ES2916601T3 - Composiciones que comprenden cepas bacterianas - Google Patents

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Amy Beth HOLT
Suaad Ahmed
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Samantha Yuille
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John Cryan
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Abstract

Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en el tratamiento de enfermedades estimulando el sistema inmunitario, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16S que es por lo menos un 97% idéntica a la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones que comprenden cepas bacterianas
CAMPO TÉCNICO
Esta invención pertenece al campo de las composiciones que comprenden cepas bacterianas aisladas del tracto digestivo de mamíferos y el uso de tales composiciones en el tratamiento de enfermedades, en particular cáncer, y en particular para estimular el sistema inmunitario en el tratamiento de enfermedades, como se define en las reivindicaciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se cree que el intestino humano es estéril in utero, pero está expuesto a una gran variedad de microbios maternos y ambientales inmediatamente después del nacimiento. A partir de entonces, se produce un período dinámico de colonización y sucesión microbiana, que está influenciado por factores como el modo de administración, el medio ambiente, la dieta y el genotipo del huésped, todos los cuales impactan en la composición del microbiota intestinal, particularmente durante los primeros años de vida. Posteriormente, el microbiota se estabiliza y se vuelve similar a la adulta [1] El microbiota intestinal humana contiene más de 500-1000 filotipos diferentes que pertenecen esencialmente a dos divisiones bacterianas principales, Bacteroidetes y Firmicutes [2] Las relaciones simbióticas con éxito que surgen de la colonización bacteriana del intestino humano han proporcionado una amplia variedad de funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras funciones beneficiosas. Las actividades metabólicas mejoradas del intestino colonizado aseguran que los componentes dietéticos que de otro modo no serían digeribles se degraden con la liberación de subproductos que proporcionan una importante fuente de nutrientes para el huésped. De manera similar, la importancia inmunológica del microbiota intestinal está bien reconocida y se ejemplifica en animales libres de gérmenes que tienen un sistema inmunitario deteriorado que se reconstituye funcionalmente después de la introducción de bacterias comensales [3-5].
Se han documentado cambios drásticos en la composición del microbiota en trastornos gastrointestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). Por ejemplo, los niveles de bacterias Clostridium clúster XlVa se reducen en pacientes con IBD, mientras que el número de E. coli aumenta, lo que sugiere un cambio en el equilibrio de simbiontes y patobiontes dentro del intestino [6-9]. Curiosamente, esta disbiosis microbiana también se asocia con desequilibrios en las poblaciones de células T efectoras.
En reconocimiento del efecto positivo potencial que ciertas cepas bacterianas pueden tener en el intestino animal, se han propuesto varias cepas para su uso en el tratamiento de varias enfermedades (ver, por ejemplo, [10­ 13]). Además, ciertas cepas, incluyendo principalmente las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium, se han propuesto para su uso en el tratamiento de varias enfermedades inflamatorias y autoinmunes que no están directamente relacionadas con los intestinos (ver [14] y [15] para revisiones). Sin embargo, la relación entre diferentes enfermedades y diferentes cepas bacterianas, y los efectos precisos de cepas bacterianas particulares en el intestino y a nivel sistémico y en cualquier tipo particular de enfermedad, están pobremente caracterizados.
La WO2015038731 analiza un método para tratar el cáncer de colon mediante la alteración de una biopelícula colónica mediante la administración de un agente antimicrobiano o un agente probiótico. La solicitud enumera una gran cantidad de bacterias que pueden usarse en un probiótico, pero no proporciona ninguna demostración de la eficacia de ninguna de las bacterias en el tratamiento del cáncer de colon. En cambio, esta solicitud se centra en el potencial diagnóstico de las biopelículas en el cáncer colorrectal.
El número de registro de la base de datos EMBL XP002787383 proporciona una secuencia génica de ARNr 16S de una Megasphaera sp propuesta, mientras que el número de registro de la base de datos EMBL XP002787384 proporciona un gen ARNr 16S de una cepa de Megasphaera massiliensis. Estos documentos detallan el análisis genómico de cepas aisladas y no proporcionan orientación sobre el beneficio terapéutico de Megasphaera.
Ahmed et al (presentado en Frontiers Cellular Neuroscience) considera la caracterización in vitro de cepas bacterianas derivadas del microbiota intestinal. La US2004/120963 describe composiciones que contienen bacterias capaces de convertir el ácido láctico en ácido butírico y un método para prevenir/tratar la acidemia hiperláctica en el tracto digestivo y el cáncer de colon usando las mismas. La CN104415060A describe una composición comestible que comprende inulina y ácido butírico que produce bacterias. La JPS5557520 describe la preparación de una sustancia carcinostática tratando las paredes celulares de bacterias que pertenecen al género Bacteroides, etc. con una enzima y dializando con agua. La US2017/354697 describe el tratamiento de infección por Clostridium difficile. La US2016/223553 describe la formación de biopelículas para definir el riesgo de cáncer de colon. La WO2017122197A1 describe bacterias que utilizan ácido láctico modificadas genéticamente para secretas enzimas degradadoras de polisacáridos. La US2016199424A1 describe composiciones probióticas y prebióticas y métodos de uso de las mismas para la modulación del microbioma. La WO2004085628 describe bacterias que utilizan ácido láctico y su uso terapéutico. Nallabelli et al. (Scientific Reports, 6(1), 2016) describe análisis de secuencias de genoma y bioquímicos de la cepa de Megasphaera sp. DISK18 de la placa dental de un individuo sano. Padmanabhan et al. (Standards in Genomic Sciences, 8(3), 2013) divulga una secuencia de genoma finalizada no contigua y la descripción de Megasphaera massiliensis sp. nov.
Hay un requisito en la técnica para nuevos métodos de tratamiento de enfermedades. También hay un requisito para caracterizar los efectos potenciales de las bacterias intestinales para que puedan desarrollarse nuevas terapias que usen bacterias intestinales.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en el tratamiento de enfermedades estimulando el sistema inmunitario, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16S que es por lo menos un 97% idéntica a la SEQ ID NO: 1. La invención proporciona además una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1; (a) para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, (b) para su uso en el tratamiento, prevención o retraso de la inmunosenescencia, (c) para su uso como adyuvante de vacunas, o (d) para su uso en terapia con células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR-T), terapia de células madre mesenquimales (MSC), o terapia de trasplante de células madre; en un sujeto humano.
La invención también proporciona una composición que comprende una célula de la cepa bacteriana como se define en las reivindicaciones, en donde la célula expresa uno o más antígenos heterólogos; para su uso como una vacuna; opcionalmente en donde la célula presenta el uno o más antígenos heterólogos. La invención también proporciona una célula de la cepa bacteriana como se define en las reivindicaciones, en donde la célula expresa uno o más antígenos heterólogos; para su uso como una vacuna; opcionalmente en donde la célula presenta el uno o más antígenos heterólogos.
La invención proporciona además una cepa bacteriana para su uso en terapia, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 99,5% o un 99,9% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 8, 11 o 12. La invención también proporciona una cepa bacteriana que tiene la secuencia de ARNr 16S representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 8, 10, 11 o 12 para su uso en terapia.
Los inventores han desarrollado nuevas composiciones que comprenden una cepa bacteriana del género Megasphaera que puede usarse para estimular el sistema inmunitario y tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer.
Por lo tanto, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en el tratamiento de enfermedades estimulando el sistema inmunitario, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s que es por lo menos un 97% idéntica a la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la cepa bacteriana es de la especie Megasphaera massiliensis.
En aspectos adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1; para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, como el melanoma metastásico, el cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de cuello uterino, el neuroblastoma, el glioblastoma, el carcinoma, el cáncer de pulmón, la leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata, linfoma y/o cáncer gástrico. En aspectos adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1, para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, como el cáncer colorrectal y/o enfermedades malignas hematológicas.
En aspectos adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1, para su uso en el tratamiento, prevención o retraso de la inmunosenescencia.
En aspectos adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1, para su uso como adyuvante de vacunas.
En aspectos adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1, para su uso en la potenciación de una terapia celular, tal como CAR-T.
Preferiblemente, la bacteria usada en la invención es la cepa depositada con el número de registro 42787 en NCIMB.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1: Niveles de expresión de tubulina p3: inmunotinción e imagenología celular (Figura 1A); inmunotransferencia (Figura 1B)
Figura 2 : Niveles de expresión de MAP2: inmunotinción e imagenología celular (Figura 2A); inmunotransferencia (Figura 2B); veces el cambio en la expresión (Figura 2C)
Figura 3 : Cambio en la expresión de DRD2
Figura 4 : Cambio en la expresión de Casp3
Figura 5 : Cambio en la viabilidad celular
Figura 6 : fenotipado celular de células auxiliares T CD4 (Figura 6A); células CD4+ activadas (Figura 6B); células Tregs (Figura 6C); células T citotóxicas CD8 (Figura 6D); células activadas CD8+ (Figura 6E); células B (Figura 6F); Proporción CD8/Tregs (Figura 6G); Proporción CD8 activadas/Tregs (Figura 6H).
Figura 7 : Análisis de citoquinas de IL-1 p (Figura 7A); TNF-a (Figura 7B); IL-23 (Figura 7C); IL-6 (Figura 7D); MIP-3a (Figura 7E); CXCL9 (Figura 7F); Mc P-1 (Figura 7G); IL-10 (Figura 7H); GM-CSF (Figura 7I).
Figura 8 : Estrategia de regulación usada para analizar las diferentes poblaciones de células inmunitarias (células CD4, CD8 y CD 19+) mediante citometría de flujo para los datos presentados en la Figura 6.
Figura 9 : Secreción de Interleucina-8 (IL-8)).
Figura 10: Cambio en la actividad de la histona deacetilasa (HDAC)
Figura 11A: Cambios inducidos por cepas en la actividad de histona deacetilasa de células completas y lisado celular; Figura 11B: producción de metabolitos por cepas; Figura 11C: cambios inducidos por ácido en la actividad de histona deacetilasa.
Figura 12A: inhibición de HDAC1; Figura 12B: inhibición de HDAC2; Figura 12C: Inhibición de HDAC3.
Figura 13A: Inhibición de HDAC de Clase I; Figura 13B: inhibición de HDAC1; Figura 13C: inhibición de HDAC2; Figura 13D: inhibición de HDAC3.
Figura 14: Efectos sobre la función de barrera intestinal.
Figura 15: Cambios en la expresión hipocampal del Receptor 4 tipo Toll (TLR-4).
Figura 16: Cambios en la expresión hipocampal de TNF-a.
Figura 17: Cambios en la expresión hipocampal de interleucina-1 p (IL-1 p).
Figura 18: Cambios en la expresión hipocampal de interleucina-6 (IL-6).
Figura 19: Cambios en la expresión hipocampal de CD11b.
Figura 20: Cambios en la expresión de la amígdala de TLR-4.
Figura 21: Cambios en la expresión de la amígdala de CD11b.
Figura 22: Cambios en la expresión de la amígdala de IL-6.
Figura 23: Cambios en la expresión de la corteza prefrontal de TLR-4.
Figura 24: Cambios en la expresión de la corteza prefrontal de CD11b.
Figura 25: Cambios en la expresión de la corteza prefrontal de IL-6.
Figura 26: Efecto sobre la producción de interferón-Y a partir de esplenocitos de ratón de ratones a los que se les administró MRx0029.
Figura 27: Efecto sobre la producción de IL-1 p a partir de esplenocitos de ratón de ratones a los que se les administró MRx0029.
Figura 28: Efecto sobre la producción de IL-6 a partir de esplenocitos de ratón de ratones a los que se les administró MRx0029.
Figura 29: Efecto sobre la producción de TNF-a a partir de esplenocitos de ratones a los que se les administró MRx0029.
Figura 30: Efecto sobre la producción de CXCL1 a partir de esplenocitos de ratones a los que se les administró MRx0029.
Figura 31: Expresión génica de MAP2 en la línea celular SKMEL2 después de varios tratamientos, con respecto a GAPDH. “YCFA” = YCFA+
Figura 32: Supervivencia clonogénica de la línea celular SKMEL2 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 33: Crecimiento en agar blando de la línea celular SKMEL2 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 34: Señalización de ERK (ERK1 y 2 fosforilados (p44 y p42)/ERK total) en la línea celular SKMEL2 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 35: Expresión génica de MAP2 en la línea celular SKMEL28 después de varios tratamientos, con respecto a GAPDH. “YCFA” = YCFA+
Figura 36: Supervivencia clonogénica de la línea celular SKMEL28 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 37: Crecimiento en agar blando de la línea celular SKMEL28 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 38: Señalización de ERK (ERK1 y 2 fosforilados (p44 y p42)/ERK total) en la línea celular SKMEL28 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 39: Expresión génica de MAP2 en la línea celular SKMEL31 después de varios tratamientos, con respecto a GAPDH. “YCFA” = YCFA+
Figura 40: Supervivencia clonogénica de la línea celular SKMEL31 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 41: Crecimiento en agar blando de la línea celular SKMEL31 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 42: Señalización de ERK (ERK1 y 2 fosforilados (p44 y p42)/ERK total) en la línea celular SKMEL31 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 43: Expresión génica de MAP2 en la línea celular 451Lu después de varios tratamientos, con respecto a GAPDH. “YCFA” = YCFA+
Figura 44: Supervivencia clonogénica de la línea celular 451Lu después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 45: Crecimiento en agar blando de la línea celular 451Lu después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 46: Señalización de ERK (ERK1 y 2 fosforilados (p44 y p42)/ERK total) en la línea celular 451 Lu después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 47: Expresión génica de MAP2 en la línea celular F1T-29 después de varios tratamientos, con respecto a GAPDH. “YCFA” = YCFA+
Figura 48: Supervivencia clonogénica de la línea celular HT-29 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 49A: Crecimiento en agar blando de la línea celular HT-29 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 49B: Crecimiento en agar blando de la línea celular HT-29 después de varios tratamientos (fotografía de placas de agar). “YCFA” = YCFA+
Figura 50: Señalización de ERK (ERK1 y 2 fosforilados (p44 y p42)/ERK total) en la línea celular HT29 después de varios tratamientos. “YCFA” = YCFA+
Figura 51: Descripción general de la vía MAP-quinasa (de [72]).
Figura 52: Expresión de ARN de GPR109a en células Caco-2 diferenciadas (A) sin y (B) con tratamiento con miristato de forbol además de MRx0029. “YCFA” = YCFA+
Figura 53: Inducción de la secreción de IL-8 a partir de células HT29 por (A) MRx0029 con medio acondicionado y (B) MRx0029 solo.
Figura 54: Análisis de metabolitos para la cepa NCIMB 42787 de Megasphaera massiliensis.
Figura 55: Producción de ácido valérico en el sobrenadante de las cepas MRx0029 y Megasphaera massiliensis de referencia.
Figura 56: Producción y consumo de ácidos orgánicos por las cepas MRx0029 y Megasphaera massiliensis de referencia.
Figura 57: Supresión de NSE/Enolasa 2 por MRX029. “YCFA” = YCFA+.
Figura 58: Producción y consumo de ácidos orgánicos por NCIMB 42787, NCIMB 43385, NCIMB 43388 y NCIMB 43389.
Figura 59: Regulación por incremento de la secreción de IL-6 en células U373 por NCIMB 42787 y otras cepas depositadas (n=3).
Figura 60: Supresión de enolasa 2 por NCIMB 42787, NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389, NCIMB 43386 y NCIMB 43387.
Figura 61A: NCIMB 42787 y otras depositadas aumentan la expresión de MAP2; Figura 61B y C: Modulación de los niveles de citoquinas y promotor de NP k B-AP1 por NCIMB 42787.
Figura 62: NCIMB 42787 produce ácido butírico, valérico y hexanoico
Figura 63: Actividad inmunoestimuladora de metabolitos producidos por NCIMB 42787.
Figura 64: Análisis del papel de los metabolitos en la actividad inmunoestimuladora de NCIMB 42787.
Figura 65: La cepa NCIMB 43387 de Megasphaera afecta a la expresión del ARNm de IDO-1 del colon en ratones BALB/c.
Figura 66: Las cepas NCIMB 43385 y NCIMB 43387 de Megasphaera afectan a la expresión del ARNm de Tph1 del colon en ratones BALB/c.
Figura 67: la cepa NCIMB 43385 de Megasphaera modula la producción de IPNy e IL-6 tras la estimulación con ConA de esplenocitos de ratones BALB/c.
Figura 68: La cepa NCIMB 43385 de Megasphaera modula la expresión de IL-6 y CD11b en el cerebro de ratones BALB/c.
Figura 69: NCIMB 42787 modula la expresión de TLR4 en la amígdala de ratones BALB/c.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
Cepas bacterianas
Las composiciones de la invención, como se define en las reivindicaciones, comprenden una cepa bacteriana del género Megasphaera. Los Ejemplos demuestran que las bacterias de este género son útiles para estimular el sistema inmunitario y para tratar enfermedades, en particular cáncer. Las cepas bacterianas preferidas son las de la especie Megasphaera massiliensis.
Los ejemplos de especies de Megasphaera para su uso en la invención incluyen Megasphaera elsdenii, Megasphaera cerevisiae, Megasphaera massiliensis, Megasphaera indica, Megasphaera paucivorans, Megasphaera sueciensis y Megasphaera micronuciformis. Un ejemplo adicional de una especie de Megasphaera para su uso en la invención es Megasphaera hexanoica. Los Megasphaera son microbios gastrointestinales obligadamente anaeróbicos, fermentadores de lactato, de mamíferos rumiantes y no rumiantes, incluyendo los humanos.
La cepa tipo de M massiliensis es NP3 (=CSUR P245=DSM 26228) [16]. El número de registro del GenBank para las secuencias del gen ARNr 16S de la cepa NP3 de M massiliensis es JX424772.1.
A la bacteria Megasphaera massiliensis probada en los Ejemplos se hace referencia en la presente como cepa MRx0029. En la SEQ ID NO: 1 se proporciona una secuencia de ARNr 16S para la cepa MRx0029 que se probó.
La cepa MRx0029 fue depositada en la autoridad de depósito internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB252ZS, Escocia) el 13 de julio de 2017 como “Megasphaera massiliensis MRx0029” y se le asignó el número de registro nCiMB 42787.
También se espera que las cepas bacterianas estrechamente relacionadas con la cepa probada en los Ejemplos sean eficaces para estimular el sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16S representada por la SEQ ID NO: 1.
También se espera que las cepas bacterianas que son biotipos de las cepas MRx0029 sean eficaces para estimular el sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer. Un biotipo es una cepa estrechamente relacionada que tiene características fisiológicas y bioquímicas iguales o muy similares.
Las cepas que son biotipos de las cepas MRx0029 y que son adecuadas para su uso en la invención pueden identificarse secuenciando otras secuencias de nucleótidos para las cepas MRx0029. Por ejemplo, puede secuenciarse sustancialmente el genoma completo y una cepa de biotipo para su uso en la invención puede tener por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia en por lo menos un 80% de su genoma completo (por ejemplo, en por lo menos el 85%, 90%, 95% o 99%, o en su genoma completo). Otras secuencias adecuadas para su uso en la identificación de cepas de biotipo pueden incluir hsp60 o secuencias repetitivas como BOX, ERIC, (GTG)5o REP o [17]. Las cepas de biotipo pueden tener secuencias con por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de las cepas MRx0029.
Alternativamente, las cepas que son biotipos de las cepas MRx0029 y que son adecuadas para su uso en la invención pueden identificarse usando cepas MRx0029 y análisis de fragmentos de restricción y/o análisis por PCR, por ejemplo usando polimorfismo de longitud de fragmento amplificado fluorescente (FAFLP) e identificación de elemento de ADN repetitivo (rep)-PCR, o realización de perfiles de proteínas, o secuenciación parcial de ADNr 16S o 23S. En realizaciones preferidas, tales técnicas pueden usarse para identificar otras cepas de Megasphaera massiliensis.
En ciertas realizaciones, las cepas que son biotipos de las cepas MRx0029 y que son adecuadas para su uso en la invención son cepas que proporcionan el mismo patrón que la cepa MRx0029 cuando se analizan mediante análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), por ejemplo, cuando se usa la enzima de restricción Sau3AI (para métodos ejemplares y orientación, consultar, por ejemplo, [18]). Alternativamente, las cepas de biotipo se identifican como cepas que tienen los mismos patrones de fermentación de carbohidratos que las cepas MRx0029.
Otras cepas de Megasphaera que son útiles en las composiciones y métodos de la invención, como los biotipos de la cepa MRx0029, pueden identificarse usando cualquier método o estrategia apropiados, incluyendo los ensayos descritos en los Ejemplos. Por ejemplo, las cepas para su uso en la invención pueden identificarse añadiéndolas al lisado celular o a células completas y analizando la expresión de MAP2, la expresión de DRD2, los niveles de citoquinas o la supervivencia celular. En particular, las cepas bacterianas que tienen patrones de crecimiento, tipo metabólico y/o antígenos de superficie similares a las cepas MRx0029 pueden ser útiles en la invención. Una cepa útil tendrá una actividad inmunomoduladora comparable a las cepas MRx0029. En particular, una cepa de biotipo provocará efectos comparables sobre la expresión de MAP2, la expresión de DRD2, los niveles de citoquinas o la supervivencia celular como se muestra en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos. Una cepa de biotipo puede provocar efectos comparables sobre la actividad inhibidora de histona deacetilasa como se muestra en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos.
En algunas realizaciones, las cepas bacterianas útiles en la invención pueden identificarse realizando perfiles rutinariamente de la producción y el consumo de metabolitos por una cepa bacteriana. Los inventores han descubierto que la cepa bacteriana usada en los Ejemplos produce butirato, ácido valérico y ácido hexanoico y consume acetato y propionato (ver las Figuras 54-56). También se descubrió que las cepas Ref 1, Ref 2 y Ref 3 de Megasphaera massiliensis consumen y producen estos metabolitos (ver las Figuras 54-56). Por lo tanto, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana de la invención produce uno o más de los metabolitos butirato, ácido valérico y ácido hexanoico. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana de la invención consume uno o ambos de acetato y propionato. En realizaciones preferidas, la cepa bacteriana de la invención produce butirato, ácido valérico y ácido hexanoico y consume acetato y propionato.
Una cepa particularmente preferida de la invención es la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis. Esta es la cepa ejemplar probada en los Ejemplos y que ha demostrado ser eficaz para tratar enfermedades. Por lo tanto, la invención proporciona una célula, como una célula aislada, de la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis, o un derivado de la misma. La invención también proporciona una composición que comprende una célula de la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis, o un derivado de la misma. La invención también proporciona un cultivo biológicamente puro de la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis. La invención también proporciona una célula de la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis, o un derivado de la misma, para su uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas en la presente.
Una cepa particularmente preferida de la invención es la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787. Esta es la cepa MRx0029 ejemplar probada en los Ejemplos y que ha demostrado ser eficaz para estimular el sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer. Por lo tanto, la invención proporciona una célula, tal como una célula aislada, de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787, o un derivado de la misma. La invención también proporciona una composición que comprende una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787, o un derivado de la misma. La invención también proporciona un cultivo biológicamente puro de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787. La invención también proporciona una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42787, o un derivado de la misma, para su uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas en la presente.
Un derivado de la cepa de la invención puede ser una cepa hija (progenie) o una cepa cultivada (subclonada) a partir de la original. Un derivado de una cepa de la invención puede modificarse, por ejemplo a nivel genético, sin extirpar la actividad biológica. En particular, una cepa derivada de la invención es terapéuticamente activa. Una cepa derivada tendrá una actividad terapéutica comparable a la cepa MRx0029. En particular, una cepa derivada provocará efectos comparables sobre la expresión de MAP2, la expresión de DRD2, los niveles de citoquinas o la supervivencia celular como se muestra en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos. Una cepa derivada puede provocar efectos comparables sobre la actividad inhibidora de la histona deacetilasa como se muestra en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos. Un derivado de la cepa MRx0029 será generalmente un biotipo de la cepa MRx0029.
Las referencias a células de la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis abarcan cualquier célula que tenga las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que la cepa MRx0029, y tales células están abarcadas por la invención.
En realizaciones preferidas, las cepas bacterianas en las composiciones de la invención son viables y capaces de colonizar parcial o totalmente el intestino.
Los inventores han descubierto que las cepas de Megasphaera massiliensis aumentan la activación de citoquinas inflamatorias como IL-1 p, TNF-a, MIP-3a, IL-23, IL-8 y/o iL-6.
Los inventores han descubierto que las cepas de Megasphaera massiliensis aumentan la activación de las células inmunitarias y mejoran la secreción de citoquinas como IL-1 p, TNF-a, MIP-3a, IL-23, IL-8 y/o IL-6.
En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 42787, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer, más preferiblemente cáncer de cerebro, como el neuroblastoma. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 42787, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en el tratamiento o prevención de melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, cáncer de pulmón, leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata, linfoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o enfermedades malignas hematológicas.
En realizaciones preferidas, las cepas bacterianas en las composiciones de la invención son viables y capaces de colonizar parcial o totalmente el intestino.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención no comprende una célula de la cepa 42787 de Megasphaera massiliensis.
En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones de la invención es una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 42787.
En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones de la invención es una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 42787.
Estas cepas bacterianas fueron depositadas ante la autoridad de depósito internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB25 2ZS, Escocia) el 6 de mayo de 2019 como Megasphaera massiliensis (con los números de registro NCIMB 43388 y NCIMB 43389) y Megasphaera spp. (números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386 y NCIMB 43387). Por consiguiente, en una realización alternativa, las composiciones de la invención comprenden una o más de estas cepas bacterianas, o biotipos o derivados de las mismas. Para evitar dudas, la Ref 1 mencionada anteriormente es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43385, la Ref 2 mencionada anteriormente es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43388, y la Ref 3 mencionada anteriormente es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43389.
También se espera que las cepas bacterianas estrechamente relacionadas con las cepas probadas en los Ejemplos sean eficaces para estimular el sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer.
En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención es la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 43388. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43388, o un derivado de la misma, para su uso en terapia. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43388, o un derivado de la misma, para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para el tratamiento y la prevención de enfermedades, en particular cáncer. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43388, para su uso en cualquiera de las enfermedades descritas en la presente.
En realizaciones preferidas, la invención proporciona el uso de una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 43388, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer, más preferiblemente cáncer de cerebro, como neuroblastoma. En realizaciones preferidas, la invención proporciona el uso de una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 43388, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en el tratamiento o prevención de melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, cáncer de pulmón, leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata, linfoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la composición para el uso de acuerdo con la invención no comprende una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 43388. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones para el uso de acuerdo con la invención es una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43388. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones para su uso de acuerdo con la invención es una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43388.
Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención es la Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 43389. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43389, o un derivado de la misma, para su uso en terapia. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43389, o un derivado de la misma, para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43389, para su uso en cualquiera de las enfermedades descritas en la presente.
En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 43389, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer, más preferiblemente cáncer de cerebro, como neuroblastoma. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 43389, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en el tratamiento o prevención de melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, cáncer de pulmón, leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata, linfoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la composición para su uso de acuerdo con la invención no comprende una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 43389. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones para su uso de acuerdo con la invención es una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43389. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones para su uso de acuerdo con la invención es una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43389.
En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO:9. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16S representada por la SEQ ID NO:9. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una cepa bacteriana que tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO:9 para su uso en terapia.
En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO:10. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16S representada por la SEQ ID NO: 10. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una cepa bacteriana que tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO: 10 para su uso en terapia. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una cepa bacteriana que tiene la secuencia de ARNr 16S representada por la SEQ ID NO: 10 para su uso en terapia.
En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la secuencia de ARNr 16S de una cepa bacteriana del género Megasphaera. La cepa bacteriana para su uso en la invención es del género Megasphaera.
En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención es la cepa de Megasphaera depositada con el número de registro NCIMB 43385. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43385, o un derivado de la misma, para su uso en terapia. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43385, o un derivado de la misma, para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43385, para su uso en cualquiera de las enfermedades descritas en la presente.
En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 43385, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer, más preferiblemente cáncer de cerebro, como neuroblastoma. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 43385, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en el tratamiento o prevención de melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, cáncer de pulmón, leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata, linfoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención no comprende una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 43385. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones de la invención es una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43385. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones de la invención es una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43385.
En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención es la cepa de Megasphaera depositada con el número de registro NCIMB 43386. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43386, o un derivado de la misma, para su uso en terapia. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43386, o un derivado de la misma, para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para el tratamiento y la prevención de enfermedades, en particular cáncer. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43386, para su uso en cualquiera de las enfermedades descritas en la presente.
En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 43386, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para tratar y prevenir enfermedades, en particular cáncer, más preferiblemente cáncer de cerebro, como neuroblastoma. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 43386, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en el tratamiento o prevención de melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, cáncer de pulmón, leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata, linfoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la composición para su uso de acuerdo con la invención no comprende una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 43386. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones de la invención es una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43386. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones para su uso de acuerdo con la invención es una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43386.
En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención es la cepa de Megasphaera depositada con el número de registro NCIMB 43387. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43387, o un derivado de la misma, para su uso en terapia. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43387, o un derivado de la misma, para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para el tratamiento y la prevención de enfermedades, en particular cáncer. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una célula de la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43387, para su uso en cualquiera de las enfermedades descritas en la presente.
En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en el NCIMB con el número de registro NCIMB 43387, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en la estimulación del sistema inmunitario y para el tratamiento y prevención de enfermedades, en particular cáncer, más preferiblemente cáncer de cerebro, como neuroblastoma. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada en NCIMB con el número de registro NCIMB 43387, o un derivado o biotipo de la misma, preferiblemente para su uso en el tratamiento o prevención de melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, cáncer de pulmón, leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata, linfoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención no comprende una célula de la cepa Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 43387. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones de la invención es una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43387. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en las composiciones de la invención es una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, en donde la cepa bacteriana no es la cepa depositada con el número de registro NCIMB 43387.
En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO:8. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO: 11. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO: 12. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 99,5% o 99,9% idéntica a las SEQ ID NO: 8, 11 o 12. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una cepa bacteriana que tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 99,5% o 99,9% idéntica a las SEQ ID NO: 8, 11 o 12 para su uso en terapia.
