CN107739756A - 一种结核杆菌基因耐药位点的高通量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结核分歧杆菌耐药位点的高通量测序检测方法，本方法利用已用耐药结核杆菌已有突变数据库，结合第二代高通量测序技术，更全面有效快速的检测结核杆菌抗结核药物的耐药位点。本方法克服了其他耐药位点检测方法中检测基因位点数目受限，无法区分重要基因的沉默突变，从而导致假阳性结果的困难，在高通量检测技术的帮助下，可以为更好治疗耐药结核杆菌提供更全面的诊断信息，有助于提高疗效和减少低效药物的使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种结核杆菌基因耐药位点的高通量检测方法。
背景技术
结核分枝杆菌是一种引起人类结核病的病原菌，它是典型的胞内致病菌，通过进化获得一系列毒力成分，又通过多种机制抑制宿主免疫应答，逃逸免疫监视，导致结核病的发生。结核病至今仍为重要的传染病，给结核病的有效防治造成了极大困难。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。随着预防接种、抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。但是，近年来世界各地结核分枝杆菌的多耐菌株逐渐增多，甚至引起暴发流行，发病率又有上升趋势。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题。
抗结核的一线药物主要有利福平(RFP)、异烟肼(INH)、，链霉素(SM)等，但结核分枝杆菌对很多常用的一线药物都产生了抗药性。如，结核杆菌耐异烟肼，文献报道结核杆菌耐INH可能与编catalase-peoxidase基因katG、NADH脱氢酶基因ndh、烯酸基载体蛋白还原酶基因ihhA、酮酰基酰基转移蛋自酶基因kasA以及烷基过氧化氢酶基因ah-pC的改变有关。有报道称，在耐INH的MTB分离株中有50%~70%的katG基因发生突变。结核杆菌耐利福平：MTB耐利福平的分子机制可能有两种，一是RFP直接作用于RNA聚介酶亚单位的编码基因，诱导少数高度保守的氨基酸密码子突变，导致空间结构发生改变，阻止RFP的结合，从而产生RFP耐药；其二、可能是细胞壁结构的改变降低了药物摄入，细胞壁的渗透屏障导致鸟胞内分枝杆菌复合群耐RFP，而在rpoB基因上没有突变的因素。耐药基因在染色体上，对不同药物的耐药基因不相连接，所以联合用药治疗有效。疾病耐药的治疗疗程长、成本高、效果也较差。治疗药物可能毒性较高，常有不良反应，而且可能会引起严重和和不可逆的后果。耐受性较差导致减少治疗依从性，反过来降低治愈率，更严重是可导致耐药的上升。
早期检测对于有效的治疗和防止疾病进一步传播于至关重要。充分、全面的了解疾病耐药和药敏的信息，有助于提高疗效和减少低效药物的使用。目前，针对大多数抗结核药物的耐药检测所需时间较长，几个星期乃至几个月。耐药的主要原因是药物靶标基因或者药物转换酶基因上点突变和插入/缺失（Indels)累积后引起。因此，针对关键基因快速分子检测技术应运而生。Xpert MTB/RIF (Cepheid, Inc., Sunnyvale, CA, USA)，被FDA 批准用于耐利福平检测，此外使用探针的检测方法（Line Probe Assays，LPA)也被用于开发其它耐药位点的检测。也存在检测的基因位点数目受限，无法区分重要基因的沉默突变，从而导致假阳性的结果的缺点，影响药物疗效。而高通量的基因组测序则可以克服上述困难，而且已被用于临床试验。利用耐药结核杆菌已有突变数据库（TBDreaMDB 和MUBII-TB-DB），在第二代高通量测序技术帮助下，可以为更好治疗耐药结核杆菌提供更全面的诊断信息。本专利利用二代高通量测序技术检测结核杆菌耐药位点，有如下优势：缩短了耐药检测所需时间，可以一次检测全部所需基因，获取基因全部的突变信息，可以为更好治疗耐药结核杆菌提供更全面的诊断信息，有助于医生更准确制定治疗方案，减少结核病患者的痛苦。
因此，利用二代高通量测序技术检测结核杆菌耐药位点，可以为医生提供患者更全面的诊断信息，有助于医生更准确制定治疗方案，减少疾病耐药的治疗疗程，成本和不良反应的发生，提高结核病治疗疗效。
发明内容
本发明提供一种准确度高、临床意义明确的结核杆菌耐药位点筛查方法。
实现本发明目的的一种结核杆菌耐药位点的筛查方法，包括如下步骤:
(1)根据结核杆菌基因组，调取结核杆菌耐药位点序列。常见结核杆菌耐药位点列表如下：
调取耐药位点的序列包含列表基因的基因区域，以及已知各个转录本的启动子区域；
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;
(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针，并制作结核杆菌耐药位点扫描试剂盒；
所述试剂盒检测方法包括如下步骤:
从患者肺部灌洗液或者培养结核杆菌中提起基因组DNA，然后利用结核杆菌耐药基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(Illumina Nextseq 500) 进行高通量测序，进而分析，找出与结核杆菌耐药相关基因的所有突变信息，从而得到结核杆菌耐药位点，以达到准确基因诊断的目的。
利用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序，分析的过程包括单核昔酸多态性分析(SNP分析)过程、插入缺失标记分析(InDel分析)分析流程;
