CN108359630B - 一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法及其在蛋白质转染中的应用 - Google Patents

Abstract

一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法及其在蛋白质转染中的应用。构建方法是，将铜绿假单胞菌Δ8菌株中参与细胞壁肽聚糖合成的谷氨酸消旋酶基因murI删除，从而获得D‑谷氨酸营养缺陷型菌株Δ9。其应用是，Δ9菌株无细胞毒性并保留有完好的III型分泌系统(T3SS)，可将外源蛋白质通过其T3SS高效地注入到哺乳动物细胞中，能够应用于哺乳动物细胞蛋白质转染。Δ9在缺少D‑谷氨酸的培养环境中无法生长，因此，转染后该菌可通过D‑谷氨酸营养限制自行清除。我们分别利用HeLa细胞和小鼠感染模型阐释了该菌体外和体内应用的安全性。本发明对于开发安全、高效的哺乳动物细胞蛋白质转染技术有着积极的意义。

Description

一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法及其在蛋白质转染中的 应用

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，涉及一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法及其在哺乳细胞蛋白质转染方面的应用。

【背景技术】

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为革兰氏阴性菌，这类细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，是原核生物细胞所特有的物质。肽聚糖由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥三部分组成。聚糖骨架由N-乙酰葡糖胺(N-acetyl glucosamine，GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid，MurNAc)交替间隔排列，经β-1,4糖苷键联结而成。四肽侧链由L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸和D-丙氨酸依次排列组成；第三位的L-赖氨酸由5个甘氨酸组成的五肽交联桥连接到相邻聚糖骨架四肽侧链末端的D-丙氨酸，从而构成机械强度十分坚韧的三维立体结构。D-谷氨酸掺入到四肽侧链的第二个残基上在原核生物中是高度保守的。

功能性D-谷氨酸(D-Glu)是由MurI通过改变同名L-谷氨酸立体化学式结构生成的。MurI是一类不需辅助因子，专一催化L型和D型谷氨酸之间相互转化的酶，为细胞壁合成提供D-谷氨酸，是细菌生长的关键酶。通过对铜绿假单胞菌的基因组分析可知，MurI由单一的murI基因编码。对细菌细胞壁合成所需的酶的编码基因murI进行突变，从而使细菌不能形成完整的细胞壁，逐渐导致细菌消亡。

铜绿假单胞菌PAK具有III型分泌系统(T3SS)，它是一种锚定在细菌表面的针状复合结构，细菌利用该系统能够将自身的毒力蛋白ExoS、ExoT和ExoY高效地注入到宿主细胞体内，是自然界存在的一种高效的蛋白质注入机制。铜绿假单胞菌之所以具有较强的感染能力和致病能力，也与这些毒素蛋白注入靶细胞息息相关。由于细菌的T3SS是一种高效、快速的蛋白质分泌系统，已被广泛应用于哺乳动物细胞的蛋白质转染。然而，通过细菌T3SS对哺乳动物细胞进行蛋白质转染后，如何将细菌彻底清除就成为重要的课题。

在细菌感染细胞的模型中，细菌与细胞长时间的接触，仍然会产生较大的细胞毒性，因此必须将细胞中的细菌除去。目前，通过细菌T3SS对哺乳动物细胞进行蛋白质转染后，大多数采用抗生素对细菌进行清除。前期研究表明，高浓度抗生素(如环丙沙星)的使用对多能干细胞(如人胚胎干细胞)的转录组有显著性影响，虽然尚未有证据表明这种影响会导致其细胞干性的丧失，但抗生素杀菌所产生的副作用不容忽视。因此我们将进一步优化这种蛋白质转染系统，构建低浓度抗生素或者无抗生素处理即可自行清除的蛋白质转染菌株。