En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16S representada por la SEQ ID NO: 8. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16S representada por la SEQ ID NO: 11. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16S representada por la SEQ ID NO:12. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para su uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16S representada por las SEQ ID NO: 8, 11 o 12. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una cepa bacteriana que tiene la secuencia de ARNr 16S representada por las SEQ ID NO: 8, 11 o 12 para su uso en terapia.
También se espera que las cepas bacterianas que son biotipos de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389 sean eficaces para estimular el sistema inmunitario y tratar y prevenir enfermedades. en particular cáncer. Un biotipo es una cepa estrechamente relacionada que tiene características fisiológicas y bioquímicas iguales o muy similares.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona las cepas bacterianas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389, o biotipos de las mismas, para su uso en terapia.
Las cepas que son biotipos de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389 y que son adecuadas para su uso en la invención pueden identificarse secuenciando otras secuencias de nucleótidos para una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389. Por ejemplo, puede secuenciarse sustancialmente el genoma completo y una cepa de biotipo para su uso en la invención puede tener por lo menos un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia en por lo menos el 80% de su genoma completo (por ejemplo, en por lo menos el 85%, 90%, 95% o 99%, o en su genoma completo). Otras secuencias adecuadas para su uso en la identificación de cepas de biotipo pueden incluir hsp60 o secuencias repetitivas como BOX, ERIC, (GTG)5 o REP. Las cepas de biotipo pueden tener secuencias con por lo menos un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389.
Alternativamente, las cepas que son biotipos de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, nCiMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389 y que son adecuadas para su uso en la invención pueden identificarse usando uno o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389 y análisis de fragmentos de restricción y/o análisis de PCR, por ejemplo usando polimorfismo de longitud de fragmento amplificado fluorescente (FAFLP) e identificación de elemento de ADN repetitivo (rep)-PCR, o realización de perfiles de proteínas o secuenciación parcial de ADNr 16S o 23S. En realizaciones preferidas, tales técnicas pueden usarse para identificar otras cepas de Megasphaera massiliensis.
En ciertas realizaciones, las cepas que son biotipos de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389 y que son adecuadas para su uso en la invención son cepas que proporcionan el misma patrón que una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCiMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389 cuando se analiza mediante análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), por ejemplo, cuando se usa la enzima de restricción Sau3AI. Alternativamente, las cepas de biotipo se identifican como cepas que tienen los mismos patrones de fermentación de carbohidratos que una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389.
Otras cepas que son útiles en las composiciones y métodos de la invención, como los biotipos de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389, pueden identificarse usando cualquier método o estrategia apropiados, incluyendo los ensayos descritos en los Ejemplos. Por ejemplo, las cepas para su uso en la invención pueden identificarse añadiéndolas al lisado celular o a células completas y analizando la expresión de MAP2, la expresión de DRD2, los niveles de citoquinas o la supervivencia celular. En particular, las cepas bacterianas que tienen patrones de crecimiento, tipo metabólico y/o antígenos de superficie similares a una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCiMB 43389 pueden ser útiles en la invención. Una cepa útil tendrá una actividad inmunomoduladora comparable a una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389. En particular, una cepa de biotipo provocará efectos comparables sobre la expresión de MAP2, expresión de DRD2, niveles de citoquinas o supervivencia celular como se muestra en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos. Una cepa de biotipo puede provocar efectos comparables sobre la actividad inhibidora de histona deacetilasa como se muestra en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos.
En ciertas realizaciones, las cepas preferidas de la invención son cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389. Estas son cepas ejemplares analizadas en los Ejemplos y que han demostrado ser eficaces para tratar enfermedades. Por tanto, la invención proporciona una célula, como una célula aislada, de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389, o un derivado de las mismas. La invención también proporciona una composición que comprende una célula de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389, o un derivado de las mismas. La invención también proporciona un cultivo biológicamente puro de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389, o un derivado de las mismas, para su uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas en la presente.
Un derivado de la cepa de la invención puede ser una cepa hija (progenie) o una cepa cultivada (subclonada) a partir de la original. Un derivado de una cepa de la invención puede modificarse, por ejemplo a nivel genético, sin eliminar la actividad biológica. En particular, una cepa derivada de la invención es terapéuticamente activa. Una cepa derivada tendrá una actividad terapéutica comparable a una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389. En particular, una cepa derivada provocará efectos comparables sobre la expresión de MAP2, expresión de DRD2, niveles de citoquinas o supervivencia celular como se muestra en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos. Una cepa derivada puede provocar efectos comparables sobre la actividad inhibidora de la histona deacetilasa como se muestra en los Ejemplos, que pueden identificarse usando los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos. Un derivado de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389 será generalmente un biotipo de una o más de las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 y/o NCIMB 43389, respectivamente.
Los inventores han descubierto que la cepa bacteriana usada en los Ejemplos produce ácido 2-metilpropanoico y ácido 3-metil-butanoico y consume ácido fórmico (ver Figura 58). También se descubrió que las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCiMb 43388 y NCIMB 43389 producían ácido 2-metilpropanoico y ácido 3-metil-butanoico. Además, también se descubrió que las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385 y NCIMB 43388 consumían ácido fórmico.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana de la invención produce uno o más de los metabolitos ácido 2-metil-propanoico y ácido 3-metil-butanoico. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana de la invención consume ácido fórmico. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana de la invención produce ácido 2-metil-propanoico y ácido 3-metil-butanoico y consume ácido fórmico. En realizaciones preferidas, la cepa bacteriana de la invención produce butirato, ácido valérico, ácido hexanoico, ácido 2-metil-propanoico y ácido 3-metil-butanoico, y consume acetato, propionato y ácido fórmico.
En ciertas realizaciones, la producción de butirato y/o ácido valérico genera secreción de IL-8. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden estimular el sistema inmunitario a través de la producción de butirato y/o ácido valérico.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención no comprenden Megasphaera elsdenii. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana útil en las composiciones y métodos de la invención no es Megasphaera elsdenii.
Usos terapéuticos
Estimulación del sistema inmunitario
Los ejemplos muestran que la administración de las composiciones para su uso de acuerdo con la invención puede llevar a una estimulación inmunitaria en células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC). Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención tiene un efecto inmunoestimulador sobre las PBMC, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, en particular enfermedades caracterizadas por activación inmunitaria reducida y enfermedades que pueden tratarse por una respuesta inmunitaria aumentada. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades mediante la estimulación del sistema inmunitario. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de promover una respuesta inmunitaria.
Los Ejemplos muestran que la administración de las composiciones para su uso de acuerdo con la invención puede llevar a una disminución del porcentaje de Tregs en las PBMC (Figura 6C). Las Tregs, también conocidas como células T supresoras, son una población de células T que funcionan para suprimir la respuesta inmunitaria. Las Tregs se caracterizan por la alta expresión del marcador de superficie celular CD25 y la baja expresión de CD127 [19]. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención reduce selectivamente la población de Tregs (Figura 6C), las composiciones para su uso de acuerdo con la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por un aumento en el porcentaje de Tregs en una población celular. En una realización, las composiciones para su uso de acuerdo con la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir enfermedades caracterizadas por un aumento en el porcentaje de Tregs en una población celular. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por un aumento en el porcentaje de células CD4+CD25+CD127- en una población celular. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades disminuyendo el porcentaje de Tregs en las poblaciones celulares. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción de la supresión de la respuesta inmunitaria por Tregs. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria mediante la reducción selectiva de Tregs. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la inmunoestimulación, en donde las composiciones de la invención reducen el número o porcentaje de Tregs.
Los ejemplos demuestran que las composiciones de la invención pueden ser capaces de dirigirse selectivamente a las Tregs, sin afectar significativamente a células como células B, células T CD4 o células T CD8. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden reducir selectivamente las Tregs en las PBMC, sin afectar significativamente al porcentaje de los otros tipos de células analizadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción selectiva del número o porcentaje de Tregs, en donde el número o porcentaje de células T CD4 no cambia significativamente. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción selectiva del número o porcentaje de Tregs, en donde el número o porcentaje de células T CD8 no cambia significativamente. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción selectiva del número o porcentaje de Tregs, en donde el número o porcentaje de células B no cambia significativamente. En una realización adicional, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción selectiva del número o porcentaje de Tregs, en donde el número o porcentaje de células B, células T CD4 y/o células T CD8 no cambia significativamente.
La disminución en el porcentaje de Tregs fue particularmente sorprendente porque la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis produce butirato, y el butirato se ha asociado con niveles de células Tregs aumentados en sangre y una actividad de Tregs aumentada [20]. Por lo tanto, era inesperado que las composiciones de la invención llevaran a una disminución en el porcentaje de Tregs en las PBMC.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la proporción de células CD8 a células Tregs. Las células T CD8+ (células CD8) son células T citotóxicas y desempeñan un papel clave en la defensa inmunitaria contra los patógenos intracelulares. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la proporción tanto de las células CD8/Tregs como de las células CD8/Tregs activadas (Figura 6G y Figura 6H), las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la proporción de células CD8/Tregs y/o CD8/Tregs activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por la disminución de la proporción de células CD8/Tregs. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por la disminución de la proporción de células CD8/Tregs activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades disminuyendo el porcentaje de células Tregs en las poblaciones celulares, aumentando de este modo la proporción de células CD8/Tregs. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades disminuyendo el porcentaje de células Tregs en las poblaciones celulares, aumentando de este modo la proporción de células CD8/Tregs, en donde el aumento en la proporción de células CD8/Tregs da como resultado la inmunoestimulación. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades disminuyendo el porcentaje de Tregs en las poblaciones celulares, aumentando de este modo la proporción de células CD8/Tregs activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades disminuyendo el porcentaje de células Tregs en las poblaciones celulares, aumentando de este modo la proporción de células CD8/Tregs, en donde el aumento en la proporción de células CD8/Tregs activadas da como resultado la estimulación inmunitaria. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria aumentando la proporción de células CD8/Tregs. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria aumentando la proporción de células CD8/Tregs activadas.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en el porcentaje de células CD19+CD3- en las PBMC (Figura 6F). Por lo tanto, la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento del porcentaje de células B en una población celular. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta el porcentaje de células B, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células B. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células B. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución del número o porcentaje de células CD19+CD3-. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando el número o porcentaje de células B en poblaciones celulares, en donde el aumento en el número o porcentaje de células B da como resultado una estimulación inmunitaria. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria aumentando el número o porcentaje de células B.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en el porcentaje de células T-citotóxicas CD8 (Figura 6D) en las PBMC. Por lo tanto, la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento del porcentaje de células T CD8 en una población celular. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta el porcentaje de células T citotóxicas CD8, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células T citotóxicas CD8. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células T citotóxicas CD8. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando el número o porcentaje de células T citotóxicas CD8 en poblaciones celulares, en donde el aumento en el número o porcentaje de células T citotóxicas CD8 da como resultado una estimulación inmunitaria. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria aumentando el número o porcentaje de células T-citotóxicas CD8.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en el porcentaje de células CD8+ activadas (Figura 6E) en las PBMC. Por lo tanto, la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento del porcentaje de células CD8+ activadas en una población celular. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta el porcentaje de células CD8+ activadas, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células CD8+ activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en el número o porcentaje de células CD8+ activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades aumentando el número o porcentaje de células CD8+ activadas en poblaciones celulares, en donde el aumento en el número o porcentaje de células CD8+ activadas da como resultado una estimulación inmunitaria. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la estimulación de la respuesta inmunitaria aumentado el número o porcentaje de células CD8+ activadas.
Los Ejemplos muestran que la administración de las composiciones para su uso de acuerdo con la invención puede llevar a un aumento en la expresión de moléculas proinflamatorias en las PBMC, como citoquinas proinflamatorias (Figura 7 y Figura 9). Los ejemplos de moléculas inmunoestimuladoras (por ejemplo, proinflamatorias) que mostraron un aumento en los niveles de expresión tras la administración de las composiciones de la invención incluyen IL-23, TNF-a, IL-1 p, MIP-3a, IL-8 e IL -6. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de moléculas inmunoestimuladoras (por ejemplo, proinflamatorias), las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de moléculas proinflamatorias, como las citoquinas proinflamatorias. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de moléculas proinflamatorias, en particular enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de citoquinas proinflamatorias. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-23, TNF-a, IL-1 p, MIP-3a y/o IL-6. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-8. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de CD11b. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y /o actividad de IL-23, TNF-a, IL-1 p, MIP-3a y/o IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-8. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o la actividad de CD11b. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y /o actividad de IL-23, TNF-a, IL-1 p, MIP-3a y/o IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de IL-8. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de CD11b.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-1 p en las PBMC. IL-1 p es una citoquina proinflamatoria [21]. La producción y secreción de IL-1 p está regulada por el inflamasoma, un complejo proteico que está asociado con la activación de la respuesta inflamatoria [22]. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de IL-1 p, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de IL-1 p. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-1 p. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-1 p. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de IL-1 p. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es útil en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-1 p. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es útil en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-1 p. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es útil en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o la actividad de IL-1 p.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-23. La IL-23 se ha relacionado con la inflamación [23,24] Las funciones propuestas de la IL-23 en la respuesta inmunitaria incluyen promover la proliferación de células T de memoria CD4+ y promover la secreción de IFN- y por las células dendríticas (DC) [25]. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de IL-23, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución de la expresión de IL-23. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-23. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-23. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de IL-23. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-23. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-23. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o la actividad de IL-23.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de Proteína Inflamatoria de Macrófagos-3 (MIP3-a) o CCL20 en las PBMC. La MIP3-a es una quimiocina inflamatoria que se une al receptor CCR6 y funciona como quimioatrayente para las DC y las células T de memoria. La MIP3-a se asocia con el desencadenamiento de la respuesta inmunitaria adaptativa mediante el reclutamiento de DC inmaduras en el sitio de la inflamación [26]. La expresión desregulada de MIP3-a se ha asociado con enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal [27]. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de MIP3-a, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizado por una disminución en la expresión de MIP3-a. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de MIP3-a. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de MIP3-a. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de MIP3-a. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de MIP3-a. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de MIP3-a. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de MIP3-a
Los Ejemplos muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión del Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a). El TNF-a es una citoquina proinflamatoria que se sabe que está implicada en varias vías de señalización para promover la muerte celular. TNF-a inicia la apoptosis al unirse a su receptor afín, TNFR-1, lo que lleva a una cascada de eventos de escisión en la vía apoptótica [28]. El TNF-a también puede desencadenar necrosis a través de un mecanismo dependiente de la quinasa RIP [29]. Como la administración de las composiciones de la invención muestra un aumento en la expresión de TNF-a, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, en particular para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de TNF-a. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de TNF-a. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de TNF-a. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de TNF-a. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o la actividad de TNF-a. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de TNF-a. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de TNF-a. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o la actividad de TNF-a.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-6 en PBMC. La IL-6 es una citoquina proinflamatoria que se produce durante la inflamación y promueve la diferenciación de células T CD4+ inmaduras y la diferenciación de células T CD8+ en células T citotóxicas [30]. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de IL-6, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución de la expresión de IL-6. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o la actividad de IL-6. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-6. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-6. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o la actividad de IL-6.
Bettelli et al. [31] informaron que la IL-6 inhibe la producción de Tregs. Como los Ejemplos muestran que las composiciones de la invención aumentan la expresión de IL-6, las composiciones de la invención pueden disminuir selectivamente el número o porcentaje de Tregs aumentando la expresión de IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en inmunoestimulación aumentando la expresión de IL-6. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en inmunoestimulación disminuyendo el número o porcentaje de Tregs. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en inmunoestimulación aumentando la expresión de IL-6. En otra realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en inmunoestimulación disminuyendo el número o porcentaje de Tregs.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-8 (ver Ejemplo 8). La IL-8 es una citoquina proinflamatoria secretada predominantemente por macrófagos con efectos inmunoestimuladores. Induce la quimiotaxis en las células objetivo, principalmente los neutrófilos pero también otros granulocitos, lo que hace que migren hacia el sitio de la infección. IL-8 también estimula la fagocitosis. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de IL-8, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución de la expresión de IL-8. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de IL-8. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-8. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de IL-8. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de IL-8 y/o la actividad de IL-8. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de IL-8. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o la actividad de IL-8.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de CD11b (ver Ejemplo 12). La CD11b es una citoquina proinflamatoria con efectos inmunoestimuladores. La CD11b se expresa en la superficie de muchos leucocitos implicados en el sistema inmunitario innato y media la inflamación regulando la adhesión y migración de leucocitos. CD11b se ha implicado en varios procesos inmunitarios, por ejemplo, fagocitosis, citotoxicidad mediada por células, quimiotaxis y activación celular. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de CD11b, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de CD11 b. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión y/o actividad de CD11b. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de CD11b. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o actividad de CD11b. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una disminución en la expresión de CD11b y/o la actividad de CD11b. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades aumentando la expresión y/o actividad de CD11b. En una realización, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la promoción de la respuesta inmunitaria aumentando la expresión y/o la actividad de CD11b.
Los Ejemplos muestran que las composiciones de la invención pueden inducir la activación del promotor NF- k B—Ap1 (ver Figura 61). El NF- k B está implicado en la activación de la respuesta inmunitaria, en particular estimulando la expresión de mediadores de la inflamación y de citoquinas implicadas en la respuesta inmunitaria, por ejemplo, la IL-6. Como se ha descrito anteriormente, un aumento en la expresión de IL-6 ayuda a estimular el sistema inmunitario y, por lo tanto, la activación de la vía NF- k B tiene actividad inmunoestimuladora. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención activan la señalización de NF-kB y estimulan por tanto el sistema inmunitario. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención estimulan la expresión de mediadores de inflamación y citoquinas inmunoestimuladoras aumentando la activación del promotor NF-kB.
Cáncer
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de cerebro, en particular el neuroblastoma. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma, en particular el melanoma metastásico. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de cerebro. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del neuroblastoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma metastásico. En una realización más preferida, la composición de la invención comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis y es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de cerebro, en particular el neuroblastoma. En otra realización más preferida, la composición de la invención comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis y es para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma, en particular el melanoma metastásico.
Los Ejemplos (Ejemplo 1) demuestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de tubulina beta de Clase III (Tubulina p3) en células de neuroblastoma no diferenciadas. La tubulina p3 es ampliamente conocida como marcador neuronal [32]. Los ejemplos también demuestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2) en células de neuroblastoma no diferenciadas. MAP2 se expresa predominantemente en las neuronas y funciona para estabilizar los microtúbulos, para promover el desarrollo de las dendritas y para el crecimiento de las neuritas [33]. MAP2 es conocido como un marcador de neuronas diferenciadas.
Los agentes que provocan la diferenciación celular se han asociado con agentes terapéuticos contra el cáncer, ya que la administración de agentes de diferenciación celular se ha correlacionado con la inhibición del crecimiento tumoral [34]. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de cánceres induciendo la diferenciación celular, en particular la diferenciación neuronal. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del cáncer de cerebro induciendo la diferenciación neuronal, en particular el tratamiento del neuroblastoma.
Además, se ha descubierto que MAP2 se expresa en gran medida en los melanomas cutáneos primarios, pero tiene una expresión reducida en los melanomas metastásicos [35]. Se ha propuesto que la expresión aumentada de proteínas estabilizadoras de microtúbulos o el tratamiento con proteínas estabilizadoras de microtúbulos como MAP2 pueden interferir en la inestabilidad dinámica de los microtúbulos que se requiere durante la división celular. Por lo tanto, se cree que la regulación por incremento de MAP2 dificulta la división celular y retrasa el crecimiento tumoral en el cáncer [35]. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar el cáncer, en particular los cánceres metastásicos. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en un método para tratar el cáncer. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres mediados por expresión disminuida de MAP2. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres caracterizados por una expresión de MAP2 disminuida o ausente. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el aumento de la expresión de MAP2 en el tratamiento del cáncer. En una realización preferida, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma metastásico.
En ciertas realizaciones, las combinaciones terapéuticas de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma. De acuerdo con algunas realizaciones, las combinaciones terapéuticas de la invención tienen un efecto sobre los melanocitos y pueden ser eficaces para tratar el melanoma. En ciertas realizaciones, las combinaciones terapéuticas de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducir el crecimiento del tumor o reducir la angiogénesis en el tratamiento del melanoma.
En particular, los Ejemplos muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de MAP2 en células de neuroblastoma no diferenciadas. Como MAP2 es ampliamente conocido como un marcador de neuronas diferenciadas y se ha demostrado que su expresión tiene implicaciones en el cáncer, las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para tratar el cáncer de cerebro, como el neuroblastoma. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en un método para tratar el cáncer de cerebro. En una realización preferida, las composiciones de la invención son para su uso en un método para tratar el neuroblastoma.
Además, los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a una disminución significativa en la expresión del Receptor de Dopamina D2 (DRD2) (ver el Ejemplo 2 y la Figura 3). El DRD2 es un receptor acoplado a proteína G (GPCR) y es parte de la familia de los receptores de dopamina. DRD2 está implicado en las vías de señalización que promueven la supervivencia celular y, por lo tanto, está asociado con el cáncer. La sobreexpresión o regulación por incremento de DRD2 se ha implicado en varios tipos de cáncer, ya que las células malignas muestran una expresión de DRD2 aumentada en comparación con las células normales [36]. Se ha demostrado que la inhibición de DRD2 a través de antagonistas específicos de DRD2 tiene efectos antitumorales. Se ha demostrado que los antagonistas de DRD2 tienen eficacia antitumoral en muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama [37][38], el glioblastoma [39][40][4l], el neuroblastoma [42], carcinoma hepatocelular [43], cáncer de pulmón, cáncer de próstata [44], cáncer de cuello uterino [45], cáncer de ovario [46], linfoma [47] y cáncer gástrico [48]. Por lo tanto, las composiciones que disminuyen el nivel de expresión de DRD2 pueden ser útiles para el tratamiento del cáncer. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención disminuye la expresión de DRD2, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer, en particular para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres caracterizados por una expresión de DRD2 aumentada. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de cánceres caracterizados por una expresión y/o actividad de DRD2 aumentadas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la disminución de la expresión y/o actividad de DRD2 en el tratamiento del cáncer. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar el cáncer, en particular cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de cerebro, en particular el glioblastoma y el neuroblastoma, el carcinoma, en particular el carcinoma hepatocelular, el cáncer de pulmón, el cáncer de próstata, el linfoma y/o el cáncer gástrico. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir el cáncer disminuyendo el nivel y/o la actividad de DRD2.
Prabhu et al. informaron que ONC201, un antagonista de DRD2, ha demostrado eficacia en la reducción de tumores en modelos de glioblastoma. La expresión de DRD2 está regulada por incremento en los tumores de glioblastoma y, por lo tanto, DRD2 es un objetivo atractivo para agentes terapéuticos contra el cáncer [49]. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del glioblastoma.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de Caspasa 3 (Casp3) en células SH-SY5Y. Las caspasas son parte de la familia de las cisteínas proteasas y se sabe que promueven la apoptosis. Casp3 se conoce como una “caspasa ejecutora”, que desempeña un papel importante en la cascada de escisión de proteínas celulares en la vía apoptótica. La regulación por disminución de la expresión de Casp3 se ha demostrado previamente en cánceres de tejidos tumorales de mama, ovario y cuello uterino, y se cree que la disminución de la expresión de Casp3 promueve la supervivencia celular en el tejido canceroso [50]. Por lo tanto, las composiciones que aumentan el nivel de expresión de las caspasas ejecutoras, en particular Casp3, pueden ser útiles para el tratamiento del cáncer. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de Casp3, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer, en particular para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres mediados por la expresión de Casp3. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres caracterizados por una expresión disminuida o ausente de Casp3. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar cánceres caracterizados por una expresión disminuida o ausente de la caspasa ejecutora. En una realización particular, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir cánceres caracterizados por una expresión disminuida o ausente de Casp3. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el aumento de la expresión de Casp3 en el tratamiento del cáncer. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar el cáncer, en particular cáncer de mama, cáncer de ovario y/o cáncer de cuello uterino. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar el cáncer aumentando el nivel y/o la actividad de Casp3.
Además, se ha informado que las caspasas están implicadas en procesos distintos a la apoptosis, como la diferenciación celular [51]. Los Ejemplos (Ejemplo 1 y Ejemplo 3) demuestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de los marcadores neuronales Tubulina p3 y MAP2, y también aumentar la expresión de Casp3 en células de neuroblastoma indiferenciado. Como las composiciones de la invención pueden llevar a un aumento en la expresión de marcadores neuronales y proteínas que se sabe que desempeñan un papel en la diferenciación celular, las composiciones de la invención pueden ser útiles en la diferenciación de neuronas de células indiferenciadas.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a una disminución de la viabilidad celular en células de neuroblastoma no diferenciadas (Figura 5). En particular, los Ejemplos muestran que la administración de MRx0029 a una concentración del 5% o del 10% provoca una disminución significativa, dependiente de la dosis, en la viabilidad celular (Figura 5).
Se sabe que una disminución de la viabilidad celular o un aumento de la muerte celular de las células cancerosas es un objetivo para el tratamiento del cáncer [52] Por lo tanto, las composiciones que disminuyen la viabilidad celular en líneas celulares de cáncer, como las líneas celulares de neuroblastoma, pueden ser útiles para el tratamiento del cáncer. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del cáncer disminuyendo la viabilidad celular. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del cáncer aumentando la muerte celular.
Además, como los Ejemplos muestran que las composiciones de la invención aumentan tanto la expresión de Casp3 como disminuyen la viabilidad celular (Figura 4 y Figura 5), se propone que las composiciones de la invención disminuyan la viabilidad celular regulando por incremento la apoptosis. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la regulación por incremento de la apoptosis. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del cáncer aumentando la muerte celular, en particular aumentando la apoptosis. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de cánceres disminuyendo la viabilidad celular. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de cánceres disminuyendo la viabilidad celular. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de cánceres mediante la regulación por incremento de la apoptosis. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de cánceres mediante la regulación por incremento de la apoptosis. En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de cánceres caracterizados por una expresión reducida o ausente de Casp3 mediante la regulación por incremento de la apoptosis. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el aumento de la apoptosis en el tratamiento del cáncer. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la disminución de la viabilidad celular en el tratamiento del cáncer.
Los Ejemplos muestran que las composiciones de la invención aumentan tanto la expresión de Casp3 como la de MAP2. Por lo tanto, la regulación por incremento de Casp3 y la regulación por incremento de MAP2 pueden estar relacionadas.
La acetilación y desacetilación de histonas son importantes reguladores epigenéticos de la expresión génica. La regulación epigenética es una poderosa herramienta para regular todos los aspectos de la función celular. Las histonas deacetilasas (HDAC) reprimen la expresión génica eliminando los grupos acetilo de un aminoácido s-N-acetil lisina en una histona, permitiendo que las histonas envuelvan el ADN con más fuerza y dando como resultado la supresión transcripcional a través de la inaccesibilidad del nucleosoma. HDAC tiene 18 isoformas que se organizan en cuatro clases: Clase I, II, III y IV. Se han observado alteraciones en los niveles de HDAC en muchos tipos de enfermedades incluyendo, por ejemplo, cánceres, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias y enfermedades neurodegenerativas [53,54,55].
Los inhibidores de HDAC (HDACi) son una clase emergente de fármacos anticancerígenos prometedores que han demostrado que provocan la detención del crecimiento, la diferenciación, la apoptosis, la reducción de la angiogénesis y la modulación de la respuesta inmunitaria en una variedad de líneas celulares de cáncer [56,57,58,59]. Aunque el mecanismo preciso por el cual está mediada la actividad clínica de estos agentes sigue sin estar claro, actualmente se están investigando una amplia variedad de HDACi como posibles agentes anticancerígenos. Además, debido a la actividad anticancerígena demostrable en estudios tanto in vitro como in vivo, muchos HDACi han progresado rápidamente a través del desarrollo clínico, ya sea como monoterapias o en combinación con otros agentes anticancerígenos [60]. Entre ellos, el vorinostat (Zolinza™), la romidepsina (Istodax™) y el belinostat (Beleodaq™) han recibido la aprobación de la FDA de los Estados Unidos para el tratamiento del linfoma. El linfoma y otros tipos de cáncer de la sangre (también llamados cánceres hematológicos o enfermedades malignas hematológicas) son particularmente sensibles a los HDACi. El microbiota intestinal, con su inmensa diversidad y capacidad metabólica, representa un enorme depósito metabólico para la producción de una amplia variedad de moléculas con efectos potenciales sobre la actividad de HDAC. Pocos estudios han evaluado la actividad inhibidora de HDAC de metabolitos derivados de microbios distintos del butirato, que se ha demostrado que inhibe HDAC y se asocia con una mejora de la función motora en la enfermedad de Huntington [61].
Los Ejemplos muestran que las composiciones de la invención inhiben la actividad HDAC, en particular HDAC de Clase I, por ejemplo HDAC2 (Ejemplos 9 y 10). Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la actividad de HDAC. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la actividad de HDAC. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención inhiben HDAC. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son HDACi. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención reducen la actividad de HDAC Clase I. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la actividad de HDAC de Clase II. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la actividad de HDAC de Clase III. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la actividad de HDAC de Clase IV. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la actividad de HDAC1. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención reducen la actividad de HDAC2. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la actividad de HDAC3. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la actividad de HDAC a través de la producción de ácido valérico. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la actividad de HDAC a través de la producción de butirato de sodio. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer reduciendo la actividad de HDAC. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres asociados con HDAC. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, neuroblastoma, glioblastoma, carcinoma, cáncer de pulmón, leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata, linfoma, cáncer colorrectal, enfermedades malignas hematológicas y/o cáncer gástrico reduciendo la actividad de HDAC. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades malignas hematológicas reduciendo la actividad de HDAC.
