CN101875946A - 一种抗流感病毒药物筛选模型及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于抗流感病毒药物筛选模型与方法及应用，特别涉及一种流感病毒RNA聚合酶抑制剂筛选模型及其应用；本发明的目的是这样实现的，它利用甲型流感病毒4个聚合酶(PB1，PB2，PA和NP)基因的转录活性，将上述4个RNA聚合酶基因与报告基因共同转染细胞后使报告基因在细胞内转录表达，然后利用荧光显微镜等荧光检测仪器检测其转录产生的荧光报告基因的发光强度或通过间接检测报告基因作用底物的变化来筛选抗流感病毒药物的方法；本发明以流感病毒感染和生活周期肩负重要功能、又相对稳定的RNA聚合酶作为抗流感病毒新型药物筛选模型，有望开发出高效、低毒、副作用小的破坏酶结构或抑制酶活性的新型的抗流感病毒新药。

Description

一种抗流感病毒药物筛选模型及其应用
技术领域：
本发明涉及一种用于抗流感病毒药物筛选模型与方法及应用，特别涉及一种流感病毒RNA聚合酶抑制剂筛选模型及其应用。
背景技术：
甲流感与禽流感是目前严重威胁人类生命健康的急性呼吸道传播性疾病。随着疫苗和药物的广泛使用，抗原变异株和耐药株的出现，使疫苗的保护效力和目前抗流感药物的治疗效果显著降低，因此开发出新型的抗流感病毒药物迫在眉睫。甲型流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒属。目前已发现16种HA亚型和9种NA亚型。甲型流感病毒RNA聚合酶是负责流感病毒RNA复制、转录等生物学功能的多亚基、多功能酶，在流感病毒的生活周期中发挥着极其重要的作用。甲型流感病毒的RNA聚合酶是由由2个碱性亚基PB1、PB2和1个酸性亚基PA组成的复合物。在病毒体内，3个RNA聚合酶亚基与NP蛋白、RNA形成较为紧密的RNP复合物。甲型流感病毒RNA聚合酶是一个多功能酶，不仅具有RNA聚合酶活性(转录酶和复制酶)，还有RNA核酸酶活性(内切酶和外切酶)。流感病毒的RNA聚合酶可直接从宿主细胞内的mRNA上剪切加帽的RNA引物(capped RNA primer)来启动合成自身的mRNA。因此，流感病毒与高等生物转录后需加上帽子结构不同，流感病毒mRNA转录后不再需要加帽的引物，直接先以vRNA为模板合成出其互补RNA(cRNA)，然后再以cRNA为模板复制出vRNA。综上所述，流感病毒RNA聚合酶是一个多功能酶，既是转录酶又是复制酶，同时在转录过程中，具有切割宿主mRNA帽子结构的核酸内切酶活性，又有发挥校对作用的核酸外切酶活性。在不同亚型的流感病毒中RNA聚合酶较为稳定，不像表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)那样容易发生抗原变异。只要任何一个RNA聚合酶亚基的活性被阻断，那么流感病毒的复制就会受到抑制，而且RNA聚合酶基因位于病毒体内很少受到宿主免疫压力的影响，基因序列相对较为保守。因此，本发明以流感病毒感染和生活周期肩负重要功能、又相对稳定的RNA聚合酶作为抗流感病毒新型药物筛选模型，有望开发出高效、低毒、副作用小的破坏酶结构或抑制酶活性的新型的抗流感病毒新药。
发明内容：
发明目的
本发明目的在于建立一种抗流感病毒药物筛选模型及其应用。
发明内容
本发明的目的是这样实现的，它利用甲型流感病毒4个聚合酶(PB1，PB2，PA和NP)基因的转录活性，将上述4个RNA聚合酶基因与报告基因共同转染细胞后使报告基因在细胞内转录表达，然后利用荧光显微镜等荧光检测仪器检测其转录产生的荧光报告基因的发光强度或通过间接检测报告基因作用底物的变化来筛选抗流感病毒药物的方法。
一种新型的抗流感病毒药物筛选模型的按如下步骤制备：
A、通过将含甲型流感病毒4个RNA聚合酶相关基因(PB1、PB2、PA和NP)分别插入pHW2000双向转录真核表达载体BsmBI酶切位点，构建具有流感病毒RNA聚合酶活性的真核质粒pHWPB2、pHWPB1、pHWPA和pHWNP；
B、按如下引物PCR扩增报告基因反向插入上述pHW2000载体的BsmBI酶切位点，
引物F1：
5’-ATACGTCTCGGGG
AGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACCGAGTGACATCAACACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’
引物F2：
5’-ATACGTCTCATATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’，如何插入pHW2000载体的BsmBI酶切位点
C、将上述质粒按任意比例，利用脂质体转染试剂，按转染试剂说明共转染真核细胞293T细胞，，转染后0-24h在转染后的真核细胞293T细胞中加入待检测药物，培养12-36h后，以不加待测药物的细胞转染组为对照，利用荧光显微镜或相应检测试剂观察或检测报告基因的表达丰度来判定待检测药物对甲型流感病毒RNA聚合酶的影响
所述的脂质体转染试剂可以为Lipofectamine2000(Invitrogen)
所述的报告基因为绿色荧光蛋白(GFP)，红色荧光蛋白(rGFP)；也可以是通过化学发光法来检测的报告基因，如CAT，Luciferase
有益效果
1、本发明以流感病毒感染和生活周期肩负重要功能、又相对稳定的RNA聚合酶作为抗流感病毒新型药物筛选模型，有望开发出高效、低毒、副作用小的破坏酶结构或抑制酶活性的新型的抗流感病毒新药
附图说明
图1为实施例1的示意图
具体实施方式：
实施例1
(1)通过将含甲型流感病毒4个RNA聚合酶相关基因(PB1、PB2、PA和NP)分别插入pHW2000双向转录真核表达载体BsmBI酶切位点，构建具有流感病毒RNA聚合酶活性的真核质粒pHWPB2、pHWPB1、pHWPA和pHWNP；
(2)按参考文献[1]的方法通过如下引物PCR扩增绿色荧光蛋白(GFP)基因反向插入pHW2000载体的BsmBI酶切位点，具体操作方式如下：
引物F1：
5’-ATACGTCTCGGGG
AGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACCGAGTGACATCAACACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’
引物F2：
5’-ATACGTCTCATATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’
(3)将上述质粒按任意比例，利用脂质体转染试剂如Lipofectamine2000(Invitrogen)，按转染试剂说明共转染真核细胞293T细胞，在转染后0-24h加入待检测药物，培养12-36h后，以不加待测药物的细胞转染组为对照，利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因是否表达来判定待检测药物对甲型流感病毒RNA聚合酶的影响。

