CN108690826A - 基于人肺颗粒体外培养的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的构建及应用 - Google Patents

基于人肺颗粒体外培养的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体公开了基于人肺颗粒体外培养的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的构建及应用。本发明将肺组织切成大小0.05~0.2 mm3小颗粒，以悬浊液形式均匀分装，体外培养一段时间后感染流感病毒。实验证明，流感病毒在猪肺颗粒组织和人肺颗粒组织中均可以高效复制，并引发一系列炎症因子的上调。已知的抗流感病毒药和抗炎药物在构建的肺颗粒组织模型上可以抑制流感病毒和炎症因子并呈剂量效应。本发明构建的模型方法操作简单快捷、省时省力，可以极大的保留组织活性，减少组织的浪费且和动物的生理状况接近。该方法优化后可以使抗流感病毒药和抗炎药物筛选模型达到微量、快速及均一的效果，用来评价药物更为准确。

Description

基于人肺颗粒体外培养的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的 构建及应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及人肺组织以颗粒形式体外培养并用来进行抗流感病毒或抗炎药物筛选的模型构建及应用。
背景技术
流感病毒严重威胁着人类健康，在全球范围内造成了巨大的损失。1918年流感大流行，全世界范围内约有5亿人感染，导致5000万-1亿人死亡。2009年爆发的猪流感波及200多个国家，导致约18000人死亡。2013年，出现在中国的高致病性禽流感H7N9引起人们对流感病毒及如何控制流感病毒的广泛关注。2017年，再次爆发的H7N9病毒在国内已造成近百例人死亡，死亡率达45％，引起人们巨大的恐慌。
对于流感病毒的致病机理，一直以来有两方面的争论。一则病毒复制本身导致的肺部病变，二则机体过强的免疫反应导致肺部免疫调节失衡。目前，被美国FDA批准临床使用的直接针对流感病毒某个靶点的药物只有2类，即病毒M2蛋白和NA蛋白抑制剂。M2蛋白抑制剂为金刚烷胺和金刚乙胺，已经临床使用40余年，但是明显的毒副作用和迅速产生耐药毒株大大限制其临床使用。被批准临床使用的NA抑制剂即奥司他韦、扎那米韦和派瑞米韦。奥司他韦具有窗口期，即感染两天内吃药才有效，而扎那米韦生物利用度低，且这些药物也逐渐有耐药株的发现。鉴于种种问题，亟待寻找新型抗流感病毒药物。
抗流感病毒的药物筛选和评价模型主要是细胞和动物模型。对于细胞模型来说，离体的单细胞因失去所在的组织环境，不能模拟机体的真实生理状况。以小鼠为主的动物模型，由于物种的差别，小鼠上有效的药物临床试验中只有成功率不到15％。且每次临床都需要经过I、II、III、IV的人体试验，时间周期长，人力、物力及财力耗资巨大，因而急需构建一种新型的药物评价模型与评价体系。
组织培养经历了从最早期的离体器官到单细胞的分离培养，是天然的立体培养体系。它相对完好的保持了器官本身的各种细胞及细胞间的联系，是毒理，药理研究的良好材料。人肺组织通过体外培养感染流感病毒可以很好的模拟正常情况下病毒感染人体的结果。它使药物评价更为准确，可以极大的降低药物临床试验的失败率，减少了大量的人力、物力和财力的成本，具有重要的研究意义。
