CN102839144A - 一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法，其是以内源性表达ESX-1分泌系统的海分枝杆菌为模式生物，选择ESX-1分泌系统中C末端带有信号肽的重要的毒力因子CFP-10蛋白与荧光素酶融合，构建外源表达CFP-10和荧光素酶融合蛋白的重组海分枝杆菌，向含有该重组菌的培养液中加入待筛选的药物化合物，培养一定时间后取上清进行荧光素酶活性测定，以此来评价药物对ESX-1分泌系统的抑制活性；同时，通过测定A₆₀₀来监测海分枝杆菌的生长状况。将此分析方法发展成高通量药物筛选模型，筛选ESX-1分泌系统抑制剂，获得既能降低结核分枝杆菌的致病性又不抑制其体外生长，即不易诱发耐药的新型抗结核活性化合物。

Description

一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法

技术领域

本发明涉及药物高通量筛选模型的构建方法，具体地说，涉及一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法。

背景技术

结核病是一种死亡率较高的感染性疾病，严重威胁着人类健康。全球约有三分之一的人感染了结核分枝杆菌，现有结核病人约2000万，每年新发生约900万病人，死亡人数高达300万。我国作为22个结核病的高发国家之一，结核病人数仅次于印度，位居世界第二，每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。此外，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且结核的病程发展更快，更易致死。结核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，成为威胁人类健康的全球性公共卫生问题。

由于耐药及耐多药结核分枝杆菌的出现，发展新型抗结核药物，特别是抗耐药结核药物成为研究的重点，寻找抑制细菌生长的活性化合物是目前抗结核药物研发的主要思路。现有的抗结核的一线药物主要有利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺等，这些药物多数是通过抑制结核分枝杆菌细胞壁合成或蛋白合成等细菌生存所必需的环节，直接抑制细菌的生长或者杀死细菌。在药物产生的生存压力下，结核分枝杆菌通过突变作用靶点、增加药物的外排、产生钝化酶、改变膜的通透性等各种途径，使原有的抗结核药物逐渐失去效力，导致耐药性的产生。据世界卫生组织最新报告显示，全球范围内几种抗结核一线药物的平均耐药率依次为链霉素(6.3％)、异烟肼(5.6％)、利福平(1.4％)、乙胺丁醇(0.8％)。所以，尽管具有新作用机制的药物可以有效抑制这些耐药菌的生长，但如何从根本上解决“药物-耐药-新药-耐新药”这一循环性耐药性问题，成为目前抗结核药物研发的关键之一。

本发明选择结核分枝杆菌生长非必需但与其致病性密切相关的ESX-1分泌系统为药物靶点，探索利用低药物选择性的毒力因子为靶点发展抗结核药物的新策略，突破以抑制结核分枝杆菌生长为目标的传统药物研发思路，发展低药物选择压力的致病性抑制剂，解决目前日趋严重的结核杆菌耐药问题。

致病细菌将其毒力因子分泌到胞外，可以促进细菌在宿主体内的繁殖和扩散并产生致病性。研究表明结核分枝杆菌的ESX-1分泌系统(VII型分泌系统)介导多种毒力因子的分泌，在结核杆菌的致病性中起着关键作用。ESX-1分泌系统在结核分枝杆菌的早期感染中发挥着重要的作用，参与结核分枝杆菌与宿主细胞早期的结合，引起细胞溶解，促进肉芽肿的形成，抑制吞噬体成熟，同时能够调节宿主细胞的相关免疫反应，对减少感染的巨噬细胞的细胞因子分泌反应起重要作用。ESX-1分泌系统主要由RD1(region of difference 1)区编码。该基因区在非致病性结核分枝杆菌和BCG疫苗株中是缺失的。RD1区包括9个基因(Rv3871～Rv3879c)，是结核分枝杆菌重要的毒力因子。ESAT-6(early secreted antigenic target of 6kD，Rv3875)和CFP-10(culture filtrate protein of 10kD，Rv3874)是最先被发现的两个由ESX-1分泌系统分泌的蛋白。这两种蛋白能够形成1∶1的二聚体结构来发挥毒力效应。ESAT-6是ESX-1分泌系统中一个重要的效应分子，当改变ESAT-6蛋白的个别氨基酸时不会抑制ESAT-6的分泌，但是会导致重组结核分枝杆菌毒力的减弱。CFP-10和ESAT-6的协同分泌是分枝杆菌在巨噬细胞中增殖和抑制吞噬体成熟所必需的，其中C端起着重要的作用。CFP-10的C端具有信号序列能够和细胞质蛋白Rv3871结合，信号序列位点的突变能够阻止ESAT-6和CFP-10的分泌。Rv3869、Rv3870和Rv3877分别有1、3和11个转膜位点，这3种蛋白同ESX-1分泌系统的Rv3871共同形成一个膜结合的ESX-1分泌复合体，通过ATP的水解转运分泌蛋白。研究表明，Rv3870、Rv3871和Rv3877的突变株对巨噬细胞的毒力减弱，并且在巨噬细胞的感染过程中引发弱化的免疫反应。如果将完整的RD-1区整合入BCG菌株后，ESAT-6蛋白的ESX-1分泌系统依赖性分泌能够恢复。这些均表明ESX-1分泌系统是结核分枝杆菌关键的致病因素。

