CN111848772B

CN111848772B - SAMD9突变型蛋白、Vero细胞系及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN111848772B
Application number: CN202010770180.7A
Authority: CN
Inventors: 唐娜; 沈志强; 张倩; 苑文娴; 管宇; 肖跃强; 苗立中
Original assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy; Shandong Lvdu Bio Sicience & Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy; Shandong Lvdu Bio Sicience & Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-03
Filing date: 2020-08-03
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2040-08-03
Also published as: CN111848772A

Abstract

本发明公开了SAMD9突变型蛋白，所述SAMD9突变型蛋白的氨基酸序列缺少第61~448位氨基酸。本发明还公开了编码该蛋白的基因、细胞系及其在制备山羊痘病毒疫苗中的应用。本发明还公开了SAMD9突变型蛋白的Vero细胞系的制备方法。本发明通过基因编辑技术敲除了Vero细胞SAMD9基因的AlbA_2结构域及其两侧序列，以降低Vero细胞的病毒抑制功能，获得的SAMD9突变型蛋白Vero细胞对山羊痘病毒具有更高的易感性，且遗传性状稳定，能够应用到山羊痘病毒等病毒疫苗生产中，替代原代细胞疫苗生产工艺，大幅度降低生产成本，并提高疫苗的安全性。

Description

SAMD9突变型蛋白、Vero细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及细胞与病毒疫苗领域，具体涉及SAMD9突变型蛋白、Vero细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

非洲绿猴肾细胞(Vero)是世界卫生组织允许用于疫苗生产的细胞株，它的研究背景相对清晰，又对多种病毒敏感，在病毒的分离培养、机制研究等方面也具有非常重要的应用价值。在痘病毒研究方面，早从上世纪70年代起就陆续有报道猴痘病毒(Lourie，Binghamet al.1972)、痘苗病毒(Tsuchiya and Tagaya 1979)、小鼠痘病毒(Tantawi，Zaghloul etal.1983)、骆驼痘病毒(el Harrak，Loutfi et al.1991)等正痘病毒属病毒，羊口疮等副痘病毒属病毒(Rziha，Henkel et al.2000)均可在Vero细胞生长形成病变灶。

但是，常用的Vero细胞在羊痘病毒属痘病毒(山羊痘病毒、绵羊痘病毒、皮肤结节病病毒)培养方面的应用却表现出很大的局限性。山羊痘病毒和绵羊痘病毒对原代羔羊睾丸细胞和肾细胞最易感(OIE陆生动物手册，2017)，直接在Vero细胞上接种往往不能出现稳定的病变。现有的山羊痘病毒和绵羊痘病毒Vero细胞适应株是先将羊痘病毒在原代羊细胞中连续传代几十代，再转接种至Vero细胞上连续传代9～26代以上而成的(Hosamani，Nandiet al.2004)，(Chaudhary，Pandey et al.2009)。即便如此，仍然有很多羊痘病毒株在Vero细胞上不能稳定产生病变(6代以后病变消失，安维雪等，2016)或者增殖效价相对较低(比原代羊睾丸细胞培养低31.6～63.1倍，李春艳，2011)，导致我国现有的羊痘疫苗生产工艺仍然摆脱不了原代羊睾丸细胞生产方法(中华人民共和国兽药典三部2015版)。然而，原代细胞制备需要大量新鲜羔羊组织，羔羊组织的无菌摘取操作要求复杂、组织中细胞数量有限、羔羊成本较高，严重限制了山羊痘疫苗的批生产产量。目前国内绵羊养殖水平不一，羔绵羊感染布氏杆菌、支原体、牛病毒性腹泻病毒等致病菌及病毒的风险仍然较高，也在很大程度上增加了操作人员生物安全风险和生产检验成本。因此，如能显著提高Vero细胞增殖羊痘病毒的能力，替代现有原代细胞培养方法，必将有力提升羊痘疫苗生产技术，促进羊病防控领域的技术进步。

随着功能基因组学的发展，蛋白质相互作用的研究已成为分子生物学家研究的热点之一，蛋白质与其他蛋白质之间形成的稳定或临时复合物，对生物体的活动如信号引导、转录、代谢网络调控等有很多影响。目前对羊痘病毒在宿主细胞中增殖的机制仍然较为缺乏，但是Vero细胞中有一种广泛存在于多种动植物细胞质中的蛋白——SAMD9蛋白，可能与应激、抗病毒和细胞凋亡有关。RNA干扰试验证明，SAMD9是细胞固有免疫的关键蛋白，其表达量下降能够明显提高细胞内日本乙型脑炎病毒(JEV)的复制(Zhang LK，2013)。痘苗病毒感染Vero细胞后，细胞中的SAMD9蛋白可以与痘苗病毒的C7L家族蛋白结合，形成“分子爪”状结构，抑制核糖体中cap依赖性蛋白质的合成和抑制病毒mRNA的解离，阻断病毒mRNA翻译过程(Meng X，2015)。

早期研究分析预测认为，SAMD9家族蛋白主要架构从N端至C端依次为：一个SAM结构域、一个AlbA_2结构域、一个SIR2家族组蛋白脱乙酰酶类似结构域、一组P环型三磷酸酶(P-loop NTPase)结构域串联TPR重复序列，和一个类似冷休克DNA结合蛋白的C端OB折叠结构域。其中SAM结构域和P-loop NTPase结构可能具有调节细胞凋亡和炎症信号通路的作用，AlbA_2结构域(在SIR2类似结构域的辅助下)和C端OB折叠结构域可能具有结合病毒核酸的能力，从而介导SAMD9蛋白对病毒复制的抑制作用(Mekhedov，Makarova et al.2017)。