【发明内容】

本发明的目的是解决细菌利用其T3SS对哺乳动物细胞进行蛋白质转染后，如何将细菌彻底清除的问题，进而构建一种D-谷氨酸营养缺陷的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌株，该菌在缺失D-谷氨酸的环境中生长受到限制，但仍具备正常的生理功能，这些细菌可以通过其T3SS对靶细胞进行蛋白质转染，而后由于无法合成新的细胞壁而最终死亡。该发明通过营养限制策略解决了蛋白质转染菌株的清除问题，降低了细菌毒力的同时提升了蛋白质转染量，使细菌T3SS介导的蛋白质转染技术更为安全、高效。

本发明的技术方案

一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法，该方法包括：

将铜绿假单胞菌Δ8菌株基因组中参与细胞壁肽聚糖合成的谷氨酸消旋酶基因murI删除，获得营养缺陷型减毒菌株Δ9；该菌对哺乳动物细胞无细胞毒性，在不添加外源的D-谷氨酸时无繁殖能力，能够通过D-谷氨酸营养缺陷限制抑制细菌的增殖；Δ9菌株的III型分泌系统具有完整功能，能够在短时间内实施对哺乳动物细胞的蛋白质转染。

本发明构建的菌株Δ9在补充10mM D-谷氨酸的培养基中可正常生长；而不添加外源的D-谷氨酸时，细菌无法繁殖。在D-谷氨酸营养限制条件下，以10⁸CFU的Δ9菌株感染哺乳动物细胞4小时后无显著的细胞毒性产生；用PBS洗细胞三次，残留细菌经10μg/mL环丙沙星或青霉素-链霉素(双抗)处理15小时可彻底清除。

由于哺乳动物体内环境无D-谷氨酸，以10⁸CFU的Δ9感染小鼠，12小时后，小鼠各器官内细菌的存活率几乎为零，且在小鼠体内引起的炎症反应较弱。

本发明构建的菌株Δ9具有完整的III型分泌系统，Δ9菌株在无D-谷氨酸培养基中仍保留完好的III型蛋白质分泌功能，在接触到哺乳动物细胞的时候细菌的III型分泌被激活，能够高效地向哺乳动物细胞内注入效应蛋白。

本发明同时提供了一种减毒铜绿假单胞菌Δ9菌株的应用，所述的工程菌株Δ9能够应用于哺乳动物细胞蛋白质转染，即通过将目标蛋白与III型分泌系统信号肽ExoS₅₄融合表达于表达载体pExoS₅₄F中，当携带有该表达载体的Δ9菌株与哺乳动物细胞共同培养的时候，Δ9的III型分泌系统被激活，目标蛋白与ExoS₅₄融合表达，从而通过III型分泌系统的针状复合物被注入到哺乳动物细胞当中。

所述的目标蛋白为转录因子，酶，疫苗，结构蛋白或效应因子。

所述的工程菌株Δ9能够应用于各种哺乳动物细胞系的蛋白质转染，所述的细胞系包括人和鼠的皮肤细胞、肌细胞、肠道细胞、肝细胞、免疫细胞、胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。

所述的工程菌株Δ9还能够应用于体内的蛋白质转染。

本发明的优点和有益效果

本发明构建的菌株Δ9具有完整的T3SS，Δ9菌株在无D-谷氨酸培养基中仍保留完好的III型蛋白质分泌功能，在接触到哺乳动物细胞的时候细菌的T3SS被激活，能够高效地向哺乳动物细胞内注入效应蛋白。

本发明利用减毒铜绿假单胞菌T3SS作为一种蛋白质转染的工具，既能够简单、高效地将外源蛋白质注入到哺乳动物细胞内，又很容易将残留的细菌清除掉，是一种安全有效的蛋白质注入工具。

【附图说明】

图1.LDH法检测菌株Δ9对哺乳动物细胞系的细胞毒性。

图2.基因工程菌株Δ9体外的生长和存活率。

图3.基因工程菌株Δ9在小鼠体内的生长和存活率，a.定植在肺部的细菌数，b.定植在脾脏的细菌数，c.定植在肝脏的细菌数。

图4.基因工程菌株Δ9在小鼠体内的炎症反应，a.感染后脾脏中炎症因子IL-1β，IL-6，IL-12b和TNFα的基因表达水平，b.感染后肺中炎症因子IL-1β，IL-6，IL-12b和TNFα的基因表达水平。

