CN111961681A - 外泌体在细胞外基质中的富集方法、富含外泌体的ecm生物材料与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外泌体在细胞外基质中的富集方法、富含外泌体的ECM生物材料与应用。本发明还公开了一种CBD‑LAMP 2b融合基因。含有前述CBD‑LAMP 2b融合基因的细胞系能够稳定表达CBD‑LAMP 2b蛋白，并能够稳定分泌结合到细胞外基质上的外泌体，实现外泌体在细胞外基质中的富集。所述ECM生物材料由前述细胞系合成并分泌到胞外。本发明构建了携带有胶原结合区域CBD的LAMP 2b融合蛋白，进而使外泌体具有结合到ECM成分之一胶原I上的能力，ECM生物海绵实现了对于外泌体的抓取和富集，并且采用反复冻融的方式制备富含外泌体的ECM生物材料，其可以作为药物或miRNA载体，实现对于疾病的药物递送。

Description

外泌体在细胞外基质中的富集方法、富含外泌体的ECM生物材 料与应用

技术领域

本发明涉及一种外泌体在细胞外基质中的富集方法，具体涉及一种利用胶原结合域多肽(Collagen Binding Domain,CBD)实现外泌体在细胞外基质中富集的技术方法，以及制备富含大量外泌体的细胞外基质生物材料及其应用，属于生物材料及基因工程技术领域。

背景技术

外泌体(exosome)是由多囊泡体与细胞膜融合形成的直径为50-200nm的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)(Gurunathan S,Kang M,Jeyaraj M,et al.Review ofthe Isolation,Characterization,Biological Function,and MultifariousTherapeutic Approaches of Exosomes.[J].Cells,2019,8(4).)，在蔗糖梯度中浮力密度为1.13-1.18g/ml，在电镜下为具有膜结构的杯形。1983年，外泌体首次在网织红细胞中被发现，随后Rose Johnstone将这类EVs命名为“外泌体”(Harding C V,Heuser J E,Stahl PD,et al.Exosomes:Looking back three decades and into the future[J].Journal ofCell Biology,2013,200(4):367-371.)。很长时间外泌体都充当着默默无闻的信息传递者，刚被发现时更是被当成细胞代谢所产生的“排泄物”。但随着外泌体研究的深入，科学家发现外泌体中包含各种生物活性物质，例如：细胞因子、mRNA、miRNA等。这些生物活性物质参与细胞增殖和凋亡、炎症反应、血管生成、纤维化、组织修复等重要生理过程(Gupta K,Goldufsky J W,Wood S,et al.Apoptosis and Compensatory Proliferation SignalingAre Coupled by CrkI-Containing Microvesicles[J].Developmental Cell,2017,41(6).；G V N,Dangelo G,Raposo G,et al.Shedding light on the cell biology ofextracellular vesicles[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2018,19(4):213-228.；Immunomodulatory Effects of Mesenchymal Stromal Cells-DerivedExosome.)。目前外泌体收集分离方式主要有五种：①超速离心法；②密度梯度离心法；③共沉淀法；④凝胶组排层析法；⑤场流分级法。在实验研究中外泌体的提取普遍采用超速离心法，并且为了满足用药剂量，需要大规模收集细胞培养上清，这就造成了收集过程复杂和成本较高的问题。因此，如何对外泌体进行简便快速富集成为了一个难题(Shao H,Im H,Castro C M,et al.New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles[J].Chemical Reviews,2018,118(4):1917-1950.)。

细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)是细胞赖以生存的外部环境，为细胞生长提供三维网络和生长因子微环境。目前，ECM制备方法主要有两种方法：1.透析制备液态ECM；2.冻干制备成固态ECM(崔秉显，朴索拉，闵炳显。细胞衍生细胞外基质膜的制备方法：CN 2007；Lin H.,Yang G.,Tan J.,et al.Influence of decellularized matrixderived from human mesenchymal stem cells on their proliferation,migrationand multi-lineage differentiation potential.Biomaterials,2012,33(18):4480-4489.；Xu Y.,Xu G.Y.,Tang C.,et al.Preparation and characterization of bonemarrow mesenchymal stem cell-derived extracellular matrixscaffolds.J.Biomed.Mater.Res.B,2015,103(3):670-678.)。