En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de las composiciones de la invención da como resultado la detención del crecimiento. En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de las composiciones de la invención da como resultado la detención del ciclo celular. En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de las composiciones de la invención da como resultado la diferenciación celular. En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de las composiciones de la invención da como resultado la apoptosis. En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de las composiciones de la invención da como resultado la reducción de la angiogénesis. En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de las composiciones de la invención da como resultado la modulación de la respuesta inmunitaria. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción de la actividad de HDAC como monoterapia. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción de la actividad de HDAC como terapia de combinación. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se utilizan en combinación con otro agente anticancerígeno. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en combinación con más de otro agente anticancerígeno. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en combinación con un agente quimioterapéutico. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en combinación con un inhibidor de proteasomas. En aspectos adicionales, las composiciones de la invención son reguladores epigenéticos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por aberraciones epigenéticas.
En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis modula la actividad de HDAC. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce la actividad de HDAC. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis inhibe HDAC. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es una HDACi. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce la actividad de HDAC de Clase I. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce la actividad de HDAC de Clase II. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce la actividad de HDAC de Clase III. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce la actividad de HDAC de Clase IV. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce la actividad de HDAC1. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce la actividad de HDAC2. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce la actividad de HDAC3. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce la actividad de HDAC a través de la producción de ácido valérico. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce la actividad de HDAC a través de la producción de butirato de sodio. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer mediante la reducción de la actividad de HDAC. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres asociados con HDAC. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, neuroblastoma, glioblastoma, carcinoma, cáncer de pulmón, leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata, linfoma, cáncer colorrectal, enfermedades malignas hematológicas y/o cáncer gástrico reduciendo la actividad de HDAC. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades malignas hematológicas mediante la reducción de la actividad de HDAC.
En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de la cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis da como resultado la detención del crecimiento. En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de la cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis da como resultado la detención del ciclo celular. En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de la cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis da como resultado la diferenciación celular. En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de la cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis da como resultado la apoptosis. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis da como resultado una reducción de la angiogénesis. En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis da como resultado la modulación de la respuesta inmunitaria. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción de la actividad de HDAC como monoterapia. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción de la actividad de HDAC como terapia de combinación. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en combinación con otro agente anticancerígeno. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en combinación con más de otro agente anticancerígeno. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en combinación con un agente quimioterapéutico. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en combinación con un inhibidor de proteasomas. En aspectos adicionales, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es un regulador epigenético. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por aberraciones epigenéticas.
Las composiciones de la invención pueden regular la permeabilidad epitelial modificando la transducción de señales intracelulares implicadas en la expresión y localización de proteínas implicadas en la función de barrera intestinal. En particular, las composiciones de la invención mejoran la expresión de ARNm de ocludina, villina, proteína de unión estrecha 1 (TJP1) y proteína de unión estrecha 2 (TJP2). Por lo tanto, las composiciones de la invención funcionan para aumentar la función de barrera intestinal y reducir la permeabilidad intestinal (Ejemplo 11). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el aumento de la función de barrera intestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción de la permeabilidad intestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de la reducción de la función de barrera intestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del aumento de la permeabilidad intestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades o condiciones que se caracterizan por la reducción de la función de barrera intestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones que se caracterizan por una permeabilidad intestinal aumentada. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o la prevención de la reducción de la función de barrera intestinal resultante de radioterapia o quimioterapia. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o la prevención del aumento de la permeabilidad intestinal resultante de radioterapia o quimioterapia. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de la caquexia aumentando la función de barrera intestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de la caquexia reduciendo la permeabilidad intestinal. En ciertas realizaciones, la caquexia es caquexia por cáncer.
En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis espara su uso en el aumento de la función de barrera intestinal. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción de la permeabilidad intestinal. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de la reducción de la función de barrera intestinal. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del aumento de la permeabilidad intestinal. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones que se caracterizan por la reducción de la función de barrera intestinal. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones que se caracterizan por una permeabilidad intestinal aumentada. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de la reducción de la función de barrera intestinal resultante de radioterapia o quimioterapia. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del aumento de la permeabilidad intestinal resultante de radioterapia o quimioterapia. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de la caquexia aumentando la función de barrera intestinal. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de la caquexia reduciendo la permeabilidad intestinal. En ciertas realizaciones, la caquexia es caquexia por cáncer.
En realizaciones preferidas, las composiciones son para tratar el cáncer en un paciente que se está sometiendo a radioterapia o quimioterapia. En tales realizaciones, la composición puede administrarse antes, durante o después de la radioterapia o la quimioterapia. A los pacientes sometidos a radioterapia o quimioterapia no se les debe administrar ningún agente que induzca un intestino permeable, pero la Megasphaera massiliensis promueve la función de barrera intestinal [62], por lo que las composiciones de la invención son particularmente adecuadas para tratar pacientes sometidos a radioterapia o quimioterapia. Se ha demostrado que la activación de TLR-5 mejora el daño epitelial inducido por la radiación in vivo [63]. Las composiciones de la invención también activan el sistema inmunitario. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del daño inducido por radioterapia. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento del daño inducido por radioterapia.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención pueden llevar a una reducción del crecimiento tumoral.
En ciertas realizaciones, el tratamiento con las composiciones de la invención da como resultado una reducción del tamaño del tumor o una reducción del crecimiento del tumor. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor o reducción del crecimiento del tumor. Las composiciones de la invención pueden ser eficaces para reducir el tamaño o el crecimiento del tumor. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en pacientes con tumores sólidos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción o prevención de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer. Las composiciones de la invención pueden tener un efecto sobre los sistemas inmunitario o inflamatorio, que tienen funciones centrales en la angiogénesis. Las composiciones de la invención pueden tener actividad antimetastásica. Una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis puede tener actividad antimetastásica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención de la metástasis. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la prevención de la metástasis.
Los Ejemplos muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a una disminución del porcentaje de Tregs en las PBMC (Figura 6C). Las Tregs se han relacionado con el cáncer, y la infiltración de Tregs en el tejido tumoral se ha relacionado con un mal pronóstico [64]. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención reduce selectivamente la población de Tregs (Figura 6C), las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres caracterizados por un aumento en el porcentaje de Tregs en una población celular. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir cánceres caracterizados por un aumento en el porcentaje de células CD4+CD25+CD127-en una población celular. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres disminuyendo el número o porcentaje de Tregs, en particular en tejido canceroso. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del cáncer mediante la reducción selectiva de Tregs.
Se ha propuesto que reducir selectivamente el número de Tregs y activar las células T efectoras, como las células T CD8+, será una terapia eficaz contra el cáncer [64]. Los ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la proporción de células CD8 a células Tregs. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la proporción de tanto las células CD8/Tregs como las células CD8/Tregs activadas (Figura 6G y Figura 6H), las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres caracterizados por una disminución en la proporción de células CD8/Tregs y/o CD8/Tregs activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres caracterizados por una disminución en la proporción de células CD8/Tregs. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres caracterizados por una disminución en la proporción de células CD8/Tregs activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer disminuyendo el porcentaje de Tregs en las poblaciones celulares, aumentando de este modo la proporción de células CD8/Tregs. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer disminuyendo el porcentaje de Tregs en las poblaciones celulares, aumentando de este modo la proporción de células CD8/Tregs activadas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del cáncer aumentando la proporción de células CD8/Tregs. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del cáncer aumentando la proporción de células CD8/Tregs activadas.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-1 p. En el cáncer asociado a la colitis, la disminución de la expresión de IL-1 p en los sitios tumorales se ha relacionado con síntomas como un resultado de la enfermedad y morbilidad aumentados [65]. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de IL-1 p, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres caracterizados por una expresión disminuida o ausente de IL-1 p. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer aumentando la expresión de IL-1 p.
Los Ejemplos muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión del Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a). El TNF-a es una citoquina proinflamatoria que se sabe que está implicada en varias vías de señalización para promover la muerte celular. TNF-a inicia la apoptosis uniéndose a su receptor afín, TNFR-1, lo que lleva a una cascada de eventos de escisión en la vía apoptótica. TNF-a también desencadena la necrosis a través de un mecanismo dependiente de quinasa RIP. Como muchos tipos de cáncer tienen vías apoptóticas y necróticas defectuosas, y se sabe que el TNF-a media en estas vías de muerte celular, el TNF-a es un objetivo potencial para la terapia contra el cáncer. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de TNF-a, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer, en particular para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres mediados por la expresión de TNF-a. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar cánceres mediados por la expresión de TNF-a, en particular cánceres con expresión y/o actividad disminuida de TNF-a. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar el cáncer. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar el cáncer aumentando el nivel y/o la actividad de TNF-a.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de mama. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de mama. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de mama. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de mama. En realizaciones preferidas, el cáncer es carcinoma mamario. En realizaciones preferidas, el cáncer es cáncer de mama en estadio IV.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de pulmón. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de pulmón. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de pulmón. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de pulmón. En realizaciones preferidas, el cáncer es carcinoma de pulmón.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de hígado. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, la reducción del crecimiento del tumor o la reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de hígado. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de hígado. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de hígado. En realizaciones preferidas, el cáncer es un hepatoma (carcinoma hepatocelular).
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del melanoma. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del melanoma. En realizaciones preferidas, el melanoma es un melanoma metastásico.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de ovario. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de ovario. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de ovario. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de ovario.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de cuello uterino. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de cuello uterino. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de cuello uterino. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de cuello uterino.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del neuroblastoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del neuroblastoma. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del neuroblastoma. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del neuroblastoma.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del glioblastoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento tumoral, o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del glioblastoma. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del glioblastoma. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del glioblastoma.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de próstata. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de próstata. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de próstata.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades malignas hematológicas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento de enfermedades malignas hematológicas. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades malignas hematológicas. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento de enfermedades malignas hematológicas. En ciertas realizaciones, la enfermedad maligna hematológica es leucemia aguda. En ciertas realizaciones, la enfermedad maligna hematológica es leucemia crónica. En ciertas realizaciones, la enfermedad maligna hematológica es leucemia mielógena aguda. En ciertas realizaciones, la enfermedad maligna hematológica es leucemia mielógena crónica. En ciertas realizaciones, la enfermedad maligna hematológica es leucemia linfocítica aguda. En ciertas realizaciones, la enfermedad maligna hematológica es leucemia linfocítica crónica. En ciertas realizaciones, la enfermedad maligna hematológica es linfoma. En ciertas realizaciones, la enfermedad maligna hematológica es mieloma múltiple. En ciertas realizaciones, la enfermedad maligna hematológica es un síndrome mielodisplásico.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de la leucemia linfocítica crónica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención de la leucemia linfocítica crónica. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del linfoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del linfoma. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del linfoma. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del linfoma. En ciertas realizaciones, el linfoma es linfoma de Hodgkin. En ciertas realizaciones, el linfoma es un linfoma no Hodgkin.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer gástrico. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer gástrico. En realizaciones preferidas, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer gástrico. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer gástrico.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de colon. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer colorrectal. Las composiciones de la invención pueden tener un efecto sobre las células de cáncer de colon y pueden ser eficaces para tratar el cáncer de colon. Las composiciones de la invención pueden tener un efecto sobre las células de cáncer de colon y pueden ser eficaces para tratar el cáncer colorrectal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de colon. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer colorrectal. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de colon. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer colorrectal. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer de colon. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer colorrectal. En realizaciones preferidas, el cáncer es adenocarcinoma colorrectal.
En ciertas realizaciones, las combinaciones terapéuticas de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de riñón (también denominado en la presente cáncer renal). En ciertas realizaciones, las combinaciones terapéuticas de la invención son para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer renal. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de riñón (también denominado en la presente cáncer renal). En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la reducción del tamaño del tumor, reducción del crecimiento del tumor o reducción de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer renal. Los Ejemplos demuestran que las combinaciones terapéuticas de la invención tienen un efecto sobre las células de cáncer renal y pueden ser eficaces para tratar el cáncer renal. En realizaciones preferidas, el cáncer es carcinoma de células renales o carcinoma de células de transición. En algunas realizaciones, el cáncer es del intestino. En algunas realizaciones, el cáncer es de una parte del cuerpo que no es el intestino. En algunas realizaciones, el cáncer no es cáncer del intestino. En algunas realizaciones, el cáncer no es cáncer colorrectal. En algunas realizaciones, el cáncer no es cáncer del intestino delgado. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención se produce en un sitio distinto del intestino. En algunas realizaciones, el tratamiento o la prevención se produce en el intestino y también en un sitio distinto del intestino.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del carcinoma. Las composiciones de la invención pueden ser eficaces para tratar numerosos tipos de carcinoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer no inmunogénico. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del carcinoma. Una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis puede ser eficaz para tratar numerosos tipos de carcinoma. En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer no inmunogénico. Los Ejemplos demuestran que las composiciones de la invención pueden ser eficaces para tratar cánceres no inmunogénicos.
Los efectos terapéuticos de las composiciones de la invención sobre el cáncer pueden estar mediados por un mecanismo proinflamatorio. La expresión de una serie de citoquinas proinflamatorias puede aumentar después de la administración de MRx0029. La inflamación puede tener un efecto supresor del cáncer [66] y las citoquinas proinflamatorias como la TNF-a se están investigando como terapias contra el cáncer [67]. La regulación por incremento de genes como el TNF-a que se muestra en los Ejemplos puede indicar que las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar el cáncer a través de un mecanismo similar. La regulación por incremento de un ligando de CXCR3 como CXCL9) puede indicar que las composiciones de la invención provocan una respuesta de tipo IPNy. IPNy es un potente factor activador de macrófagos que puede estimular la actividad tumoricida [68], y CXCL9, por ejemplo, también tiene efectos anticancerígenos [69-71] Los ejemplos demuestran que la expresión de una serie de citoquinas proinflamatorias puede aumentar después de la administración de MRx0029. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la inflamación en el tratamiento del cáncer. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la inflamación de Th1 en el tratamiento del cáncer. Las células Th1 producen IPNy y tienen potentes efectos anticancerígenos [66]. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un cáncer en estadio temprano, como un cáncer que no ha hecho metástasis, o un cáncer en estadio 0 o estadio 1. Promover la inflamación puede ser más eficaz contra los cánceres en estadio temprano [66]. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para potenciar el efecto de un segundo agente anticancerígeno. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la promoción de la inflamación para mejorar el efecto de un segundo agente anticancerígeno. En ciertas realizaciones, el tratamiento o prevención del cáncer comprende aumentar el nivel de expresión de una o más citoquinas. En ciertas realizaciones, el tratamiento o la prevención del cáncer comprende aumentar el nivel de expresión de una o más citoquinas proinflamatorias. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el tratamiento o la prevención del cáncer comprende aumentar el nivel de expresión de uno o más de IL-1 p, IL-6, MIP-3a, CXCL9, IL-23, MCP-1, GMCSF y TNF-a. En ciertas realizaciones, el tratamiento o prevención del cáncer comprende aumentar el nivel de expresión de uno o más de IL-1 p y MIP-3a. Se sabe que los aumentos en los niveles de expresión de cualquiera de IL-1 p, IL-6 y TNF-a son indicativos de eficacia en el tratamiento contra el cáncer.
Cuando se usa una cepa bacteriana como se describe en la presente en combinación con lipopolisacárido (LPS), puede haber un aumento sinérgico en IL-1 p. Se sabe que el LPS provoca un efecto proinflamatorio. Por tanto, en ciertas realizaciones, el tratamiento o la prevención comprende el uso de una cepa bacteriana como se describe en la presente en combinación con un agente que regula por incremento IL-1 p. En ciertas realizaciones, el tratamiento o la prevención comprende el uso de una cepa bacteriana como se describe en la presente en combinación con LPS. Por consiguiente, una composición de la invención puede comprender adicionalmente un agente que regula por incremento Il-1p. Por consiguiente, una composición de la invención puede comprender adicionalmente LPS.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un paciente que ha recibido quimioterapia con anterioridad. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de un paciente que no ha tolerado un tratamiento de quimioterapia. Las composiciones de la invención pueden ser particularmente adecuadas para tales pacientes.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para prevenir la recaída. Las composiciones de la invención pueden ser adecuadas para la administración a largo plazo. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención de la progresión del cáncer.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de carcinoma de pulmón de células no pequeñas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del carcinoma de pulmón de células pequeñas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del carcinoma de células escamosas. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de adenocarcinoma. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de tumores glandulares, tumores carcinoides o carcinomas indiferenciados.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de hepatoblastoma, colangiocarcinoma, cistoadenocarcinoma colangiocelular o cáncer de hígado resultante de una infección viral.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de carcinoma ductal invasivo, carcinoma ductal in situ o carcinoma lobular invasivo.
En realizaciones adicionales, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de la leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, carcinoma de células basales, cáncer de conducto biliar, cáncer de vejiga, tumor óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales, glioma, vía visual infantil e hipotalámico, linfoma de Hodgkin, melanoma, carcinoma de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de células renales, cáncer de laringe, leucemias, linfomas, mesotelioma, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides, cáncer de faringe, adenoma pituitario, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, retinoblastoma, sarcoma, cáncer testicular, cáncer de tiroides o cáncer uterino. En realizaciones adicionales, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades malignas hematológicas, mieloma múltiple, o síndromes mielodisplásicos.
Las composiciones de la invención pueden ser particularmente eficaces cuando se usan en combinación con agentes terapéuticos adicionales. Los efectos inmunomoduladores de las composiciones de la invención pueden ser eficaces cuando se combinan con agentes anticancerígenos más directos. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende la cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis y un agente anticancerígeno. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende la cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en la estimulación de un cáncer para mejorar su susceptibilidad al tratamiento con un segundo agente anticancerígeno. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende la cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis es para su uso en el tratamiento de un cáncer, como un cáncer de cerebro, aumentando su susceptibilidad al tratamiento con un segundo agente anticancerígeno. El segundo agente anticancerígeno puede administrarse concurrentemente, o puede administrarse después de la composición que comprende la cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, como por lo menos un día, una semana o un mes después.
En realizaciones preferidas, el agente anticancerígeno es un inhibidor del punto de control inmunitario, una inmunoterapia con anticuerpos dirigidos, una terapia con células CAR-T, un virus oncolítico o un fármaco citostático. En realizaciones preferidas, la composición comprende un agente anticancerígeno seleccionado del grupo que consiste de: Yervoy (ipilimumab, b Ms ); Keytruda (pembrolizumab, Merck); Opdivo (nivolumab, BMS); MEDI4736 (AZ/MedImmune); MPDL3280A (Roche/Genentech); Tremelimumab (AZ/MedImmune); CT-011 (pidilizumab, CureTech); BMS-986015 (lirilumab, BMS); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MSB-0010718C (Merck); PF-05082566 (Pfizer); MEDI6469 (AZ/MedImmune); Bm S-986016 (BMS); BMS-663513 (urelumab, BMS); IMP321 (Prima Biomed); LAG525 (Novartis); ARGX-110 (arGEN-X); PF-05082466 (Pfizer); CDX-1127 (varlilumab; CellDex Therapeutics); TRX-518 (GITR Inc.); MK-4166 (Merck); JTX-2011 (Jounce Therapeutics); ARGX-115 (arGEN-X); NLG-9189 (indoximod, NewLink Genetics); INCB024360 (Incyte); IPH2201 (Innate Immotherapeutics/AZ); NLG-919 (NewLink Genetics); anti-VISTA (JnJ); Epacadostat (INCB24360, Incyte); F001287 (Flexus/BMS); CP 870893 (University of Pennsylvania); MGA271 (Macrogenix); Emactuzumab (Roche/Genentech); Galunisertib (Eli Lilly); Ulocuplumab (BMS); BKT140/BL8040 (Biokine Therapeutics); Bavituximab (Peregrine Pharmaceuticals); CC 90002 (Celgene); 852A (Pfizer); VTX-2337 (VentiRx Pharmaceuticals); IMO-2055 (Hybridon, Idera Pharmaceuticals); LY2157299 (Eli Lilly); EW-7197 (Ewha Women’s University, Korea); Vemurafenib (Plexxikon); Dabrafenib (Genentech/GSK); BMS-777607 (BMS); BLZ945 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre); Unituxin (dinutuximab, United Therapeutics Corporation); Blincyto (blinatumomab, Amgen); Cyramza (ramucirumab, Eli Lilly); Gazyva (obinutuzumab, Roche/Biogen); Kadcyla (ado-trastuzumab emtansine, Roche/Genentech); Perjeta (pertuzumab, Roche/Genentech); Adcetris (brentuximab vedotin, Takeda/Millennium); Arzerra (ofatumumab, GSK); Vectibix (panitumumab, Amgen); Avastina (bevacizumab, Roche/Genentech); Erbitux (cetuximab, BMS/Merck); Bexxar (tositumomab-I131, GSK); Zevalin (ibritumomab tiuxetan, Biogen); Campath (alemtuzumab, Bayer); Mylotarg (gemtuzumab ozogamicin, Pfizer); Herceptina (trastuzumab, Roche/Genentech); Rituxan (rituximab, Genentech/Biogen); volociximab (Abbvie); Enavatuzumab (Abbvie); AbT-414 (Abbvie); Elotuzumab (Abbvie/BMS); ALX-0141 (Ablynx); Ozaralizumab (Ablynx); Actimab-C (Actinium); Actimab-P (Actinium); Milatuzumab-dox (Actinium); Emab-SN-38 (Actinium); Naptumonmab estafenatox (Active Biotech); AFM13 (Affimed); AFM11 (Affimed); AGS-16C3F (Agensys); AGS-16M8F (Agensys); AGS-22ME (Agensys); AGS-15ME (Agensys); GS-67E (Agensys); ALXN6000 (samalizumab, Alexion); ALT-836 (Altor Bioscience); AlT-801 (Altor Bioscience); ALT-803 (Altor Bioscience); AMG780 (Amgen); AMG 228 (Amgen); AMG820 (Amgen); AMG172 (Amgen); AMG595 (Amgen); AMG110 (Amgen); AMG232 (adecatumumab, Amgen); AMG211 (Amgen/MedImmune); BAY20-10112 (Amgen/Bayer); Rilotumumab (Amgen); Denosumab (Amgen); AMP-514 (Amgen); MEDI575 (AZ/Med-Immune); MEDI3617 (AZ/MedImmune); MEDI6383 (AZ/MedImmune); MEDI551 (AZ/MedImmune); Moxetumomab pasudotox (AZ/MedImmune); MEDI565 (AZ/MedImmune); MEDI0639 (AZ/MedImmune); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MEDI562 (AZ/MedImmune); AV-380 (AVEO); AV203 (AVEO); AV299 (AVEO); BAY79-4620 (Bayer); Anetumab ravtansina (Bayer); vantictumab (Bayer); BAY94-9343 (Bayer); Sibrotuzumab (Boehringer Ingleheim); BI-836845 (Boehringer Ingleheim); B-701 (BioClin); BIIB015 (Biogen); Obinutuzumab (Biogen/Genentech); BI-505 (Bioinvent); BI-1206 (Bioinvent); TB-403 (Bioinvent); BT-062 (Biotest) BIL-010t (Biosceptre); MDX-1203 (BMS); MDX-1204 (BMS); Necitumumab (BMS); CAN-4 (Cantargia AB); CDX-011 (Celldex); CDX1401 (Celldex); CDX301 (Celldex); U3-1565 (Daiichi Sankyo); patritumab (Daiichi Sankyo); tigatuzumab (Daiichi Sankyo); nimotuzumab (Daiichi Sankyo); DS-8895 (Daiichi Sankyo); DS-8873 (Daiichi Sankyo); DS-5573 (Daiichi Sankyo); MORab-004 (Eisai); MORab-009 (Eisai); MORab-003 (Eisai); MORab-066 (Eisai); LY3012207 (Eli Lilly); LY2875358 (Eli Lilly); LY2812176 (Eli Lilly); LY3012217(Eli Lilly); LY2495655 (Eli Lilly); LY3012212 (Eli Lilly); LY3012211 (Eli Lilly); LY3009806 (Eli Lilly); cixutumumab (Eli Lilly); Flanvotumab (Eli Lilly); IMC-TR1 (Eli Lilly); Ramucirumab (Eli Lilly); Tabalumab (Eli Lilly); Zanolimumab (Emergent Biosolution); FG-3019 (FibroGen); FPA008 (Five Prime Therapeutics); FP-1039 (Five Prime Therapeutics); FPA144 (Five Prime Therapeutics); catumaxomab (Fresenius Biotech); IMAB362 (Ganymed); IMAB027 (Ganymed); HuMax-CD74 (Genmab); HuMax-TFADC (Genmab); GS-5745 (Gilead); GS-6624 (Gilead); OMP-21M18 (demcizumab, GSK); mapatumumab (GSK); IMGN289 (ImmunoGen); IMGN901 (ImmunoGen); IMGN853 (ImmunoGen); IMGN529 (ImmunoGen); IMMU-130 (Immunomedics); milatuzumab-dox (Immunomedics); IMMU-115 (Immunomedics); IMMU-132 (Immunomedics); IMMU-106 (Immunomedics); IMMU-102 (Immunomedics); Epratuzumab (Immunomedics); Clivatuzumab (Immunomedics); IPH41 (Innate Immunotherapeutics); Daratumumab (Janssen/Genmab); CNTO-95 (Intetumumab, Janssen); CNTO-328 (siltuximab, Janssen); KB004 (KaloBios); mogamulizumab (Kyowa Hakko Kirrin); KW-2871 (ecromeximab, Life Science); Sonepcizumab (Lpath); Margetuximab (Macrogenics); Enoblituzumab (Macrogenics); MGD006 (Macrogenics); MGF007 (Macrogenics); MK-0646 (dalotuzumab, Merck); MK-3475 (Merck); Sym004 (Symphogen/Merck Serono); DI17E6 (Merck Serono); MOR208 (Morphosys); MOR202 (Morphosys); Xmab5574 (Morphosys); BPC-1C (ensituximab, Precision Biologics); TAS266 (Novartis); LFA102 (Novartis); BHQ880 (Novartis/Morphosys); QGE031 (Novartis); HCD122 (lucatumumab, Novartis); LJM716 (Novartis); AT355 (Novartis); OMP-21M18 (Demcizumab, OncoMed); OMP52M51 (Oncomed/GSK); OMP-59R5 (Oncomed/GSK); vantictumab (Oncomed/Bayer); CMC-544 (inotuzumab ozogamicin, Pfizer); PF-03446962 (Pfizer); PF-04856884 (Pfizer); PSMA-ADC (Progenics); REGN1400 (Regeneron); REGN910 (nesvacumab, Regeneron/Sanofi); REGN421 (enoticumab, Regeneron/Sanofi); RG7221, RG7356, RG7155, RG7444, RG7116, RG7458, RG7598, RG7599, RG7600, RG7636, RG7450, RG7593, RG7596, DCDS3410A, RG7414 (parsatuzumab), RG7160 (imgatuzumab), RG7159 (obintuzumab), RG7686, RG3638 (onartuzumab), RG7597 (Roche/Genentech); SAR307746 (Sanofi); SAR566658 (Sanofi); SAR650984 (Sanofi); SAR153192 (Sanofi); SAR3419 (Sanofi); SAR256212 (Sanofi), SGN-LIV1A (lintuzumab, Seattle Genetics); SGN-CD33A (Seattle Genetics); SGN-75 (vorsetuzumab mafodotin, Seattle Genetics); SGN-19A (Seattle Genetics) SGN-CD70A (Seattle Genetics); SEA-CD40 (Seattle Genetics); ibritumomab tiuxetan (Spectrum); MLN0264 (Takeda); ganitumab (Takeda/Amgen); CEP-37250 (Teva); TB-403 (Thrombogenic); VB4-845 (Viventia); Xmab2512 (Xencor); Xmab5574 (Xencor); nimotuzumab (YM Biosciences); Carlumab (Janssen); NY-ESO TCR (Adaptimmune); Ma GE-A-10 TCR (Adaptimmune); CTL019 (Novartis); JCAR015 (Juno Therapeutics); KTE-C19 CAR (Kite Pharma); UCART19 (Cellectis); BPX-401 (Bellicum Pharmaceuticals); BPX-601 (Bellicum Pharmaceuticals); ATTCK20 (Unum Therapeutics); cAr-NKG2D (Celyad); Onyx-015 (Onyx Pharmaceuticals); H101 (Shanghai Sunwaybio); DnX-2401 (DNAtrix); Vc N-01 (VCN Biosciences); Colo-Adl (PsiOxus Therapeutics); ProstAtak (Advantagene); Oncos-102 (Oncos Therapeutics); CG0070 (Cold Genesys); Pexa-vac (JX-594, Jennerex Biotherapeutics); GL-ONC1 (Genelux); T-VEC (Amgen); G207 (Medigene); h F10 (Takara Bio); SEPREHVIR (HSV1716, Virttu Biologics); OrienX010 (OrienGene Biotechnology); Reolysin (Oncolytics Biotech); SVV-001 (Neotropix); Cacatak (CVA21, Viralytics); Alimta (Eli Lilly), cisplatin, oxaliplatin, irinotecan, folinic acid, methotrexate, cyclophosphamide, 5-fluorouracilo, Zykadia (Novartis), Tafinlar (GSK), Xalkori (Pfizer), Iressa (AZ), Gilotrif (Boehringer Ingelheim), Tarceva (Astellas Pharma), Halaven (Eisai Pharma), Veliparib (Abbvie), AZD9291 (AZ), Alectinib (Chugai), LDK378 (Novartis), Genetespib (Synta Pharma), Tergenpumatucel-L (NewLink Genetics), GV1001 (Kael-GemVax), Tivantinib (ArQule); Cytoxan (BMS); Oncovin (Eli Lilly); Adriamycin (Pfizer); Gemzar (Eli Lilly); Xeloda (Roche); Ixempra (BMS); Abraxane (Celgene); Trelstar (Debiopharm); Taxotere (Sanofi); Nexavar (Bayer); IMMU-132 (Immunomedics); E7449 (Eisai); Thermodox (Celsion); Cometriq (Exellxis); Lonsurf (Taiho Pharmaceuticals); Camptosar (Pfizer); UFT (Taiho Pharmaceuticals); y TS-1 (Taiho Pharmaceuticals).
En algunas realizaciones, la cepa bacteriana de Megasphaera massiliensis depositada con el número de registro NCIMB 42761 es el único agente terapéuticamente activo en una composición de la invención.
