CN102617712A - 有效抑制流感病毒聚合酶活性的多肽 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包括流感病毒聚合酶亚基PB1481-515位的氨基酸。同时发现在所述多肽的N端和/或C端缺少5个或10个氨基酸的截短体以及在所述多肽和它的上述截短体的C端添加了序列为YGRKKRRQRRRPP的13个氨基酸的衍生多肽也具有类似的对流感病毒聚合酶活性的抑制作用。

Description

有效抑制流感病毒聚合酶活性的多肽

技术领域

本发明涉及生物信息学领域。更具体地，本发明涉及流感病毒PB1的模拟结构及针对该结构的有效抑制流感病毒聚合酶活性的多肽。

背景技术

流感病毒，属于正粘病毒科，是极易发生突变的负链RNA病毒。它是引起流行性感冒(简称流感)的病原体，在历史上多次引起流行性感冒大流行：如1918年西班牙流感大流行，造成多达5000万人死亡，1957年流感，引起全球15亿人发病。流感病毒的流行为全球的经济和社会发展造成了巨大的危害。所以针对流感病毒的防治是摆在我们面前的一项重要任务。现在使用的有效的流感药物有Amantadine、Ostamivir、Zanamivir等，分别针对流感病毒的离子通道蛋白(M2)，及表面蛋白(NA)。但是这些小分子药物也存在一些问题，如抗性病毒的出现等(18、24)。所以，我们需要更多的手段来抑制流感病毒的传播。

流感病毒的基因组由8个基因片段组成，共编码11个蛋白。流感病毒聚合酶是由3个蛋白(PB2、PB1、PA)组成的异源三聚体复合物，是负责流感病毒复制和转录的重要复合物。PB2主要负责Cap binding，PA主要有核酸内切酶活性，负责切割5’端“帽子”结构，而PB1是聚合酶的核心蛋白，负责RNA链的延伸，单独和PB2，PA都有很强的相互作用。另外流感病毒聚合酶在体内要行使功能还需要NP蛋白的辅助，NP蛋白负责结合到病毒的基因组RNA上，保持RNA的结构稳定性，另外NP也能和PB2相互作用从而调控转录和复制的过程(9、11、25)。对流感病毒聚合酶的功能研究用的最多的是流感病毒聚合酶的微型复制系统(minirepliconsystem)，即在细胞中表达流感病毒聚合酶行使功能所需要的4个蛋白PB2、PB1、PA和NP，另外再表达一个RNA报告基因，报告基因反向互补克隆在流感病毒保守的基因组RNA(vRNA)启动子的5’端和3’端之间，报告基因最初会被细胞内的RNA聚合酶I复合物转录出一个5’和3’端带有流感病毒的启动子的RNA(报告基因是反向互补的)，然后细胞内表达的流感病毒聚合酶会识别该启动子RNA，从而复制出报告基因为正向克隆的mRNA，从而在细胞中翻译出报告基因的蛋白产物(22、23)。简单的讲细胞中转染表达RNA报告基因的载体后，只要细胞中有足够的流感病毒聚合酶或流感病毒，就能在细胞中检测到报告基因的表达(17、18、22)，这也是用来研究针对流感病毒聚合酶的药物的很好的系统，当药物能有效抑制流感病毒聚合酶活性的时候，报告基因的表达量就会低，反之会高。

在进化上，流感病毒聚合酶结构和功能都非常的保守，针对流感病毒聚合酶的药物相对于针对表面蛋白的药物来讲具有更好的广谱性和耐药性。到现在，PA的两个亚基结构已被解析，PB2有近1/2的结构被解析，而PB1的两端有少部分结构外，还没有更多的PB1的结构数据(25)。随着对流感病毒聚合酶结构和功能认识的不断深入，现在流感病毒聚合酶成为人们研制流感药物的新的有效的靶点。

