CN102051345B - 一种抗流行性感冒病毒药物的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗流感病毒药物的筛选方法，为通过将待测样品添加至表达流感病毒RNA聚合酶及其活性依赖的报告基因的融合蛋白细胞，考察报告基因编码产物的量，来判断样品对RNA聚合酶的阻断作用，并进一步判断初选的样品是否为RNA聚合酶活性抑制剂，从而筛选出抗流感病毒的药物。本发明的筛选方法选择流感病毒RNA聚合酶复合物作为靶点，解决了病毒高变异导致的耐药性问题，且与目前临床应用的抗流感病毒药物无交叉耐药性。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物的筛选方法，具体地，涉及抗流感病毒药物的筛选方法。
背景技术
流行性感冒(简称流感)是由流行性感冒病毒(influenza)引起的急性呼吸道传染病，主要经空气飞沫传播。是目前人类尚不能有效控制的世界性传染性疾病。每年引致相当高的发病率和死亡率，而且不时会出现流感流行或局部爆发。我国被世界公认为是流感的多发地。
目前，临床上预防和治疗病毒性流感的手段主要有药物治疗和疫苗。由于流感病毒为多节段负链RNA病毒，具有极强的重组变异和抗原漂移特点，从而严重制约了目前流感疫苗的免疫保护作用和抗病毒化学药物的治疗效果。抗流感病毒药物则主要设计为作用于病毒的蛋白质，如奥司他韦、扎那米韦、金刚烷胺、金刚乙胺和新近研发的盐酸阿比多尔等，这些药物具有较强的特异性，但也面临巨大挑战。
目前临床批准使用的抗流感药物有阻断流感病毒基质2(M2)离子通道活性的金刚烷胺类化合物(金刚烷胺和金刚乙胺)和阻断病毒神经氨酸酶已上市与其受体结合的神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦，zanamivir、奥司米韦(oseltamivir，商品名“达菲”)。金刚烷胺类药物主要通过干扰M2离子通道活性来抑制流感病毒的复制。但金刚烷胺类药物对B型流感无效，而且存在神经毒性、长期用药易产生耐药毒株等缺陷，这限制了金刚烷胺类药物在临床上的广泛应用。
流感病毒神经氨酸酶抑制剂：流感病毒NA是流感病毒的另一种主要结构蛋白，具有唾液酸酶活性，能切割糖蛋白、糖脂和寡居糖蛋白通过酮基连接的唾液酸。NA抑制剂不仅抑制A型流感病毒，而且能抑制B型流感病毒，除了治疗外它还能对流感起预防作用，其抗流感的保护率是74％。目前两种流感病毒NA抑制剂扎那米韦(zanamivir)、奥司米韦(oseltamivir)已上市。其中奥司米韦(商品名“达菲”)对治疗高致病性禽流感病毒感染有相当好的疗效，但随后有报道显示“达菲”的耐药突变株已经出现。
由于目前应用的抗流感药物主要针对病毒颗粒中变异性较强的基因靶点，使得病毒总是能很快适应和逃避来自药物施加的选择压力，而产生耐药性，同时药物对宿主细胞还存在毒副作用大的问题。因此，亟待寻找新的抗流感病毒药物靶标，发展新型抗病毒药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选抗流感病毒药物的方法，具体地讲是一种针对流感病毒复制前形成的流感病毒RNA聚合酶复合物为靶点的抗流感病毒药物筛选方法。
为实现上述目的，本发明首先构建了一种流感病毒RNA聚合酶活性依赖的表达载体，该表达载体带有依赖流感病毒RNA聚合酶活性表达的报告基因。
这里的报告基因可以是本领域技术人员所熟知的常规报告基因，优选为荧光素酶基因或者荧光蛋白基因，例如绿荧光蛋白(GFP)、红荧光蛋白(DsRed2)以及深蓝萤光蛋白(CFP)，更优选为黄荧光蛋白。可以通过检测细胞的荧光值方便地进行观察。
进一步，本发明将上述表达在于与表达流感病毒RNA聚合酶PA、PB1、PB2亚基和NP蛋白的质粒共转染宿主细胞，构建得到稳定表达Rluc的细胞。
上述细胞可通过如下方法构建：引入内部核糖体结合位点，构建报告基因和抗性基因双蛋白表达载体。利用抗性基因的表达依赖于流感病毒RNA聚合酶活性的特点，建立稳定表达流感病毒RNA聚合酶PA、PB1、PB2亚基、NP蛋白和RLuc的细胞系。利用该细胞系建立基于稳定表达的流感病毒RNA聚合酶活性分析方法，并对其进行可行性评价和药物筛选。
基于此，本发明的药物筛选方法是：将添加待测样品至上述的细胞；检测细胞报告基因表达产物量的变化，选择能使报告基因表达产物量下降的样品。
当然，以上筛选得到的样品还应当是对细胞内正常蛋白表达(例如actin，或许CMV启动子下表达的RLuc)没有影响的样品。
本发明筛选方法选择流感病毒RNA聚合酶复合物作为靶点，解决了病毒高变异导致的耐药性问题，且与目前临床应用的抗流感病毒药物无交叉耐药性。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1、表达载体的构建；
应用PCR扩增真核细胞表达载体pRluc-N2(PerkinElmer)中的Rluc基因片段。所用引物所用引物：上游引物5′-GATTCAATTCAGCTACCATAATGATGCAGAGAGGCAATTTTGGTAC-3′，下游引物5′-CAAAATTGCCTCTCTGCATCATTATGCTAGCTGAATTG-3′，。
反应体系：
反应条件：94℃45s，68℃90s，共30个循环。
将Rluc片段插入到流感病毒M片段表达载体pWSN-M(Kawaoka博士惠赠)的克隆位点BsmB I中，得到质粒pFLU-Rluc，表达荧光蛋白。
2、细胞培养