所述单核昔酸多态性分析(SNP分析)过程包括如下步骤:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到H37Rv结核杆菌基因组数据(Genbank accession number: NC_000962.3)相应的位置上(所用到参数: bwaaln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核昔酸多态性(SNP)的信息;
(5)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等，过滤低质量值(小于25)和低覆盖度(小于10)的单核昔酸;
(6)利用自建数据库YunYing_TB_DB对单核昔酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核昔酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核昔酸影响蛋白功能预测。得到相关的候选单核昔酸。
所述插入缺失标记分析(InDel分析)流程包括如下步骤:
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到H37Rv结核杆菌基因组数据(Genbank accession number: NC_000962.3)相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(2)用Pindel软件找出序列中所含有的括入/缺失(InDel)的信息(所用到参数:Pindel -k -H 50 -w 10 -E 0.6 -a 8 -M 10 -m 10 -d 100 -A 50 );
(3)利用自建数据库YunYing_TB_DB对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸括入/氨基酸缺失/移码突变)。得到相关的候选InDels。
本发明的一种结核杆菌耐药位点的检测方法的有益效果如下:
本发明的一种结核杆菌耐药位点的检测方法，是以DNA文库的方式进行捕获测序，因此，样品DNA的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响，而过量的探针，保证了对目标片段的完全捕获。所以，即使可能出现的某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来，其灵敏度相对于其他方法要高出许多。本方法结核杆菌DNA为样本，采取高深度测序的方法（1000X）检测其驱动基因的突变情况。相比于临床上传统的病理学诊断而言，本方法有以下优势:
1、缩短了耐药检测所需时间，可以一次检测全部所需基因，获取基因全部的突变信息，可以为更好治疗耐药结核杆菌提供更全面的诊断信息，有助于医生更准确制定治疗方案，减少结核病患者的痛苦。
2、采取高深度测序，平均要达到1000X，保证低频突变能够检测出，能检测每个位点0.1%以上的基因突变。准确度高;本方法提供的结核杆菌耐药位点检测试剂盒覆盖了目前最新的结核杆菌耐药位点的所有区域。
具体实施方式
本发明的一种结核杆菌耐药位点的检测方法，包括如下步骤:
1.样本文库制备:
(1)、超声片段化：起始量为3ug，加无核酶的水到100ul稀释到30ng/ul。采用SCIENTZ08-Ⅲ杯式超声波细胞粉碎机进行超声片段化，设定参数为：功率70%，打断3s，停止1s，循环30-60min。
(2)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，取180ul磁珠加入超声打断后的PCR产物中，抽打混匀，温室孵育5min。
(3)、将PCR单管放于磁力架上，静置5min，去上清，保持PCR管在磁力架上，加入80%乙醇（新配）200ul漂洗，静置30s后去上清，80%乙醇漂洗两遍，室温干燥10min（还有2min时用小抢头吸残液），直至无乙醇残留。
（4）将PCR管从磁力架上取出，加入65ul超纯灭菌水，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，将PCR单管置于磁力架上，静置5min后小心吸取上清60ul于新的PCR管中。
（5）将40ul Endprep mix加入（4）中60ul上清的PCR管中，吹打混匀，短暂离心，进行末端修复，反应条件为30℃、30min。
(4)、将PCR管从磁力架中取出，加入20ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清17.5ul于新的PCR管中，再在PCR管中加入12.5ul dA-Tailing（解冻后放4℃，离心后再使用），吹打混匀。进行末端加尾，反应条件为37℃ 30min, 70℃ 5min,4℃ 5min。
(5)、在上步加尾后的产物中加入Ligation mix 和adapter各2.5ul，吹打混匀，短暂离心，放入PCR仪中，反应条件为30℃ 10min ，20℃ 20min。