图5.HeLa细胞中Cre重组酶的转染量，a.Western Blot检测细胞内的Cre蛋白，b.对Western Blot的定量柱状图。

【具体实施方式】

本发明使用的菌种和质粒

铜绿假单胞菌PAK和Δ8(PAK-J背景下敲除染色体上的exoS、exoT、exoY、ndk、popN、rhlR-I,、lasR-I和xcpQ基因)为实验室保存；大肠杆菌DH5α/λpir用于分子克隆，本实验室保存；大肠杆菌S17-1/λpir用于接合转移，本实验室保存；基因敲除载体pEX18Tc，融合蛋白表达载体pExoS₅₄F，本实验室保存。

本发明使用的哺乳动物细胞

Hela细胞为本实验室保存。

本发明使用的实验动物：

雌性BALB/c小鼠(6-8周大小)购自维通利华公司，许可证编号SYXK(津)2014-0003，保证12h光照-黑暗循环环境，所有的程序和实验均遵循国际接受的实验动物饲养使用标准。

本发明使用的试剂

DNA Marker、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP来自于Takara公司；T₄DNA连接酶(Promega)、酵母提取物物(Yeast extract)和胰蛋白胨(Tryptone)购自英国Oxoid公司；蔗糖(Sucrose)和二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品；琼脂糖购自BIOWEST；琼脂粉(Bacto-agar)、四环素和卡那霉素购自自生工生物工程(上海)股份有限公司；基因组提取试剂盒(EasyPureGenomic DNA Extraction Kit)为全氏金公司产品；质粒小提试剂盒(PlasmidMiniPrep Kit)为美国Axygen公司产品；DNA纯化试剂盒(DNA clean&Concentrator)和DNA胶回收试剂盒(Zymoclean Gel DNA Recovery Kit)为美国Zymoresearch公司产品；Anti-Flag抗体和Anti-mouse酶标二抗为Sigma公司产品。

基因敲除质粒的构建

1)以Δ8菌株基因组DNA为模板，PCR扩增得到murI的上下游1-kb左右的同源臂片段。在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物的大小及大致浓度，并切胶回收同源臂DNA片段。

2)取上述PCR产物，上游同源臂片段用限制性内切酶HindIII/NotI酶切，下游同源臂片段用NotI/XbaI进行酶切，然后克隆到具有相应粘性末端的pEX18Tc质粒上，连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂布在含10μg/mL四环素(Tc)的LB平板上筛选转化子，PCR和质粒酶切对转化子进行鉴定，得到基因敲除质粒pEX18Tc-murI。

Δ9菌株的构建

提取保存在大肠杆菌DH5a中的基因敲除质粒pEX18Tc-murI，使用化学转化的方法将质粒分别转化到大肠杆菌S17感受态细胞中。运用接合转移的方法将S17中的基因敲除质粒转入到Δ8菌株中，对Δ8基因组中的murI基因进行敲除。具体操作如下：

1)挑取新鲜划线培养的S17/pEX18Tc-murI单菌落，接种于3mL含有10μg/mL Tc的新鲜无菌L-Broth培养基中，37℃，200rpm振荡过夜培养；同时，挑取新鲜划线培养的Δ8单菌落，接种于3mL新鲜无菌L-Broth培养基中，42℃，200rpm振荡过夜培养；

2)次日分别以1:50的比例，转接过夜培养的S17/pEX18Tc-murI和Δ8分别到3mL含有Tc10和不含有抗生素的L-Broth培养基中，S17/pEX18Tc-uvrA于37℃，200rpm振荡培养至对数期(OD₆₀₀＝0.6-0.8)，Δ8于42℃振荡培养到对数期(OD₆₀₀＝0.8-1.0)；