取293T细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃旧培养基，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化。待细胞变圆，弃消化液，立即加入含10％FBS的高糖DMEM培养基(HyClone)，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底且使之分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，10cm细胞培养皿接种2.4×106个细胞，培养24h后转染。
3、细胞转染
转染步骤按Lipofectamine 2000(Invitrogene)的说明书进行。具体操作如下：用1.5ml高糖DMEM培养基稀释质粒，pWSN-PB1(Kawaoka博士惠赠，表达流感病毒PB1)、pWSN-PB2(Kawaoka博士惠赠，表达流感病毒PB2)和pWSN-PA(Kawaoka博士惠赠，表达流感病毒PA)质粒用量为1.0μg，pWSN-NP(Kawaoka博士惠赠，表达流感病毒NP)质粒用量为1.5μg，而pFLU-Rluc质粒的用量为4.0μg。用1.5ml高糖DMEM培养基稀释60μl Lipofectamine2000。室温孵育5min，将含有转染质粒和Lipofectamine 2000的培养基轻轻混匀(总体积为3ml)，室温孵育25min，加到10cm培养皿的细胞培养上清中。
转染后，37℃，5％的CO2培养12h。然后吸去旧的培养基，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化，弃消化液，立即加入含10％FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打，使细胞分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，用培养基将细胞浓度调整为2.5×105个/ml，四周白色不透明、底部透明、平底的96孔板(Costar)每孔接种150μl细胞悬液。
4、样品制备
化合物样品：10mg纯品化合物溶到1ml DMSO中，50％DMSO稀释到1mg/ml，取1.5μl作用于150μl细胞体系，使其终浓度为10μg/ml。
发酵液样品：菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃、190rpm旋转摇床培养4d。取10ml发酵液用10ml的丙酮抽提，挥干后，用1ml的DMSO溶解。取10μl加10μl水倍比稀释，取1.5μl作用于150μl细胞体系。
5、样品活性检测
96孔板培养12h后，按以下分组进行操作。
阴性对照组：加入1.5μl RLuc质粒于细胞培养上清中，该组反映pFLU-Rluc质粒表达的RLuc激活的荧光蛋白对细胞的作用。
阳性药对照组：加1.5μl的500μM TMC-125于150μl的细胞体系中，使TMC-125的终浓度为5μM。该组反映TMC-125抑制流感病毒RNA聚合酶的程度。
样品实验组：加药筛选的样品1.5μl于150μl的细胞体系中。该组反映筛选样品抑制RNA聚合酶的程度。
继续培养16h后，吸去旧的培养基，每孔加入150μLPBS清洗细胞后，4℃离心弃去PBS，加入20μL细胞裂解液，离心吸出上清转到测量板中，加入荧光底物，用480nm(±10nm)激发光，520nm(±10nm)处发射光，检测Luc强度。与阴性对照比较得出结果。
结果，阳性药物对照组的荧光强度显著弱于阴性对照组，表明TMC-125抑制流感病毒RNA聚合酶。从组合化学库共筛选4000个样品，其中初筛阳性化合物30个，阳性率为0.75％。
序列表
<110>中国医学科学院生物技术研究所
<120>一种抗流行性感冒病毒药物的筛选方法
<130>KHP09113516.6
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gattcaattc agctaccata atgatgcaga gaggcaattt tggtac 46
<210>2
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
caaaattgcc tctctgcatc attatgctag ctgaattg 38
Claims (2)
1.一种由以下载体共转染得到的表达流感病毒RNA聚合酶PA、PB1、PB2亚基和NP蛋白以及至少一种报告基因的细胞：1）表达流感病毒RNA聚合酶PA、PB1、PB2亚基和NP蛋白的质粒载体A；2）流感病毒RNA聚合酶活性依赖的表达载体B，该表达载体B带有依赖流感病毒RNA聚合酶活性表达的报告基因，所述表达载体B在报告基因的上下游分别具有流感病毒M蛋白非编码片段；所述报告基因为Rluc；所述表达载体B为pFLU-Rluc，将Rluc基因插入到流感病毒M片段表达载体pWSN-M的克隆位点BsmBⅠ中，得到质粒pFLU-Rluc。
2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述Rluc基因是用PCR扩增真核细胞表达载体pRluc-N2获得的，所用引物为：上游引物：5′-GATTCAATTCAGCTACCATAATGATGCAGAGAGGCAATTTTGGTAC-3′，下游引物：5′-CAAAATTGCCTCTCTGCATCATTATGCTAGCTGAATTG-3′。
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