CN103820440A - 结核分枝杆菌异烟肼耐药相关的新突变位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了结核分枝杆菌异烟肼耐药相关的新突变位点及其应用，该新突变位点位于标准株H37Rv基因组第1673425位，即基因间区Rv1482c-Rv1483*的第126位碱基，发生的点突变为碱基C突变为T或者A。本发明发现的新突变位点可作为检测靶点应用于结核分枝杆菌异烟肼耐药性的检测中，提高结核分枝杆菌耐异烟肼的分子检测水平，缩短患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。本发明说明结核菌耐药突变位点也可能发生在非编码区，提示基因间区的碱基突变可能也与耐药相关，也存在耐药生物标志物。本发明为找到新的、更有效的结核病耐药分子标识物提供了一种新思路。
Description
技术领域
本发明涉及结核分枝杆菌耐药碱基突变位点的高通量筛选和验证，具体涉及一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变位点的筛查和验证。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。到20世纪80年代后期，由于贫困、艾滋病、人口流动和耐药等因素，结核病发病率和死亡率在全球范围内出现快速回升，成为与艾滋病并列的全球性危害最严重的传染病。结核分枝杆菌耐药情况严重，耐药率高达46％，给结核病的预防和治疗构成严峻挑战。
抗结核药物是结核病化学治疗的基础，而结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手段。异烟肼（Isoniazid,INH）是酰肼类化学合成药物，结核杆菌对其极其敏感，自1952年用于抗结核治疗以来，作为预防用药及结核病治疗方案的一线药物已有70年。但异烟肼在单药化疗和不适当化疗期间很容易产生耐药性，其作用的靶分子、作用机制以及结核杆菌耐INH的机制还不十分清楚。最近研究表明结核杆菌耐INH可能与过氧化氢酶-过氧化物酶(catalase-peroxidase)编码基因(katG,GenBanknumberX68081S42739)、烯酰基还原酶(the enoyl-acylcarrierproteinreductase)编码基因(inhA,GenbanknumberU02492)、烷基过氧化氢酶还原酶(thealkylhydroperoxidereductasesubunitC)编码基因（ahpC,GenbanknumberU16243）或β-酮酰基酰基运载蛋白合成酶(beta-ketoacyl-acylcarrierproteinsynthase)编码基因(kasA)改变有关，但目前为止，还有5%-10%的耐INH分离株尚未发现上述基因突变。
目前临床上采用的耐药检测方法可分为表型检测和基因型检测两类，并以前者为主。然而表型检测因为各种原因，如耗时、设备昂贵、有放射性危害或干扰因素多等，难以形成快速高效的筛查手段。相对而言，基因检测更为直接，目前已经使用的基因分析方法有单链构象多态性分析法(SSCP)，限制性片段长度多态性分析法(RFLP)，DNA测序法，线性探针杂交法，RNA/RNA错配分析法，以及DNA阵列(芯片)检测等。这些方法主要利用基因katG、inhA、ahpC、kasA等典型突变，检测样品结核分枝杆菌是否发生同样的突变，从而快速判断结核分枝杆菌是否具有异烟肼耐药性，但仍有许多耐异烟肼的结核分枝杆菌不能被检测出来，呈假阴性。
结核病耐药率高是造成结核病疫情难以控制的重要原因，而传统的结核分枝杆菌药敏试验费时长，影响患者诊治，增加耐药株扩散机会，那么有效提高分子生物学方法快速鉴定结核分枝杆菌耐药性的检出率和准确率具有重要意义。较高的结核分枝杆菌异烟肼耐药性的检出率，对临床耐药性检测和用药具有指导意义。
发明内容
本发明的目的在于提供结核分枝杆菌异烟肼耐药新突变位点。
本发明的另一目的在于提供一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测膜。
本发明的再一目的在于提供一种结核分枝杆菌异烟肼耐药性的快速筛查法。
本发明所采取的技术方案是：
一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变位点，该突变位点位于标准株H37Rv基因组的第1673425位，即基因间区Rv1482c-Rv1483*的第126位，发生的点突变为碱基C替换为A或者T。
一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测异烟肼耐药突变基因间区Rv1482c-Rv1483*的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQIDNO:1或其碱基互补序列。
一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测膜，该膜含有用于检测异烟肼耐药突变基因间区Rv1482c-Rv1483*的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQIDNO:1或其碱基互补序列。
一种结核分枝杆菌异烟肼耐药性的快速筛查法，该方法利用PCR扩增法检测基因间区Rv1482c-Rv1483*第126位的碱基。
本发明的有益效果是：