Los inventores han identificado que las cepas bacterianas del género Megasphaera pueden ser particularmente eficaces para tratar o prevenir el cáncer que comprende la señalización de la quinasa relacionada con la señal extracelular (ERK) oncogénica. La quinasa relacionada con la señal extracelular (ERK) es un efector en sentido descendente en la vía de la quinasa de la proteína activada por mitógenos (MAP), una vía de transducción de señales altamente conservada que se encuentra en todos los eucariotas [72]. La vía de la MAP-quinasa regula procesos como la proliferación celular, la diferenciación, la supervivencia y la apoptosis, y la activación aberrante de la vía está estrechamente relacionada con la patogénesis del cáncer. Como se describe en los ejemplos, la administración de composiciones que comprenden cepas de Megasphaera puede inhibir la señalización de ERK en líneas celulares de cáncer; es decir, reduce los niveles celulares de ERK fosforilada con respecto a la proteína ERK total. Los inventores también han identificado que el tratamiento con cepas de Megasphaera puede reducir la supervivencia clonogénica de líneas celulares de cáncer que comprenden señalización de ERK oncogénica, en particular en líneas celulares de melanoma y cáncer colorrectal. Los inventores también han identificado que el tratamiento con cepas de Megasphaera puede inducir la expresión génica de la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2), lo que indica una utilidad particular en el tratamiento de cánceres metastásicos.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer, en donde el cáncer comprende la señalización de ERK oncogénica.
Como se usa en la presente, "señalización de ERK oncogénica" se refiere al cáncer que comprende señalización celular desregulada, como la señalización independiente del estímulo, a través de la vía de la MAP quinasa, cuyo resultado es una señalización hiperactiva por parte de ERK (ya sea la isoforma ERK1 o ERK2, o ambas), que impulsa una proliferación y/o supervivencia aumentada de las células cancerosas. ERK1 está activo (es decir, señalización) cuando se fosforila en las posiciones Thr202 y Tyr204. ERK2 está activo (es decir, señalización) cuando se fosforila en las posiciones Thr173 y Tyr185. Por consiguiente, la "señalización de ERK oncogénica" puede ser el resultado de la presencia de mutaciones oncogénicas en (mutaciones de ganancia de función) o sobreexpresión de reguladores positivos de la vía de la MAP quinasa, o mutaciones oncogénicas en (mutaciones de pérdida de función) o expresión regulada por disminución de reguladores negativos de la vía de la MAP quinasa.
El cáncer que comprende la señalización de ERK oncogénica puede definirse alternativamente como cáncer que “muestra” o “caracterizado por” la señalización de ERK oncogénica. El cáncer que comprende la señalización de ERK oncogénica puede definirse alternativamente como un cáncer en el que se "estimulan", "inducen" o "regulan por incremento" la proliferación y/o la supervivencia de las células malignas mediante la señalización de ERK. El cáncer que comprende ERK oncogénico puede definirse alternativamente como cáncer que comprende, muestra o se caracteriza por la señalización de ERK "independiente del estímulo".
La "mutación oncogénica" abarca cualquier variación de aminoácidos en una proteína, con respecto a la proteína de tipo salvaje, que promueve la proliferación y/o supervivencia de células cancerosas incluyendo, pero no limitado a, sustituciones (incluyendo sustituciones de un solo aminoácido), inserciones y/o deleciones. Como se ha indicado anteriormente, las mutaciones oncogénicas pueden ser mutaciones de pérdida de función o de ganancia de función, dependiendo de la proteína y su función dentro de la vía de la MAP-quinasa. "Sobreexpresión" o "expresión regulada por disminución" se refieren respectivamente al aumento o disminución de la expresión de una proteína en una célula cancerosa con respecto a una célula no cancerosa.
Por consiguiente, los cánceres que comprenden la señalización de ERK oncogénica incluyen aquellos que comprenden una mutación oncogénica en, o sobreexpresión de, BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, s Os , HRAS, KRAS4A, KRAS4B, MEK1, MEK2, ERK1 o ERK2; como BRAF, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 o ERK2. Estas proteínas son reguladores positivos de la vía de MAP quinasa (es decir, oncoproteínas) [72] Por ejemplo, el cáncer puede comprender una mutación oncogénica en BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 o ERK2.
Los cánceres que comprenden la señalización de ERK oncogénica también incluyen aquellos que comprenden (ya sea alternativamente o además de las mutaciones/sobreexpresiones oncogénicas anteriores) una mutación oncogénica o una expresión regulada por disminución de RSK, DUSP1, DUSP5, DUSP6 o SPRY. Estas proteínas son reguladores negativos de la vía MAP quinasa (es decir, proteínas supresoras de tumores) [72].
Cualquier cáncer que comprenda la señalización de ERK oncogénica puede tratarse o prevenirse usando composiciones de la invención, como tumores sólidos o enfermedades malignas hematológicas. Tales cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer colorrectal, melanoma, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, carcinoma de células basales, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, tumor óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales, glioma, vía visual infantil e hipotalámico, linfoma de Hodgkin, carcinoma de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de células renales, cáncer de laringe, leucemias, linfomas, mesotelioma, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides, cáncer de faringe, adenoma hipofisario, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, retinoblastoma, sarcoma, cáncer testicular, cáncer de tiroides o cáncer uterino.
Cualquier cáncer que comprenda la señalización de ERK oncogénica puede tratarse o prevenirse mediante una composición que comprenda una cepa bacteriana del género Megasphaera, y preferiblemente cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de próstata, adenocarcinoma de pulmón como adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, leucemia como leucemia de células pilosas o leucemia mieloide aguda, glioma, astrocitoma pilocítico, cáncer de ovario, cáncer de tiroides papilar o folicular, seminoma, cáncer de hígado, síndrome mielodisplásico, cáncer de riñón o enfermedad de Hodgkin.
En realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer que comprende una mutación oncogénica en BRAF, opcionalmente en donde el cáncer comprende además la sobreexpresión de BRAF. Los inventores han identificado que el tratamiento con cepas de Megasphaera puede inhibir la supervivencia clonogénica, inhibir la señalización de ERK y regular por incremento la expresión del gen MAP2 en líneas celulares de cáncer que comprenden mutaciones de BRAF oncogénicas, en particular la mutación oncogénica BRAF V600E en líneas celulares de cáncer colorrectal y melanoma. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, la invención también proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer que comprende una mutación oncogénica en la posición 600 de BRAF, preferiblemente BRAF V600E. En realizaciones especialmente preferidas, el cáncer es cáncer colorrectal o melanoma.
Además de, o en lugar de, una mutación oncogénica en la posición 600 de BRAF (como V600E), el cáncer puede comprender una mutación oncogénica seleccionada de BRAF K601E, G469A, G469V, L597R, K601N, G464V, N581S, F597Q, A598V, G464R, G466A o G469E; opcionalmente en donde el cáncer es cáncer colorrectal. En otra realización, además de, o en lugar de, la mutación V600E, el cáncer puede comprender una mutación oncogénica seleccionada de BRAF V600K, V600R o V600D; opcionalmente en donde el cáncer es melanoma.
En un aspecto adicional, la invención también proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, para su uso en un método para tratar el cáncer colorrectal, como el cáncer colorrectal metastásico. Como se muestra en los ejemplos, los inventores han descubierto que las cepas de Megasphaera massiliensis pueden inhibir la supervivencia clonogénica y la señalización de ERK en líneas celulares de cáncer colorrectal.
En un aspecto adicional, la invención también proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, para su uso en un método para tratar el melanoma, como el melanoma metastásico. Como se muestra en los ejemplos, los inventores han descubierto que las cepas de Megasphaera massiliensis pueden inhibir la supervivencia clonogénica y la señalización de ERK en líneas celulares de melanoma. Además, la capacidad de las cepas de Megasphaera massiliensis para inducir la expresión del gen MAP2 en líneas celulares de melanoma indica una eficacia particular contra el melanoma metastásico.
En realizaciones preferidas, un inhibidor de BRAF se administra simultáneamente, por separado o secuencialmente, con respecto a la administración de la composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera. Preferiblemente, el inhibidor de BRAF es un inhibidor selectivo de BRAFV600E, preferiblemente seleccionado de Vemurafenib, Dabrafinib o Encorafenib. Más preferiblemente, el inhibidor de BRAF es Vemurafenib.
En un aspecto adicional de la invención, la invención también proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera y un inhibidor de BRAF, preferiblemente los definidos anteriormente, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento o prevención del cáncer.
En otras realizaciones preferidas, un análogo de citidina se administra simultáneamente, por separado o secuencialmente, con respecto a la administración de la composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera. Preferiblemente, el análogo de citidina se selecciona de Azacitidina-c, Decitabina o Zebularina. Más preferiblemente, el análogo de citidina es Azacitidina-c.
En un aspecto adicional, la invención también proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera y un análogo de citidina, preferiblemente los definidos anteriormente, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento o prevención del cáncer.
En otras realizaciones preferidas, un inhibidor de la polimerización de tubulina o un inhibidor de la despolimerización de tubulina se administran simultáneamente, por separado o secuencialmente, con respecto a la administración de la composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera. Preferiblemente, el inhibidor de la polimerización de tubulina o el inhibidor de la despolimerización de tubulina se selecciona de Paclitaxel, Abraxane, Docetaxel, Epotilona, (+-)-Discodermolida, Colchicina, Combretastatina, 2-Metoxiestradiol, E7010, Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina o Vinflunina; más preferiblemente Paclitaxel.
En un aspecto adicional, la invención también proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera y un inhibidor de la polimerización de tubulina o inhibidor de la despolimerización de tubulina, preferiblemente los definidos anteriormente, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento o prevención del cáncer. En un aspecto adicional, la invención también proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en la terapia contra el cáncer aumentando la susceptibilidad del cáncer a un inhibidor de la polimerización o despolimerización de la tubulina, preferiblemente los definidos anteriormente.
En tales realizaciones adicionales, la invención proporciona:
1. Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia del gel de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1, para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer, en particular, en donde el cáncer comprende la señalización oncogénica de ERK.
2. Una composición para su uso de acuerdo con la realización 1, en donde el cáncer comprende una mutación oncogénica en, o sobreexpresión de, BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, F1RAS, KRAS4A, KRAS4B, MEK1, MEK2, ERK1 o ERK2.
3. Una composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en donde el cáncer comprende una mutación oncogénica o una expresión regulada a la baja de RSK, DUSP1, DUSP5, DUSP6 o SPRY.
4. Una composición para su uso de acuerdo con la realización 2, en donde el cáncer comprende una mutación oncogénica o sobreexpresión de BRAF, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 o ERK2.
5. Una composición para su uso de acuerdo con la realización 2, en donde el cáncer comprende una mutación oncogénica en BRAF, NRAS, ARAF, CRAF, EGFR, GRB2, SOS, HRAS, MEK1, MEK2, ERK1 o ERK2.
6. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en donde el cáncer comprende una mutación oncogénica en BRAF o NRAS, opcionalmente en donde el cáncer comprende además la sobreexpresión de BRAF o NRAS.
7. La composición para su uso de acuerdo con la realización 6, en donde el cáncer comprende una mutación oncogénica en BRAF, opcionalmente en donde el cáncer comprende además la sobreexpresión de BRAF.
8. La composición para su uso de acuerdo con la realización 7, en donde el cáncer comprende una mutación oncogénica en la posición 600 de BRAF.
9. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 6-8, en donde el cáncer comprende una mutación oncogénica seleccionada de BRAF V600E, K601E, G469A, G469V, L597R, K601N, G464V, N581S, L597Q, A598V, G464R, G466A o G469E; opcionalmente en donde el cáncer es cáncer colorrectal.
10. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 6-8, en donde el cáncer comprende una mutación oncogénica seleccionada de BRAF V600E, V600K, V600R o V600D; opcionalmente en donde el cáncer es melanoma.
11. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 6-10, en donde el cáncer comprende la mutación oncogénica BRAF V600E.
12. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 6-11, en donde el cáncer comprende la mutación oncogénica NRAS Q61R, opcionalmente en donde el cáncer es melanoma.
13. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en donde el cáncer se selecciona de cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de próstata, adenocarcinoma de pulmón como adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, leucemia como leucemia de células pilosas o leucemia mieloide aguda, glioma, astrocitoma pilocítico, cáncer de ovario, cáncer de tiroides papilar o folicular, seminoma, cáncer de hígado, síndrome mielodisplásico, cáncer de riñón o enfermedad de Hodgkin. 14. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en donde el cáncer es cáncer colorrectal.
15. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1-13, en donde el cáncer es melanoma.
16. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en donde la cepa bacteriana es de la especie Megasphaera massiliensis.
17. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en un método para inhibir la señalización de ERK1 y/o ERK2 en el tratamiento o prevención del cáncer.
18. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en un método para inhibir la fosforilación de ERK1 y/o ERK2 en el tratamiento o prevención del cáncer.
19. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en un método para inducir la expresión del gen MAP2 en el tratamiento o prevención del cáncer.
20. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en un método para reducir el tamaño del tumor, el crecimiento del tumor, prevenir o inhibir la metástasis o prevenir la angiogénesis en el tratamiento o la prevención del cáncer.
21. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en un método para inhibir la metástasis en el tratamiento del cáncer.
22. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en donde el método comprende la administración simultánea, separada o secuencial de un inhibidor de BRAF, con respecto a la administración de la composición.
23. La composición para su uso de acuerdo con la realización 22, en donde BRAF inhibe selectivamente BRAFv600E, preferiblemente en donde el inhibidor de BRAF se selecciona de Vemurafenib, Dabrafinib o Encorafenib.
24. La composición para su uso de acuerdo con la realización 23, en donde el inhibidor de BRAF es Vemurafenib.
25. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en donde el método comprende la administración simultánea, separada o secuencial de un análogo de citidina, con respecto a la administración de la composición.
26. La composición para su uso de acuerdo con la realización 25, en donde el análogo de citidina se selecciona de Azacitidina-c, Decitabina o Zebularina.
27. La composición para su uso de acuerdo con la realización 26, en donde el análogo de citidina es Aazacitidina-c.
28. La composición para su uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en donde el método comprende la administración simultánea, separada o secuencial de un inhibidor de la polimerización de tubulina o un inhibidor de la despolimerización de tubulina, con respecto a la administración de la composición.
29. La composición para su uso de acuerdo con la realización 28, en donde el inhibidor de la polimerización de tubulina o el inhibidor de la despolimerización de tubulina se selecciona de Paclitaxel, Abraxane, Docetaxel, Epotilona, (+)-Discodermolida, Colchicina, Combretastatina, 2-Metoxiestradiol, E7010, Vincristina, Vinblastina, Vinorelbina o Vinflunina.
Preferiblemente, los cánceres que comprenden señalización de ERK oncogénica que pueden tratarse o prevenirse usando composiciones de la invención (en particular, aquellas que comprenden una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis) incluyen, pero no se limitan a, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de próstata, adenocarcinoma de pulmón como adenocarcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, leucemia como leucemia de células pilosas o leucemia mieloide aguda, glioma, astrocitoma pilocítico, cáncer de ovario, cáncer de tiroides papilar o folicular, seminoma, cáncer de hígado, síndrome mielodisplásico, cáncer de riñón y enfermedad de Hodgkin. Se ha informado que tales cánceres comprenden una vía de MAP-quinasa hiperactiva (es decir, señalización ERK oncogénica) [72].
En una realización particular, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer que comprende una mutación oncogénica en BRAF o NRAS, opcionalmente en donde el cáncer comprende además la sobreexpresión de BRAF o NRAS. Preferiblemente, las composiciones de la invención (en particular, aquellas que comprenden una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis) son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer que comprende una mutación oncogénica en BRAF y la sobreexpresión opcional de BRAF.
Las mutaciones oncogénicas en BRAF incluyen V600E, K601E, G469A, G469V, F597R, K601N, G464V, N581S, F597Q, A598V, G464R, G466A o G469E, que se han identificado en cánceres colorrectales [73], y las composiciones de las composiciones de la invención (en particular, las que comprenden una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis) pueden usarse para tratar o prevenir tales cánceres. Otras mutaciones oncogénicas en BRAF incluyen V600E, V600K, V600R o V600D, que se han identificado en melanomas [74], y las composiciones de las composiciones de la invención (en particular, las que comprenden una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis) pueden usarse para tratar o prevenir tales cánceres. Los aminoácidos en BRAF se numeran de acuerdo con la entrada P15056 de UniProt [75] (BRAF de tipo salvaje).
En una realización especialmente preferida, las composiciones de la invención (en particular, aquellas que comprenden una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis) son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer que comprende la mutación BRAF V600E. Las líneas celulares de cáncer SKMEF28, 451Lu y HT29 comprenden esta mutación en BRAF, y se descubrió que una cepa de Megasphaera de los Ejemplos inhibía la supervivencia clonogénica, inhibía la señalización de ERK e inducía la expresión del gen MAP2 en dichas líneas celulares. El cáncer puede comprender además la mutación oncogénica NRAS Q61R. La línea celular de cáncer SKMEL2 comprende esta mutación en NRAS, y se descubrió que una cepa de Megasphaera de los Ejemplos inducía la expresión del gen MAP2 en esta línea celular.
La línea celular HT29 usada en los Ejemplos es una línea celular de cáncer colorrectal, y se descubrió que una cepa de Megasphaera inhibía la supervivencia clonogénica e inhibía la señalización de ERK en esta línea celular. Por lo tanto, en realizaciones especialmente preferidas, las composiciones de la invención (en particular, las que comprenden una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis) son para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer colorrectal, como el cáncer colorrectal que comprende la mutación BRAF V600E.
Las líneas celulares SKMEL2 y SKMEL28 y 451Lu usadas en los Ejemplos son líneas celulares de melanoma, y se descubrió que una cepa de Megasphaera inhibía la supervivencia clonogénica, inhibía la señalización de ERK e inducía la expresión del gen MAP2 en dichas líneas celulares. Por lo tanto, en realizaciones especialmente preferidas, las composiciones de la invención (en particular, aquellas que comprenden una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis) se usan para tratar o prevenir el melanoma, como el melanoma que comprende la mutación BRAF V600E.
En otro aspecto, la composición de la invención comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, para su uso en un método de tratamiento del cáncer colorrectal. En otro aspecto, la composición de la invención comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis, para su uso en un método de tratamiento del melanoma.
En cualquiera de los aspectos y realizaciones detallados anteriormente, la composición de la invención (en particular, una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis) es preferiblemente para su uso en el tratamiento de un cáncer metastásico. Como se informa en los Ejemplos, se descubrió que una cepa de Megasphaera regulaba por incremento la expresión del gen MAP2. Se ha descubierto que MAP2 se expresa en gran medida en los melanomas cutáneos primarios, pero tiene una expresión reducida en los melanomas metastásicos [76]. Se ha propuesto que la expresión aumentada de proteínas estabilizadoras de microtúbulos o el tratamiento con proteínas estabilizadoras de microtúbulos como MAP2 pueden interferir con la inestabilidad dinámica de los microtúbulos que se requiere durante la división celular. Por lo tanto, se cree que la regulación por incremento de MAP2 dificulta la división celular y retrasa el crecimiento tumoral en el cáncer [76], lo que indica que las composiciones de la invención pueden tener un uso particular en el tratamiento de cánceres metastásicos.
Como se demuestra en los Ejemplos, las composiciones de la invención que comprenden una cepa de Megasphaera tienen los efectos de inducir la expresión del gen MAP2 e inhibir la señalización de ERK en líneas celulares de melanoma y cáncer colorrectal. Por lo tanto, las composiciones de la invención son útiles en métodos para inhibir la señalización de ERK, como la señalización de ERK1 y/o ERK2, en el tratamiento o prevención de cánceres que comprenden la señalización de ERK oncogénica, como se ha definido anteriormente. Las composiciones de la invención también son útiles en métodos para inhibir la fosforilación de ERK, como la fosforilación de ERK1 y/o ERK2, en el tratamiento o prevención de tales cánceres. Las composiciones de la invención también son útiles en métodos para inducir la expresión del gen MAP2 en el tratamiento o prevención de tales cánceres. La expresión del gen MAP2 se ha asociado con una sensibilidad aumentada del cáncer a compuestos dirigidos a microtúbulos como Paclitaxel [77]. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden usarse para aumentar la susceptibilidad de tales cánceres a un inhibidor de la polimerización o despolimerización de tubulina, en particular Paclitaxel. Las composiciones de la invención también son útiles en métodos para reducir el tamaño del tumor, reducir el crecimiento del tumor, prevenir o inhibir la metástasis o prevenir la angiogénesis en el tratamiento o la prevención de cánceres que comprenden la señalización de ERK oncogénica. Debido a los efectos sobre la expresión del gen MAP2 demostrados en los Ejemplos, las composiciones de la invención son preferiblemente para su uso en métodos de inhibición de metástasis en el tratamiento de tales cánceres.
En un aspecto adicional, una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera es para su uso en un método para inhibir la señalización de ERK1 y/o ERK2 en el tratamiento o la prevención del cáncer. En un aspecto adicional, una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera es para su uso en un método para inhibir la fosforilación de ERK1 y/o ERK2 en el tratamiento o prevención del cáncer. En un aspecto adicional, una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera es para su uso en un método para inducir la expresión del gen MAP2 en el tratamiento o prevención del cáncer. En dichos aspectos adicionales, preferiblemente los cánceres se caracterizan como se ha detallado anteriormente ("Cánceres y características de los mismos").
En ciertas realizaciones, la composición de la invención es para su uso en el tratamiento del cáncer de intestino delgado, como el adenocarcinoma de intestino delgado. La línea celular HT29 tratada con metotrexato usada en los ejemplos tiene un fenotipo que se asemeja a las células epiteliales del intestino delgado y se demostró que las composiciones de la invención tienen un efecto útil sobre tales células. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para promover la apoptosis en el tratamiento o prevención del cáncer, en particular del cáncer de intestino delgado.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención es para su uso en un método para inducir la expresión del gen GPR109a en el tratamiento o la prevención del cáncer.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención es para su uso en un método para aumentar los niveles de IL-8 en el tratamiento o la prevención del cáncer.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención es para su uso en el tratamiento del cáncer colorrectal, como el adenocarcinoma colorrectal. La línea celular Caco-2 utilizada en los ejemplos es una línea celular de adenocarcinoma colorrectal y se demostró que las composiciones de la invención tienen un efecto útil sobre tales células.
En ciertas realizaciones, las composiciones son para su uso en el tratamiento o prevención del melanoma metastásico, el cáncer de pulmón de células pequeñas o el carcinoma de pulmón adenoescamoso. El efecto sobre NSE que se muestra en los ejemplos sugiere que las composiciones de la invención pueden ser especialmente eficaces contra estos cánceres.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención no es para su uso en el tratamiento del cáncer. En ciertas realizaciones, la composición de la invención es para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno que no es cáncer.
Uso como adyuvante de vacunas
Los Ejemplos muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión del Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a). Se sabe que el TNF-a es importante para las respuestas a las vacunas. Por ejemplo, se ha demostrado que se requiere el TNF-a para una respuesta vacunal eficaz en la vacunación contra la gripe de la población de edad avanzada [78]. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de TNF-a, las composiciones de la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvantes de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de TNF-a. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas en la terapia contra la gripe. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición para administrar en combinación con un antígeno. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su administración a un paciente poco antes o después de la vacunación.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-6. La expresión de IL-6 aumentada se ha asociado con respuestas a vacunas para muchas enfermedades. Por ejemplo, los monocitos inflamatorios CD14+CD16- produjeron IL-6 después de que se administrase una vacuna contra la gripe a adultos [79], y los niveles más altos de IL-6 se asociaron con el logro de una respuesta vacunal a una vacuna contra la gripe [80]. Además, se produjo IL-6 después de la inyección del sistema adyuvante AS03 [81] y se demostró que la regulación por disminución de IL-6 en ratones reduce la respuesta de las células T auxiliares después de la administración de una vacuna contra la tuberculosis [82]. Como se demostró que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de IL-6, las composiciones de la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas en la terapia contra la tuberculosis.
Además, se ha demostrado que la expresión de IL-6 y TNF-a se correlaciona con la eficacia de una vacuna terapéutica contra el VIH [Huang et al], una vacuna contra la tuberculosis y una vacuna contra la clamidia [83]. Su et al. [84] demostraron que la coinoculación de IL-6 o TNF-a con la vacuna de ADN contra el FMDV dio como resultado un aumento de la expresión de IFN-y por las células T CD4+ y CD8+, una mayor expresión de IL-4 en las células T CD4+ y una mayor expresión de la respuesta citotóxica específica del antígeno. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de IL-6 y TNF-a, las composiciones de la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de TNF-a. En una realización, las composiciones de la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de IL-6. En una realización particular, las composiciones de la invención pueden ser útiles como adyuvante de vacunas aumentando el nivel y/o actividad de TNF-a e IL-6. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas en la terapia del VIH. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas en la terapia de clamidia.
Los Ejemplos muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de MIP-3a. Se ha demostrado que MIP-3a aumenta la respuesta a una vacuna contra el VIH [85]. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de MIP-3a, las composiciones de la invención pueden ser útiles como adyuvante de vacunas.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-1 p. Li et al. [86] demostraron que el adyuvante hidróxido de aluminio activaba la secreción de IL-1 p y sugirieron que la propia IL-1 p puede actuar como adyuvante. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de IL-1 p, las composiciones de la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. Los ejemplos muestran que la administración de las composiciones de la invención puede aumentar la proporción de células T CD8+ a Tregs. Se ha demostrado que los adyuvantes estimulan las células T CD8+ [87] y como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la proporción de células T CD8+ a Tregs, las composiciones de la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvantes de vacunas aumentando la proporción de células T CD8+ a Tregs.
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-8. El aumento de la expresión de 11-8 se ha asociado con respuestas a vacunas para muchas enfermedades. Por ejemplo, los niveles más altos de IL-8 se asociaron con el logro de una respuesta vacunal a una vacuna contra la gripe aviar [88]. Además, la IL-8 sirve como adyuvante molecular en un modelo de vacunación con ADN [89]. Por lo tanto, la IL-8 puede usarse como inmunoestimulante para potenciar la eficacia inmunitaria de, por ejemplo, una vacuna contra la gripe aviar. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de IL-8, las composiciones de la invención pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvantes de vacunas aumentando el nivel y/o la actividad de IL-8. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvante de vacunas en la terapia contra la gripe. En algunas realizaciones, cuando se usan como adyuvantes de vacunas, las composiciones de la invención se administrarán por sí solas para proporcionar un efecto adyuvante para un antígeno que se ha administrado por separado al paciente. En ciertas realizaciones, la composición de la invención se administra por vía oral, mientras que el antígeno se inyecta por vía parenteral.
Las composiciones de la invención pueden usarse para potenciar una respuesta inmunitaria a cualquier antígeno útil. Ejemplos de antígenos para su uso con la invención incluyen: antígenos virales, como proteínas de superficie virales; antígenos bacterianos, como antígenos proteicos y/o sacáridos; antígenos fúngicos; antígenos de parásitos; y antígenos tumorales. La invención es particularmente útil para vacunas contra el virus de la gripe, VIH, anquilostomiasis, virus de la hepatitis B, virus del herpes simple, rabia, virus respiratorio sincitial, citomegalovirus, Staphylococcus aureus, clamidia, coronavirus del SARS, virus de la varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, virus de Epstein Barr, virus del papiloma humano, etc. Antígenos adicionales para su uso con la invención incluyen antígenos de glicoproteína y lipoglicano, antígenos de arqueas, antígeno de melanoma E (MAGE), antígeno carcinoembrionario (CEA), MUC-1, HER2, sialilTn (STn), transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), gen del tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno prostático específico (PSA), antígenos del virus de Epstein-Barr, neoantígenos, oncoproteínas, amiloide-beta, Tau, PCSK9 y sustancias que crean hábito, por ejemplo, nicotina, alcohol u opiáceos.
Los antígenos preferidos para su uso con la invención incluyen antígenos patógenos y antígenos tumorales. Un antígeno provocará una respuesta inmunitaria específica para el antígeno que será eficaz para proteger contra la infección por el patógeno o atacar el tumor. Los antígenos pueden ser, por ejemplo, péptidos o polisacáridos.
La invención también proporciona el uso de: (i) una preparación acuosa de un antígeno; y (ii) una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, preferiblemente la especie Megasphaera massiliensis, en la fabricación de un medicamento para obtener una respuesta inmunitaria en un paciente.
La respuesta inmunitaria provocada por estos métodos y usos incluirá generalmente una respuesta de anticuerpos, preferiblemente una respuesta de anticuerpos protectores.
En algunas realizaciones, se manipula una cepa bacteriana del género Megasphaera para que presente un antígeno. La presentación de un antígeno en la cepa bacteriana de la invención puede maximizar las actividades inmunoestimuladoras y potenciar adicionalmente la respuesta inmunitaria protectora generada contra el antígeno. Además, la fabricación y el suministro de productos terapéuticos que comprenden un antígeno y una bacteria de la invención pueden ser más eficientes y eficaces de esta manera que cuando cada antígeno y la composición que comprende la cepa bacteriana se fabrican y suministran por separado. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera que presenta un antígeno, por ejemplo, en su superficie celular. En algunas realizaciones, la composición que comprende la cepa bacteriana que presenta un antígeno es para su uso como antígeno vacunal. En algunas realizaciones, el antígeno se deriva de VIH, anquilostomiasis, virus de la hepatitis B, virus del herpes simple, rabia, virus respiratorio sincitial, citomegalovirus, Staphylococcus aureus, clamidia, coronavirus del SARS, virus de la varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, virus de Epstein Barr o virus del papiloma humano. En algunas realizaciones, el antígeno es un antígeno de glicoproteína, antígeno de lipoglicano, antígeno de arqueas, antígeno de melanoma E (MAGE), antígeno carcinoembrionario (CEA), MUC-1, HER2, sialil-T n (STn), transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), gen del tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno prostático específico (PSA), antígenos del virus de Epstein-Barr, neoantígenos, oncoproteínas, amiloide-beta, Tau, PCSK9 y sustancias que crean hábito, por ejemplo, nicotina, alcohol u opiáceos y similares.