3)使用紫外分光光度计，测定并记录S17/pEX18Tc-murI和Δ8的OD₆₀₀的数值；

4)分别将S17/pEX18Tc-murI和Δ8培养液，使用1.5mL离心管于12000rpm离心1min，收集菌体，弃去上清。加入1mL L-Broth，使用移液器吹散，于12000rpm离心1min，弃去上清，收集菌体，重复一次，然后将菌体重悬到1mL L-Broth中；

5)在无菌试管中，将S17/pEX18Tc-murI和Δ8以细菌个数比为10:1－5:1的比例混合，调整总菌量少于3×10⁹CFU；

6)连接好膜结合用真空抽滤装置，向装置中加满75％的酒精杀菌，待所有酒精过滤到真空装置中的锥形瓶后，再次向装置中加满75％的酒精洗涤一次。最后向装置中加满无菌水洗涤两次，待无菌水全部真空过滤到锥形瓶后，用无菌镊子取一张0.45μm孔径的无菌的硝酸纤维素膜，小心地置于该装置的装膜位置，重新安装好真空抽滤装置；

7)将步骤5中的混合菌液，使用移液器转移到真空过滤装置中，真空过滤菌液到锥形瓶中，使混合好的S17/pEX18Tc-murI和Δ8存留在硝酸纤维素膜上；

8)用无菌镊子小心地将硝酸纤维素膜存有混合菌的一面朝上放于Nutrient Agar培养基平板上，将培养皿正置于37℃培养箱，静置培养7-16h；

9)将硝酸纤维素膜使用无菌镊子小心地转移到一个无菌试管中，向试管中加入1mL L-Broth，漩涡振荡洗涤硝酸纤维素膜；

10)将硝酸纤维素膜的洗脱培养基转移到1.5mL的无菌离心管中，使用无菌的L-Broth系列稀释到10^-2；

11)分别从原始洗下的菌液、稀释到10^-1和10^-2的离心管中各取100μL涂布于含有适当抗生素的平板上(50μg/mL Tc,25μg/mL Kan)，于37℃培养箱静置培养24-48h；

12)挑取抗生素平板上长出的可能的单交换的单菌落，接种到3mL无抗生素的含10mM D-Glu的L-Broth培养基中，37℃，180rpm振荡培养8h左右，使其浓度达到10⁹CFU/mL；

13)使用新鲜无菌无抗生素的L-Broth培养基，以1:10的比例，系列稀释步骤12中的培养液到细菌细胞浓度为10⁴CFU/mL；

14)分别从10⁴，10⁵，10⁶CFU/mL离心管中各取100μL菌液，涂布到包含和不包含终浓度为7.5％蔗糖的含10mM D-Glu L-Agar培养基平板上，于37℃培养箱静置过夜培养；

15)次日比较含蔗糖的平板和不含蔗糖的平板上的菌落数，含蔗糖平板上出现的菌落数应该明显少于不含蔗糖平板上的菌落数。最佳结果应为蔗糖平板上出现10-100个菌落，而不含蔗糖的平板上出现更多的菌落；

16)从含有7.5％蔗糖的平板上挑选单菌落，于终浓度为7.5％蔗糖的含10mM D-Glu L-Agar平板上纯化；

17)将筛选到的双交换菌落，分别以单交换菌落和出发菌株Δ8的培养液为对照，进行菌液PCR验证和抗生素抗性检测。

18)挑选PCR验证正确的单菌落，制25％甘油管冻存于-80℃，最终获得了Δ9菌株。细菌细胞毒性检测

挑取新鲜培养的PAK和Δ8单菌落接种到LB培养基中，Δ9接种于新鲜的含10mM D-Glu的LB培养基中，37℃振荡过夜培养；次日按照1:50的比例分别转接，37℃传代培养至对数期，OD₆₀₀为1.0左右；然后取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，弃去上清，再重悬于1mL的1×PBS中，在含有5％FBS和无抗生素的DMEM培养基中，以感染复数MOI＝50，感染细胞。共培养4h后，用乳酸脱氢酶(LDH)释放检测的方法，比较野生型菌株和基因工程菌株对哺乳动物细胞的毒性。