本发明发现的异烟肼耐药突变位点提高了结核分枝杆菌耐异烟肼的分子检测水平，阳性检出率在原有的基础上增加了24.2%，能够有效缩短这部分患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。
本发明发现结核菌耐药突变位点不仅发生在编码区，同时也可能发生在非编码区，提示基因间区（IGR）的耐药分子标识物或许同时与药物的耐药相关，为找到新的、更有效的结核病耐药分子标识物提供了一种新的思路。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变位点的筛选：
1）预测与INH耐药相关的碱基突变位点：收集全国的结核分枝杆菌临床菌株161例，进行全基因组测序，通过生物信息学方法，预测与异烟肼（INH）耐药相关的碱基突变位点；
2）验证预测的与INH耐药相关的碱基突变位点：收集异烟肼单耐药临床菌株44例，设计特异引物，对基因间区Rv1482c-Rv1483*序列进行PCR扩增并测序，对测序序列进行比对分析，找到突变率最高的碱基突变位点为基因间区Rv1482c-Rv1483*第126位，突变率为17.78%（8株突变）；
3）对比分析基因间区Rv1482c-Rv1483*和基因katG中与INH耐药相关的碱基突变率：对2）中44株异烟肼单耐药菌中的基因katG基因的第315碱基（该位点已被报道与结核分枝杆菌的异烟肼耐药性相关）也进行测序，分析发现基因katG第315位的突变率为65.91%（29株突变）；其中有1株菌株在基因间区Rv1482c-Rv1483*第126位和基因katG第315位中均发生相应的碱基突变，如果同明检测Rv1482c-Rv1483*第126位和基因katG第315位的碱基，可将结核分枝杆菌INH耐药性的检出率提高24.2%；结果说明基因间区Rv1482c-Rv1483*第126位的碱基突变（C突变为T或者A）可以作为结核分枝杆菌INH耐药性检测的靶点，有利于提高对具有INH耐药性的结核分枝杆菌的检出率。
实施例1：
一、预测与INH耐药相关的碱基突变位点
首先采用deep-sequencing技术，对来自中国的161株结核杆菌进行了全基因组测序，其中有44株敏感菌、94株多重耐药菌（MDR）、23株广泛耐药菌（XDR），并以H37Rv标准结核杆菌株基因组序列为对照进行生物信息学分析，发现了一批与耐药性密切相关的新基因、基因间区（IGR）的单核苷酸多态性（SNP）位点，其中基因间区Rv1482c-Rv1483*的单碱基突变位点与异烟肼（INH）耐药性具有很高的相关性，其P值为0，如表1所示。
表1基因间区FABG1的单碱基突变位点与不同耐药性的相关性
| 耐药谱 | INH-RFP | EMB | STR | CPM | KAN | OFX | ETH | MDR | XDR |
| P值 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
表1中列出了Rv1482c-Rv1483*基因间区的单碱基突变位点与INH（异烟肼）、RFP（利福平）、EMB（乙胺丁醇）、STR（链霉素）、CPM（卷曲霉素）、KAN（卡那霉素）、OFX（氧氟沙星）、ETH（乙硫异烟胺）、MDR（多重耐药）和XDR（广泛耐药）耐药性的相关度，基 因间区的单碱基突变位点与不同药物耐药性间的P值均为0，表明基因间区Rv1482c-Rv1483*的单碱基突变位点与结核分枝杆菌耐药性密切相关。
基于上述161株结核杆菌的全基因组测序信息，通过生物信息学方法，预测与INH耐药相关的碱基突变信息如表2所示，一共有3个预测位点，分别为基因间区Rv1482c-Rv1483*的第107、126、133位的碱基。
表2基因间区Rv1482c-Rv1483*与INH耐药相关的预测碱基位点
二、对预测的与INH耐药相关的碱基位点作进一步验证
对表2的预测结果作进一步验证，另选取广东省临床分离的44株异烟肼（INH）耐药的结核分枝杆菌，对基因间区Rv1482c-Rv1483*进行PCR扩增、测序并进行序列比对分析，其中扩增基因间区Rv1482c-Rv1483*的上下游引物及扩增条件如表3所示。
以H37Rv标准株为对照，对44株INH耐药临床株的基因间区Rv1482c-Rv1483*的PCR测序结果进行分析，有8株在基因间区Rv1482c-Rv1483*内发生了碱基突变，突变位点在基因组中的位置（ID）为1673425，发生的点突变为碱基C突变为A或T，如表4所示，该突变率为17.78%。进一步证明了，预测碱基位点中的ID：1673425位点可能与结核分枝杆菌异烟肼耐药性相关。
表3Rv1482c-Rv1483*基因间区的扩增引物及扩增条件
三、对比分析基因间区Rv1482c-Rv1483*与基因katG中与INH耐药相关的碱基突变率
katG基因是已报道的与结核分枝杆菌异烟肼耐药基因，常应用于结核分枝杆菌异烟肼耐药性的检测。katG基因位于结核杆菌染色体上，含2223个核苷酸，G+C含量为64.4%，其表达的过氧化氢酶-过氧化物酶是一种既有过氧化氢酶活性又有过氧化物酶活性的热稳定的酶。过氧化氢酶-过氧化物酶可能在细胞内将INH氧化成异烟酸，成为烟酸的类似物，参与辅 酶I（NAD）的合成，使其不能起同工酶的作用，而抑制细胞壁枝菌酸的生物合成，使保护分支杆菌抵抗氧化和侵袭的屏障受到损害。若katG缺失或突变，使过氧化氢酶-过氧化物酶活性丧失或降低，阻止INH转换成活性形式，就会导致耐INH的发生。katG的第315位密码子突变是主要常见的突变类型，发生率约60%。