前期有将人肺通过组织灌胶切成薄片的研究，但该方法需要有完整包膜的肺部组织以方便琼脂糖凝胶的灌入来进行切片。而在实际操作中，样品取材于手术后切余的肺部组织，很难有完整包膜，且肺组织本身不易灌胶，存在着琼脂糖凝胶分布不均匀、细胞活力损失大及样品的浪费等问题。其它相关的研究也存在着病毒感染与炎症因子分泌水平低、均一性差、不易定量及操作困难等诸多问题，不适宜用来进行药物筛选。本发明构建的人肺颗粒组织体外培养模型方法，是将人肺组织切成小颗粒，以悬浊液形式分装，培养一段时间后再感染流感病毒的方法。该方法不需要切片，因而不需要琼脂糖灌胶及活体组织切片机。组织切成小颗粒以悬浊液形式分装可以保持较好的均一性。培养一段时间后，流感病毒复制水平及炎症因子分泌水平提高。除此之外，样品活力损失小、材料浪费少，可以达到微量、快速及均一的效果。通过该模型方法筛选抗流感病毒药不仅省时省力，且和人体接近，评价药物更为准确。目前，尚未有筛选抗流感病毒药或抗炎药物利用该人肺颗粒组织体外培养方法的评价和报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种基于肺组织颗粒体外培养进行抗流感病毒或抗炎药物筛选的模型的构建方法。肺颗粒体经均匀分装、体外培养之后感染流感病毒，病毒复制水平高，并产生由流感病毒刺激而分泌的炎症因子。抗流感病毒药和抗炎药在通过该方法构建的模型上进行应用，极大的提高了筛选出有效抗流感病毒药的效率，为抵抗流感病毒的侵袭做出了重要意义。
本发明的另一个目的在于提供了一种基于肺组织颗粒体外培养进行抗流感病毒和抗炎药物筛选的模型的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
基于肺组织颗粒体外培养的抗流感病毒或抗炎药物筛选模型的构建，包括下述步骤：
Hanks buffer清洗干净后的肺组织切成细小颗粒，肺颗粒大小为0.05～0.2mm3，将该肺颗粒用DMEM/F12培养基洗涤干净后，加入新鲜的DMEM/F12培养基制备成悬浮液，置于37℃培养箱内培养，流感病毒PR8液进行感染后弃病毒液，PBS清洗，加入待筛选药物，37℃培养箱中培养后取上清检测；
所述的肺组织为人肺组织或猪肺组织。
以上所述方案中，优选的，步骤包括：
取无菌4mL EP管，加入3mL DMEM/F12培养基；将取来的肺组织用Hanks buffer清洗3-5次，剪成1cm3的小块放在无菌塑料板上；用灭过菌的一次性刀片将组织切成细小颗粒，直至大小为0.05～0.2mm3；用剪刀将1mL枪头减去头部1cm，用该加样枪头将组织颗粒吸入到前述装有DMEM/F12培养基的EP管中，待肺颗粒自然沉淀后吸去上清，用新鲜的DMEM/F12培养基用同样的方法将肺颗粒洗涤3-5次后，加入200微升DMEM/F12培养基混匀成悬浊液；取96孔板，每孔加入200μL DMEM/F12培养基；将肺颗粒悬浊液混合均匀，用剪去枪头1cm的200uL加样枪头吸出20μL肺颗粒悬浊液，分装于96孔板内，放入37℃培养箱内培养，每隔2h换液一次，共换3次，培养所需时间后，用106TCID50/mL的流感病毒PR8液进行感染，感染所需时间后弃病毒液，PBS清洗，加入待筛选药物，37度培养箱中培养后取上清检测。
以上所述方案中国，优选的，肺颗粒培养3-5天后，再感染病毒。
以上所述模型，可用于人肺或猪肺的流感病毒药物筛选；或是用于人肺或猪肺的由流感病毒引起的炎症药物的筛选。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1.创新性的将肺组织切成小颗粒，以悬浊液形式分装，保持了较好的均一性。
2.将肺组织颗粒体外培养3～5天后再感染流感病毒，病毒复制及炎症因子分泌水平较高。
3.抗流感病毒药和抗炎药物通过该方法构建的模型上可以抑制流感病毒和炎症因子并呈剂量效应，方便计算药物的EC50和选择指数。
4.通过该方法构建的药物筛选模型，肺组织用量很少，几乎无组织的浪费，药物用量少且简单易操作。模型优化后可以达到微量、快速和均一的效果，可以很好的用来药物筛选和药物评价。
5.具有比细胞模型和动物模型更接近人体真实生理和病理状况的特点，提高药物临床试验的成功率，节省了大量的人力、物力和财力成本。