发明内容

发明目的：为了克服细胞固有免疫对Vero细胞增殖山羊痘病毒的限制，通过基因编辑突变非洲绿猴肾细胞Vero细胞(源自ATCC细胞库，编号ATCC CCL-81)的SAMD9基因中核酸结合区AlbA_2结构域编码区域，降低SAMD9蛋白的抑制病毒功能，从而提高山羊痘病毒在Vero细胞上的增殖能力，为山羊痘疫苗生产提供优秀细胞系。

本发明采用的技术方案如下：本发明提供了SAMD9突变型蛋白，所述SAMD9突变型蛋白的氨基酸序列缺失第61～448位氨基酸(AlbA_2结构域及两侧共388aa的序列)。

其中，所述的SAMD9突变型蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明内容还包括编码所述的突变型蛋白的SAMD9突变型基因。

其中，所述SAMD9突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明内容还包括SAMD9突变型蛋白的Vero细胞系，其含有所述的基因。

本发明内容还包括所述的SAMD9突变型蛋白的细胞系的制备方法，包括以下步骤：通过扩增测序获取了Vero细胞SAMD9基因序列，在其AlbA_2结构域两侧设计基因敲除sgRNA，应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对Vero细胞SAMD9基因的AlbA_2结构域实施基因敲除，经过克隆筛选纯化获得SAMD9突变型Vero细胞，命名为VeroSAMD9。

其中，所述gRNA序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

其中，所述克隆筛选中采用的PCR引物序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。

本发明内容还包括所述的突变型蛋白、所述的突变型基因、所述的细胞系在制备山羊痘病毒疫苗中的应用。

本发明内容还包括一种山羊痘病毒疫苗，所述疫苗包括所述的SAMD9突变型蛋白。

与亲本Vero细胞相比，本发明的突变型细胞VeroSAMD9株缺失了181～1344bp区域共计1164bp碱基序列。推导其氨基酸序列，VeroSAMD9细胞的SAMD9基因编码1200aa蛋白，与亲本细胞相比，该细胞缺失了AlbA_2结构域及两侧共计388个氨基酸。

Vero SAMD9株的SAMD9突变型基因编码序列为：SEQ ID NO：1

Vero SAMD9株的SAMD9突变型蛋白氨基酸序列为：SEQ ID NO：2

突变型克隆株VeroSAMD9的细胞形态较为单一，为均匀的上皮样细胞。绘制的细胞生长曲线表明，VeroSAMD9株在接种24小时即呈对数生长，形成细胞单层后可维持良好细胞形态168小时以上，为山羊痘病毒的充分增殖创造了良好的细胞条件。与亲本株相比，VeroSAMD9株的细胞饱和密度较为一致，但细胞倍增时间缩短，细胞贴壁更好，形成较大集落，其种板效率是亲本株的2.46倍左右。

应用山羊痘病毒疫苗毒AV41株(购自中国兽医药品监察所菌种保藏管理中心)感染VeroSAMD9株发现，AV41株在VeroSAMD9上的效价可以达到10^7.25TCID₅₀/ml，比亲本Vero株(10^4.125TCID₅₀/ml)高1000倍以上，比原代羊睾丸细胞(10^6.5TCID₅₀/ml)高5～10倍。应用VeroSAMD9细胞株连续培养疫苗毒15代，病毒效价一直维持在10^7.0TCID₅₀/ml以上，相对较为稳定。

连续传代20代后测定SAMD9突变型基因序列，未出现任何回复突变，VeroSAMD9株的遗传较为稳定。对第15代AV41株病毒的主要毒力基因F3L、Kelch-like protein 2、Kelch-like protein 3等测序证明，应用VeroSAMD9连续传代未造成山羊痘病毒的基因突变。

将临床检测阳性的山羊痘病毒含毒组织匀浆处理后，过滤上清接种VeroSAMD9细胞，连续传代3代后，细胞病变较为稳定，PCR扩增并测序验证分离到山羊痘病毒。证明该细胞可以用于山羊痘病毒野毒株的分离培养。

应用VeroSAMD9细胞替代羔绵羊原代细胞，建立了山羊痘疫苗的生产方法。对生产的3个批次山羊痘疫苗按照《中华人民共和国兽药典》公布的安全与效力检验方法进行检验，均符合规定，证明该传代细胞源山羊痘疫苗具有良好的安全性与免疫保护能力。应用VeroSAMD9细胞生产山羊痘病毒疫苗，成本显著降低，疫苗效力稳定，每瓶疫苗中病毒含量可达100头份以上。

有益效果：本发明通过基因编辑技术敲除了Vero细胞SAMD9基因的AlbA 2结构域及其两侧序列，以降低Vero细胞的病毒抑制功能，获得的SAMD9突变型细胞对山羊痘病毒具有更高的易感性，且遗传性状稳定，能够应用到山羊痘病毒等病毒疫苗生产中，替代原代细胞疫苗生产工艺，大幅度降低生产成本，并提高疫苗的安全性。

此外，本发明获得的SAMD9突变型细胞对组织中的山羊痘病毒也有更高的易感性，可以用于山羊痘病毒的分离鉴定、细胞抗病毒作用研究等研究开发过程中。

附图说明

图1为转染后细胞单克隆PCR鉴定结果，M为DNAmarker，F0为转染后的细胞培养物，D6～A2为第一轮单克隆后挑选的单细胞团孔，各泳道中1430bp条带为未编辑的扩增产物，275bp大小条带为编辑后的突变基因扩增产物，500bp条带为非特异性扩增条带。其中A3克隆表现出明亮而浓厚的275bp突变基因条带，仅出现少量的1430bp未编辑基因，表明A3克隆中出现了较大比例的SAMD9基因缺失细胞。

图2为Vero SAMD9和Vero的测序峰图。2A为Vero SAMD9细胞株SAMD9基因160～200bp处序列图；2B为亲本Vero细胞160～200bp处序列图，其中160～180bp与Vero SAMD9细胞160～180bp序列相同；Vero2C为亲本Vero细胞1324～1365bp区域的序列图，其中1345～1365bp与Vero SAMD9细胞181～200bp序列一致。