发明内容

我们通过对PB1结构的模拟，以及通过将诺沃克病毒(Norwalk virus)RdRp晶体结构(PDB ID：3BSN)中的RNA对接(称为“dock”)到我们模拟的PB1的结构上，发现PB1的氨基酸序列中的第481位至第515位的片段(下文中称为PB1 481-515，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)可能参与PB1与RNA的结合。细胞学实验表明PB1 481-515对流感病毒聚合酶具有抑制效果。病毒学实验表明PB1 481-515对流感病毒的复制具有很好的抑制效果。并且发现PB1 481-515与已报道的对流感病毒聚合酶有抑制效果的片段PB1n 1-25AA(SEQ ID NO.2)(18)在抑制病毒复制方面效果相当。因此，本发明的多肽PB1 481-515具有非常好的实用价值和应用前景。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包括流感病毒聚合酶亚基PB1 481-515位的氨基酸片段(SEQ ID NO：1)。

2.一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽包括SEQ IDNO：1的截短体，所述截短体与SEQ ID NO：1相比在N端和/或C端缺少15个以下的氨基酸，优选地缺少10个以下的氨基酸。

3.根据2的多肽，其中所述截短体与SEQ ID NO：1相比在N端缺少10个或5个氨基酸。

4.根据2的多肽，其中所述截短体与SEQ ID NO：1相比在N端缺少10个氨基酸并且在C端缺少5个氨基酸。

5.一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽是在根据1至4中任一项的多肽的C端添加了序列为YGRKKRRQRRRPP的13个氨基酸的衍生多肽。

6.核苷酸序列，其编码根据前述中任一项的多肽。

7.包括根据6的核苷酸序列的表达载体。

8.包含根据7的表达载体的细胞。

9.一种使用根据1-5中任一项的多肽来抑制流感病毒聚合酶活性的方法，所述方法包括将根据7的载体提前转染到之后会被病毒感染的人细胞中。

10.根据1-5中任一项的多肽、根据6的核苷酸序列、根据7的表达载体或根据8的细胞在制备用于抑制流感病毒聚合酶活性的药物中的应用。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1是流程框图，其表示模拟构建PB1三维结构的流程；

图2是模拟构建的PB1整体结构的示意图；

图3A显示PB1 481-515片段对流感病毒聚合酶的抑制效果；

图3B显示PB1 481-515片段在N端和/或C端缺少5个或10个氨基酸的截短体对流感病毒聚合酶的抑制效果；

图4A显示PB1 481-515片段对流感病毒H1N1A/WSN/33复制的抑制效果；

图4B显示PB1 481-515片段对流感病毒H9N2A/Quail/HK/G1/97复制的抑制效果。

图5显示在PB1 481-515的截短体PB1 491-515的C端添加了序列为YGRKKRRQRRRPP的13个氨基酸的衍生肽(491-515-TAT)在体外对流感病毒聚合酶转录活性的抑制效果

具体实施方式

实施例1、PB1三维结构的模拟

由于PB1和已有晶体结构的RNA dependent RNA polymerase(依赖RNA的RNA聚合酶，RdRp)序列的相似性非常低，很难用已有的常规的基于模板的模建方法来模建PB1的结构。在本文中本发明人将已知的PB1的功能信息加入常规的基于模版的结构模拟方法FR-t5(7)来找最优的PB1的模板。

首先挑选用于模拟PB1结构的模板，挑选PB1的模板所用的信息包括：PB1的111-636区域为PB1的RdRp核心区和PB1的5个保守的基序(motif)(pre-A、A、B、C、D)区域(2、13)。根据设计的方法找到的打分最高的前20个蛋白中，大部分模板是正链RNA病毒的RdRp。打分最高的三个模板从高到低依次为诺沃克病毒(Norwalk Virus，NV)(6)、手足口病病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)(5)和登革热病毒(Dengue Virus，DV)(8)的RdRps。我们选取排在第一位的NV RdRP(PDBID 2B43，1208-1695AA)为模板用Swiss-Model(1)来构建PB1的结构。序列比对时一个原则是优先将5个基序的位点比对准确，另一个原则是尽可能不在模板二级结构中间加入“间隔”，保持二级结构的完整性。序列和结构比对分析NV和DV的RdRp发现，DV RdRp多了一个“Flap”结构，从而使其不能结合双链RNA(4、10)，而PB1和NV RdRp都能结合双链RNA启动子(promoter)(3、12、15)，说明NV RdRp是非常适合用于构建PB1结构的模板。