6.目前，抗流感病毒的药物筛选和评价模型主要是细胞和动物模型。细胞不能模拟机体的真实生理状况。动物模型由于物种的差别，药物临床试验中成功率很低。组织培养相对完好的保持了器官本身的各种细胞及细胞间的联系，是毒理，药理研究的良好材料。人肺组织通过体外培养感染流感病毒可以很好的模拟正常情况下病毒感染人体的结果。它使药物评价更为准确，可以极大的降低药物临床试验的失败率，减少了大量的人力、物力和财力的成本，具有重要的研究意义。
附图说明
图1猪肺颗粒组织培养1天后感染流感病毒(PR8)，病毒复制水平的检测。
其中C为细胞对照组，V为病毒对照组。
图2抗流感病毒药利巴韦林在猪肺颗粒组织体外培养模型上对流感病毒(PR8)抑制效果的检测。
图3人肺颗粒组织分别培养不同时间后感染流感病毒(PR8)，病毒复制水平的检测。
图4人肺颗粒组织分别培养不同时间后感染流感病毒(PR8)，不同炎症因子分泌水平的检测；
图4A所检测炎症因子为人源IL-8；
图4B所检测炎症因子为人源IL-6；
图4C所检测炎症因子为人源IP-10；
图4D所检测炎症因子为人源CCL-5。
图5抗流感病毒药利巴韦林对流感病毒(PR8)抑制水平的检测。
图6为不同浓度的抗炎药EGCG对不同炎症因子的抑制水平检测示意图；
其中，图6A抗炎药EGCG对炎症因子MCP-1抑制水平的检测；
图6B抗炎药EGCG对炎症因子IL-6抑制水平的检测。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未热别说明，均为常规技术；所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
用于筛选抗流感病毒药的猪肺颗粒体外培养模型的建立
1.实验材料
1.1猪肺组织和病毒
猪肺组织取材于武汉大学菜市场，为销售人员新鲜取来的猪肺组织。流感毒株A/PuertoRico/8/34(H1N1)冻存于-80℃冰箱。
1.2试剂
DMEM/F12培养基购自于GIBCO公司；2'-(4-methylumbelliferyl)-α-D-acetylneuraminic acid(MUNANA)购自Sigma。
1.3仪器设备
眼科剪，眼科镊，Perkin Elmer公司Wallac Envision多标记读板机，37℃的CO2加湿培养箱。
2.实验方法与结果
2.1猪肺颗粒组织的制备、分装及培养
取无菌4mL EP管，加入3mL DMEM/F12培养基。将取来的猪肺组织用Hanks buffer清洗5次，剪成1cm3的小块放在无菌塑料板上。用灭过菌的一次性刀片将组织切成细小颗粒，直至大小为0.05～0.2mm3。用剪刀将1mL的枪头减去头部1cm，用该加样枪头将组织颗粒吸入到前述装有DMEM/F12培养基的EP管中，待肺颗粒自然沉淀后吸去上清；用新鲜的DMEM/F12培养基用同样的方法将肺颗粒洗涤5次后，加入200微升DMEM/F12培养基混匀成猪肺悬浊液。取96孔板，每孔加入200μL DMEM/F12培养基。将猪肺颗粒悬浊液混合均匀，用剪去枪头1cm的200uL加样枪头吸出20μL猪肺悬浊液，分装于96孔板内，放入37℃培养箱内培养，每隔2h换一次液，共换3次。
2.2猪肺颗粒组织的病毒感染
猪肺颗粒组织在培养1d后，每孔加入106TCID50/mL，200微升的PR8(H1N1)感染2小时。2小时后，弃病毒液，PBS洗两次后，添加新鲜DMEM/F12培养液。同时设立利巴韦林药物药处理组，利巴韦林的浓度分别为0.8微摩尔/升和200微摩尔/升。在培养后2天采集上清，用来检测上清中病毒复制水平。
2.3流感病毒的NA活性检测