(6)、在上步连接产物中加入15ul的超纯灭菌水，再加入50ul磁珠，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，放入磁力架上，静置5min，澄清后去上清，保持PCR管在磁力架上，用200ul的80%乙醇（新配）漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(7)、将PCR管从磁力架上取出，加入25ul超纯灭菌水，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，将PCR单管置于磁力架上，静置5min后小心吸取上清22ul于新的PCR管中。
(8)、将PCR primer mix和Amplification mix 2解冻后颠倒混匀，在上步连接产物中加入3ul的primer mix和25ul的Amplification mix 2，吹打混匀，短暂离心，进行PCR扩增，反应条件为
第一步95℃ 3min
第二步98℃ 20s
第三步60℃ 15s
第四步72℃ 30s
第五步72℃ 5min
第六步Hold at 4℃
第二----四步扩增15cycle。
(9)、用上步扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带亮度。
(10)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，取50ul加入PCR扩增产物中，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，置于磁力悬架上，静置5min，待溶液澄清后去上清，用200ul的80%乙醇（新配）漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(11)、将PCR管从磁力架中取出，加入40ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中，用Qubit测溶液浓度并记录，-20℃保存。
2.样本富集液相杂交
(1)、用于杂交的建库后DNA总量为500ng，根据检测的溶液浓度计算杂交时加入EP管的溶液体积。
(2)、在上步的EP管中加入2.5ul的cot-1 DNA，2.5ul的SS DNA，2ul的P5（500um），2ul的P7-x（500um），短暂离心。
(3)、将上步混合好的溶液在60℃真空干燥30 min，直至无液体残留。
(4)、在上步干燥后的EP管中加入10ul超纯灭菌水，轻弹混匀，水化10 min，短暂离心，取10ul加入PCR八连排中。
(5)、将上步PCR八连排放入PCR仪中进行PCR反应，反应条件为
第一步95℃ 5min
第二步65℃ 5min
第三步65℃ 无限
在95℃结束后，将1ul RNAsin和5ul RNAbait混合（每个样品所取量），在65℃ 2.5min时将RNAsin和RNAbait混合液以及杂交液放入65℃PCR仪中，在65℃ 5min结束后先在八连排每个孔中加入6ul的混合液，加入时吹打混匀，2.5min后加入10ul（每个样品所取量）杂交液，加入后吹打混匀，65℃过夜。
3.捕获
(1)、洗磁珠，取Dnabeads磁珠震荡混匀，根据样品数取磁珠（每个样品取30ul磁珠），用200ul beads洗液洗3次。
(2)、悬浮磁珠于binding buffer中，每个样品取165ul的binding buffer。
(3)、吸取binding buffer和磁珠的结合液165ul于杂交样品中，震荡45min（每隔5min上下颠倒混匀），45min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清。
(4)、加165ul的洗液1于上步磁珠中，洗15min，每5min颠倒混匀一次，15min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清。
(5)、将洗液2提前放入70℃PCR仪预热，加165ul的洗液2于上步磁珠中，颠倒混匀，在70℃洗10min，10min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清，洗液2洗3次。
(6)、在上步八连排的每个孔中加入22 ul的超纯灭菌水，3ul的primer和25ul的Amplification mix2，颠倒混匀，进行PCR扩增，扩增程序为
第一步95℃ 3min
第二步98℃ 20s
第三步60℃ 15s
第四步72℃ 30s
第五步72℃ 5min
第六步Hold at 4℃
第二----四步扩增15cycle。
(7)、将上步八连排放在磁力架上，待溶液澄清后，吸上清进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带亮度。
(8)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，吸取上步八连排中的上清于新的PCR单管中，吸取50ul磁珠加入PCR单管中，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，置于磁力悬架上，静置5min，待溶液澄清后去上清，用200ul的80%乙醇（新配）漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(9)、将PCR管从磁力架中取出，加入40ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中，用Qubit测溶液浓度并记录，-20℃保存。
以上得到的DNA通过Illumina Nextseq 500测序，得到测序的数据。