发明内容

本发明的目的是以结核分枝杆菌生长非必需但与其致病性密切相关的ESX-1分泌系统为药物靶点，提供一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法，其是通过构建外源表达来自于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的CFP-10蛋白和报告蛋白的融合蛋白的重组海分枝杆菌，以该重组菌作为针对ESX-1分泌系统的抗结核病药物高通量筛选模型，向含有该重组菌的培养液中加入待筛选的药物化合物，培养一段时间后离心取上清测定报告蛋白的表达量或活性，以此来评价该药物化合物对ESX-1分泌系统的抑制活性。

其中，所述报告蛋白为荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶、β-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶或荧光蛋白家族中的成员，优选荧光素酶。

本发明还提供含有CFP-10蛋白和荧光素酶的融合蛋白以及编码该融合蛋白的基因。

本发明还提供含有上述基因的载体。优选地，其出发载体为pMV261。

本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。优选地，其为海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)。

本发明进一步提供上述融合蛋白、编码所述融合蛋白的基因、含有该基因的载体以及含有该载体的宿主细胞在筛选抗结核病药物中的应用。

相对于结核分枝杆菌而言，海分枝杆菌生长速度相对较快，存在ESX-1分泌系统且生物安全性较高，目前已广泛用于结核病发病机制的研究。以内源性表达ESX-1分泌系统的海分枝杆菌为模式生物，选择ESX-1分泌系统中C末端带有信号肽的重要的毒力因子CFP-10蛋白与荧光素酶(Luciferase简称LUC)融合，构建外源表达CFP-10和荧光素酶融合蛋白的重组海分枝杆菌，向含有该重组菌的培养液中加入待筛选的药物化合物，培养一定时间后取上清进行荧光素酶活性测定，以此来评价药物对ESX-1分泌系统的抑制活性；同时，通过测定A₆₀₀来监测海分枝杆菌的生长状况。将此分析方法发展成高通量药物筛选模型，筛选ESX-1分泌系统抑制剂，获得既能降低结核分枝杆菌的致病性又不抑制其体外生长，即不易诱发耐药的新型抗结核活性化合物。

附图说明

图1为本发明重组质粒pMV261-LUC-CFP-10的结构示意图。

图2为反义DNA对重组海分枝杆菌MM-pMV261-LUC-CFP-10分泌活性的影响。

图3为重组海分枝杆菌发酵液上清与荧光值的量效关系曲线。

图4为荧光值分析结果的重复性实验。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施中使用的质粒pMV261已在C.K.Stover等，New use ofBCG for recombinant vaccines.Nature 1991，351：456-460中公开，该质粒由法国UniversitéMontpellier II Laurent博士惠赠。

实施例1抗结核病药物高通量筛选模型的构建流程

1.1质粒pMV261-LUC-CFP-10的构建

以质粒pGL4(购自Promega公司)为模板，以5′-TTCCGAATTCATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGA-3′为上游引物，以5′-CTTCATCTCTGCCATCACGGCGATCTTG-3′为下游引物进行PCR扩增得到LUC片段，以结核分枝杆菌基因组DNA为模板，以5′-CAAGATCGCCGTGATGGCAGAGATGAAG-3′为上游引物，以5′-AATTAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGG-3′为下游引物得到CFP-10片段，再以LUC和CFP-10为模板，以5′-TTCCGAATTCATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGA-3′为上游引物，以5′-AATTAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGG-3′为下游引物进行PCR扩增得到LUC-CFP-10片段，在质粒pMV261上的酶切位点EcoR I和Hind III之间插入此片段，得到重组质粒，命名为pMV261-LUC-CFP-10(重组质粒的结构如图1所示，其核苷酸序列如Seq ID No：10所示)。

1.2海分枝杆菌的培养

取冻存的海分枝杆菌(ATCC 927)，加入7H9液体培养基(购自BD公司)中，28℃，180r/min培养活化。用接种环蘸少许菌液，在7H11固体培养基(购自BD公司)平板上划线，28℃静置培养数天后挑取单菌落于7H9液体培养基中，28℃，180r/min振摇培养至A₆₀₀(600nm处的吸光度值)约0.8。