细菌体外生长和存活率实验

1)挑取新鲜划线培养的Δ8菌株和Δ9菌株单菌落，分别接种于3mL新鲜无菌LB培养基和含10mM D-Glu的LB培养基中，37℃、200rpm振荡过夜培养；次日以1:50转接过夜培养的菌液到3mL LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养到OD₆₀₀＝0.8-1.0；

2)取对数期的菌液1mL，用无菌的1×PBS溶液清洗两次，12000rpm离心1min收集菌体，弃去上清，再重悬于1mL的1×PBS中，最终取适量稀释至10⁶CFU/mL的新鲜的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养；

3)每隔一定时间取100μL原始菌液，稀释到10^-1和10^-2的离心管中各取20μL涂布于含有10mM D-Glu的LB平板上，于37℃培养箱静置培养24-48h，检测试管中Δ8和Δ9的活菌数；

4)统计Δ8菌株和Δ9菌株平板上的菌落数目，并绘制变化趋势图。

小鼠腹腔感染模型实验

1、细菌感染小鼠

1)挑取新鲜划线的单菌落，接种到含有3mL的LB液体培养基中，37℃过夜振荡培养；

2)按1:50转接过夜的培养物至3ml的LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h，至OD₆₀₀＝0.8-1.0；

3)按OD₆₀₀＝1时菌浓度为1×10⁹CFU/mL计算菌数；收集菌体(1×10⁹CFU)，12000rpm室温离心2min，弃去上清；

4)用1ml的PBS缓冲液洗涤菌体，12000rpm室温离心2min，弃去上清。加入适当体积的PBS缓冲液重悬菌体沉淀，调到所需的菌体浓度备用；

5)向小鼠腹腔注射50μL(1×10⁸CFU)菌悬液；

6)在感染后12h用CO₂窒息法处死小鼠，按需求进行下一步操作。

2、肺组织匀浆

1)用CO₂处理小鼠，迅速解剖被处死的小鼠，打开腹腔和胸腔，剪下整个肺、肝、脾等组织，放到于无菌的玻璃试管中，迅速置于冰上；

2)向玻璃试管中加入1mL的1％的蛋白胨溶液，如果组织用来提RNA，则加入1mLTrizol溶液；

3)利用手提式调整匀浆仪进行肺组织匀浆。将匀浆刀头插入玻璃试管的液体中(不能接触试管底)，匀浆5s，将玻璃试管再置于冰上，间歇10s后，重复匀浆过程4次；

4)取小量体积的匀浆液，进行梯度稀释，滴板计数。

3、组织RNA的提取

1)将研磨好的组织液12000rpm离心5min，使组织碎片完全沉淀，吸取上清液到新的不含RNA酶的EP管中；

2)每1mL Trizol溶液中加入200μL氯仿，漩涡振荡15s，室温静置3min；

3)4℃，12000rpm离心15min，吸取上层水相至新的不含RNA酶的EP管中；

4)加入500μL异丙醇，混匀后，室温静置10min；

5)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

6)加入1mL 75％乙醇(不含RNA酶)洗涤，4℃，7500rpm离心5min，弃上清，尽量吸出管内液体；

7)重复此操作一次；

8)室温晾干，加入30μL RNA-free ddH₂O，溶解RNA，-80℃保存备用。

4、RNA的反转录为cDNA合成和实时定量PCR

1)RNA反转录体系(20μL)