图3为对数生长期Vero SAMD9和Vero的细胞图片。A为Vero SAMD9细胞株，B为Vero细胞。

图4Vero SAMD9和Vero细胞的细胞生长曲线。

图5Vero SAMD9和Vero细胞的贴壁效率实验。

图6山羊痘病毒AV41株感染Vero SAMD9和Vero细胞5天后病变情况。左侧上下分别为感染山羊痘病毒AV41株的Vero SAMD9及未感染的细胞对照，右侧上下分别为感染山羊痘病毒AV41株的Vero细胞及未感染的细胞对照。

图7山羊痘病毒组织样品接种VeroSAMD9细胞产生病变。左图为接种后第三代的细胞，中间图为细胞对照，右图为细胞液中山羊痘病毒DNA的PCR检测结果，M为DNA marker，F3为第三代细胞液PCR结果，在490bp左右出现明亮的山羊痘目的条带，Ctr为细胞空白对照组。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 Vero SAMD9细胞的构建

1.1 sgRNA设计与制备

根据GenBank中所登录的非洲绿猴基因组SAMD9基因序列(Genbank登录号XM_007982155)，选择其外显子近N端160～420bp序列和1300～1550bp序列，应用设计网站http：//crispr.mit.edu/在线设计两组引导RNA序列，命名为AlbA_g1和AlbA_g2(表1)，并与人、猴、羊基因组进行比对分析脱靶效应。设计并合成AlbA_g1和AlbA_g2体外转录引物，按照商品化的一步法sgRNA体外转录试剂盒(Inovogen科技)说明书进行PCR扩增和sgRNA转录得到转录后的两种sgRNA，并将sgRNA浓度调整为400ng/μL。

表1试验所用sgRNA及体外转录引物

1.2转染

Vero细胞来源于ATCC细胞库(编号ATCC CCL-81)，培养细胞使其处于对数生长期，传代至24孔板中制备长满90％孔底的细胞单层。各取1.25μl的1.1中转录后的两种sgRNA，分别与2.5μl的商品化Cas9蛋白(Genescript公司，5μM)先后加入到第一个1.5ml管中，等体积混匀，室温反应10分钟后加入20μL Buffer CRISPR缓冲液。按照商品化CRISPR RNP转染试剂盒(Viromer，Origene)说明书，在第二个1.5ml管中配置转染试剂25μL(0.4μL Viromer+24.6μL Buffer CRISPR缓冲液得到Cas9/sgRNA复合物)，并与第一个管中的Cas9/sgRNA复合物迅速等体积混匀，室温孵育15分钟后加入到24孔板中，培养72小时。

1.3基因缺失细胞系的克隆筛选

转染后72小时，将24孔板中的转染细胞消化重悬成单个细胞，以96孔板有限稀释法进行亚克隆。挑选长出单一细胞克隆的孔，以建立的PCR方法(引物见表2SAMDF1和SAMDR1)筛选SAMD9基因缺失的细胞克隆。

表2试验所用缺失鉴定引物与测序引物

经过第一轮细胞亚克隆培养和PCR鉴定，获得了一株PCR出现275bp左右缺失条带的克隆(见附图1)，选择该株进行第二次亚克隆纯化，直到获得生长良好、PCR鉴定为100％纯净(扩增后无1430bp片段，仅出现275bp条带)的基因缺失的细胞克隆株，连续扩大传代，保存4代以上细胞，命名为Vero SAMD9。

1.4 Vero SAMD9株SAMD9基因测序鉴定

根据Genbank登录的非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)基因组SAMD9基因(XM_007982155)序列设计引物，对Vero SA3株的SAMD9基因编码区进行全长扩增并测序(测序引物SAMDF和SAMDR见表2)。

将选育的VeroSAMD9细胞以PBS清洗3次后，按照10000个细胞/ml的密度以PBS重悬，取200uL上清，利用DNA/RNA抽提试剂盒提取核酸。以提取细胞DNA作为模板，使用设计的引物SAMDF和SAMDR扩增各样品的SAMD9全长mRNA，目的片段送生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果与GenBank登录的Chlorocebus sabaeus基因组中相关序列进行比对。

测序比较发现，VeroSAMD9细胞的SAMD9基因编码区全长为3603bp，CRISPR系统在AlbA_g1的近PAM位点3nt前发生了双链断裂，同时在AlbA_g2的近PAM位点3nt前发生双链断裂，产生双切口，切口处经随机修复重新连接，形成基因突变型。与亲本Vero细胞相比，突变型细胞Vero SA3株缺失了181～1344nt区域共计1164bp碱基序列(见附图2)。和推导其氨基酸序列并与亲本Vero细胞进行比对，Vero SA3细胞的SAMD9基因编码1200aa蛋白，与亲本细胞相比，缺失了61-448aa处共388aa，覆盖整个AlbA_2结构域，以及SAM结构域C末端和SIR2结构域N末端少数残基。Vero SA3株的SAMD9基因编码序列和其氨基酸序列见序列表中的序列1和2。

综上，本实施例将Vero细胞经过敲除SAMD9基因AlbA_2结构域筛选而得的一株细胞克隆，该细胞的分子特征是其SAMD9蛋白缺少AlbA_2结构域及两侧388aa片段，以下简称VeroSAMD9细胞。

实施例2 Vero SAMD9细胞的生长特性

2.1 VeroSAMD9细胞传代与形态观察

配置含有6％新生牛血清(康源)的DMEM培养基(GIBCO)作为细胞生长液，以0.25％胰酶(GIBCO)消化Vero SA3细胞，按照每T25培养瓶1×10⁶个细胞的浓度传代，同时对亲本株Vero同样条件传代，观察细胞形态与生长状态。与亲本株相比，突变型克隆株VeroSAMD9的细胞形态较为规则，对数生长期时细胞铺展好，呈较为均匀的多角形样结构(见图3)。