En algunas realizaciones, las bacterias de la invención expresan uno o más antígenos. Generalmente, el antígeno se expresará de manera recombinante y será heterólogo para las bacterias de la invención. Por lo tanto, la invención proporciona una cepa bacteriana del género Megasphaera que expresa un antígeno heterólogo. El antígeno puede ser parte de un polipéptido de fusión expresado con uno o más polipéptidos homólogos a las bacterias. En algunas realizaciones, las bacterias expresan el antígeno como un polipéptido no de fusión. En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una célula de una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la célula expresa un antígeno heterólogo. En algunas realizaciones, la composición es para su uso como vacuna. En algunas realizaciones, la invención proporciona una célula de una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la célula expresa un antígeno heterólogo. En algunas realizaciones, la célula se usa como una vacuna.
Los antígenos ejemplares para su uso con la invención incluyen: antígenos virales, como proteínas de superficie viral; antígenos bacterianos, como antígenos proteicos y/o sacáridos; antígenos fúngicos; antígenos de parásitos; y antígenos tumorales. Antígenos adicionales para expresar en una cepa bacteriana del género Megasphaera incluyen antígenos de glicoproteína y lipoglicano, antígenos de arqueas, antígeno de melanoma E (MAGE), antígeno carcinoembrionario (CEA), MUC-1, HER2, sialil-Tn (STn), transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), gen del tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno prostático específico (PSA), antígenos del virus de Epstein-Barr, neoantígenos, oncoproteínas, amiloide-beta, Tau, PCSK9 y sustancias que crean hábito, por ejemplo, nicotina, alcohol, opiáceos o similares.
La invención también puede ser útil para potenciar la respuesta a las vacunas contra enfermedades no transmisibles como la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos, en cuyo caso el antígeno para su uso con la invención puede ser amiloide-beta o Tau. Otros antígenos de este tipo para enfermedades no transmisibles incluyen PCSK9 (para el tratamiento del colesterol elevado).
La invención también puede ser útil para potenciar la respuesta a las vacunas contra las sustancias que crean hábito, por ejemplo, nicotina, alcohol u opiáceos.
Terapias celulares
Terapia de células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR-T)
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede llevar a un aumento en la expresión de IL-6. El aumento de la expresión de IL-6 se ha correlacionado con la respuesta a la terapia con CD19 CAR-T de la leucemia linfocítica crónica. Un aumento en la IL-6 en suero se ha asociado con la expansión de las células CAR-T, mientras que la inhibición de la IL-6 se ha asociado con la inhibición de la proliferación de las células CAR-T [90]. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención aumenta la expresión de IL-6, las composiciones de la invención pueden ser útiles en terapia celular, en particular en terapia celular CAR-T. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en terapia celular. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en terapia celular CAR-T. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de leucemia linfocítica crónica.
Sorprendentemente, los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención redujo selectivamente el porcentaje de Tregs en una población de PBMC (Figura 6C). Se ha demostrado que el agotamiento selectivo de Tregs mejora la eficacia de los linfocitos citotóxicos [91]. Las células CAR-T son un subconjunto de linfocitos citotóxicos y, por lo tanto, se cree que el agotamiento selectivo de Tregs es eficaz en la terapia con células CAR-T. Como se ha demostrado que la administración de las composiciones de la invención agota las Tregs, las composiciones de la invención pueden ser útiles en terapia celular, en particular en terapia con células CAR-T.
Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser útiles en la terapia celular, en particular para potenciar la respuesta a una terapia celular.
Terapia con células madre mesenquimales (MSC)
Se ha informado que la terapia con células madre mesenquimales (MSC) tiene propiedades inmunoestimuladoras. Cuando las MSC se tratan con LPS, regulan por incremento las citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-8, lo que provoca una mayor proliferación de células B [92]. Por lo tanto, como se ha demostrado que las composiciones de la invención aumentan la expresión de IL-6, pueden ser útiles en combinación con la terapia celular con MSC.
Terapia de trasplante de células madre
Se ha informado que, en lugar de usar células madre no diferenciadas en la terapia de trasplante de células madre, puede ser beneficioso diferenciar las células madre hasta cierto punto antes del trasplante. Por ejemplo, Heng et al. [93] informaron que la diferenciación cardiomiogénica de las células madre puede ser beneficiosa ya que tiene una mayor eficiencia de injerto, una regeneración de los miocitos mejorada y una restauración aumentada de la función cardíaca. Como la administración de las composiciones de la invención inició la diferenciación neuronal en células de neuroblastoma no diferenciadas, las composiciones de la invención pueden ser útiles para la diferenciación de células madre en la terapia de trasplante de células madre.
Inmunosenescencia
Los Ejemplos también muestran que la administración de las composiciones de la invención puede agotar selectivamente las Tregs y aumentar el número de células B (Figura 6C y Figura 6F). Fulop et al. [94] identificaron que un aumento en el número de células Tregs y una disminución en el número de células B están asociados con el envejecimiento en el sistema inmunitario adaptativo. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden usarse para prevenir o retrasar la inmunosenescencia. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención de la inmunosenescencia. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia caracterizada por un aumento en el número de células Tregs. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia caracterizada por una disminución en el número de células B. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia caracterizada por un aumento en el número de células Tregs y una disminución en el número de células B. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia disminuyendo el número de células Tregs. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia aumentando el número de células B. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso de la inmunosenescencia disminuyendo el número de células Tregs y aumentando el número de células B. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades provocadas por inmunosenescencia. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el envejecimiento retrasando y/o previniendo la inmunosenescencia.
Además, se ha propuesto que los adyuvantes de las vacunas pueden superar la inmunosenescencia [95]. Como las composiciones de la invención son adecuadas para su uso como adyuvante de vacunas, las composiciones de la invención pueden ser útiles para prevenir o retrasar la inmunosenescencia. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso en el retraso y/o prevención de la inmunosenescencia como adyuvante de vacunas. En otra realización, las composiciones de la invención son para su uso como adyuvantes de vacunas, en donde las composiciones retrasan y/o previenen la inmunosenescencia.
Las enfermedades que están asociadas con la inmunosenescencia incluyen enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, cáncer, diabetes mellitus tipo 2 [96] y trastornos autoinmunes [97] En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares al retrasar y/o prevenir la inmunosenescencia. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en particular la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, al retrasar y/o prevenir la inmunosenescencia. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento del cáncer al retrasar y/o prevenir la inmunosenescencia. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 al retrasar y/o prevenir la inmunosenescencia. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de trastornos autoinmunes. En una realización, las composiciones de la invención son para su uso en el tratamiento de trastornos autoinmunes al retrasar y/o prevenir la inmunosenescencia.
Modos de administración
Preferiblemente, las composiciones de la invención son para su administración en el tracto gastrointestinal para permitir el suministro y/o la colonización parcial o total del intestino con la cepa bacteriana de la invención. Generalmente, las composiciones de la invención se administran por vía oral, pero pueden administrarse por vía rectal, intranasal o por vía bucal o sublingual.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden administrarse como una espuma, un aerosol o un gel.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden administrarse como un supositorio, como un supositorio rectal, por ejemplo en forma de aceite de teobroma (manteca de cacao), grasa dura sintética (por ejemplo, suppocire, witepsol), glicerogelatina, composición de polietilenglicol o glicerina de jabón.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención se administra al tracto gastrointestinal a través de un tubo, como un tubo nasogástrico, un tubo orogástrico, un tubo gástrico, un tubo de yeyunostomía (tubo en J), una gastrostomía endoscópica percutánea (PEG) o un puerto, como como puerto de pared torácica que proporciona acceso al estómago, yeyuno y otros puertos de acceso adecuados.
Las composiciones de la invención pueden administrarse una vez o pueden administrarse secuencialmente como parte de un régimen de tratamiento. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para su administración diaria.
En ciertas realizaciones de la invención, el tratamiento de acuerdo con la invención va acompañado de una evaluación del microbiota intestinal del paciente. El tratamiento puede repetirse si no se logra el suministro y/o la colonización parcial o total con la cepa de la invención de tal manera que no se observa eficacia, o puede suspenderse el tratamiento si el suministro y/o la colonización parcial o total tiene éxito y se observa eficacia.
En ciertas realizaciones, la composición de la invención puede administrarse a un animal preñado, por ejemplo, un mamífero como un humano, para reducir la probabilidad de que se desarrolle cáncer en su hijo in utero y/o después de su nacimiento.
Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente al que se le ha diagnosticado una enfermedad o afección mediada por una actividad inmunitaria reducida, o que se ha identificado como en riesgo de una enfermedad o afección mediada por una actividad inmunitaria reducida. Las composiciones también pueden administrarse como medida profiláctica para prevenir el desarrollo de enfermedades o afecciones mediadas por una actividad inmunitaria reducida en un paciente sano.
Las composiciones de la invención pueden administrarse a un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer, o que se ha identificado que tiene riesgo de cáncer. Por ejemplo, el paciente puede tener una colonización reducida o ausente por Megasphaera, y en particular Megasphaera massiliensis.
Las composiciones de la invención pueden administrarse como un producto alimenticio, como un suplemento nutricional.
Generalmente, las composiciones de la invención son para el tratamiento de humanos, aunque pueden usarse para tratar animales que incluyen mamíferos monogástricos como aves, cerdos, gatos, perros, caballos o conejos. Las composiciones de la invención pueden ser útiles para mejorar el crecimiento y el rendimiento de los animales. Si se administra a animales, puede usarse alimentación forzada oral.
Composiciones
Generalmente, la composición de la invención comprende bacterias. En realizaciones preferidas de la invención, la composición se formula en forma secada por congelación. Por ejemplo, la composición de la invención puede comprender gránulos o cápsulas de gelatina, por ejemplo cápsulas de gelatina dura, que comprenden una cepa bacteriana de la invención.
Preferiblemente, la composición de la invención comprende bacterias liofilizadas. La liofilización de bacterias es un procedimiento bien establecido y la orientación relevante está disponible, por ejemplo, en las referencias [98, 100].
Alternativamente, la composición de la invención puede comprender un cultivo bacteriano vivo activo.
En realizaciones preferidas, la composición de la invención se encapsula para permitir la administración de la cepa bacteriana al intestino. La encapsulación protege la composición de la degradación hasta la administración en la localización objetivo mediante, por ejemplo, la ruptura con estímulos químicos o físicos como presión, actividad enzimática o disgregación física, que pueden desencadenarse por cambios en el pH. Puede usarse cualquier método de encapsulación apropiado. Las técnicas de encapsulación ejemplares incluyen atrapamiento dentro de una matriz porosa, unión o adsorción sobre superficies portadoras sólidas, autoagregación por floculación o con agentes de reticulación y contención mecánica detrás de una membrana microporosa o una microcápsula. La orientación sobre la encapsulación que puede ser útil para preparar composiciones de la invención está disponible en, por ejemplo, las referencias [101] y [102].
La composición puede administrarse por vía oral y puede estar en forma de comprimido, cápsula o polvo. Se prefieren los productos encapsulados porque las Megasphaera son anaerobias. Pueden incluirse otros ingredientes (como la vitamina C, por ejemplo), como captadores de oxígeno y sustratos prebióticos para mejorar la administración y/o la colonización parcial o total y la supervivencia in vivo. Alternativamente, la composición probiótica de la invención puede administrarse por vía oral como un producto alimenticio o nutricional, como leche o producto lácteo fermentado a base de suero, o como un producto farmacéutico.
La composición puede formularse como un probiótico.
Una composición de la invención incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana de la invención. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana es suficiente para ejercer un efecto beneficioso sobre un paciente. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana puede ser suficiente para dar como resultado la administración y/o colonización parcial o total del intestino del paciente.
Una dosis diaria adecuada de las bacterias, por ejemplo para un humano adulto, puede ser de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias (UFC); por ejemplo, de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1010 UFC; en otro ejemplo de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1010 UFC; en otro ejemplo de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1011 UFC; en otro ejemplo de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1010 UFC; en otro ejemplo de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1011 UFC.
En ciertas realizaciones, la dosis de la bacteria es de por lo menos 109 células al día, como por lo menos 1010, por lo menos 1011 o por lo menos 1012 células al día.
En ciertas realizaciones, la composición contiene la cepa bacteriana en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1011 UFC/g, con respecto al peso de la composición; por ejemplo, de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1010 UFC/g. La dosis puede ser de, por ejemplo, 1 g, 3 g, 5 g y 10 g.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cantidad de la cepa bacteriana es de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias por gramo con respecto al peso de la composición.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra a una dosis de entre 500 mg y 1000 mg, entre 600 mg y 900 mg, entre 700 mg y 800 mg, entre 500 mg y 750 mg o entre 750 mg y 1000 mg. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde las bacterias liofilizadas de la composición farmacéutica se administran a una dosis de entre 500 mg y 1000 mg, entre 600 mg y 900 mg, entre 700 mg y 800 mg, entre 500 mg y 750 mg o entre 750 mg y 1000 mg.
Típicamente, un probiótico, como la composición de la invención, se combina opcionalmente con por lo menos un compuesto prebiótico adecuado. Un compuesto prebiótico es habitualmente un carbohidrato no digerible, como un oligo- o polisacárido, o un alcohol de azúcar, que no se degrada ni se absorbe en el tracto digestivo superior. Los prebióticos conocidos incluyen productos comerciales como inulina y transgalacto-oligosacáridos.
En ciertas realizaciones, la composición probiótica de la presente invención incluye un compuesto prebiótico en una cantidad de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 30% en peso, con respecto a la composición en peso total (por ejemplo, del 5 al 20% en peso). Los carbohidratos pueden seleccionarse del grupo que consiste de: fructo-oligosacáridos (o FOS), fructo-oligosacáridos de cadena corta, inulina, isomaltoligosacáridos, pectinas, xilo-oligosacáridos (o XOS), quitosano-oligosacáridos (o COS), beta-glucanos, goma de almendra modificada y almidones resistentes, polidextrosa, D-tagatosa, fibras de acacia, algarroba, avena y fibras de cítricos. En un aspecto, los prebióticos son los fructo-oligosacáridos de cadena corta (por simplicidad mostrados a continuación como FOSs-c.c.); dichos FOSs-c.c. son carbohidratos no digeribles, obtenidos generalmente por la conversión de azúcar de remolacha y que incluyen una molécula de sacarosa a la que se unen tres moléculas de glucosa.
Las composiciones de la invención pueden comprender excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de tales excipientes adecuados pueden encontrarse en la referencia [103]. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en la referencia [104]. Los ejemplos de portadores adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua. La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de administración pretendida y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además del portador, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente de solubilización adecuado. Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, betalactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. En la composición farmacéutica pueden proporcionarse conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión.
Las composiciones de la invención pueden formularse como un producto alimenticio. Por ejemplo, un producto alimenticio puede proporcionar un beneficio nutricional además del efecto terapéutico de la invención, como en un suplemento nutricional. De manera similar, un producto alimenticio puede formularse para mejorar el sabor de la composición de la invención o para hacer que la composición sea más atractiva para el consumo al ser más similar a un producto alimenticio común, que a una composición farmacéutica. En ciertas realizaciones, la composición de la invención se formula como un producto a base de leche. El término "producto a base de leche" significa cualquier producto a base de leche o suero líquido o semisólido que tenga un contenido variable de grasa. El producto a base de leche puede ser, por ejemplo, leche de vaca, leche de cabra, leche de oveja, leche desnatada, leche entera, leche recombinada a partir de leche en polvo y suero sin ningún procesamiento, o un producto procesado, como yogur, leche cuajada, cuajada, leche agria, leche entera agria, leche de mantequilla y otros productos de leche agria. Otro grupo importante incluye las bebidas lácteas, como las bebidas de suero, las leches fermentadas, las leches condensadas, las leches infantiles o para bebés; leches aromatizadas, helados; alimentos que contienen leche, como dulces.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención contienen una única cepa o especie bacteriana y no contienen ninguna otra cepa o especie bacteriana. Tales composiciones pueden comprender solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de otras cepas o especies bacterianas. Tales composiciones pueden ser un cultivo que esté sustancialmente libre de otras especies de organismos.
Las composiciones para su uso de acuerdo con la invención pueden requerir o no aprobación de comercialización.
En algunos casos, la cepa bacteriana liofilizada se reconstituye antes de la administración. En algunos casos, la reconstitución se realiza mediante el uso de un diluyente descrito en la presente.
Las composiciones de la invención pueden comprender excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto con necesidad de ello; y en donde el trastorno es cáncer, como neuroblastoma, cáncer de cerebro, melanoma, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado o cáncer gástrico. En una realización adicional, el cáncer es cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, leucemia linfocítica crónica, linfoma o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por MAP2. En realizaciones preferidas, dicha enfermedad o afección es cáncer, como neuroblastoma, cáncer de cerebro, melanoma, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado o cáncer gástrico. En una realización adicional, el cáncer es cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, leucemia linfocítica crónica, linfoma o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por tubulina p3. En realizaciones preferidas, dicha enfermedad o afección es cáncer, como neuroblastoma, cáncer de cerebro, melanoma, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado o cáncer gástrico. En una realización adicional, el cáncer es cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, leucemia linfocítica crónica, linfoma o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por DRD2. En realizaciones preferidas, dicha enfermedad o afección es cáncer como neuroblastoma, cáncer de cerebro, melanoma, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado o cáncer gástrico. En una realización adicional, el cáncer es cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, leucemia linfocítica crónica, linfoma o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por HDAC. En realizaciones preferidas, dicha enfermedad o afección es cáncer, como neuroblastoma, cáncer de cerebro, melanoma, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado o cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, linfocito crónico leucemia, linfoma o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por citoquinas proinflamatorias, como IL-1 p, TNF-a, MIP-3a, IL-23 o IL-6. En una realización preferida, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por TNF-a. En una realización preferida, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por IL-8. En una realización preferida, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por CD11b. En realizaciones preferidas, dicha enfermedad o afección es cáncer, como neuroblastoma, cáncer de cerebro, melanoma, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado o cáncer gástrico. En una realización adicional, dicho cáncer es cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, leucemia linfocítica crónica, linfoma o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana de la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en donde la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por Casp3. En realizaciones preferidas, dicha enfermedad o afección es cáncer, como neuroblastoma, cáncer de cerebro, melanoma, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado o cáncer gástrico.
En una realización adicional, dicho cáncer es cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, leucemia linfocítica crónica, linfoma o enfermedades malignas hematológicas.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la cantidad de la cepa bacteriana es de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias por gramo con respecto al peso de la composición.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra a una dosis de 1 g, 3 g, 5 g o 10 g.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde la composición se administra mediante un método seleccionado del grupo que consiste de oral, rectal, subcutáneo, nasal, bucal y sublingual.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un portador seleccionado del grupo que consiste de lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol y sorbitol.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un diluyente seleccionado del grupo que consiste de etanol, glicerol y agua.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste de almidón, gelatina, glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorante de maíz, acacia, tragacanto, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio y cloruro de sodio.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende además por lo menos uno de un conservante, un antioxidante y un estabilizador.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un conservante seleccionado del grupo que consiste de benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde dicha cepa bacteriana está liofilizada.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en donde cuando la composición se almacena en un recipiente sellado a aproximadamente 4° C o aproximadamente 25° C y el recipiente se coloca en una atmósfera que tiene una humedad relativa del 50%, permanece por lo menos un 80% de la cepa bacteriana medida en unidades formadoras de colonias, después de un período de por lo menos aproximadamente: 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1,5 años, 2 años, 2,5 años o 3 años.
Métodos de cultivo
Las cepas bacterianas para su uso en la presente invención pueden cultivarse usando técnicas estándar de microbiología como se detalla, por ejemplo, en las referencias [105,107].
El medio sólido o líquido usado para el cultivo puede ser agar YCFA o medio YCFA. El medio YCFA puede incluir (por 100 ml, valores aproximados): casitona (1,0 g), extracto de levadura (0,25 g), NaHCÜ3 (0,4 g), cisteína (0,1 g), K2HPO4 (0,045 g), KH2PO4 (0,045 g), NaCl (0,09 g), (NH4)2SÜ4 (0,09 g), MgSÜ4 ■ 7H2O (0,009 g), CaCl2 (0,009 g), resazurina (0,1 mg), hemina (1 mg), biotina (1 pg), cobalamina (1 pg), ácido p-aminobenzoico (3 pg), ácido fólico (5 pg) y piridoxamina (15 pg).
Cepas bacterianas para su uso en composiciones de vacunas.
Los inventores han identificado que las cepas bacterianas de la invención son útiles para tratar o prevenir enfermedades o afecciones asociadas con una actividad inmunitaria reducida. Es probable que esto sea el resultado del efecto que las cepas bacterianas de la invención tienen sobre el sistema inmunitario del huésped. Por lo tanto, las composiciones de la invención también pueden ser útiles para prevenir enfermedades o afecciones como el cáncer, cuando se administran como composiciones de vacunas. En ciertas realizaciones de este tipo, las cepas bacterianas de la invención pueden estar muertas, inactivadas o atenuadas. En ciertas realizaciones de este tipo, las composiciones pueden comprender un adyuvante de vacuna. En ciertas realizaciones, las composiciones son para administración mediante inyección, como mediante inyección subcutánea.
En ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis reduce los niveles de ácido fórmico. El ácido fórmico es la base conjugada del formiato que se ha implicado en la alteración del transporte de electrones mitocondrial y la producción de energía inhibiendo la actividad de la citocromo oxidasa, el aceptor de electrones terminal de la cadena de transporte de electrones. Por consiguiente, la reducción del ácido fórmico y, por tanto, del formiato, reduciría la incidencia de muerte celular o mediante la inhibición de la citocromo oxidasa o la acumulación de especies reactivas de oxígeno. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, una cepa bacteriana de la especie Megasphaera massiliensis estimula el sistema inmunitario en el tratamiento de enfermedades reduciendo los niveles de ácido fórmico.
General
La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, las referencias [108] y [109,115], etc.
El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10%.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.
Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos significan que, cuando se alinean, ese porcentaje de nucleótidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. [116]. El algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman determina una alineación preferida usando una búsqueda de espacio afín con una penalización de espacio abierto de 12 y una penalización de extensión de espacio de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman se describe en la ref. [117]
A menos que se indique específicamente, un proceso o método que comprende numerosos pasos puede comprender pasos adicionales al principio o al final del método, o puede comprender pasos intermedios adicionales. Además, los pasos pueden combinarse, omitirse o realizarse en un orden alternativo, si es apropiado.
En la presente se describen varias realizaciones de la invención. Se apreciará que las características especificadas en cada realización pueden combinarse con otras características especificadas, para proporcionar realizaciones adicionales. En particular, las realizaciones resaltadas en la presente como adecuadas, típicas o preferidas pueden combinarse entre sí (excepto cuando sean mutuamente excluyentes).
MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
Ejemplo 1 - MRx0029 induce un fenotipo maduro en células SH-SY5Y
Introducción
Los inventores buscaban identificar el efecto de MRx0029 sobre la expresión de marcadores de neurodiferenciación, tubulina p3 y MAP2 en células de neuroblastoma. La tubulina p3 es un marcador de prediferenciación en neuronas y MAP2 es un marcador de neuronas maduras (diferenciadas).
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Línea celular
Células SH-SY5Y
Método
qPCR
Las SH-SY5Y se colocaron en placas petri de 10 cm con una densidad de 2 x 106 células. Después de 24 h, las células se trataron en medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1% sin RA) con sobrenadantes de bacterias al 10% o YCFA+, RA 10 uM, ácido hexanoico 200 uM o ácido valproico 200 uM, durante 17 horas. Posteriormente, se tomaron imágenes representativas usando un microscopio central EVOS XL de contraste de fase con un aumento de 40X/0,65. Se recogieron las células y se aisló el ARN total de acuerdo con el protocolo del mini kit RNeasy (Qiagen). Los ADNc se elaboraron usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La expresión génica se midió usando qPCR. Se usó GAPDH como control interno. El cambio de veces se calculó de acuerdo con el método 2(-ññct).
Inmunomarcado e imagenología celular
Las células se sembraron en portaobjetos de cámara de 8 pocillos (Marienfeld Laboratory Glassware) a 5 x 104 células/pocillo durante la noche y se trataron con sobrenadante bacteriano al 10% durante 24 h. Para la diferenciación, las células se trataron con RA 10 nM durante 5 días antes de tratarlas con sobrenadante bacteriano libre de células durante 24 h.
Posteriormente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA). Las células fijadas se lavaron con PBS y se permeabilizaron con Triton X-100 al 1% en PBS durante 10 minutos. Después de lavarlos con PBS, los portaobjetos se incubaron con tampón de bloqueo (BSA/PBS al 4%) durante 1 h a TA antes de añadir el anticuerpo anti-MAP2 o tubulina p3 (sc-74421 y sc-80005 respectivamente, Santa Cruz Biotechnology Inc) diluidos en BSA/PBS al 1% durante 12 horas a 4° C. Luego se lavaron dos veces con PBS, seguido de incubación con anti-ratón conjugado con Alexa Flour 488 (Molecular Probes Inc) y faloidina conjugada con Alexa Flour 594 (ab176757, Abeam) durante 1 h a TA. Después de lavar 3X con PBS, los portaobjetos se tiñeron con DAPI y se montaron con Vectashield® (Vector Laboratories). Los portaobjetos se observaron usando un microscopio Axioskop 50 (Zeiss) equipado con un conjunto de objetivo 63x/1.2 W Korr y filtros adecuados para la detección de los fluorocromos usados. Los tiempos de exposición manual para la adquisición digital de imágenes inmunomarcadas con MAP-2 se mantuvieron constantes, lo que permitió la comparación entre diferentes pocillos y tratamientos. Los tiempos de exposición de faloidina (actina F) y DAPI variaron para adaptarse al campo de visión. Los campos de visión aleatorizados se adquirieron usando una cámara Qlmaging controlada por el software Image Pro Plus. Las imágenes se guardaron como archivos TIFF y se abrieron en Adobe Photoshop CC 2015.1.2. Las imágenes de MAP-2, DAPI y Faloidina se superpusieron y fusionaron. Se seleccionaron imágenes representativas para ilustrar las diferencias en abundancia y localización de las proteínas examinadas.
Inmunotransferencia
Se trataron células SH-SY5Y cultivadas en las condiciones indicadas descritas anteriormente con MRx0029 durante 24 h y luego se lisaron en tampón RIPA que contenía un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics, Reino Unido). La concentración de proteínas se estimó usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), se separó mediante SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF. Luego, las membranas se bloquearon con leche descremada en polvo al 5% o BSA al 5% y se incubaron durante la noche a 4° C con los anticuerpos primarios (respectivamente MAP2 y tubulina p3). Luego, las transferencias se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiado y las proteínas se detectaron mediante un kit de detección de quimioluminiscencia (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Tanto para MAP2 como para tubulina p3, la p-actina sirvió como control para monitorizar la variabilidad de la carga de proteínas entre las muestras.
Resultados
MRx0029 induce la expresión de tubulina p3 en células de neuroblastoma SH-SY5Y indiferenciadas. La Figura 1 muestra que el tratamiento con MRx0029 aumenta la expresión de tubulina p3 en comparación con las células SH-SY5Y no tratadas.
MRx0029 induce la expresión de MAP2 en células SH-SY5Y de neuroblastoma indiferenciadas. La Figura 2 muestra que el tratamiento con MRx0029 aumentó significativamente la expresión de MAP2 en comparación con las células SH-SY5Y no tratadas.
Análisis
Los resultados muestran que MRx0029 puede ser una composición eficaz para promover la diferenciación, en particular la diferenciación neuronal. Además, los resultados muestran que MRx0029 puede ser una composición eficaz en el tratamiento de cáncer de cerebro, en particular neuroblastoma y melanoma, en particular, melanoma metastásico.
Ejemplo 2: MRx0029 disminuye la expresión de DRD2 en células SH-SY5Y
Introducción
Los inventores buscaban identificar el efecto de MRx0029 sobre la expresión de DRD2 en células de neuroblastoma.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Línea celular
Células SH-SY5Y
Método
Los inventores midieron el cambio en la expresión de DRD2 en células de neuroblastoma usando el mismo método que se describe en el Ejemplo 1.
Resultados
MRx0029 disminuye la expresión de DRD2 en células de neuroblastoma SH-SY5Y. La Figura 3 muestra que el tratamiento con MRx0029 disminuyó significativamente la expresión de DRD2 en comparación con las células SH-SY5Y no tratadas.
Análisis
Esto muestra que MRx0029 puede ser una composición eficaz en el tratamiento del cáncer.
Ejemplo 3 - MRx0029 induce la regulación por incremento de Caspasa 3 en células SH-SY5Y
Introducción
Los inventores buscaban identificar el efecto de MRx0029 sobre la expresión de Caspasa 3 (Casp3) en células de neuroblastoma.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Línea celular
Células SH-SY5Y
Método
Los inventores midieron el cambio en la expresión de Casp3 en células de neuroblastoma.
Resultados
MRx0029 induce la regulación por incremento de Casp3 en células SH-SY5Y de neuroblastoma indiferenciadas. La Figura 4 muestra que el tratamiento con MRx0029 aumenta la expresión de Casp3 en comparación con las células SH-SY5Y no tratadas. En particular, la Figura 4 muestra que la administración de MRx0029 aumentó tres veces la expresión de Casp3 en comparación con el control.
Análisis
En células SH-SY5Y no diferenciadas, el aumento de la expresión del gen Casp3 por parte de MRx0029 podría estar relacionado tanto con la diferenciación celular como con la inducción de muerte celular programada, como la apoptosis.
La caspasa 3 es una caspasa ejecutora y, por lo tanto, está asociada con la apoptosis. La apoptosis desregulada se ha implicado en los cánceres y, por lo tanto, los resultados muestran que MRx0029 puede ser una composición eficaz en el tratamiento del cáncer.
Se ha mostrado que las caspasas tienen funciones en la diferenciación celular. Por lo tanto, el aumento de la expresión de Casp3 después del tratamiento con MRx0029 muestra que MRx0029 puede ser una composición eficaz para aumentar la diferenciación celular.
Ejemplo 4 - Ensayo MTT en células SH-SY5Y:
Introducción
Los inventores buscaban identificar el efecto de MRx0029 sobre la viabilidad de las células de neuroblastoma, usando el ensayo MTT, que es un método ampliamente usado para evaluar la actividad metabólica celular que se refleja en el número de células viables.