如图1所示，PB1模建的流程包括4个步骤步：1)要模拟区域的选择，2)位点限制的折叠识别，3)模版的选择和4)模板构建优化

实施例2、PB1 481-515片段的挑选

如在图2A中所示，本发明的模拟的PB1结构呈现出RdRp典型的“闭合的右手”的拓扑结构。该结构的中心是由手指(fingers)(71-266，314-405AA)，手掌(palm)(267-313，406-501AA)和拇指(thumb)(502-600AA)组成的一个通道，这个通道是结合RNA模板的通道(RNAtemplate channel)。整个结构中包含5个保守的基序。4个保守位点D405、G406、D445和K481均位于RNA模板的通道周围；图2B是将图2A沿纵坐标旋转180°得到的图。将已知的诺沃克病毒RdRp晶体结构(PDBID：3BSN)中的RNA对接(称为“dock”)到本发明模拟的PB1的结构中，可以看到在本发明模拟的PB1结构的中心形成的RNA模板的通道正好可以容纳一个双链的RNA，本发明的PB1 481-515的位置正好位于所对接的RNA周围。

PB1的481位-515位氨基酸区域非常保守，并且包含了基序E(在负链RNA病毒中是非常保守的)(20)，这个片段在如上所述的模拟的含有RNA的PB1的结构模型中可能参与了PB1对RNA的结合，可见这个片段在流感病毒复制过程中功能非常重要，在体内过表达该片段后，该片段可能会和PB1竞争性结合RNA，从而抑制PB1的功能及病毒的复制。我们选这个片段进行进一步的检测。

实施例3、将多肽片段PB1 481-515构建到真核表达载体上

用定点突变的方法将获得自He，W等的载体pcDNA3.1-6HA(14)中的NdeI酶切位点突变掉，引物为NdeI-F：CATCAAGTGTATCGTATGCCAAGTAC；NdeI-R：CGTACTTGGCATACGATACACTTGATG。测序正确后记为pcDNA3.1-6HA-M，设计引物：Flag-F：CCCAAGCTTCATATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAG；Flag-R：CCGGAATTCCCCGGGACTACTTGTACAGCTCGTCCATGC，将Flag-GFP从模板pEGFP-N1(购自clontech)中扩增出来，用HindIII、EcoRI酶切所得到的PCR产物并回收，将该切好的PCR产物连接到用HindIII、EcoRI(Takara公司生产)酶切并回收的载体pcDNA3.1-6HA-M上，得到pFA-Flag-GFP，其中Flag两边带有NdeI、BamHI的酶切位点(下划线表示)，测序正确后，用于之后的载体构建。

设计特异引物(481-F：CCATTATGGCCCCATATGCCCAAGTCTTACATAAATCGGACAGGAAC；481-R：CGACATGTTTTTTGGATCCCCCCTAGGATCCAGACACTCCAAAGCTGGGCA)将PB1 481-515从模板pBD-PB1(来自于1996年在广东的鹅体内分离的A型高致病性禽流感H5N1的基因，毒株名称为：A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)(8、19))中扩增出来，用NdeI、BamHI(Takara公司生产)双酶切所得的PCR产物和载体pFA-Flag-GFP，用T4连接酶(Takara公司生产)进行连接，转化到TOP10感受态细胞(购自北京GenStar公司)中，测序鉴定正确并在本文中记为pFA-PB1481-515-GFP，即将pFA-Flag-GFP载体中的Flag片段替换为PB1 481-515片段。其他片段的克隆都采用同样的策略。下文中除非另外说明，就用pFA-peptide-GFP表示表达多种肽(peptide)与GFP相连的融合蛋白(peptide-GFP)的载体。