2'-(4-methylumbelliferyl)-α-D-acetylneuraminic acid(MUNANA)是NA的特异性荧光底物。将40μL病毒上清和20μL的20μM的MUNANA放入96孔黑色Optiplates。37℃孵育1小时后，用Wallac Envision多标记读板机读板(激发光355nm，发射光485nm)，NA活性可以代表流感病毒在组织颗粒上的复制情况。结果如图1所示，PR8(H1N1)病毒可在以在猪肺颗粒组织上进行复制。如图2所示，利巴韦林在流感病毒感染的猪肺颗粒组织上可以有效的抑制流感病毒的复制。
实施例2：
用于筛选抗流感病毒药及其抗炎药的人肺颗粒体外培养模型方法的建立
1.实验材料
1.1人肺组织和病毒
人肺组织取材于武汉大学中南医院，为肺癌组织部分手术切除的零碎肺组织。流感毒株A/PuertoRico/8/34(H1N1)冻存于-80℃冰箱。
1.2试剂
DMEM/F12培养基购自于GIBCO公司；2'-(4-methylumbelliferyl)-α-D-acetylneuraminic acid(MUNANA)购自Sigma。人源IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1及CCL-5的AlphaLISA炎症因子检测试剂盒购自于Perkin Elmer公司。
1.3仪器设备
眼科剪，眼科镊，Perkin Elmer公司Wallac Envision多标记读板机，37℃的CO2加湿培养箱。
2.实验方法与结果
2.1人肺颗粒组织的制备、分装及培养
取无菌4mL EP管，加入3mL DMEM/F12培养基。将取来的人肺组织用Hanks buffer清洗5次，剪成1cm3的小块放在无菌塑料板上。用灭过菌的一次性刀片将组织切成细小颗粒，直至大小为0.05～0.2mm3。用剪刀将1mL枪头减去头部1cm，用该加样枪头将组织颗粒吸入到前述装有DMEM/F12培养基的EP管中，待肺颗粒自然沉淀后吸去上清，用新鲜的DMEM/F12培养基用同样的方法将肺颗粒洗涤5次后，加入200微升DMEM/F12培养基混匀成人肺悬浊液。取96孔板，每孔加入200μL DMEM/F12培养基。人肺颗粒悬浊液混合均匀，用剪去枪头1cm的200uL加样枪头吸出20μL人肺悬浊液，分装于96孔板内，放入37℃培养箱内培养，每隔2h换一次液，共换3次。
2.2人肺颗粒组织的病毒感染
人肺颗粒组织在分别培养1d、3d和5d后，每孔加入106TCID50/mL，200微升的PR8(H1N1)感染2小时。2小时后，弃病毒液，PBS洗两次后，添加新鲜DMEM/F12培养液。在培养后2天采集上清，用来检测上清中病毒滴度和炎症因子水平。
2.3流感病毒的NA活性检测
2'-(4-methylumbelliferyl)-α-D-acetylneuraminic acid(MUNANA)是NA的特异性荧光底物。将40μL病毒上清和20μL的20μM的MUNANA放入96孔黑色Optiplates。37℃孵育1小时后，用Wallac Envision多标记读板机读板(激发光355nm，发射光485nm)，NA活性可以代表流感病毒在组织颗粒上的复制情况。结果如图3所示，PR8(H1N1)病毒可在以在人肺颗粒组织上进行复制，且随着组织培养时间的增加，病毒复制水平不断增加，培养3d后再感染的流感病毒组相对于未感染对照组，信噪比为10左右。
2.4人肺颗粒组织培养物上清炎症因子的检测
将分别培养培养1d、3d和5d后感染流感病毒的人肺组织颗粒再培养2d。组织上清中的IL-6、IL-8、IP-10及CCL-5炎症因子采用Perkin Elmer公司的AlphaLISA试剂盒检测。结果如图4所示，当组织培养1d后，流感病毒感染组与未感染组炎症因子表达水平相差不大。随着组织培养时间的增加，流感病毒感染后引起的炎症因子IL-6、IL-8、IP-10及CCL-5表达显著上升。
实施例3：
人肺颗粒体外培养模型在抗流感病毒及抗炎药物筛选及评价中的应用
1、本实验所用材料、试剂和设备如上所示，所用的抗流感病毒药和抗炎药物为：利巴韦林购自Sigma-Aldrich公司；EGCG购自四川省维克奇生物科技有限公司。