Cepas bacterianas
Megasphaera massiliensis MRx0029
Línea celular
Células SH-SY5Y
Método
Ensayo MTT
Las células SH-SY5Y se sembraron en placas a una densidad de siembra de 10.000 células/pocillo, 24 horas después, las células se trataron en 100 ul de medio de crecimiento FBS al 1% con diferentes concentraciones (expresadas como porcentaje v/v) de sobrenadantes bacterianos libres de células de los cultivos de la fase estacionaria durante 22 h. Luego, se añadieron 10 |jl de solución de MTT y las células se incubaron en una incubadora de CO2 durante 4 h, al final de este tiempo se añadieron 100 j l de isopropanol con 0,04 HCl a cada pocillo. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 560 nm y una longitud de onda de referencia de 655 nm. El kit de ensayo MTT se adquirió de Merck Millipore (N° de Cat. CT01).
Resultados
MRx0029 mostró efectos dependientes de la dosis sobre la viabilidad de las células de neuroblastoma, en donde MRx0029 al 10% redujo la viabilidad en aproximadamente un 70% en comparación con el control. El tratamiento con un 10% de sobrenadante bacteriano libre de células de MRx0029 mostró una disminución de la viabilidad celular. Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 5.
Análisis
Esto muestra que MRx0029 puede ser una composición eficaz para aumentar la muerte celular y, por lo tanto, MRx0029 puede ser una composición eficaz para su uso en el tratamiento del cáncer.
Ejemplo 5: -fenotipado celular básico en PBMC de donantes sanos
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Método
Tratamiento de PBMC
Se adquirieron PBMC humanas sanas congeladas de Stem Cells Technologies (Cambridge, Reino Unido). Brevemente, las células se descongelaron y se dejaron reposar durante la noche en medio de crecimiento completo (RPMI 1640 con FBS al 10%, glutamina 2 mM l, 2-mercapoetanol 55 jM y 100 U/ml de penicilina, 100 jg/ml estreptomicina) en una incubadora de CO2 a 37° C. Para el experimento, las células se sembraron en placas a una densidad de 750.000 células/pocillo en placas de 48 pocillos y se trataron en medio de crecimiento completo con sobrenadantes de bacterias al 10% en presencia o ausencia de 1 ng/ml de LPS. Se añadió medio de cultivo celular a los pocillos no tratados. Las células se dejaron reposar durante 72 h, posteriormente se recogieron los sobrenadantes libres de células y se centrifugaron durante 3 minutos a 10.000 g a 4° C. Las muestras se almacenaron a -80° C para el análisis de citoquinas.
Inmunofenotipado
Se tiñeron 1,5 x 106 células por muestra con colorante de viabilidad fijable (Miltenyi) para discriminar entre células vivas y muertas durante 10 min a TA. Posteriormente, las células se tiñeron con el cóctel de anticuerpos enumerados a continuación (Miltenyi) para inmunofenotipado básico (CD3/CD4/CD8/CD25/CD127 y CD 19) y se incubaron durante 10 min a TA.
Se llevaron a cabo experimentos para medir el porcentaje de las siguientes poblaciones celulares:
• Células CD4+ CD3+ (marcadores de células T auxiliares CD4)
• Células CD4+ CD25+ (marcadores de células CD4+ activadas)
• Células CD25++ CD17- de la población de células CD4+ (marcadores de células T regs)
• Células CD8+ CD3+ (marcadores de células T citotóxicas)
• Células CD25+ CD8+ (marcadores de células CD8+ activadas)
• Células CD19+ CD3-(marcadores de células B).
Se determinó la proporción de células CD8+/Tregs y la proporción de CD8/Tregs activadas.
Anticuerpos
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Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 6.
El resultado más sorprendente es el efecto del tratamiento con MRx0029 sobre el porcentaje de células CD25++ CD17-, que representan células Tregs (ver Figura 6C). MRx0029 redujo selectivamente el porcentaje de Tregs en la población de PBMC. El tratamiento con MRx0029 no cambió significativamente el porcentaje de células T auxiliares CD4, células CD4+ activadas, células T citotóxicas, células CD8+ activadas o células B.
El tratamiento con MRx0029 aumentó la proporción de CD8+/Tregs y la proporción de células CD8/Tregs activadas en comparación con las células no tratadas (ver la Figura 6G y la Figura 6H).
Análisis
La observación de que el tratamiento con MRx0029 disminuyó selectivamente el porcentaje de Tregs, aumentando de este modo las proporciones de CD8/Tregs y CD8/Tregs activadas es sorprendente porque MRx0029 produce butirato, y la producción de butirato se ha asociado con aumentos en la población de Tregs.
El perfil de inmunofenotipado básico de MRx0029 en PBMC de donantes sanos sugiere que el tratamiento con MRx0029 disminuye el porcentaje relativo de Tregs en la población de linfocitos, lo que se refleja en una proporción creciente entre células CD8/Tregs.
Esto muestra que MRx0029 puede ser una composición eficaz para estimular la respuesta inmunitaria y disminuir la supresión inmunitaria por las Tregs. Los resultados también muestran que MRx0029 puede ser una composición eficaz para su uso en el tratamiento del cáncer.
Ejemplo 6 - Análisis de citoquinas de PBMC de donantes sanos
Introducción
Los inventores buscaban analizar adicionalmente las PBMC después de la incubación con MRx0029. Los inventores analizaron la expresión de citoquinas particulares de PBMC tras el tratamiento con MRx0029, incluyendo las citoquinas proinflamatorias TNF-a, IL-1 p e IL-23.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Método
Tratamiento de las PBMC
Las PBMC se trataron como se describe en el Ejemplo 5.
Cuantificación de citoquinas
La cuantificación de citoquinas se realizó usando un inmunoensayo multiplex ProcartaPlex siguiendo las recomendaciones del fabricante (Thermo Fischer Scientific). En resumen, se usaron 50 pl de sobrenadantes de cocultivo libres de células para la cuantificación de citoquinas usando un sistema MAGPIX® MILLIPLEX® (Merck) con el software xPONENT (Luminex, Austin, TX, USA). Los datos se analizaron usando el software analista MILLIPLEX® (Merck) usando una curva logística de 5 parámetros y sustracción de fondo para convertir la intensidad de fluorescencia media en valores de pg/ml.
Resultados
Los resultados del análisis de citoquinas de MRx0029 en cultivo de PBMC de donantes sanos mostraron una firma inmunoestimuladora para MRx0029. En particular, el tratamiento con MRx0029 aumentó la expresión de TNF-a, IL-1 p e IL-23.
Los resultados también muestran que el tratamiento con MRx0029 aumentó la expresión de MIP-3a, IL-6 e IL-10. Los niveles de expresión de MCP-1, CXCL9 y GMCSF fueron similares a los de los controles.
Análisis
Esto muestra que MRx0029 tiene propiedades inmunoestimuladoras y puede ser una composición eficaz para la inmunoestimulación. Los resultados también muestran que MRx0029 puede ser una composición eficaz en el tratamiento del cáncer.
Ejemplo 7 - Análisis de citometría de flujo de diferentes poblaciones celulares
Introducción
Los inventores buscaban analizar adicionalmente las PBMC después de la incubación con MRx0029. Se usó análisis de citometría de flujo para determinar los porcentajes de células CD4 (CD4+ CD3+), Tregs (CD25++ CD127-), células CD8 (CD8+ CD3+) y células B (CD19+ CD3-).
Método
Tratamiento de PBMC
Las PBMC se trataron como se describe en el Ejemplo 5.
Análisis de citometría de flujo de diferentes poblaciones celulares
Se tiñeron 1,5 x 106 células por muestra con colorante de viabilidad fijable (Miltenyi) para discriminar entre células vivas y muertas durante 10 min a TA. Posteriormente, las células se tiñeron con el cóctel de anticuerpos enumerados a continuación (Miltenyi) para inmunofenotipado básico (CD3/CD4/CD8/CD25/CD127 y CD19) y se incubaron durante 10 min a TA. Luego, las células se lavaron y resuspendieron en PBS y se analizaron inmediatamente usando un FACS Aria II equipado con láseres azul (488 nm), rojo (633 nm) y violeta (405 nm). Se incluyeron FMO en todos los experimentos. Para el análisis se usó el software Flowjo versión 10.4.2 (FlowJo, LLC). Resultados
Los resultados de los experimentos de citometría de flujo se muestran en la Figura 8.
La Figura 8A muestra que el 0,73% de las PBMC eran Tregs (CD25++ CD127-).
Análisis
Los resultados muestran que MRx0029 puede ser útil para regular por diminución las Tregs. Además, los resultados muestran que MRx0029 puede ser una composición eficaz para estimular la respuesta inmunitaria y disminuir la supresión inmunitaria por las Tregs. Los resultados también muestran que MRx0029 puede ser una composición eficaz para su uso en el tratamiento del cáncer.
E jem plo 8 - M R x0029 aum enta la secreción de IL -8 en células M G U373
Introducción
Los inventores buscaban identificar el efecto de MRx0029 sobre la secreción de IL-8 en células de neuroblastoma. Se trataron células de astrocitoma de glioblastoma de Fluman con composiciones que comprendían MRx0029 en combinación con LPS para observar su capacidad para modular los niveles de IL-8. La IL-8 es una citoquina proinflamatoria secretada predominantemente por macrófagos con efectos inmunoestimuladores.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Línea celular
MG U373 es un astrocitoma de glioblastoma humano derivado de un tumor maligno y se adquirió de Sigma-Aldrich (N° de cat. 08061901 -1VL). Se cultivaron células de astrocitoma de glioblastoma humano MG U373 en MEM (Sigma Aldrich, N° de cat. M-2279) suplementado con FBS al 10%, Pen Strep al 1%, L-Glut 4 mM, solución de aminoácidos no esenciales MEM 1X y piruvato sódico 1X.
Método
Una vez cultivadas, las células MG U373 se sembraron en una placa de 24 pocillos a 100.000 células/pocillo. Las células se trataron con LPS (1ug/ml) solo o con un 10% de bacterias sobrenadantes de MRx0029 durante 24 h. El LPS es un estimulador conocido de citoquinas proinflamatorias como la IL-8. Posteriormente se recogieron los sobrenadantes libres de células, se centrifugaron a 10.000 g durante 3 min a 4° C. La IL-8 se midió usando el kit IL-8 ELISA humano de Peprotech (N° de cat. 900-K18) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resultados
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 9. El tratamiento de las células con las cepas bacterianas llevó a un aumento de la secreción de IL-8 independientemente de la presencia de LPS.
Análisis
Los resultados muestran que MRx0029 puede ser útil para aumentar la secreción de IL-8. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, en particular enfermedades caracterizadas por una activación inmunitaria reducida y enfermedades que pueden tratarse por una respuesta inmunitaria aumentada.
Ejemplo 9 - MRx0029 reduce los niveles de activ idad de histona deacetilasa en células HT-29 Introducción
Se investigó la capacidad de las composiciones que comprenden MRx0029 para alterar la actividad de histona deacetilasa. Se ha demostrado que HDACi provoca la detención del crecimiento, la diferenciación, la apoptosis, la reducción de la angiogénesis y la modulación de la respuesta inmunitaria en una variedad de líneas de células cancerosas.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Línea celular
Se usó la línea celular HT-29 porque está presente la histona deacetilasa.
Método
Los sobrenadantes libres de células de cultivos bacterianos en fase estacionaria se aislaron mediante centrifugación y filtración en un filtro de 0,22 uM. Las células HT-29 se usaron 3 días después de la confluencia y se redujeron en 1 ml de DTS 24 horas antes del comienzo del experimento. Las células HT-29 se desafiaron con sobrenadante libre de células al 10% diluido en DTS y se dejó incubar durante 48 horas. Luego, se extrajeron las proteínas de nucleasa usando el kit de extracción Sigma Aldrich Nuclease y las muestras se congelaron al instante antes de la medición de la actividad de HDAC. La actividad de HDAC se evaluó fluorométricamente usando el kit Sigma Aldrich (Reino Unido).
Resultados
Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 10. La Figura 109 muestra que MRx0029 es capaz de reducir los niveles de actividad de histona deacetilasa.
Análisis
Los resultados muestran que MRx0029 es un candidato prometedor para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades caracterizadas por aberraciones epigenéticas, mediante la inhibición de la actividad HDAC. El cáncer es una enfermedad caracterizada por aberraciones epigenéticas. Además, los inhibidores de HDAC (HDACi) son una clase emergente de fármacos anticancerígenos prometedores que han demostrado que provocan la detención del crecimiento, la diferenciación, la apoptosis, la reducción de la angiogénesis y la modulación de la respuesta inmunitaria en una variedad de líneas de células cancerosas. Por lo tanto, los resultados muestran que las composiciones de la invención pueden ser eficaces para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer.
Ejemplo 10 - Análisis adicional del mecanismo de inhibición de la desacetilación de histonas Introducción
El microbiota intestinal, con su inmensa diversidad y capacidad metabólica, representa un enorme depósito metabólico para la producción de una gran variedad de moléculas con potencial para influir en la actividad de HDAC. Por lo tanto, los inventores buscaban determinar qué metabolitos son responsables de la inhibición de HDAC y dilucidar adicionalmente los mecanismos mediante los cuales se logra la inhibición.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Método
Cultivo bacteriano y recogida de sobrenadante libre de células
Los cultivos puros de bacterias se cultivaron anaeróbicamente en caldo YCFA+ hasta que alcanzaron su fase de crecimiento estacionario. Los cultivos se centrifugaron a 5.000 x g durante 5 minutos y el sobrenadante libre de células (CFS) se filtró usando un filtro de 0,2 pM (Millipore, Reino Unido). Se almacenaron alícuotas de 1 ml de CFS a -80° C hasta su uso. El butirato de sodio, el ácido hexanoico y el valérico se obtuvieron de Sigma Aldrich (Reino Unido) y se prepararon suspensiones en caldo YCFA+.
Cuantificación de SCFA y MCFA de sobrenadantes bacterianos
Se analizaron y cuantificaron los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) y los ácidos grasos de cadena media (MCFA) de sobrenadantes bacterianos por MS Omics APS de la siguiente manera. Las muestras se acidificaron usando ácido clorhídrico y se añadieron estándares internos marcados con deuterio. Todas las muestras se analizaron en un orden aleatorio. El análisis se realizó usando una columna de alta polaridad (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. de 30 m x 0,25 mm x 0,25 pm) instalada en un GC (7890B, Agilent) acoplada a un detector de cuadropolo (59977B, Agilent). El sistema fue controlado por ChemStation (Agilent). Los datos sin procesar se convirtieron al formato netCDF usando Chemstation (Agilent), antes de que los datos fueran importados y procesados en Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando el software PARADISe descrito en [118].
Análisis de actividad de HDAC específica
Se analizó la actividad de inhibición específica de HDAC para HDAC1,2, 3, 4, 5, 6, 9 usando kits de ensayo fluorogénico para cada tipo de HDAC (BPS Bioscience, CA). Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cada muestra se realizó por duplicado. Los sobrenadantes libres de células se diluyeron 1 en 10 y se expusieron a proteínas de HDAC específicas proporcionadas en el kit para mantener la consistencia entre los métodos.
Resultados
Los metabolitos microbianos comensales intestinales que inhiben la histona deacetilasa son butirato y ácido valérico MRx0029, cuyo sobrenadante mostró una fuerte inhibición de HDAC tanto en células enteras HT29 como en lisados de células HT29 (ver Figura 11 A), produjo ácido valérico y ácido hexanoico a concentraciones medias de 5,08 mM y 1,60 mM, respectivamente (ver Figura 11B).
Para investigar qué metabolitos eran responsables de la inhibición de HDAC inducida por la cepa, se midieron diferentes concentraciones de ácido hexanoico, ácido valérico y butirato de sodio para determinar su inhibición de HDAC en células HT-29 completas y en lisado de células HT-29. Los resultados en la Figura 11C muestran una inhibición significativa (P<0,05) de la actividad de HDAC por el butirato de sodio en células completas así como en el lisado celular, mientras que el ácido hexanoico no mostró una actividad inhibidora significativa. El ácido valérico también inhibió la actividad de HDAC en células enteras así como en el lisado celular (*(p<0,05), **(p<0,005), ***(P<0,001), ****(p<0,0001)).
Los potentes inhibidores totales de HDAC investigados se dirigen a las HDAC de clase I.
Se investigó el perfil de inhibición específico de HDAC de la cepa de bacterias de prueba. Se llevaron a cabo ensayos de inhibición específicos de HDAC (BPS Bioscience, CA) para HDAC de Clase I y Clase II. La capacidad de la cepa bacteriana para inhibir las enzimas de HDAC se comparó con butirato, ácido hexanoico y valérico. Nuestros resultados demuestran que MRx0029 es un inhibidor muy potente de las enzimas de HDAC de Clase 1 (HDAC1,2 y 3). La inhibición de las HDAC de clase II no fue tan significativa (datos no mostrados).
Análisis
La cepa con actividad inhibidora de HDAC produjo cantidades significativas de ácido valérico y ácido hexanoico, así como cantidades significativas de butirato de sodio (Figura 11B). Cuando se probaron como sustancias puras, el ácido valérico y el butirato de sodio dieron como resultado una inhibición significativa de HDAC (p<0,0001).
Curiosamente, los resultados de la actividad específica de HDAC muestran que la cepa analizada es un potente inhibidor de las HDAC de clase I y, en particular, de HDAC2 (Figura 12 y Figura 13). Las HDAC de clase I (HDAC1,2, 3 y 8) residen en el núcleo y se expresan ubicuamente en varios tipos de células humanas. Las HDAC 1 -3 comparten más del 50% de homología, pero tienen estructuras y funciones celulares distintas [119]. Participan principalmente en la supervivencia, proliferación y diferenciación celular y, por lo tanto, su inhibición puede ser útil en una amplia variedad de enfermedades [120]; [121]; [122]; [123]; [124]. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para el tratamiento de enfermedades en las que la actividad de las HDAC de Clase I está regulada por incremento. En particular, las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para el tratamiento de cánceres en los que la actividad de las HDAC de Clase I está regulada por incremento. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para el tratamiento de cánceres en los que la actividad de HDAC2 está regulada por incremento.
Ejemplo 11 - Modulación de la función de barrera intestinal y permeabilidad intestinal por MRx0029 Introducción
Se investigó la capacidad de MRx0029 para provocar cualquier disfunción de la barrera intestinal. Se usaron monocapas de células epiteliales productoras de mucina HT29-mtx [125] como modelo in vitro para evaluar la alteración de la barrera intestinal y la estimulación inmunitaria después del tratamiento con MRx0029.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Métodos
Extracción de ARN y análisis qPCR
El ARN total se extrajo usando el mini kit RNeasy (Qiagen, Manchester, JUK) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la concentración de ARN se determinó por absorbancia a 260/280nm usando un espectrofotómetro (nano-Drop ND-1000; Thermo Scientific, Wilmington, DE). Para el análisis de expresión de ARNm, se preparó ADNc a partir de ARN total usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de transcripción inversa se realizaron en un termociclador (Biometra, Alemania) a 25° C durante 10 min, 37° C durante 120 min y 85° C durante 5 min, manteniendo a 4° C. El ADNc resultante se amplificó por duplicado mediante el ensayo de PCR SYBR-Green y los productos se detectaron en la máquina de PCR en tiempo real QuantStudio 6 flex (Applied Biosystems, Reino Unido) usando un perfil estandarizado (desnaturalización inicial de 95° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 15 segundos de desnaturalización a 95° C y 60 segundos de apareamiento/extensión a 60/65° C, dependiendo de los cebadores. Se añadio una etapa de disociación después de 40 ciclos para generar una curva de fusión. El análisis se realizó usando el software de PCR en tiempo real Applied Biosystems QuantStudio v1.2.
Resultados
Las células HT29-mtx diferenciadas expuestas a forbol 12-miristato-13-acetato (PMA) secretaron una cantidad significativa de IL-8; por el contrario, el tratamiento durante 24 h con sobrenadantes bacterianos de MRx0029 indujo una secreción incluso más baja de IL-8 en comparación con las células no tratadas y las tratadas con YCFA+ (Figura 14A).
Luego se investigó la capacidad de MRx0029 para regular la permeabilidad epitelial mediante la modificación de la transducción de señales intracelulares implicadas en la expresión y localización de proteínas implicadas en la formación de la barrera intestinal.
Se aisló el ARN y se realizó un análisis de RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) para caracterizar los cambios en la expresión génica de las proteínas de unión estrecha durante la incubación con MRx0029. La administración de MRx0029 mejoró la expresión de ARNm de Ocludina, Vilina, Proteína de Unión Estrecha 1 y 2 (respectivamente TJP1 y TJP2) después de 2 horas de incubación (Figura 14B).
Los resultados in vitro se compararon con los datos del análisis paralelo ex vivo en el intestino de ratones alimentados con MRx0029. La expresión génica de TJP1 y Ocludina se cuantificó en el colon y el íleon. Los datos ex vivo reflejan perfectamente los datos in vitro ya que MRx0029 fue capaz de regular significativamente TJP1 y Ocludina (p=0,073) en la región del colon del intestino murino (Figura 14C+14D). MRx0029 también pudo disminuir la función de permeabilidad en el colon de los mismos ratones (Figura 14F).
Análisis
Los resultados muestran que MRx0029 es capaz de regular la permeabilidad epitelial modificando la transducción de señales intracelulares implicadas en la expresión y localización de proteínas implicaas en la función de barrera intestinal (por ejemplo, Ocludina, Vilina, TJP1 y TJP2). Por lo tanto, los resultados muestran que MRx0029 funciona para aumentar la función de barrera intestinal y reducir la permeabilidad intestinal. Por lo tanto, las composiciones de la invención son eficaces para el tratamiento o la prevención de enfermedades o afecciones que se caracterizan por la reducción de la función de barrera intestinal o el aumento de la permeabilidad intestinal.
Ejemplo 12
Introducción
Los inventores buscaban analizar la expresión de genes para marcadores inflamatorios en tejido cerebral del hipocampo, la amígdala y la corteza prefrontal de ratones alimentados con MRx0029. Los inventores también exploraron los efectos sobre la producción de citoquinas del bazo en los mismos ratones a los que se les administró MRx0029.
Cepa bacteriana
Megasphaera massiliensis MRx0029
Métodos
Animales
Se alojaron en grupo ratones macho adultos BALBc (Envigo, Reino Unido) bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h; La comida estándar para roedores y el agua estaban disponibles a voluntad. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas europeas luego de la aprobación del Comité de Experimentación de Ética Animal del University College Cork. Los animales tenían 8 semanas de edad al comienzo del experimento.
Diseño del estudio
Se permitió que los animales se habituaran a su sala de espera durante una semana después de su llegada a la unidad de animales. Reciben alimentación forzada oral (dosis de 200 gl) de bioterapéuticos vivos a una dosis de 1 X 109 UFC durante 6 días consecutivos entre las 15:00 y las 17:00. El día 7, los animales son decapitados y se recogen los tejidos para experimentación.
Recogida de Tejidos
Los animales se sacrificaron de manera aleatoria según el tratamiento y las condiciones de prueba; el muestreo se realizó entre las 9:00 am y las 2:30 pm. Se recogió sangre del tronco en tubos con EDTA de potasio (ácido etilendiaminotetraacético) y se centrifugó durante 15 min a 4000 g. El plasma se aisló y almacenó a -80° C para su análisis posterior. El cerebro se extirpó rápidamente, se diseccionó y cada región del cerebro se congeló al instante en hielo seco y se almacenó a -80° C para su análisis posterior. Se extrajo el bazo, se recogió en 5 ml de medio RPMI (con L-glutamina y bicarbonato de sodio, R8758 Sigma FBS al 10% (F7524, Sigma) Pen/Strep al 1% (P4333, Sigma)) y se procesó inmediatamente después de los sacrificios para la estimulación inmune ex-vivo. Se montó tejido intestinal (se extirparon 2 segmentos de 3 cm de íleon y colon más cercanos al ciego, y se usaron los 1cm 2cm más alejados del ciego) en las cámaras de Ussing para el ensayo de permeabilidad intestinal. Se extrajo el ciego, se pesó y se almacenó a -80° C para el análisis de SCFA.
Ensayo de citoquinas del bazo
Los bazos se recogieron inmediatamente en 5 ml de medio RPMI después del sacrificio y se cultivaron inmediatamente. Primero se homogeneizaron las células de bazo en este medio RPMI, seguido de 5 min de incubación con 1 ml de tampón de lisis de RBC (11814389001 ROCHE, Sigma). Se añadieron 10 ml adicionales de medio RPMI, seguido de centrifugación a 200G durante 5 min. Luego, el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 40 um. Las células se contaron y sembraron (4.000.000/ml de medio). Después de 2,5 h de adaptación, las células se estimularon con lipopolisacárido (LPS-2 gg/ml) o concanavalina A (ConA-2,5 gg/ml) durante 24 h. Después de la estimulación, se recogieron los sobrenadantes para evaluar la liberación de citoquinas usando el kit V-pLeX (Meso Scale Discovery, Maryland, USA) del Panel 1 (ratón) proinflamatorio para TNF-a, IL-10, IL-1 p, Interferón y, CXCL2 e IL6. Los análisis se realizaron usando MESO QuickPlex SQ 120, SECTOR Imager 2400, SECTOR Imager 6000, SECTOR S 600.
Análisis de expresión génica
El ARN total se extrajo con el kit de aislamiento de ARNmi mirVana™ (Ambion/Llife technologies, Paisley, Reino Unido) y se trató con DNasa (Turbo DNA-free, Ambion/life technologies) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ARN se cuantificó usando el espectrofotómetro NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, Delaware, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó usando el Agilent Bioanalyzer (Agilent, Stockport, Reino Unido) de acuerdo con el procedimiento del fabricante y se calculó un número de integridad del ARN (RIN). Se usó ARN con un valor RIN>7 para experimentos posteriores. El ARN se transcribió inversamente a ADNc usando el kit de ADNc de capacidad de vuelo de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, Se añadió transcriptasa inversa Multiscribe (50 U/gl) (1 )(2)(1 )(10) como parte de la mezcla maestra de RT, se incubó a 25° C durante 10 min, 37° C durante 2 h, 85° C durante 5 min y se almacenó a 4°C. La PCR cuantitativa se llevó a cabo usando sondas (6 carboxifluoresceína-FAM) diseñadas por Applied Biosystems para genes objetivo específicos de ratón, mientras se usaba p-actina como control endógeno. Las reacciones de amplificación contenían 1 gl de ADNc, 5 gl de la mezcla maestra de PCR 2X (Roche), 900 nM de cada cebador y se llevaron a un total de 10 gl mediante la adición de agua libre de RNasa. Todas las reacciones se realizaron por triplicado usando placas de 96 pocillos en el sistema LightCycler®480. Las condiciones de los ciclado térmico fueron las recomendadas por el fabricante (Roche) para 55 ciclos. Para verificar la contaminación por amplicones, cada serie no contenía controles de plantilla por triplicado para cada sonda uszada. Se registraron los valores de umbral de ciclo (Ct). Los datos se normalizaron usando p-actina y se transformaron usando el método 2-AACT y se presentaron como un cambio de veces frente al grupo de control.
Análisis estadístico
Los datos normalmente distribuidos se presentan como media ± SEM; Los conjuntos de datos no paramétricos se presentan como mediana con rango intercuartílico. Se aplicó la prueba t de dos colas no pareadas para analizar los datos paramétricos y la prueba de Mann-Whitney para los no paramétricos. Se empleó el coeficiente de correlación de rangos de Spearman para el análisis de correlación en los conjuntos de datos agrupados. Un valor de p<0,05 se consideró significativo en todos los casos.
Resultados - Expresión génica
Se analizó la expresión de genes para marcadores inflamatorios [IL-1 p, IL6, CD11b, TNF-a y TLR-4] en tejido cerebral del hipocampo, la amígdala y la corteza prefrontal. Las Figuras 15-25 muestran los cambios en la expresión génica después del tratamiento con MRx0029 en el hipocampo, la amígdala y la corteza prefrontal. El tratamiento con MRx0029 aumentó significativamente la expresión de TLR-4 en la amígdala (Figura 20). El tratamiento con MRx0029 también aumentó la expresión de CD11b en la amígdala (Figura 21).
Resultados - Efecto sobre la expresión de citoquinas de los esplenocíticos
El ensayo de esplenocitos ex vivo implica desafiar los esplenocitos (células aisladas del bazo, un órgano principal implicado en la defensa inmunitaria), con un desafío mimético bacteriológico o viral.
El tratamiento con MRx0029 llevó a una reducción de interferón-Y, iinterleucina-1 p e interleucina-6 después de un desafío con LPS (Figuras 26, 27 y 28, respectivamente).
El tratamiento con MRx0029 llevó a un aumento en los niveles del quimioatrayente CXCL1 (Figura 30). Análisis
El tratamiento con MRx0029 aumentó significativamente la expresión de las citoquinas proinflamatorias TLR-4 y CD11b en la amígdala. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, en particular enfermedades caracterizadas por una activación inmunitaria reducida y enfermedades que pueden tratarse por una respuesta inmunitaria aumentada.
Ejemplo 13 - Prueba de estabilidad
Una composición descrita en la presente que contiene por lo menos una cepa bacteriana descrita en la presente se almacena en un recipiente sellado a 25° C o 4° C y el recipiente se coloca en una atmósfera que tiene un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% o 95% de humedad relativa. Después de 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1,5 años, 2 años, 2,5 años o 3 años, deberá quedar por lo menos el 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la cepa bacteriana medida en unidades formadoras de colonias determinadas por protocolos estándar.