实施例4、将多肽片段PB1 481-515的截短体构建到真核表达载体上

PB1 481-515截短体是在PB1 481-515的N端和C端截去若干个(例如5个或10个)氨基酸的不同截短体。将所述截短体构建到实施例3中所述的真核表达载体上，所用方法与实施例3中所述基本相同，不同之处在于当从模板扩增目的片段时，使用以下表1中的引物以获得相应的截短体克隆。

表1PB1 481-515的不同截短体的构建

实施例5、PB1 481-515在293T细胞内对流感病毒WSN33聚合酶的抑制效果

转染的前一天铺HEK293T细胞(ATCC：CRL-11268)于6孔板(购自Corning公司)；待细胞长至60％-80％密度时转染；每孔所需质粒pcDNA-PB2、pcDNA-PB1、pcDNA-PA为90ng，pcDNA-NP为300ng，分别用于表达病毒A/WSN/33的蛋白PB2、PB1、PA和NP，这是流感病毒聚合酶在体内行使功能必需的4个蛋白，这4种质粒的来源请参见参考文献(12)；pPolI-NP-Luc为50ng，构建载体时将firefly luciferase的基因反向互补克隆在A型流感病毒保守的启动子5’和3’端中间，用于检测流感病毒聚合酶的活性，流感病毒聚合酶活性高，则firefly luciferase的活性就高，反之亦然(该质粒的来源参见文献18)；pRenilla(购自Promega)为100ng，转染后直接表达Renilla luciferase，转染效率的高低直接体现在Renilla luciferase的活性高低上，用于归一化转染效率(firefly luciferase的信号除以renilla luciferase的信号)；以及900ng本发明中构建的多种质粒pFA-peptide-GFP，用于表达peptide-GFP的融合蛋白；具体过程如下：

1)转染时，先在EP管中准备PEI(polyethyleneimine简写，购自Sigma公司)混合物，按照质粒∶PEI＝1∶2(质量体积比)转染，将PEI加到100ul opti MEM(Gibicol)中，震荡混匀，3000rpm离心30秒(离心机型号Centrifuge 5424，购自Eppendorf公司)，室温放置5min；

2)取另一EP管准备DNA混合物，将上述7种质粒混在一起，加入100ul opti-MEM中，震荡混匀，3000rpm离心30秒，即为DNA混合物；

3)PEI混合物放置5min后，将PEI混合物逐滴加入到DNA混合物中，震荡混匀，3000rpm离心30秒，室温放置25min；

4)25min后，将第3步的混合物均匀滴加到有293T细胞的6孔板中，放入细胞培养箱，培养24小时后，裂解细胞进行检测。阴性对照与实验组的区别在于用pcDNA3.1-6HA代替pcDNA-PB2。

转染24h后检测firefly和Renilla luciferase的活性(用promega的dualluciferase assay试剂盒)，具体做法是：先去培养基，用1mlPBS/孔洗细胞一次，去掉PBS；用300ul PLB裂解液裂解细胞，放室温2-3min，然后反复吹打，收集所有的细胞裂解液；再放至-80℃冻融一次；放冰上溶解后，12000rpm离心1min，取30ul上清用GENiosPlus酶标仪(购自Tecan公司)检测firefly和renilla luciferase信号，检测的buffer各用50ul即可；将Flag-GFP一组的归一化后的firefly luciferase活性值设为100％，其他组的和其比较，值越低，说明多肽对流感病毒聚合酶活性的抑制效果越好；值越高，说明多肽对流感病毒聚合酶活性的抑制效果越差。