1.3重组海分枝杆菌的构建

1.3.1海分枝杆菌感受态细胞的制备

将培养至A₆₀₀约0.8的海分枝杆菌菌液置于冰浴30min后，4℃，8000r/min离心15min收集菌体，并用预冷的10％甘油洗涤4次后重悬于1ml 10％甘油中，即得到海分枝杆菌感受态细胞。

1.3.2重组质粒的电穿孔转化

取1μg重组质粒加入到500μl感受态细胞中，以空白质粒pMV261作为对照，充分混匀，冰浴30min后转入预冷的直径为2mm电穿孔杯中，在电压2.5kV，电容50μF，电阻720Ω的条件下进行电穿孔转化，脉冲时间4ms，放电完毕后立即冰浴10min。将转化后的海分枝杆菌转入不含抗生素的7H9液体培养液中于28℃，180r/min培养4-5小时后，取200μl涂布于含有50μg/ml卡那霉素(购自Sigma公司)的7H11固体培养基平板表面，于28℃静置培养5-7d，筛选阳性克隆。将含有质粒pMV261-LUC-CFP-10的重组海分枝杆菌命名为MM-pMV261-LUC-CFP-10。

1.4待筛选的药物化合物样品的制备

化合物样品：将10mg纯品化合物溶于1ml DMSO中，用50％DMSO稀释到1mg/ml，取2μl作用于198μl菌体上清中，使其终浓度为10μg/ml。

发酵液样品：菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物接入盛有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃，190rpm旋转摇床培养4d。取10ml发酵液用10ml的丙酮抽提，挥干后，用1ml的DMSO溶解。取10μl加10μl水倍比稀释，取2μl作用于198μl菌体上清中。

1.5样品活性检测

将培养A₆₀₀约为0.8的重组海分枝杆菌离心收集菌体，换新的培养基稀释A₆₀₀约为0.1，按以下分组进行操作。

空白对照组：加入2μl 50％DMSO于198μl海分枝杆菌(ATCC927)中。

实验组分为两组：

对照组：加入2μl 50％DMSO于198μl重组海分枝杆菌(MM-pMV261-LUC-CFP-10)菌液中，以此来反映DMSO对LUC-CFP-10分泌的影响。

样品组：取待筛选的样品2μl于198μl上述重组海分枝杆菌菌液中，该组反映筛选样品对ESX-1分泌系统的抑制程度，同时反映对菌体生长的抑制程度。

96孔板密封培养48h后离心收集上清，吸取20μl上清至白色酶标板中，加入50μl荧光素酶底物(购自Promega公司)测定荧光素酶活性，并测定A₆₀₀。

1.6数据处理

分泌效率＝(样品组-空白对照组)/(对照组-空白对照组)×100％

抑制率＝100-分泌效率

1.7测试样品对重组海分枝杆菌体外生长的影响。

为了获得能抑制ESX-1系统的分泌效率，但是对重组海分枝杆菌的生长抑制作用却很小，因此不易产生耐药的活性化合物，将已加入样品并且培养了48小时的重组海分枝杆菌取100μl测定其A₆₀₀，以此来监测测试样品对重组海分枝杆菌生长状况的影响。

实验数据用x±s表示，显著性分析采用Excel软件中的数据分析工具进行t检验(n≥3)。

1.8测试样品对LUC酶活性的影响

ESX-1系统是结核分枝杆菌及海分枝杆菌等引发致病性的重要分泌系统，许多重要的毒力蛋白都是通过该分泌系统分泌到胞外。为了得到抑制ESX-1分泌系统分泌效率的活性化合物，以期能降低结核分枝杆菌的毒力。将接种时加入样品并培养了48小时的重组海分枝杆菌，离心吸取上清20μl于白色酶标板中，加入50μl底物测定Luciferase活性。

实验数据用x±s表示，显著性分析采用Excel软件中的数据分析工具进行t检验(n≥3)。

实验例1

将实施例1中得到的重组海分枝杆菌培养至A₆₀₀约为0.8，离心收集菌体，更换新鲜培养基继续培养A₆₀₀约为0.5，离心。取198μl上清加入96孔板中，加入2μl样品混匀，半小时后取20μl于白色酶标板中，加入50μl底物，测定Luciferase活性。

实验例2

将实施例1中得到的重组海分枝杆菌置于3ml 7H9液体培养基培养至A₆₀₀约为0.8左右，离心。收集上清，加入到MWCO 30000离心超滤管(Amicon Ultra-4ml，Millipore)中，4000g离心25分钟，至终体积为100μl。将离心收集后的菌体细胞加入PBS重悬，进行超声破碎，5000g离心10分钟，去除未破碎的菌体及细胞碎片。将上述浓缩后的上清及超声破碎得到的菌体蛋白进行蛋白定量(Bradford蛋白定量试剂盒购自上海美季生物技术公司)，将定量后的所有样品加入SDS-PAGE上样缓冲液，振荡混匀，沸水浴煮10min，冷却后即上样，进行Western blotting检测。所用抗体(Luciferase、goat anti-mouse)购自Santa Cruz公司。