因此，如何寻求一种能够实现外泌体在ECM中的靶向富集的新技术，已然成为业界研究人员长期以来一直努力的方向。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种利用胶原结合域多肽(Collagen BindingDomain,CBD)实现外泌体在细胞外基质中富集的技术方法，以及制备富含大量外泌体的细胞外基质生物材料及其应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种CBD-LAMP 2b融合基因，它的序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明实施例还提供了一种携带有前述的CBD-LAMP 2b融合基因的重组表达载体。

本发明实施例还提供了一种转化或转染有前述重组表达载体的宿主菌。

本发明实施例还提供了一种含有前述的CBD-LAMP 2b融合基因或重组表达载体的细胞系，所述细胞系能够稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白，并能够稳定分泌结合到细胞外基质上的外泌体，实现外泌体在细胞外基质中的富集。

本发明实施例还提供了一种富含外泌体的ECM生物材料，它是由前述的细胞系合成并分泌到胞外。

进一步地，所述ECM生物材料富集了膜蛋白上含有CBD-LAMP 2b的外泌体。

本发明实施例还提供了前述的富含外泌体的ECM生物材料作为药物或者miRNA载体在药物递送中的应用。

本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包括前述的富含外泌体的ECM生物材料。

本发明实施例还提供了一种外泌体在细胞外基质中的富集方法，其包括：

(1)用引物通过聚合酶链式反应对LAMP 2b基因的cDNA进行扩增，将CBD基因序列插入到LAMP 2b基因中，再根据引物所选用的酶切位点将扩增出来的基因和原始载体骨架同时进行酶切，之后回收酶切片段，并使酶切片段与载体酶切片段在DNA连接酶的作用下进行酶连反应，酶连反应结束后，酶连产物转化进入感受态细胞中并扩增质粒，之后进行载体测序确定载体质粒序列正确性，构建得到重组质粒或重组表达载体；

(2)通过病毒包装体系将重组质粒或重组表达载体整合到细胞基因组中，构建稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白的细胞模型，获得稳转细胞系；

(3)对稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白的细胞系进行培养，细胞在培养过程中向外分泌细胞外基质和外泌体，细胞分泌的外泌体通过CBD-LAMP 2b蛋白固定到细胞周围的ECM中，ECM生物海绵对细胞系分泌的膜蛋白具有CBD-LAMP 2b的外泌体进行提取，实现外泌体的富集。

本发明实施例还提供了一种富含外泌体的ECM生物材料的制备方法，其包括：

按照前述方法实现外泌体在细胞外基质中的富集；

以及，采用反复冻融方法制备富含外泌体的ECM生物材料，可以根据实际治疗操作要求，制备成液态或者固态形式进行保存或者运输。

与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：

1)本发明通过转基因技术构建了携带有胶原结合区域CBD的LAMP 2b融合蛋白，进而使外泌体具有结合到ECM的胶原I上的能力，ECM生物海绵实现了对于外泌体的抓取和富集，克服了差速离心法步骤繁琐的弊端；

2)本发明采用反复冻融的方式制备ECM生物材料，材料的状态可为固态也可为液态，与常规透析或者冻干相比，步骤简单和方便；

3)本发明制备的富含外泌体的固/液态ECM生物材料可以作为药物或者miRNA载体，实现对于疾病的药物递送。

附图说明

为了更清楚的说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一典型实施方案中外泌体膜蛋白LAMP 2b与CBD多肽的转基因融合、ECM生物海绵对于外泌体的富集、固/液态ECM生物材料的制备流程图；