Claims (2)

1.一种抗流感病毒药物筛选模型，其特征在于按如下步骤制备：
A、通过将含甲型流感病毒4个RNA聚合酶相关基因(PB1、PB2、PA和NP)分别插入pHW2000双向转录真核表达载体BsmBI酶切位点，构建具有流感病毒RNA聚合酶活性的真核质粒pHWPB2、pHWPB1、pHWPA和pHWNP；
B、按如下引物PCR扩增报告基因反向插入上述pHW2000载体的BsmBI酶切位点，
引物F1：
5’-ATACGTCTCGGGG
AGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACCGAGTGACATCAACACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’
引物F2：
5’-ATACGTCTCATATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’，如何插入pHW2000载体的BsmBI酶切位点
C、将上述质粒按任意比例，利用脂质体转染试剂，按转染试剂说明共转染真核细胞293T细胞，，转染后0-24h在转染后的真核细胞293T细胞中加入待检测药物，培养12-36h后，以不加待测药物的细胞转染组为对照，利用荧光显微镜或相应检测试剂观察或检测报告基因的表达丰度来判定待检测药物对甲型流感病毒RNA聚合酶的影响。
2.根据权利要求1所述的抗流感病毒药物筛选模型，其特征在于所述的报告基因为绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(rGFP)、CAT或Luciferase。
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