实验例3

结核分枝杆菌ESX-1分泌系统中的毒力蛋白对分泌起到至关重要的作用。RV3871能够识别CFP-10的C端并同RV3870相互作用而促进蛋白的分泌。海分枝杆菌中的M5446与RV3871是同源基因，根据M5446基因序列设计三条反义DNA，5′、3′端各进行3个PS(硫代磷酸)修饰，序列如下：

PS-OND1：5′-TTCAGGTTCGGCAGTCAT-3′；

PS-OND2：5′-ATAGAACTGGACCTTGCGCGGCGA-3′；

PS-OND3：5′-CAGAATCGTGTGCACCAAAGGA-3′。

将培养至A₆₀₀为0.8左右的重组海分枝杆菌离心收集菌体，换新的苏通培养基(Sauton)稀释至A₆₀₀约为0.5，同时加入三条反义DNA，每条至终浓度为10μM，培养2-3天后，离心收集菌体，取20μl上清于白色酶标板中，加入50μl底物测定Luciferase活性(结果如图2所示)。

加入三条反义DNA的重组海分枝杆菌发酵液的上清中Luciferase的酶活性明显低于未加入组。这表明当ESX-1分泌系统的毒力因子MM5446被抑制后，外源蛋白的分泌活性明显受到抑制。因此，ESX-1分泌系统中的毒力蛋白不但对分枝杆菌的致病性起着关键作用，而且与蛋白的分泌密切相关。

实验例4

为确定本发明筛选方法中，加入化合物作用48小时后测定Luciferase活性时合适的上清体积，将培养A₆₀₀为0.8左右的重组海分枝杆菌离心收集菌体，换新的培养基培养A₆₀₀约为0.5，离心收集上清。分别取5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl上清于白色酶标板中，加入50μl底物，测定Luciferase活性(结果如图3所示)，在0-20μl范围内，酶的活性随着上清体积的增加而增加，大于20μl后，上清体积的增加并没有增加酶的活性。所以本发明选择20μl上清体积作为每次测定的体积。

实验例5

本发明通过测定荧光素酶的荧光强度来评价化合物对ESX-1分泌系统的抑制效率。所建立的筛选方法是否适用于高通量筛选，通常用Z′来评价，如果Z′大于0.4，则该方法较可靠、稳定性高、特异性好。本筛选方法经过优化验证，计算得出Z′为0.95，大于0.4，说明该模型符合高通量筛选的统计学要求。运用该模型筛选到的活性化合物，不仅能发展为新的抗结核药物，而且也为研发不易引发耐药的抗结核药物提供有力的工作基础。

实验例6

将培养A₆₀₀约为0.8的重组海分枝杆菌离心收集菌体，换新的培养基稀释A₆₀₀约为0.1，取200μl接入96孔板中，共接种32个孔，静置培养48小时后离心收集上清。取20μl上清于白色酶标板中，加入50μl底物测定Luciferase活性。测定得到的活性值可以用来评价96孔板中培养重组海分枝杆菌所有孔的均一性(结果如图4所示)。从图4可以看出，全部测定值都在正负三倍标准差内，整个微孔板中样品测定值的重复性很好，能够满足高通量筛选的要求。

实验例7

采用本发明方法构建的筛选模型进行小规模药物筛选，初筛2000个化合物，每个化合物的筛选质量浓度为10μg·mL^-1。根据每个化合物对luciferase酶活性的抑制程度，选择抑制率大于85％的化合物作为初筛得到的阳性化合物，阳性率为1.4％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法，其特征在于，其是通过构建外源表达来自于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中的CFP-10蛋白和报告蛋白的融合蛋白的重组海分枝杆菌，以该重组菌作为针对ESX-1分泌系统的抗结核病药物高通量筛选模型，向含有该重组菌的培养液中加入待筛选的药物化合物，培养一段时间后离心取上清测定报告蛋白的表达量或活性，以此来评价该药物化合物对ESX-1分泌系统的抑制活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述报告蛋白为荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶、β-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶或荧光蛋白家族中的成员。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述报告蛋白为荧光素酶。

4.含有CFP-10蛋白和荧光素酶的融合蛋白。

5.编码权利要求4所述融合蛋白的基因。

6.含有权利要求5所述基因的载体。

7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，其出发载体为pMV261。

8.含有权利要求6或7所述载体的宿主细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，其为海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)。

10.权利要求4所述的融合蛋白、权利要求5所述的基因、权利要求6或7所述的载体、权利要求8或9所述的宿主细胞在筛选抗结核病药物中的应用。

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