结果如图3A显示，不转染PB2表达载体的组，活性很低，为Flag-GFP组的0.1％左右，阳性对照PB1n1-25AA对流感病毒聚合酶活性能抑制80％左右，PB1 481-515也能很好的抑制流感病毒聚合酶的活性，抑制效果也接近80％。

如图3B所示，N端缺少10个或5个氨基酸的截短体PB1 491-515或PB1 486-515以及N端缺少10个氨基酸并且C端缺少5个氨基酸的截短体PB1 491-510的抑制效果也很好。

对同样样品，通过蛋白质印迹法(Western Blotting)检测GFP融合蛋白的表达量：取16ul跑SDS-PAGE，小鼠GFP一抗(购自Santa)稀释比例为1∶1000，用于检测peptide-GFP融合蛋白的量，并用GAPDH的抗体(购自上海康成)检测内参蛋白GAPDH的量，一抗均用含5％脱脂奶粉的PBS稀释，稀释比例为1∶10000，羊抗鼠二抗(购自中杉金桥)用含5％脱脂奶粉的PBS稀释，稀释比例为1∶4000。结果在内参蛋白GAPDH表达量一致时，Flag-GFP融合蛋白的表达量最高(结果未显示)，这也说明有抑制效果的片段并不是由于表达量高引起的。

实施例6、PB1 481-515在人肺癌细胞A549中对流感病毒复制的抑制效果

A549细胞(ATCC，CCL-185)，培养在24孔板(购自Corning公司)，长至60％满度，PEI转染(pFA-peptide-GFP和pPolI-Gluc-Infection(17)分别0.45ug、0.35ug)，pFA-peptide-GFP用来表达peptide-GFP融合蛋白，pPolI-Gluc-Infection用于检测病毒的多少，原理和pPolI-NP-Luc一样，区别在于报告基因不是firefly luciferase，而是Gaussia luciferase。当该载体转染A549细胞后，细胞中只要存在A型流感病毒，细胞就会分泌Gaussialuciferase到培养基中，细胞中病毒越多，培养基中的luciferase信号会越强，反之亦然(17)，可以用这个方法来检测多肽对病毒是否具有抑制效果。转染12h后(90-100％满度)，去细胞培养基；用PBS洗2遍；用1ml病毒感染液感染细胞(感染复数Multiplicity of infection为0.01-0.03，WSN33的全称为A/WSN/33，最初是1933年在Wisconsin分离到的A型H1N1病毒。H9N2的全称为A/Quail/HK/G1/97，是1997年在香港的鹌鹑体内分离的A型流感病毒)，37℃，2h；去上清，用PBS洗2遍；加入病毒感染液液2ml；对照为不感染病毒的组(Mock)。

感染12小时后检测细胞的Luciferase活性：取上清60ul，8000rpm，2min，取上清，放于-20℃冻融一次后检测；将测得的转染Flag-GFP融合蛋白组的Luciferase活性值减掉不感染病毒的组的luciferase活性值后设为100％，测得的其他组的Luciferase活性值同样减掉不感染病毒的组的luciferase值后，和Flag-GFP组作对比，得到相对活性值，相对活性值越低，说明多肽对流感病毒复制的抑制效果越好；相对活性值越高，说明多肽对流感流感病毒复制的抑制效果越差。结果如图4A和4B所示，阳性对照PB1 1-25AA能有效的抑制流感病毒A/WSN/33和A/Quail/HK/G1/97的复制，抑制效果在80％以上，PB1 481-515也能很好的抑制上述两种流感病毒的复制，抑制效果在80％左右。