2.2细胞生长曲线

将2.1中传代的Vero SAMD9细胞悬液分别以每孔4000个细胞的密度接种24孔板，同样接种36个孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养，每隔24小时各取3个孔，消化细胞并计数，连续计数9天，将每天的细胞数量绘制成细胞生长曲线(见图4)。试验发现，VeroSAMD9株在接种24小时内出现增殖，24小时后开始呈对数生长，72h后细胞形成较好的单层，生长速度减缓，约168小时进入平台期，此后仍可维持良好细胞形态3天以上，为病毒的充分增殖创造了良好的细胞条件。与亲本Vero细胞相比，VeroSAMD9倍增时间显著缩短，但饱和密度较为一致。

2.3贴壁效率

将2.1中传代的VeroSAMD9细胞悬液分别稀释成10、20、100、200个/ml，分别取5ml含有细胞的培养基接种到6cm细胞培养皿中，置于37℃二氧化碳培养箱培养直到培养皿中肉眼可见细胞集落。弃去培养基，以甲醇固定细胞10min，加入结晶紫染色10min，用水冲洗培养皿并自然干燥。选择细胞数大于16个的集落进行计数并计算贴壁效率。结晶紫染色后，VeroSAMD9细胞各个试验组的细胞集落从数目上、集落大小上均与亲本Vero细胞有显著差别，VeroSAMD9细胞形成的集落明显较大，而Vero细胞多形成针尖大小的集落(图5)。定义阈值为每个集落50个细胞，则线性范围内VeroSAMD9细胞种板效率约为40.35％(R²＝0.9942)，Vero细胞种板效率约为16.43％(R²＝0.998)，VeroSAMD9细胞的种板效率约是亲本细胞的2.46倍。

实施例3山羊痘病毒在VeroSAMD9与Vero中的传代特性比较

分别以相同数量的Vero细胞及亚克隆细胞株VeroSAMD9制备细胞单层，按照1∶50体积比接种相等剂量山羊痘病毒AV41株(购自中国兽医药品监察所菌种保藏管理中心)，待培养7天，或有75％左右细胞出现病变时收获，反复冻融收获的病毒液，继续按照1∶50体积比接种相应细胞，连续传代15代，将第1、5、10、15代病毒液分别以药典所规定方法测定病毒效价，比较AV41株在两种细胞上的传代增殖特性。

在传代中观察发现，VeroSAMD9在接种第一代山羊痘病毒AV41株后5天即观察到明显的细胞病变(见图6)，7天时病变细胞约50％以上，此后传代过程中病毒效价逐渐增高，5代后趋于稳定，病毒效价可达10⁷TCID₅₀/ml以上。而Vero细胞接种山羊痘病毒AV41株后病变较差，第一代培养5～7天仅能观察到少数几个病变灶(图6)，此后传代过程中病毒效价先缓慢增高又逐渐下降，在8代时，6天时间仍未达到75％左右病变。10代以后接种后7天内不再出现病变。效价测定结果见表3，AV41株在VeroSAMD9上的效价可以达到10^7.25TCID₅₀/ml，比亲本Vero株(10^4.125TCID₅₀/ml)高1000倍以上，比原代羊睾丸细胞(10^6.5TCID₅₀/ml)高5～10倍。应用VeroSAMD9细胞株连续培养疫苗毒15代，病毒效价一直维持在10^7.0TCID₅₀/ml以上，相对较为稳定。

表3山羊痘病毒在VeroSAMD9与Vero细胞上的连续传代的效价比较

实施例4 VeroSAMD9在山羊痘临床样品病毒分离中的应用

将临床诊断为山羊痘阳性的流产胎儿组织样本匀浆处理后，过滤上清接种VeroSAMD9细胞，连续传代3代，VeroSAMD9细胞出现明显的细胞病变，而亲本株Vero细胞未观察到明显病变。以山羊痘病毒P32基因特异性引物(上游引物P1：5′-CAAATCGTATGCCGATGC-3′；下游引物P2：5′-TCAGGAAATCtATGAGCC-3′，其PCR扩增产物为490bp)进行PCR检测，VeroSAMD9细胞培养物中山羊痘病毒阳性(见图7)，经测序验证，其序列与NCBI数据库中登录的山羊痘病毒P32基因的同源性为99％～100％，该细胞可以用于山羊痘病毒野毒株的分离培养。

实施例5 VeroSAMD9细胞SAMD9基因的传代稳定性

将VeroSAMD9细胞连续传代20代以上，取第20代样品，按照实施例1中实验1.4所用引物及实验步骤，扩增SAMD9编码区全长约4800bp目的片段，送生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果与实施例1中实验1.4所得序列进行比对，其序列同源性100％，未出现任何回复突变，VeroSAMD9株的遗传较为稳定。

实施例6山羊痘病毒基因在VeroSAMD9中的传代稳定性

根据Genbank登录的GTPV AV41株的基因组(MH381810.1)序列，设计6对特异性的引物，分别扩增3个主要毒力基因F3L、Kelch-like protein 2、Kelch-like protein 3和3个宿主相关基因gp67、gp133、gp134，由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列及产物大小见表4。

表4引物序列及产物大小

以选育的VeroSAMD9细胞连续培养AV41病毒至第20代，将新收获的病毒样品冻融2次后进行12000r/min离心5min，取200μ1上清，利用病毒RNA/DNA抽提试剂盒提取病毒核酸。以提取的山羊痘病毒的DNA作为模板使用设计的引物扩增各个目的基因片段。扩增体系：2×Premix Taq 10μL、上下游引物(10μM)各1μL、DNA模板2μL、灭菌双蒸水6uL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。1％的琼脂糖凝胶电泳进行结果鉴定。胶回收目的片段，用微量紫外分光光度计测定质粒的浓度与纯度，送生工生物工程(上海)有限公司测序，与AV41原始代次基因序列进行比对，结果以上6种毒力相关基因序列和宿主范围相关基因均未发生任何变异。