将“二”中所述的44株INH耐药的结核杆菌的katG基因也进行测序分析，发现katG的第315位碱基的突变率为65.91%（29株突变），其中Ser(AGC）→Thr(ACC)突变率为40.91%（18株突变），Ser(AGC)→Asn(AAC)突变类型的突变率为25%（11株突变），测序结果如表4所示。
表444株INH耐药的结核分枝杆菌的基因间区Rv1482c-Rv1483*第126位碱基和katG基因第315位碱基的突变情况
根据表4的碱基突变统计结果可知，有7株INH耐药菌株（H11、H17、H18、H23、H38、H43、H46）在基因间区Rv1482c-Rv1483*第126位碱基发生了突变而没有在katG315密码子中发生碱基突变。有1株（H12）在基因间区Rv1482c-Rv1483*第126位碱基、katG第315位密码子中均发生了碱基突变。
如果同时检测基因间区Rv1482c-Rv1483*第126位碱基、katG第315位这两个位点的碱基，INH耐药检测准确率达81.82%（36/44），相比只检测katG315传统密码子的准确率65.91%（29/44）提高了24.2%。
结核分枝杆菌基因间区Rv1482c-Rv1483*的野生型基因序列如SEQIDNO:4所示，其第126位碱基发生突变后的Rv1482c-Rv1483*序列1如SEQIDNO:5所示，突变后的Rv1482c-Rv1483*序列2如SEQIDNO:6所示。
上述分析结果说明单核苷酸多态性（SNP）位点Rv1482c-Rv1483*基因间区第126位碱基位点（即标准株H37Rv基因组的第1673425位碱基位点）可作为结核分枝杆菌INH耐药性分子诊断的一个标志物，有利于提高对具有INH耐药性的结核分枝杆菌的检出率。可应用于以下几个方面：
1）一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测异烟肼耐药突变基因间区Rv1482c-Rv1483*的特异性寡核苷酸探针，该探针检测的原理利用了Rv1482c-Rv1483*第126位碱基的INH耐药突变，如序列为SEQIDNO:1所示或其碱基互补 序列所示的特异性寡核苷酸探针。
2）一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测膜，该检测膜含有用于检测异烟肼耐药突变基因间区Rv1482c-Rv1483*的特异性寡核苷酸探针，该探针检测的原理利用了Rv1482c-Rv1483*第126位碱基的INH耐药突变，如序列为SEQIDNO:1所示或其碱基互补序列所示的特异性寡核苷酸探针。
3）一种结核分枝杆菌异烟肼耐药性的快速筛查法，利用PCR扩增含基因间区Rv1482c-Rv1483*第126位碱基的序列，再测序验证该位点是否发生碱基C突变为A或T。
<110> 广东省结核病控制中心
<120> 结核分枝杆菌异烟肼耐药相关的新突变位点及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 1
aacctatcgt ctcgccgcgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
gtagggcgtc aatacacccg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
gtcacattcg acgccaaaca 20
<210> 4
<211> 140
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<400> 4
ggtcgaagtg tgctgagtca caccgacaaa cgtcacgagc gtaaccccag tgcgaaagtt 60
cccgccggaa atcgcagcca cgttacgctc gtggacatac cgatttcggc ccggccgcgg 120
cgagacgata ggttgtcggg 140
<210> 5
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<213> 结核分枝杆菌
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cgagaagata ggttgtcggg 140
Claims (4)
1.一种结核分枝杆菌异烟肼耐药碱基突变位点，其特征在于：该碱基突变位点位于标准株H37Rv基因组的第1673425位，即基因间区Rv1482c-Rv1483*的第126位，发生的点突变为碱基C突变为T或者A。
2.一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有用于检测异烟肼耐药突变基因间区Rv1482c-Rv1483*的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO : 1或其碱基互补序列。
3.一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测膜，其特征在于：该膜含有用于检测异烟肼耐药突变基因间区Rv1482c-Rv1483*的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO : 1或其碱基互补序列。
4.一种结核分枝杆菌异烟肼耐药性的快速筛查法，其特征在于：扩增基因间区Rv1482c-Rv1483*中的碱基序列，并检测该基因间区第126位的是否发生碱基突变。
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