图2a、图2b分别是本发明一典型实施方案中所需稳定表达LAMP 2b的稳转细胞系的QPCR和WB验证结果示意图；

图3a-图3c是本发明一典型实施方案中HFF、HFF-LAMP 2b及HFF-CBD-LAMP 2b细胞周围ECM中外泌体富集的SEM图像；

图4是本发明一典型实施方案中制备的液/固态ECM生物材料的marker蛋白WB鉴定结果示意图；

图5a和图5b分别是本发明一典型实施方案中制备的ECM中外泌体的NTA粒径、浓度分析和TEM图像。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是提供一种富集和快速获取外泌体的方法，克服差速离心法步骤繁琐的弊端，其原理在于通过转基因方式可以使外泌体膜蛋白上含有CBD-LAMP 2b融合蛋白，融合了胶原结合区域CBD的lamp 2b蛋白可以和ECM中胶原I相结合，从而实现ECM生物海绵对于外泌体的快速抓取，实现了外泌体的富集。

本案需要解释的术语如下：

1、细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)：由细胞合成并分泌到胞外，分布在细胞表面或细胞之间的大分子物质。ECM构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。ECM主要由胶原蛋白、粘连蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等组成。

2、胶原结合域(Collagen Binding Domain,CBD)：一段可以和胶原I结合的肽段。

3、外泌体(exosome)：是细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)的一种，大小在50-200nm，由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液等。

4、溶酶体膜糖蛋白(lysosomeassociated membrane glycoprotein 2b,LAMP2b)：一种外泌体膜蛋白。

本发明实施例的一个方面提供的一种利用分子生物学技术构建的CBD-LAMP 2b融合基因的序列如SEQ ID NO:1所示，具体序列为ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAACCAAGAAGACCCTGAGAACCGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTTTGGAACTTAATTTGACAGATTCAGAAAATGCCACTTGCCTTTATGCAAAATGGCAGATGAATTTCACAGTTCGCTATGAAACTACAAATAAAACTTATAAAACTGTAACCATTTCAGACCATGGCACTGTGACATATAATGGAAGCATTTGTGGGGATGATCAGAATGGTCCCAAAATAGCAGTGCAGTTCGGACCTGGCTTTTCCTGGATTGCGAATTTTACCAAGGCAGCATCTACTTATTCAATTGACAGCGTCTCATTTTCCTACAACACTGGTGATAACACAACATTTCCTGATGCTGAAGATAAAGGAATTCTTACTGTTGATGAACTTTTGGCCATCAGAATTCCATTGAATGACCTTTTTAGATGCAATAGTTTATCAACTTTGGAAAAGAATGATGTTGTCCAACACTACTGGGATGTTCTTGTACAAGCTTTTGTCCAAAATGGCACAGTGAGCACAAATGAGTTCCTGTGTGATAAAGACAAAACTTCAACAGTGGCACCCACCATACACACCACTGTGCCATCTCCTACTACAACACCTACTCCAAAGGAAAAACCAGAAGCTGGAACCTATTCAGTTAATAATGGCAATGATACTTGCCTGCTGGCTACCATGGGGCTGCAGCTGAACATCACTCAGGATAAGGTTGCTTCAGTTATTAACATCAACCCCAATACAACTCACTCCACAGGCAGCTGCCGTTCTCACACTGCTCTACTTAGACTCAATAGCAGCACTATTAAGTATCTAGACTTTGTCTTTGCTGTGAAAAATGAAAACCGATTTTATCTGAAGGAAGTGAACATCAGCATGTATTTGGTTAATGGCTCCGTTTTCAGCATTGCAAATAACAATCTCAGCTACTGGGATGCCCCCCTGGGAAGTTCTTATATGTGCAACAAAGAGCAGACTGTTTCAGTGTCTGGAGCATTTCAGATAAATACCTTTGATCTAAGGGTTCAGCCTTTCAATGTGACACAAGGAAAGTATTCTACAGCCCAAGAGTGTTCGCTGGATGATGACACCATTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAAGAAAAAGTTATGCTGGATATCAGACTCTGTAG。