Ejemplo 14 - análisis del efecto de M. massiliensis sobre la vía de señalización de ERK
Materiales y métodos
Extracción de ARN y análisis MAP2 qPCR
Las células se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 2 x 105 células/pocillo. Después de 24 h, las células se trataron o con DMSO o con Vemurafenib (662005; EMD Millipore; VEMU; SKMEL28, SKMEL31, 451Lu, HT29 (1 pM) SKMEL2 (10 pM) o Azacitidina-C (A3656; Sigma Aldrich; AzaC; 5 pg/ml) o ambos fármacos (VEMU+Aza) juntos, en presencia de 10% de sobrenadantes de bacterias o ausencia de ellas (YCFA+). El ARN total se extrajo usando el mini kit RNeasy (Qiagen, Manchester, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la concentración de ARN se determinó mediante espectrofotómetro a 260/280 nm (NanoDrop ND-1000; Thermo Fisher Scientific, Loughborough). Para el análisis de expresión de ARNm, se preparó ADNc a partir de 2000 ng de ARN total usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher, Loughborough) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de transcripción inversa se realizaron en un termociclador (Biometra, Alemania) a 25° C durante 10 min, 37° C durante 120 min y 85° C durante 5 min. El ADNc resultante se amplificó por duplicado mediante el ensayo de PCR SYBR-Green y los productos se detectaron en la máquina de PCR en tiempo real QuantStudio 6 flex (Applied Biosystems, Reino Unido) usando un perfil estandarizado (desnaturalización inicial de 95° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 10 segundos de desnaturalización a 95° C y 30 segundos de apareamiento/extensión a 65° C). Se añadió una etapa de disociación después de los 40 ciclos para generar una curva de fusión. El análisis se realizó usando el software de PCR en tiempo real QuantStudio v1.2 de Applied Biosystems. Las secuencias de los cebadores para GAPDH y MAP2 se muestran a continuación.
Análisis de Transferencia Western
Después de 24 horas de tratamiento con los fármacos apropiados en presencia o ausencia de sobrenadante bacteriano al 10% (YCFA+), se obtuvieron extractos de proteína lisando las células en tampón RIPA (R0278; Sigma Aldrich) suplementado con inhibidores de proteasa (cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets; Roche, Suiza) y ortovanadato de sodio 1 mM/l, PMSF 0,5 mM/l. La cuantificación de proteínas se realizó mediante el ensayo de proteínas BCA. Luego, se separaron cantidades iguales de proteína total (20 pg/filal) mediante SDS-PAGE en gel con gradiente del 4-15% (BioRad) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Loughborough). Después de bloquear con BSA al 5% o leche en polvo desnatada en TBST (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,5%) durante 60 min, las membranas se probaron con anticuerpos primarios contra fosfo-ERK (9101S, 1:1000, Cell Signalling; New England Biolabs (Reino Unido)) o ERK total (4696S, 1:1000, Cell signalling; New England Biolabs (Reino Unido)).
Las proteínas de interés se detectaron con el anticuerpo secundario conjugado con HRP adecuado (1: 10.000, Thermo Fisher Scientific, Loughborough), desarrollado con el sustrato de transferencia Western ECL Super Signal PicoPlus (34577; Thermo Fisher Scientific, Loughborough) y se visualizaron en Chemidoc XRS Imager (BioRad).
Crecimiento independiente de anclaje (ensayo de crecimiento de agar suave) en placas de 96 pocilios
Se sembraron en placas una mezcla de 25 pl precalentada (37° C) 2x de medio de crecimiento apropiado (EMEM para líneas celulares de melanoma; DMEM alto en glucosa para HT29) que contenía FBS al 20%, L-Glu 4 mM, 2x NEAA, bicarbonato de sodio al 0,6%, 200 U/ml de penicilina/estreptomicina (Invitrogen) y 25 pl de agar noble al 1,2% precalentado (47° C) (A5431; Sigma Aldrich) en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos para servir como capa previa para el ensayo. Se mezclaron diez microlitros de suspensiones celulares que contenían 0-2 x 103 células con 25 pl de medio de cultivo 2x y 35 pl de agar noble al 0,8% en una microplaca de polipropileno de fondo redondo de 96 pocillos y se transfirieron a la microplaca de 96 pocillos que contenía las capas previas solidificadas. Se permitió que las células crecieran durante 2 días y luego se alimentaron con medios que contenían fármacos en presencia de sobrenadantes bacterianos al 10% o YCFA+ cada tres días. Se dejaron crecer en la incubadora humidificada a 37° C con CO2 al 5% durante 1 o 2 semanas antes de puntuar el crecimiento en agar blando usando el ensayo de transformación de células de 96 pocillos CytoSelect (CBA-130; Cell Biolabs) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El crecimiento celular se midió usando un lector de placas de múltiples pocillos Tecan Infinite F200 Pro Series (Tecan Biosystems), con excitación a 485 nm y emisión a 530 nm.
Crecimiento independiente del anclaje (ensayo de crecimiento de asar suave) en una placa de 32 mm
Se mezcló una mezcla de 1 ml de medio de cultivo 2x apropiado precalentado (37° C) (EMEM para líneas celulares de melanoma; DMEM alto en glucosa para HT29) y 1 ml de agar noble al 0,8% precalentado (47° C) por placa (agar final al 0,4%) con 1 ml de suspensión celular y se sembraron sobre una precapa de agar/crecimiento celular al 0,6% (2 ml) en una placa de 6 pocillos. Se permitió que las células crecieran en la incubadora humidificada a 37° C con CO2 al 5% durante 21-28 días. Se alimentaron con fármacos en ausencia (YCFA+) o presencia de sobrenadante bacteriano al 10% cada tres días. Las colonias se fotografiaron usando un microscopio Evos XL Core (Thermo Fisher Scientific, Loughborough).
Ensayo clonogénico
Las células se tripsinizaron y se sembraron 200 células/pocillo en placas de 12 pocillos. Después de 48 h, las células se trataron con los fármacos apropiados en ausencia (YCFA+) o presencia de sobrenadante bacteriano al 10% y se realimentaron cada tres días. El día 21 después de la siembra, las células se fijaron en metanol enfriado con hielo y se tiñeron con azul cristal violeta. Se contaron las colonias (0,50 células) y se calculó la fracción de supervivencia como el número de colonias dividido por el número de células sembradas (eficacia de sembrado) de las tratadas dividido por la eficacia de sembrado del control.
Ejemplo 14A - Línea celular de melanoma SKMEL2
Se evaluaron los efectos de los siguientes tratamientos sobre la línea celular de melanoma SKMEL2 (WT BRAF; mutación oncogénica N61R en Nras): (1) MRX0029; (2) Vemurafenib (VEMU) en medio YFCA+; (3) VEMU y MRX029; (4) azacitidina-C (Aza-c) en medio YfCa +; (5) Aza-c y MRX029; (6) VEMU, Aza-c y MRX0029.
La expresión del gen MAP2 en la línea celular SKMEL2 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 31. Todos los tratamientos con MRX029 (solo o en combinación con VEMU y/o Aza-c) aumentaron la expresión del gen MAP2 con respecto a ambos controles negativos (línea celular solamente y YCFA+). La supervivencia clonogénica de la línea celular SKMEL2 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 32. El crecimiento en agar blando de la línea celular SKMEL2 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 33. VEMU+Aza-c mejoró la inhibición del crecimiento en agar blando por MRX029. La señalización de ERK en la línea celular SKMEL2 se evaluó usando el protocolo en Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 34 (no se evaluaron VEMU, Aza-c y MRX029).
Estos resultados indican que MRX0029 solo o en combinación con Vemurafenib y/o Azacitidina-C puede tener los efectos de inducir la expresión del gen MAP2 en una línea celular de melanoma (SKMEL2). Además, Vemurafenib+Azacitidina-C mejoró la inhibición del crecimiento en agar blando por MRX0029. Sobre esta base, se espera que las composiciones de la invención sean útiles en el tratamiento o prevención de varios cánceres, en particular cánceres metastásicos, en particular melanoma metastásico.
Ejemplo 14B - Línea celular de melanoma SKMEL28
Se evaluaron los efectos de los siguientes tratamientos sobre la línea celular de melanoma SKMEL28 (mutación oncogénica V600E en BRAF): (1) MRx0029; (2) Vemurafenib (VEMU) en medio YCFA+; (3) VEMU y MRx0029; (4) azacitidina-C (Aza-c) en medio YCFA+; (5) Aza-c y MRX0029; (6) VEMU, Aza-c y MRx0029.
La expresión del gen MAP2 en la línea celular SKMEL28 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 35. La supervivencia clonogénica de la línea celular SKMEL28 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 36. MRx0029 en combinación con VEMU y/o Aza-c disminuyó la supervivencia clonogénica con respecto a ambos controles negativos (YCFA+ y línea celular solamente). El crecimiento en agar blando de la línea celular SKMEE28 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 37. La señalización de ERK en la línea celular SKMEL28 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 38 (VEMU, Aza-c y MRx0029 no fueron evaluados). Todos los tratamientos con MRx0029 (solo o en combinación con VEMU o Aza-c) redujeron la señalización de ERK con respecto al control negativo (YFCA+).
Estos resultados indican que MRx0029 solo o en combinación con Vemurafenib y/o Azacitidina-C puede tener los efectos de inhibir la señalización de ERK y disminuir la supervivencia clonogénica de una línea celular de melanoma que comprende la mutación BRAF V600E (SKMEL28). Sobre esta base, se espera que las composiciones de la invención sean útiles en el tratamiento o prevención de cánceres, en particular aquellos que comprenden señalización de ERK oncogénica, especialmente melanomas. En particular, se espera que las composiciones de la invención sean útiles en el tratamiento o prevención de tales cánceres que comprenden una mutación oncogénica en BRAF, en particular en la posición 600, y especialmente la mutación BRAF V600E.
Ejemplo 14C - Línea celular de melanoma SKMEL31
Se evaluaron los efectos de los siguientes tratamientos en la línea celular de melanoma SKMEL31 (heterocigota para BRAF V600E): (1) MRx0029; (2) Vemurafenib (VEMU) en medio YFCA+; (3) VEMU y MRx0029; (4) Azacitidina-C (Aza-c) en medio y FcA+; (5) Aza-c y MRx0029; (6) VEMU, Aza-c y MRx0029.
La expresión del gen MAP2 en la línea celular SKMEL31 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 39. La supervivencia clonogénica de la línea celular SKMEL31 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 40. El crecimiento en agar blando de la línea celular SKMEL31 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 41. VEMU, Aza-c y VEMU+Aza-c mejoraron el crecimiento en agar blando y la inhibición de la supervivencia clonogénica mediante MRx0029. La señalización de ERK en la línea celular SKMEL31 se evaluó usando el protocolo en Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 42 (VEMU, Aza-c y MRx0029 en combinación no se evaluaron). Todos los tratamientos con MRx0029 (solo o en combinación con VEMU o Aza-c) redujeron la señalización de ERK con respecto al control negativo (YFCA+).
Ejemplo 14D - Linea celular de melanoma 451Lu
Se evaluaron los efectos de los siguientes tratamientos en la línea celular de melanoma 451Lu (mutación oncogénica V600E en BRAF): (1) MRx0029; (2) Vemurafenib (VEMU) en medio YFCA+; (3) VEMU y MRx0029; (4) Azacitidina-C (Aza-c) en medio YFCA+; (5) Aza-c y MRx0029; (6) VEMU, Aza-c y MRx0029.
La expresión del gen MAP2 en la línea celular 451Lu se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 43. Todos los tratamientos con MRx0029 (solo o en combinación con VEMU y/o Aza-c) aumentaron la expresión del gen MAP2 con respecto a la línea celular sólo con control negativo. La supervivencia clonogénica de la línea celular 451Lu se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 44. Todos los tratamientos con MRx0029 (solo o en combinación con VEMU y/o Aza-c) redujeron la supervivencia clonogénica con respecto a ambos controles negativos (línea celular solamente y YCFA+ DMSO). El crecimiento en agar blando de la línea celular 451Lu se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 45. La azacitidina C mejoró la inhibición del crecimiento en agar blando por MRx0029. La señalización de ERK en la línea celular 451Lu se evaluó usando el protocolo en Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 46 (VEMU, Aza-c y MRx0029 en combinación no se evaluaron). MRx0029 en combinación con VEMU o Aza-c redujo la señalización de ERK con respecto al control negativo (YFCA+ DMSO).
Estos resultados indican que MRx0029 solo o en combinación con Vemurafenib y/o Azacitidina-C tiene los efectos de inducir la expresión del gen MAP2 y disminuir la supervivencia clonogénica y el crecimiento de una línea celular de melanoma portadora de una mutación oncogénica BRAF V600E (451Lu). Sobre esta base, se espera que las composiciones de la invención sean útiles en el tratamiento o prevención de cánceres, en particular aquellos que comprenden señalización de ERK oncogénica, especialmente melanomas como melanomas metastásicos. En particular, se espera que las composiciones de la invención sean útiles en el tratamiento o prevención de dichos cánceres que comprenden una mutación oncogénica en BRAF, en particular en la posición 600, y especialmente la mutación BRAF V600E.
Ejemplo 14E - Línea celular de cáncer colorrectal HT29
Se evaluaron los efectos de los siguientes tratamientos sobre la línea celular de cáncer colorrectal HT29 (mutación oncogénica V600E en BRAF): (1) MRx0029; (2) Vemurafenib (VEMU) en medio YFCA+; (3) VEMU y MRx0029; (4) Azacitidina-C (Aza-c) en medio YCFA+; (5) Aza-c y MRx0029; (6) VEMU, Aza-c y MRx0029.
La expresión del gen MAP2 en la línea celular HT29 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 47. MRx0029 en combinación con VEMU y/o Aza-c aumentó la expresión del gen MAP2 con respecto a ambos controles negativos (línea celular solamente e YCFA+). La supervivencia clonogénica de la línea celular HT29 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 48. Todos los tratamientos con MRx0029 (solo o en combinación con VEMU y/o Aza-c) disminuyeron la supervivencia clonogénica con respecto a ambos controles negativos (línea celular solamente y YCFA+ DMSO). Aza-c mejoró los efectos de MRx0029 en la inhibición de la supervivencia clonogénica. El crecimiento en agar blando de la línea celular HT29 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 49a y b. La señalización de ERK en la línea celular HT29 se evaluó usando el protocolo de Materiales y Métodos, y los resultados se muestran en la Figura 50 (VEMU, Aza-c y MRx0029 en combinación no se evaluaron). MRx0029 solo señalización de ERK con respecto al control negativo (YFCA+ DMSO).
Estos resultados indican que MRx0029 solo o en combinación con Vemurafenib y/o Azacitidina-C tiene los efectos de inducir la expresión del gen MAP2, disminuir la supervivencia clonogénica e inhibir la señalización de ERK en una línea celular portadora de la mutación oncogénica V600E (EEG29). Sobre esta base, se espera que las composiciones de la invención sean útiles en el tratamiento o prevención de cánceres, en particular aquellos que comprenden señalización de ERK oncogénica, especialmente cánceres colorrectales como cáncer colorrectal metastásico. En particular, se espera que las composiciones de la invención sean útiles en el tratamiento o prevención de dichos cánceres que comprenden una mutación oncogénica en BRAF, en particular en la posición 600, y especialmente la mutación BRAF V600E.
Ejemplo 15 - Expresión de ARN de GPR109a en células Caco-2 diferenciadas
GPR109a es un receptor acoplado a proteína G expresado en la membrana apical orientada hacia el lumen de las células epiteliales intestinales y colónicas. El silenciamiento de la expresión de GPR109a se encuentra en líneas celulares de cáncer de colon, y se ha informado que la inducción de su expresión induce la apoptosis de las células tumorales en presencia de productos de fermentación bacteriana como el butirato [126].
Se sembraron células HT29mtx sembradas en placas de 12 pocillos y se diferenciaron durante 10 días; luego se privaron de suero durante 12 horas y posteriormente se expusieron a sobrenadante al 10% derivado de bacterias en fase estacionaria durante 24 horas. Se recogieron las células y se aisló el ARN total de acuerdo con el protocolo del RNeasy mini kit (Qiagen). El ADNc se preparó usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La expresión génica se midió por qPCR. Se usó p-actina como control interno. Se calcularon las veces de cambio de acuerdo con el método 2A(-AAct) [127]. Las secuencias de los cebadores directo e inverso usados se proporcionan como las SEQ ID NO: 6 y 7, respectivamente.
Las Caco-2 diferenciadas forman membranas apicales/mucosas y basolaterales/serosas polarizadas que son impermeables y estructural y funcionalmente similares a las células epiteliales del intestino delgado. El tratamiento de células Caco-2 con MRx0029 provocó un aumento de la expresión de GPR109a (Figura 52A). Además, las Caco-2 tratadas con sobrenadante de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) mostraron una mayor expresión de ARN de GPR109a que el tratamiento con PMA solo (o PMA en medio YCFA+) - ver la Figura 52B. Por lo tanto, estos datos sugieren que las composiciones de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de cánceres, especialmente cánceres metastásicos, en particular cáncer colorrectal metastásico o cáncer de intestino delgado como adenocarcinoma de intestino delgado, y en particular aquellos que comprenden señalización de ERK oncogénica. Estos datos también sugieren que las composiciones de la invención pueden efectuar tal tratamiento a través del mecanismo de inducción de apoptosis, como resultado de la expresión de GPR109a.
Ejemplo 16 - Efecto de MRx0029 sobre la secreción de IL-8 por la linea celular HT29
Las células HT29 diferenciadas forman membranas apicales/mucosas y basolaterales/serosas polarizadas que son impermeables y son estructural y funcionalmente similares a las células epiteliales del intestino delgado. Las células HT29 se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 200.000 células/pocillo. Las células se diferenciaron durante 10 días (cambio de medio cada 2 días). El día del experimento las células se colocaron en la campana anaeróbica y se lavaron con solución de HANKs equilibrada anaeróbica. Luego se añadieron a las células 900 ul de medio de cultivo (sin FBS ni antibióticos). Las células bacterianas se volvieron a suspender en medio de crecimiento (sin FBS ni antibióticos) y luego se añadieron a 10A7 UFC en total en 100ul. Las células se coincubaron con bacterias durante 2 h en una campana anaeróbica. Posteriormente, las células se lavaron en medios de crecimiento sin FBS pero que contenían antibióticos. Las células se dejaron reposar en 1 ml de medio de acondicionamiento de THP1 durante 24 h. Después de 24 h de incubación, se recogió el sobrenadante y se centrifugó a 10.000 g durante 3 min y 4° C. Las muestras se congelaron a -80°C hasta su uso posterior.
Medios de acondicionamiento de THP1: se sembraron THp1 en un matraz T25 a una densidad de 4310A6/matraz. Las células se trataron en medio RPMI (que contenía L-glutamina 2 mM sin FBS) con LPS 1ug/ml o LPS ATP 5 mM (ATP añadido 3 horas después de LPS). Las células se dejaron reposar durante 24 horas. Posteriormente, se recogió el Medio de Acondicionamiento (CM) centrifugando las células a 250 g durante 5 min y a TA. Se usaron diferentes CM para tratar las células HT29. Se congeló una pequeña alícuota a 80° C para ELISA.
Se recogieron los sobrenadantes de las diferentes muestras y se realizó el análisis de citoquinas de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando un kit ELISA de IL-8 humana de Peprotech. Se usó GraphPad Prism7 para trazar y analizar los datos.
MRx0029 aumentó la secreción de IL-8, que es una citoquina potente inmunoestimuladora (Figura 53). Estos datos demuestran la actividad inmunoestimuladora de MRx0029.
Como se ha indicado anteriormente, la secreción de IL-8 aumenta la proliferación de células B. Las células B se han implicado en la modulación de la respuesta inmunitaria a los tumores. De hecho, la secreción de anticuerpos antitumorales por parte de las células B es un potente mecanismo de control tumoral. Es bien sabido que la producción de anticuerpos específicos de tumores puede desencadenar que las células asesinas naturales se unan al dominio constante de los anticuerpos, lo que da como resultado la lisis de las células tumorales a través de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden efectuar el tratamiento del cáncer a través de la modulación apropiada de la respuesta de las células B asegurando respuestas inmunitarias antitumorales aumentadas.
En base al hecho de que el mecanismo patológico de la mayoría de los cánceres implica la evasión de la vigilancia por parte del sistema inmunitario del huésped, cualquier mecanismo implicado en la estimulación de la respuesta inmunitaria tendría un impacto terapéutico beneficioso. Por lo tanto, se espera que las composiciones de la invención sean útiles en el tratamiento o prevención de varios tipos de cáncer.
Ejemplo 17 - Análisis de metabolitos
Introducción
El microbiota intestinal, con su inmensa diversidad y capacidad metabólica, representa un enorme depósito metabólico para la producción de una gran variedad de moléculas. Los inventores buscaban determinar qué ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena media son producidos y consumidos por la cepa NCIMB 42787 de M.massiliensis y otras cepas de M.massiliensis identificadas en la presente como Ref 1, Ref 2 y Ref 3.
Material y métodos
Cultivo bacteriano y recogida de sobrenadante libre de células
Los cultivos puros de bacterias se cultivaron anaeróbicamente en caldo YCFA+ hasta que alcanzaron su fase de crecimiento estacionario. Los cultivos se centrifugaron a 5000 x g durante 5 minutos y el sobrenadante libre de células (CFS) se filtró usando un filtro de 0,2 pM (Millipore, Reino Unido). Se almacenaron alícuotas de 1 ml de CFS a -80° C hasta su uso. El butirato de sodio, el ácido hexanoico y el valérico se obtuvieron de Sigma Aldrich (Reino Unido) y se prepararon suspensiones en caldo YCFA+.
Cuantificación de SCFA y MCFA de sobrenadantes bacterianos
Se analizaron y cuantificaron los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) y los ácidos grasos de cadena media (MCFA) de sobrenadantes bacterianos mediante MS Omics APS de la siguiente manera. Las muestras se acidificaron usando ácido clorhídrico y se añadieron estándares internos marcados con deuterio. Todas las muestras se analizaron en un orden aleatorio. El análisis se realizó usando una columna de alta polaridad (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 30 m x 0,25 mm x 0,25 pm) instalada en un GC (7890B, Agilent) acoplado a un detector de cuadropolo (59977B, Agilent). El sistema fue controlado por ChemStation (Agilent). Los datos sin procesar se convirtieron al formato netCDF usando Chemstation (Agilent), antes de que los datos fueran importados y procesados en Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando el software PARADISe descrito en [128].
Resultados
Como se muestra en las Figuras 54-56, la cepa 42787 produce ácido valérico, butirato y ácido hexanoico y consume propionato y acetato. Los inventores también descubrieron otras cepas de la especie M. massiliensis que producen niveles comparables de ácido valérico, ácido hexanoico y butirato y que consumen cantidades similares de acetato y propionato.
Ejemplo 18 - Supresión de enolasa 2
La Figura 57 demuestra que MRx0029 tiene un efecto estadísticamente significativo que suprime la enolasa específica de neuronas (NSE)/enolasa 2. Se cree que la NSE respalda las demandas metabólicas de las células tumorales aumentadas, protege a las células tumorales de condiciones estresantes y promueve su invasión y migración [129]. También está implicado en la progresión del melanoma metastásico [130], la supervivencia y la progresión en el cáncer de pulmón de células pequeñas [131 ] y el pronóstico del carcinoma de pulmón adenoescamoso [132]. Por lo tanto, se espera que las composiciones de la invención sean eficaces para tratar y prevenir el cáncer, en particular, melanoma metastásico, cáncer de pulmón de células pequeñas y carcinoma de pulmón adenoescamoso.
Ejemplo 19 - Análisis de metabolitos
Además de los datos proporcionados en el Ejemplo 17, la Figura 58 demuestra qué otros ácidos grasos de cadena corta son producidos y consumidos por la cepa NCIMB 42787 de M. massiliensis y otras cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, Nc IMB 43388 y NCIMB 43389.
La cepa de M. massiliensis NCIMB 42787 reduce el ácido fórmico a la vez que aumenta los niveles de ácido 2-metil-propanoico y ácido 3-metil-butanoico (Figura 58). Por lo tanto, la cepa NCIMB 42787 produce ácido 2-metil-propanoico y ácido 3-metil-butanoico y consume ácido fórmico. Los inventores también descubrieron que otras de las cepas depositadas producen niveles comparables de ácido 2-metil-propanoico y ácido 3-metil-butanoico y consumen cantidades similares de ácido fórmico.
Ejemplo 20 - Regulación por incremento de IL-6
Introducción
Se investigó la capacidad de las cepas bacterianas para desencadenar un aumento en la secreción de IL-6 por la línea celular de astrocitoma U373.
Materiales y Métodos
Línea celular de astrocitoma de glioblastoma humana (U373), se mantuvieron en 25 ml de MEME 4,5 g/l de D-glucosa suplementada con 10% de FBS inactivado por calor, 4 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 gg/ml de estreptomicina y 5 gg/ml de ml de plasmocina, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de piruvato de sodio (denominado medio de crecimiento completo).
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 100.000 células/pocillo en 1ml de medio de cultivo completo y se dejaron reposar a 37°C/5% de CO2 durante 72 h. El día del tratamiento, se retiró el medio de cada pocillo, las células se enjuagaron con 0,5 ml de medio de lavado (MEME libre de suero), 0,9 ml de medio de estimulación (medio MEME que contenía FBS al 2%). Después de una preincubación de 1 h, las células se retiraron de la incubadora de CO2 y se trataron con 100 gl de sobrenadante de bacterias. Se usó medio YCFA+ como control. Luego, las células se incubaron durante 24 h adicionales a 37° C/5% de CO2, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes libres de células y se centrifugaron a 10.000 g a 4° C durante 3 min. Las muestras se dividieron en alícuotas en microtubos de 1,5 ml y se almacenaron a -80° C para hIL-6 ELISA.
Resultados y conclusiones
La Figura 59 demuestra que la cepa NCIMB 42787 de M. massiliensis regula por incremento la secreción de IL-6 en células U373 en comparación con los controles de YCFA+ y sin tratar. Otras cepas depositadas, en particular la NCIMB 43389, también aumentaron la secreción de IL-6. Las cepas depositadas adicionales son NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43386 y NCIMB 43387.
La secreción de IL-6 aumenta la proliferación de células B. Como se ha descrito anteriormente, la proliferación de células B aumentada puede actuar como un potente mecanismo para mejorar la respuesta inmunitaria contra un cáncer (por ejemplo, a través de la producción de anticuerpos y la activación de ADCC).
De hecho, la actividad inmunoestimuladora se demuestra, no sólo por la cepa depositada, sino también por las cepas depositadas relacionadas. Por lo tanto, se espera que las composiciones de la invención que comprenden cepas del género Megasphaera, o biotipos de las mismas, sean útiles en el tratamiento o prevención de varios cánceres.
Ejemplo 21 - Supresión de enolasa 2
Materiales y Métodos
Se cultivó la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y en medio MEM al 50% y mezcla de nutrientes F-12 Ham al 50% suplementado con L-glutamina 2 mM, FBS inactivado por calor al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 |jg/ml de estreptomicina. Las SH-SY5Y se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 0,5 x 106 células. Después de 24 h, las células se trataron en medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1%) con sobrenadantes bacterianos al 10% o YCFA+ durante 17 h. Se recogieron las células y se aisló el ARN total de acuerdo con el protocolo del RNeasy mini kit (Qiagen). El ADNc se elaboró usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La expresión génica se midió por qPCR. Se usó GAPDH como control interno. El cambio de veces se calculó de acuerdo con el método 2(-ññct). Los conjuntos de cebadores usados se enumeran como las SEQ ID NO: 2, 3, 13 y 14.
Resultados
La Figura 60 demuestra que la cepa NCIMB 42787 de M. massiliensis tiene un efecto estadísticamente significativo de supresión de la enolasa específica de las neuronas (NSE)/enolasa 2. Además, los inventores también descubrieron que las cepas de referencia depositadas desencadenan una reducción estadísticamente significativa de la enolasa 2 en comparación con el control de cultivo de YCFA+. En particular, las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389, NCIm B 43386 y NCIm B 43387 provocaron una supresión significativa de la enolasa 2.
Conclusión
Por consiguiente, de acuerdo con los comentarios del Ejemplo 18 anterior, se espera que las composiciones de la invención, en ciertas realizaciones que comprenden las cepas de referencia ejemplares, sean eficaces para tratar y prevenir el cáncer, en particular, el melanoma metastásico, el cáncer de pulmón de células pequeñas y el cáncer de pulmón adenoescamoso.
Ejemplo 22 - Regulación por incremento de MAP2
Materiales y Métodos
La línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y se cultivó en medio MEM al 50% y mezcla de nutrientes F-12 Ham al 50% suplementado con L-glutamina 2 mM, FBS inactivado por calor al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina. Las SH-SY5Y se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 0,5 x 106 células. Después de 24 h, las células se trataron en medio de diferenciación (medio de crecimiento que contenía FBS al 1%) con sobrenadantes bacterianos al 10% o YCFA+ durante 17 h. Se recogieron las células y se aisló el ARN total de acuerdo con el protocolo del RNeasy mini kit (Qiagen). El ADNc se elaboró usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La expresión génica se midió por qPCR. Se usó GAPDH como control interno. El cambio de veces se calculó de acuerdo con el método 2(-ññct). Los conjuntos de cebadores usados se enumeran como las SEQ ID NO: 2, 3, 4 y 5.
Resultados
La Figura 61 A muestra que la cepa NCIMB 42787 de M. massiliensis y otras cepas depositadas desencadenan un aumento estadísticamente significativo de la expresión de MAP2 en comparación con los controles (es decir, control negativo y control de medios). En particular, las cepas depositadas con los números de registro NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389, NCiMb 43386 y NCIMB 43387 provocaron un aumento significativo en la expresión de MAP2. Sobre esta base, se espera que las composiciones de la invención sean útiles en el tratamiento o prevención de varios tipos de cáncer, en particular cánceres metastásicos, en particular melanoma metastásico.
Ejemplo 23 - Modulación de la secreción de citoquinas en células HMC3 expuestas a TNFa tras el tratamiento con la cepa NCIMB 42787 de M. massiliensis
Introducción
Las células HMC3 se trataron con TNFa y se midió la secreción de IL-8 tras el tratamiento con sobrenadantes libres de células del cultivo en fase estacionaria de NCIMB 42787.