2、验证药物在该模型上的作用效果：人肺颗粒组织在37℃培养3d后，每孔用200微升，106TCID50/mL的PR8(H1N1)感染2小时。2小时后，弃病毒液，PBS洗两次后，添加梯度稀释后的药物溶液。为比较加药组和对照组流感病毒和炎症因子的水平，确定药物的抗病毒和抗炎效果。一列设为阴性对照孔，一列感染但不加药孔，其余孔添加梯度稀释的利巴韦林或EGCG，每个浓度3个平行，37℃培养箱培养。
3、流感病毒复制水平或炎症因子复制水平的检测：样品培养48h后收集上清。取40μL病毒上清和20μL的20μM的MUNANA放入96孔黑色Optiplates。37℃孵育1小时后，用WallacEnvision多标记读板机读板(激发光355nm，发射光485nm)。结果如图5所示，随着抗流感病毒药物利巴韦林浓度的增加，对流感病毒抑制率逐渐增加并呈剂量效应，在33μM可以达到100％的抑制率。炎症因子采用Perkin Elmer公司的AlphaLISA试剂盒检测。结果如图6所示，随着EGCG浓度的增加，对IL-6及MCP-1的抑制率也逐渐增加。对于IL-6，EGCG不仅抑制了流感病毒引起的炎症因子，同时也影响了组织本身IL-6的分泌。
以上数据说明，流感病毒在猪和人肺颗粒组织上可以高效复制，并引发一系列炎症因子的上调。已知的抗流感病毒药和抗炎药物在该模型上可以抑制流感病毒和炎症因子并呈剂量效应。人肺颗粒体外培养模型可以用来抗流感病毒和抗炎药物的筛选评价。本发明构建的人肺颗粒组织体外培养方法可以极大的保留组织活性，减少组织样品的浪费。不仅如此，该模型方法药物和组织用量少，样品均一度高，省时省力且和临床试验接近，用来评价药物更为准确。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于肺组织颗粒体外培养进行抗流感病毒或抗炎药物筛选的模型的构建方法，包括：Hanks buffer清洗干净后的肺组织切成细小颗粒，肺颗粒大小为0.05~0.2 mm3，将该肺颗粒用DMEM /F12培养基洗涤干净后，加入新鲜的DMEM /F12培养基制备成悬浮液，置于37℃培养箱内培养，流感病毒PR8液进行感染后弃病毒液，PBS清洗，加入待筛选药物，37℃培养箱中培养后取上清检测；
所述的肺组织为人肺组织或猪肺组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：取无菌4 mL EP管，加入3 mL DMEM /F12培养基；将取来的肺组织用Hanks buffer清洗3-5次，剪成1 cm3的小块放在无菌塑料板上；用灭过菌的一次性刀片将组织切成细小颗粒，直至大小为0.05~0.2 mm3；用剪刀将1 mL枪头减去头部1 cm，用该加样枪头将组织颗粒吸入到前述装有DMEM /F12培养基的EP管中，待肺颗粒自然沉淀后吸去上清，用新鲜的DMEM /F12培养基用同样的方法将肺颗粒洗涤3-5次后，加入200微升DMEM /F12培养基混匀成悬浊液；取96孔板，每孔加入200 μL DMEM/F12培养基；将肺颗粒悬浊液混合均匀，用剪去枪头1 cm的200 uL加样枪头吸出20μL肺颗粒悬浊液，分装于96孔板内，放入37℃培养箱内培养，每隔2 h换液一次，共换3次，培养所需时间后，用 106 TCID50/mL的流感病毒PR8液进行感染，感染所需时间后弃病毒液，PBS清洗，加入待筛选药物，37度培养箱中培养后取上清检测。
3.根据权利要求1所述的方法，肺颗粒培养3-5天后，再感染病毒。
4.权利要求1所述方法制备的模型在筛选抗流感药物中的应用。
5.权利要求1所述方法制备的模型在筛选抗流感病毒引起的炎症药物中的应用。
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