实施例7 VeroSAMD9细胞源山羊痘疫苗的初步应用

7.1疫苗制备与一般检验

应用VeroSAMD9细胞替代羔绵羊原代细胞增殖山羊痘病毒AV41株，先后收获3批病毒液，按照《中华人民共和国兽药典》2015年版所述方法分别配置冻干疫苗并进行各项检验。样品在胰酪大豆胨液体培养基和硫乙醇酸盐流体培养基小管中连续培养7天无细菌生长；在支原体液体培养基和固体培养基中连续培养30天，无支原体生长，PCR检测阴性；样品反复冻融后取上清接种Vero细胞和羊睾丸细胞等连续培养3代，未观察到病变，无红细胞吸附现象，PCR检测无BVDV。

7.2特异性检验与效价测定

样品以山羊痘阳性血清中和后接种VeroSAMD9细胞，连续培养7天未出现病变。疫苗样品测定效价分别为10^4.0TCID₅₀/头份、10^3.875TCID₅₀/头份、10^3.625TCID₅₀/头份，符合规定要求。

7.3安全检验

用12～18月龄健康山羊9只，用灭菌生理盐水分别将疫苗稀释成每毫升病毒含量为4头份(4×10^3.5TCID₅₀)，分别于腹部皮内注射山羊3只，每只注射2点，每点0.5ml，观察15日，判定各批次疫苗接种山羊的接种部位痘疹情况。整个观察期间，各批次疫苗接种的3只山羊体温均无明显波动、精神佳、采食正常。接种3天后，各组山羊相继出现痘肿反应，5～6d时达到最大(直径1.5～3.5cm)，呈微红色或无色，此后开始逐渐消退，注射部位发痘情况见表5，三批疫苗安全性合格。

表5安检山羊痘斑情况表

7.4效力检验

用12～18月龄健康山羊9只，用灭菌生理盐水将各批疫苗稀释成每毫升病毒含量为0.02头份(约63.25TCID₅₀)，分别在胸腹部皮内注射山羊3只，每只注射2点，每点0.5ml，观察15日，记录注射部位发痘情况。各批次3只效力检验山羊在疫苗注射15日内体温均无明显波动、精神佳、采食正常，注射部位发痘情况见表6，三批疫苗效力符合要求。

表6效检山羊痘斑情况表

序列表

<110> 山东绿都生物科技有限公司、山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> SAMD9突变型蛋白、Vero细胞系及其构建方法和应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3603

<212> DNA

<213> SAMD9突变型基因(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcaaagc aactgaacct tccacaaaat acagatgatt ggaccaaaga ggatgtaaat 60