实施例7、检测合成的多肽PB1 491-515-TAT在体外对流感病毒聚合酶转录活性的抑制效果

用TAP pull down的方法制备流感病毒聚合酶复合物，即将流感病毒聚合酶3个亚基PA，PB1，PB2从细胞中纯化出来(27)。首先，35mm细胞培养皿(购自Corning公司)中培养HEK293T细胞(ATCC：CRL-11268)至90％满度，每皿细胞中转染pcDNA-PB1，pcDNA-PB2，pcDNA-PA-TAP各1.7ug，分别用来表达流感病毒聚合酶的PB1，PB2，PA亚基，其中PA蛋白的C端带有TAP标签，TAP标签从N端到C端依次为钙调蛋白结合区域，TEV蛋白酶酶切位点及两个蛋白酶A结构域。转染后培养48小时，用预冷的PBS洗细胞两次，用胰酶消化后离心收细胞，冰上裂解细胞30min(裂解液含10mM HEPES、200mM NaCl、25％甘油、0.5％NP-40、1mM beta-巯基乙醇、0.1mM PMSF，按照1片蛋白酶抑制剂配10mL裂解液的比例加入蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail Tablet，购自Roch公司)。先用IgG偶联的基质(购自GE公司)和细胞裂解液4度孵育过夜；然后用TEV蛋白酶将流感病毒聚合酶从IgG基质上切下来，使用前放于-20℃保存。

配制2.5ul ApG作为引物的体外转录(ApG primed transcription)体系(26)，该体系包括1.5ul流感病毒聚合酶复合物、5mM MgCl、1mM DTT、1mM ApG(购自Sigma公司)、4U Rnasin(购自Fermentas公司)、1mM ATP、0.5mM CTP、0.15uM alpha-³²P GTP(3000ci/mmol购自北京福瑞公司)、4pmol 3’端vRNA(5’-GGCCUGCUUUUGCU-3’)、4pmol 5’端vRNA(5’-AGUAGAAACAAGGCC-3’)，vRNA由上海吉玛公司合成。转录体系中再加入0.5ul合成的PB1 491-515-TAT片段(见下面)，转录时在30℃反应1小时。转录时，流感病毒聚合酶会以vRNA作为模板，用ApG作为引物进行转录，转录时alpha-³²P GTP会掺入到新合成的RNA上，得到14nt大小的掺有alpha-³²P GTP转录产物，可以用同位素信号的强弱来衡量转录活性的高低。如果多肽对聚合酶活性有抑制效果，那么和对照相比，转录产物的信号会低。反应结束后，加入10ul含有1mM EDTA，及溴酚蓝和二甲苯青的80％的甲酰胺，95℃处理3min终止反应。用含7M尿素的丙烯酰胺浓度为16％的凝胶电泳，用放射性自显影的方法检测转录产物的多少，用到的胶片购自柯达公司(BioMax MS Film)。

将PB1 491-515区域(PB1 481-515N端去掉10个氨基酸的截短体)的C端加入13个氨基酸(这13个氨基酸是HIV TAT蛋白的一段蛋白序列，能协助多肽进入细胞膜，下文中称为TAT，序列参见SEQ ID NO.6)(18)，这个衍生多肽记为491-515-TAT(SEQ ID NO.7)。由公司进行多肽合成(由上海强耀公司合成)，阴性对照多肽为PX-TAT(SEQ ID NO.8)(18)，PX为博尔纳病病毒的磷蛋白的69-93区域，合成的两个多肽的水溶性很好，每管1mg的样品用ddH2O溶解成600uM浓度后，再将其稀释10倍，取0.5ul加入到2.5ul ApG作为引物的体外转录体系中，检测肽的终浓度分为100uM，10uM时对RdRp体外转录活性的影响。

结果见图5。合成的肽491-515-TAT在浓度为100uM时在体外对流感病毒聚合酶具有很好的抑制效果。而对照多肽PX-TAT则对聚合酶几乎没有抑制效果。作为另一个对照，体系中加入0.5ul水对聚合酶的活性也没有影响。

参考文献

1.Arnold，K.，L.Bordoli，J.Kopp，and T.Schwede.2006.The SWISS-MODELworkspace：a web-based environment for protein structure homology modelling.Bioinformatics 22：195-201.