本案发明人是将CBD基因序列插入到lamp 2b基因中，构建出CBD-LAMP 2b融合基因。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种构建的可以结合在ECM上的、携带有前述的CBD-LAMP 2b融合基因的重组表达载体。

进一步地，所述重组表达载体包括重组质粒。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种转化或转染有前述重组表达载体的宿主菌。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种含有前述的CBD-LAMP 2b融合基因或重组表达载体的细胞系，所述细胞系能够稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白，并能够稳定分泌结合到细胞外基质上的外泌体，实现外泌体在细胞外基质中的富集。

本发明实施例的另一个方面还构建了可以稳定分泌可以结合到ECM上的CBD-exosome的细胞。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种可富集大量外泌体的细胞外基质(ECM)生物材料，它是由前述的细胞系合成并分泌到胞外。

进一步地，所述ECM生物材料富集膜蛋白具有CBD-LAMP 2b的外泌体。

进一步地，所述ECM生物材料为固态ECM生物材料或液态ECM生物材料，亦即，所述ECM生物材料的状态可为固态也可为液态。固态可作为生物敷料的组成成分，液态可方便生物材料的使用，比如：液体注射。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的可富集大量外泌体的ECM生物材料作为药物或者miRNA载体在药物递送中的应用。

本发明制备的富含外泌体的固/液态ECM生物材料可以作为药物或者miRNA载体，实现对于疾病的药物递送。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种药物组合物，其包括前述的可富集大量外泌体的ECM生物材料。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种利用胶原结合域多肽(CollagenBinding Domain,CBD)实现外泌体在细胞外基质中富集的技术方法，随后采用反复冻融方法制备富含大量外泌体的细胞外基质生物材料。内容涉及人工改造外泌体膜蛋白使其具有细胞外基质靶向能力、ECM生物海绵吸附外泌体和富含外泌体的ECM生物材料的制备。

本发明构建的可以使外泌体富集到在ECM上的CBD-LAMP 2b重组载体的方法的设计理念主要是：1.将胶原结合域多肽(CBD)通过转基因方式构建到外泌体膜表面；2.实现外泌体在细胞外基质(ECM)中富集；3.通过反复冻融方法制备富含外泌体的ECM生物材料。

在一些优选实施例中，本发明的利用胶原结合域多肽(Collagen BindingDomain,CBD)实现外泌体在细胞外基质中富集的技术方法包括：

(1)用引物通过聚合酶链式反应对LAMP 2b基因的cDNA进行扩增，将CBD基因序列插入到LAMP 2b基因中，再根据引物所选用的酶切位点将扩增出来的基因和原始载体骨架同时进行酶切，之后回收酶切片段，并使酶切片段与载体酶切片段在DNA连接酶的作用下进行酶连反应，酶连反应结束后，酶连产物转化进入感受态细胞中并扩增质粒，之后进行载体测序，确保重组载体序列的正确性，构建得到重组质粒或重组表达载体；

(2)通过病毒包装体系将重组质粒或重组表达载体整合到细胞基因组中，构建稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白的细胞模型，获得稳转细胞系；

(3)对稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白的细胞系进行培养，细胞在培养过程中向外分泌细胞外基质和外泌体，以ECM生物海绵对细胞系分泌的膜蛋白具有CBD-LAMP 2b的外泌体CBD-LAMP 2b蛋白进行提取，实现外泌体的富集。

进一步地，所述引物的序列分别如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:7所示。

进一步地，所述载体骨架可以包括慢病毒载体、逆转录病毒载体，也可以是非病毒的载体，但不限于此。其中，构建的载体是可以替换的，比如：是非病毒的载体pcDNA 3.1等。也可以是其他的逆转录或者慢病毒载体，比如：pQH载体等。

进一步地，所述细胞也是可选择其他细胞，比如：间充质干细胞、293T细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、NIH 3T3细胞等，但不限于此。

综上所述，本发明通过转基因技术构建了携带有胶原结合区域CBD的LAMP 2b融合蛋白，进而使外泌体具有结合到ECM的胶原I上的能力，ECM生物海绵实现了对于外泌体的抓取和富集。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种富含外泌体的ECM生物材料的制备方法，其包括：