aggtggttag aaagtcacaa gattgaccaa aaacacaggg aaattttgac tggacaagat 120

gtgaatggag cagtgttgaa gtggttaaaa aaagaacatc ttgttgatat gggcatcacc 180

aatggagtgg tccaagatta caaagcaagc cgagtagcaa accttcactt tccaagtatg 240

tatgtagaag ggaaaaccac accaaatgag aagatttcta ctctgaatct ttaccatcaa 300

ccaagctgga ttttctgcaa tggcaggtca gaccttgaca gtgaaaaata taaacccttt 360

gatccaagtt cctggcaaag agaaagagct tctgatgtca ggaaactgat ttcatttctt 420

acccatgaag acataatgcc aagagggaag tttttggtgg tgtttctatt actatcctct 480

gtggatgacc caagagatcc cctcattgag actttctgtg ctttctacca ggatctcaaa 540

ggaatagaaa atatactgtg tatttgtgta cagccacaca tatttcaggg atggaaagat 600

ctacttgaag caagattaat aaaacaccaa gatgaaattt caagccaatg tatttctgct 660

ttaagccttg aagagatcaa tggcactatt cttaaactaa aatctgtgac tcaatcttca 720

aaaagacttt taccatctat tggcttatcg actgtccttc tgaaaaaaga agaagatatc 780

atgacttctc tggaaattat ctgtgaaaat gaatgtgagg gtacactgtt agagacggac 840

aaaaataaat tccttgaatt caaggcatca aaagaggaag acttctatcg aggtggcaaa 900

gtgtcatggt ggaacttcta cttctcttct gaaagttatt cttcaccttt tgtcaaaagg 960

gataaatatg aaagacttga agcaatgatt caaaactgcg cagattcttc taaaccaaca 1020

tgtaccaaaa ttattcacct gtaccatcat ccaggctgtg ggggaactac cttggctatg 1080

ccaattctct gggacctaag gaaaaaattc agatgtgctg tgctaaaaaa caagacagtg 1140

gatttttctg aaattggaga acaggtaacc aatttaatca cctatggggc aatgaaccga 1200

caggaatatg tacctgtact gctccttgtt gatgattttg aagaacaaga taatgtctat 1260

cttctgcagt actctattca aacagttata gctaaaaagt acattcgata tgaaaaacct 1320

ctggtgatta tcctaaattg tatgagatca caaaatcctg aaaaaagtgc aaggatccca 1380

gacagcattg ccgtaataca gcaactctct cccaaagaac agagagcttt cgagcttaaa 1440

ttgaaagaaa tcaaagaaca gcataaaaat tttgaggatt tttattcctt tatgatcatg 1500

aaaaccaatt ttaataaaga atacatagaa aatgtggtcc ggaatatcct gaaagggcag 1560

aatattttta ccaaggaagc aaagctcttt tcttttctgg ctcttcttaa ttcatatgtg 1620

cctgatacca ccatttcact atcacagtgt gaaagattct taggaattgg aaacaagaag 1680

gctttctggg ggacagaaaa atttgaagac aagatgggca cctactctac aattctgata 1740

aaaacagagg tcatcgaatg tgggaactac tgtggagtac gcatcattca ctctttgatt 1800

gcaaagttct cactggaaga attgaagaaa agctatcacc tgaataaaag tcaaattatg 1860

ttggatatgc taactgagaa tttgttcttc gatactggta tgggaaaaag caaatttttg 1920

caagatatgc acacactcct actcacaaga caccgcaatg aacatgaagg tgaaacagga 1980

aattggtttt ccccatttat tgaagcatta cataaagatg aaggaaatga agcagttgaa 2040

gctgtattgc ttgaaggtat ccatcgattc aacccaaatg cattcatatg ccaagcgttg 2100

gcaagacatt tctacattaa aaagaaggac tttggcaatg ctctaaactg ggcaaaacaa 2160

gcaaaaatca tagaacctga caattcttat atctcagata cactgggtca agtctacaaa 2220

agtaaaataa gatggtggat agaggaaaac ggaagaaaca gaaacatttc agttgatgat 2280

ctaactgctc ttttgaattt agcagaacag gcctcaagtg cattcaaaga atctcaacag 2340

caaagtgaat atagagagta tgaagtgaag gaaaggttgt atcagaagtc aaaaaggagg 2400

tatgatactt acaatatcgc tggttatcaa ggagagatag aagttgggct ttacacaatc 2460

caaattctcc agctcattcc tttttttgat aataaaaatg agctatctaa aagagatatg 2520

gtcaattttg tatcaggaag tggtgatatt ccaggggatc aaaatgatga atataaatta 2580

gccctcaaaa actatattcc ttatttaact aaattgaaat tttctttgaa aaagtccttt 2640

gatttttttg atgaatactt tgtcctgcta aaacccagga acaacattaa gcaaaatgaa 2700

aaggccaaaa ctcggagaaa ggtggccgta tattttaaga aatatacaga tatattttgt 2760

ctcttagaag aatcacaaga cataggtctt ggatcaaagt tcagtgagcc acttcaaata 2820

gagagatgcc ggaaaagcgt agtagcttta aaagcagaca agtgttctgg gctcttggaa 2880

tatcttatca aaagtcaaga ggatgctata agcactatgg aatatatagt gaacaaatat 2940

gcttttctct tagaacaatg cactgtcaaa atccaggcaa aagaaaagtt aaatttcatc 3000

ttggccaaca ttattctctc ctgtatcaaa cctacctcga cattagtaaa gccagttgaa 3060

aaactaaaag atcagcttcg agaagtcttg caaccaatag gactgactta ccggttttca 3120

gaaccttatt ttctagcttc cctcttattc tggccagaaa atcaacaact agatcaacat 3180

tctcaaaaaa tgaaagagta tgctcaagca ctggaaaatt ctttcaaggg gcaatataaa 3240

catatgcatc gtacaaagca accaattgcg tatttctttc ttggaaaagg taaaagactg 3300

aaaagacttg ttcacaaagg aaaaattgat cagtgctttg aaaagacact agatattaat 3360

tccttgtggc agagtggaga tgtgtggaag gaggaaaaag tccaagaact tttgcttcgt 3420

ttacaaggtc gagctgaaaa taattgttta tacatagagt atggaatcaa tgaaaaaatc 3480

acaataccca ttactcccac ttttttaggt caacttagaa gtggcagaag catagaaaag 3540

gtgtcttttt acctgggatt ttccattgga ggcccacttg cttatgacat tgaaattgtt 3600

taa 3603

<210> 2

<211> 1200

<212> PRT

<213> SAMD9突变型蛋白(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Lys Gln Leu Asn Leu Pro Gln Asn Thr Asp Asp Trp Thr Lys