2.Biswas，S.K.，and D.P.Nayak.1994.Mutational analysis of the conserved motifs ofinfluenza A virus polymerase basic protein 1.J Virol 68：1819-26.

3.Ferrer-Orta，C.，A.Arias，C.Escarmis，and N.Verdaguer.2006.A comparison ofviral RNA-dependent RNA polymerases.Curr Opin Struct Biol 16：27-34.

4Zhong W，Ferrari E，Lesburg CA，Maag D，Ghosh SK，et al.(2000)Template/primer requirements and single nucleotide incorporation by hepatitis Cvirus nonstructural protein 5B polymerase.J Virol 74：9134-9143.

5.Hogbom，M.，K.Jager，I.Robel，T.Unge，and J.Rohayem.2009.The active form ofthe norovirus RNA-dependent RNA polymerase is a homodimer with cooperativeactivity.J Gen Virol 90：281-91.

6.Ferrer-Orta，C.，A.Arias，R.Perez-Luque，C.Escarmis，E.Domingo，and N.Verdaguer.2004.Structure of foot-and-mouth disease virus RNA-dependent RNApolymerase and its complex with a template-primer RNA.J Biol Chem279：47212-21.

7.Hu，Y.，X.Dong，A.Wu，Y.Cao，L.Tian，and T.Jiang.2011.Incorporation of localstructural preference potential improves fold recognition.PLo S One 6：e 17215.

8.Yap，T.L.，T.Xu，Y.L.Chen，H.Malet，M.P.Egloff，B.Canard，S.G.Vasudevan，and J.Lescar.2007.Crystal structure ofthe dengue virus RNA-dependent RNApolymerase catalytic domain at 1.85-angstrom resolution.J Virol 81：4753-65.

9.He，X.，J.Zhou，M.Bartlam，R.Zhang，J.Ma，Z.Lou，X.Li，J.Li，A.Joacnimiak，Z.Zeng，R.Ge，Z.Rao，and Y.Liu.2008.Crystal structure ofthe polymerase PA(C)-PB1(N)complex from an avian influenza H5N1virus.Nature 454：1123-6.

10.Hong，Z.，C.E.Cameron，M.P.Walker，C.Castro，N.Yao，J.Y.Lau，and W.Zhong.2001.A novel mechanism to ensure terminal initiation by hepatitis C virusNS5B polymerase.Virology 285：6-11.

11.Poole，E.L.，L.Medcalf，D.Elton，and P.Digard.2007.Evidence that the C-terminalPB2-binding region of the influenza A virus PB1 protein is a discrete alpha-helicaldomain.FEBS Lett 581：5300-6.

12.Deng，T.，J.Sharps，E.Fodor，and G.G.Brownlee.2005.In vitro assembly of PB2with a PB1-PA dimer supports a new model of assembly of influenza A viruspolymerase subunits into a functional trimeric complex.J Virol 79：8669-74.

13.Jung，T.E.，and G.G.Brownlee.2006.A new promoter-binding site in the PB1subunit of the influenza A virus polymerase.J Gen Virol 87：679-88.

14.He，W.，X.Ma，X.Yang，Y.Zhao，J.Qiu，and H.Hang.2011.A role for the argininemethylation of Rad9 in checkpoint control and cellular sensitivity to DNA damage.Nucleic Acids Res 39：4719-27.

15.Perez，M.，and J.C.de la Torre.2003.Characterization of the genomic promoter ofthe prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus.J Virol 77：1184-94.

16.Obayashi，E.，Yoshida，H.，Kawai，F.，Shibayama，N.，Kawaguchi，A.，Nagata，K.，Tame，J.R.，and Park，S.Y.(2008).The structural basis for an essential subunitinteraction in influenza virus RNA polymerase.Nature 454，1127-1131.

17.Zhu，W.，J.Zhou，K.Qin，N.Du，L.Liu，Z.Yu，Y.Zhu，W.Tian，X.Wu，and Y.Shu.2011.A reporter system for assaying influenza virus RNP functionality basedon secreted Gaussia luciferase activity.Virol J 8：29.

