗生素的DMEM培养基中，以MOI＝50，感染细胞。共培养4h后，弃去细菌，PBS洗涤细胞3次后，再用胰酶消化的方法收集细胞，制备蛋白样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳，利用Flag抗体进行WesternBlot和细胞免疫荧光检测，以beta-actin作为细胞内参以评估ExoS54-mApple融合蛋白的注入量。
融合蛋白注递送效率的检测
挑取新鲜菌落接种到LB培养基中，37℃振荡过夜培养；次日按照1:50的比例接种于新鲜的LB培养基中，37℃传代培养至OD600为1.0左右。然后取1mL菌液，12000g离心1min收集菌体，重悬于含有5％FBS和无抗生素的DMEM培养基中，以不同MOI感染细胞不同时间。感染结束后，弃去细菌，多次洗涤细胞后，再用胰酶消化的方法收集细胞，通过流式细胞仪检测细胞内ExoS54-mApple蛋白阳性的细胞比例。
数据分析
数据使用平均值(n≥3)±标准偏差来表示，两组间比较使用t检验。“*”表示p<0.05被认为在统计学上有显著性差异，“***”表示p<0.001，“ns”表示无统计学差异。
实施例1.基因工程菌株Δ5的构建
以PAK菌株基因组DNA为模板，PCR扩增得到exoS、exoT、exoY、ndk和popN的上下游1-kb左右的同源臂片段。上述PCR产物经酶切后克隆到质粒pEX18Tc上，构建基因敲除质粒pEX18Tc-exoS、pEX18Tc-exoT、pEX18Tc-exoY、pEX18Tc-ndk和pEX18Tc-popN。提取保存在DH5a中的基因敲除质粒，使用化学转化的方法将质粒分别转化到大肠杆菌S17感受态细胞中。采用接合转移的方法将S17中的基因敲除质粒转入到PAK菌株中，对PAK基因组中的exoS、exoT、exoY、ndk和popN基因进行逐一敲除。基因敲除原理如图1所示，在含有50μg/mL四环素的琼脂糖平板上筛选单侧同源臂发生同源重组的单交换菌株，然后在含有7.5％蔗糖的琼脂糖平板上筛选双侧同源臂均发生同源重组的双交换菌株，最终获得突变株Δ5。
实施例2.基因工程菌株Δ5对多种哺乳动物细胞的细胞毒性
选取野生型菌株PAK和基因工程菌株Δ5作为感染菌株，比较其对哺乳动物细胞HeLa,A549,鼠胚胎干细胞(mESC)J1和人胚胎干细胞(hESC)H9的细胞毒性。细胞毒性强弱通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测。当细胞受到损伤时，会导致胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶LDH，在乳酸脱氢酶的作用下，NAD+被还原成NADH，NADH经催化反应生成强生色物，在490nm波长下产生吸收峰，通过比色来定量LDH活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。将HeLa，A549，mESCJ1和hESCH9细胞培养至70-80％的细胞密度；挑取新鲜的Δ5/pExoS54-mApple单菌落接种到LB培养基中，37℃振荡过夜培养；次日按照1:50的比例接种于新鲜的LB培养基中，37℃传代培养至对数期，OD600为1.0左右；然后取1mL菌液，12000g离心1min收集菌体，弃去上清，1×PBS洗一次，将细菌重悬于含有5％FBS和无抗生素的DMEM培养基中，以MOI＝50，感染细胞。取120μL细胞上清液，加入60μL的LDH检测试剂，混匀，室温下避光孵育30min，然后在490nm波长下测定吸光度。三种菌株均以MOI＝50，侵染哺乳动物细胞4h，包括HeLa，A549，mESCJ1和hESCH9。细胞毒性如图2所示，以无细菌感染的细胞(Un-infected)作为对照，野生型菌株PAK对各种哺乳动物细胞均具有显著的细胞毒性，而基因工程菌Δ5在测试条件下无细胞毒性。
实施例3.利用基因工程菌株Δ5向HeLa细胞内注入mApple蛋白