按照前述方法实现外泌体在细胞外基质中的富集；

以及，采用反复冻融方法制备富含外泌体的ECM生物材料，可以根据实际治疗操作要求，制备成液态或者固态形式进行保存或者运输。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

在此，还需说明的是，为了避免因为不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了本发明关系不大的其他细节。

以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1

本发明提供的一种利用胶原结合域多肽(Collagen Binding Domain,CBD)实现外泌体在细胞外基质中富集的技术方法，随后采用反复冻融方法制备富含大量外泌体的细胞外基质生物材料。主要技术流程可分为四个步骤：1、外泌体膜蛋白lamp 2b与CBD多肽的转基因融合；2、ECM生物海绵对于外泌体的抓取，实现外泌体的富集；3、富含外泌体的ECM生物材料的制备。

下面将对每个步骤进行详细描述：

1、外泌体膜蛋白LAMP 2b与CBD多肽的转基因融合

1.首先使用trizol提取HFF细胞总RNA；随后使用反转录mix生成cDNA；利用LAMP2b forward和LAMP 2b reverse两条引物，通过PCR反应，从全基因组里提取LAMP 2b序列；通过重叠PCR，将CBD序列插入到LAMP 2b序列目标位置，实现LAMP 2b与CBD的转基因融合。

请参阅图1所示为本实施例外泌体膜蛋白LAMP 2b与CBD多肽的转基因融合、ECM生物海绵对于外泌体的富集、固/液态ECM生物材料的制备流程图。

选择慢病毒/逆转录病毒表达载体，将CBD基因序列插入到LAMP 2b基因中，构建稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白的人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast,HFF)细胞系(PLVX-HFF,PLVX-LAMP 2b-HFF，PLVX-CBD-LAMP 2b-HFF)。PLVX-CBD-LAMP 2b-HFFs细胞系分泌的外泌体膜蛋白LAMP 2b上具有CBD多肽。

慢病毒包装实验步骤

1.转染前一天，通过胰酶消化将293T传代于6cm培养皿上，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的70％以上。将细胞置于含5％CO₂的37℃温箱中孵育8h，当细胞贴壁完全后即可开始转染；

2.转染前30min换液(用4ml DMEM空培基置换旧的培养基)；

3.制备包装质粒、目的质粒和转染试剂的混合物。

3.1取无菌1.5ml EP管，加入200μl无血清Opti-MEM，加入4μg目的质粒和4.5μg病毒包装质粒(psPAX2：pMD2.G＝2:1)，充分混匀；

3.2取无菌1.5ml EP管，加入200μl无血清Opti-MEM，将34μl转染试剂溶于Opti-MEM中，充分混匀，静置5min；

3.3将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边滴加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合物。

3.4取出培养皿，将配置好的DNA-转染试剂混合物加入到培养皿中，轻轻混匀，做好标记，放回培养箱中。

3.5 6h后吸去培养基，加入4ml新鲜完全培养基培养。

4.转染后每隔24h收集培养后的上清至15ml离心管，做好标记，并给细胞更换新鲜的完全培养基。最后一次收集病毒液后，将接触过病毒的枪头、离心管培养皿等物品用84消毒液浸泡后丢弃。

载体构建：

1.重组质粒和原始载体分别进行双酶切反应，再回收酶切片段；2.重组质粒酶切片段与原始载体酶切片段在T4 DNA连接酶的作用下进行酶连反应；3.酶连产物转化进入感受态细胞中，再涂板培养阳性单菌落；4.挑取单菌落进行菌落PCR,检测出成功转入PLVX-CBD-LAMP 2b质粒的阳性单菌落；5.挑取阳性单菌落进行菌落扩大培养，提取质粒测序。其中，本发明构建载体所需引物列表如表1所示。