4.SNP分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到H37Rv结核杆菌基因组数据(Genbank accession number: NC_000962.3)相应的位置上(所用到参数: bwaaln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核昔酸多态性(SNP)的信息;
(5)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等，过滤低质量值(小于25)和低覆盖度(小于10)的单核昔酸;
(6)利用自建数据库YunYing_TB_DB信息对单核昔酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核昔酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核昔酸影响蛋白功能预测。得到相关的候选单核昔酸。
5.InDel分析流程
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到H37Rv结核杆菌基因组数据(Genbank accession number: NC_000962.3)相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(2)用Pindel软件找出序列中所含有的括入/缺失(InDel)的信息(所用到参数:Pindel -k -H 50 -w 10 -E 0.6 -a 8 -M 10 -m 10 -d 100 -A 50 );
(3)利用自建数据库YunYing_TB_DB信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸括入/氨基酸缺失/移码突变)。得到相关的候选InDels。
上面所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种用于结核杆菌耐药位点的高通量测序检测方法，包括结核杆菌耐药位点扫描试剂盒的方法。
2.结核杆菌耐药位点扫描试剂盒的方法包括如下步骤：
根据结核杆菌基因组，调取结核杆菌耐药位点序列，常见结核杆菌耐药位点列表如下：
调取耐药位点的序列包含列表基因的基因区域，以及已知各个转录本的启动子区域；
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;
(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针，并制作结核杆菌耐药位点基因捕获试剂盒；
所述试剂盒检测方法包括如下步骤:
从患者肺部灌洗液或者痰液中提取基因组DNA，然后利用肺癌常见基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(Illumina Nextseq 500) 进行高通量测序，进而分析，找出与结核杆菌耐药相关基因的所有突变信息，从而得到结核杆菌耐药位点，以达到准确基因诊断的目的。
3.利用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序，分析的过程包括单核昔酸多态性分析(SNP分析)过程、插入缺失标记分析(InDel分析)分析流程;
所述单核昔酸多态性分析(SNP分析)过程包括如下步骤:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到H37Rv结核杆菌基因组数据(Genbank accession number: NC_000962.3)相应的位置上(所用到参数: bwaaln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核昔酸多态性(SNP)的信息;
(5)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等，过滤低质量值(大于25)和低覆盖度(大于10)的单核昔酸;
(6)利用自建数据库YunYing_TB_DB对单核昔酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核昔酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核昔酸影响蛋白功能预测，得到相关的候选单核昔酸。
4.所述插入缺失标记分析(InDel分析)流程包括如下步骤:
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到H37Rv结核杆菌基因组数据(Genbank accession number: NC_000962.3)相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(2)用Pinel软件找出序列中所含有的括入/缺失(InDel)的信息(所用到参数:Pindel-k -H 50 -w 10 -E 0.6 -a 8 -M 10 -m 10 -d 100 -A 50 );
(3)利用自建数据库YunYing_TB_DB对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸括入/氨基酸缺失/移码突变)，得到相关的候选InDels。
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