2)轻轻混匀，放入PCR仪中，设置如下程序：

30℃ 10min

42℃ 30min

70℃ 15min

3)反应结束后，5倍稀释cDNA作为模板，进行实时定量PCR；

4)配制qRT-PCR扩增体系(16μL)：

5)体系混匀后，程序运行如下：

6)实验结果分析：实验结束后，分析结果前，首先与对照比较确定是否有DNA污染，如果没有污染，可进行后续结果分析。

Cre重组酶递送菌株的构建

PCR扩增Cre基因，克隆到表达载体pExoS₅₄F中，构建成表达载体pExoS₅₄F-Cre。将该表达载体电转化入铜绿假单胞菌Δ8和Δ9菌株，构建成Cre递送菌株Δ8/pExoS₅₄F-Cre和Δ9/pExoS₅₄F-Cre。该菌株在接触到靶细胞或在EGTA诱导下，其T3SS被激活，细菌大量表达Cre重组酶蛋白，该蛋白与表达载体上的T3SS分泌信号ExoS₅₄融合，因此可通过T3SS注入到靶细胞或分泌到细菌上清液中。

Western blot检测营养缺陷型菌株中Cre蛋白的分泌注入

1)挑取新鲜划线培养的单菌落，接种到3mL含有适当抗生素的L-Broth培养基中，37℃200rpm振荡过夜培养；

2)次日按照1:50的比例，接种到含有相应抗生素及10mM D-Glu的L-Broth培养基中，37℃200rpm振荡培养3h至OD₆₀₀为1.0左右；

3)取1mL菌液置于1.5mL离心管中，于室温12000rpm离心1min收集菌体，弃去上清，1×PBS洗涤2次，重悬于含有5％FBS和无抗生素的DMEM培养基中，以MOI＝50感染细胞；

4)共培养4h后，弃去细菌，PBS洗涤细胞3次后，再用胰酶消化的方法收集细胞，制备蛋白样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳；

5)由于Cre融合蛋白中带有Flag标签，用Flag抗体可对Cre蛋白进行western blot检测，以beta-actin作为细胞内参以评估ExoS₅₄-Flag-Cre融合蛋白的注入量。

数据分析

数据使用平均值(n≥3)±标准偏差来表示，两组间比较使用t检验。“*”表示p<0.05被认为在统计学上有显著性差异，“***”表示p<0.001，“ns”表示无统计学差异。采用imageJ软件完成对Western blot条带的定量分析。

实施例1.基因工程菌株Δ9的构建

以Δ8菌株基因组DNA为模板，PCR扩增得到murI的上下游1-kb左右的同源臂片段。上述PCR产物经酶切后克隆到质粒pEX18Tc上，构建基因敲除质粒pEX18Tc-murI。提取保存在DH5a中的基因敲除质粒，使用化学转化的方法将质粒分别转化到大肠杆菌S17感受态细胞中。采用接合转移的方法将S17中的基因敲除质粒转入到Δ8菌株中，对Δ8基因组中的murI基因进行敲除。在含有50μg/mL四环素的琼脂糖平板上筛选单侧同源臂发生同源重组的单交换菌株，然后在含有7.5％蔗糖的琼脂糖和10mM D-Glu的平板上筛选双侧同源臂均发生同源重组的菌株，最终获得突变株Δ9。

实施例2.基因工程菌株Δ9对哺乳动物HeLa细胞的细胞毒性

选取野生型菌株PAK，减毒菌株Δ8和营养缺陷型减毒株Δ9作为感染菌株，比较其对哺乳动物细胞HeLa的细胞毒性。细胞毒性强弱通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测。当细胞受到损伤时，会导致胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶LDH，在乳酸脱氢酶的作用下，NAD⁺被还原成NADH，NADH经催化反应生成强生色物，在490nm波长下产生吸收峰，通过比色来定量LDH活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。将HeLa细胞培养至70-80％的细胞密度；挑取新鲜的PAK和Δ8单菌落接种到LB培养基中，Δ9单菌落接种到含10mM D-Glu LB培养基中，37℃振荡过夜培养；次日按照1:50的比例相应的培养基中转接到，37℃传代培养至对数期，OD₆₀₀为1.0左右；然后取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，弃去上清，1×PBS洗一次，将细菌重悬于含有5％FBS和无抗生素的DMEM培养基中，以MOI＝50，感染细胞。取120μL细胞上清液，加入60μL的LDH检测试剂，混匀，室温下避光孵育30min，然后在490nm波长下测定吸光度。三种菌株均以MOI＝50侵染哺乳动物细胞4h。细胞毒性如图1所示，以无细菌感染的细胞作为对照(-)，野生型菌株PAK对各种哺乳动物细胞均具有显著的细胞毒性，而减毒菌Δ8和营养缺陷型减毒株Δ9在测试条件下几乎无细胞毒性。