表1：本发明构建载体所需引物列表

2.ECM生物海绵对于外泌体的抓取，实现外泌体的富集

将HFFs细胞接种在10cm的培养皿中，在37℃无菌培养箱中培养，待细胞长满后加入含有50μM维生素C的完全培养基(DMEM+20％FBS+1％青霉素-链霉素)，培养2周，每2天换一液。

3.富含exosome的ECM生物材料的制备

采用反复冻融(-80℃放置2h，37℃放置5min，循环3次的方式制备固/液态ECM生物材料)。

4.富含exosome的ECM生物海绵表征

(1)扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察exosome在HFF细胞周围富集情况。请参阅图3a-图3c所示，发现与PLVX-HFF,PLVX-LAMP 2b-HFF相比，PLVX-CBD-LAMP 2b-HFF细胞周围的50-200nm的外泌体明显增多，说明利用胶原结合域(CBD)实现外泌体在细胞外基质(ECM)中富集。

图2a和图2b示出了本实施例中所需稳定表达LAMP 2b的稳转细胞系的QPCR和WB结果验证结果。

(2)请参阅图4所示，WB检测所制备的固/液态ECM生物海绵的主要蛋白如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白等，发现ECM marker蛋白都存在制备的固/液态ECM里，说明通过反复冻融方式成功制备了固态/液态ECM生物海绵。

(3)透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,简称TEM)观察ECM生物材料中外泌体的形貌。纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)测量ECM生物材料中外泌体粒径和浓度。图5a和图5b示出了制备的ECM中外泌体的NTA粒径、浓度分析和TEM图像。TEM和NTA结果显示，液态ECM中存在50-200nm外泌体颗粒和图像。

藉由上述技术方案，本发明通过转基因技术构建了携带有胶原结合区域CBD的LAMP2b融合蛋白，进而使外泌体具有结合到ECM的胶原I上的能力，ECM生物海绵实现了对于外泌体的抓取和富集，克服了差速离心法步骤繁琐的弊端；本发明采用反复冻融的方式制备ECM生物材料，材料的状态可为固态也可为液态，与常规透析或者冻干相比，步骤简单和方便；同时，本发明制备的富含外泌体的固/液态ECM生物材料可以作为药物或者miRNA载体，实现对于疾病的药物递送。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本领域技术人员应当理解，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所

<120> 外泌体在细胞外基质中的富集方法、富含外泌体的ECM生物材料与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1308

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atggtgtgct tccgcctctt cccggttccg ggctcagggc tcgttctggt ctgcctagtc 60