1 5 10 15

Glu Asp Val Asn Arg Trp Leu Glu Ser His Lys Ile Asp Gln Lys His

20 25 30

Arg Glu Ile Leu Thr Gly Gln Asp Val Asn Gly Ala Val Leu Lys Trp

35 40 45

Leu Lys Lys Glu His Leu Val Asp Met Gly Ile Thr Asn Gly Val Val

50 55 60

Gln Asp Tyr Lys Ala Ser Arg Val Ala Asn Leu His Phe Pro Ser Met

65 70 75 80

Tyr Val Glu Gly Lys Thr Thr Pro Asn Glu Lys Ile Ser Thr Leu Asn

85 90 95

Leu Tyr His Gln Pro Ser Trp Ile Phe Cys Asn Gly Arg Ser Asp Leu

100 105 110

Asp Ser Glu Lys Tyr Lys Pro Phe Asp Pro Ser Ser Trp Gln Arg Glu

115 120 125

Arg Ala Ser Asp Val Arg Lys Leu Ile Ser Phe Leu Thr His Glu Asp

130 135 140

Ile Met Pro Arg Gly Lys Phe Leu Val Val Phe Leu Leu Leu Ser Ser

145 150 155 160

Val Asp Asp Pro Arg Asp Pro Leu Ile Glu Thr Phe Cys Ala Phe Tyr

165 170 175

Gln Asp Leu Lys Gly Ile Glu Asn Ile Leu Cys Ile Cys Ala Gln Pro

180 185 190

His Ile Phe Gln Gly Trp Lys Asp Leu Leu Glu Ala Arg Leu Ile Lys

195 200 205

His Gln Asp Glu Ile Ser Ser Gln Cys Ile Ser Ala Leu Ser Leu Glu

210 215 220

Glu Ile Asn Gly Thr Ile Leu Lys Leu Lys Ser Val Thr Gln Ser Ser

225 230 235 240

Lys Arg Leu Leu Pro Ser Ile Gly Leu Ser Thr Val Leu Leu Lys Lys

245 250 255

Glu Glu Asp Ile Met Thr Ser Leu Glu Ile Ile Cys Glu Asn Glu Cys

260 265 270

Glu Gly Thr Leu Leu Glu Thr Asp Lys Asn Lys Phe Leu Glu Phe Lys

275 280 285

Ala Ser Lys Glu Glu Asp Phe Tyr Arg Gly Gly Lys Val Ser Trp Trp

290 295 300

Asn Phe Tyr Phe Ser Ser Glu Ser Tyr Ser Ser Pro Phe Val Lys Arg

305 310 315 320

Asp Lys Tyr Glu Arg Leu Glu Ala Met Ile Gln Asn Cys Ala Asp Ser

325 330 335

Ser Lys Pro Thr Cys Thr Lys Ile Ile His Leu Tyr His His Pro Gly

340 345 350

Cys Gly Gly Thr Thr Leu Ala Met His Ile Leu Trp Asp Leu Arg Lys

355 360 365

Lys Phe Arg Cys Ala Val Leu Lys Asn Lys Thr Val Asp Phe Ser Glu

370 375 380

Ile Gly Glu Gln Val Thr Asn Leu Ile Thr Tyr Gly Ala Met Asn Arg

385 390 395 400

Gln Glu Tyr Val Pro Val Leu Leu Leu Val Asp Asp Phe Glu Glu Gln

405 410 415

Asp Asn Val Tyr Leu Leu Gln Tyr Ser Ile Gln Thr Val Ile Ala Lys

420 425 430

Lys Tyr Ile Arg Tyr Glu Lys Pro Leu Val Ile Ile Leu Asn Cys Met

435 440 445

Arg Ser Gln Asn Pro Glu Lys Ser Ala Arg Ile Pro Asp Ser Ile Ala

450 455 460

Val Ile Gln Gln Leu Ser Pro Lys Glu Gln Arg Ala Phe Glu Leu Lys

465 470 475 480

Leu Lys Glu Ile Lys Glu Gln His Lys Asn Phe Glu Asp Phe Tyr Ser

485 490 495

Phe Met Ile Met Lys Thr Asn Phe Asn Lys Glu Tyr Ile Glu Asn Val

500 505 510

Val Arg Asn Ile Leu Lys Gly Gln Asn Ile Phe Thr Lys Glu Ala Lys

515 520 525

Leu Phe Ser Phe Leu Ala Leu Leu Asn Ser Tyr Val Pro Asp Thr Thr

530 535 540

Ile Ser Leu Ser Gln Cys Glu Arg Phe Leu Gly Ile Gly Asn Lys Lys

545 550 555 560

Ala Phe Trp Gly Thr Glu Lys Phe Glu Asp Lys Met Gly Thr Tyr Ser

565 570 575

Thr Ile Leu Ile Lys Thr Glu Val Ile Glu Cys Gly Asn Tyr Cys Gly

580 585 590

Val Arg Ile Ile His Ser Leu Ile Ala Lys Phe Ser Leu Glu Glu Leu

595 600 605

Lys Lys Ser Tyr His Leu Asn Lys Ser Gln Ile Met Leu Asp Met Leu

610 615 620

Thr Glu Asn Leu Phe Phe Asp Thr Gly Met Gly Lys Ser Lys Phe Leu

625 630 635 640

Gln Asp Met His Thr Leu Leu Leu Thr Arg His Arg Asn Glu His Glu

645 650 655

Gly Glu Thr Gly Asn Trp Phe Ser Pro Phe Ile Glu Ala Leu His Lys

660 665 670

Asp Glu Gly Asn Glu Ala Val Glu Ala Val Leu Leu Glu Gly Ile His

675 680 685

Arg Phe Asn Pro Asn Ala Phe Ile Cys Gln Ala Leu Ala Arg His Phe

690 695 700

Tyr Ile Lys Lys Lys Asp Phe Gly Asn Ala Leu Asn Trp Ala Lys Gln

705 710 715 720

Ala Lys Ile Ile Glu Pro Asp Asn Ser Tyr Ile Ser Asp Thr Leu Gly

725 730 735

Gln Val Tyr Lys Ser Lys Ile Arg Trp Trp Ile Glu Glu Asn Gly Arg

740 745 750

Asn Arg Asn Ile Ser Val Asp Asp Leu Thr Ala Leu Leu Asn Leu Ala

755 760 765

Glu Gln Ala Ser Gly Ala Phe Lys Glu Ser Gln Gln Gln Ser Glu Tyr

770 775 780

Arg Glu Tyr Glu Val Lys Glu Arg Leu Tyr Gln Lys Ser Lys Arg Arg

785 790 795 800

Tyr Asp Thr Tyr Asn Ile Ala Gly Tyr Gln Gly Glu Ile Glu Val Gly

805 810 815

Leu Tyr Thr Ile Gln Ile Leu Gln Leu Ile Pro Phe Phe Asp Asn Lys

820 825 830

Asn Glu Leu Ser Lys Arg Asp Met Val Asn Phe Val Ser Gly Ser Gly

835 840 845

Asp Ile Pro Gly Asp Gln Asn Asp Glu Tyr Lys Leu Ala Leu Lys Asn

850 855 860

Tyr Ile Pro Tyr Leu Thr Lys Leu Lys Phe Ser Leu Lys Lys Ser Phe

865 870 875 880

Asp Phe Phe Asp Glu Tyr Phe Val Leu Leu Lys Pro Arg Asn Asn Ile

885 890 895

Lys Gln Asn Glu Glu Ala Lys Thr Arg Arg Lys Val Ala Val Tyr Phe

900 905 910

Lys Lys Tyr Thr Asp Ile Phe Cys Leu Leu Glu Glu Ser Gln Asp Ile

915 920 925

Gly Leu Gly Ser Lys Phe Ser Glu Pro Leu Gln Ile Glu Arg Cys Arg

930 935 940

Lys Ser Leu Val Ala Leu Lys Ala Asp Lys Phe Ser Gly Leu Leu Glu

945 950 955 960

Tyr Leu Ile Lys Ser Gln Glu Asp Ala Ile Ser Thr Met Glu Tyr Ile