实施例3.基因工程菌株Δ9体外的生长和存活率

由于细菌感染细胞最后涉及到细菌如何清除的问题，以前我们使用高浓度的环丙沙星能彻底清除细菌，但通过转录组分析得知，高浓度环丙沙星处理对细胞表达谱会产生严重的影响。而当murI基因突变后，使得细菌无法合成细胞壁，最终死亡，从而实现了不使用抗生素或使用普通的双抗便可彻底清除细菌的方法，也减少了高浓度环丙沙星对细胞的毒理作用。因此，为了确定murI突变株Δ9在不补充D-Glu时无法繁殖，我们研究了Δ9在体外的生长情况，在添加D-Glu(+)和不添加D-Glu(-)的条件下，每隔一定时间，滴板检测试管中细菌的数量，绘制成曲线图。如图2所示，在不添加D-Glu(-)的条件下，随着时间的延长Δ9的活菌数量逐渐减少，并在20小时候全部死亡，表明在D-Glu营养限制的情况下，当murI基因缺失后确实会导致细菌死亡。

实施例4.基因工程菌株Δ9在小鼠体内的生长和存活率

为了确定Δ9体内应用的安全性，我们使用了小鼠腹腔感染模型。使用了Δ8和Δ9(10⁸CFU)，腹腔注射感染雌性BALB/c小鼠(6-8周大小)。感染12小时后，取肺、脾和肝组织，匀浆后，梯度稀释匀浆液，并滴板计量小鼠各器官的活菌数。由图3(a、b、c)可知，Δ9菌株在小鼠体内的存活率较其背景菌株Δ8显著下降。

实施例5.基因工程菌株Δ9在小鼠体内的炎症反应

为了确定Δ9在小鼠体内是否引起较低的炎症反应，我们测定了Δ8和Δ9(10⁸CFU)感染小鼠后的促炎症细胞因子的表达水平，其中包括IL-1β(白介素-1β)、IL-6(白介素-6)、IL-12b(白介素-12b)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)。在感染12小时后，取小鼠的脾和肺组织，研磨提取总RNA，然后用real-time PCR检测不同促炎症细胞因子的表达水平。由图4a可知，Δ9感染的小鼠脾部，IL-1β、IL-6、IL-12b的mRNA水平显著低于Δ8感染的，TNF-α的表达水平相似，没有明显差异；Δ9感染的小鼠肺部(见图4b)，IL-6、TNF-α的mRNA水平显著低于Δ8感染的，IL-1β、IL-12b的表达水平，没有明显差异。以上结果表明，Δ9在小鼠体内引起的炎症反应要小于Δ8。

实施例6.利用基因工程菌株Δ9向HeLa细胞内注入Cre重组酶

PCR扩增Cre基因，克隆到表达载体pExoS₅₄F中，使Cre重组酶与T3SS分泌信号肽ExoS₅₄相融合，构建成表达载体pExoS₅₄F-Cre。将该表达载体分别电转化入铜绿假单胞菌Δ8和Δ9菌株中，构建成Cre递送菌株Δ8/Cre和Δ9/Cre。该菌株在接触到靶细胞后，其T3SS被激活，表达载体pExoS₅₄F-Cre表达ExoS₅₄-Flag-Cre融合蛋白，该融合蛋白可通过T3SS注入到靶细胞当中。由于表达载体上ExoS₅₄序列后面带有Flag标签，因此可通过Western blot方法检测融合蛋白的表达。外源蛋白Cre可以在T3SS分泌信号ExoS₅₄的引导下注入HeLa细胞，以Actin作为内参(图5a)。以Δ8为对照，在相同的MOI，相同的感染时间，不添加D-Glu的情况下，Δ9仍然具有蛋白注入的能力，且蛋白注入量相对Δ8更高(图5b)。