PCR扩增mApple基因，克隆到表达载体pExoS54中，使待注入的目标蛋白(mApple)与T3SS分泌信号肽ExoS54相融合，构建成表达载体pExoS54-mApple(图3)。将该表达载体电转化入铜绿假单胞菌Δ5菌株，构建成mApple递送菌株Δ5/pExoS54-mApple。该菌株在接触到靶细胞后，其T3SS被激活，细菌表达载体pExoS54-mApple高效表达ExoS54-mApple融合蛋白，该融合蛋白可通过T3SS注入到靶细胞当中。由于表达载体上ExoS54序列后面带有Flag标签，因此可通过WesternBlot方法检测融合蛋白的表达。如图4所示，外源蛋白mApple可以在T3SS分泌信号ExoS54的引导下注入HeLa细胞，而未经Δ5感染得HeLa细胞中无mApple的注入；以Actin作为内参，可见随着MOI的增加，注入量随之增加；同等MOI的情况下，敲除popN基因的Δ5菌株的注入量大于Δ4菌株。通过荧光显微镜检测，可以直观地看到Δ5/pExoS54-mApple菌株向HeLa细胞中递送mApple蛋白(图5)。
实施例4.基因工程菌株Δ5蛋白质递送效率的评价
将Δ5/pExoS54-mApple菌株培养到对数期，通过控制不同的MOI和感染时间分别感染HeLa细胞。感染完成后，弃去细菌，PBS洗涤细胞后，再用胰酶消化的方法收集细胞，400g离心5min，弃上清。将细胞重悬在新鲜的培养基中，轻微振荡洗涤，离心收集。利用流式细胞仪检测mApple阳性的细胞百分比，样品浓度约105cell/mL。如图6所示，当以MOI＝50的细菌和细胞共培养4h后，约97.2％的HeLa细胞被注入了mApple蛋白，平均递送效率>95％。

Claims (6)

1.一种用于哺乳动物细胞蛋白质递送的基因工程菌株的构建方法，其特征是：将铜绿假单胞菌PAK基因组中4个毒力因子exoS,exoT,exoY,ndk基因删除，使铜绿假单胞菌对哺乳动物细胞无细胞毒性，获得基因敲除株Δ4；将Δ4菌株中抑制III型蛋白分泌系统(T3SS)的popN基因从染色体上删除，使细菌T3SS介导的蛋白质注入量显著提高，最终获得工程菌株Δ5。
2.权利要求1所述方法构建的铜绿假单胞菌基因工程菌株Δ5的应用，其特征在于：所述应用是指菌株Δ5能够用于对多种哺乳动物细胞系实施蛋白质递送；即通过将目标蛋白与T3SS分泌信号肽ExoS54融合表达于表达载体pExoS54中，当携带有该表达载体的Δ5菌株与哺乳动物细胞共同培养的时候，Δ5的T3SS被激活，目标蛋白与ExoS54融合表达，随后在ExoS54信号肽的引导下，将目标蛋白注入到哺乳动物细胞当中。
3.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌基因工程菌株Δ5的应用，其特征在于：所注入的目标蛋白为转录因子，酶，疫苗，结构蛋白，或毒力因子。
4.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌基因工程菌株Δ5的应用，其特征在于：所述的细菌感染细胞的最佳条件是：随着感染系数(MOI)和侵染时间的增加，蛋白质的注入量也相应增加；当MOI为50，侵染4h，为最佳注入条件。
5.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌基因工程菌株Δ5的应用，其特征在于：所述的工程菌株Δ5能够应用于各种哺乳动物细胞系，包括人和鼠的皮肤细胞、肌细胞、肠道细胞、肝细胞、免疫细胞、胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。
6.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌基因工程菌株Δ5的应用，其特征在于：所述的工程菌株Δ5能够应用于多领域研究，包括干细胞定向分化，细胞重编程，细胞基因编辑，蛋白质功能研究。
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