18.Ghanem，A.，D.Mayer，G.Chase，W.Tegge，R.Frank，G.Kochs，A.Garcia-Sastre，and M.Schwemmle.2007.Peptide-mediated interference with influenza A viruspolymerase.J Virol 81：7801-4.

19.李泽君，焦培荣，于康震，陈化兰.2005，H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立.中国农业科学2005，38(8)：1686-1690

20.Muller，R.，O.Poch，M.Delarue，D.H.Bishop，and M.Bouloy.1994.Rift Valleyfever virus L segment：correction of the sequence and possible functional role ofnewly identified regions conserved in RNA-dependent polymerases.J Gen Virol 75(Pt 6)：1345-52.

21.Nath，S.T.，and D.P.Nayak.1990.Function of two discrete regions is required fornuclear localization of polymerase basic protein 1 of A/WSN/33 influenza virus(H1N1).Mol Cell Biol 10：4139-45.

22.Fodor，E.，Devenish，L.，Engelhardt，O.G.，Palese，P.，Brownlee，G.G.，andGarcia-Sastre，A.(1999).Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.JVirol 73，9679-9682.

23.刘大飞，刘春国，刘明，刘大程.流感病毒反向遗传学技术研究进展.生物化学与生物物理进展2008年35卷8期.

24.Su CY，Cheng TJ，Lin MI，Wang SY，Huang WI，et al.(2010)High-throughput identification of compounds targeting influenza RNA-dependentRNA polymerase activity.Proc Natl Acad Sci USA 107：19151-19156.

25Ruigrok RW，Crepin T，Hart DJ，Cusack S(2010)Towards an atomic resolutionunderstanding of the influenza virus replication machinery.Curr Opin Struct Biol20：104-113.

26Fodor，E.，Crow，M.，Mingay，L.J.，Deng，T.，Sharps，J.，Fechter，P.，and Brownlee，G.G.(2002).A single amino acid mutation in the PA subunit of the influenzavirus RNA polymerase inhibits endonucleolytic cleavage of capped RNAs.J Virol76，8989-9001.

27Deng，T.，Sharps，J.，Fodor，E.，and Brownlee，G.G.(2005).In vitro assembly ofPB2 with a PB1-PA dimer supports a new model of assembly of influenza A viruspolymerase subunits into a functional trimeric complex.J Virol 79，8669-8674.

Claims (10)

1.一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包括流感病毒聚合酶亚基PB1481-515位的氨基酸片段(SEQ ID NO：1)。

2.一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽包括SEQ IDNO：1的截短体，所述截短体与SEQ ID NO：1相比在N端和/或C端缺少15个以下的氨基酸，优选地缺少10个以下的氨基酸。

3.根据权利要求2的多肽，其中所述截短体与SEQ ID NO：1相比在N端缺少10个或5个氨基酸。

4.根据权利要求2的多肽，其中所述截短体与SEQ ID NO：1相比在N端缺少10个氨基酸并且在C端缺少5个氨基酸。

5.一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽是在根据权利要求1至4中任一项的多肽的C端添加了序列为YGRKKRRQRRRPP的13个氨基酸的衍生多肽。

6.核苷酸序列，其编码根据前述权利要求中任一项的多肽。

7.包括根据权利要求6的核苷酸序列的表达载体。

8.包含根据权利要求7的表达载体的细胞。

9.一种使用根据权利要求1-5中任一项的多肽来抑制流感病毒聚合酶活性的方法，所述方法包括将根据权利要求7的载体提前转染到之后会被病毒感染的人细胞中。

10.根据权利要求1-5中任一项的多肽、根据权利要求6的核苷酸序列、根据权利要求7的表达载体或根据权利要求8的细胞在制备用于抑制流感病毒聚合酶活性的药物中的应用。

Images