ctgggagctg tgcggtctta tgcaggtaac tcgactatgg gcagtggaac caagaagacc 120

ctgagaaccg gcagtggatc tggatccggt ggctcgagtt tggaacttaa tttgacagat 180

tcagaaaatg ccacttgcct ttatgcaaaa tggcagatga atttcacagt tcgctatgaa 240

actacaaata aaacttataa aactgtaacc atttcagacc atggcactgt gacatataat 300

ggaagcattt gtggggatga tcagaatggt cccaaaatag cagtgcagtt cggacctggc 360

ttttcctgga ttgcgaattt taccaaggca gcatctactt attcaattga cagcgtctca 420

ttttcctaca acactggtga taacacaaca tttcctgatg ctgaagataa aggaattctt 480

actgttgatg aacttttggc catcagaatt ccattgaatg acctttttag atgcaatagt 540

ttatcaactt tggaaaagaa tgatgttgtc caacactact gggatgttct tgtacaagct 600

tttgtccaaa atggcacagt gagcacaaat gagttcctgt gtgataaaga caaaacttca 660

acagtggcac ccaccataca caccactgtg ccatctccta ctacaacacc tactccaaag 720

gaaaaaccag aagctggaac ctattcagtt aataatggca atgatacttg cctgctggct 780

accatggggc tgcagctgaa catcactcag gataaggttg cttcagttat taacatcaac 840

cccaatacaa ctcactccac aggcagctgc cgttctcaca ctgctctact tagactcaat 900

agcagcacta ttaagtatct agactttgtc tttgctgtga aaaatgaaaa ccgattttat 960

ctgaaggaag tgaacatcag catgtatttg gttaatggct ccgttttcag cattgcaaat 1020

aacaatctca gctactggga tgcccccctg ggaagttctt atatgtgcaa caaagagcag 1080

actgtttcag tgtctggagc atttcagata aatacctttg atctaagggt tcagcctttc 1140

aatgtgacac aaggaaagta ttctacagcc caagagtgtt cgctggatga tgacaccatt 1200

ctaatcccaa ttatagttgg tgctggtctt tcaggcttga ttatcgttat agtgattgct 1260

tacgtaattg gcagaagaaa aagttatgct ggatatcaga ctctgtag 1308

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

ggactagtgc caccatggtg tgcttccgcc tcttc 35

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

tgctctagac tagttctgca tctgctcaaa gaacttg 37

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

ggactagtgc caccatggtg tgcttccgcc tct 33

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

ggttctcagg gtcttcttgg ttccactgcc catagtcgag ttac 44

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

accaagaaga ccctgagaac cggcagtgga tctggatccg 40

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

aaggaaaaaa gcggccgctt acagagtctg atatccagca taactt 46

Claims (14)

1.一种CBD-LAMP 2b融合基因，其特征在于，所述CBD-LAMP 2b融合基因的序列如SEQID NO:1所示。

2.携带有权利要求1所述的CBD-LAMP 2b融合基因的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的含有CBD-LAMP 2b融合基因的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包括重组质粒。

4.转化或转染有权利要求2所述重组表达载体的宿主菌。

5.含有权利要求1所述的CBD-LAMP 2b融合基因或权利要求2所述的重组表达载体的细胞系，所述细胞系能够稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白，并能够稳定分泌结合到细胞外基质上的外泌体，实现外泌体在细胞外基质中的富集。

6.一种富含外泌体的ECM生物材料，其特征在于它是由权利要求5所述的细胞系合成并分泌到胞外。

7.根据权利要求6所述的ECM生物材料，其特征在于：所述ECM生物材料为固态ECM生物材料或液态ECM生物材料。

8.权利要求6-7中任一项所述富含外泌体的ECM生物材料作为药物或者miRNA载体在药物递送中的应用。

9.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求6-7中任一项所述的富含外泌体的ECM生物材料。

10.一种外泌体在细胞外基质中的富集方法，其特征在于包括：

(1)用引物通过聚合酶链式反应对LAMP 2b基因的cDNA进行扩增，将CBD基因序列插入到LAMP 2b基因中，再根据引物所选用的酶切位点将扩增出来的基因和原始载体骨架同时进行酶切，之后回收酶切片段，并使酶切片段与载体酶切片段在DNA连接酶的作用下进行酶连反应，酶连反应结束后，酶连产物转化进入感受态细胞中并扩增质粒，之后进行载体测序验证质粒序列的准确性，构建得到重组质粒或重组表达载体；

(2)通过病毒包装体系将重组质粒或重组表达载体整合到细胞基因组中，构建稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白的细胞模型，获得稳转细胞系；

(3)对稳定表达CBD-LAMP 2b蛋白的细胞系进行培养，细胞同时向胞外分泌ECM和外泌体，细胞分泌的外泌体通过CBD-LAMP 2b蛋白固定到细胞周围的ECM中，实现外泌体的富集。

11.根据权利要求10所述的富集方法，其特征在于：所述引物的序列分别如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:7所示。

12.根据权利要求10所述的富集方法，其特征在于：所述载体骨架包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒的载体。

13.根据权利要求10所述的富集方法，其特征在于：所述细胞选用间充质干细胞、293T细胞、神经干细胞、脂肪干细胞或NIH 3T3细胞。

14.一种富含外泌体的ECM生物材料的制备方法，其特征在于包括：

按照权利要求10-13中任一项所述方法实现外泌体在细胞外基质中的富集；

以及，采用反复冻融方法制备富含外泌体的ECM生物材料。

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