Claims (8)

1.一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于：具体步骤包括：

以Δ8菌株基因组DNA为模板，PCR扩增得到murI的上下游1-kb的同源臂片段；上述PCR产物经酶切后克隆到质粒pEX18Tc上，构建基因敲除质粒pEX18Tc-murI；提取保存在DH5a中的基因敲除质粒，使用化学转化的方法将质粒分别转化到大肠杆菌S17感受态细胞中；采用接合转移的方法将S17中的基因敲除质粒转入到Δ8菌株中，对Δ8基因组中的murI基因进行敲除；在含有50μg/mL四环素的琼脂糖平板上筛选单侧同源臂发生同源重组的单交换菌株，然后在含有7.5％蔗糖的琼脂糖和10mM D-Glu的平板上筛选双侧同源臂均 发生同源重组的菌株，最终获得突变株Δ9；

该菌对哺乳动物细胞无细胞毒性，在不添加外源的D-谷氨酸时无繁殖能力，能够通过D-谷氨酸营养缺陷限制抑制细菌的增殖；Δ9菌株的III型分泌系统具有完整功能，能够在短时间内实施对哺乳动物细胞的蛋白质转染；

所述铜绿假单胞菌Δ8菌株为敲除PAK-J菌株染色体上的exoS、exoT、exoY、ndk、popN、rhlR-I、lasR-I和xcpQ基因所得。

2.根据权利要求1所述的减毒铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于：以10⁸CFU的Δ9菌株感染哺乳动物细胞4小时无显著的细胞毒性产生。

3.根据权利要求1所述的减毒铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于：菌株Δ9在补充10mM D-谷氨酸的培养基中可正常生长；而不添加外源的D-谷氨酸时，细菌无法繁殖；在D-谷氨酸营养限制条件下，以10⁸CFU的Δ9菌株感染HeLa细胞4小时后，用PBS洗去浮游细菌，残留细菌经抗生素处理15小时可彻底清除。

4.根据权利要求1所述的减毒铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于：由于哺乳动物体内环境无D-谷氨酸，以10⁸CFU的Δ9菌株感染小鼠，12小时后，小鼠各器官内细菌的存活率几乎为零，且在小鼠体内引起的炎症反应较弱。

5.根据权利要求1所述的减毒铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于：菌株Δ9具有完整的III型分泌系统，Δ9菌株在无D-谷氨酸培养基中仍保留完好的III型蛋白质分泌功能，在接触到哺乳动物细胞的时候细菌的III型分泌被激活，能够高效地向哺乳动物细胞内注入效应蛋白。

6.权利要求1所述方法构建的菌株Δ9的应用，其特征在于：所述的减毒菌株Δ9应用于体外哺乳动物细胞的蛋白质转染，即通过将目标蛋白与III型分泌系统信号肽ExoS54融合表达于表达载体pExoS54F中，当携带有该表达载体的Δ9菌株与哺乳动物细胞共同培养的时候，Δ9的III型分泌系统被激活，目标蛋白与ExoS54融合表达，从而通过III型分泌系统的针状复合物被注入到哺乳动物细胞当中。

7.根据权利要求6所述的菌株Δ9的应用，其特征在于：所注入的目标蛋白为转录因子，酶，疫苗，结构蛋白或效应因子。

8.根据权利要求6所述的菌株Δ9的应用，其特征在于：所述的工程菌株Δ9应用于各种哺乳动物细胞系的蛋白质转染，所述的细胞系包括人和鼠的皮肤细胞、肌细胞、肠道细胞、肝细胞、免疫细胞和诱导性多能干细胞。

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