965 970 975

Val Asn Lys Tyr Ala Phe Leu Leu Glu Gln Cys Thr Val Lys Ile Gln

980 985 990

Ala Lys Glu Lys Leu Asn Phe Ile Leu Ala Asn Ile Ile Leu Ser Cys

995 1000 1005

Ile Lys Pro Thr Ser Thr Leu Val Lys Pro Val Glu Lys Leu Lys Asp

1010 1015 1020

Gln Leu Arg Glu Val Leu Gln Pro Ile Gly Leu Thr Tyr Arg Phe Ser

1025 1030 1035 1040

Glu Pro Tyr Phe Leu Ala Ser Leu Leu Phe Trp Pro Glu Asn Gln Gln

1045 1050 1055

Leu Asp Gln His Ser Gln Lys Met Lys Glu Tyr Ala Gln Ala Leu Glu

1060 1065 1070

Asn Ser Phe Lys Gly Gln Tyr Lys His Met His Arg Thr Lys Gln Pro

1075 1080 1085

Ile Ala Tyr Phe Phe Leu Gly Lys Gly Lys Arg Leu Lys Arg Leu Val

1090 1095 1100

His Lys Gly Lys Ile Asp Gln Cys Phe Glu Lys Thr Leu Asp Ile Asn

1105 1110 1115 1120

Ser Leu Trp Gln Ser Gly Asp Val Trp Lys Glu Glu Lys Val Gln Glu

1125 1130 1135

Leu Leu Leu Arg Leu Gln Gly Arg Ala Glu Asn Asn Cys Leu Tyr Ile

1140 1145 1150

Glu Tyr Gly Ile Asn Glu Lys Ile Thr Ile Pro Ile Thr Pro Thr Phe

1155 1160 1165

Leu Gly Gln Leu Arg Ser Gly Arg Ser Ile Glu Lys Val Ser Phe Tyr

1170 1175 1180

Leu Gly Phe Ser Ile Gly Gly Pro Leu Ala Tyr Asp Ile Glu Ile Val

1185 1190 1195 1200

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> AlbA_g1(Artificial Sequence)

<400> 3

gttgatatgg gcatcacaca tgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> AlbA_g2(Artificial Sequence)

<400> 4

gatcctgagt ctaacatcaa tgg 23

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> AlbA_g1引物(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg gttgatatgg gcatcacaca gttcagagct atgctgga 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> AlbA_g2引物(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg gatcctgagt ctaacatcaa gttcagagct atgctgga 58

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> SAMDF1(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcaaagcaa ctgaaccttc c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> SAMDR1(Artificial Sequence)

<400> 8

tctcatttgg tgtggttttc cc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> SAMDF(Artificial Sequence)

<400> 9

tatcagaatg gcaaagcaac tg 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> SAMDR(Artificial Sequence)

<400> 10

aggtggtact gagaccaaat tct 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 016F(Artificial Sequence)

<400> 11

tgctcctata acgttccatc c 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 016R(Artificial Sequence)

<400> 12

gaatatgtag aagaactaaa gtaca 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 137F(Artificial Sequence)

<400> 13

acgaattacg taaatactgc gatgt 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 137R(Artificial Sequence)

<400> 14

acgatctatc aaatatactc catgt 25

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 144F(Artificial Sequence)

<400> 15

aataccattt gttacagaag 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 144F(Artificial Sequence)

<400> 16

cctttctatc acctatcttg gg 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 063F(Artificial Sequence)

<400> 17

agaactcatc gggggtaagg 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 063R(Artificial Sequence)

<400> 18

ttcctggagc tgatccaaca t 21

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 133F(Artificial Sequence)

<400> 19

tggattctga tagtcgaaac ggt 23

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 133R(Artificial Sequence)

<400> 20

cacctcgcgt gttatttcca c 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 134F(Artificial Sequence)

<400> 21

acctggttgc gatcatgtct t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 134R(Artificial Sequence)

<400> 22

ggaccatcat ccaacgacaa c 21

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 上游引物P1(Artificial Sequence)

<400> 23

caaatcgtat gccgatgc 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 下游引物P2(Artificial Sequence)

<400> 24

tcaggaaatc tatgagcc 18

Claims

1.SAMD9突变型蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所述的突变型蛋白的SAMD9突变型基因。

3.根据权利要求2所述的SAMD9突变型基因，其特征在于，所述SAMD9突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.SAMD9突变型蛋白的Vero细胞系，其含有权利要求2或3所述的突变型基因。

5.权利要求4所述的SAMD9突变型蛋白的Vero细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：通过扩增测序获取了Vero细胞SAMD9基因序列，在其AlbA_2结构域两侧设计基因敲除sgRNA，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对Vero细胞SAMD9基因的AlbA_2结构域实施基因敲除，经过克隆筛选纯化获得SAMD9突变型Vero细胞，命名为VeroSAMD9。

6.根据权利要求5所述的SAMD9突变型蛋白的Vero细胞系的制备方法，其特征在于，所述sgRNA序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

7.根据权利要求5所述的SAMD9突变型蛋白的Vero细胞系的制备方法，其特征在于，所述克隆筛选中采用的PCR引物序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。

8.权利要求1所述的SAMD9突变型蛋白、权利要求2或3所述的突变型基因、权利要求5所述的细胞系在制备山羊痘病毒疫苗中的应用。

9.一种山羊痘病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1所述的SAMD9突变型蛋白。