Materiales y Métodos
Se cultivaron células HMC3 de microglía humana en medio EMEM suplementado con glutamina que contenía FBS inactivado por calor al 15% y 100 |ug/ml de penicilina y 100 |ug/ml de estreptomicina. Las células HMC3 se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 50.000 células/pocillo. Las células se dejaron en una incubadora de CO2 en reposo durante 48 horas. Luego, las células se lavaron en EMEM en blanco y se pretrataron en medio de cultivo FBS al 2% con 10 ng/ml de TNF-a durante 1 h. Posteriormente, se añadieron sobrenadantes bacterianos libres de células al 10% para cultivos de crecimiento estacionarios de NCIMB 42787 (aislados como se ha descrito anteriormente) a pocillos tratados y no tratados con TNF-a y se incubaron en incubadora con CO2 a 37° C durante 24 h. Los sobrenadantes libres de células se recogieron y centrifugaron a 10.000 x g durante 3 minutos y 4° C. Las muestras se dividieron en alícuotas en microtubos de 1,5 ml y se almacenaron a -80° C para hIL-8 ELISA.
La secreción de IL-8 se analizó usando kits de ELISA estándar de hIL-8, de acuerdo con el protocolo del fabricante en los sobrenadantes libres de células de células HMC3 tratadas como se ha descrito anteriormente. Las muestras se midieron a 405 nm con una longitud de onda de corrección establecida a 655 nm en un lector de microplacas (iMark, Bio-Rad). Los datos sin procesar se trazaron y analizaron utilizando el software GraphPad Prism 7.
Análisis estadístico
Los datos normalmente distribuidos se presentan como media ± SEM; Se usó Anova unidireccional (prueba de comparación múltiple de Sidak) para analizar los datos presentados en la presente. Un valor de p<0,05 se consideró significativo en todos los casos.
Resultados
NCIMB 42787 induce la secreción de IL-8 en ausencia de estimulación (Figura 61B). Como se ha indicado anteriormente, la IL-8 está implicada en la activación del sistema inmunitario, en particular mediante la estimulación de la proliferación de células B.
Ejemplo 24 - Activación del promotor de NF- k B en células HEK-TLR4 por M. massiliensis NCIMB 42787 Introducción
Para verificar si el tratamiento con NCIMB 42787 induciría la actividad del promotor NF-KB-Ap1 inducida por la participación de TLR4, se trataron células F1EK-TLR4 con sobrenadantes bacterianos sin células para NCIMB 42787 solo o en combinación con LPS.
Materiales y Métodos
Se cultivaron células informadoras FlEK293-Blue que expresan de manera estable TLR4 humano (HEK-TLR4) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células HEK-TLR4 se mantuvieron en DMEM 4,5 g/l de D-glucosa suplementada con FBS inactivado por calor al 10% (v/v), L-glutamina 4 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 100 pg/ml de ml de normocina, medio de selección HEK-Blue 1X.
Brevemente, las células se lavaron con PBS, se disociaron en PBS y se recogieron en medios de cultivo. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 25.000 células/pocillo. Para evaluar el efecto de las cepas bacterianas sobre el LPS que induce la activación del promotor de NF-kB, las células se trataron con 10 ng/ml de LPS en presencia o ausencia de sobrenadantes al 10% (aislados como se ha descrito anteriormente) y se incubaron en una incubadora de CO2. Los tratamientos continuaron durante 22 h a 37° C y 5% de CO, después de lo cual se realizó la detección de la actividad de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) del sobrenadante del cultivo celular usando la solución QUANTI-blue de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recogieron 20 pl de sobrenadante libre de células y se analizó la presencia de SEAP mezclándolo con 200 pl de medio de detección QUANTI-Blue filtrado estéril. Después de 2 h de incubación a 37° C, se midió la densidad óptica a 655 nm en un lector de microplacas (microplaca iMark, Bio-Rad).
Análisis estadístico
Los datos normalmente distribuidos se presentan como media ± SEM; Se usó Anova unidireccional (prueba de comparación múltiple de Sidak) para analizar los datos presentados en la presente. Un valor de p<0,05 se consideró significativo en todos los casos.
Resultados
NCIMB 42787 indujo la activación del promotor NF-KB-Ap1 por sí mismo (Figura 61C).
El NF-kB está implicado en la activación de la respuesta inmunitaria, en particular estimulando la expresión de mediadores de la inflamación y de citoquinas implicadas en la respuesta inmunitaria, por ejemplo, la IL-6. Como se ha indicado anteriormente, un aumento en la expresión de IL-6 ayuda a estimular el sistema inmunitario y, por lo tanto, la activación de la vía de NF-kB tiene actividad inmunoestimuladora. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención activan la señalización de NF-kB y, por tanto, estimulan el sistema inmunitario.
Ejemplo 25 - Las cepas de M. massiliensis producen ácido butírico, valérico y hexanoico
Materiales y Métodos
La extracción de SCFA de YCFA+, YCFA+ enriquecidos con una mezcla estándar de SCFA (ácido acético 40 mM y ácido fórmico 20 mM, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico y ácido hexanoico) se realizó de acuerdo con el método de De Baere et al.133.
Análisis HPLC de SCFA
La detección y cuantificación de SCFA por HPLC se realizó de acuerdo con el método de De Baere et al. 133 con ligeras modificaciones. Brevemente, el análisis HPLC se realizó usando un sistema Waters e2695 HPLC equipado con un detector Waters Photodiode Array (PDA) 2998 (Waters Limited, Elstree, Reino Unido). El análisis HPLC de los estándares de SCFA, SCFA extraídos de los extractos de MRx0005 y MRx0029 BCFS y MRx0005 y MRx0029 hexano, éter dietílico, acetato de etilo, acetonitrilo y metanol se realizaron usando una columna LC Xselect® HSS T33,5 qm 4,6 x 150 mm (Waters Limited, Elstree, Reino Unido).). El análisis LC se realizó usando el conjunto de detectores de matriz de fotodiodos (PDA) para analizar longitudes de onda de 200-800 nm. La detección y cuantificación de SCFA se realizó a 210 nm. La fase móvil consistía de tampón de fosfato de sodio 25 mM en agua HPLC (pH ajustado a 3,0 usando ácido fosfórico (A) y acetonitrilo (B). El método de LC para la detección y cuantificación de SCFA se llevó a cabo usando el sistema de solventes con el siguiente gradiente: t0'A=95%, B=5%; t10' A=95%, B=5%; t30' A=30%, B=70%; t31' A=0%, B=100%; t36' A=0%, B=100%; t38' A=5%, B=95%; t60' A=5%, B=95%; caudal=lml/min.
Se preparó una curva de calibración de siete puntos para cada SCFA inyectando 20 |ul de una dilución en serie doble de un SCFA (ácido acético 40 mM y ácido fórmico 20 mM, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico y ácido hexanoico). La eficiencia de cuantificación-extracción se calculó mediante la siguiente fórmula:
[SCFA en YCFA+ enriquecido y extraído]/[SCFA en YCFA+ enriquecido no extraído]
Se usó la eficiencia de extracción para determinar las concentraciones de SCFA individuales en cada muestra. La producción de SCFA específicos se calculó restando la cantidad de SCFA correspondiente presente en el control de medios no enriquecidos.
Metabolómica dirigida: metabolitos bacterianos y análisis de ácidos grasos
El análisis de las muestras se realizó por MS-Omics (Copenhague, Dinamarca). Se creó una muestra agrupada mixta (muestra QC) tomando una alícuota de cada muestra. Esta muestra se analizó con intervalos regulares a lo largo de la secuencia. Se probaron los efectos de la matriz para los compuestos cuantificados enriqueciendo la muestra QC en un mínimo de dos niveles.
Para el análisis de metabolitos de GC, las muestras se derivatizaron con cloroformiato de metilo usando una versión ligeramente modificada del protocolo descrito por Smart et al.134. Todas las muestras se analizaron en un orden aleatorio. El análisis se realizó usando GC (7890B, Agilent) acoplado con un detector de cuadrupolo (59977B, Agilent). Los datos sin procesar se convirtieron al formato netCDF usando Chemstation (Agilent), antes de que los datos se importaran y procesaran en Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando el software PARADISe descrito por Johnsen et al.135.
Para el análisis SCFA, las muestras se acidificaron usando ácido clorhídrico y se añadieron estándares internos marcados con deuterio. El análisis se realizó usando una columna de alta polaridad (Columna Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 30mx0,25mmx0,25qm) instalada en un GC (7890B, Agilent) acoplado a un detector de cuadrupolo (59977B, Agilent). Los datos sin procesar se convirtieron a formato netCDF usando Chemstation (Agilent), antes de que los datos se importaran y procesaran en Matlab R2014b (Mathworks, Inc.) usando el software PARADISe descrito por Johnsen et al.135.
Resultados
El análisis de ácidos grasos, usando metabolómica dirigida, demostró que NCIMB 42787 produce ácido butanoico (butírico), pentanoico (valérico) y hexanoico (caproico), tanto en forma lineal como ramificada (C4-C6) (Figura 62A). Además, la proporción de ácido 4-hidroxi-fenilacético:medio aumentó en el sobrenadante libre de células NCIMB 42787. Se usó análisis HPLC de sobrenadantes libres de células para monitorizar la producción de ácido fórmico, acético, propiónico, butírico, valérico y hexanoico (en base al tiempo de retención y el espectro de absorbancia de SCFA relevantes) por NCIMB 42787. En la Figura 62C se informa de cromatogramas representativos para estándares de SCFA superpuestos a sobrenadantes libres de células NCIMB 42787 extraídos para SCFA. El análisis HPLC confirmó la producción de ácido butírico, valérico y hexanoico por NCIMB 42787.
Ejemplo 26 - Las fracciones metanólicas de M. massiliensis que contienen butirato y valerato muestran actividad inmunoestimuladora en células U373
Para investigar la función de los SCFA en la reducción de la secreción de IL-8, se trataron células U373 con concentraciones crecientes de butirato de sodio (SB), valerato de sodio (SV) y ácido hexanoico (HA).
Métodos
Las células U373 se prepararon como se ha descrito anteriormente. Las células se pretrataron durante 1 h con 1 gg/ml de LPS indicado anteriormente y se incubaron a 37° C y CO2 al 5%. Después de una preincubación de 1 h, las células se retiraron de la incubadora con CO2 y se trataron con una concentración creciente de butirato de sodio (SB), valerato de sodio (SV) y ácido hexanoico (HA) recién preparados.
Análisis estadístico
Los datos normalmente distribuidos se presentan como media ± SEM; Se usó Anova unidireccional (prueba de comparación múltiple de Sidak) para analizar los datos presentados en la presente. Un valor de p<0,05 se consideró significativo en todos los casos.
Resultados y conclusiones
Las concentraciones probadas cubrieron el intervalo de concentraciones medidas en los sobrenadantes libres de células para los diferentes ácidos grasos y tuvieron en cuenta el hecho de que solo se usó el 10% de los sobrenadantes mencionados anteriormente en los ensayos basados en células. Tanto SB como SV aumentaron la secreción de IL-8 inducida por LPS en las mismas células (Figura 63), lo que sugiere que la presencia de ambos SCFA probablemente contribuyó a la inducción de IL-8 cuando se añade NCIMB 42787 al cultivo. HA no inhibía la secreción de IL-8 después del desafío con LPS. Ninguno de los SFCA probados indujo per se la secreción de IL-8 por encima del nivel de referencia (control de células sin tratar). La mezcla reconstituida de los tres SCFA reprodujo la actividad biológica del sobrenadante libre de células NCIMB 42787, tanto en presencia como en ausencia de LPS.
Por consiguiente, en ciertas realizaciones, el ácido butírico y/o valérico están implicados en la generación de IL-8 y, por lo tanto, son importantes para estimular el sistema inmunitario, por ejemplo mediante la proliferación de células B. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, las cepas bacterianas de la invención estimulan el sistema inmunitario a través de la producción de ácido butírico y/o valérico.
Ejemplo 27 - Los SCFA generados por NCIMB 42787 son por lo menos parcialmente responsables de la actividad inmunoestimuladora
Introducción
Para confirmar aún más si la actividad de NCIMB 42787 se debía por lo menos en parte a los SCFA, se fraccionó el sobrenadante bacteriano libre de células con diferentes solventes de polaridad creciente. Se realizó un análisis HPLC de los extractos brutos desproteinizados (hexano, F5; éter dietílico, F4; acetato de etilo, F3; acetonitrilo, F4; metanol, F1) de los sobrenadantes de esta cepa para analizar la complejidad bioquímica de los sobrenadantes de fase estacionaria libres de células de NCIMB 42787, así como para subfraccionar compuestos en base a la polaridad y la solubilidad.
Métodos
Extracciones secuenciales con solventes - preparación de extractos brutos
Se extrajeron tres réplicas biológicas de BCFS de la cepa NCIMB 42787 y YCFA+ (control de medio) secuencialmente con hexano de grado HPLC (HEX), éter dietílico (DE), acetato de etilo (EtOAc), acetonitrilo (ACN) y metanol (MeOFl). Brevemente, se colocaron 20 ml de BCFS en viales de vidrio y se extrajeron a temperatura ambiente (TA) en 20 ml de HEX en un agitador rotatorio (70 rpm) durante 30 min. Se realizaron un total de tres extracciones en cada BCFS y control de medio YCFA+. Luego, las capas acuosas restantes se extrajeron a TA en 20 ml de DE, EtOAc en un agitador rotatorio MX-RD-Pro (70 rpm) durante 30 min un total de tres veces. Los extractos combinados de cada muestra se secaron a presión reducida en un evaporador rotatorio R-300 equipado con una bomba de vacío V-300 (Büchi, Flawil, Suiza) a una temperatura que no excedía los 30° C. Los extractos resultantes se volvieron a solubilizar en 2 ml del solvente correspondiente y se dividieron en alícuotas en cuatro tubos Eppendorf de 1,5 ml (500 ml cada uno correspondiente a 5 ml de muestra original). Luego, las capas acuosas restantes se extrajeron a TA en 20 ml de DE, EtOAc en un agitador rotatorio MX-RD-Pro (70 rpm) durante 30 min un total de tres veces. Los extractos combinados de cada muestra se secaron a presión reducida en un evaporador rotatorio R-300 equipado con una bomba de vacío V-300 (Büchi, Flawil, Suiza) a una temperatura que no excedía los 30° C. Los extractos resultantes se volvieron a solubilizar en 2 ml del solvente correspondiente y se dividieron en alícuotas en cuatro tubos Eppendorf de 1,5 ml (500 ml cada uno correspondiente a 5 ml de muestra original).
Las capas acuosas restantes se evaporaron hasta la sequedad usando un evaporador rotatorio R-300. Los extractos secos resultantes se extrajeron durante 30 min en 20 ml de ACN un total de tres veces. Los extractos de ACN se combinaron, se evaporaron hasta la sequedad usando un evaporador rotatorio, se volvieron a solubilizar en 2 ml de ACN y se dividieron en alícuotas en cuatro tubos Eppendorf de 1,5 ml (500 pl cada uno). Los extractos secos restantes (porción insoluble en ACN de los extractos) se extrajeron luego durante 30 min en 20 ml de MeOH un total de tres veces. Los extractos de MeOH se combinaron, se evaporaron hasta la sequedad usando un evaporador rotatorio R-300, se volvieron a solubilizar en 2 ml de MeOH y se dividieron en alícuotas en cuatro tubos Eppendorf de 1,5 ml (500 ml cada uno).
Se mantuvieron alícuotas de los extractos brutos durante la noche a -20° C induciendo la precipitación de los componentes proteicos. Después de la precipitación durante la noche, cada alícuota se centrifugó a 10.000 xg durante 6 min y se transfirió a un tubo nuevo de 2 ml. La precipitación durante la noche se repitió tres veces, después de lo cual los extractos se secaron en un RVC 2-18 CDPlus speedvac (Christ, Osterode am Harz, Alemania) y se pesaron. Todas las alícuotas secas de cada extracto se almacenaron a -80° C hasta su uso posterior. Tratamiento
Las células U373 se prepararon como se ha descrito anteriormente. Las células se pretrataron durante 1 h con 1 pg/ml de LPS como se ha indicado anteriormente. Posteriormente, las células se retiraron de la incubadora de CO2 y se trataron con 100 ml de las diferentes fracciones. Las fracciones de los medios se usaron como controles. Los sobrenadantes libres de células se recogieron 24 horas después del tratamiento y se analizaron mediante ELISA para determinar la secreción de IL-8 (como se ha descrito anteriormente).
Análisis estadístico
Los datos normalmente distribuidos se presentan como media ± SEM; Se usó Anova unidireccional (prueba de comparación múltiple de Sidak) para analizar los datos presentados en la presente. Un valor de p<0,05 se consideró significativo en todos los casos.
Resultados
El análisis por HPLC confirmó la extracción selectiva y el fraccionamiento bruto de los compuestos presentes en los sobrenadantes desproteinizados. El NCIMB 42787 no fraccionado indujo la secreción de IL-8 en células U373 tanto en presencia como en ausencia de LPS, y la misma actividad fue producida por la fracción metanólica F1, reiterando por tanto la importante función de los ácidos butírico y valérico en la producción de IL-8 por estos tipos de células (Figura 64A y B).
Por lo tanto, como se ha descrito anteriormente, en ciertas realizaciones, la producción de ácido butírico y/o valérico estimuló el sistema inmunitario. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las cepas bacterianas de la invención estimulan el sistema inmunitario a través de la producción de ácido butírico y/o valérico.
Ejemplo 28 - La cepa de referencia de Megasphaera NCIMB 43387 reduce significativamente la expresión de ARNm de IDO-1 colónico en ratones BALB/c
La Figura 65 demuestra que NCIMB 43387 provoca una reducción significativa (cuantificada por qPCR normalizada a p-actina) en la expresión de ARNm de IDO-1 en el colon de ratones BALB/c en comparación con el control del vehículo.
Se ha implicado a IDO-1 en la promoción de la inmunosupresión en respuesta a la inflamación o infección. Por consiguiente, impulsar una disminución en la expresión de IDO-1 está asociada con la inmunoestimulación. Además, las reducciones en IDO-1 reducen la capacidad proliferativa y migratoria de las células cancerosas y mejoran la vigilancia inmunitaria contra los tumores. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, las cepas bacterianas de la invención sirven para reducir la expresión de IDO-1. En ciertas realizaciones, la inmunoestimulación está asociada con la reducción de la expresión de IDO-1. Además, en ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención previenen el crecimiento del cáncer metastásico. En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención son eficaces para tratar y prevenir el cáncer, en particular, el melanoma metastásico, cáncer de pulmón de células pequeñas y carcinoma de pulmón adenoescamoso a la luz de su actividad contra la metástasis Ejemplo 29 - Las cepas de Megasphaera depositadas con los números de registro NCIMB 43385 y NCIMB 43387 reducen la expresión del ARNm de Tph-1 colónico en ratones BALB/c
A los ratones BALB/c se les administró bioterapéutico vivo y los tejidos se aislaron para el análisis de la expresión génica usando qPCR.
La Figura 66 demuestra la capacidad de las composiciones de la invención para reducir la expresión de ARNm de Tph-1 (usando la cuantificación por qPCR normalizada a p-actina) en comparación con el control del vehículo.
Se sabe que las disminuciones en Tph-1 están asociadas con una mayor resistencia al cáncer y un crecimiento reducido de células cancerosas. Además, una disminución en la actividad de Tph-1 estimula el sistema inmunitario proporcionando niveles suficientes del aminoácido esencial triptófano para que los mastocitos impulsen la inmunidad antitumoral. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención disminuyen los niveles de expresión de Tph-1. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención desencadenan la inmunoestimulación y tratan y/o previenen las enfermedades divulgadas en el presente reduciendo los niveles de Tph-1.
Ejem plo 30 - La cepa M egasphaera depositada con e l núm ero de registro N C IM B 43385 aum enta la producción de IF N y e IL -6 tras la estim ulación con ConA de esplenocitos de ratones BALB/c
Las cepas bioterapéuticas vivas se seleccionaron ex vivo en cuanto a la eficacia de la producción de marcadores inmunitarios en esplenocitos aislados de ratones BALB/c y estimulados con ConA.
La Figura 67 muestra la capacidad de las composiciones de la invención para aumentar significativamente la producción de las citoquinas proinflamatorias IFNy e IL-6. Como se ha descrito anteriormente, ambas citoquinas están implicadas en la estimulación de la respuesta inmunitaria. Además, IFNy tiene actividad tumoricida significativa.
Por consiguiente, como se ha descrito anteriormente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan la producción de y/o IL-6 y, por lo tanto, impulsan la estimulación de la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, el beneficio terapéutico de las composiciones de la presente invención está relacionado con un aumento en la producción de IFNy y/o IL-6.
Ejem plo 30 - La cepa de referencia de M egasphaera depositada con e l núm ero de registro N C IM B 43385 aum enta s ignificativam ente la expresión de IL -6 y CD11b
A los ratones B ALB/c se les administró bioterapéutico vivo y los tejidos se aislaron para el análisis de la expresión génica usando qPCR.
La Figura 68 demuestra la capacidad de NCIMB 43385 para aumentar significativamente la expresión de IL-6 y CD11b en el hipocampo de ratones BALB/c en comparación con el control del vehículo.
Por consiguiente, como se ha descrito anteriormente, las composiciones de la presente invención, en ciertas realizaciones, aumentan la expresión de citoquinas proinflamatorias implicadas en la estimulación de la respuesta inmunitaria, en particular IL-6 y CD11b. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son terapéuticamente eficaces a la luz del aumento en la expresión de IL-6 y CD11b.
E jem plo 31 - N C IM B 42787 aum enta la expresión de TLR4
A los ratones BALB/c se les administró bioterapéutico vivo y los tejidos se aislaron para el análisis de la expresión génica usando qPCR.
La Figura 69 demuestra la capacidad de NCIMB 42787 para aumentar significativamente la expresión de TLR4 en la amígdala de ratones BALB/c en comparación con el control del vehículo.
TLR4 está asociado con la activación de la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, aumentar la expresión de TLR4 mejorará la inmunoestimulación. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan la expresión de TLR4. En ciertas realizaciones, el aumento de la expresión de TLR4 aumenta la respuesta inmunitaria. En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención aumentan la respuesta inmunitaria y tienen un efecto terapéutico en el tratamiento de las enfermedades divulgadas en la presente a través del aumento de la expresión de TLR4.
Secuencias
SEQ ID NO: 1 (secuencia de ARNr 16S de consenso para la cepa MRx0029 de Megasphaera massiliensis) TGAGAAGCTTGCTTCTTATCGATTCTAGTGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTAAGCAACC TGCCCTTCAGATGGGGACAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGAATACGTTCTTTCC GCCGCATGACGGGAAGAAGAAAGGGAGGCCTTCGGGCTTTCGCTGGAGGAGGGGCTTG CGTCTGATTAGCTAGTTGGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGTC TGAGAGGATGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA GCAGTGGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGA T GAC GGC C TTCGGGTT GT A AAGTTCTGTT AT AT GGGAC GA AC AGGAC AT C GGTT AAT AC CCGGTGTCTTTGACGGTACCGTAAGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGC GGCATCGCAAGTCGGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACCGAAACTGT GA AGCTC GAGT GT C GGAGAGGA AAGC GG A ATT C CT AGT GT AGC GGT GA AAT GC GT AGA TATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCTGAGGC GCGAAAGCCAGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGAT GGATACTAGGTGTAGGAGGTATCGACTCCTTCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATC CCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCAC AAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGCCTTGAC ATTGATTGCTACGGAAAGAGATTTCCGGTTCTTCTTCGGAAGACAAGAAAACAGGTGGT GCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA CCCCTATCTTCTGTTGCCAGCACCTCGGGTGGGGACTCAGAAGAGACTGCCGCAGACAA TGCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGGCTTGGGCTACACA CGTACTACAATGGCTCTTAATAGAGGGAAGCGAAGGAGCGATCCGGAGCAAACCCCAA AAACAGAGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCAGGAATCGCT AGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC GTCACACCACGAAAGTCATTCACACCCGAAGCCGGTGAGGCAACCGCAAG
Cebadores usados para qPCR
Figure imgf000066_0001
SEQ ID NO: 8 (secuencia de ARNr 16S de consenso para la cepa de Megasphaera depositada con el número de registro NCIMB43385)
GGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACG GGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTA GCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTT GGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTG TAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTC TGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCTTAGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCG CTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCAC C T GTTTT C TTGTCTTC C G A A G A A G A A C C GG A A A TC TC TTTC C GT A GC A AT C A A TGT CA A G GCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGG CCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTAT TGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACG GCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCA GTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCAC CGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCT CACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTAC GCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAG TTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAGGGATAACGGGTATTGACCGCTATCCTGT TCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTC CGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGC CGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTG GTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCC CGAAGGCCTCCCTTTCTTCATCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCA GCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTT TGCCACTCGAATTGATAAGAAGCAAGCTTCTCATC
SEQ ID NO: 9 (secuencia de ARNr 16S de consenso para la cepa de Megasphaera depositada con el número de registro NCIMB43388) GGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACG GGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTA GCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTT GGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTG TAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTC TGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCGAGGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCG CTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCAC CTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAG GCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGG CCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTAT TGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACG GCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCA GTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCAC CGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCT CACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTAC GCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAG TTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAAAGACACCGGGTATTAACCGATGTCCTGT TCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTC CGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGC CGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTG GTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCC CGAAGGCCTCCCTTTCTTCTTCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAG CCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTT GCCACTAGAATCGATAAGAAGCAAGCTTCTCATGTCTTCT SEQ ID NO: 10 (secuencia de ARNr 16S de consenso para la cepa de Megasphaera massilliensis depositada con el número de registro NCIMB43389) CGACGGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGT GACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATT ACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTG TTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACG TGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCAT TGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCGAGGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGT TGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCA CCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGT CAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTG CGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATAC TTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTT TACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGC GTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATT TCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTC CCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCT TTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC GTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAAAGACACCGGGTATTAACCGATGCC CTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTT GCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCT GGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGC CTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACCAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAA AGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCTTCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTA GCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCC GTTTGCCACTAGAATCGATAAGAAGCAAGCTTCTCATGTCTTCTCGTTCGACTTGCAT SEQ ID NO: 11 (secuencia de ARNr 16S de consenso para la cepa de Megasphaera depositada con el número de registro NCIMB43386)
CGACGGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGT GACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATT ACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTG TTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACG TGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCAT TGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCTTAGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTT GCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCAC CACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTC AAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGC GGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACT TATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTT ACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCG TCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTT CACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCC CCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTT TACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACG TAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAGGGATAACGGGTATTGACCGCTATCC TGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTG CTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTG GGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCC TTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAA GCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCATCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAG CAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCG TTTGCCACTCGAATTGATAAGAAGCAAGCTTCTCATCTCTTCTCGTTCGACTGCA SEQ ID NO: 12 (secuencia de ARNr 16S de consenso para la cepa de Megasphaera depositada con el número de registro NCIMB43387) TCGAACGGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGT GTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGA TTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCT GTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTAC GTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGC ATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCTTAGTGCTGGCAACAGAAGATAGGG GTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTG CACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAAT GTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTG TGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGAT ACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCG TTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCA
GCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCA
TTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGG
TCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCC
CTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCA
CGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAGGGATAACGGGTATTGACCGCTAT
CCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGT
TGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTC
TGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCG
CCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGA
AAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCATCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATT
AGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACC
CGTTTGCCACTCGAATTGATAAGAAGCAAGCTTCTCATCTCTTCTCGTTCGACTTGCA
Cebadores usados para qPCR de endolasa
Figure imgf000070_0001
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, para su uso en el tratamiento de enfermedades estimulando el sistema inmunitario, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16S que es por lo menos un 97% idéntica a la SEQ ID NO: 1.
2. Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Megasphaera, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1; (a) para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, (b) para su uso en el tratamiento, prevención o retraso de la inmunosenescencia, (c) para su uso como adyuvante de vacunas, o (d) para su uso en terapia con células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR-T), terapia de células madre mesenquimales (MSC), o terapia de trasplante de células madre; en un sujeto humano.
3. La composición para el uso de la reivindicación 1 o 2, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, como melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, carcinoma, cáncer de pulmón, leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata, linfoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o enfermedades malignas hematológicas.
4. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la composición tiene actividad inhibidora de histona deacetilasas, y/o en donde la composición regula por incremento citoquinas proinflamatorias.
5. La composición para el uso de la reivindicación 1 o 2, para su uso en el tratamiento, prevención o retraso de la inmunosenescencia.
6. La composición para el uso de la reivindicación 1 o 2, para su uso como adyuvante de vacunas.
7. La composición para el uso de la reivindicación 1 o 2, para su uso en terapia con CAR-T, terapia con MSC o terapia de trasplante de células madre.
8. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s que es por lo menos un 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 8, 9. 10, 11 o 12 o en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 o 12.
9. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la cepa bacteriana es de Megasphaera massiliensis.
10. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s que es por lo menos un 98%, 99%, 99,5% o 99,9% idéntica a la SEQ ID NO: 1 o en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia génica de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO: 1; opcionalmente en donde la cepa bacteriana es la cepa depositada con el número de registro 42787 en el NCIMB.
11. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición es para administración oral, y/o en donde la composición comprende uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables, y/o en donde la cepa bacteriana está liofilizada; o un producto alimenticio que comprende dicha composición, para el uso de cualquier reivindicación anterior.
12. Una composición que comprende una célula de la cepa bacteriana definida en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 8-10 en donde la célula expresa uno o más antígenos heterólogos; para su uso como vacuna; opcionalmente en donde la célula presenta el uno o más antígenos heterólogos.
13. Una célula de la cepa bacteriana definida en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 8-10, en donde la célula expresa uno o más antígenos heterólogos; para su como vacuna; opcionalmente en donde la célula presenta el uno o más antígenos heterólogos.
14. Una cepa bacteriana para su uso en terapia, en donde la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16S que es por lo menos un 99,5% o 99,9% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 8, 11 o 12.
15. Una cepa bacteriana que tiene la secuencia de ARNr 16S representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 8, 10, 11 o 12 para su uso en terapia.
16. La cepa bacteriana depositada con el número de registro NCIMB. 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388, o NCIMB 43389, para su uso en terapia.
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